CN107281486A - 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107281486A
CN107281486A CN201710501689.XA CN201710501689A CN107281486A CN 107281486 A CN107281486 A CN 107281486A CN 201710501689 A CN201710501689 A CN 201710501689A CN 107281486 A CN107281486 A CN 107281486A
Authority
CN
China
Prior art keywords
subunit
vaccine
heat
seq
pathogenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710501689.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107281486B (zh
Inventor
张雪寒
孙小涵
张碧成
郭芸芸
俞正玉
祝昊丹
汪伟
何孔旺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201710501689.XA priority Critical patent/CN107281486B/zh
Publication of CN107281486A publication Critical patent/CN107281486A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107281486B publication Critical patent/CN107281486B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法，属于生物制药领域。该粘膜免疫增强剂含有质量比为（0.2‑4）:1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白、不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明还提供一种口蹄疫疫苗，含有灭活的口蹄疫病毒、25‑80μg/mL非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和25‑80μg/mL不耐热肠毒素B亚基。本发明粘膜免疫增强剂，能够显著提高免疫动物对抗原的免疫应答，尤其是黏膜免疫应答；含有所述免疫增强剂的灭活疫苗免疫后能够诱导高滴度IgG和sIgA，免疫效果好。

Description

一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-MouthDisease Virus, FMDV）引起的一种使偶蹄类动物发生的急性、热性高度接触性的传染病，以口腔粘膜和蹄部皮肤水泡和溃疡为主要临床症状。我国将FMD列为第一类动物疾病。目前，疫苗接种仍然是我国预防口蹄疫的主要手段。现在使用的口蹄疫疫苗主要以灭活疫苗为主，但是现有灭活疫苗的缺点很明显，抗体水平较低、不能诱导产生粘膜抗体。FMDV主要经粘膜感染，而预防接种主要以注射为主，如果能在注射的同时，诱导产生粘膜抗体，则会筑起预防口蹄疫病毒感染的第一道防线，而且大大降低防治工作的人力成本。
IgA（免疫球蛋白A ）主要分布在唾液、泪液、肠胃液、乳汁以及呼吸道分泌液等外分泌液当中，是黏膜免疫产生的主要抗体。细菌鞭毛蛋白（Flagella, F）和不耐热肠毒素（Labile toxin, LT）是具有良好免疫增强效果的佐剂，单一使用时能在一定程度上提高血清中和抗体效价，但诱导产生的IgA抗体滴度较低，甚至检测不到。
发明内容
本发明的目的：一是提供一种粘膜免疫增强剂，能够显著提高免疫动物对抗原的免疫应答，尤其是黏膜免疫应答； 二是提供含有所述免疫增强剂的灭活疫苗，其免疫后能够诱导高滴度IgG和sIgA，免疫效果好。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂，含有质量比为（0.2-4）:1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明中，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白采用如下方法制备：将非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的编码基因插入表达载体，然后转化大肠杆菌，获得重组菌；诱导重组菌表达非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白，纯化后得到。
在本发明中，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO：3所示。
在本发明中，所述不耐热肠毒素B亚基采用如下方法制备：将不耐热肠毒素B亚基的编码基因插入表达载体，然后转化大肠杆菌，获得重组菌；诱导重组菌表达不耐热肠毒素B亚基，纯化后得到。
在本发明中，所述不耐热肠毒素B亚基的编码基因序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供一种口蹄疫疫苗，含有灭活的口蹄疫病毒、25-80μg/mL非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和25-80μg/mL不耐热肠毒素B亚基，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供所述口蹄疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：将含有质量比为（0.2-4）:1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基的水溶液与灭活口蹄疫病毒液按照体积比为10:90进行混合，得到疫苗水相；将疫苗水相与ISA206佐剂按照体积比1:1混合，乳化，得到口蹄疫疫苗；所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
有益效果：
采用本发明提供的粘膜免疫增强剂制备的口蹄疫疫苗，皮下免疫能够同时诱导高滴度IgG和IgA，解决了现有口蹄疫灭活疫苗仅诱导产生IgG，不能诱导产生高滴度粘膜抗体的问题。本发明粘膜免疫增强剂制备的口蹄疫疫苗由于诱导产生了较高的IgA抗体水平，防控口蹄疫病毒感染的第一道防线，降低侵入门户-口咽部和鼻咽部的带毒量，大大降低防治工作的人力成本。
附图说明：
图1：纯化后的重组蛋白F的SDS-PAGE电泳图，M：中分子量蛋白质Marker；1：纯化后的重组蛋白F。
图2：纯化后的重组蛋白LTB的SDS-PAGE电泳图，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化后的重组蛋白LTB。
图3：仔猪免疫后血清中平均IgG抗体水平。
图4：仔猪免疫后猪鼻拭子中平均IgA抗体水平。
具体实施方式
实施例1：制备鞭毛蛋白（F）和不耐热肠毒素B亚基（LTB）
1、重组质粒的构建
非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白（缩写为F）的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。不耐热肠毒素B亚基（缩写为LTB）的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。申请人利用计算机软件对F和LTB的编码基因进行了密码子优化，优化后的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。将密码子优化后的F和LTB编码基因送金斯瑞公司合成。将两条合成序列分别克隆到pCold I载体的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pCold I-F（插入了SEQ ID NO:3）和pCold I-LTB（插入了SEQ ID NO:4）。
2、重组菌的构建及鉴定
将获得的重组质粒pCold I-F和pCold I-LTB分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养。挑取平板上的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，经EcoRⅠ与SalⅠ双酶切鉴定，然后用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。pCold I-F重组质粒酶切后，可见大小约为1500bp的条带，为F片段。pCold I-LTB重组质粒酶切后，可见大小约为300bp的条带，为LTB片段。将成功导入了pCold I-F重组质粒的大肠杆菌BL21命名为重组菌pCold I-F/BL21，将成功导入了pCold I-LTB重组质粒的大肠杆菌BL21命名为重组菌pCold I-LTB /BL21。
将空质粒pCold I转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到对照菌株pCold I/BL21。
3、重组蛋白的诱导表达
分别诱导重组菌pCold I-F/BL21和pCold I-LTB/BL21表达重组蛋白F和LTB，阴性对照为对照菌株pCold I/BL21。具体方法如下：
（1）挑取重组菌的单菌落，接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基（含有10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母粉，10g/LNaCl）中，37℃过夜培养。
（2）取步骤（1）得到的重组菌培养液100μl，接种于新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基中，在37℃培养2-3h，使OD600达到1.0-2.0。
（3）向OD600达到1.0-2.0的菌液中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，16℃继续培养24h。
（4）将诱导表达后的重组菌pCold I-F/BL21、pCold I-LTB/BL21和对照菌株pColdI/BL21在4℃、12000rpm 条件下离心10min，收集菌体；将菌体用PBS 缓冲液（0.05M，pH7.2）洗涤2 次后进行重悬。
（5）将菌体悬液置于冰浴中，用超声波裂解菌体，功率为200W，超声裂解5s，停顿5s，直至菌液澄清，得到各重组菌的裂解液。
（6）将各重组菌的裂解液，在4℃、12000rpm 条件下离心15min，分别收集各重组菌的裂解液上清。采用His TrapTMHP柱（GE公司）纯化重组蛋白F和LTB。采用SDS-PAGE电泳检测重组蛋白F和LTB的纯化效果，并测定蛋白浓度。
从图1可以看到，在纯化后的重组蛋白F泳道上出现了大小约为51kDa的条带，纯度达到85%以上。从图2可以看出，在纯化后的重组蛋白LTB泳道上出现了大小约为12kDa的条带，纯度达到95%以上。
实施例2 口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂及对照免疫增强剂的配制
重组蛋白F和LTB按照实施例1中方法制备，FMDV灭活病毒液（猪O 型口蹄疫病毒缅甸98株，4ug/ml）由兰州兽医研究所提供，ISA206由上海Seppic公司提供。PBS缓冲液（磷酸盐缓冲液，pH=7.4, 0.01mM）是含有磷酸二氢钾 0.27g/L、磷酸氢二钠 1.42g/L、氯化钠 8g/L和氯化钾 0.2g/L的水溶液，购自南京助研生物科技有限公司。
1.口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂及采用该免疫增强剂制备的疫苗
（1）配制粘膜免疫增强剂A、B和C
配制重组蛋白F母液：用PBS缓冲液将实施例1中纯化后的重组蛋白F配制成浓度为2.0mg/mL 的溶液，备用。
配制重组蛋白LTB母液：用PBS缓冲液将实施例1中纯化后的重组蛋白LTB配制成浓度为2.0 mg/mL 的溶液，备用。
将重组蛋白F母液和重组蛋白LTB母液分别按照体积比为2:5、5:2和1:1混合，制备得到粘膜免疫增强剂A、B和C，具体见表1。
表1 各黏膜免疫增强剂及其组成和含量
黏膜免疫增强剂编号 F母液：LTB母液（V/V） F浓度 LTB浓度
A 2:5 0.57mg/mL 1.43mg/mL
B 5:2 1.43mg/mL 0.57mg/mL
C 1:1 1.00mg/mL 1.00mg/mL
（2）配制口蹄疫疫苗A、B和C
将FMDV灭活病毒液分别与粘膜免疫增强剂A、B和C按照体积比为90:10进行混合，得到疫苗水相；将各疫苗水相分别与ISA206（Seppic 公司）按照体积比1:1混合，乳化，制备成剂型为W/O/W的口蹄疫疫苗A、B和C。口蹄疫疫苗编号与采用的粘膜免疫增强剂编号相对应。
2.配制对照疫苗
对照疫苗1：将重组蛋白F母液采用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，然后将该稀释液与FMDV灭活毒液按照体积比10:90进行混合，得到疫苗水相；将疫苗水相与ISA206按照体积比1:1混合，乳化，制备对照疫苗1。
对照疫苗2：将重组蛋白LTB母液采用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，然后将该稀释液与FMDV灭活毒液按照体积比10:90进行混合，得到疫苗水相；将疫苗水相与ISA206按照体积比1:1混合，乳化，制备对照疫苗2。
对照疫苗3：取FMDV灭活毒液与PBS缓冲液按照体积比90:10混合制备水相溶液，再与ISA206按照体积比1:1混合，乳化，制备对照疫苗3。
对照疫苗4：ISA206佐剂。
实施例3：口蹄疫疫苗A、B和C对猪的免疫效果
免疫方法：取60日龄、健康的FMDV阴性仔猪35头，随机分成7组，每组5只。将口蹄疫疫苗A、口蹄疫疫苗B、口蹄疫疫苗C、对照苗1、对照苗2、对照苗3、对照苗4各免疫一组仔猪，免疫剂量均为2 ml/头。分别于免疫后14天、28天和56天，采血测定IgG抗体水平，采集鼻拭子检测IgA抗体水平。
检测方法：采用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒（韩国金诺）检测IgG抗体水平，方法参照说明书，OD450小于0.6 判为阳性，OD450大于0.6判为阴性。采用间接ELISA法检测鼻拭子中IgA滴度，当S/N大于2.1时待检样品最大稀释倍数的倒数即为IgA抗体滴度，其中S是待检测样品（Sample）的OD450，N是阴性对照的OD450。间接ELISA法检测IgA滴度的步骤：将鼻拭子放置500μl PBS缓冲液（同实施例2）中，4℃ 静置2 h，振荡器震摇5-6下后，取出棉拭子，所得沥出液，即可用于IgA的检测。以灭活的FMDV全病毒（猪O 型口蹄疫病毒缅甸98 株）为抗原包被ELISA反应板，4℃包被过夜，PBST液（含0.05% Tween-20的PBS缓冲液）洗板3次；用含5%脱脂乳的PBST液于37 ℃封闭 1 h，PBST液洗板3次；采用PBST按一定的倍数稀释待检样品和阴性对照（阴性猪的鼻拭子沥出液），然后以100 μL/孔的量加入包被板中， 37 ℃反应1 h，PBST液洗3次；加入1:10000稀释的HRP-羊抗猪 IgA抗体（美国BETHYL公司），37 ℃反应1 h，PBST液洗5次。加TMB底物显色液（南京助研生物科技有限公司），37 ℃避光显色10min，加终止液（2M的硫酸水溶液），酶标测定仪在波长450 nm处测定每孔的光吸收值OD450。
结果分析：
（1）疫苗的免疫效力-血清平均IgG抗体水平
血清平均IgG抗体水平检测结果见图3。从图3可见，仔猪免疫疫苗A、B和C后28天，所有猪只血清的OD450均远远小于0.6，均一度良好，抗体阳转率为100%，所有猪只血清的平均OD450均远远小于0.6，说明免疫后仔猪产生了FMDV特异性的IgG；仔猪免疫对照疫苗1、2、3和4后28天，大部分猪只血清的OD450处于临界值，阳转率低。对照疫苗4，为阴性对照（只免疫佐剂），无阳转；对照疫苗1、2和3阳转率介于40%-60%。
（2）疫苗的免疫效力-鼻拭子中平均IgA滴度
鼻拭子中平均IgA滴度的检测结果见图4。从图4可见，仔猪免疫疫苗A、B和C后28～56天，鼻拭子中IgA滴度在76-140之间，而对照苗1、2、3和4免疫后的仔猪IgA滴度在1.4-10.4之间。
上述结果说明，重组蛋白F和LTB复配后作为口蹄疫疫苗的佐剂，能够诱导高滴度的IgG和IgA，尤其是IgA滴度水平是对照疫苗免疫后的至少7倍以上，说明本发明口蹄疫疫苗免疫佐剂能够显著提高免疫动物对抗原的黏膜免疫应答。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法
<130> 20170626-2
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 498
<212> PRT
<213> 非致病性大肠杆菌
<400> 1
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr
85 90 95
Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile
100 105 110
Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met
130 135 140
Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Ser Val Lys
165 170 175
Asn Asn Asp Thr Val Thr Thr Ser Ala Pro Val Thr Ala Phe Gly Ala
180 185 190
Thr Thr Thr Asn Asn Ile Lys Leu Thr Gly Ile Thr Leu Ser Thr Glu
195 200 205
Ala Ala Thr Asp Thr Gly Gly Thr Asn Pro Ala Ser Ile Glu Gly Val
210 215 220
Tyr Thr Asp Asn Gly Asn Asp Tyr Tyr Ala Lys Ile Thr Gly Gly Asp
225 230 235 240
Asn Asp Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Thr Val Ala Asn Asp Gly Thr Val
245 250 255
Thr Met Ala Thr Gly Ala Thr Ala Asn Ala Thr Val Thr Asp Ala Asn
260 265 270
Thr Thr Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Pro Val Gln Ile
275 280 285
Asp Asn Thr Ala Gly Ser Ala Thr Ala Asn Leu Gly Ala Val Ser Leu
290 295 300
Val Lys Leu Gln Asp Ser Lys Gly Asn Asp Thr Asp Thr Tyr Ala Leu
305 310 315 320
Lys Asp Thr Asn Gly Asn Leu Tyr Ala Ala Asp Val Asn Glu Thr Thr
325 330 335
Gly Ala Val Ser Val Lys Thr Ile Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Gly Ala
340 345 350
Ala Ser Ser Pro Thr Ala Val Lys Leu Gly Gly Asp Asp Gly Lys Thr
355 360 365
Glu Val Val Asp Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ser Ala Asp Leu Asn
370 375 380
Gly Gly Asn Leu Gln Thr Gly Leu Thr Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr
385 390 395 400
Ala Val Ala Asn Gly Lys Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp
405 410 415
Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln
420 425 430
Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn
435 440 445
Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu
450 455 460
Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser
465 470 475 480
Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu
485 490 495
Gln Gly
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 致病性大肠杆菌
<400> 2
Met Asn Lys Val Lys Phe Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Leu Cys Ala His Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu
20 25 30
Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr
35 40 45
Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys
50 55 60
Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp
65 70 75 80
Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr
85 90 95
Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys
100 105 110
Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn
115 120
<210> 3
<211> 1494
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 鞭毛蛋白编码基因
<400> 3
atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tgtcaacaag 60
aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120
gcgaaggatg acgcagcggg tcaggcgatt gctaaccgtt tcacctctaa cattaaaggc 180
ctgactcagg cggcccgtaa cgccaacgac ggtatctccg ttgcgcagac caccgaaggc 240
gcgctgtccg aaatcaacaa caacttacag cgtgtgcgtg aactgacggt acaggccact 300
accggtacta actctgagtc tgatctgtct tctatccagg acgaaattaa atcccgtctg 360
gatgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctggcaaaa 420
aatggctcca tgaaaatcca ggttggcgca aatgataacc agactatcac tatcgatctg 480
aagcagattg atgctaaaac tcttggcctt gatggtttta gcgttaaaaa taacgataca 540
gtaaccacta gtgctccagt aactgctttt ggtgctacca ccacaaacaa tattaaactt 600
actggaatta ccctttctac ggaagcagcc actgatactg gcggaactaa cccagcttca 660
attgagggtg tttatactga taatggtaat gattactatg cgaaaatcac cggtggtgat 720
aacgatggga agtattacgc agtaacagtt gctaatgatg gtacagtgac aatggcgact 780
ggagcaacgg caaatgcaac tgtaactgat gcaaatacta ctaaagctac aactatcact 840
tcaggcggta cacctgttca gattgataat actgcaggtt ccgcaactgc caaccttggt 900
gctgttagct tagtaaaact gcaggattcc aagggtaatg ataccgatac atatgcgctt 960
aaagatacaa atggcaatct ttacgctgcg gatgtgaatg aaactacagg tgctgtttct 1020
gttaaaacta ttacctatac tgactcttcc ggtgccgcca gttctccaac cgcggtcaaa 1080
ctgggcggag atgatggcaa aacagaagtg gtcgatattg atggtaaaac atacgattct 1140
gccgatttaa atggcggtaa tctgcaaaca ggtttgactg ctggtggtga ggctctgact 1200
gctgttgcaa atggtaaaac cacggatccg ctgaaagcgc tggacgatgc tatcgcatct 1260
gtagacaaat tccgttcttc cctcggtgcg gtgcaaaacc gtctggattc cgcggttacc 1320
aacctgaaca acaccactac caacctgtct gaagcgcagt cccgtattca cgacgccgac 1380
tatgcgaccg aagtgtccaa tatgtcgaaa gcgcagatca tccagcaggc cggtaactcc 1440
gtgttggcaa aagctaacca ggtaccgcag caggttctgt ctctgctgca gggt 1494
<210> 4
<211> 372
<212> DNA
<213> 不耐热肠毒素B亚基
<400> 4
atgaataaag taaaatttta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atgtgcacac 60
ggagctcctc agtctattac agaactatgt tcggaatatc acaacacaca aatatatacg 120
ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc 180
attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac 240
tcccaaaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag 300
accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc 360
agtatggaaa ac 372

Claims (7)

1.一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂，含有质量比为（0.2-4）:1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂，其特征在于所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白采用如下方法制备：将非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的编码基因插入表达载体，然后转化大肠杆菌，获得重组菌；诱导重组菌表达非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白，纯化后得到。
3.根据权利要求2所述口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂，其特征在于所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1或2所述口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂，其特征在于所述不耐热肠毒素B亚基采用如下方法制备：将不耐热肠毒素B亚基的编码基因插入表达载体，然后转化大肠杆菌，获得重组菌；诱导重组菌表达不耐热肠毒素B亚基，纯化后得到。
5.根据权利要求4所述口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂，其特征在于所述不耐热肠毒素B亚基的编码基因序列如SEQ ID NO：4所示。
6.一种口蹄疫疫苗，含有灭活的口蹄疫病毒、25-80μg/mL非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和25-80μg/mL不耐热肠毒素B亚基，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
7.权利要求6所述口蹄疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：将含有质量比为（0.2-4）:1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基的水溶液与灭活口蹄疫病毒液按照体积比为10:90进行混合，得到疫苗水相；将疫苗水相与ISA206佐剂按照体积比1:1混合，乳化，得到口蹄疫疫苗；所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
CN201710501689.XA 2017-06-27 2017-06-27 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法 Expired - Fee Related CN107281486B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710501689.XA CN107281486B (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710501689.XA CN107281486B (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107281486A true CN107281486A (zh) 2017-10-24
CN107281486B CN107281486B (zh) 2020-07-31

Family

ID=60099501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710501689.XA Expired - Fee Related CN107281486B (zh) 2017-06-27 2017-06-27 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107281486B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110156881A (zh) * 2019-05-28 2019-08-23 余文庚 一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物
CN111265660A (zh) * 2020-01-19 2020-06-12 青岛明勤生物科技有限公司 一种通用型疫苗免疫增强剂

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104873967A (zh) * 2015-04-30 2015-09-02 中国农业科学院特产研究所 O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104873967A (zh) * 2015-04-30 2015-09-02 中国农业科学院特产研究所 O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKINOBU KAJIKAWA ET AL.: "Dissimilar properties of two recombinant Lactobacillus acidophilus strains displaying Salmonella FliC with different anchoring motifs.", 《APPL ENVIRON MICROBIOL》 *
NCBI: "NCBI Reference Sequence:WP_000079739.1", 《NCBI》 *
NCBI: "NCBI Reference Sequence:WP_024167713.1", 《NCBI》 *
孙小涵等: "非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对O型口蹄疫病毒的佐剂效果", 《中国农业科学》 *
王会等: "大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及其免疫增强作用的探讨", 《畜牧兽医科技信息》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110156881A (zh) * 2019-05-28 2019-08-23 余文庚 一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物
CN111265660A (zh) * 2020-01-19 2020-06-12 青岛明勤生物科技有限公司 一种通用型疫苗免疫增强剂
CN111265660B (zh) * 2020-01-19 2022-11-15 青岛明勤生物科技有限公司 一种通用型疫苗免疫增强剂

Also Published As

Publication number Publication date
CN107281486B (zh) 2020-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103172749B (zh) 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备
McEwen et al. Synthetic recombinant vaccine expressing influenza haemagglutinin epitope in Salmonella flagellin leads to partial protection in mice
CN104593397B (zh) 一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用
CN101955545B (zh) 一种多靶点重组基因及其蛋白在防治幽门螺旋杆菌感染中的应用
CN107298716A (zh) 一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法
CN102068690A (zh) 多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法
CN104693310B (zh) 一种嵌合蛋白、病毒样颗粒及其应用
CN113173977B (zh) 一种双功能抗原、其制备方法及应用
CN105949287A (zh) 一种a型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原及其应用
CN106928373A (zh) 一种猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗
CN108690126A (zh) 一种牦牛源轮状病毒重组vp6蛋白抗原与应用
CN103275912B (zh) 肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗
CN107281486A (zh) 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法
CN107961371A (zh) 季节流感-rsv联合疫苗及其制备方法和应用
CN102058881B (zh) 预防肠道病毒71型感染的基因重组疫苗及其制备方法
CN102010876A (zh) 重组枯草芽孢杆菌ev71-vp1表达载体及其制备方法与应用
CN109021115A (zh) 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
CN103421832A (zh) 包含氟苯尼考耐药基因蛋白的卵黄抗体及制备与应用
CN1973903A (zh) 预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗及其制备方法
CN110229234A (zh) 一种具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白CdtB-OppA
CN109608541A (zh) 一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法
CN108619507A (zh) 呼吸道合胞病毒-流脑联合疫苗及其制备方法
CN104610456A (zh) 一种 h7n9 亚型禽流感亚单位疫苗的制备方法及应用
CN104945513B (zh) 变形链球菌细胞表面蛋白抗原(SpaP)和葡糖基转移酶(GtfB)融合蛋白疫苗及其制备方法
CN107050443A (zh) 使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200731

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee