CN110156881A - 一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物,其包含一种增强免疫特性的佐剂，该佐剂能够快速的提高疫苗的免疫特性和杀菌特性，使得疫苗的应用前景变得更为广阔。

Description

一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物
技术领域
本申请涉及疫苗领域，具体的涉及一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物及其用途。
背景技术
肠出血性大肠杆菌((EHEC)有诸多血清型，其中血清型0157是引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis,HC)的最主要的致病菌，过去对EHEC致病机理和流行病学研究大多都来源于0157血清型展开。EHEC 0157的主要特征是表达很强毒力的志贺毒素，因此又称为产志贺毒素型大肠杆菌。
EHEC是大肠杆菌的一个亚型，是一类能引起人类的出血性肠炎的大肠杆菌，最常见的血清型有EHEC 0157:H7，不常见的血清型有0157:NM,026:H11,0121:H19,0111:H8,0125:NM,04:NM,045:H2,0103:H2,0145:NM,0113:H2,O5:NM,091:H21等。
0157:H7是EHEC最常见的血清型，也是最早被报道的EHEC。1982年，美国俄勒冈州和密歇根州暴发的出血性腹泻疫情以及加拿大握太华爆发的出血性腹泻疫情，使人们首次认识一种新型致病性大肠杆菌，即肠出血性大肠杆菌0157:H7。同年，Wells J.G在从8名美国感染患者粪样中分离出大肠杆菌0157:H7，质粒图谱分析也表明引起这两次美国疫情暴发的病原体均为大肠杆菌0157:H7。1986年，Wells J.G在调查由大肠杆菌0157:H7引起的HUS疫情以及与食用原料奶有关的HUS的两例散发病例过程中，分别从成年公牛、奶牛、犊牛的粪便中分离出大肠杆菌0157:H7，证明大肠杆菌0157:H7为人畜共患病原菌；同时从牛肉样品和原料奶样品中分别分离出大肠杆菌0157:H7，显示大肠杆菌O157:H7可能通过污染原料奶和肉制品感染人类。
目前针对该菌已经开发出了多种疫苗用于防治该病菌。CN100478028C中公开了一种多价融合型肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗，其采用肠出血性大肠杆菌O157:H7毒力抗原志贺毒素Ⅱ结合亚单位、紧密粘附素及Ⅲ型分泌蛋白A通过基因重组方法构建融合工程菌，经高密度发酵及一系列的纯化程序从而获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体产生高效的免疫应答和免疫预防保护及治疗作用。
CN101240019B公开了一种肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1重组蛋白，其包括1)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1蛋白和表达载体片段；或2)肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1蛋白羧基端经一个或几个氨基端缺失或添加获得的与Stx2a1蛋白具有相似功能的蛋白和表达载体片段；本发明还公开了上述肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素2A1亚单位活性片段Stx2a1重组蛋白的制备方法及其在制备检测试剂盒和制备防治EHEC O157:H7感染的亚单位疫苗中的应用。
本申请的发明人在前也发明了相应的疫苗，具体参见CN103275912B，具体获得重组质粒pCold-fliC-hcpA-tir-eae，在BL21(DE3)获得高效表达，经过高密度发酵和一系列的纯化程序获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获得目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体在体液免疫，但是在抗体滴度产生速度以及小鼠实验除菌速度上面还有改进的空间。
发明内容
一方面，本发明的一个目的是提供一种肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素亚单位活性片段重组蛋白。
另外一方面，本发明提供表达所述重组蛋白的重组菌的构建方法，具体为：根据GenBank中0157:H7EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：
fliC-Pl：5’-RRRRaRctcactattaccaacaaa-3'SacI
fliC_P2:5'-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3’XholI
hcpA-Pl：5’-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3’Xhol I
hcpA-P2:5'-ttt￡aattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3,EcoR I
tir-Pl：5'-gatgaattcgagccggatagccca-3'EcoR I
tir-P2：5'-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3'Sal I
eae-Pl:5'-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3,SalI eae～P2：5'-ggctctagattattctacacaaaccgc-3'XbaI 0157:H7过夜培养物，lmL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮l0min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存-20℃，用于PCR扩增用；扩增fliC片段的上下游引物分别加有SacI和XholI酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有SalI和XbaI酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；扩增hcpA片段的上下游分别引物加有XholI和EcoRI酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoRI和Sal I酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟；fliC-Pl和fliC-P2、hcpA-Pl和hcpA-P2、tir-Pl和tir-P2、eae-Pl和eae-P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和81Ibp；将扩增的PCR产物用质量比1.2％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0.5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段；将SacI和XholI酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pColdI片段4uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.OuL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用SacI和XholI双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到fliC片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC重组质粒；用XhoI和EcoRI酶切hcpA片段和pColdI-fliC重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC取4.OuL，hcpA片段取2uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.Oul，补水2uL，一同加入eppendorf管，混勾后，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA重组质粒；用EcoRI和SalI酶切tir片段和pColdI-fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC-hcpA取2.0uL，tir片段取3.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.OuL，补水3uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA-tir重组质粒；用SalI和XbaI酶切eae片段和pColdI-fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC-hcpA-tir和eae各取4.OuL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.Oul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pColdI-fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21pColdI-fliC-hcpA-tir-eae。
本发明另外一方面提供一种免疫增强佐剂，其包含免疫增强肽MY-1，其序列如SEQID NO：1所示。该多肽具有能刺激多核淋巴细胞，促进淋巴细胞分化和成熟，进而提高免疫增强的效果。
本发明另外一方面，提供一种修饰的免疫增强肽MY-1，该多肽通过mPEG-MAL-40k修饰剂进行修饰获得。
免疫增强肽MY-1，其序列如SEQ ID NO：1所示：
CLFVAMSNRWMHKHDSNQSEVEMCDRTCSTQWHSSWCPYAVQKAKVRRQ。
本课题的免疫增强肽MY-1多肽C末端半胱氨酸(Cys)，mPEG-MAL-40K修饰剂与多肽C端的Cys的游离琉基发生偶联反应。，但是为了防止自身联结，因此，在与mPEG-MAL-40k偶联反应时，多肽应处在还原的缓冲体系中，以保持其游离琉基充分暴露不形成自身二聚体。发明人经过研究发现，mPEG-MAL-40K在pH6.5-8.5的修饰缓冲体系中能特异的偶联或者多肽游离巯基上。
本发明另外提供一种改进的免疫组合物，其含有fliC-hcpA-tir重组蛋白以及含有mPEG-MAL-40k-MY-1修饰肽的佐剂，其中佐剂中还含有ISA50V(法国Seppic公司生产)。
更进一步的，所述蛋白与mPEG-MAL-40k-MY-1(0.01mg/mL)以及ISA50V按照1：0.5：0.5V/V进行分散处理制成油乳剂。
附图说明
图1为mPEG-MAL-40k结构图
图2位MY-1肽修饰后的蛋白图，其中泳道2和3位为修饰后的多肽，4和5位修饰前的多肽。
本发明的主要优点在于：针对在前发明的重组蛋白疫苗进行应用的改进，提供了一种增强免疫特性的佐剂，该佐剂能够快速的提高疫苗的免疫特性和杀菌特性，使得疫苗的应用前景变得更为广阔。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。
实施例1.免疫增强肽MY-1多肽的活化
样品处理：免疫增强肽MY-1多肽干粉以1.0mg/ml的终浓度溶解于终浓度为5mmol/l DTT、100mmol/l Na2HPO4的缓冲液中(调pH为8.0)，25℃反应4小时。
阴离子柱层析回收，除去未与Byt-C多肽还原作用的游离DTT。
其中，Q阴离子柱层析具体步骤为：Q Sepharose填料装入层析柱，室温条件下，DDW冲洗3个柱体积，用平衡缓冲液100mmol/l Na2HPO4(p H8.0)平衡3个柱体积，取样品调节pH至8.0，15.0ml/min流速匀速上样，上样结束后用平衡液平衡至电导稳定，洗脱缓冲100mmol/l Na2HPO4含200mmol/l Na Cl(pH 8.0)进行洗脱，根据214nm紫外吸收的变化收集洗脱峰，即为活化后的免疫增强肽MY-1多肽。
实施例2.免疫增强肽MY-1多肽的修饰
取活化后的免疫增强肽MY-1多肽，按照1.Omg/ml溶解于100mmo1/1Na2HP04(pH8.0)，缓冲液为修饰缓冲液(100mmo1/1Na2HP04-NaH2P04,200mmo1/1NaCl,5mmol/1Lys,2mmo1/1EDTA,pH8.0，按照摩尔比1:1加入mPEG-MAL-40k修饰剂，室温反应过夜后终止反应，取样进行SDS-PAGE分析其修饰情况。从图1的结果可以看出，泳道4和5为未修饰的多肽，泳道2和3位修饰后的多肽，从图可以看出，修饰后分子量明显加大。说明修饰成功，制备得到mPEG-MAL-40k-MY-1。
实施例3.免疫蛋白的制备
按照发明人在前发明的方法，具体的参见CN103275912A实施例第1和2部分制备纯化的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。
具体步骤如下：根据GenBank中0157:H7EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：
fliC-Pl：5’-RRRRaRctcactattaccaacaaa-3'SacI
fliC_P2:5'-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3’XholI
hcpA-Pl：5’-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3’Xhol I
hcpA-P2:5'-ttt￡aattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3,EcoR I
tir-Pl：5'-gatgaattcgagccggatagccca-3'EcoR I
tir-P2：5'-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3'Sal I
eae-Pl:5'-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3,SalI
eae～P2：5'-ggctctagattattctacacaaaccgc-3'XbaI 0157:H7过夜培养物，lmL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮l0min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存-20℃，用于PCR扩增用；扩增fliC片段的上下游引物分别加有SacI和XholI酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有SalI和XbaI酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；扩增hcpA片段的上下游分别引物加有XholI和EcoRI酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoRI和Sal I酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟；fliC-Pl和fliC-P2、hcpA-Pl和hcpA-P2、tir-Pl和tir-P2、eae-Pl和eae-P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和81Ibp；将扩增的PCR产物用质量比1.2％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0.5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段；将SacI和XholI酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pColdI片段4uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.OuL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用SacI和XholI双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到fliC片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC重组质粒；用XhoI和EcoRI酶切hcpA片段和pColdI-fliC重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC取4.OuL，hcpA片段取2uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.Oul，补水2uL，一同加入eppendorf管，混勾后，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA重组质粒；用EcoRI和SalI酶切tir片段和pColdI-fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC-hcpA取2.0uL，tir片段取3.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.OuL，补水3uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA-tir重组质粒；用SalI和XbaI酶切eae片段和pColdI-fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC-hcpA-tir和eae各取4.OuL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.Oul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pColdI-fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21pColdI-fliC-hcpA-tir-eae。
将多价重组菌BL21pColdI-fliC-hcpA-tir-eae培养物按体积比2％接种于含100μg/mL有氨苄抗生素的LB培养基(蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠5g/L)中，37℃振荡培养至A＝0.6～0.8时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0.6mM，继续15℃震荡培养24小时，诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超声裂解后，12000g离心25分钟，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小为88kD目的蛋白，主要存在于菌体上清中，获得fliC-hcpA-tir-eae多价重组蛋白。
将上述诱导多价重组菌BL21pColdI-fliC-hcpA-tir-eae经12000g离心10分钟，收集菌体，用1/10体积的螯合缓冲液重悬，再加入1mg/mL的溶菌酶，混匀后30℃作用2小时，超声波进行超声破碎，4℃12000g离心30分钟收集上清，0.45μM滤器过滤后，加入到Ni+亲和层析柱，加入洗脱缓冲液收集蛋白，即为经过纯化的fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。
实施例4多价融合蛋白亚单位疫苗的制备
将实施例3制备的多价融合蛋白控制浓度为0.2mg/mL。抗原与佐剂ISA50V(法国Seppic公司生产)按照1:1V/V进行分散处理制成油乳剂1。另外，将抗原与佐剂ISA50V(法国Seppic公司生产)以及实施例2制备得到的mPEG-MAL-40k-MY-1(0.01mg/mL)按照1：0.5：0.5V/V进行分散处理制成油乳剂2。
实施例5、免疫小鼠试验
(1)实验动物选取雄性BALB/c小鼠30只，17g-21g/只。
(2)实验动物的前处理在攻毒前所有组均给予5g/L链霉素溶液饮用3天，3天后粪检肠道排菌少于l03CFU/g，灌胃攻菌后全部给予0.5g/L的链霉素溶液饮用。以排除肠道正常菌群，为0157:H7在小鼠体内驯化一个定居和生长的环境，在肠道中成为优势菌群，增加小鼠的易感性。并在攻毒前断水断食12小时，攻毒后6小时恢复饮水饮食，防止攻毒后细菌快速排出动物肠道，延长在其体内作用时间。
(3)免疫攻毒和分组情况
将30只小鼠随机分为3组，每组10只，即实验组应用制备的二种亚单位疫苗，而对照组用等量的无菌磷酸盐缓冲液替代。采用背部及腹部皮下多点注射方式进行免疫，免疫1次，免疫剂量为25ug/只。免疫后35天后进行灌胃攻毒，剂量约为1Xl010CFU/只。攻菌后密切观察各组小鼠的行为、摄食情况及精神状态的变化，详细统计各组小鼠死亡情况，并每隔两天收集小鼠新鲜粪便，测定粪便中排菌时间和排菌量的变化情况。
(4)免疫后血清中fliC-hcpA-tir-eae特异性IgG抗体的检测
小鼠免疫前后，对小鼠采取断尾方式采血制备血清，应用间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清IgG抗体效价。
(5)免疫效果确定依据
①抗体变化利用ELISA检测免疫后血清抗体变化，以重组抗原包被酶标板，结果表明：采用二种佐剂的抗原都能够诱导高滴度的IgG,并且一致性良好，但是油乳剂2明显具有更高的和更快滴度效率。具体见下表1。
表1抗体IgG滴度列表
0天 8天 14天 21天 28天
油乳剂1 0 8.78×10<sup>2</sup> 2.05×10<sup>4</sup> 1.99×10<sup>5</sup> 4.85×10<sup>5</sup>
油乳剂2 0 2.14×10<sup>3</sup> 7.63×10<sup>5</sup> 1.55×10<sup>6</sup> 9.82×10<sup>6</sup>
②攻毒保护情况35天攻毒，结果显示：二种免疫组小鼠存活率均为10/10,对照组存活率为5/10。保护效果显著。
③排菌量变化攻毒后24小时开始采集粪便，之后每隔两天采集一次，经过适当处理后涂布筛选性麦康凯平板，37℃培养18～24小时，取出平板计数，并对菌落用二重PCR进行鉴定，均为0157:H7。免疫组排菌时间缩短，而对照组于第14天仍能检测到高达104CFU上的排菌，具体结果见表2所示。
表2菌落变化表
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 余文庚
<120> 一种改进的肠出血性大肠杆菌疫苗组合物
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 49
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Cys Leu Phe Val Ala Met Ser Asn Arg Trp Met His Lys His Asp Ser
1 5 10 15
Asn Gln Ser Glu Val Glu Met Cys Asp Arg Thr Cys Ser Thr Gln Trp
20 25 30
His Ser Ser Trp Cys Pro Tyr Ala Val Gln Lys Ala Lys Val Arg Arg
35 40 45
Gln

Claims (7)

1.一种肠出血性大肠杆菌0157:H7志贺毒素亚单位活性片段重组蛋白，该重组蛋白的制备方法为：根据GenBank中0157:H7EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：
fliC-Pl：5’-RRRRaRctcactattaccaacaaa-3'SacI
fliC_P2:5'-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3’XholI
hcpA-Pl：5’-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3’Xhol I
hcpA-P2:5'-ttt￡aattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3,EcoR I
tir-Pl：5'-gatgaattcgagccggatagccca-3'EcoR I
tir-P2：5'-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3'Sal I
eae-Pl:5'-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3,SalI eae～P2：5'-ggctctagattattctacacaaaccgc-3'XbaI 0157:H7过夜培养物，lmL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮l0min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存-20℃，用于PCR扩增用；扩增fliC片段的上下游引物分别加有SacI和XholI酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有SalI和XbaI酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；扩增hcpA片段的上下游分别引物加有XholI和EcoRI酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoRI和SalI酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟；fliC-Pl和fliC-P2、hcpA-Pl和hcpA-P2、tir-Pl和tir-P2、eae-Pl和eae-P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和81Ibp；将扩增的PCR产物用质量比1.2％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0.5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段；将SacI和XholI酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pColdI片段4uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.OuL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用SacI和XholI双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到fliC片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC重组质粒；用XhoI和EcoRI酶切hcpA片段和pColdI-fliC重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC取4.OuL，hcpA片段取2uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.Oul，补水2uL，一同加入eppendorf管，混勾后，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA重组质粒；用EcoRI和SalI酶切tir片段和pColdI-fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC-hcpA取2.0uL，tir片段取3.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.OuL，补水3uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA-tir重组质粒；用SalI和XbaI酶切eae片段和pColdI-fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pColdI-fliC-hcpA-tir和eae各取4.OuL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.Oul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pColdI-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pColdI-fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21pColdI-fliC-hcpA-tir-eae，将所述重组均表达并纯化目的蛋白即为fliC-hcpA-tir-eae重组蛋白。
2.一种亚单位疫苗组合物，其包括权利要求1所述的重组蛋白以及免疫增强佐剂，所述佐剂包含ISA50V和修饰的免疫增强肽MY-1，其序列如SEQ ID NO：1所示；所述修饰的免疫增强肽MY-1是通过mPEG-MAL-40k修饰剂进行修饰获得。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：修饰的免疫增强肽MY-1制备方法为取免疫增强肽MY-1多肽，按照1.Omg/ml溶解于100mmo1/1 Na2HP04 pH8.0，缓冲液为修饰缓冲液100mmo1/1 Na2HP04-NaH2P04,200mmo1/1 NaCl,5mmol/1 Lys,2mmo1/1 EDTA,pH8.0，按照摩尔比1:1加入mPEG-MAL-40k修饰剂，室温反应过夜后终止反应，纯化借口获得修饰的免疫增强肽MY-1。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于所述蛋白0.2mg/mL与mPEG-MAL-40k-MY-1 0.01mg/mL以及ISA50V按照1：0.5：0.5V/V进行分散处理制成油乳剂。
5.一种免疫增强佐剂，其特征在于所述佐剂包含ISA50V和修饰的免疫增强肽MY-1，其序列如SEQ ID NO：1所示；所述修饰的免疫增强肽MY-1是通过mPEG-MAL-40k修饰剂进行修饰获得。
6.根据权利要求6所述的佐剂，其特征在于：修饰的免疫增强肽MY-1制备方法为取免疫增强肽MY-1多肽，按照1.Omg/ml溶解于100mmo1/1 Na2HP04pH8.0，缓冲液为修饰缓冲液100mmo1/1 Na2HP04-NaH2P04,200mmo1/1 NaCl,5mmol/1 Lys,2mmo1/1 EDTA,pH8.0，按照摩尔比1:1加入mPEG-MAL-40k修饰剂，室温反应过夜后终止反应，纯化借口获得修饰的免疫增强肽MY-1。
7.一种免疫增强肽，其序列如SEQ ID NO：1所示。
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