CN102838680B - 一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白及其制备的多表位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白及其制备的多表位疫苗。所述幽门螺杆菌多表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的多表位疫苗中的融合蛋白可诱导胃组织中特异性sIgA的生成以及血清中高效价的特异性IgG的形成，并且能够有效降低小鼠胃内幽门螺杆菌的定值量，具有显著的保护效果。

Description

一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白及其制备的多表位疫苗

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及多表位疫苗，尤其涉及一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白及其制备的多表位疫苗。

背景技术

幽门螺杆菌是寄居在人胃粘膜的革兰氏阴性菌，已被确定为慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病菌和胃癌的Ⅰ类致病因子。全球50%以上人群存在幽门螺杆菌感染，在中国，幽门螺杆菌感染者已超过6亿。其中，约有30%的感染者发展为慢性胃炎，10%-20%的人可发展为消化性溃疡（胃溃疡和十二指肠溃疡），部分感染者可出现胃粘膜萎缩和肠上皮化生甚至胃癌。目前临床主要通过抗生素联用铋剂和抗胃酸分泌药来根除幽门螺杆菌，但随着各种耐药菌株的出现，加上多联用药病人依从性差等原因，彻底根除幽门螺杆菌也愈加困难。

一直以来，疫苗接种是抵抗和清除微生物感染的有效途径。目前所研究的防治幽门螺杆菌感染的疫苗大多采用幽门螺杆菌全菌体成分（灭活菌体、全菌裂解物，全菌超声物等）或单一完整抗原蛋白，抗原蛋白包括尿素酶（UreA、UreB）、空泡毒素（VacA）、毒素相关蛋白（CagA）、粘附素（BabA、HpaA、NAP）和过氧化氢酶（KatA）等，并分别辅以不同佐剂，如霍乱毒素（CT），大肠杆菌不耐热肠毒素（LT），铝盐等，进行口服或皮下或腹腔内免疫接种，均有不同程度的预防和清除效果，但（见下表1）。

表1防治幽门螺杆菌感染的疫苗研究现状

现有幽门螺杆菌疫苗未获得理想免疫预防或治疗效果，其可能的原因为：①疫苗抗原的选择与组成不合理：多采用全抗原蛋白或全菌体成分，自然感染的机体对幽门螺杆菌自身天然蛋白成分存在一定程度的免疫耐受，应进行抗原改造。其次，单一的抗原成分不足以激发全面有效的免疫应答，而全菌体抗原又存在不利于保护性应答的复杂组分；②免疫佐剂活性不足，或佐剂类型与可能的免疫清除机制不一致，同时尚存在安全性问题；③疫苗投递途径与方式不确定，造成所激发的免疫应答强度较弱。

蛋白抗原发挥其功能主要通过表位来体现特异性。筛选多个蛋白抗原的免疫显性表位，将各抗原的表位进行串联所得到表位多肽疫苗同样可以激发有效的免疫应答。与全长蛋白抗原相比，表位多肽疫苗的基因重组构建和表达都更为容易，而且可以同时发挥多个抗原的作用。目前，普遍认为CD4⁺T淋巴细胞，而非CD8⁺T淋巴细胞应答在幽门螺杆菌感染清除中起到关键作用。以霍乱毒素（CT）或大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）为佐剂的疫苗口服免疫后，粘膜淋巴结中致敏CD4⁺T淋巴细胞主要产生IFN-γ等Th1型细胞因子，同时，血清中IgG2a水平高于IgG1，此时，机体幽门螺杆菌定植数量明显减少，而以铝盐等为佐剂的疫苗注射免疫后却出现血清IgG1水平显著高于IgG2a，且幽门螺杆菌定植数量未出现减少或轻微减少。由此可见：Th1型CD4⁺T淋巴细胞应答，尤其是粘膜性Th1反应可能有利于机体清除幽门螺杆菌，而Th2型CD4⁺T淋巴细胞应答，尤其是系统性Th2反应可能在免疫清除保护中不发挥主导作用(Nystrom J,etal.Mucosal immune responses are related to reduction of bacterialcolonization in the stomach after therapeutic Helicobacter pylori immunizationin mice.Microbes Infect,2006,8(2):442-9)。筛选幽门螺杆菌膜表面蛋白抗原（如HpaA、CagA、UreB等）的Th1细胞表位，构建表位多肽疫苗，可以有效激发特异性CD4^＋T淋巴细胞应答，从而有助于机体有效清除幽门螺杆菌。

免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能促进、延长或增强对疫苗抗原特异性免疫应答的物质。为了启动粘膜免疫应答，目前幽门螺杆菌治疗用疫苗多采用LT、CT等作为佐剂。以上佐剂虽能引起强烈的粘膜免疫应答，但不能诱导初始CD4⁺T细胞向Th1细胞分化，而Th1反应对清除幽门螺杆菌至关重要，不能诱导Th1细胞分化在一定程度上影响了疫苗的治疗效果。幽门螺杆菌表位多肽疫苗联用Th1极化的佐剂，可大大提高幽门螺杆菌的清除率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的融合蛋白可用于制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的制剂。优选地，所述制剂为疫苗。

本发明还提供一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的多表位疫苗，其包含上述的融合蛋白。进一步地，还包含医学上可接受的免疫佐剂。所述免疫佐剂优选可引起Th1细胞应答的佐剂，具体可以为霍乱毒素B亚单位（CTB）、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）、突变体LTKA63、CPGODN 1863、MPLA（Monophosphoryl Lipid A）、N-Glycolyl-MDP VacciGrade或AddaVax。

本发明还提供上述的预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的多表位疫苗的制备方法，其包含步骤：

1）将编码幽门螺杆保护性抗原HpaA、CagA、UreB的CD4⁺T细胞表位的序列进行串联，形成融合蛋白表达序列，然后与表达载体连接重组表达载体；

2）将步骤1）制得的重组表达载体转入宿主菌表达该融合蛋白；

3）将步骤2）制得的融合蛋白与医学上可接受的免疫佐剂混合，制得所述疫苗。

其中步骤1）所述的串联的T细胞表位的序列为：幽门螺杆菌保护性抗原（HpaA、CagA、Ureb）的CD4+T细胞表位肽的串联体，在三类表位之间用2个赖氨酸相连接，所选择的表位如下：

粘附素A亚单位（HpaA）：HpaA 88-100（EQILQNQGYKVIS）、HpaA136-150（TIQKKSEPGLLFSTG）、HpaA178-212（DSFTM DLSELDIQEKFLKTTHSSHSGGLVSTMVKG）、HpaA 228-240（FANIMQEIDKKLT）

尿素酶B亚单位（UreB）：UreB97-111(GKGGNKDMQDGVKNN)、UreB157-176(IGGGTGPADGTNATITPGR)、UreB200-214(NASNDASLADQIEAG)、UreB249-264(TDTLNEAGCVEDTMAA)、UreB388-405(GRLKEEKGDND NFRIKRY)、UreB515-533(PVKNCRNITKKDMQFNDTT)。

毒素相关蛋白A亚单位（CagA）：CagA5-20(TIDQTRTPDQTQSQTA)、CagA 45-67(DPDQKPIVDKNDRDNRQ AFDGIS)、CagA 149-164(NIIQPPIPDDKEKAEF)、CagA 196-217(KERQEAEKNGGPTGGDWLDIFL)、CagA 419-433(SEKEKEKFQNEIEDF）、CagA824-840(AQQAQKNEDFNTGKNSE)。

步骤3）所述的佐剂优选可引起Th1细胞应答的佐剂，具体可以为霍乱毒素B亚单位（CTB）、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）、突变体LTKA63、CPG ODN 1863、MPLA（Monophosphoryl Lipid A）、N-Glycolyl-MDP VacciGrade或AddaVax。

上述疫苗可以制成滴鼻剂、口服剂、皮下和肌肉注射剂。

将上述疫苗通过滴鼻或皮下注射等途径对BALB/c小鼠进行免疫。通过先免疫后攻毒或先攻毒后免疫两种方式分别对疫苗的预防或治疗幽门螺杆菌感染的效果进行评价。评价结果显示，滴鼻和皮下两种免疫方式均能获得较好的免疫效果。小鼠血清中抗体水平测定结果显示，疫苗组产生了高水平的IgG抗体，并且效价非常高，其中皮下免疫组的抗体效价又要明显高于滴鼻免疫组，表明该蛋白具有非常好的免疫原性。此外，免疫过的小鼠胃粘膜上sIgA的水平与对照组相比也明显升高。

通过测定疫苗组和对照组小鼠胃组织中幽门螺杆菌的定值量，发现疫苗组小鼠胃组织中的幽门螺杆菌的定值量要显著低于对照组，说明疫苗具有一定的保护性。

以上结果表明，本发明中的疫苗蛋白可诱导胃组织中特异性sIgA的生成以及血清中高效价的特异性IgG的形成，并且能够有效降低小鼠胃内幽门螺杆菌的定值量，具有显著的保护效果。本发明中的疫苗蛋白可以被抗原递呈细胞加工处理为T细胞表位，并与MHC-II分子形成复合物，复合物被提呈到具有相应受体的T细胞表面，从而介导强烈的Th1细胞免疫应答，有助于预防和治疗幽门螺杆菌感染。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是重组质粒pET 30a-EpiVac的酶切电泳图，泳道1是marker，泳道2是酶切的重组质粒pET 30a-EpiVac。

图2是重组蛋白EpiVac的表达。泳道1为重组菌菌液诱导前，泳道2为重组菌菌液诱导后，泳道3为用超声破碎后上清的检测结果，泳道4为超声破碎后上清的检测结果，泳道5为蛋白质分子量标准，自上而下依次为170Kd，130Kd，95Kd，72Kd，55Kd，43Kd，34Kd，26Kd和17Kd。

图3是纯化后的疫苗蛋白的SDS-PAGE检测。泳道1为疫苗蛋白的SDS-PAGE检测结果，泳道2为蛋白分子量标准，自上而下依次为94Kd,67Kd,45Kd,30Kd,20Kd,l4.4Kd。

图4是疫苗蛋白的免疫原性和免疫反应性检测。泳道1所用一抗是正常小鼠的血清，泳道2所用一抗是EpiVac抗血清，泳道3所用一抗是抗组氨酸标签抗体。

图5是小鼠血清IgG的滴度（预防组）。

图6是用real-time PCR的方法检测IFN-γ，IL-4与看家基因β-Actin的相对含量（预防组）。

图7是小鼠胃组织中的sIgA水平（预防组）。

图8是小鼠胃组织中幽门螺杆菌定值量（预防组）。

图9是小鼠血清IgG的滴度（治疗组）。

图10是用real-time PCR的方法检测IFN-γ，IL-4与看家基因β-Actin的相对含量（治疗组）。

图11是小鼠胃组织中slgA的水平（治疗组）。

图12是小鼠胃组织中幽门螺杆菌定值量（治疗组）。

具体实施方式

实施例1重组质粒的构建

利用大肠杆菌偏爱的密码子合成疫苗蛋白的编码基因EpiVac，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。将EpiVac插入质粒载体pET 30a，得到重组质粒，命名为pET 30a-EpiVac。将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，将转化后的感受态细胞接种于含终浓度为30μg/ml卡那霉素的LB平板上进行抗性选择，挑取单克隆，采用全菌PCR方法及重组质粒限制性酶切鉴定重组子。重组质粒酶切鉴定正确，经测序鉴定也正确，其酶切电泳图请参照图1。

实施例2疫苗蛋白的诱导表达和表达形式的鉴定

将实施例1中制得的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆，接种于10m1含终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养过夜,然后以1:100的体积比接种于新鲜的LB培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养，待菌体密度OD_600nm到0.6左右时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导培养5h。收集菌体超声破碎，12000rpm/min离心30min，将得到的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析，确定目的蛋白的表达形式。结果表明，重组蛋白EpiVac为包涵体蛋白，重组蛋白EpiVac的表达情况以及表达形式如图2所示。其中，泳道1为重组菌菌液诱导前，泳道2为重组菌菌液诱导后，泳道3为用超声破碎后上清的检测结果，泳道4为超声破碎后上清的检测结果，泳道5为蛋白质分子量标准，自上而下依次为170Kd，130Kd，95Kd，72Kd，55Kd，43Kd，34Kd，26Kd和17Kd。

实施例3疫苗蛋白的纯化

将1L诱导后的重组菌离心后收集菌体，PBS洗涤一次，然后将菌体重悬在100ml A液（20mM Tris，5mM EDTA）中，高压均质仪破碎，4℃条件下800×g离心20min，弃沉淀，上清再于8000rpm/min离心30min，弃上清得包涵体。包涵体用B液（20mM Tris，5m MEDTA，1%Triton）分散并搅拌1h。再于8000rpm/min离心30min，沉淀用C液（20mM Tris，5mM EDTA，2M尿素）分散并搅拌10min，再次离心将沉淀溶解于裂解液中（20mM Tris，8M尿素，pH 8.5）。用0.22um的滤膜过滤，滤液用亲和层析进行纯化。使用Invitrogen公司的Ni-NTAAgarose柱，通过重组蛋白N端的6×His标签与Ni的亲和作用纯化蛋白。先用结合缓冲液(20mMPB，0.5M NaCl，8M尿素)平衡Ni柱，上样后，用洗涤缓冲液（20mM PB，0.5M NaCl，8M尿素，20mM咪唑)洗去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液(20mM PB，0.5M NaCl，8M尿素，250mM咪唑)将目的蛋白洗脱下来。将各批次的目的蛋白浓缩，合并和冻干。

将纯化后的疫苗蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示。其中，泳道1为疫苗蛋白的SDS-PAGE检测结果，泳道2为蛋白分子量标准，自上而下依次为94Kd,67Kd,45Kd,30Kd,20Kd,l4.4Kd。

实施例4疫苗蛋白浓度的测定

首先制作BSA蛋白的浓度梯度，分别配制成0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml  、250μg/ml的BSA的溶液。取9支1.5ml离心管，分别加入以上各浓度的BSA蛋白质溶液。随机抽取三瓶疫苗蛋白冻干品，加入1ml双蒸水配制成疫苗蛋白溶液，并以不同浓度梯度进行稀释。取各浓度的BSA蛋白质溶液以及样品稀释液各200μl。再在各管中加入1ml稳定型碱性铜试剂，室温静置10min，然后在各管中加入100ulFolin-酚试剂，于室温静置30min。以0号管为空白对照，在分光光度计上测各管的OD_750nm值。以各浓度的OD_750nm平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。在标准曲线上确定出该样品稀释液的蛋白质浓度。结果表明，每瓶疫苗蛋白冻干品中含有蛋白的量为2.354mg。

实施例5疫苗蛋白抗体的制备

用上述实施例中获得的疫苗蛋白免疫BALB/c雌性小鼠（第三军医大学实验动物中心），每次免疫5只小鼠，免疫剂量为100μg，每1周免疫1次，共免疫三次，其中基础免疫一次，加强免疫两次。基础免疫将疫苗蛋白和等体积弗氏完全佐剂混合，加强免疫将疫苗蛋白和等体积弗氏不完全佐剂混合。免疫结束后15天，取眼球静脉血，5000×g离心15min收集血清，测定抗体效价。

用包被液（含2.9%NaHCO₃和1.9%Na₂CO₃的水溶液）溶解疫苗蛋白，至终浓度为1μg/ml,，4℃条件下以每孔100μl的量包被过夜。洗板后，加入终浓度为1%BSA的PBST溶液200μl，4℃条件下封闭过夜。加入不同浓度梯度的一抗及对照血清各100μl，37℃孵育40分钟，洗板。然后加入100μl辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，37℃孵育40分钟，洗板。再加入底物邻苯二胺（OPD），室温避光显色数分钟后加入2mol/L的H₂SO₄50μl终止反应。以疫苗蛋白免疫小鼠血清OD_492nm检测值大于对照血清的检测值的2倍为阳性。结果表明，疫苗蛋白免疫小鼠后得到的抗体效价均在256000×以上。

实施例6免疫印记法检测疫苗蛋白的免疫原性

取冻干疫苗蛋白进行SDS-PAGE，每孔的上样量约3μg。采用Bio-Rad的半干转膜装置，转膜恒定电压为20V，转膜时间为25分钟。转膜完毕后，把PVDF膜置于TBST Buffer中漂洗2min。吸尽洗涤液，加入封闭液（5%的脱脂蛋白粉），室温封闭1h。使用封闭液（5%的脱脂蛋白粉）对本室自制抗体进行稀释（稀释度为1：10000）。用台式真空泵吸尽封闭液，加入稀释好的一抗，室温于孵育1h，或4℃孵育过夜。倾去一抗后，加入TBST Buffer进行洗涤，每次洗涤10分钟，共洗涤3次，换洗涤液的同时进行翻面。二抗的稀释：使用TBST Buffer对辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗（山羊抗鼠IgG）进行稀释（稀释度为1：5000）。台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温孵育1h。倾去二抗后，加入TBSTBuffer进行洗涤，每次洗涤10分钟，共洗涤3次，换洗涤液的同时进行翻面将洗涤后的PVDF膜置于DAB显色液中避光显色，待目的条带显色后水洗终止显色。结果如图4所示，见特异反应带，可见疫苗蛋白具有免疫原性。

实施例7疫苗蛋白的免疫保护性评价

1、预防免疫及攻毒实验方案

将上述实施例制备的疫苗蛋白和不同佐剂进行混合免疫小鼠。具体的免疫方案如下：

实验动物：BALB/c小鼠雌性6-8周龄

免疫方式：滴鼻、皮下

免疫体积：滴鼻：10ul；皮下：200ul

实验分组：

①PBS对照组；滴鼻四次（第0、1、2、3周）

②Epivac抗原免疫组；滴鼻四次（第0、1、2、3周）

③LTB-epivac疫苗免疫组（低剂量10ug/只）滴鼻四次（第0、1、2、3周）

④LTB-epivac疫苗免疫组（高剂量50ug/只）滴鼻四次（第0、1、2、3周）

⑤Epivac（50ug/只）+CpG（20ug/只）滴鼻四次（第0、1、2、3周）

⑥Epivac（100ug/只）+CpG（20ug/只）皮下三次（第0、2、4周）

⑦Epivac（100ug/只）+MDP（30ug/只）皮下三次（第0、2、4周）

⑧Epivac（100ug/只）+MPLA（10ug/只）皮下三次（第0、2、4周）

⑨Epivac（100ug/只）+Aju59（体积1:1）皮下三次（第0、2、4周）

最后一次免疫两周以后，对小鼠灌胃给予幽门螺杆菌B₀进行攻毒实验，每只小鼠灌胃给予1.0×10⁸CFU幽门螺杆菌，每天灌胃一次，共灌胃4次。攻毒两周后，4周后处死小鼠，评价疫苗蛋白的免疫保护效果。

2、血清中IgG抗体的检测

将上述步骤获得的免疫血清进行初始稀释（滴鼻组以100×稀释，皮下免疫组以1000×稀释）然后以2倍倍比依次稀释作为一抗，分别测定各稀释度的免疫血清的OD_490nm值。以OD_490nm值大于对照组OD值平均值1倍对应的稀释度作为抗体的效价。测定结果如图5所示，与PBS组相比，疫苗蛋白与佐剂联用各组IgG的水平大幅提高，滴鼻组的抗体效价明显低于皮下免疫组。

3．细胞免疫应答的分型

取1×10⁷小鼠脾淋巴细胞入1ml TRIzol，反复吸打。于室温放置10分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡，室温放置10分钟。于4℃12000rpm离心15分钟。吸取水相转移到新的EP管中。用异丙醇沉淀水相中的RNA。加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。4℃12000rpm离心10分钟，用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。4℃不超过7500rpm离心5分钟，弃上清。室温放置干燥RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。加入30μl无RNase的水，得小鼠脾淋巴细胞的总RNA。

将所提取小鼠脾淋巴细胞的总RNA逆转录为cDNA，并用real-timePCR的方法检测IFN-γ，IL-4，β-actin的相对含量，检测结果如图6所示，说明不管是采用滴鼻还是皮下注射的免疫方式，都能表现出Th1为主导的免疫反应。

3、胃组织中sIgA的制备及其抗体水平检测

最后一次免疫两周后，取小鼠胃组织的1/4，向其中加入500μl PBS溶液，匀浆后8000rpm离心10min，取上清，得到胃组织中的sIgA溶液。

将上述实施例中制备的疫苗蛋白以1μg/ml的浓度包被96孔板，分别以上述获得的胃组织中的sIgA作为一抗，以HRP标记的兔抗小鼠IgA为二抗，测定OD_492nm，同时以PBS组小鼠作为对照。实验设三次重复，小鼠胃组织中sIgA水平的测定结果如图7所示，结果表明，疫苗蛋白和佐剂混合后免疫小鼠，在小鼠的胃组织中检测到相对于对照组明显升高的sIgA抗体。

4、胃组织中幽门螺杆菌的定值量

取上述步骤1中处死的小鼠的胃组织的1/2，加入500μl生理盐水，匀浆后8000rpm离心10min，弃上清得胃组织研磨碎片。用细菌基因组提取试剂盒提取组织研磨碎片中的基因组。用实时定量PCR的方法检测幽门螺杆菌的定值量，具体步骤如下：合成引物和探针，幽门螺杆菌特异性基因16srDNA的引物：上游引物：5’-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3’（SEQ ID NO:3所示）,下游引物：5’-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3’（SEQ ID NO:4所示），Taqman探针：5’-FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA-3’。用上述提取的胃组织基因组进行实时定量PCR，根据标准曲线计算出小鼠胃组织中幽门螺杆菌的定值量（Roussel Y，Wilks M,Harris A,Mein C,Tabaqchali S.Evaluation of DNAextraction methods from mouse stomachs for the quantification of H.pylori byreal-time PCR.J Microbiol Methods 2005;62(1):71-81）。测定结果如图8所示，将保护性定义为:胃组织中菌体载量显著性降低。结果表明，疫苗蛋白免疫组小鼠、胃组织中的菌体载量的差异有统计学意义（P<0.01），疫苗蛋白对幽门螺杆菌感染具有保护性，能显著降低幽门螺杆菌在小鼠胃组织中的定值，具有一定的保护性作用。

实施例8疫苗蛋白的免疫治疗性评价

1、建立幽门螺杆菌呢感染模型和免疫治疗

对小鼠灌胃给予幽门螺杆菌B₀，每只小鼠灌胃给予1.0×10⁸CFU幽门螺杆菌，每天灌胃一次，共灌胃4次，建立感染模型。感染两周后，抽样检测感染率，感染成功后采用以下方案进行免疫治疗：

实验动物：Blab/c小鼠雌性6-8周龄

免疫方式：滴鼻、皮下

免疫体积：滴鼻：<10ul；皮下：<200ul

试验分组：

以幽门螺杆菌感染成功小鼠为模型：每组7只

①PBS对照组；滴鼻四次（第0、4、8、12天）

②Epivac抗原免疫组；（50ug/只）滴鼻四次（第0、4、8、12天）

③LTB-epivac疫苗免疫组（低剂量10ug/只）滴鼻四次（第0、4、8、12天）

④LTB-epivac疫苗免疫组（高剂量50ug/只）滴鼻四次（第0、4、8、12天）

⑤Epivac（50ug/只）+CpG（20ug/只）滴鼻四次（第0、4、8、12天）

⑥Epivac（100ug/只）+CpG（20ug/只）皮下三次（第0、7、14天）

⑦Epivac（100ug/只）+MDP（30ug/只）皮下三次（第0、7、14天）

⑧Epivac（100ug/只）+MPLA（10ug/只）皮下三次（第0、7、14天）

2、血清中IgG抗体的检测

将上述步骤获得的免疫血清进行初始稀释（滴鼻组以100×稀释，皮下免疫组以1000×稀释）然后以2倍倍比依次稀释作为一抗，分别测定各稀释度的免疫血清的OD_490nm值。以OD_490nm值大于对照组OD值平均值2倍对应的稀释度作为抗体的效价，测定结果如图9所示。与PBS组相比，疫苗蛋白与佐剂联用各组IgG的水平均大幅提高。

3、细胞免疫应答的分型

取1×10⁷小鼠脾淋巴细胞入1ml TRIzol，反复吸打。于室温放置10分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡，室温放置10分钟。于4℃12000rpm离心15分钟。吸取水相转移到新的EP管中。用异丙醇沉淀水相中的RNA。加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。4℃12000rpm离心10分钟，用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。4℃不超过7500rpm离心5分钟，弃上清。室温放置干燥RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。加入30μl无RNase的水，得小鼠脾淋巴细胞的总RNA。

将所提取小鼠脾淋巴细胞的总RNA逆转录为cDNA，并用real-timePCR的方法检测IFN-γ，IL-4，β-actin的相对含量，检测结果如图10所示，说明不管是采用滴鼻还是皮下注射的免疫方式，都能表现出Th1为主导的免疫反应。

4、胃组织中sIgA的制备及其抗体水平检测

最后一次免疫两周后，取小鼠胃组织的1/4，向其中加入500μl PBS溶液，匀浆后8000rpm离心10min，取上清，得到胃组织中的sIgA溶液。

将上述制备的疫苗蛋白以1μg/ml的浓度包被96孔板，分别以上述获得的胃组织中的sIgA作为一抗，以HRP标记的兔抗小鼠IgA为二抗，测定OD_492nm，同时以PBS组小鼠作为对照。实验设三次重复，小鼠胃组织中sIgA水平的测定结果如图11所示，结果表明，疫苗蛋白和佐剂混合后免疫小鼠，在小鼠的胃组织中检测到相对于对照组明显升高的sIgA抗体。

5、胃组织中幽门螺杆菌的定值量

取上述步骤1中处死的小鼠的胃组织的1/2，加入500μl生理盐水，匀浆后8000rpm离心10min，弃上清得胃组织研磨碎片。用细菌基因组提取试剂盒提取组织研磨碎片中的基因组。用实时定量PCR的方法检测幽门螺杆菌的定值量，具体步骤如下：合成引物和探针，幽门螺杆菌特异性基因16srDNA的引物：上游引物：5’-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3’（SEQ ID NO:3所示）,下游引物：5’-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3’（SEQID NO:4所示），Taqman探针：5’-FAM-CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA-3’。用上述提取的胃组织基因组进行实时定量PCR，根据标准曲线计算出小鼠胃组织中幽门螺杆菌的定值量。

测定结果如图12所示，将具有治疗作用定义为：感染后的小鼠在免疫治疗后胃组织中幽门螺杆菌的定值量显著性降低。结果表明，，疫苗蛋白免疫组小鼠胃组织中的菌体定值量与PBS组之间差异有统计学意义，疫苗蛋白对幽门螺杆菌感染具有治疗作用。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (9)

1. 一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3. 权利要求1所述的融合蛋白在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的制剂中的应用。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂为疫苗。

5. 一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的多表位疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的融合蛋白。

6. 根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，还包含医学上可接受的免疫佐剂。

7. 根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为霍乱毒素B亚单位 (CTB)、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)、突变体LTKA63、CPG ODN 1826、 N-糖基化胞壁酰二肽或AddaVax。

8. 一种权利要求5所述预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的多表位疫苗的制备方法，其特征在于，包含步骤：

1）将编码幽门螺杆菌膜表面蛋白抗原HpaA、CagA、UreB的T细胞表位的序列进行串联，形成融合蛋白表达序列，然后与表达载体连接重组表达载体；

2）将步骤1）制得的重组表达载体转入宿主菌表达该融合蛋白；

3）将步骤2）制得的融合蛋白与医学上可接受的免疫佐剂混合，制得所述疫苗。

9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3）所述的免疫佐剂为霍乱毒素B亚单位 (CTB)、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)、突变体LTKA63、CPG ODN 1826、 N-糖基化胞壁酰二肽或AddaVax。

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