CN105106945B

CN105106945B - 一种幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗及其制备方法

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Publication number: CN105106945B
Application number: CN201510545643.9A
Authority: CN
Inventors: 刘昆梅; 郭乐; 汤锋; 廖国玲; 徐广贤; 刘宏鹏
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2035-09-01
Also published as: CN105106945A

Abstract

本发明提供一种可针对幽门螺旋杆菌四种关键毒力因子的多表位疫苗，其活性是一条多肽，主要由尿素酶A和B亚基、细胞毒素相关蛋白A、空泡毒素相关蛋白A的优势Th和B细胞抗原表位或区段及中性粒细胞激活蛋白构成。本发明通过基因合成和分子克隆技术构建一个融合基因，其包含尿素酶、细胞毒素相关蛋白A、空泡毒素相关蛋白A的优势Th和B细胞抗原表位或区段以及中性粒细胞激活蛋白。利用大肠杆菌表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得四价毒力因子多表位疫苗。该疫苗可激发机体产生针对尿素酶、细胞毒素相关蛋白A、空泡毒素相关蛋白A和中性粒细胞激活蛋白的T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答，可用于防治幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。

Description

一种幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种新型幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎、消化性胃溃疡和十二指肠溃疡的重要致病因子，与胃癌发生密切相关。幽门螺旋杆菌感染呈世界性分布，在发达国家，Hp感染率为30％～50％，在我国Hp感染率更加严峻，高达58.07％(超过6亿人口)，且呈现明显的家庭聚集性。据统计，每年我国用于Hp感染相关性疾病的医疗费用高达100亿人民币，仍无法有效控制Hp感染相关性疾病的发生。我国是胃癌的高发区，胃癌年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多，每年新增胃癌病例约40万人，造成20～30万人死亡，居世界首位。目前治疗Hp感染的方法主要基于“三联”药物疗法(成分：质子泵抑制剂、抗生素和铋剂)，存在诸多弊端：(1)抗生素广泛使用，导致Hp耐药菌株日益增多，药物疗效每况日下，临床上同时使用2种或3种抗生素仍难以将其彻底根治。(2)治疗药物存在毒副作用。(3)药物治疗难以避免反复治疗，反复感染的尴尬局面。(4)药物价格昂贵，治疗周期长，病人依从性较差。药物疗法因上述弊端，难以在Hp感染人群中大规模使用，研发有效的预防性和治疗性Hp疫苗具有很好的市场前景，在美国Hp疫苗已被列为21世纪疫苗发展的重大项目之一。

幽门螺旋杆菌通过一些黏附因子黏附胃黏膜，然后释放直接可作用于胃黏膜的一些毒力蛋白(毒力因子)，破坏胃黏膜细胞，导致慢性胃炎、消化性胃溃疡和胃癌等疾病的发生。幽门螺旋杆菌的毒力因子主要涉及以下几类关键蛋白：(1)尿素酶(Ure)。幽门螺旋杆菌含有丰富的尿素酶，约占全菌体蛋白的5％～10％，在Hp内部和表面广泛表达，敲除尿素酶的Hp无法黏附胃黏膜。因此，尿素酶在Hp黏附胃黏膜的过程中发挥重要作用，是Hp一种重要的黏附因子；其次，尿素酶也是Hp一种重要的毒力因子；一般细菌难以在胃部的高酸环境中存活，但Ure能水解尿素产生氨来中和胃酸，并可对胃黏膜造成病理性损伤。尿素酶由A和B两个亚单位(UreA和UreB)组成，二者都是Hp疫苗的理想候选抗原。(2)细胞毒素相关蛋白A(CagA)。CagA是Hp重要的毒力因子之一，可经Cag致病岛编码的IV型分泌系统(Type IVsecretion system，TFSS)注入宿主细胞，通过依赖和或独立于磷酸化的机制，与宿主细胞中调控细胞生长和运动的多种蛋白相互作用，导致宿主细胞功能异常。流行病学研究发现，CagA阳性Hp菌株感染比CagA阴性Hp菌株更易增加十二指肠溃疡和胃癌等严重胃肠疾病发生的危险性。(3)空泡毒素相关蛋白A(VacA)。VacA也是Hp重要的毒力因子之一，其可通过受体介导的内吞作用进入细胞内，导致细胞内空泡样变性；同时能在胞浆膜上形成通道，增强极化上皮单层细胞的渗透性，最终导致细胞死亡。(4)幽门螺旋杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)。NAP是Hp的主要毒力因子之一，对中性粒细胞、单核细胞有趋化作用，导致中性粒细胞浸润胃黏膜，并诱导中性粒细胞NADPH氧化酶激活，产生活性氧中间产物(ROI)，引起黏膜炎症和组织损伤。NAP抗原性强，大多数Hp感染患者产生NAP抗体。其次，NAP是一种很好的Th1型极化细胞免疫佐剂。

本发明的思路如下：根据机体对Hp的免疫保护性机制，合理预测和筛选Hp尿素酶A和B双亚基(UreA和UreB)、细胞毒素相关蛋白A(CagA)和空泡毒素相关蛋白A(VacA)的优势Th和B细胞抗原表位或表位区段和Th1型细胞免疫佐剂NAP，通过生物信息学软件对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE。利用Western Blot、ELISA等多种免疫学方法检测Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE的免疫原性和免疫特异性，研究表明Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE能够激发BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A和B双亚基、CagA、VacA和NAP的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。

发明内容

本发明的第一个方面是提供了一种可针对Hp四种关键毒力因子尿素酶、CagA、VacA和NAP的Hp四价毒力因子多表位疫苗。

本发明的第二个方面是提供了Hp四价毒力因子多表位疫苗的制备方法。

本发明的第三个方面是公布了Hp四价毒力因子多表位疫苗的用途。

本发明的第一个方面是提供了一种针对Hp关键毒力因子尿素酶、CagA、VacA和NAP的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE。该Hp多价表位疫苗主要由Hp尿素酶A和B亚基、CagA、VacA的优势Th和B细胞抗原表位或区段及中性粒细胞激活蛋白(NAP)构成，Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE的整体氨基酸序列如(序列1)所示，其整体核苷酸序列如序列2所示。

本发明的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE具有以下优点：(1)Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE将尿素酶A和B双亚基、CagA和VacA的优势抗原表位或区段和Th1型极化细胞免疫佐剂NAP科学合理地整合在一起，可激发针对Hp四种关键毒力因子尿素酶A和B双亚基、CagA、VacA和NAP的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。(2)Hp关键毒力因子尿素酶、CagA和VacA具有细胞生物学毒性，尤其是CagA和VacA蛋白，其与Hp导致的慢性胃炎、胃溃疡和胃癌密切相关。Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE只含有尿素酶、CagA和VacA的优势Th和B细胞抗原表位或区段，避免了其生物学毒性，且能够激发更高特异性的抗体，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。(3)以尿素酶、CagA、VacA和NAP等制备Hp四价亚单位基因工程疫苗，存在重组蛋白过大，不易表达、提取、纯化等问题，Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE只含有尿素酶、CagA和VacA的优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对分子量较小，易于表达、提取及纯化。(4)Hp毒力因子抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本发明的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE采取“偶联分子内免疫佐剂”和“抗原表位多重拷贝”两种设计思路来增强Hp毒力因子抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的特异性抗体。

本发明的第二个方面是提供Hp四价毒力因子多表位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下：

(1)Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE的结构设计

根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，通过生物信息学软件合理筛选Hp尿素酶A和B双亚基、CagA和VacA的优势Th和B细胞抗原表位及Th1型细胞免疫佐剂NAP，并对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE。

(2)重组表达质粒pET-FVpE(含有融合基因FVpE)的构建

首先基因合成细胞毒素相关蛋白A优势表位区段基因、空泡毒素相关蛋白A优势表位区段基因、尿素酶多表位肽基因(UE)，然后通过分子克隆技术将这些合成基因与中性粒细胞激活蛋白NAP基因拼接成一个融合基因，即为FVpE融合基因；然后将其插入pET28a表达载体中构建重组表达载体pET-FVpE。

(3)重组蛋白FVpE的原核表达及纯化

将重组表达载体pET-FVpE转化进大肠杆菌Arctic Express中，构建重组基因工程菌株Arctic Express/pET-FVpE。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTP镍离子亲和层析能够获得高纯度融合蛋白FVpE，即为Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE。

本发明的第三个方面是提供了Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE的用途。Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。

附图说明

图1：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE的分子结构设计特点。

图2：重组表达质粒pET-FVpE的双酶切鉴定。

泳道M：DNA Marker；泳道1：pET-FVpE/Nco I+Xhol；泳道2：酶切前质粒。

图3：重组蛋白FVpE的原核表达。

泳道M：蛋白质Marker；泳道1：Arctic Express/pET-FVpE全菌蛋白(未经IPTG诱导)；泳道2：Arctic Express/pET-FVpE全菌蛋白(经IPTG诱导1h)；泳道3：Arctic Express/pET-FVpE全菌蛋白(经IPTG诱导2h)；泳道4：Arctic Express/pET-FVpE包涵体蛋白(经IPTG诱导4h)；泳道5：Arctic Express/pET-FVpE可溶性蛋白(经IPTG诱导4h)。

图4：重组蛋白FVpE的Ni-NTA亲和层析纯化。

泳道M：蛋白质Marker；泳道1：FVpE包涵体蛋白(上样蛋白)；泳道2：杂蛋白；泳道3：纯化后的FVpE蛋白样品。

图5：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE诱发抗天然Hp尿素酶抗体的检测。

Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE和天然Hp尿素酶都能诱发较高滴度抗尿素酶抗体。

图6：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE诱发抗UreA抗体的检测。

Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE和Hp尿素酶都能诱发较高滴度的抗UreA抗体。

图7：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE诱发抗UreB抗体的检测。

Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE和Hp尿素酶都能诱发较高滴度的抗UreB抗体。

图8：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE诱发抗CagA抗体的检测。

只有Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE才能诱发较高滴度的抗CagA抗体。

图9：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE诱发抗VacA抗体的检测。

只有Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE才能诱发较高滴度的抗VacA抗体。

图10：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE诱发抗NAP抗体的检测。

只有Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE才能诱发较高滴度的抗NAP抗体。

图11：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE致敏的小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应。

Hp尿素酶A亚基、尿素酶B亚基、CagA、VacA、NAP和FVpE刺激Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞均能发生明显的淋巴细胞增殖反应。

具体实施方式

材料

1.IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50ml离心管中，加入40ml无菌水，充分混匀溶解后，定容至50ml。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2.氨苄青霉素(Amp)贮液(100mg/mL)：称取100mg氨苄青霉素(Amp)溶于1mL无菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3.培养基：(1)LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。(2)LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4.DNA电泳缓冲液(50x TAE)：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA.2H₂O和57.1ml冰乙酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。

5.SDS-PAGE电泳缓冲液(5X)：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS 5.0g；加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6.考马斯亮蓝蛋白染色试剂：(1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用)：考马斯亮蓝G-250 100mg溶解在50ml 95％乙醇中，然后加入86％磷酸100ml，用蒸馏水稀释至1000ml。(2)考马斯亮蓝R-250染液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中。(3)固定液：500ml乙醇、100ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。(4)脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。(5)保存液：25ml 87％甘油溶于225ml脱色液中。

7.RNase A溶液(10mg/ml)：10mg RNase A溶解于987μl水中，加入10μl 1M Tris-HCl(pH7.5)和3μl 5M NaCl，沸水浴15min后，缓慢冷却至室温，分成小份存于-20℃备用。

8.Lysozyme溶液(10mg/ml)：10mg Lysozyme溶于1ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)。

9.实验动物：BALB/c小鼠为SPF级，雄性，8～10周龄，购自宁夏医科大学实验动物中心。

10.ELISA试剂：(1)包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。(2)洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5ml Tween-20，加入ddH2O定容至1000ml(PBST)。(3)封闭液：称取3.0g BSA溶解于100ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。(4)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。(5)终止液：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml(1M H₂SO₄)。

11.淋巴细胞增殖实验主要试剂(1)小鼠脾脏淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司)(2)RPMI-1640完全培养液：在RPMI-1640基础培养液加入10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。(3)RPMI-1640不完全培养液：称取10.4g RPMI-1640干粉、2.4gHEPES、0.75g NaHCO₃，加去离子水至1000ml，pH 7.4，超滤除菌，分装。

13.BHI血平板：称取3.5g BHI干粉，加蒸馏水93ml，1.5g琼脂粉，121℃灭菌13min，待冷却至60℃以下，加入7ml脱纤维羊血，多粘菌素B(终浓度5μg/ml)，万古霉素(终浓度10μg/ml)和甲氧苄氨嘧啶(终浓度5μg/ml)，分装至培养皿，冷却后备用。

14.尿素肉汤：称取葡萄糖1g、蛋白胨1g、磷酸二氢钾2g、氯化钠5g，加蒸馏水1000ml，矫正PH至7.2，再加入2ml 0.4％酚红溶液，高压灭菌(68.95kPa)20分钟，冷至60℃左右时加入已用滤菌器过滤的1ml 50％尿素溶液，混匀后备用。

实例1：幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗FVpE的分子结构设计

根据“机体对Hp的免疫保护性机制”和“Hp尿素酶A和B双亚基、CagA和VacA等关键黏附因子抗原表位或区段的免疫学性质”，通过生物信息学筛选CagA_302-437、VacA_34-79、VacA_365-527、UreA_74-94、UreB_229-251、UreA_183-203、UreB_327-334等抗原表位或区段和Th1型细胞免疫佐剂NAP用于幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗FVpE的构建。然后，通过表位疫苗的构建理论和生物信息学的分析，对所选择的抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和抗原表位拷贝数，加以分析和确定，最终设计出具有科学合理结构的幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗FVpE。经DNAstar和MOE等生物信息学软件分析，FVpE具有较好的等电点、抗原性和高级结构。从设计理论上讲，FVpE能够激发机体产生针对Hp尿素酶A和B双亚基、CagA、VacA和NAP的T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答，能够达到Hp感染性疾病的有效预防和治疗。

结果：幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗FVpE的分子结构设计特点和思路如(图1)所示。

实例2：重组表达质粒pET-FVpE(含有融合基因FVpE)的构建

(1)黏附因子多表位肽FAdE核苷酸序列的基因合成

将前期筛选和设计的CagA优势抗原表位区段(CagA^E)、VacA优势抗原表位区段复合体(VacA^E)、尿素酶优势抗原表位复合体(UE)的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，委托钟鼎生物科技公司进行基因合成。

(2)重组表达载体pET-FVpE的构建

利用分子克隆技术将合成的基因片段(CagA^E、VacA^E和UE)和中性粒细胞激活蛋白NAP基因按照NAP-CagA^E-VacA^E-UE顺序拼接成融合基因，即为FVpE融合基因；然后，将FVpE克隆到pET28a的Nco I和Xho I位点之间，获得重组表达载体pET-FVpE；将重组表达载体pET-FVpE转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子进行双酶切和基因测序鉴定。

结果：利用Nco I/Xho I双酶切待检重组表达载体pET-FVpE，37℃反应2h，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段约为2000bp，与预期结果大小一致。再将pET-FVpE送交钟鼎生物科技公司，采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序，证明pET-FVpE中融合基因FVpE的核苷酸序列完全正确，且无移码突变。重组表达载体pET-FVpE双酶切图谱如(图2)所示。

实例3：重组蛋白FVpE的原核表达

将验证正确的重组表达质粒pET-FVpE转化进Arctic Express菌株中。在预先制备好的含50μg/ml Kan的LB平板上，接种环划线基因工程菌株Arctic Express/pET-FVpE，倒置于37℃培养箱，过夜培养12～16h后，挑取单个菌落，接种于含50μg/ml Kan的3ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；次日按1∶100接种于50μg/ml Kan的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)。取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220rpm振摇4h，诱导FVpE融合蛋白表达。取出1ml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。最后，进行10％SDS-PAGE分析。

结果：将基因工程重组菌株Arctic Express/pET-FVpE在PH值为7、IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导温度37℃、诱导表达4h。与对照菌株对比，基因工程重组菌株ArcticExpress/pET-FVpE在约72.2KD处出现目的蛋白条带，与重组蛋白FVpE的理论大小相符合(图3)。重组蛋白FVpE主要以包涵体蛋白的形式存在。

实例4：重组蛋白FVpE的纯化

利用低压层析系统，重组蛋白FVpE包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱。用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜。最后，进行10％SDS-PAGE分析

结果：经Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析纯化后，可获得高纯度重组蛋白FVpE，纯度为97.1％(图4)。

实施例5：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE的免疫原性和免疫特异性研究

(1)BALB/c小鼠的免疫

实验分组：将SPF级BALB/c小鼠随机分为3组，分别为Hp尿素酶(Ure)免疫组、Hp 四价毒力因子多表位疫苗(FVpE)免疫组和PBS免疫组。每组6只BALB/c小鼠，共18只，详细分组如下表所示：

表1：SPF级BALB/c小鼠分组及免疫方案

免疫方式：用75％酒精对小鼠腹部消毒，然后腹腔注射重组蛋白和弗氏完全佐剂的混合乳化剂；每隔一周加强免疫一次，第2和3周加弗氏不完全佐剂，第4周直接注射重组蛋白溶液加强免疫。

抗血清的采集：在每次免疫前采取尾部静脉采血，检测血清特异性抗体水平的变化；在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，-70℃冻存备用。

(2)抗血清中特异性抗体的ELISA检测

将抗原(天然Hp尿素酶、UreA、rUreB、CagA、VacA、NAP)用包被液稀释成5μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清(鼠抗Ure抗血清、鼠抗FVpE抗血清)和小鼠阴性血清按照1∶4000稀释后加入ELISA板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10000)，100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应15min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD₄₅₀值。

结果：天然Hp尿素酶(Ure)的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE能够产生与Hp尿素酶(Ure)相近水平的抗尿素酶抗体(图5)；Hp尿素酶A亚基(UreA)的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE和尿素酶(Ure)免疫组能够产生相近水平的抗UreA抗体(图6)；Hp尿素酶B亚基(UreB)的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE和尿素酶(Ure)能够产生相近水平的抗UreB抗体，而霍乱毒素B亚基(CTB)不能产生抗UreB抗体(图7)；CagA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE能够产生较高水平的抗CagA抗体(图8)；VacA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE免疫组能够产生较高水平的抗VacA抗体(图9)；NAP的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE能够产生较高水平的抗NAP抗体(图10)。

上述结果说明Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE能够刺激机体产生针对Hp尿素酶、尿素酶A亚基、尿素酶B亚基、CagA、VacA和NAP的高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性。

(3)小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

将经抗原免疫的小鼠脱臼处死，泡75％酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏(暗红色)。在20ml的无菌小烧杯中放入4～5ml EZ-Sep^TM Mouse 1X淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入到淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μl的1640培养基；800g离心30min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基制备成一定浓度的细胞悬液(5x 10⁶/ml)。在96孔平底培养板中，每孔加入100μl细胞，同时加入重组蛋白FVpE、尿素酶A亚基(UreA)、尿素酶B亚基(UreB)、CagA、VacA、NAP和生理盐水各100μl，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃5％CO₂培养箱中培养60h后，向各孔中加入MTT溶液(5mg/ml)30μl，继续培养4h后，轻轻吸出上清，每孔加入DMSO 100μl振荡混匀后用酶标仪读取OD₅₇₀值。刺激指数计算公式如下：

结果：Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经Hp尿素酶A亚基、Hp尿素酶B亚基、CagA、VacA、NAP和FVpE刺激均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE关键毒力因子的Th表位或区段均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答(图11)。

Claims

1.一种幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其特征在于：活性成分是一条多肽，包括幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白A(CagA)的优势Th和B细胞抗原表位区段、空泡毒素相关蛋白A(VacA)的优势Th和B细胞抗原表位区段、尿素酶A和B亚基的优势Th和B细胞抗原表位肽及中性粒细胞激活蛋白(NAP)，其氨基酸序列如序列1所示。

2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其特征在于：其核苷酸序列如序列2所示。

3.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其特征在于：幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白A(CagA)的优势Th和B细胞抗原表位区段其氨基酸序列如序列3所述。

4.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其特征在于：幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白A(CagA)的优势Th和B细胞抗原表位区段其核苷酸序列如序列4所述。

5.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其特征在于：幽门螺旋杆菌空泡毒素相关蛋白A(VacA)的优势Th和B细胞抗原表位区段其氨基酸序列如序列5所述。

6.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其特征在于：幽门螺旋杆菌空泡毒素相关蛋白A(VacA)的优势Th和B细胞抗原表位区段其核苷酸序列如序列6所述。

7.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其特征在于：能够激发机体产生针对尿素酶A和B双亚基、细胞毒素相关蛋白A(CagA)、空泡毒素相关蛋白A(VacA)和中性粒细胞激活蛋白(NAP)的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体。

8.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其特征在于：可以用作预防和治疗幽门螺旋杆菌感染的药物组合。

9.包含权利要求2中所述的核苷酸序列的表达载体，转基因细胞系及宿主菌。

10.一种幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

首先合成细胞毒素相关蛋白A(CagA)优势抗原表位区段基因、空泡毒素相关蛋白A(VacA)优势抗原表位区段基因、尿素酶A和B亚基多表位肽基因，然后通过分子克隆技术将这些合成基因与中性粒细胞激活蛋白(NAP)偶联起来，构建如序列2所示核苷酸序列的融合基因FVpE，并进一步构建含有融合基因FVpE的重组表达载体pET-FVpE及其重组基因工程菌，重组基因工程菌株发酵后，经Ni-NTA镍离子交换层析纯化获得该疫苗的融合蛋白FVpE。