CN100535116C

CN100535116C - 幽门螺杆菌尿素酶b亚单位b细胞抗原表位多肽与应用

Info

Publication number: CN100535116C
Application number: CN 200710078172
Authority: CN
Inventors: 毛旭虎; 邹全明; 李海侠; 吴亚男; 石云; 罗萍; 张卫军; 余抒; 陈洪章; 郭刚; 童文德; 吴超; 周维英; 鲁东水; 刘开云
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2007-02-05
Filing date: 2007-02-05
Publication date: 2009-09-02
Anticipated expiration: 2027-02-05
Also published as: CN101033468A

Abstract

本发明提供了一个来自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽与应用，确定了抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6所对应的抗原表位，并且证实此B细胞表位为单克隆抗体6E6所识别的特异性抗原表位；本发明还提供了包含此B细胞表位及载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)的嵌合表位疫苗及其制备方法，此B细胞表位具有较强的抗原性。本发明的B细胞表位作为活性成分制成的疫苗或药物，可以起到预防或清除幽门螺杆菌感染的作用，在医药领域具有广阔的应用前景。

Description

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽与应用

技术领域

本发明涉及生物制药和基因工程领域，特别是涉及来自幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位蛋白的一个中和性B细胞抗原表位多肽及其编码的DNA，以及鉴定此中和性B细胞抗原表位的方法与其在医药生物技术领域的应用。

背景技术

1982年澳大利亚学者Warren和Marshall首先从人胃粘膜中分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)，他们的发现使得在过去的20多年中，对于溃疡病的认识和治疗发生了很大的变革。2005年10月3日，诺贝尔奖评审委员会宣布，将2005年度诺贝尔生理学和医学奖授予这两位澳大利亚科学家，以表彰他们发现了幽门螺杆菌(Hp)以及这种细菌在胃炎和胃溃疡等疾病中的作用。研究已证实Hp是慢性胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子，与胃癌的发生密切相关，世界卫生组织已经把Hp列为胃癌的I类致病因子。有效的治疗和根除Hp感染已成为人们关注的焦点。

Hp是人类感染率最高的慢性致病菌，流行病学调查显示全世界成年人中有50％携带有该菌，因此要克服该致病菌的危害仅仅被动治疗是难以实现的，与其他传染病一样免疫接种将是预防该菌感染的最有效方法.1991年Czinn et al获得了免疫接种的第一证据.他们把Hp的粗制抗原加上佐剂霍乱毒素(CT)经口服途径免疫小鼠，实验组比对照组产生高得多的局部粘膜IgA反应.随着研究的深入，人们所利用的Hp抗原包括超声粉碎抗原，纯化尿素酶全酶，尿素酶亚单位，纯化的细胞空泡毒素(VacA)，热休克蛋白等，其中尿素酶已证实为一种有效的保护性抗原而成为疫苗的首选抗原。Hp尿素酶是Hp的最主要的抗原成份，它能够刺激机体产生强烈的免疫反应。免疫佐剂CT或大肠杆菌毒素能够引起局部粘膜免疫反应以提高免疫保护效果。目前尿素酶疫苗预防Hp感染已在许多动物模型上获得成功.

目前临床主要采用抗生素多联疗法治疗Hp感染，虽然可以达到85％的根除率，但存在以下缺点：1、药物疗法毒副作用大；2、复杂的联合用药导致病人的依从性差；3、药物不能防止Hp的再感染；4、抗生素治疗易产生耐药性而导致治疗失败；5、对发展中国家病人而言，药物疗法在经济上也较困难。免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法，鉴于Hp感染的高发病率及其与慢性胃炎、消化性溃疡以及胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的密切关系，如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的，一直是各国科研人员研究的重点问题。疫苗接种通过有效地调动机体的免疫系统，克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染细菌的目的，经济而简便，可在人群中大规模运用，并且对耐药细菌仍然有效，因此研究幽门螺杆菌疫苗具有重要的意义。

动物实验研究表明，疫苗接种可以减少Hp在胃粘模定植，并减轻胃粘膜的炎症反应，起到预防和治疗Hp感染的作用。目前关于Hp的疫苗研究多是采用全菌疫苗或重组亚单位疫苗及核酸疫苗等，其引发的免疫应答与Hp自然感染时的免疫应答相似。Hp自然感染时体内产生强烈的细胞与体液免疫应答，但是感染仍慢性持续化甚至终身感染，说明机体已经对Hp存在免疫耐受，自然感染时产生的免疫应答不能起到保护作用，因而通过疫苗接种的方式清除Hp就必须在抗原选择以及表位水平对抗原进行改造，激发更有效的免疫应答。表位疫苗是近年随分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗形式，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，并且其具有低变应原性、生产成本低、副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个新的方向，广泛应用于病毒、肿瘤、及慢性感染性疾病的免疫预防和治疗。并且目前很多多肽疫苗倾向于与T细胞或B细胞表位交联，从而构建一个嵌合表位疫苗而发挥作用。借鉴表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，以Hp表位为基础设计的疫苗有可能打破机体的免疫耐受，达到预防和治疗Hp感染的目的。

尿素酶(Urease)是Hp的主要致病因子，对Hp在人胃粘膜定居起着重要作用，在胃部的酸性环境中，一般细菌很难存活，但是Hp的尿素酶能够水解尿素而释放氨，在菌体周围形成一层“氨云”保护Hp抵抗胃酸而在胃粘膜定植，并且释放的氨能直接损害胃粘膜。尿素酶在Hp菌体中的含量高，占可溶性蛋白的6％，由A和B两个亚单位组成，其中B亚单位(UreB)为尿素酶活性亚基，在各菌株中相对保守，研究证实UreB具有很强的抗原性，是较好的Hp疫苗的候选抗原。目前关于Hp的表位研究主要是针对尿素酶的B细胞表位开展的，研究发现针对尿素酶B亚单位(UreB)不同表位的单抗可以抑制尿素酶的活性，从而阻断幽门螺杆菌的感染。近些年来，很多学者通过一些生物信息学软件来分析一些蛋白的氨基酸序列，预测其T细胞或B细胞表位，但预测的准确率仅有50％左右，因此建立一种准确有效的筛选B细胞表位的方法显得尤为重要。因此本发明从鉴定Hp的尿素酶B亚单位的B细胞表位入手，研究预防和治疗Hp感染的方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位(UreB)中和性B细胞抗原表位多肽。

其中上述表位多肽，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸残基；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有诱导产生幽门螺杆菌尿素酶B亚单位抗原特异性的细胞或体液免疫应答作用的多肽；

3)序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列所对应的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明中的一较佳实施例中采用的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位中和性B细胞抗原表位多肽，名称为U_211-225，来源于幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)上第211-225位氨基酸残基，具有序列表中SEQ ID No：1的15个氨基酸残基序列。

含有本发明表位肽DNA的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的内容。

扩增本发明表位肽DNA中的引物对也为本发明的内容。

本发明的另外一个目的在于提供一种鉴定上述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽的方法，该方法是通过应用生物信息学软件对Hp的UreB蛋白氨基酸序列进行分析的基础上，经过综合考虑各项参数，选择性的将UreB蛋白分成5段，分别克隆、构建、诱导和表达，通过SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，初步确定抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6所针对的抗原表位所在区域，步移合成法合成4条长度为15个氨基酸的表位多肽，以此获得抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6针对的抗原B细胞抗原表位。

上述方法主要包括以下步骤：

1)将通过生物信息学软件分析的Hp的UreB抗原采用截短法分段构建，将重组表达载体导入宿主细胞进行诱导表达，确定单抗6E6所针对的表位范围；6E6抗体是由本实验室人员制备，其特征如序列表中SEQ ID NO：3所示。

(1)培养幽门螺杆菌(HPNCTC11637)，并抽提其基因组；

(2)DNASTAR软件分析UreB蛋白氨基酸序列，分段构建UreB重组抗原，并分别命名为U12，U13，U47，U15，U16；

(3)克隆幽门螺杆菌NCTC11637的U12，U13，U47，U15，U16的编码基因；

(4)构建U12，U13，U47，U15，U16基因的原核细胞表达质粒；

(5)测定重组融合基因的序列；

(6)诱导基因重组工程菌表达获得目的蛋白；

(7)免疫印迹分析，初步确定幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6所针对的抗原表位所在区域；

2)根据上述步骤1)所确定的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6所针对的抗原表位所在范围，步移合成表位肽。

3)根据上述步骤2)合成的表位肽，通过表位作图(间接ELISA和斑点印迹)方法，确定幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6所对应的表位肽。

其中，根据上述步骤2)中步移合成的表位肽，涵盖了6E6单抗识别的表位范围，相互重叠5个氨基酸残基，合成的每条表位肽包含15个氨基酸。

本发明涉及5个来自Hp的UreB抗原，上述这些分段的抗原选自下组：具有序列表中SEQ ID NO：4、5、6、7、8氨基酸序列的蛋白，经DNASTAR软件预测分析是具有良好抗原性、疏水性、柔韧性和可及性的蛋白肽段，其具有如下特征：

1)具有序列表中SEQ ID NO：4、5、6、7、8的核苷酸序列。

2)序列表中SEQ ID NO：4、5、6、7、8编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：44、55、66、77、88所示。

其中含有本发明分段抗原编码核苷酸序列的载体，包括裸DNA，以及转入包含该5段分段抗原核苷酸序列载体的原核或真核表达宿主菌、扩增本发明UreB分段基因中的引物对均属于本发明内容。

本发明中所述的原核细胞可为大肠杆菌，如E.coliBL21、E.coliM15、E.coliJM109、或E.coliDH5α等。

本发明中所述的真核细胞可为哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞等，包括COS-7、CHO、BHK-21或Pichia pastoris等。

本发明中的用于构建含有Hp尿素酶B亚单位分段抗原编码DNA的重组表达载体的出发载体可为pET系列、pGEX系列、pMAL系列、pBluescriptSK+的出发载、pTrx、pTrxFus、pQE-30、pCAT3、pβ-gal系列、pcDNA3.1(+/-)、pCMV系列、pCMVScript、pd2EGFP系列、PGL3系列、或pPIC系列等。

本发明中的培养含有本发明的Hp尿素酶B亚单位分段抗原编码DNA的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

本发明的另外一个目的在于提供一种活性成分为上述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的B细胞抗原表位多肽的嵌合表位疫苗及其制备方法。

上述疫苗为人工合成表位肽与载体蛋白偶联后制备的嵌合表位疫苗，该嵌合表位疫苗包含序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列和载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)。

上述嵌合表位疫苗的构建方法，采用上述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽与载体蛋白进行化学偶联，主要步骤如下；

1)人工合成编码6E6单克隆抗体识别的抗原表位氨基酸序列，以下用epi表示此表位的氨基酸序列；

2)构建Epitope-BSA共价偶联物；

3)将偶联物在缓冲液中透析，除去未偶联上的小分子多肽，以便得到纯的偶联蛋白；

4)此偶联物即为二价的嵌合表位疫苗。

本发明的表位疫苗也可以以基因工程重组的方法获得，也可以是裸DNA疫苗，或者是将表位肽及其表位疫苗通过重组到其他载体上获得，如减毒沙门氏菌，痘病毒载体，病毒样颗粒。

需要的时候，在上述疫苗中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的嵌合表位疫苗中包含的表位氨基酸残基数目的增减、额外的表位的添加以及表位疫苗中包含的表位的串连拷贝数的增加等都属于本发明的范围。

本发明的表位疫苗具有良好的免疫原性，在小鼠动物模型中可以诱导产生针对此B细胞表位的特异性体液免疫应答，即产生针对B细胞表位的抗体。

本发明还涉及采用血清学分析方法鉴定临床感染幽门螺杆菌患者血清中是否有针对此幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞表位多肽的抗体。经动物试验证实，此B细胞表位具有较强的抗原性，产生的抗血清不仅具有中和尿素酶活性的效应，并且还能与不同Hp天然菌株的尿素酶B亚单位蛋白发生特异性抗原抗体反应。

本发明还有一个目的，在于提供一种用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物，该药物的活性成分为上述幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽。

本发明中B细胞表位作为活性成分制成的疫苗或药物，可以起到清除幽门螺杆菌感染的作用，在医药领域具有广阔的应用前景。

本发明的主要优点在于：用生物信息学软件分析加实验鉴定的方法快速，准确，经济，避免大量合成表位多肽，减少费用。获得了具有中和Hp尿素酶活性的6E6单克隆抗体对应的抗原表位，可安全有效的引起针对Hp的体液免疫应答。获得此B细胞表位肽不仅对Hp发病机制的研究，而且对疫苗以及治疗制剂的研制均有重要的意义。此外获得一种基于表位肽和载体蛋白偶联的嵌合表位疫苗，动物实验中显示了良好的免疫原性，特异性好，具有良好的应用前景。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明：

图1为本发明的目的基因U12，U13，U47，U15和U16的PCR克隆扩增。

泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，

泳道2为目的基因U12的PCR扩增产物(900bp)；

泳道3为目的基因U13的PCR扩增产物(300bp)；

泳道4为目的基因U47的PCR扩增产物(420bp)；

泳道5为目的基因U15的PCR扩增产物(690bp)；

泳道6为目的基因U16的PCR扩增产物(780bp)。

结果表明目的基因U12，U13，U47，U15，U16的PCR克隆扩增效果良好。

图2是U12，U13，U47，U15，U16重组表达质粒的酶切鉴定。

泳道1为7000bp核酸(DNA)分子量标准(Marker)；

泳道2为1500bp核酸(DNA)分子量标准(Marker)；

泳道3为pET-11c空载体质粒BamHI单酶切产物(5675bp)；

泳道4为重组质粒pET11c-U12NdeI和BamHI双酶切鉴定产物(900bp)；

泳道5为重组质粒pET11c-U13NdeI和BamHI双酶切鉴定产物(600bp)；

泳道6为重组质粒pET11c-U47NdeI和BamHI双酶切鉴定产物(420bp)；

泳道7为重组质粒pET11c-U15NdeI和BamHI双酶切鉴定产物(690bp)；

泳道8为重组质粒pET11c-U16NdeI和BamHI双酶切鉴定产物(780bp)。

图3是U12，U13，U47，U15，U16基因重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE电泳图。

泳道1为蛋白质分子量标准(Marker)；

泳道2为空载体菌诱导前0hr；

泳道3为空载体菌诱导4hr；

泳道4为基因重组菌U12诱导4hr；

泳道5为基因重组菌U13诱导4hr；

泳道6为基因重组菌U47诱导4hr；

泳道7为基因重组菌U15诱导4hr；

泳道8为基因重组菌U16诱导4hr；

图4基因重组菌与单克隆抗体6E6免疫印迹图。

泳道1为本室构建的UreB414与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道2为不相关蛋白BSA(牛血清白蛋白)与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道3为重组UreB全蛋白与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道4为空载体菌pET11c与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道5为基因重组工程菌pET11c-U16与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道6为基因重组工程菌pET11c-U15与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道7为基因重组工程菌pET11c-U47与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道8为基因重组工程菌pET11c-U13与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道9为基因重组工程菌pET11c-U12与mAb6E6蛋白印迹分析；

泳道10为蛋白质分子量标准(Marker)。

图5mAb 6E6与合成肽表位作图。

图6(B)斑点印迹

1泳道为合成多肽U201-215aa与mAb 6E6的斑点印迹分析；

2泳道为合成多肽U206-220aa与mAb 6E6的斑点印迹分析；

3泳道为合成多肽U211-225aa与mAb 6E6的斑点印迹分析；

4泳道为合成多肽U216-230aa与mAb 6E6的斑点印迹分析；

5泳道为基因重组蛋白UreB(阳性对照)与mAb 6E6的斑点印迹分析；

6泳道为BSA(阴性对照)与mAb 6E6的斑点印迹分析。

图7合成表位的拮抗试验。

图8表位肽，表位肽与BSA偶联的表位疫苗免疫动物后抗血清效价测定图。

图9抗血清与不同Hp菌株尿素酶B亚单位蛋白的Western blot分析

1泳道为Hp菌株NCTC11637尿素酶B亚单位蛋白与抗血清的免疫印迹分析；

2泳道为Hp菌株26695尿素酶B亚单位蛋白与抗血清的免疫印迹分析；

3泳道为Hp菌株SS1尿素酶B亚单位蛋白与抗血清的免疫印迹分析；

4泳道为Hp临床分离菌株9806尿素酶B亚单位蛋白与抗血清的免疫印迹分析；

5泳道为Hp纯化重组尿素酶B亚单位蛋白与抗血清的免疫印迹分析；

6泳道为阴性对照牛血清白蛋白与抗血清的免疫印迹分析；

图10显示的是单克隆抗体6E6抑制幽门螺杆菌尿素酶活性的时间依赖曲线。

图11合成表位U211-225的血清学试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，及对本发明表位肽的利用都属于本发明要求保护的范围。

本发明的思路如下：最初的研究以本教研室已经制备的抗幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6为基础，以BALB/c小鼠为动物模型，制备了在BALB/c小鼠的动物模型上研究Hp的表位嵌合疫苗。本发明应用生物信息学软件DNASTAR分析Hp尿素酶B亚单位的氨基酸序列，尽量保证不破坏其高抗原性和高亲水性区域，采用截短方法分段构建了UreB抗原，分别命名为U12，U13，U47，U15，U16，并以基因重组工程菌诱导表达和免疫印迹分析，初步确定单克隆抗体6E6所对应的抗原表位所在区域。采用步移合成法，合成表位多肽，通过表位作图，确定单克隆抗体6E6具体对应的表位氨基酸序列。通过拮抗试验，检测表位能否抑制单克隆抗体中和尿素酶的活性。本发明人还收集了临床感染Hp患者的血清，观察了此B细胞表位肽对人产生的抗体作用，发现B细胞表位肽也可以和人的抗体发生阳性反应。因此本发明的B细胞表位肽可以用来研制人或小鼠用的Hp表位疫苗，并可以用来开发预防或治疗Hp感染的多肽药物。

材料的准备

1、重组幽门螺杆菌Hp尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6为本发明单位制备。申请号：200510057034.5

2、实验动物：BALB/c小鼠：6-8周龄，SPF级，雌性，体重18-22g，购自第三军医大学实验动物中心。

3、合成多肽：用二甲亚砜(DMSO)溶解成5mg/ml的浓度，-70℃保存，临用时用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成0.5mg/ml。

4、弗氏佐剂：弗氏完全佐剂：石蜡油(1份)+羊毛脂(1份)+灭活卡介苗1支，弗氏不完全佐剂：石蜡油(1份)+羊毛脂(1份)

5、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。

6、LB固体培养基：1.5g琼脂粉加入100ml LB培养液中，高压蒸气灭菌后(15磅20min)倾倒平板。

7、DNA电泳缓冲液(50×TAE)：Tris 242g，冰乙酸57.1ml，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g，加水至1000ml即可，应用浓度为1×TAE。

8、EB溶液：EB贮存液(10mg/ml)，0.2g EB溶解于20ml H₂O中，混匀后于4℃避光保存。

9、EB染色液：10μl EB贮存液，100ml 1×TAE缓冲液

10、PBS缓冲液(pH7.2)：Na₂HPO₄14mmol，NaH₂PO₄6mmol，NaCl₂9g，加蒸馏水到1L

11、NdeI、BamHI 中国大连Takara公司

12、DNAmaker 中国鼎国公司

13、质粒抽提试剂盒 Omega公司

14、考马斯亮兰R-250快速染色系统(参考《精编分子生物学实验指南》)。染色液：0.29g考马斯亮兰R-250溶于250ml下述脱色液中。脱色液：250ml 95％乙醇和80ml冰乙酸，加双蒸水至1000ml。

15、TE buffer(pH 8.0)：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA

16、ELISA试剂的配制

1)包被液：0.05mmol/L碳酸盐缓冲液pH9.6：Na₂CO₃ 1.6g，NaHCO₃ 2.9g，NaN₃ 0.2g，加蒸馏水至1000ml

2)抗体稀释液：10mmol/L PBS(pH7.3)；0.05％Tween-20；0.5％BSA

3)封闭液：10mmol/L PBS(pH7.3)；2.0％BSA

4)洗涤液：10mmol/L PBS(pH7.3)；0.05％Tween-20

5)底物液：0.1mmol/LNa₂HPO₄ 5.12ml；0.05mmol/L柠檬酸4.86ml；OPD 4mg；30％H₂O₂5μl；加水至100ml。

17、偶联试剂的配制

1)硼酸盐缓冲液

0.1mol/L，pH8.5：18.55g硼酸，2850mlH₂O，10mol/LNAOH调校至pH8.5，最后补水至3L；

0.1mol/L，pH10：0.618g硼酸，95mlH₂O，10mol/LNAOH调校至pH10，最后补水至100ml；

2)用pH10的硼酸盐缓冲液配制0.3％的戊二醛：30ul戊二醛溶液溶于10mlpH10的硼酸盐缓冲液；

3)1mol/L甘氨酸：

18、Western blot试剂的配制

1)TBS缓冲液：100mmol/L Tris.cl，pH7.5，0.9％NaCl；

2)TTBS：0.1％(V/V)Tween20溶于TBS缓冲液中，于4℃保存备用；

3)丽春红染液：0.5g丽春红(Ponceans)融解于1ml冰醋酸中，加水至100ml，临用时配制；

4)电转液：在500ml去离子水中加入3.03gTris碱和14.41g甘氨酸，再加入200ml甲醇，并补水至1L，溶液pH值约为8.3-8.4；如果用PVDF膜，甲醇浓度应降至15％，如果用尼龙膜，可不加甲醇；

实施例1、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)5个分段抗原U12，U13，U47，U15，U16编码基因的克隆

1、HP的培养

将HP菌株NCTC11637接种于20mlHP专用液体培养基上，于37℃，含5％O₂，85％N₂，10％CO₂的微需氧条件下培养24小时。

2、幽门螺杆菌(Hp)NCTC11637基因组DNA的制备：(按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书操作)

1)取细菌培养液1-5ml.10000rpm离心1分钟，尽量吸尽上清。

2)向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

3)向管中加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混匀。

4)加入220ul缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)加220ul无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入500ul去蛋白液GD(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液GW(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

9)向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液。

10)吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去处除。将吸附柱CB3置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液体。

11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul经65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心30秒。

12)离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。此时得到的溶液即为HP基因组DNA溶液。

3、采用PCR方法自Hp基因组扩增U12，U13，U47，U15，U16的编码基因。

1)运用DNASTAR软件分析UreB蛋白序列，确定分段位点，为保证不破坏UreB的高亲水性和抗原性区域，分段位点分别为UreB蛋白的200aa，230aa，250aa，260aa，300aa，390aa位置处。

2)引物设计合成如下(下划线示酶切位点)

根据GeneBank公布的UreB(ACCESSION NCTC11637)基因序列和引物合成原则设计引物，引入酶切位点，引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7的具体序列如序列表中SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15所示。其中P1和P4作为上游引物引入NdeI酶切位点，P2，P3，P5，P6，P7作为下游引物引入BamHI酶切位点。

3)目的基因的PCR扩增：

以幽门螺杆菌HP基因组DNA为模板，以P1和P2，P1和P3，P4和P7，P1和P5，P1和P6分别扩增U12，U13，U47，U15，U16基因片段，采用如下的PCR体系和程序：

在500ul微量离心管中加入下列试剂：

模板DNA 2ul

10×PCR缓冲液 5ul

dNTPs(10mmol/L) 4ul

氯化镁 4ul

上、下游引物(0.025mmol/L)各 1ul

Taq DNA聚合酶(5U/u1) 1ul

加去离子水至终体积 50ul

混合后加入矿物油3滴

反应条件：94℃预变性5分钟后，94℃，30秒；55℃30秒；72℃65秒；30个循环周期，然后72℃延伸10分钟。

4)PCR产物的克隆

采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞：TA克隆及双链DNA测序，介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法，中国免疫学杂志，1994，10(1)：5)。

5)PCR产物的序列分析

将TA克隆转化菌株送至上海英俊公司，按常规方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港实验室出版社1989聚丙烯酰胺凝胶电泳1.21-1.32)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。

PCR扩增结果如图1所示，表明目的基因U12，U13，U47，U15，U16的PCR克隆扩增效果良好，分别扩增出了900bp，600bp，420bp，690bp和780bp大小的目的片段。

实施例2幽门螺杆菌HP尿素酶的U12，U13，U47，U15，U16表达质粒的构建及高效表达工程菌的构建及筛选

1、重组质粒的构建

将U12，U13，U47，U15，U16基因扩增(PCR)产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳、胶回收纯化后与载体pMD-18T连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，分别用NdeI和BamHI双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将含U12，U13，U47，U15，U16目的基因的pMD-18T载体及pET-28a(+)用NdeI和BamHI双酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳、目的片段胶回收纯化后，用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，NdeI和BamHI双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

酶切鉴定结果如图2所示，酶切片段大小与设计基本一致，初步证明重组质粒构建成功。

有关操作具体步骤如下：

1)质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒)

(1)挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。

(2)取4ml菌液于5mL离心管中，12000g离心2分钟，留取沉淀。

(3)每管加250μl Solution I悬浮，充分混匀。

(4)加入250μlSolutionII，轻柔颠倒混匀4-6次。

(5)加入350μlSolutionIII，轻柔颠倒混匀4-6次。

(6)4℃、12000g离心10分钟，将上清移至分离柱中。

(7)12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液。

(8)加入500μl Hb buffer于分离柱中，12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液。

(9)加入750μl DNA wash buffer(加入无水乙醇)，12000g离心1分钟，重复一次。空柱离心12000g，2分钟。

(10)室温放置5-10分钟，使乙醇完全挥发。

(11)将分离柱置于另一干净1.5ml的Ep管中并加入50μl的ddH₂O(55℃预温)，12000g离心1分钟。收集洗脱液即为抽提的质粒，取一定量的洗脱液进行电泳，其余置于-2℃保存备用。

2)琼脂糖凝胶电泳：

1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120-150mA，电泳20-40分钟。

50×TAE储存液配方：2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，1.0mol/L Na₂EDTA；用冰醋酸调节pH至8.3。

3)质粒DNA双酶切鉴定反应：

用NdeI和BamHI双酶切鉴定，酶切体系如下：

质粒 6μl，

NdeI 0.5μl，

BamHI 0.5μl，

10×buffer(K) 1μl，

ddH₂O 2μl，

混匀，37℃水浴1小时，1.0％的琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

4)琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化：(使用Omega公司胶回收试剂盒)

(1)在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1.5mlEP管中；

(2)加入700ul DNA binding buffer，65℃水浴使凝胶完全融化并保持溶液pH值在5.0-6.0之间；

(3)将溶胶液移入分离管中，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；

(4)加入500ul Washing buffer，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，并重复洗涤一次；

(5)12000g空离心1分钟，分离管移置另一干净1.5ml EP管，加入一定体积的TE buffer洗脱，65℃孵育10分钟，12000g离心1分钟；

(6)取一定量洗脱液电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化结果；

5)连接反应(使用Takara公司连接试剂盒)

通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2-10的原则，设计连接反应体系如下：

目的DNA 1ul

质粒载体 1-2ul

Ligation solution 5ul

ddH₂O 2-3μl

总体积 10ul

反应条件：16℃连接12-16小时。

6)感受态细菌的制备(CaCl₂法)：

(1)无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。

(2)挑取单个菌落接种于5ml LB培养液中，37℃摇床过夜培养。

(3)将过夜培养的BL21按1％比例转种至10ml LB培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.2～0.4时，取4ml菌液转移到5ml离心管中，冰浴10分钟，

(4)5000转离心10分钟，弃上清。

(5)加入1mL冰预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰水浴1小时。5000转离心10分钟，弃上清。加入100μl冰预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。

7)连接产物转化

(1)取感受态菌液100μl，加入连接反应产物10μl，对照管中不加连接产物；冰水浴45分钟，42℃水浴热休克90秒，迅速放置冰水浴2分钟。

(2)加100μl LB培养液，37℃摇床培养复苏1小时。

(3)以8000g离心10分钟，吸弃100μl上清后混匀沉淀，各取50μl涂布Amp⁺-LB平板，37℃孵箱培养过夜。

2、高效表达重组蛋白工程菌的构建及筛选

将分别含U12，U13，U47，U15，U16基因的重组质粒pET-11c(+)转化大肠杆菌BL21并提取质粒进行酶切鉴定。基因工程大肠杆菌BL21的感受态菌制备、转化及重组菌的质粒抽提酶切鉴定同前。

取鉴定无误的重组菌接种于3ml含Amp⁺的LB培养液中，3℃摇床培养过夜。次日，将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20ml含Amp⁺的LB培养液中，3℃摇床培养2.5小时，以终浓度为1mmol/L的IPTG诱导4小时，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株。

诱导表达鉴定结果如图3所示，表明基因重组菌经过诱导后，分别在分子量33KDa，22KDa，15KDa，26KDa，29KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量大小一致。

实施例3抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6抗原识别表位的初步鉴定

1、采用免疫印迹试验鉴定6E6单克隆抗体识别的表位所在区域。

Western blot具体操作步骤如下：

1)SDS-PAGE电泳

取已经处理的样品重组菌pET11c-U12，pET11c-U13，pET11c-U47，pET11c-U15和pET11c-U16，以空载体工程菌pET11c和不相关蛋白为阴性对照，以纯化的重组蛋白UreB为阳性对照，并设定蛋白质分子量标准，在5％浓缩胶，15％分离胶上进行垂直SDS-PAGE，先行60V电泳，待样品跑过浓缩胶后，加压至120V，2-3小时，直至样品跑到分离胶底部。

2)转膜

(1)电泳结束后，在SDS电泳所用的盒中，倒入电转液，将海绵放入浸湿后挤于水，把海绵放入夹子中，取滤纸6张浸润，同时将NC膜也浸泡于电转液中10分钟。

(2)将浸润的滤纸放置夹板的海绵上，每边3张，用玻璃棒挤干，不留气泡。

(3)把NC膜放在电泳后的玻片上，将胶切下，使之贴在NC膜上，然后把NC膜轻轻放在滤纸上，胶在NC膜上，挤干水，不留气泡，做成三明治状，所有纸的边缘与夹板边缘对齐。

(4)把三明治插入电转槽中，胶朝阴，NC膜朝阳，加入电转液至NC膜的位置。

(5)加电压60V，电转3小时。(电转过程中由于电压过高需加冰袋冰浴)

3)染色

转膜结束后，取出NC膜，用配制的丽春红染色1分钟，至Marker条带清晰显现，用清水终止显色反应，然后用铅笔标出每一条Marker条带，最后将NC膜置于平皿中，TTBS洗涤3次，每次5分钟。

4)封闭

0.5g BSA加入10mlTTBS中(即按5％比例)配成封闭液，将NC膜洗干净后加入封闭液，封保鲜膜，放在摇床上，封闭1小时，然后放4℃冰箱封闭过夜。

5)免疫印迹

(1)弃去封闭液，用洗涤液TTBS漂洗膜4次，每次10-15分钟。

(2)清洗干净后，加入以洗液1∶2000稀释的6E6单抗腹水，3℃，150rpm，轻轻振摇反应1小时。

(3)弃去一抗，TTBS漂洗膜4次，每次10-15分钟。

(4)清洗干净后，加入以洗液1∶20000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG，3℃，150rpm，轻轻振摇反应1小时。

(5)弃去酶标二抗，TTBS漂洗膜4次，每次10-15分钟。

(6)加入DAB显色液(10mlTTBS中加4mgDAB，5ulH₂O₂)，轻摇至显色，蒸馏水漂洗终止反应。

Western blot结果见图4，免疫印迹结果显示抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6与阳性对照重组UreB全蛋白，基因重组工程菌pET11c-U12，pET11c-U15和pET11c-U16与发生了抗原抗体特异性结合反应，而与基因重组工程菌UreB414，pET11c-U13和pET11c-U47不发生抗原抗体特异性结合反应，与阴性对照BSA和空载体菌亦不发生特异性结合反应，说明了单克隆抗体6E6所针对的抗原表位位于UreB蛋白200-230aa内。

实施例4步移合成表位多肽以精确定位6E6单克隆抗体所针对的抗原表位

1)表位肽的合成

针对实施例4中所确定的6E6单抗识别表位位于UreB蛋白的200-230aa之间，采用步移合成法先后重叠5个氨基酸分4段合成表位多肽(送北京中科亚光生物有限公司合成)，分别命名为U_201-215aa，U_206-220aa，U_211-225aa，U_216-230aa，纯度为85％以上，合成量为10mg，合成的具体序列如序列表中SEQ ID NO：16、17、1、18所示。

2)酶联免疫吸附试验(ELISA)方法确定6E6单抗表位

将合成的4条表位多肽分别包被ELISA板，以检测6E6单抗所针对的表位。具体操作步骤如下：

(1)酶标板的预处理：将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用。

(2)用包被液将抗原稀释为合适的浓度：合成表位多肽为10μg/ml。

(3)包被：酶标板加100μl/孔上述抗原液，4℃过夜，洗涤液洗涤5遍，空干。

(4)封闭：加封闭液300μl/孔，4℃过夜，洗涤5遍，空干，密封4℃保存备用。

(5)抗体稀释：6E6单抗腹水按1∶1000倍稀释。

(6)取包被好4条表位肽的酶标板，加入依次稀释抗体100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干。

(7)加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶20000稀释)100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干。

(8)加底物显色液100μl/孔，室温避光反应5～10分钟。

(9)加终止液2M/L H₂SO₄50μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值。

(10)结果判断：6E6抗体与4条表位肽结合反应，OD值最大的，且大于或等于阴性对照(正常小鼠血清1∶100倍稀释)的2.1倍时视为6E6单抗所针对的抗原表位。

反应结果如图5所示，表明单克隆抗体6E6与合成表位肽U211-225aa发生了特异性结合反应，说明单抗所对应表位为U211-225aa。

3)斑点印迹方法(Dot blot)确定6E6单抗表位

(1)将合成的4条含有15个氨基酸残基的表位多肽U201-215，U206-220，U211-225，U216-230分别以4μg的量点到NC膜上，同时以纯化重组的UreB蛋白作为阳性对照，以牛血清白蛋白作为阴性对照，点样量均为4μg；

(2)将点好样的NC膜置于室温内风干30分钟；

(3)用含有5％BSA的封闭液于37℃条件下封闭2小时；

(4)TTBS清洗膜4次，加入1∶1000稀释的单克隆抗体6E6，37℃条件下摇床孵育1小时；

(5)TTBS清洗膜4次，加入1∶10000稀释的羊抗鼠IgG(HRP标记)，37℃条件下摇床孵育1小时；

(6)TTBS清洗膜4次，加入DAB显色液(10mlTTBS中加4mg DAB，5ul H₂O₂)，轻摇至显色，蒸馏水漂洗终止反应。

反应结果如图6所示，结果与ELISA一致，mAb 6E6与合成表位肽U211-225和UreB全蛋白发生了特异性结合反应，而与合成多肽U201-215，U211-220，U216-230不发生特异性结合反应，与阴性对照BSA亦不发生反应，说明mAb 6E6所针对的抗原表位为U211-225。

实施例56E6单抗所对应的表位U211-215aa与BSA的偶联用以制备嵌合表位疫苗

由于单个表位分子量较小，属于半抗原，免疫原性较差，所以欲将其与载体蛋白BSA偶联，从而增强其免疫原性，可以引发特异性抗原抗体反应。本实验采用戊二醛将合成肽表位通过化学偶联法偶联到担体蛋白质上。具体操作如下：

1)将2mg的载体蛋白BSA溶于2ml pH10的硼酸盐缓冲液中，置于15ml的玻璃试管中，温和振摇，然后加入2umol的合成肽表位；

2)缓慢加入2ml的0.3％戊二醛溶液，于室温下振摇，使其反应2h(溶液将变成黄色)；

3)加入0.5ml的1mol/L的甘氨酸以封闭未反应的戊二醛，使其反应30min；

4)将表位与BSA的偶联物对2L硼酸缓冲液(pH8.5)在4℃透析过夜，更换硼酸缓冲液后继续透析4h，然后分装于EP管中，贮存于-20℃备用。

实施例6抗体拮抗试验

1)将培养的幽门螺杆菌(11637标准菌株)约10⁴重悬于25μl培养基中；

2)单克隆抗体6E6分别以5μg，10μg，15μg，20μg，25μg等剂量与10μg表位肽U211-225aa混合后，与幽门螺杆菌于37℃共孵育1小时；

3)加入快速尿素酶显色试剂，反应30分钟后，检测550nm处吸光值；

4)同时做单克隆抗体和不相关蛋白BSA与幽门螺杆菌反应的对照；

试验结果如图7所示，单克隆抗体6E6单独与幽门螺杆菌共孵育时，其中和尿素酶的能力明显高于单克隆抗体6E6与表位肽混合组，说明表位肽竞争抑制了单抗中和尿素酶的活性。

实施例76E6单抗表位，表位-BSA嵌合表位疫苗的免疫效应观察

1、福林(folin)-酚试剂法(也称Lowry法)测定表位-BSA偶联蛋白浓度：

1)Lowry蛋白浓度检测试剂(由本校生化教研室提供)，

2)样品准备：首先将表位-BSA偶联蛋白样品2倍、5倍、10倍稀释，于试管中每管加入500μl；标准管加入标准品(牛血清白蛋白：250μg/ml)500μl，空白管加双蒸水500μl；均做复管；

3)加入甲试剂(有甲试剂A与甲试剂B 50∶1的比例混合而成)每管2.5ml，混匀室温放置10分钟；

4)加入乙试剂，每管250μl，室温放置30分钟；

5)紫外分光光度计检测波长650nm处的吸光度，以空白管调零。

6)结果绘制标准曲线，获得标准曲线的回归方程，将样品值待入公式计算样品，取复管的均值为最后浓度。

结果：标准曲线方程：Y＝0.0021X+0.0056

表位-BSA偶联蛋白浓度为0.6mg/ml。

2、动物免疫

2.1分组：分为三组，如下表：

动物分组

2.2免疫动物：雌性Balb/c小鼠，8周龄。

2.3免疫程序

首次采用抗原加完全福氏佐剂(CFA)免疫，然后于第2、4周采用相同抗原加不完全福氏佐剂(IFA)加强免疫，于免疫3次后第七天取小鼠的血液上清检测特异性抗体效价的改变。

3、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测抗体的产生：

采用合成表位肽包被ELISA板检测表位疫苗免疫的血清中的抗体。步骤如下：

1)酶标板的预处理：将新购酶标板用双蒸水浸泡过夜，晾干后备用。

2)用包被液将抗原稀释为合适的浓度：合成表位肽包被浓度为10μg/ml。

3)包被：酶标板加100μl孔上述抗原液，4℃过夜，洗涤液洗涤5遍，空干。

4)封闭：加封闭液300μl/孔，4℃过夜，洗涤5遍，空干，密封4℃保存备用。

5)采血及稀释：小鼠眼眶取血，离心取上清用抗体稀释液按1∶100，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，1∶32000，1∶64000，1∶128000梯度进行被比稀释。

6)取包被好的酶标板，加入依次稀释血清100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干。

7)加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶20000稀释)100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干。

8)加底物显色液100μl/孔，室温避光反应5～10分钟。

9)加终止液50μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值

10)结果判断：OD值大于或等于阴性对照(小鼠免疫前血清1∶100倍稀释)的2.1倍时视为抗体阳性。

结果：如图8所示，表位-BSA嵌合表位疫苗免疫组的血清能够与表位合成肽反应，而单表位免疫对照组和PBS对照组基本不与表位合成肽反应。说明本发明构建的嵌合表位疫苗诱导小鼠产生的抗体能够特异性识别表位合成肽蛋白，并且本发明也证实了牛血清白蛋白是一个很好的载体蛋白，能够增强表位的免疫原性诱导产生针对表位的特异性抗体。

4、抗血清与不同天然Hp菌株尿素酶B亚单位蛋白的Western blot分析

1)幽门螺杆菌国际标准菌株NCTC11637、SS1、26695来源于中国生物制品检定所，Hp9806来源于中国CDC临床分离株。

2)在补充有50g/L去纤维蛋白牛血的脑心滴注琼脂培养基上分步划线培养不同幽门螺杆菌菌株，平板在微需氧环境中37℃培养2-3d，得到典型菌落。用L棒刮下菌落，悬浮在PBS中。10000×g 4℃离心10分钟，收集细胞，再悬浮于PBS中重复3次，洗涤细胞，以此获得幽门螺杆菌细胞悬液。

3)将幽门螺杆菌细胞悬液处理后，行SDS-PAGE电泳，转膜，然后与表位疫苗免疫小鼠后抗血清进行免疫印迹分析，以纯化的重组UreB全蛋白作为阳性对照，同时以大肠杆菌DH5α作为阴性对照，抗血清按1∶200倍稀释。(具体操作步骤同实施例3)

结果如图9所示，抗血清与重组ureB蛋白发生了阳性反应，并且与4株天然Hp菌株的UreB蛋白发生了特异性抗原抗体反应，而与大肠杆菌DH5α未见阳性反应发生，说明由表位疫苗免疫BALB/c小鼠制备的抗血清能够识别天然的UreB蛋白，并且与标准菌株、人分离株和动物分离株均发生反应，进一步说明我们制备的表位疫苗是一个有效的疫苗，能够引发特异性体液免疫应答，同时也说明本发明中鉴定的表位肽是一个优势抗原表位，可作为疫苗的候选分子。

5、抗血清的中和尿素酶活性试验

1)以幽门螺杆菌国际标准菌株NCTC11637作为反应菌株。

2)菌株的培养同上述试验操作。

3)将培养的幽门螺杆菌以220V超声破碎30，间隔30秒，以此获得含有尿素酶的细胞碎片。

4)将含有尿素酶的细胞碎片(50ul)与抗血清(50ul)在96孔板4℃反应过夜。次日加入含有500mmol/L尿素和0.2g/L酚红的50mmol/L(pH6.8)的磷酸盐缓冲液100ul/孔。23℃共孵育4小时后，以分光光度计550nm比色，颜色变化率以曲线的线性分布来表示。试验结果如图10所示，与对照组相比，抗血清对尿素酶有显著的抑制作用。

实施例8临床感染幽门螺杆菌(Hp)标本的检测

为了证实本发明的Hp中和性抗原表位在幽门螺杆菌感染中的作用，发明人收集江苏省赣榆地区的57份幽门螺杆菌感染病人血清和10份正常人血清，将表位肽包被ELISA板，检测临床感染HP血清中是否有针对此表位的特异性抗体。具体操作如下：

1)将合成表位U_211-225aa，重组UreB纯化蛋白，表位与BSA偶联蛋白分别包被96孔板，包被浓度分别为5μg/ml，10μg/ml，10μg/ml，4℃过夜；

2)封闭：加1％BSA封闭液300μl/孔，4℃过夜，洗涤5遍，空干，密封4℃保存备用。

3)抗体稀释：幽门螺杆菌感染的57份人抗血清，10份正常人血清作为阴性对照，标准的人感染HP血清作为阳性对照，分别按照1∶100稀释。

4)取包被好6条抗原的酶标板，依次加入稀释的抗血清100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干。

5)加辣根过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG抗体工作液(1∶20000稀释)100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干。

6)加底物显色液100μl/孔，室温避光反应5～10分钟。

7)加终止液2M/L H₂SO₄ 50μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值。

8)结果判断：HP感染人抗血清与表位U_211-225aa，重组UreB纯化蛋白，表位-BSA嵌合表位疫苗的结合反应，OD值最大的，且大于或等于阴性对照(正常人血清1∶100倍稀释)的2.1倍时视为抗原抗体反应阳性。

反应结果如图11所示，重组UreB蛋白与57份幽门螺杆菌感染患者血清均发生了阳性反应，表位肽U_211-225aa和表位-BSA嵌合表位疫苗与37份幽门螺杆菌感染患者血清均发生了阳性反应，而表位U_211-225aa，重组UreB纯化蛋白和表位-BSA嵌合表位疫苗与10份正常人血清均不发生反应(数据未示出)，说明本发明的表位肽在幽门螺杆菌致病中发挥着重要作用，是幽门螺杆菌的一个优势表位，为多价表位疫苗和诊断试剂的研制奠定了基础。

根据以上试验可证明，本发明利用分段截短法构建分段抗原以及表位作图确定了单抗所针对的抗原表位。本发明确定的B细胞表位能够竞争抑制单克隆抗体6E6中和幽门螺杆菌尿素酶的活性。本发明中的嵌合表位疫苗利用本发明的B细胞表位多肽与载体蛋白BSA偶联，经动物实验验证具有良好免疫原性，能够诱导机体的特异性体液免疫应答，并且产生的抗血清能够部分中和尿素酶的活性以及能够和不同天然幽门螺杆菌菌株的尿素酶发生反应，表明本发明的表位疫苗的构建策略是成功的。

本发明的嵌合表位疫苗是本发明的表位多肽在疫苗研制中的一种应用的实施举例，而不是本发明表位多肽在疫苗研制领域应用的限制，其他利用本发明表位多肽的氨基酸序列或DNA序列或不同于本发明中表位多肽对应的DNA序列，但是由于遗传密码的兼并性，编码的氨基酸序列与本发明表位多肽的氨基酸序列相同的核苷酸序列的疫苗也属于本发明的保护范围；本发明的表位多肽具有抗HP感染的作用，用来研制预防性或治疗性多肽药物或免疫制剂。

此外，这里提供的实施方案应看作是举例说明而非限制性的，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员在不违反前面充分阐述的本发明的实质或范围条件下，可对本发明的实施方案做各种改动或修饰多肽，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

SEQ ID NO：1

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽及其鉴定方法与应用

<130>

<160>23

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的表位多肽

<400>1

Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly

1 5 10 15

SEQ ID NO：2

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>根据大肠杆菌的优势密码子合成的编码表位肽的核苷酸序列

<400>2

ATT GAA GCC GGT GCG ATT GGT TTT AAA ATC CAC GAA GAC TGG GGA

Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly

1 5 10 15

SEQ ID NO：3

<210>3

<213>抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位单克隆抗体6E6

<310>CN1687134

<311>2005.04.25

<312>2005.10.26

SEQ ID NO：4

<210>4

<211>900

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原U12基因人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(900)

<400>4

ATGAAAAAGA TTAGCAGAAA AGAATATGTT TCTATGTATG GCCCTACTAC AGGCGATAAA 60

GTGAGATTGG GCGATACAGA TTTGATCGCT GAAGTAGAAC ATGACTACAC CATTTATGGC 120

GAAGAGCTAA AATTTGGTGG CGGTAAAACT TTAAGAGAAG GCATGAGCCA ATCCAACAAC 180

CCCAGCAAAG AAGAACTGGA TTTAATCATC ACTAACGCTT TAATCGTGGA TTACACCGGT 240

ATTTATAAAG CGGATATTGG TATTAAAGAT GGCAAAATCG CTGGCATTGG CAAAGGCGGT 300

AACAAAGACA TGCAAGATGG CGTTAAAAAC AATCTTAGCG TGGGTCCTGC TACTGAAGCC 360

TTAGCTGGTG AAGGTTTGAT CGTAACTGCT GGCGGTATTG ACACACACAT CCACTTCATC 420

TCCCCCCAAC AAATCCCTAC AGCTTTTGCA AGCGGTGTAA CAACTATGAT TGGTGGCGGA 480

ACTGGCCCTG CTGATGGCAC TAACGCAACC ACTATCACTC CAGGCAGAAG AAATTTAAAA 540

TGGATGCTCA GAGCGGCTGA AGAATATTCT ATGAACTTAG GTTTCTTAGC TAAAGGTAAC 600

ACTTCTAACG ATGCGAGCTT AGCCGATCAA ATTGAAGCCG GTGCGATTGG TTTTAAAATC 660

CACGAAGACT GGGGAACAAC TCCTTCTGCA ATCAACCATG CGTTAGATGT TGCGGACAAA 720

TACGATGTGC AAGTCGCTAT CCACACAGAC ACTCTGAATG AAGCCGGTTG TGTAGAAGAC 780

ACTATGGCAG CCATTGCCGG ACGCACTATG CACACTTTCC ACACTGAAGG TGCTGGTGGT 840

GGACACGCTC CTGATATTAT TAAAGTGGCC GGCGAACACA ACATTCTGCC CGCTTCCTAG 900

SEQ ID NO：44

<210>44

<211>300

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原U12氨基酸序列

<220>

<221>INIT_MET

<212>(1)...(299)

<400>44

MetLysLysIleSer ArgLysGluTyrVal SerMetTyrGlyPro 15

ThrThrGlyAspLys ValArgLeuGlyAsp ThrAspLeuIleAla 30

GluValGluHisAsp TyrThrIleTyrGly GluGluLeuLysPhe 45

GlyGlyGlyLysThr LeuArgGluGlyMet SerGlnSerAsnAsn 60

ProSerLysGluGlu LeuAspLeuIleIle ThrAsnAlaLeuIle 75

ValAspTyrThrGly IleTyrLysAlaAsp IleGlyIleLysAsp 90

GlyLysIleAlaGly IleGlyLysGlyGly AsnLysAspMetGln 105

AspGlyValLysAsn AsnLeuSerValGly ProAlaThrGluAla 120

LeuAlaGlyGluGly LeuIleValThrAla GlyGlyIleAspThr 135

HisIleHisPheIle SerProGlnGlnIle ProThrAlaPheAla 150

SerGlyValThrThr MetIleGlyGlyGly ThrGlyProAlaAsp 165

GlyThrAsnAlaThr ThrIleThrProGly ArgArgAsnLeuLys 180

TrpMetLeuArgAla AlaGluGluTyrSer MetAsnLeuGlyPhe 195

LeuAlaLysGlyAsn ThrSerAsnAspAla SerLeuAlaAspGln 210

IleGluAlaGlyAla IleGlyPheLysIle HisGluAspTrpGly 225

ThrThrProSerAla IleAsnHisAlaLeu AspValAlaAspLys 240

TyrAspValGlnVal AlaIleHisThrAsp ThrLeuAsnGluAla 255

GlyCysValGluAsp ThrMetAlaAlaIle AlaGlyArgThrMet 270

HisThrPheHisThr GluGlyAlaGlyGly GlyHisAlaProAsp 285

IleIleLysValAla GlyGluHisAsnIle LeuProAlaSer 299

SEQ ID NO：5

<210>5

<211>600

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原U13基因人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(600)

<400>5

ATGAAAAAGA TTAGCAGAAA AGAATATGTT TCTATGTATG GCCCTACTAC AGGCGATAAA 60

GTGAGATTGG GCGATACAGA TTTGATCGCT GAAGTAGAAC ATGACTACAC CATTTATGGC 120

GAAGAGCTAA AATTTGGTGG CGGTAAAACT TTAAGAGAAG GCATGAGCCA ATCCAACAAC 180

CCCAGCAAAG AAGAACTGGA TTTAATCATC ACTAACGCTT TAATCGTGGA TTACACCGGT 240

ATTTATAAAG CGGATATTGG TATTAAAGAT GGCAAAATCG CTGGCATTGG CAAAGGCGGT 300

AACAAAGACA TGCAAGATGG CGTTAAAAAC AATCTTAGCG TGGGTCCTGC TACTGAAGCC 360

TTAGCTGGTG AAGGTTTGAT CGTAACTGCT GGCGGTATTG ACACACACAT CCACTTCATC 420

TCCCCCCAAC AAATCCCTAC AGCTTTTGCA AGCGGTGTAA CAACTATGAT TGGTGGCGGA 480

ACTGGCCCTG CTGATGGCAC TAACGCAACC ACTATCACTC CAGGCAGAAG AAATTTAAAA 540

TGGATGCTCA GAGCGGCTGA AGAATATTCT ATGAACTTAG GTTTCTTAGC TAAAGGTTAG 600

SEQ ID NO：55

<210>55

<211>200

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原U13氨基酸序列

<220>

<221>INIT_MET

<212>(1)...(199)

<400>55

MetLysLysIleSer ArgLysGluTyrVal SerMetTyrGlyPro 15

ThrThrGlyAspLys ValArgLeuGlyAsp ThrAspLeuIleAla 30

GluValGluHisAsp TyrThrIleTyrGly GluGluLeuLysPhe 45

GlyGlyGlyLysThr LeuArgGluGlyMet SerGlnSerAsnAsn 60

ProSerLysGluGlu LeuAspLeuIleIle ThrAsnAlaLeuIle 75

ValAspTyrThrGly IleTyrLysAlaAsp IleGlyIleLysAsp 90

GlyLysIleAlaGly IleGlyLysGlyGly AsnLysAspMetGln 105

AspGlyValLysAsn AsnLeuSerValGly ProAlaThrGluAla 120

LeuAlaGlyGluGly LeuIleValThrAla GlyGlyIleAspThr 135

HisIleHisPheIle SerProGlnGlnIle ProThrAlaPheAla 150

SerGlyValThrThr MetIleGlyGlyGly ThrGlyProAlaAsp 165

GlyThrAsnAlaThr ThrIleThrProGly ArgArgAsnLeuLys 180

TrpMetLeuArgAla AlaGluGluTyrSer MetAsnLeuGlyPhe 195

LeuAlaLysGly 199

SEQ ID NO：6

<210>6

<211>420

<212>DNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(420)

<400>6

ATGACTCTGA ATGAAGCCGG TTGTGTAGAA GACACTATGG CAGCCATTGC CGGACGCACT 60

ATGCACACTT TCCACACTGA AGGTGCTGGT GGTGGACACG CTCCTGATAT TATTAAAGTG 120

GCCGGCGAAC ACAACATTCT GCCCGCTTCC ACTAACCCCA CTATCCCTTT CACCGTGAAT 180

ACAGAAGCAG AACACATGGA CATGCTTATG GTGTGCCACC ACTTGGATAA AAGCATTAAA 240

GAAGATGTTC AGTTCGTTGA TTCAAGGATC CGCCCTCAAA CCATTGCGGC TGAAGACACT 300

TTGCATGACG TGGGGATTTT CTCAATCACC AGTTCTGACT CTCAAGCTAT GGGTCGTGTG 360

GGTGAAGTTA TCACCAGAAC TTGGCAAACA GCTGACAAAA ACAAAAAAGA ATTTGGCTAG 420

SEQ ID NO：66

<210>66

<211>140

<212>PRT

<220>

<221>INIT_MET

<212>(1)...(139)

MetThrLeuAsnGlu AlaGlyCysValGlu AspThrMetAlaAla 15

IleAlaGlyArgThr MetHisThrPheHis ThrGluGlyAlaGly 30

GlyGlyHisAlaPro AspIleIleLysVal AlaGlyGluHisAsn 45

IleLeuProAlaSer ThrAsnProThrIle ProPheThrValAsn 60

ThrGluAlaGluHis MetAspMetLeuMet ValCysHisHisLeu 75

AspLysSerIleLys GluAspValGlnPhe ValAspSerArgIle 90

ArgProGlnThrIle AlaAlaGluAspThr LeuHisAspValGly 105

IlePheSerIleThr SerSerAspSerGln AlaMetGlyArgVal 120

GlyGluValIleThr ArgThrTrpGlnThr AlaAspLysAsnLys 135

LysGluPheGly 139

SEQ ID NO：7

<210>7

<211>690

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原U15基因人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(690)

<400>7

ATGAAAAAGA TTAGCAGAAA AGAATATGTT TCTATGTATG GCCCTACTAC AGGCGATAAA 60

GTGAGATTGG GCGATACAGA TTTGATCCCT GAAGTAGAAC ATGACTACAC CATTTATGGC 120

GAAGAGCTAA AATTTGGTGG CGGTAAAACT TTAAGAGAAG GCATGAGCCA ATCCAACAAC 180

CCCAGCAAAG AAGAACTGGA TTTAATCATC ACTAACGCTT TAATCGTGGA TTACACCGGT 240

ATTTATAAAG CGGATATTGG TATTAAAGAT GGCAAAATCG CTGGCATTGG CAAAGGCGGT 300

AACAAAGACA TGCAAGATGG CGTTAAAAAC AATCTTAGCG TGGGTCCTGC TACTGAAGCC 360

TTAGCTGGTG AAGGTTTGAT CGTAACTGCT GGCGGTATTG ACACACACAT CCACTTCATC 420

TCCCCCCAAC AAATCCCTAC AGCTTTTGCA AGCGGTGTAA CAACTATGAT TGGTGGCGGA 480

ACTGGCCCTG CTGATGGCAC TAACGCAACC ACTATCACTC CAGGCAGAAG AAATTTAAAA 540

TGGATGCTCA GAGCGGCTGA AGAATATTCT ATGAACTTAG GTTTCTTAGC TAAAGGTAAC 600

ACTTCTAACG ATGCGAGCTT AGCCGATCAA ATTGAAGCCG GTGCGATTGG TTTTAAAATC 660

CACGAAGACT GGGGAACAAC TCCTTCTTAG 690

SEQ ID NO：77

<210>77

<211>230

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原U15氨基酸序列

<220>

<221>INIT_MET

<212>(1)...(229)

<400>77

MetLysLysIleSer ArgLysGluTyrVal SerMetTyrGlyPro 15

ThrThrGlyAspLys ValArgLeuGlyAsp ThrAspLeuIleAla 30

GluValGluHisAsp TyrThrIleTyrGly GluGluLeuLysPhe 45

GlyGlyGlyLysThr LeuArgGluGlyMet SerGlnSerAsnAsn 60

ProSerLysGluGlu LeuAspLeuIleIle ThrAsnAlaLeuIle 75

ValAspTyrThrGly IleTyrLysAlaAsp IleGlyIleLysAsp 90

GlyLysIleAlaGly IleGlyLysGlyGly AsnLysAspMetGln 105

AspGlyValLysAsn AsnLeuSerValGly ProAlaThrGluAla 120

LeuAlaGlyGluGly LeuIleValThrAla GlyGlyIleAspThr 135

HisIleHisPheIle SerProGlnGlnIle ProThrAlaPheAla 150

SerGlyValThrThr MetIleGlyGlyGly ThrGlyProAlaAsp 165

GlyThrAsnAlaThr ThrIleThrProGly ArgArgAsnLeuLys 180

TrpMetLeuArgAla AlaGluGluTyrSer MetAsnLeuGlyPhe 195

LeuAlaLysGlyAsn ThrSerAsnAspAla SerLeuAlaAspGln 210

IleGluAlaGlyAla IleGlyPheLysIle HisGluAspTrpGly 225

ThrThrProSer 229

SEQ ID NO：8

<210>8

<211>780

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原U16基因人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(780)

<400>8

ATGAAAAAGA TTAGCAGAAA AGAATATGTT TCTATGTATG GCCCTACTAC AGGCGATAAA 60

GTGAGATTGG GCGATACAGA TTTGATCGCT GAAGTAGAAC ATGACTACAC CATTTATGGC 120

GAAGAGCTAA AATTTGGTGG CGGTAAAACT TTAAGAGAAG GCATGAGCCA ATCCAACAAC 180

CCCAGCAAAG AAGAACTGGA TTTAATCATC ACTAACGCTT TAATCGTGGA TTACACCGGT 240

ATTTATAAAG CGGATATTGG TATTAAAGAT GGCAAAATCG CTGGCATTGG CAAAGGCGGT 300

AACAAAGACA TGCAAGATGG CGTTAAAAAC AATCTTAGCG TGGGTCCTGC TACTGAAGCC 360

TTAGCTGGTG AAGGTTTGAT CGTAACTGCT GGCGGTATTG ACACACACAT CCACTTCATC 420

TCCCCCCAAC AAATCCCTAC AGCTTTTGCA AGCGGTGTAA CAACTATGAT TGGTGGCGGA 480

ACTGGCCCTG CTGATGGCAC TAACGCAACC ACTATCACTC CAGGCAGAAG AAATTTAAAA 540

TGGATGCTCA GAGCGGCTGA AGAATATTCT ATGAACTTAG GTTTCTTAGC TAAAGGTAAC 600

ACTTCTAACG ATGCGAGCTT AGCCGATCAA ATTGAAGCCG GTGCGATTGG TTTTAAAATC 660

CACGAAGACT GGGGAACAAC TCCTTCTGCA ATCAACCATG CGTTAGATGT TGCGGACAAA 720

TACGATGTGC AAGTCGCTAT CCACACAGAC ACTCTGAATG AAGCCGGTTG TGTAGAATAG 780

SEQ ID NO：88

<210>88

<211>260

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原U16氨基酸序列

<220>

<221>INIT_MET

<212>(1)...(259)

<400>88

MetLysLysIleSer ArgLysGluTyrVal SerMetTyrGlyPro 15

ThrThrGlyAspLys ValArgLeuGlyAsp ThrAspLeuIleAla 30

GluValGluHisAsp TyrThrIleTyrGly GluGluLeuLysPhe 45

GlyGlyGlyLysThr LeuArgGluGlyMet SerGlnSerAsnAsn 60

ProSerLysGluGlu LeuAspLeuIleIle ThrAsnAlaLeuIle 75

ValAspTyrThrGly IleTyrLysAlaAsp IleGlyIleLysAsp 90

GlyLysIleAlaGly IleGlyLysGlyGly AsnLysAspMetGln 105

AspGlyValLysAsn AsnLeuSerValGly ProAlaThrGluAla 120

LeuAlaGlyGluGly LeuIleValThrAla GlyGlyIleAspThr 135

HisIleHisPheIle SerProGlnGlnIle ProThrAlaPheAla 150

SerGlyValThrThr MetIleGlyGlyGly ThrGlyProAlaAsp 165

GlyThrAsnAlaThr ThrIleThrProGly ArgArgAsnLeuLys 180

TrpMetLeuArgAla AlaGluGluTyrSer MetAsnLeuGlyPhe 195

LeuAlaLysGlyAsn ThrSerAsnAspAla SerLeuAlaAspGln 210

IleGluAlaGlyAla IleGlyPheLysIle HisGluAspTrpGly 225

ThrThrProSerAla IleAsnHisAlaLeu AspValAlaAspLys 240

TyrAspValGlnVal AlaIleHisThrAsp ThrLeuAsnGluAla 255

GlyCysValGlu 259

SEQ ID NO：9

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原引物P1人工序列

<400>9

CGCCATATGA AAAAGATTAG CAGAAAAG

1 10 20

SEQ ID NO：10

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原引物P2人工序列

<400>10

CGCGGATCCC TAGGAAGCGG GCAGAAT

1 10 20

SEQ ID NO：11

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原引物P3人工序列

<400>11

GGCGGATCCC TAACCTTTAG CTAAGAAACC

1 10 20 30

SEQ ID NO：12

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原引物P4人工序列

<400>12

CATATGACAC TTTGAATGAA GCCG

1 10 20

SEQ ID NO：13

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原引物P5人工序列

<400>13

GCCGGATCCC TATGCAGAAG GAGTTGT

1 10 20

SEQ ID NO：14

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原引物P6人工序列

<400>14

CGCGGATCCC TAGTCTTCTA CACAACC

1 10 20

SEQ ID NO：15

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位截短抗原引物P7人工序列

<400>15

GGATCCAAAT TCTTTTTTGT TTTTGTCAG

1 10 20

SEQ ID NO：16

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的多肽

<400>16

Thr Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala Asp Glu Ile Glu Ala Gly Ala

1 5 10 15

SEQ ID N0：17

<210>17

<211>15

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的多肽

<400>17

Ser Leu Ala Asp Glu Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile

1 5 10 15

SEQ ID NO：18

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<220>

<230>源自幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的多肽

<400>18

Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly Thr Thr Pro Ser Ala

1 5 10 15

Claims

1.一种幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽，其特征在于：所述多肽为序列表中的SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽。

2.一种嵌合表位疫苗，其特征在于其活性成分为权利要求1所述的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽。

3.一种嵌合表位疫苗的构建方法，其特征在于将权利要求1所述的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽与载体蛋白进行化学偶联。

4.一种用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物，其特征在于其活性成分为权利要求1所述的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位B细胞抗原表位多肽。