CN110372797A

CN110372797A - 一种牙鲆海豚链球菌gapdh串联多表位多肽及其应用

Info

Publication number: CN110372797A
Application number: CN201910685706.9A
Authority: CN
Inventors: 绳秀珍; 刘敏; 战文斌; 唐小千; 邢婧
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-07-28
Filing date: 2019-07-28
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2039-07-28
Also published as: CN110372797B

Abstract

本发明提供一种牙鲆海豚链球菌GAPDH串联多表位多肽及其应用，所提供的串联多表位多肽，是用多肽接头连接的四个抗原表位肽；其中四个抗原表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1‑4。所提供的串联多表位多肽，其一种具体的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。本发明另一个方面还提供一种海豚链球菌GAPDH多表位疫苗，是将上述的串联多表位多肽作为抗原与疫苗佐剂制备的。本发明所制备的多表位疫苗能够为牙鲆抗S.iniae感染提供较强的免疫保护，且效果明显高于GAPDH重组蛋白亚单位疫苗以及S.iniae灭活疫苗。

Description

一种牙鲆海豚链球菌GAPDH串联多表位多肽及其应用

技术领域

本发明属于水产疫苗技术领域，具体涉及一种牙鲆海豚链球菌(Streptococcusiniae)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)串联多表位多肽及其在制备疫苗中的应用。

背景技术

海豚链球菌(S.iniae)是革兰氏阳性菌，属链球菌科链球菌属(Streptococcus)。海豚链球菌广泛分布于海淡水环境中，可感染多种海淡水养殖鱼类，如牙鲆(P.olivaceus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、真鲷(Chrysophrys major)、黑鲷(Sparus microcephalus)、罗非鱼(Oreochromis nilotica)等，稚鱼至成鱼均可被感染，给水产养殖业造成重大经济损失。海豚链球菌也可感染人类，引起细菌性蜂窝织炎、脑膜炎、心内膜炎和感染性关节炎。目前，治疗海豚链球菌病主要是使用抗生素和化学药物，容易产生耐药株，药物残留也会影响水产品的质量安全、污染水环境。疫苗接种因安全有效成为防控水产养殖动物疾病的主流方向，有望替代药物治疗，具有广阔的应用前景。

有关海豚链球菌的抗原蛋白的研究表明，MtsB，Sip11，FBA、CAMP、SiM蛋白、C5a肽酶、白介素-8蛋白酶、烯醇化酶、荚膜多糖和PGM等尽管能诱导宿主产生免疫应答，但是作为疫苗的效果并不理想。目前对海豚链球菌疫苗的研究包括福尔马林灭活疫苗、改良活疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗等，但尚无关于表位疫苗的报道。本申请发明人最近发现海豚链球菌GAPDH能够诱发牙鲆较高水平的免疫应答，产生较高的针对海豚链球菌感染的免疫保护效果，具有开发为疫苗的潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牙鲆海豚链球菌GAPDH串联多表位多肽及其应用，所提供的串联多表位多肽可用于制备牙鲆海豚链球菌GAPDH多表位疫苗。

本发明首先提供一种串联多表位多肽，是用多肽接头连接的四个抗原表位肽；其中四个抗原表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1-4；

所述多肽接头，是序列为GGGG、EAAAK、AAY或GPGPG的多肽接头；

更优选的，所述的多肽接头是序列为KK的接头；

本发明所提供的串联多表位多肽，其一种具体的氨基酸序列为SEQ ID NO:8:

GRLAFRRIQNVEGVKKTRINDLTDPNMLAHKKSAEREPANIDWATDKKGAKKVVITAPGGND；

本发明还提供一种核酸片段，所述的核酸片段用于编码上述的串联多表位多肽；

所述的核酸片段，其一种具体的序列为SEQ ID NO:9；

本发明再一个方面提供一种重组工程菌，能够重组表达上述的串联多表位多肽；

本发明另一个方面还提供一种海豚链球菌GAPDH多表位疫苗，是将上述的串联多表位多肽作为抗原与疫苗佐剂制备的；

所述的疫苗佐剂，可以选用亚单位疫苗领域中常用的佐剂；其中作为实施例的一种具体记载，所述的佐剂为弗氏佐剂。

本发明所制备的多表位疫苗能够为牙鲆抗S.iniae感染提供较强的免疫保护，且效果明显高于GAPDH重组蛋白亚单位疫苗以及S.iniae灭活疫苗。

附图说明

图1：海豚链球菌GAPDH蛋白的二级结构分析图；

图2：海豚链球菌GAPDH蛋白分子三级结构模型；

图3：ELISA检测GAPDH抗原表位合成肽与牙鲆抗rGAPDH血清(A)以及抗海豚链球菌血清抗体(B)的反应性；

图4：模拟表位串联肽的亲水性、抗原性及表面可及性预测；

图5：多表位多肽rMEPIG反应原性鉴定图，

其中M：分子量标准蛋白；1：阴性对照，未加诱导剂的表达菌；2：加入诱导剂的表达菌；3：纯化后的蛋白；4：重组蛋白与牙鲆抗S.iniae血清反应；5：阴性对照；

图6：海豚链球菌攻毒后FKC、rGAPDH、rMEPIG及PBS组牙鲆相对免疫保护率图；

图7：免疫FKC、rGAPDH、rMEPIG及PBS后，牙鲆外周血、头肾CD4-1⁺、CD4-2⁺、CD8β⁺T淋巴细胞比例变化图，其中A/A1为各组外周血、头肾中CD4-1⁺T淋巴细胞比例变化；B/B1为各组外周血、头肾中CD4-2⁺T淋巴细胞比例变化；C/C1为各组外周血、头肾中CD8β⁺T淋巴细胞比例变化；

图8：免疫FKC、rGAPDH、rMEPIG及PBS后，牙鲆外周血(A)、脾脏(B)、头肾(C)中sIgM⁺B淋巴细胞比例变化图；

图9：ELISA测定免疫FKC、rGAPDH、rMEPIG及PBS后1-7w牙鲆血清中总抗体水平(A)和抗海豚链球菌特异性抗体水平(B)的变化图。

具体实施方式

本发明所涉及的GAPDH是糖酵解途径的关键酶，可以催化甘油脱氢3磷酸氧化磷酸化为1,3双磷酸甘油酸，还可与蛋白质结合。

表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇，它是TCR/BCR及抗体特异结合的基本单位。表位可分为连续表位(线性表位)和不连续表位(构象表位)。在免疫应答中，根据抗原表位所识别的TCR和BCR不同，分为T细胞表位和B细胞表位。表位大小一般不超过20个氨基酸，能被机体识别且能够刺激机体产生抗体，是蛋白质抗原性的基础，也是诱导机体产生免疫应答的基本结构，自然发生的免疫反应不能识别所有的表位，而是集中于相对较少的表位。

表位疫苗是以抗原表位为基础制备的新型疫苗，相较于传统疫苗，避免了完全抗原中其它不利表位的副作用，提高了安全性。

本发明通过分析海豚链球菌GAPDH氨基酸序列，筛选位于GAPDH蛋白三维结构表面的抗原表位，并运用ELISA技术及牙鲆抗血清鉴定有效表位，同时分析抗原表位的连接顺序和间隔序列以确定最优的连接方式，构建串联多表位连接序列的重组表达载体，原核表达获得重组蛋白，联合弗氏佐剂制备多表位疫苗。制备的疫苗免疫牙鲆后，检测CD4+、CD8β⁺T淋巴细胞和sIgM⁺B淋巴细胞比例变化、总抗体水平、抗S.iniae特异性抗体水平变化，评价多表位疫苗引起的细胞免疫和体液免疫应答。结果表明本发明制备的多表位疫苗可以为牙鲆抗S.iniae感染提供较强的免疫保护，效果好于GAPDH重组亚单位疫苗和S.iniae全菌灭活疫苗。

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1：海豚链球菌多表位多肽分子结构的设计

(1)以海豚链球菌GAPDH蛋白氨基酸序列(ACX85247.1)为分析材料，利用SOPMAServer对海豚链球菌GAPDH蛋白的二级结构进行预测。结果显示，GAPDH基因中无规则卷曲占36.62％，β-转角占7.32％，α-螺旋和延伸链即β-折叠分别占30.57％和25.48％，各种结构在海豚链球菌GAPDH蛋白氨基酸序列中的分布情况见图1。

(2)应用DNAStar Protean生物信息学软件及在线网站(IEDB:http://tools.iedb.org/main/bcell/和ProtScale:http://us.expasy.org/)分析蛋白二级结构中的柔性区域和可塑性区域，预测氨基酸的亲水性(Hydrophilicity Plot-Kyte-Doolittle)、柔韧性(Flexible Regions-Karplus-Schulz)、抗原性(Antigenic Index-Jameson-Wolf)和表面可及性(Surface Probability Plot-Emini)，综合各个软件和网站分析的多参数预测结果，选取位于β-转角和无规则卷曲区域、亲水性指数≥0、表面可及性指数≥1和抗原性指数≥0的氨基酸区段作为可能的GAPDH蛋白B细胞线性表位。预测获得7条GAPDH蛋白的B细胞线性表位(G1-G7)(表1)。

表1：GAPDH蛋白的B细胞线性抗原表位预测

其中G1-G7的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1-7。

(3)用PyMOL明确优势表位在蛋白三维结构中的位置。

(4)人工合成预测获得的表位多肽，每条多肽合成量为5mg，合成多肽纯度大于95％。

(5)将合成的表位肽段溶解于PBS中，并调整浓度为40.0、20.0、10.0、5.0和2.5μg/ml,每孔100μL加入96孔酶标板中，同时设置空白对照，封闭后孵育稀释度1:50的牙鲆抗海豚链球菌血清和抗GAPDH重组蛋白血清作为一抗，孵育阴性血清作为对照，用酶标仪测定吸光值(405nm)。计算阳性血清与阴性血清吸光值之比(P/N)，当P/N≥2.1时为阳性，并根据OD值的大小间接反映各表位免疫反应性的高低。

结果显示：蛋白3D结构图显示G1、G2、G3、G4表位肽序列大部分位于蛋白结构表面(图2)，进一步进行ELISA，其均能与牙鲆抗GAPDH血清抗体发生特异性结合而不与阴性对照组血清抗体发生阳性反应，且反应活性依次为G4＞G1＞G3＞G2；表位肽均能与牙鲆抗S.iniae血清反应(图3)，说明筛选获得的表位保留了海豚链球菌GAPDH蛋白的免疫反应性。而G5-G7表位肽序列不位于蛋白结构表面，ELISA分析显示其与抗血清的反应活性也低于G1-G4表位，因此，最终选择了G1-G4表位肽。

(6)将鉴定获得的抗原表位采用不同多肽接头(GGGG，EAAAK，AAY，KK，GPGPG)以及不同连接方式排列组合进行串联，确定最佳的连接方式。结果显示，GAPDH以KK接头(G1-KK-G2-KK-G3-KK-G4)的连接顺序，进行串联后的各表位间相对独立，抗原参数好(图4)，串联连接获得海豚链球菌多表位多肽序列。

实施例2：重组表达载体pET-28a-MEPIG的构建及诱导表达

1、重组表达载体的构建

将上述设计的海豚链球菌多表位疫苗分子命名为MEPIG，其氨基酸序列为SEQ IDNO:8，根据大肠杆菌表达系统的核苷酸嗜性将接头多肽对应的核苷酸序列逆转为相应的基因序列(SEQ ID NO:9)，并在串联多表位MEPIG基因序列5’端和3’端分别加上BamHⅠ/SacⅠ和SacⅠ/HindIII酶切位点、保护性碱基以及终止密码子，经密码子优化后，送至上海生工生物工程有限公司合成并克隆至pET-28a质粒，形成重组质粒。

2、重组多表位多肽的诱导表达

1)将测序后含有重组质粒的阳性菌接种于6mL含卡那抗生素的LB液体培养基中(抗生素与培养基配比为1:1000)，37℃恒温震荡培养5h。转接到600mL已添加600μL卡那抗生素的LB液体培养基中扩大培养，当OD600达到0.6时取出1mL菌液用作后续SDS实验对照组，剩余菌液加入6mLIPTG(0.1M)诱导剂，继续震荡培养12h后取1mL诱导后的菌液，8000×g离心5min，灭菌PBS重悬，用于诱导效果检测。

2)十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：取20μL已重悬的未诱导和诱导的菌液于灭菌的0.5mL离心管中，加入等量样品缓冲液，混匀后煮沸15min，冷却。取蛋白分子量标准品(Marker)加入等量的样品缓冲液，煮沸5min，冷却。将处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10μL，在恒流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50-70mA)，电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；放置在考马斯亮蓝染液中染色1h。置于脱色液中，于摇床上缓缓摇晃进行脱色，直至条带清晰，停止脱色。

实施例3：重组多表位多肽的纯化及免疫原性检测

(1)重组蛋白的纯化

确认诱导成功的菌液用离心机离心(8000×g，10min，4℃)，弃上清，收集菌体，PBS洗涤1次，用约40-50mL的Binding buffer(Na₂HPO₄ 14.5g；NaH₂PO₄ 1.48g；NaCl 29.3g；尿素480g；40mM咪唑；pH 7.4，超纯水定容至1L，滤膜过滤)重悬，置于冰上，超声破碎仪破碎(3s on，3s off，功率37％)至淡黄色清澈液体，8000×g离心5min后，取上清，4℃保存待用；连接上样杯、His标签蛋白亲和层析柱等，检测装置的密闭性；用超纯水清洗仪器管道A、B和蛋白亲和层析柱，然后用配制好的0.2M NiSO₄溶液活化层析柱，最后再用超纯水清洗上样管道和层析柱至离子水平趋于稳定；将上样管A置于Binding buffer中，以20mL/min清洗上样管，清洗1min，随后调整为Load模式以2mL/min清洗层析柱至离子水平趋于稳定；用10mL注射器将样品缓缓推入上样杯中，调整为Inject模式，以流速1mL/min上样5-6mL至吸光度值曲线趋于稳定；Binding buffer再次平衡层析柱；Elution buffer(Na₂HPO₄ 14.5g；NaH₂PO₄ 1.48g；Na₂HPO₄ 14.5g；NaH₂PO₄ 1.48g；NaCl 29.3g；尿素480g；500mM咪唑；pH 7.4，超纯水定容至1L，滤膜过滤)进行洗脱，设定收集体积(100-200mL)，以20mL/min清洗B管，清洗1min，调整为Load模式2mL/min，洗脱目的蛋白并收集。重复以上步骤，进行样品收集。

(2)Western Blot鉴定多表位多肽的反应原性

①SDS-PAGE步骤参考实例3中的操作步骤，将SDS-PAGE的凝胶浸泡于电泳缓冲液中(Gly 14.42g，Tris-Base 3.03g，甲醇200mL，蒸馏水定容至1L)，剪取与分离胶相同大小的PVDF膜，甲醇中浸润30s后超纯水中浸泡2min，置于电泳缓冲液中。

②将转膜黑夹子浸泡于电泳缓冲液中，铺上3层滤纸后，PVDF膜朝上置于滤纸上，将分离胶铺在PVDF膜上，再铺上已浸润过缓冲液的3层滤纸，合上夹子固定。置于转移槽中，连接电泳仪，30V、2h条件下进行电转移。

③取出PVDF膜于甲醇中稍作浸润后，丽春红(丽春红粉末0.5g，冰乙酸1mL，加蒸馏水定容至100mL)染色，将Maker剪下，然后将膜剩余部分用超纯水冲洗至无色后，浸泡于3-5％BSA，37℃封闭1h；

④PBST(含0.5％的Tween-20的PBS)洗涤3次，每次5min，牙鲆抗灭活S.iniae血清和健康牙鲆血清作为一抗，倒入平皿中，PVDF膜浸入其中，37℃恒温培养箱中孵育1h；

⑤PBST洗涤3次后，加入鼠抗牙鲆IgM单抗(1:3000)，37℃孵育1h；PBST洗涤3次后，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG单抗(1:5000)孵育，37℃孵育1h；

⑥将PVDF膜放入氮唑蓝/5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸盐(NBT-BCIP)发色液(避光条件下，66μL NBT贮存液，10mL NBT-BCIP底物缓冲液中，33μL BCIP贮存液)中发色，以去离子水洗涤终止反应。

结果显示，重组质粒MEPIG的阳性表达菌经IPTG诱导后，在14kDa处条带加粗，且与预期蛋白分子量大小一致，而作为阴性对照的未诱导大肠杆菌在相同位置条带没有加粗，证明成功诱导表达了目的蛋白。诱导表达成功的重组蛋白经His亲和层析柱纯化后条带单一，表明纯化效果理想，Westernblot分析重组蛋白与牙鲆抗S.iniae血清的反应情况，结果显示能发生显色反应，表明构建的多表位多肽具有良好的反应原性(图5)。

实施例4：多表位疫苗MEPIG在为牙鲆抗S.iniae感染提供免疫保护中的应用

(1)疫苗的注射免疫

实验分为实施例3重组制备的MEPIG重组蛋白(rMEPIG)制备的疫苗、GAPDH重组亚单位疫苗(rGAPDH)、海豚链球菌灭活疫苗(FKC)及PBS阴性对照共4组，每组牙鲆100尾，BCA法测定蛋白浓度并用无菌PBS调整各蛋白浓度至2mg/mL，用弗氏完全佐剂润滑后的注射器分别吸取疫苗及弗氏完全佐剂，连接管连接，注射乳化器混匀至其混合物在水中不扩散，腹腔注射免疫牙鲆。阴性对照组注射等体积PBS。

(2)疫苗免疫保护率

疫苗免疫后5周，对照组和免疫组各组分别随机取30尾牙鲆，进行攻毒实验，用于相对免疫保护率(RPS)的测定。取出保存于-80℃的S.iniae毒力株NUF849静置于冰上，解冻后接种于5mL BHI液体培养基中，28℃震荡培养4h后转接于600mL BHI液体培养基中扩大培养，28℃下震荡培养24h后，5000×g，4℃离心10min，倒掉培养基，无菌PBS重悬菌体，重复洗涤3次，收集菌体。无菌PBS调整菌液浓度至10⁷cfu/mL于4℃保存备用。每尾牙鲆腹腔注射100μL浓度为10⁷cfu/mL的S.iniae进行攻毒，每日观察并持续记录，统计各组牙鲆15天的发病及死亡状况，计算相对免疫保护率：RPS(％)＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％。

结果显示FKC、rGAPDH、rMEPIG和PBS组的死亡率分别为46.67％、33.33％、20.0％和90％，计算得到FKC、rGAPDH、rMEPIG各组的免疫保护率分别为48.15％、66.67％和77.78％(图6)；多表位疫苗rMEPIG明显高于S.iniae灭活疫苗FKC及GAPDH重组亚单位疫苗。

(3)多表位疫苗免疫后牙鲆T/B淋巴细胞应答变化

采用1.07/1.02Percoll密度梯度离心法提取牙鲆外周血、脾脏和头肾中的白细胞。

具体操作如下：

①把脾和头肾在筛网中用钥匙轻轻研磨，边磨边滴加抗凝剂进行冲洗，研磨完毕后通过筛绢过滤，将外周血和细胞研磨悬液于100×g、4℃下离心20min，收集上清。

②用注射器依次加入1.070g/cm³和1.020g/cm³的Percoll应用液于胎牛血清润洗过的离心管中，使二者出现明显的分层，接着向离心管中再加入上述收集的上清悬液，840×g、4℃离心30min。

③用注射器吸取Percoll梯度界面上的白细胞层置于新的离心管中，加入适量含5％新生牛血清的无菌PBS溶液，680×g、4℃离心5min，洗涤3次.

④离心管底部的白色沉淀即为白细胞，PBS溶液重悬沉淀后，用流式细胞仪检测白细胞的浓度，将细胞浓度调整为1×10⁶cells/mL以用于流式细胞术实验。

⑤分别以兔抗牙鲆CD4-1(1:1000)、CD4-2(1:1500)、CD8β(1:1000)多抗和鼠抗牙鲆IgM单抗2D8(1:1000)为第一抗体孵育白细胞，孵育骨髓瘤上清作为阴性对照，37℃恒温培养箱中孵育1.5h，4℃下680×g离心5min，用800μL无菌PBS重悬，重复3次。分别加入AlexaFluor 647标记的羊抗兔IgG(1:1000)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(1:256)，37℃孵育45min；洗涤后，用200μL无菌PBS重悬。利用流式细胞仪检测外周血、脾脏和头肾中CD4-1⁺、CD4-2⁺、CD8β⁺T淋巴细胞，sIgM⁺B淋巴细胞比例。

结果显示，各免疫组牙鲆外周血、脾脏、头肾中CD4-1⁺、CD4-2⁺、CD8β⁺T淋巴细胞比例均呈现先上升后下降的趋势，且于第3d/5d达到峰值(图7以外周血和头肾示例)；各免疫组sIgM⁺B淋巴细胞水平上升，于第4w/5w达到峰值，表明各免疫组均能够诱导鱼体产生细胞和体液免疫应答，其中，多表位疫苗rMEPIG组在各个组织中sIgM⁺B淋巴细胞峰值水平均高于其他组(图8)。

(4)ELISA检测牙鲆血清中总抗体水平

①免疫后1w、2w、3w、4w、5w、6w和7w从各组中分别随机取3个个体，从尾静脉抽取外周血(不加抗凝剂)置于干净离心管中，室温静置1h后，4℃静置过夜，待血清析出后4℃下3000×g离心10min，吸取上层血清于另一干净离心管中保存于-20℃。

②用移液枪将不同时间点各免疫组牙鲆血清，每孔200μL加入96孔酶标板中4℃包被过夜或37℃孵育3h，以健康牙鲆血清作为阴性对照，每组设3个平行。

③甩去孔内包被液，倒扣于滤纸上，每孔加入200μL PBST，置于摇床上，洗涤3次，每次5min。

④200μL/孔加入3-5％牛血清白蛋白(BSA)，37℃培养箱中封闭1.5h。

⑤洗涤后，每孔加入100μL鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体2D8(1:1000)，37℃孵育1h。

⑥洗涤后，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(1:3000)，37

℃孵育45min。

⑦洗涤后，每孔加入100μL pNPP发色液(10mL发色液中加入5-10mgpNPP-Na)，显色3-5min后，用酶标仪测定吸光度值(405nm)。

结果显示，各免疫组总抗体水平均于第1w开始上升，第4w达到峰值后缓慢下降。其中，亚单位疫苗rGAPDH免疫组诱导的牙鲆总抗体水平较高(图9A)。

(5)ELISA检测牙鲆血清中特异性抗体水平

①将调整好浓度为1×10⁷CFU/mL的海豚链球菌包被于96孔酶标板后4℃过夜，倒掉包被液后PBST溶液洗涤5min×3次。

②加入3％～5％BSA封闭液，37℃封闭2h，倒掉封闭液后PBST溶液洗涤5min×3次。

③依次孵育各免疫组牙鲆血清(1:100稀释)、鼠抗牙鲆IgM单抗(1:1000稀释)和碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG抗体(1:5000稀释)，37℃孵育1h，且每次孵育抗体后PBST溶液洗涤5min×3次。

④加入新鲜配制的pNPPNa发色液，室温下避光显色10min，然后放入酶标仪中，设置波长405nm处读取吸光值(OD值)。对照组用PBS溶液代替鼠抗牙鲆IgM单抗，选取PBS对照组为0.07～0.08时的读数为最终OD值。

结果显示，各免疫组中抗S.iniae的特异性抗体均呈现先上升达到峰值后逐渐降低的趋势。多表位疫苗rMEPIG的抗海豚链球菌特异性抗体水平明显高于重组亚单位疫苗rGAPDH及灭活疫苗免疫组(图9B)。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明请求保护的范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种牙鲆海豚链球菌GAPDH串联多表位多肽及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Arg Leu Ala Phe Arg Arg Ile Gln Asn Val Glu Gly Val

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Arg Ile Asn Asp Leu Thr Asp Pro Asn Met Leu Ala His

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Ala Glu Arg Glu Pro Ala Asn Ile Asp Trp Ala Thr Asp

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Ala Lys Lys Val Val Ile Thr Ala Pro Gly Gly Asn Asp

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Gly Asp Gln Met Val Leu Asp Gly Pro His Arg Gly Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Val Ala Val Leu Glu Lys Asp Thr Ser Val Glu Glu Ile Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ala Thr Gln Thr Lys Val Gln Thr Val Asp Gly Asn Gln

1 5 10

<210> 8

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Arg Leu Ala Phe Arg Arg Ile Gln Asn Val Glu Gly Val Lys Lys

1 5 10 15

Thr Arg Ile Asn Asp Leu Thr Asp Pro Asn Met Leu Ala His Lys Lys

20 25 30

Ser Ala Glu Arg Glu Pro Ala Asn Ile Asp Trp Ala Thr Asp Lys Lys

35 40 45

Gly Ala Lys Lys Val Val Ile Thr Ala Pro Gly Gly Asn Asp

50 55 60

<210> 9

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgtcttgcat tccgtcgtat tcaaaatgtt gaaggtgttg aaaagaagat caatgacctt 60

acagatccta acatgcttgc acacttgttg aagaaggaac gcgaaccagc aaacattgac 120

tgggctactg atggtgtaaa gaagaaaaaa gttgttatca cagctcctgg tggaaatgac 180

gttaaa 186

Claims

1.一种串联多表位多肽，其特征在于，所述的串联多表位多肽是用多肽接头连接的四个抗原表位肽，其中四个抗原表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1-4。

2.如权利要求1所述的串联多表位多肽，其特征在于，所述的多肽接头是序列为GGGG、EAAAK、AAY或GPGPG的多肽接头。

3.如权利要求1所述的串联多表位多肽，其特征在于，所述的多肽接头是序列为KK的接头。

4.如权利要求1所述的串联多表位多肽，其特征在于，所述的串联多表位多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

5.一种核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段用于编码权利要求1-4任一项所述的串联多表位多肽所述的核酸片段。

6.如权利要求5所述的核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段的序列为SEQ ID NO:9。

7.一种重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌用于重组表达权利要求1-4任一项所述的串联多表位多肽。

8.一种海豚链球菌GAPDH多表位疫苗，其特征在于，所述的疫苗是将权利要求1-4任一项所述的串联多表位多肽作为抗原，与疫苗佐剂联合使用制备的。

9.如权利要求8所述的多表位疫苗，其特征在于，所述的串联多表位多肽是使用权利要求7所述的重组工程菌表达制备的。

10.如权利要求8所述的多表位疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为亚单位疫苗领域中使用的佐剂。