JPH09224680A - 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子 - Google Patents
肺炎球菌タンパクの構造遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 免疫防御性肺炎球菌表面タンパク
【解決手段】 精製した肺炎球菌表面タンパクＡ（Ｐｓ
ｐＡ）は、免疫防御性を有するトランケート状のＰｓｐ
Ａタンパクから成り、ＰｓｐＡの防御エピトープを含ん
でいる。ＰｓｐＡタンパクは生理食塩水に可溶性で、タ
ンパク全体のうち少なくとも細胞膜アンカー部位を欠失
している。当該タンパクは、ｐｓｐＡ遺伝子を有する
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを挿入重複によって突然変異
を起こさせ、培地中にトランケート・タンパクを表現さ
せることにより製造する。
ｐＡ）は、免疫防御性を有するトランケート状のＰｓｐ
Ａタンパクから成り、ＰｓｐＡの防御エピトープを含ん
でいる。ＰｓｐＡタンパクは生理食塩水に可溶性で、タ
ンパク全体のうち少なくとも細胞膜アンカー部位を欠失
している。当該タンパクは、ｐｓｐＡ遺伝子を有する
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを挿入重複によって突然変異
を起こさせ、培地中にトランケート・タンパクを表現さ
せることにより製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、肺炎球菌の感染に
対する改良ワクチンの開発に関する。
対する改良ワクチンの開発に関する。
【０００２】本出願は、出願中の米国特許出願番号６５
６，７７３、出願日１９９１年２月１５日の一部継続出
願である。
６，７７３、出願日１９９１年２月１５日の一部継続出
願である。
【０００３】
【従来の技術】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ（肺炎連鎖球菌）は、中耳炎、髄膜炎、菌
血症及び肺炎の重要な病原菌である。抗生物質やワクチ
ンが使用されているにもかかわらず、肺炎球菌感染の流
行は過去２５年間ほとんど減少していない。
ｍｏｎｉａｅ（肺炎連鎖球菌）は、中耳炎、髄膜炎、菌
血症及び肺炎の重要な病原菌である。抗生物質やワクチ
ンが使用されているにもかかわらず、肺炎球菌感染の流
行は過去２５年間ほとんど減少していない。
【０００４】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅに対する免疫は、肺炎球菌の多糖類莢膜に対
する特異的抗体によって仲介されると一般に考えられて
いる。しかし、新生児や幼児は多糖類抗原に対する免疫
反応を示すことができず、同じ莢膜血清型の感染を繰り
返す。
ｏｎｉａｅに対する免疫は、肺炎球菌の多糖類莢膜に対
する特異的抗体によって仲介されると一般に考えられて
いる。しかし、新生児や幼児は多糖類抗原に対する免疫
反応を示すことができず、同じ莢膜血清型の感染を繰り
返す。
【０００５】多くの莢膜型バクテリアに対する免疫を乳
幼児に付与する方法の一つは、莢膜多糖類抗体をタンパ
クに共役させ、免疫性をもたせることである。この方法
は、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ ｂで成功している（Ｇｏｒｄｏｎ、米国特許番号
４，４９６，５３８及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許番
号４，６７３，５７４参照）。しかし、Ｓ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅの場合、８０種以上の莢膜血清型があり、そ
のうち２３種がこの病原菌による疾病のほとんどに関与
することが知られている。肺炎球菌多糖類−タンパク複
合体が成功するためには、ほとんどの肺炎球菌感染に関
与する莢膜型に対して十分な免疫性がなければならな
い。現在利用できるワクチンでは、その中に含まれてい
る２３種類の多糖類が成人に対しても全て十分な免疫性
を有しているとは限らないので、このようなアプローチ
は困難である。
幼児に付与する方法の一つは、莢膜多糖類抗体をタンパ
クに共役させ、免疫性をもたせることである。この方法
は、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ ｂで成功している（Ｇｏｒｄｏｎ、米国特許番号
４，４９６，５３８及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許番
号４，６７３，５７４参照）。しかし、Ｓ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅの場合、８０種以上の莢膜血清型があり、そ
のうち２３種がこの病原菌による疾病のほとんどに関与
することが知られている。肺炎球菌多糖類−タンパク複
合体が成功するためには、ほとんどの肺炎球菌感染に関
与する莢膜型に対して十分な免疫性がなければならな
い。現在利用できるワクチンでは、その中に含まれてい
る２３種類の多糖類が成人に対しても全て十分な免疫性
を有しているとは限らないので、このようなアプローチ
は困難である。
【０００６】子供や老人を肺炎球菌の感染から守る別の
方法は、防御免疫反応を誘発することのできるタンパク
抗原を同定することである。このようなタンパクは、そ
れ自体ワクチンとして利用することができ、優れた多糖
類−タンパク複合体と結合して、または多糖類の担体と
して利用することもできる。
方法は、防御免疫反応を誘発することのできるタンパク
抗原を同定することである。このようなタンパクは、そ
れ自体ワクチンとして利用することができ、優れた多糖
類−タンパク複合体と結合して、または多糖類の担体と
して利用することもできる。
【０００７】ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｉ）、Ｊ． Ｅｘ
ｐ． Ｍｅｄ．１６０：３８６−３９７、１９８４に
は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞表面多糖類として
知られている雑種細胞抗体の製造法と当該抗体を用いた
莢膜肺炎球菌のある種の系統によるマウスの感染予防が
記載されている。この表面タンパク抗原は、「肺炎球菌
Ａ」または略してＰｓｐＡと呼ばれている。
ｐ． Ｍｅｄ．１６０：３８６−３９７、１９８４に
は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞表面多糖類として
知られている雑種細胞抗体の製造法と当該抗体を用いた
莢膜肺炎球菌のある種の系統によるマウスの感染予防が
記載されている。この表面タンパク抗原は、「肺炎球菌
Ａ」または略してＰｓｐＡと呼ばれている。
【０００８】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩ）、Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １：５１９−５
３１、１９８６には、ＰｓｐＡの性質に関する研究が報
告されている。系統が異なることによって、ＰｓｐＡ分
子にかなりの多様性が認められ、抗体によって識別する
エピトープが異なる。
ｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １：５１９−５
３１、１９８６には、ＰｓｐＡの性質に関する研究が報
告されている。系統が異なることによって、ＰｓｐＡ分
子にかなりの多様性が認められ、抗体によって識別する
エピトープが異なる。
【０００９】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩＩ）、Ｊ． Ｅ
ｘｐ． Ｍｅｄ．１６５：３８１−３９４、１９８７に
は、ＰｓｐＡを欠く相同遺伝子肺炎球菌ではないが、Ｐ
ｓｐＡを表現する非莢膜肺炎球菌を用いて、Ｘ−連鎖免
疫不全（ＸＩＤ）マウスに免疫処置を行うと、マウスに
おけるその後の肺炎球菌による致命的な感染を防止でき
ることが記載されている。
ｘｐ． Ｍｅｄ．１６５：３８１−３９４、１９８７に
は、ＰｓｐＡを欠く相同遺伝子肺炎球菌ではないが、Ｐ
ｓｐＡを表現する非莢膜肺炎球菌を用いて、Ｘ−連鎖免
疫不全（ＸＩＤ）マウスに免疫処置を行うと、マウスに
おけるその後の肺炎球菌による致命的な感染を防止でき
ることが記載されている。
【００１０】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＶ）、Ｉｎｆｅｃ
ｔ． Ｉｍｍｕｎ．，５９：２２２−２２８、１９９１
には、莢膜型肺炎球菌６Ａ及び３に対する防御効果を誘
導することのできる組替えＰｓｐＡの完全フラグメント
を用いたマウスの免疫処置が記載されている。
ｔ． Ｉｍｍｕｎ．，５９：２２２−２２８、１９９１
には、莢膜型肺炎球菌６Ａ及び３に対する防御効果を誘
導することのできる組替えＰｓｐＡの完全フラグメント
を用いたマウスの免疫処置が記載されている。
【００１１】Ｃｒａｉｎら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕ
ｎ．，５６：３２９３−３２９９、１９９０には、臨床
的及び実験的に単離されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの
各種系統を１００％（ｎ＝９５）検出できるウサギの抗
血清が記載されている。７種の単一クローン性抗体をＰ
ｓｐＡと反応させると、単離した５７種のＳ．ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅが３１種類の反応パターンを示した。
ｎ．，５６：３２９３−３２９９、１９９０には、臨床
的及び実験的に単離されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの
各種系統を１００％（ｎ＝９５）検出できるウサギの抗
血清が記載されている。７種の単一クローン性抗体をＰ
ｓｐＡと反応させると、単離した５７種のＳ．ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅが３１種類の反応パターンを示した。
【００１２】ＰｓｐＡのタンパク型は、莢膜型とは関係
がない。環境中における遺伝子の突然変異または交換に
よって、莢膜、ＰｓｐＡ及び多分そのほかの分子構造が
きわめて多様化した系統の大きなプールが発達するもの
と考えられる。ＰｓｐＡは、その分子量が６７から９９
ｋＤの範囲にあることからも、系統によって変動するこ
とが考えられる。観察された差は安定で、本質的である
ことから、タンパクの分解によるものではない。
がない。環境中における遺伝子の突然変異または交換に
よって、莢膜、ＰｓｐＡ及び多分そのほかの分子構造が
きわめて多様化した系統の大きなプールが発達するもの
と考えられる。ＰｓｐＡは、その分子量が６７から９９
ｋＤの範囲にあることからも、系統によって変動するこ
とが考えられる。観察された差は安定で、本質的である
ことから、タンパクの分解によるものではない。
【００１３】組替えλｇｔ１１クローンから部分的に精
製したＰｓｐＡを用いて免疫処置すると、ＭｃＤａｎｉ
ｅｌら（ＩＶ）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２
２２−２２８、１９９１に記載されているように、莢膜
及びＰｓｐＡ型の異なるいくつかのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ系統の抗体投与に対する防御が誘発された。Ｐｓ
ｐＡ表現クローンを上記の報告にしたがって構成した
が、製品は不溶性で、細胞溶解後も細胞フラグメントか
ら単離することができなかった。
製したＰｓｐＡを用いて免疫処置すると、ＭｃＤａｎｉ
ｅｌら（ＩＶ）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２
２２−２２８、１９９１に記載されているように、莢膜
及びＰｓｐＡ型の異なるいくつかのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ系統の抗体投与に対する防御が誘発された。Ｐｓ
ｐＡ表現クローンを上記の報告にしたがって構成した
が、製品は不溶性で、細胞溶解後も細胞フラグメントか
ら単離することができなかった。
【００１４】タンパクの構造は肺炎球菌の系統間で異な
るが、全てのＰｓｐＡ間で多くの交差反応が存在するこ
とから、単一ＰｓｐＡまたは少なくとも小数のＰｓｐＡ
がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多くの系統に対する防御
作用を誘発するような共通的なエピトープが存在するも
のと考えられる。
るが、全てのＰｓｐＡ間で多くの交差反応が存在するこ
とから、単一ＰｓｐＡまたは少なくとも小数のＰｓｐＡ
がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多くの系統に対する防御
作用を誘発するような共通的なエピトープが存在するも
のと考えられる。
【００１５】上記の公表文献の他に、本発明者らは、共
同研究者らとともに、以下の文献にＰｓｐＡの詳細を報
告している。 １．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第８９回年次大会要旨、１２５頁
アイテムＤ−２５７、１９８９年５月 ２．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第９０回年次大会要旨、９８頁ア
イテムＤ−１０６、１９９０年５月 ３．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＳＭ Ｃｏｎｆｅ
ｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ 第３回大会要旨、１１頁、アイテム１
２、１９９０年６月 ４．Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．５９：１２８５−１２８９、１９９１ ５．Ｙｏｔｈｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７
４：６０１−６０９、１９９２ ６．Ｙｏｔｈｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７
４：６１０−６１８、１９９２ 前記のＵＳＳＮ ６５６，７７３出願後、短報を３件発
表した。
同研究者らとともに、以下の文献にＰｓｐＡの詳細を報
告している。 １．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第８９回年次大会要旨、１２５頁
アイテムＤ−２５７、１９８９年５月 ２．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第９０回年次大会要旨、９８頁ア
イテムＤ−１０６、１９９０年５月 ３．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＳＭ Ｃｏｎｆｅ
ｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ 第３回大会要旨、１１頁、アイテム１
２、１９９０年６月 ４．Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．５９：１２８５−１２８９、１９９１ ５．Ｙｏｔｈｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７
４：６０１−６０９、１９９２ ６．Ｙｏｔｈｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７
４：６１０−６１８、１９９２ 前記のＵＳＳＮ ６５６，７７３出願後、短報を３件発
表した。
【００１６】以下の明細書及び添付図面では、アミノ酸
に関して通常使用されている略称を使用した。これらの
略称を表Ｉに示す。
に関して通常使用されている略称を使用した。これらの
略称を表Ｉに示す。
【００１７】表 Ｉ アミノ酸の略称 Ａ＝Ａｌａ＝アラニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン Ｗ＝Ｔｒｙ＝トリプトファン Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン 発明の概略 本発明は、トランケート状の免疫性ＰｓｐＡタンパクを
分泌するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ突然変異株の調製及
び分泌されたタンパクの単離及び精製に関する。トラン
ケート状ＰｓｐＡタンパクは免疫防御作用を有し、Ｐｓ
ｐＡの保護エピトープを含んでいる。ＰｓｐＡタンパク
は生理食塩水に可溶性で、少なくとも機能細胞膜のアン
カー部位を欠失している。
分泌するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ突然変異株の調製及
び分泌されたタンパクの単離及び精製に関する。トラン
ケート状ＰｓｐＡタンパクは免疫防御作用を有し、Ｐｓ
ｐＡの保護エピトープを含んでいる。ＰｓｐＡタンパク
は生理食塩水に可溶性で、少なくとも機能細胞膜のアン
カー部位を欠失している。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、その１側面
で、タンパクの発現防御性エピトープを含み、かつ総Ｐ
ｓｐＡタンパクの約９０％までを占め、機能細胞膜アン
カー部位を欠失するトランケート状のＰｓｐＡから成る
精製した免疫防御性肺炎球菌表面タンパクを提供するも
のである。
で、タンパクの発現防御性エピトープを含み、かつ総Ｐ
ｓｐＡタンパクの約９０％までを占め、機能細胞膜アン
カー部位を欠失するトランケート状のＰｓｐＡから成る
精製した免疫防御性肺炎球菌表面タンパクを提供するも
のである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】ｐｓｐＡ構造遺伝子のク
ローン化フラグメントを含むプラスミッドを有するＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｘ
１株のｐｓｐＡ遺伝子に挿入複製法で突然変異を起こさ
せることにより、肺炎球菌により分泌されるＰｓｐＡの
可溶性フラグメントを製造することができる。
ローン化フラグメントを含むプラスミッドを有するＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｘ
１株のｐｓｐＡ遺伝子に挿入複製法で突然変異を起こさ
せることにより、肺炎球菌により分泌されるＰｓｐＡの
可溶性フラグメントを製造することができる。
【００２０】本発明の別の側面は、ｐｓｐＡ遺伝子で細
菌に挿入複製突然変異を起こさせることにより、トラン
ケート状の表現ＰｓｐＡタンパクをコード化し、トラン
ケート状ＰｓｐＡタンパクを表現されるために突然変異
株を培養し、タンパクを単離することから成る免疫防御
作用を有するトランケート状ＰｓｐＡタンパクを形成さ
せる方法を提供するものである。
菌に挿入複製突然変異を起こさせることにより、トラン
ケート状の表現ＰｓｐＡタンパクをコード化し、トラン
ケート状ＰｓｐＡタンパクを表現されるために突然変異
株を培養し、タンパクを単離することから成る免疫防御
作用を有するトランケート状ＰｓｐＡタンパクを形成さ
せる方法を提供するものである。
【００２１】このようにして得られた精製トランケート
状ＰｓｐＡタンパクの分子量は、遺伝子の表現終末を決
定する挿入点をｐｓｐＡ遺伝子中でいろいろな方向に調
整することによって変えることができる。例えば、約半
分は在来タンパクから成り、見かけ上の分子量４３ ｋ
Ｄを有するＮ−末端フラグメントは、有用であることが
明らかとなった。
状ＰｓｐＡタンパクの分子量は、遺伝子の表現終末を決
定する挿入点をｐｓｐＡ遺伝子中でいろいろな方向に調
整することによって変えることができる。例えば、約半
分は在来タンパクから成り、見かけ上の分子量４３ ｋ
Ｄを有するＮ−末端フラグメントは、有用であることが
明らかとなった。
【００２２】この方法で製造することのできるトランケ
ート状セグメントは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ３型を
致命的に抗原投与したマウスにおいて防御反応を誘発す
ることから、精製ＰｓｐＡが防御反応を誘発すること、
またタンパクのこのトランケート状セグメントがＰｓｐ
Ａの保護性エピトープを含んでいることを初めて実証す
ることができた。
ート状セグメントは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ３型を
致命的に抗原投与したマウスにおいて防御反応を誘発す
ることから、精製ＰｓｐＡが防御反応を誘発すること、
またタンパクのこのトランケート状セグメントがＰｓｐ
Ａの保護性エピトープを含んでいることを初めて実証す
ることができた。
【００２３】アミノ酸配列の情報は、ＰｓｐＡのトラン
ケート状セグメントのＮ−末端４５アミノ酸について得
たものである。この配列を図２に示す。予測的二次構造
分析から、この配列はきわめて強いα−螺旋状形態を有
し、非螺旋状の挿入はないことが明らかとなった。セグ
メントの約５１％がわずか２種類のアミノ酸、すなわち
荷電アミノ酸のリジンと非荷電アミノ酸のアラニンから
成っている。
ケート状セグメントのＮ−末端４５アミノ酸について得
たものである。この配列を図２に示す。予測的二次構造
分析から、この配列はきわめて強いα−螺旋状形態を有
し、非螺旋状の挿入はないことが明らかとなった。セグ
メントの約５１％がわずか２種類のアミノ酸、すなわち
荷電アミノ酸のリジンと非荷電アミノ酸のアラニンから
成っている。
【００２４】また、この４５−アミノ酸配列を分析した
ところ、７残基の周期を含むことが明らかとなった（図
２参照）。ＰｓｐＡにおいては、周期は残基８から始ま
り、ほぼ１１回転の螺旋状で配列全体にわたって広がっ
ている。”ａ”及び”ｄ”の位置は非極性アミノ酸で占
められ、一般に”ｂ”、”ｃ”及び”ｆ”の位置は親水
性のアミノ酸で占められている。位置”ｆ”はほとんど
リジンで占められている。このようなことを考慮し、Ｐ
ｓｐＡのこの領域はα−螺旋状高次コイル立体配置であ
る可能性が高い。α−螺旋状高次コイル領域全体の推定
アミノ酸配列を図８に示す。
ところ、７残基の周期を含むことが明らかとなった（図
２参照）。ＰｓｐＡにおいては、周期は残基８から始ま
り、ほぼ１１回転の螺旋状で配列全体にわたって広がっ
ている。”ａ”及び”ｄ”の位置は非極性アミノ酸で占
められ、一般に”ｂ”、”ｃ”及び”ｆ”の位置は親水
性のアミノ酸で占められている。位置”ｆ”はほとんど
リジンで占められている。このようなことを考慮し、Ｐ
ｓｐＡのこの領域はα−螺旋状高次コイル立体配置であ
る可能性が高い。α−螺旋状高次コイル領域全体の推定
アミノ酸配列を図８に示す。
【００２５】ｐｓｐＡのコード化領域全体をクローン化
し、配列を決定した（図３ないし図５参照）。ＰｓｐＡ
タンパクの推定アミノ酸配列から、図１に模式的に示し
たように、３点の特異的領域が認められる。したがっ
て、本発明の別の側面は、ＰｓｐＡタンパクまたはそれ
らのタンパク群をコード化し、図３ないし５で規定した
範囲に含まれるコード配列またはそれとかなり相同的な
配列を有する生物学的に純粋な組替えＤＮＡ分子を提供
することである。
し、配列を決定した（図３ないし図５参照）。ＰｓｐＡ
タンパクの推定アミノ酸配列から、図１に模式的に示し
たように、３点の特異的領域が認められる。したがっ
て、本発明の別の側面は、ＰｓｐＡタンパクまたはそれ
らのタンパク群をコード化し、図３ないし５で規定した
範囲に含まれるコード配列またはそれとかなり相同的な
配列を有する生物学的に純粋な組替えＤＮＡ分子を提供
することである。
【００２６】ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列は、長さが２
０８６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメント
上に含まれる。ｐｓｐＡ遺伝子自体は、このフラグメン
トのうち約１９８５塩基対を占め、転写及び翻訳シグナ
ルを含み、ＡＴＧ／ｍｅｔ（ニュクレオチド位置１２
７、コドン位置−３１）で翻訳を開始し、ＡＡＧ／ｍｅ
ｔ（ニュクレオチド位置１２７、コドン位置−３１）か
らＣＧＡ／ａｌａ（ニュクレオチド位置２１７、コドン
位置−１）に伸びるリーダー配列を含む開始領域から成
っている。成熟ＰｓｐＡは、ニュクレオチド位置２２０
（コドン＋１）のｇｌｕアミノ酸から始まり、ニュクレ
オチド位置１９８４の翻訳ストップＴＡＡ／ＯＣＨで終
わる。この翻訳ストップコドンの次に、翻訳終了シグナ
ルがある。
０８６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメント
上に含まれる。ｐｓｐＡ遺伝子自体は、このフラグメン
トのうち約１９８５塩基対を占め、転写及び翻訳シグナ
ルを含み、ＡＴＧ／ｍｅｔ（ニュクレオチド位置１２
７、コドン位置−３１）で翻訳を開始し、ＡＡＧ／ｍｅ
ｔ（ニュクレオチド位置１２７、コドン位置−３１）か
らＣＧＡ／ａｌａ（ニュクレオチド位置２１７、コドン
位置−１）に伸びるリーダー配列を含む開始領域から成
っている。成熟ＰｓｐＡは、ニュクレオチド位置２２０
（コドン＋１）のｇｌｕアミノ酸から始まり、ニュクレ
オチド位置１９８４の翻訳ストップＴＡＡ／ＯＣＨで終
わる。この翻訳ストップコドンの次に、翻訳終了シグナ
ルがある。
【００２７】タンパク配列のアミノ酸末端は、図３ない
し５のＤＮＡ並列から推察すると、３１のアミノ酸リー
ダー配列とＰｓｐＡのＮ−末端の４５アミノ酸配列（図
２）と全く同じ４５のアミノ酸配列を含む。推論したタ
ンパク配列のアミノ酸末端は高度に荷電し、α−螺旋状
の性質を持っている。この領域は、アミノ酸レベル（同
一性約２２％、類似性５０％）でトロポマイオシンと類
似である。この類似性は、主として７の残基周期を繰り
返すことによるものであり、この場合第１と第４のアミ
ノ酸は疎水性であり、介在アミノ酸は螺旋構造プロモー
ターであり、第７アミノ酸は荷電している。このパター
ンはα−螺旋状高次コイル分子のパターンと一致し、分
子のＮ−末端の半分にα−螺旋状コイルが伸びているこ
とを示している。α−螺旋状コイル領域全体のアミノ酸
配列を図８に示す。
し５のＤＮＡ並列から推察すると、３１のアミノ酸リー
ダー配列とＰｓｐＡのＮ−末端の４５アミノ酸配列（図
２）と全く同じ４５のアミノ酸配列を含む。推論したタ
ンパク配列のアミノ酸末端は高度に荷電し、α−螺旋状
の性質を持っている。この領域は、アミノ酸レベル（同
一性約２２％、類似性５０％）でトロポマイオシンと類
似である。この類似性は、主として７の残基周期を繰り
返すことによるものであり、この場合第１と第４のアミ
ノ酸は疎水性であり、介在アミノ酸は螺旋構造プロモー
ターであり、第７アミノ酸は荷電している。このパター
ンはα−螺旋状高次コイル分子のパターンと一致し、分
子のＮ−末端の半分にα−螺旋状コイルが伸びているこ
とを示している。α−螺旋状コイル領域全体のアミノ酸
配列を図８に示す。
【００２８】荷電した螺旋状領域の次に、８１アミノ酸
のうち２３がプロリンであるプロリン・リッチな領域が
存在する。プロリン・リッチな領域の次のカルボキシ
は、相同性の高い２０のアミノ酸反復の最初の１０個の
アミノ酸である。分子の配列決定部位における唯一顕著
な疎水性領域は最後の反復で始まる。この膜スパンニン
グ領域は、翻訳ストップコドンの前に数種の荷電アミノ
酸を含んでいる。
のうち２３がプロリンであるプロリン・リッチな領域が
存在する。プロリン・リッチな領域の次のカルボキシ
は、相同性の高い２０のアミノ酸反復の最初の１０個の
アミノ酸である。分子の配列決定部位における唯一顕著
な疎水性領域は最後の反復で始まる。この膜スパンニン
グ領域は、翻訳ストップコドンの前に数種の荷電アミノ
酸を含んでいる。
【００２９】挿入不活性化され、Ｃ−末端アンカー領域
を欠失するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの変異株は、化学
的に限定した培地で生育が可能であり、培地中にＰｓｐ
ＡタンパクのＮ−末端部分を分泌する。ＰｓｐＡのＮ−
末端領域は、培地に対する溶解性が高く、完全な分子に
比較して単離がはるかに容易である。可溶性のトランケ
ート分子は、図６および７に示したクローン化ＰｓｐＡ
ＤＮＡフラグメントを用いた挿入重複突然変異によって
製造した。Ｅ．ｃｏｌｉに同じトランケート状構造を表
現させる（肺炎球菌プロモーターを用い）と、同じＰｓ
ｐＡフラグメントがＥ．ｃｏｌｉの周縁細胞質中に分泌
される。ＰｓｐＡは、低張性細胞溶解により、周縁細胞
質から容易に抽出される。
を欠失するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの変異株は、化学
的に限定した培地で生育が可能であり、培地中にＰｓｐ
ＡタンパクのＮ−末端部分を分泌する。ＰｓｐＡのＮ−
末端領域は、培地に対する溶解性が高く、完全な分子に
比較して単離がはるかに容易である。可溶性のトランケ
ート分子は、図６および７に示したクローン化ＰｓｐＡ
ＤＮＡフラグメントを用いた挿入重複突然変異によって
製造した。Ｅ．ｃｏｌｉに同じトランケート状構造を表
現させる（肺炎球菌プロモーターを用い）と、同じＰｓ
ｐＡフラグメントがＥ．ｃｏｌｉの周縁細胞質中に分泌
される。ＰｓｐＡは、低張性細胞溶解により、周縁細胞
質から容易に抽出される。
【００３０】トランケート状ＰｓｐＡは、横流濾過等従
来の方法を用い、突然変異肺炎球菌の培養液から単離す
ることができる。ついで、陰イオン交換樹脂を用いてイ
オン交換クロマトグラフィーを行い、タンパクを精製す
る。この手順においては、ＰｓｐＡを含む溶液を０．０
２ Ｍの塩溶液中でｐＨ６まで透析した後、樹脂に通
す。イオン強度０．０８から２．０ Ｍまでのグラジェ
ントでＰｓｐＡを溶出し、使用するカラムの性質によ
り、０．３４から０．８７ Ｍイオン強度の画分を集め
る。
来の方法を用い、突然変異肺炎球菌の培養液から単離す
ることができる。ついで、陰イオン交換樹脂を用いてイ
オン交換クロマトグラフィーを行い、タンパクを精製す
る。この手順においては、ＰｓｐＡを含む溶液を０．０
２ Ｍの塩溶液中でｐＨ６まで透析した後、樹脂に通
す。イオン強度０．０８から２．０ Ｍまでのグラジェ
ントでＰｓｐＡを溶出し、使用するカラムの性質によ
り、０．３４から０．８７ Ｍイオン強度の画分を集め
る。
【００３１】ＰｓｐＡは、ドデシル硫酸ポリアクリルア
ミドナトリウムゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動によ
って、さらに精製することができる。ゲルのＰｓｐＡ含
有部分は、ゲルを染色することによって確認し、この部
分からＰｓｐＡを電気溶出する。
ミドナトリウムゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動によ
って、さらに精製することができる。ゲルのＰｓｐＡ含
有部分は、ゲルを染色することによって確認し、この部
分からＰｓｐＡを電気溶出する。
【００３２】電気泳動による精製は、少量のＰｓｐＡを
取り扱う場合に便利である。大量生産に適した方法とし
て、ｐＨ７のリン酸緩衝液中でサイズ・クロマトグラフ
ィーを行うことにより精製することができる。
取り扱う場合に便利である。大量生産に適した方法とし
て、ｐＨ７のリン酸緩衝液中でサイズ・クロマトグラフ
ィーを行うことにより精製することができる。
【００３３】培地中にトランケート状のＰｓｐＡを表現
させることができるので、細胞膜内にトラップされてい
る場合のように複雑な精製工程を必要とせず、ＰｓｐＡ
とその他のタンパクの間でタンパクを融合させることに
より、トランケートｐｓｐＡ遺伝子中にクローン化され
た別のタンパクを単離することもできる。このような手
法は、免疫性を増強したり、遺伝子産物の免疫性構造ま
たは提示の保存に利用することができ、融合タンパクを
全身的または粘膜的に免疫投与することを可能にする。
させることができるので、細胞膜内にトラップされてい
る場合のように複雑な精製工程を必要とせず、ＰｓｐＡ
とその他のタンパクの間でタンパクを融合させることに
より、トランケートｐｓｐＡ遺伝子中にクローン化され
た別のタンパクを単離することもできる。このような手
法は、免疫性を増強したり、遺伝子産物の免疫性構造ま
たは提示の保存に利用することができ、融合タンパクを
全身的または粘膜的に免疫投与することを可能にする。
【００３４】このような融合タンパクの１例は、Ｐｓｐ
Ａの可溶性Ｎ−末端領域とコレラ毒のＢ−サブユニット
の融合である。また、融合タンパクは、トランケート状
ＰｓｐＡタンパクを別のタンパクに化学的に付加するこ
とによっても形成することができる。
Ａの可溶性Ｎ−末端領域とコレラ毒のＢ−サブユニット
の融合である。また、融合タンパクは、トランケート状
ＰｓｐＡタンパクを別のタンパクに化学的に付加するこ
とによっても形成することができる。
【００３５】本発明の別の側面は、ＰｓｐＡタンパクの
トランケート型をコード化したｐｓｐＡ遺伝子と別のタ
ンパクをコード化した遺伝子を融合させて融合タンパク
のクローンを形成し、融合タンパククローンでＳ．ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉまたはその他の細菌を
形質変換させ、形質変換した細菌を培養してトランケー
ト状ＰｓｐＡとその他のタンパクを培養液中に表現さ
せ、融合タンパクを単離することから成るクローン化タ
ンパクの製造法を提供するものである。
トランケート型をコード化したｐｓｐＡ遺伝子と別のタ
ンパクをコード化した遺伝子を融合させて融合タンパク
のクローンを形成し、融合タンパククローンでＳ．ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉまたはその他の細菌を
形質変換させ、形質変換した細菌を培養してトランケー
ト状ＰｓｐＡとその他のタンパクを培養液中に表現さ
せ、融合タンパクを単離することから成るクローン化タ
ンパクの製造法を提供するものである。
【００３６】この手法を利用することにより、例えば
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等肺炎球菌、例えばＢａｃｉ
ｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）等
のミコバクテリア等のグラム陽性細菌中にクローン化し
たタンパクを生産させることができる。この方法は、通
常クローン化に使用されるＥ．ｃｏｌｉ等のグラム陰性
細菌に本質的な問題、特に組替えタンパクをエンドトキ
シンから分離、精製する必要性、及びグラム陰性細菌に
おける多くのグラム陽性ＤＮＡ配列の毒性等を克服する
ことができる。
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等肺炎球菌、例えばＢａｃｉ
ｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）等
のミコバクテリア等のグラム陽性細菌中にクローン化し
たタンパクを生産させることができる。この方法は、通
常クローン化に使用されるＥ．ｃｏｌｉ等のグラム陰性
細菌に本質的な問題、特に組替えタンパクをエンドトキ
シンから分離、精製する必要性、及びグラム陰性細菌に
おける多くのグラム陽性ＤＮＡ配列の毒性等を克服する
ことができる。
【００３７】ＰｓｐＡの可溶性Ｎ−末端領域及びコレラ
毒素のＢ−サブユニット（ＣＴＢ）から成る融合タンパ
クを表現させるためには、ＰｓｐＡタンパクのトランケ
ート型をコード化したｐｓｐＡ遺伝子とコレラ毒素のＢ
−サブユニットをコード化したｃｔｘＢ遺伝子の遺伝子
融合が効果的である。融合タンパクを表現させた後に
は、ＰｓｐＡとＣＴＢを、希薄酸により、希薄酸に不安
定であることが知られているので、両タンパクの融合部
位として設計されたアスパラギン−プロリン配列の部位
で相互に解裂させることができる。
毒素のＢ−サブユニット（ＣＴＢ）から成る融合タンパ
クを表現させるためには、ＰｓｐＡタンパクのトランケ
ート型をコード化したｐｓｐＡ遺伝子とコレラ毒素のＢ
−サブユニットをコード化したｃｔｘＢ遺伝子の遺伝子
融合が効果的である。融合タンパクを表現させた後に
は、ＰｓｐＡとＣＴＢを、希薄酸により、希薄酸に不安
定であることが知られているので、両タンパクの融合部
位として設計されたアスパラギン−プロリン配列の部位
で相互に解裂させることができる。
【００３８】ＣＴＢは、モノシアロガングリオシド（Ｇ
M1）に対する特異性が高いことが知られている。したが
って、融合ＰｓｐＡ−ＣＴＢタンパクは、ＧM1アフィニ
ティーカラムに吸着させ、低ｐＨで融合タンパクを溶出
させることにより、培地から単離することができる。
M1）に対する特異性が高いことが知られている。したが
って、融合ＰｓｐＡ−ＣＴＢタンパクは、ＧM1アフィニ
ティーカラムに吸着させ、低ｐＨで融合タンパクを溶出
させることにより、培地から単離することができる。
【００３９】ＰｓｐＡーＣＴＢ融合タンパクは、固相の
特異的抗体吸着体検定にきわめて有用である。融合タン
パクを使用することにより、あらかじめＰｓｐＡフラグ
メントを単離することなく、マイクロ滴定板等の固体担
体をＰｓｐＡフラグメントでコートすることができる。
これは、融合タンパクを含む細菌抽出物をＧM1でコート
したプレートに添加することにより行うことができる。
ついで、ＰｓｐＡ−ＣＴＢ融合タンパクを、ＣＴＢ部分
でＧM1に結合させることにより、固体担体をＰｓｐＡで
コートする。ついで、得られたコート産物を固相特異的
抗体吸着体検定に利用し、試験試料中のＰｓｐＡ抗体ま
たは抗原を検出することができる。このような特異的抗
体吸着体検定は、本発明の別の側面を構成する。
特異的抗体吸着体検定にきわめて有用である。融合タン
パクを使用することにより、あらかじめＰｓｐＡフラグ
メントを単離することなく、マイクロ滴定板等の固体担
体をＰｓｐＡフラグメントでコートすることができる。
これは、融合タンパクを含む細菌抽出物をＧM1でコート
したプレートに添加することにより行うことができる。
ついで、ＰｓｐＡ−ＣＴＢ融合タンパクを、ＣＴＢ部分
でＧM1に結合させることにより、固体担体をＰｓｐＡで
コートする。ついで、得られたコート産物を固相特異的
抗体吸着体検定に利用し、試験試料中のＰｓｐＡ抗体ま
たは抗原を検出することができる。このような特異的抗
体吸着体検定は、本発明の別の側面を構成する。
【００４０】また、プロリン・リッチ領域、繰り返し領
域またはＰｓｐＡのＣ−終点を含むＰｓｐＡ付加／アン
カー領域は、肺炎球菌、または機能的に付加／アンカー
領域を有するその他のグラム陽性またはグラム陰性細菌
に非相同タンパクを表現させるために使用することがで
きる。
域またはＰｓｐＡのＣ−終点を含むＰｓｐＡ付加／アン
カー領域は、肺炎球菌、または機能的に付加／アンカー
領域を有するその他のグラム陽性またはグラム陰性細菌
に非相同タンパクを表現させるために使用することがで
きる。
【００４１】一般に、表現は、グラム陽性細菌の場合は
細菌の膜、細胞壁、または細胞表面に行い、グラム陰性
細菌の場合には周縁細胞質内に行う。このような非相同
タンパク例は、コレラ毒素のＢ−サブユニットである。
細菌の膜、細胞壁、または細胞表面に行い、グラム陰性
細菌の場合には周縁細胞質内に行う。このような非相同
タンパク例は、コレラ毒素のＢ−サブユニットである。
【００４２】上記のように、ここで得られたＰｓｐＡの
トランケート型はタンパクの免疫防御エピトープを含む
ため、肺炎球菌の感染に対するワクチンとして有用であ
る。したがって、本発明のさらに別の側面は、免疫学的
活性成分として、ここで提供された精製免疫防御性肺炎
球菌表面タンパクから成る肺炎球菌の感染に対するワク
チンを提供するものである。ＰｓｐＡタンパクは、各種
の感染症に有効な混合ワクチンとしても使用することが
できる。
トランケート型はタンパクの免疫防御エピトープを含む
ため、肺炎球菌の感染に対するワクチンとして有用であ
る。したがって、本発明のさらに別の側面は、免疫学的
活性成分として、ここで提供された精製免疫防御性肺炎
球菌表面タンパクから成る肺炎球菌の感染に対するワク
チンを提供するものである。ＰｓｐＡタンパクは、各種
の感染症に有効な混合ワクチンとしても使用することが
できる。
【００４３】さらに、トランケート状可溶性ＰｓｐＡタ
ンパクをコード化したｐｓｐＡ遺伝子を表現するように
形質変換されたグラム陽性細菌は、弱毒化ワクチンまた
は死菌ワクチンの形で、肺炎球菌感染に対するワクチン
の免疫活性成分として利用することができる。形質変換
細菌においては、このようなｐｓｐＡ遺伝子を、別のタ
ンパクをコード化した遺伝子に融合させることができ
る。したがって、本発明の別の側面は、免疫活性成分と
して、ＰｓｐＡのトランケート型をコード化した遺伝子
を含む弱毒化または死菌ワクチンから成る肺炎球菌感染
に対するワクチンを提供するものである。
ンパクをコード化したｐｓｐＡ遺伝子を表現するように
形質変換されたグラム陽性細菌は、弱毒化ワクチンまた
は死菌ワクチンの形で、肺炎球菌感染に対するワクチン
の免疫活性成分として利用することができる。形質変換
細菌においては、このようなｐｓｐＡ遺伝子を、別のタ
ンパクをコード化した遺伝子に融合させることができ
る。したがって、本発明の別の側面は、免疫活性成分と
して、ＰｓｐＡのトランケート型をコード化した遺伝子
を含む弱毒化または死菌ワクチンから成る肺炎球菌感染
に対するワクチンを提供するものである。
【００４４】また、ＰｓｐＡのトランケート型は、各種
の多糖類等の通常弱免疫性または非免疫性防御を誘導す
る分子を共役させ、免疫活性を増強するために使用する
ことができる。したがって、本発明の別の側面は、免疫
活性成分として精製免疫防御性肺炎球菌表面タンパク
と、通常弱免疫性または非免疫性防御誘導分子の共役体
から成るワクチンを提供するものである。
の多糖類等の通常弱免疫性または非免疫性防御を誘導す
る分子を共役させ、免疫活性を増強するために使用する
ことができる。したがって、本発明の別の側面は、免疫
活性成分として精製免疫防御性肺炎球菌表面タンパク
と、通常弱免疫性または非免疫性防御誘導分子の共役体
から成るワクチンを提供するものである。
【００４５】ｐｓｐＡの保存配列、特に遺伝子のプロリ
ン・リッチまたは反復領域の配列は、組織、体液または
分泌物中の肺炎球菌ＤＮＡを検出することにより、肺炎
球菌の各種の系統の有無を検出するプローブとして利用
することができる。同様に、ｐｓｐＡ遺伝子の一部は、
肺炎球菌感染の検出用診断キットに利用することができ
る。
ン・リッチまたは反復領域の配列は、組織、体液または
分泌物中の肺炎球菌ＤＮＡを検出することにより、肺炎
球菌の各種の系統の有無を検出するプローブとして利用
することができる。同様に、ｐｓｐＡ遺伝子の一部は、
肺炎球菌感染の検出用診断キットに利用することができ
る。
【００４６】さらに、ｐｓｐＡの保存配列、特にプロリ
ン・リッチまたは反復領域の配列に基づいて作製したプ
ライマーは、肺炎球菌ＤＮＡの増幅を利用して、組織、
体液または分泌物中の肺炎球菌の有無の検定に使用する
ことができる。この場合、ポリメラーゼ・チェイン反応
（ＰＣＲ）を利用して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｐ
ｓｐＡ遺伝子のニュクレオチド配列に由来する単一プラ
イマー対をＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの選択的検出に利
用することができる。
ン・リッチまたは反復領域の配列に基づいて作製したプ
ライマーは、肺炎球菌ＤＮＡの増幅を利用して、組織、
体液または分泌物中の肺炎球菌の有無の検定に使用する
ことができる。この場合、ポリメラーゼ・チェイン反応
（ＰＣＲ）を利用して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｐ
ｓｐＡ遺伝子のニュクレオチド配列に由来する単一プラ
イマー対をＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの選択的検出に利
用することができる。
【００４７】特異的増幅は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
のＲｘ１株からの６７８塩基対ＤＮＡフラグメントで達
成された。３０サイクル増幅させた後、アガロースゲル
電気泳動でアンプライマーを検出することができる。試
験した３２株のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ全てで、フラ
グメントの満足のいく増幅が得られた。ＰＣＲ ＤＮＡ
増幅は、推定２０フィコグラム以下の肺炎球菌総ゲノム
ＤＮＡを検出することができた。
のＲｘ１株からの６７８塩基対ＤＮＡフラグメントで達
成された。３０サイクル増幅させた後、アガロースゲル
電気泳動でアンプライマーを検出することができる。試
験した３２株のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ全てで、フラ
グメントの満足のいく増幅が得られた。ＰＣＲ ＤＮＡ
増幅は、推定２０フィコグラム以下の肺炎球菌総ゲノム
ＤＮＡを検出することができた。
【００４８】以下のニュクレオチド配列を有するプライ
マーＬＳＭ１及びＬＳＭ２が、ｐｓｐＡからの６７８塩
基対産物をニュクレオチド１３１２からＲｘ１ ｐｓｐ
Ａ配列の１９９０に増幅した（図３ないし５）。
マーＬＳＭ１及びＬＳＭ２が、ｐｓｐＡからの６７８塩
基対産物をニュクレオチド１３１２からＲｘ１ ｐｓｐ
Ａ配列の１９９０に増幅した（図３ないし５）。
【００４９】ＬＳＭ１ ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡ
ＡＡＣ−３’ＬＳＭ２ ５’−ＧＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＴＴＡＡＡＣＣＣＡ
ＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧ−３’ ここに記載したプライマーを用いたＰＣＲ分析は、文献
に記載されている従来のＰＣＲ法、例えばＡｒｎｈｅｍ
ら、Ｃ＆ＥＮ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｒｅｐｏｒｔ，３６，
１９９０年１０月１日に従って行った。検出のため、プ
ライマーを標識するか、標識したニュクレオチド トリ
ホスフェートをＰＣＲ反応に添加し、ＰＣＲ増幅生成物
を標識してもよい。
ＡＡＣ−３’ＬＳＭ２ ５’−ＧＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＴＴＡＡＡＣＣＣＡ
ＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧ−３’ ここに記載したプライマーを用いたＰＣＲ分析は、文献
に記載されている従来のＰＣＲ法、例えばＡｒｎｈｅｍ
ら、Ｃ＆ＥＮ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｒｅｐｏｒｔ，３６，
１９９０年１０月１日に従って行った。検出のため、プ
ライマーを標識するか、標識したニュクレオチド トリ
ホスフェートをＰＣＲ反応に添加し、ＰＣＲ増幅生成物
を標識してもよい。
【００５０】ＰＣＲプライマーは、従来の方法、例えば
オリゴニュクレオチド合成または適当な制限酵素を用い
て大きなニュクレオチド配列のフラグメント化によって
調製することができる。
オリゴニュクレオチド合成または適当な制限酵素を用い
て大きなニュクレオチド配列のフラグメント化によって
調製することができる。
【００５１】多数のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株を単一
のプライマーで検出することができるので、病気の原因
となる菌株には関係なく、人間を含む哺乳動物における
肺炎球菌感染の診断に使用できる普遍的なＰＣＲ検出キ
ットを提供することができる。
のプライマーで検出することができるので、病気の原因
となる菌株には関係なく、人間を含む哺乳動物における
肺炎球菌感染の診断に使用できる普遍的なＰＣＲ検出キ
ットを提供することができる。
【００５２】菌株、プラスミッド及びプローブ 以下の実施例ならびに添付図面では、ある種のプラスミ
ッド及びこれらのプラスミッドならびにベクターＤＮＡ
セグメントで形質変換を行った細菌株を参考例として含
めた。これらのうち、いくつかのものはＡＴＣＣに寄託
されているが、ここでは全てを完全に記載した。以下の
表はこれらの材料の要約である。
ッド及びこれらのプラスミッドならびにベクターＤＮＡ
セグメントで形質変換を行った細菌株を参考例として含
めた。これらのうち、いくつかのものはＡＴＣＣに寄託
されているが、ここでは全てを完全に記載した。以下の
表はこれらの材料の要約である。
【００５３】 表ＩＩ表 示 型 説 明 供 託 記載場所 JY4313 E.coli株 PspA DNA ATCC68529 図１ JY2008 S.pneumoniae PspAフラグメント ATCC55143 図１ 株 43kDa JY4306 E.coli株 PspAフラグメント ATCC68522 図3,4,5 43kDa JY4310 PspAフラグメント なし 図10 21kDa JY4285 PspAフラグメント なし 図10 18kDa pJY4163 プラスミッド PspA-CTB融合タン なし 図９ パク(29kDa) の 表現にもちいた表現 プラスミッド JY4323 DNA プローブ HindIII-KpaI なし 図９ セグメント JY4306 DNA プローブ HindIII-Dra-I なし 図９ セグメント JY4262 DNA プローブ BclI-Bst-NI なし 図９ セグメント
【００５４】
【００５５】
【実施例】実施例１ この実施例ではＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ新種の成長及
調製法を示す。
調製法を示す。
【００５６】Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｒｘ１（これ
はカプセル２型株Ｄ３９（国立標準株保存機関、ロンド
ン、ＮＣＴＣ＃７４５５）の非カプセル型誘導型である
が）をマクダニエル等 III、１９８７年、クレイン等１
９９０年、タルキングトン等１９９１年により示されて
いるようにＰｓｐＡの１０ケの異なるクローン化フラグ
メントと共にｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ不活性化処理をし
た（第６および７図参照）。
はカプセル２型株Ｄ３９（国立標準株保存機関、ロンド
ン、ＮＣＴＣ＃７４５５）の非カプセル型誘導型である
が）をマクダニエル等 III、１９８７年、クレイン等１
９９０年、タルキングトン等１９９１年により示されて
いるようにＰｓｐＡの１０ケの異なるクローン化フラグ
メントと共にｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ不活性化処理をし
た（第６および７図参照）。
【００５７】これらのフラグメントはすべてクローン化
されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＹ４３１３株（ＡＴＣＣにアク
セス番号６８５２９で１９９１年１月３１日に寄託され
ている。）のプラスミドＰｓｐＡ ＤＮＡを制限酵素で
消化して得られたものである。
されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＹ４３１３株（ＡＴＣＣにアク
セス番号６８５２９で１９９１年１月３１日に寄託され
ている。）のプラスミドＰｓｐＡ ＤＮＡを制限酵素で
消化して得られたものである。
【００５８】このｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ重複突然変異
（第６および７図参照）はクローン化断片の３’端末近
くで遺伝子発現を終結させる。
（第６および７図参照）はクローン化断片の３’端末近
くで遺伝子発現を終結させる。
【００５９】結果物の一株、ＪＹ２００８、（ＡＴＣＣ
に５５１４３番として１９９１年１月２４日寄託した）
は、ｐＫＳＤ３００とコードされた（１９８７年マクダ
ニエル等 III）ＤＮＡの断片から導かれたものであり、
２７ｋＤａ（見かけ上の分子量は４３ｋＤａ）のＰｓｐ
Ａ断片をつくる。この断片は生来の蛋白質（見かけ上の
分子量は８４ｋＤａ）のおおよそ、４０％の大きさで、
６４ｋＤａである。
に５５１４３番として１９９１年１月２４日寄託した）
は、ｐＫＳＤ３００とコードされた（１９８７年マクダ
ニエル等 III）ＤＮＡの断片から導かれたものであり、
２７ｋＤａ（見かけ上の分子量は４３ｋＤａ）のＰｓｐ
Ａ断片をつくる。この断片は生来の蛋白質（見かけ上の
分子量は８４ｋＤａ）のおおよそ、４０％の大きさで、
６４ｋＤａである。
【００６０】予想された分子サイズは、アミノ酸配列に
デデュースしたものに基くものであり、見かけの分子サ
イズはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に基くものである。こ
れらのサイズの違いはＰｓｐＡ断片のコンフォーメーシ
ョンに基く。
デデュースしたものに基くものであり、見かけの分子サ
イズはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に基くものである。こ
れらのサイズの違いはＰｓｐＡ断片のコンフォーメーシ
ョンに基く。
【００６１】プロリン及び反覆／アンカー領域（図１参
照）を切除した。得られたタンパクは、これらの領域を
欠失するため、細胞に付着することができない。つい
で、下記のごとく、未付着タンパクを培養液上清から単
離した。
照）を切除した。得られたタンパクは、これらの領域を
欠失するため、細胞に付着することができない。つい
で、下記のごとく、未付着タンパクを培養液上清から単
離した。
【００６２】ＰｓｐＡ遺伝子中の異なる点に挿入を行う
ことにより、図１０に示すように、長さの異なるトラン
ケート状の非吸着性ＰｓｐＡタンパク誘導体が得られ
る。肺炎球菌ＪＹ２００８株は、０．１０％の塩化コリ
ン、０．７５％のＬ−システィンＨＣｌ及び、０．２５
％ＮａＨＣＯ3 を添加した６ｌの化学的制限培地（Ｉｎ
ｆ．、Ｉｍｍ、２７：４４４参照）中で培養した。
ことにより、図１０に示すように、長さの異なるトラン
ケート状の非吸着性ＰｓｐＡタンパク誘導体が得られ
る。肺炎球菌ＪＹ２００８株は、０．１０％の塩化コリ
ン、０．７５％のＬ−システィンＨＣｌ及び、０．２５
％ＮａＨＣＯ3 を添加した６ｌの化学的制限培地（Ｉｎ
ｆ．、Ｉｍｍ、２７：４４４参照）中で培養した。
【００６３】ＪＹ２００８の増殖中期の培養液上清を
０．２２μの横型メンブランフィルターでろ過し、６０
倍に濃縮した。
０．２２μの横型メンブランフィルターでろ過し、６０
倍に濃縮した。
【００６４】非修飾Ｄ３９株にｐｋＳＤ３００プラスミ
ッドを導入すると、同様に４３ｋＤのトランケート状Ｐ
ｓｐＡタンパクが得られた。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
３型ＷＵ２株（ＰｓｐＡタンパク約９２ｋＤ）にｐｋＳ
Ｄ３００プラスミッドを導入すると、細菌が増殖するに
つれ、分子量約４６ｋＤの非吸着性のトランケート状Ｐ
ｓｐＡタンパクが得られた。実施例２ 本実施例はＰｓｐＡの精製を説明するものである。
ッドを導入すると、同様に４３ｋＤのトランケート状Ｐ
ｓｐＡタンパクが得られた。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
３型ＷＵ２株（ＰｓｐＡタンパク約９２ｋＤ）にｐｋＳ
Ｄ３００プラスミッドを導入すると、細菌が増殖するに
つれ、分子量約４６ｋＤの非吸着性のトランケート状Ｐ
ｓｐＡタンパクが得られた。実施例２ 本実施例はＰｓｐＡの精製を説明するものである。
【００６５】実施例１の記載にしたがって製造した培養
液上清濃縮物を、０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄
し、１９６，０００×ｇで超遠心を行った。上清を２０
ｍＭのＬ−ヒスチジン緩衝液−ＮａＣｌで１：５に希釈
し、ｐＨを６．０に調整し、ＤＥＡＥ−ＩｓｏｎｅｔＤ
２イオン交換カラムに注入した。
液上清濃縮物を、０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄
し、１９６，０００×ｇで超遠心を行った。上清を２０
ｍＭのＬ−ヒスチジン緩衝液−ＮａＣｌで１：５に希釈
し、ｐＨを６．０に調整し、ＤＥＡＥ−ＩｓｏｎｅｔＤ
２イオン交換カラムに注入した。
【００６６】８０ｍＭから２Ｍまでの段階的ＮａＣｌグ
ラジェントでカラムを溶出し、ＰｓｐＡを含むフラクシ
ョン（イオン強度０．３２〜０．６４Ｍ）を集め、ＳＤ
Ａポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルの代表的
切片上のタンパクをコマシェブルーＲ−２５０で染色し
てＰｓｐＡを同定した。残りのＳＤＳゲルからＰｓｐＡ
を含む画分を切り取り、ゲルから電気溶出した。溶出し
たタンパクはメタノール：アセトン（５０：５０）溶媒
中で沈澱させ、再度ＰＢＳに懸濁させた。製品の純度
は、銀染色及びｍＡｂ Ｘｉ１２６を用いたウェスタン
ブロット（ＩｇＧ，２ｂ，ｋ，ＭｃＤａｎｉｅｌら、前
記参照）で確認した。実施例３ 本実施例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ の周
縁細胞質空間からのＰｓｐＡの単離を説明するものであ
る。
ラジェントでカラムを溶出し、ＰｓｐＡを含むフラクシ
ョン（イオン強度０．３２〜０．６４Ｍ）を集め、ＳＤ
Ａポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルの代表的
切片上のタンパクをコマシェブルーＲ−２５０で染色し
てＰｓｐＡを同定した。残りのＳＤＳゲルからＰｓｐＡ
を含む画分を切り取り、ゲルから電気溶出した。溶出し
たタンパクはメタノール：アセトン（５０：５０）溶媒
中で沈澱させ、再度ＰＢＳに懸濁させた。製品の純度
は、銀染色及びｍＡｂ Ｘｉ１２６を用いたウェスタン
ブロット（ＩｇＧ，２ｂ，ｋ，ＭｃＤａｎｉｅｌら、前
記参照）で確認した。実施例３ 本実施例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ の周
縁細胞質空間からのＰｓｐＡの単離を説明するものであ
る。
【００６７】Ｅ．ｃｏｌｉの周縁細胞質空間からの単離
は、標準的手法を用いて行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＹ４
３０６株（本株はＰｓｐＡの４３ｋＤａ Ｎ−末端フラ
グメントを生産し、そのアミノ酸配列は図３ないし５に
示す。本株は１９９１年１月３１日にＡＴＣＣに寄託し
た。寄託番号６８５２２）を緩衝生理食塩水で洗い、２
０％蔗糖、１０ｍＭＥＤＴＡ及び２５ｍＭトリス（ｐＨ
７．７）を用いて０℃で１０分間インキュベーションし
た。ついで、細胞を０℃、４００×ｇで１０分間遠心分
離した。上清を捨て、ペレットをただちに約１００倍量
の水（４℃）に懸濁した。１０分後に４℃、４，０００
×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、Ｐｓｐ
Ａを含む上清を保存した。上清の濃縮は、固体蔗糖を用
いた濃縮または限外ろ過等の標準的手法で行った。Ｅ．
ｃｏｌｉから単離したタンパクの精製は、肺炎球菌の培
養液から４３ｋＤａ（トランケート状）ＰｓｐＡを単離
する場合に用いたと同じクロマトグラフィー法で行っ
た。実施例４ 本実施例は、ＰｓｐＡタンパクの免疫特性を説明するも
のである。Ｘｉｄ突然変異遺伝子を有するＣＢＡ／Ｎ系
マウス（７週齢）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｅｒ，ＭＥ）１６匹の眼窩
静脈洞から採血し、免疫投与前のＰｓｐＡ抗体レベルを
測定した。実施例２に記載したように調整した精製Ｐｓ
ｐＡをフロイントの完全アジュバントで乳化させ、マウ
スあたり約５μｇのタンパクを鼠径腋窩部に皮下注射し
た。さらに１４日後、実施例２に記載したように調製し
たＰｓｐＡを５μｇ皮内注射した。対照群のマウスに
は、殺菌ＳＤＳ緩衝液を同様に免疫投与した。最後の免
疫投与から７日後に、全動物の眼窩静脈洞から採血した
後、実施例１に記載したように培養した３００ＣＦＵの
３型ＷＵ２株を静脈内に抗原投与した。
は、標準的手法を用いて行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＹ４
３０６株（本株はＰｓｐＡの４３ｋＤａ Ｎ−末端フラ
グメントを生産し、そのアミノ酸配列は図３ないし５に
示す。本株は１９９１年１月３１日にＡＴＣＣに寄託し
た。寄託番号６８５２２）を緩衝生理食塩水で洗い、２
０％蔗糖、１０ｍＭＥＤＴＡ及び２５ｍＭトリス（ｐＨ
７．７）を用いて０℃で１０分間インキュベーションし
た。ついで、細胞を０℃、４００×ｇで１０分間遠心分
離した。上清を捨て、ペレットをただちに約１００倍量
の水（４℃）に懸濁した。１０分後に４℃、４，０００
×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、Ｐｓｐ
Ａを含む上清を保存した。上清の濃縮は、固体蔗糖を用
いた濃縮または限外ろ過等の標準的手法で行った。Ｅ．
ｃｏｌｉから単離したタンパクの精製は、肺炎球菌の培
養液から４３ｋＤａ（トランケート状）ＰｓｐＡを単離
する場合に用いたと同じクロマトグラフィー法で行っ
た。実施例４ 本実施例は、ＰｓｐＡタンパクの免疫特性を説明するも
のである。Ｘｉｄ突然変異遺伝子を有するＣＢＡ／Ｎ系
マウス（７週齢）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｅｒ，ＭＥ）１６匹の眼窩
静脈洞から採血し、免疫投与前のＰｓｐＡ抗体レベルを
測定した。実施例２に記載したように調整した精製Ｐｓ
ｐＡをフロイントの完全アジュバントで乳化させ、マウ
スあたり約５μｇのタンパクを鼠径腋窩部に皮下注射し
た。さらに１４日後、実施例２に記載したように調製し
たＰｓｐＡを５μｇ皮内注射した。対照群のマウスに
は、殺菌ＳＤＳ緩衝液を同様に免疫投与した。最後の免
疫投与から７日後に、全動物の眼窩静脈洞から採血した
後、実施例１に記載したように培養した３００ＣＦＵの
３型ＷＵ２株を静脈内に抗原投与した。
【００６８】免疫投与前及び抗原投与前の血清をウェス
タンブロット法で分析してトランケート状タンパクに対
する免疫反応のベースラインを求めた。ＷＵ２株のＰｓ
ｐＡは電気泳動を行った後、ニトロセルロースメンブラ
ンに移した。このメンブランを帯状に切り、１：５０に
希釈した所定のマウス抗血清で２時間プローブし、ビオ
チン添加ヤギ抗体マウス免疫グロブリンで１時間インキ
ュベーションし、ストレプトアビジン共役ホスファター
ゼで洗浄し、インキュベーションした。０．０１％の５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート
トルイジン塩をメンブランに噴霧し、テトラゾリウムの
青色を発色させた。
タンブロット法で分析してトランケート状タンパクに対
する免疫反応のベースラインを求めた。ＷＵ２株のＰｓ
ｐＡは電気泳動を行った後、ニトロセルロースメンブラ
ンに移した。このメンブランを帯状に切り、１：５０に
希釈した所定のマウス抗血清で２時間プローブし、ビオ
チン添加ヤギ抗体マウス免疫グロブリンで１時間インキ
ュベーションし、ストレプトアビジン共役ホスファター
ゼで洗浄し、インキュベーションした。０．０１％の５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート
トルイジン塩をメンブランに噴霧し、テトラゾリウムの
青色を発色させた。
【００６９】精製ＰｓｐＡフラグメントを免疫投与した
８匹のＣＢＡ／Ｎマウスは、ＷＵ２株を抗原投与１４日
後でも全て生残し、発病症状は全く認められなかった。
対照の緩衝液を免疫投与したマウスでは、抗原投与２日
後に８匹中６匹が死亡し、残りの２匹は抗原投与２〜３
日後に、毛が波打ち、背をまるめ、活動が減少し、重度
の発病が認められたが、生残した。ｘ2 解析で、免疫投
与群と対照投与群の間の生存率に有意差（Ｐ＜０．００
３）が認められた。
８匹のＣＢＡ／Ｎマウスは、ＷＵ２株を抗原投与１４日
後でも全て生残し、発病症状は全く認められなかった。
対照の緩衝液を免疫投与したマウスでは、抗原投与２日
後に８匹中６匹が死亡し、残りの２匹は抗原投与２〜３
日後に、毛が波打ち、背をまるめ、活動が減少し、重度
の発病が認められたが、生残した。ｘ2 解析で、免疫投
与群と対照投与群の間の生存率に有意差（Ｐ＜０．００
３）が認められた。
【００７０】免疫投与前及び抗原投与前の血清をウェス
タンブロット法で分析した。免疫投与前の血清からは、
トランケート状ＰｓｐＡに対する抗体は検出されなかっ
た。免疫投与後の血清からは、８匹中８匹でＰｓｐＡ抗
体が検出され、特に６匹ではきわめて強い抗ＰｓｐＡ反
応が認められた。抗原株ＷＵ２を抗血清でプローブする
と、免疫投与したマウス全例で、ＷＵ２ＰｓｐＡエピト
ープときわめて高い交叉反応を示す抗体が認められた。
対照群のマウスではＰｓｐＡに対する抗体は検出されな
かった。
タンブロット法で分析した。免疫投与前の血清からは、
トランケート状ＰｓｐＡに対する抗体は検出されなかっ
た。免疫投与後の血清からは、８匹中８匹でＰｓｐＡ抗
体が検出され、特に６匹ではきわめて強い抗ＰｓｐＡ反
応が認められた。抗原株ＷＵ２を抗血清でプローブする
と、免疫投与したマウス全例で、ＷＵ２ＰｓｐＡエピト
ープときわめて高い交叉反応を示す抗体が認められた。
対照群のマウスではＰｓｐＡに対する抗体は検出されな
かった。
【００７１】免疫データを表III に要約する。
【００７２】 表 III 免疫原 ＰｓｐＡ 抗原投与２日後 抗原投与１４日後 抗体の検出 の生存率 の生存率 ─────────────────────────────────── 単離ＰｓｐＡ ８／８ ８／８ ８／８ （実施例２） 殺菌ＳＤＳ ０／８ ２／８ ２／８ （対 照）表III のデータから明らかなように、精製Ｐ
ｓｐＡ分子５μｇを２回免疫投与すると、ＣＢＡ／Ｎマ
ウスで致命的な感染に対する防御が誘発され、抗原株の
ＰｓｐＡに反応する抗体が誘発された。実施例５ 本実施例はＰｓｐＡタンパクの配列決定を説明するもの
である。再結晶したＳＤＳを含むゲルをレムリー緩衝液
系（Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０）で９％展開するこ
とによって、実施例２に記載したように調製した精製Ｐ
ｓｐＡの電気泳動を行った。１０％のメタノールを含む
１０ｍＭの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパ
ン スルホン酸、ｐＨ１１．０に１０分間２回ゲルを浸
漬した。ポリビニリデン ジフルオライド メンブラン
（ＰＶＤＦ）を１００％メタノールに数秒間浸漬して完
全に湿らせた後、ＣＡＰＳ緩衝液で１０分間洗った。
０．５Ａを１時間流し、ＣＡＰＳ緩衝液中のＰＶＤＦメ
ンブランにＰｓｐＡを電気的に移した。移動後、メンブ
ランを脱イオン水中で５分間、２回洗浄し、５０％メタ
ノールに溶解した０．１％コマシー青Ｒ−２５０で２０
分間染色した。ＰｓｐＡを含むメンブランを切り取り、
４０％メタノール及び１０％酢酸中で５分間脱色した。
メンブランを細切りし、配列決定まで、殺菌したエペン
ドルフ管に保存した。
ｓｐＡ分子５μｇを２回免疫投与すると、ＣＢＡ／Ｎマ
ウスで致命的な感染に対する防御が誘発され、抗原株の
ＰｓｐＡに反応する抗体が誘発された。実施例５ 本実施例はＰｓｐＡタンパクの配列決定を説明するもの
である。再結晶したＳＤＳを含むゲルをレムリー緩衝液
系（Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０）で９％展開するこ
とによって、実施例２に記載したように調製した精製Ｐ
ｓｐＡの電気泳動を行った。１０％のメタノールを含む
１０ｍＭの３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパ
ン スルホン酸、ｐＨ１１．０に１０分間２回ゲルを浸
漬した。ポリビニリデン ジフルオライド メンブラン
（ＰＶＤＦ）を１００％メタノールに数秒間浸漬して完
全に湿らせた後、ＣＡＰＳ緩衝液で１０分間洗った。
０．５Ａを１時間流し、ＣＡＰＳ緩衝液中のＰＶＤＦメ
ンブランにＰｓｐＡを電気的に移した。移動後、メンブ
ランを脱イオン水中で５分間、２回洗浄し、５０％メタ
ノールに溶解した０．１％コマシー青Ｒ−２５０で２０
分間染色した。ＰｓｐＡを含むメンブランを切り取り、
４０％メタノール及び１０％酢酸中で５分間脱色した。
メンブランを細切りし、配列決定まで、殺菌したエペン
ドルフ管に保存した。
【００７３】単離したＰｓｐＡは、ＰＶＤＦメンブラン
から直接配列決定を行った。図２はＮ−末端４５残基ア
ミノ酸配列を示し、図８はα−ら線状領域全体のアミノ
酸配列を示す。ｐｓｐＡ遺伝子全体のＤＮＡ配列及びＰ
ｓｐＡタンパクの推定アミノ酸配列は図３ないし５に示
す。実施例６ 本実施例は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＥ．ｃｏｌ
ｉから発現または排泄／分泌される非相同タンパクの発
現及びリーダー配列として、ｐｓｐＡ５’−配列または
ＰｓｐＡ Ｎ−末端領域の利用を説明するものである。
本実施例では、遺伝子融合によりコレラ毒素Ｂ−サブユ
ニット（ＣＴＢ）に融合させたＰｓｐＡタンパクのＮ−
末端の発現、肺炎球菌からの融合タンパクの排泄及びそ
のＥ．ｃｏｌｉ周縁細胞室空間中への分泌について記載
する。
から直接配列決定を行った。図２はＮ−末端４５残基ア
ミノ酸配列を示し、図８はα−ら線状領域全体のアミノ
酸配列を示す。ｐｓｐＡ遺伝子全体のＤＮＡ配列及びＰ
ｓｐＡタンパクの推定アミノ酸配列は図３ないし５に示
す。実施例６ 本実施例は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＥ．ｃｏｌ
ｉから発現または排泄／分泌される非相同タンパクの発
現及びリーダー配列として、ｐｓｐＡ５’−配列または
ＰｓｐＡ Ｎ−末端領域の利用を説明するものである。
本実施例では、遺伝子融合によりコレラ毒素Ｂ−サブユ
ニット（ＣＴＢ）に融合させたＰｓｐＡタンパクのＮ−
末端の発現、肺炎球菌からの融合タンパクの排泄及びそ
のＥ．ｃｏｌｉ周縁細胞室空間中への分泌について記載
する。
【００７４】ＣＴＢ及びＰｓｐＡの半分のＮ−末端から
成る融合タンパクはＥ．ｃｏｌｉ中に構成し、発現させ
た。用いたＨｉｎｄIII ／ＤｒａＩ ｐｓｐＡ遺伝子フ
ラグメントは、ｐｓｐＡ複写及び翻訳開始シグナル及び
細胞膜に移行させるためのＰｓｐＡシグナルペプチドリ
ーダー配列の全てを含んでいる。このフラグメントによ
りコード化された成熟ＰｓｐＡは、α−ら線状高次コイ
ルドメインの９０％以上から成る２９ｋＤａ（実測分子
量４２ｋＤａ）の産物であると推定される。用いたＣＴ
Ｂフラグメントは、複写及び翻訳開始シグナルを欠失し
ている。ＰｓｐＡを介してｐｓｐＡプロモーターから発
現させ、ＣＴＢをコード化した遺伝子ｃｔｘＢにフレー
ム内翻訳解読させることにより、上流ＰｓｐＡ産物に融
合させた１２ｋＤａのＣＴＢ産物が得られた。ＰｓｐＡ
−ＣＴＢ融合タンパクは、Ｅ．ｃｏｌｉの高及び低複写
数プラスミッド（ｐＵＣ１８では１００複写／細胞以
上、ｐＪＹ４１６３では１５〜３０複写／細胞）に安定
的に発現された。
成る融合タンパクはＥ．ｃｏｌｉ中に構成し、発現させ
た。用いたＨｉｎｄIII ／ＤｒａＩ ｐｓｐＡ遺伝子フ
ラグメントは、ｐｓｐＡ複写及び翻訳開始シグナル及び
細胞膜に移行させるためのＰｓｐＡシグナルペプチドリ
ーダー配列の全てを含んでいる。このフラグメントによ
りコード化された成熟ＰｓｐＡは、α−ら線状高次コイ
ルドメインの９０％以上から成る２９ｋＤａ（実測分子
量４２ｋＤａ）の産物であると推定される。用いたＣＴ
Ｂフラグメントは、複写及び翻訳開始シグナルを欠失し
ている。ＰｓｐＡを介してｐｓｐＡプロモーターから発
現させ、ＣＴＢをコード化した遺伝子ｃｔｘＢにフレー
ム内翻訳解読させることにより、上流ＰｓｐＡ産物に融
合させた１２ｋＤａのＣＴＢ産物が得られた。ＰｓｐＡ
−ＣＴＢ融合タンパクは、Ｅ．ｃｏｌｉの高及び低複写
数プラスミッド（ｐＵＣ１８では１００複写／細胞以
上、ｐＪＹ４１６３では１５〜３０複写／細胞）に安定
的に発現された。
【００７５】融合産物は期待した分子量（約５４ｋＤ
ａ）を有し、抗体と反応してＰｓｐＡとＣＴＢを生成し
た。ＣＴＢ産物がその機能を保有していることは、ＣＴ
Ｂの特性であるガングリオシドＧM1に対する融合タンパ
クの結合能力によって確認することができた。
ａ）を有し、抗体と反応してＰｓｐＡとＣＴＢを生成し
た。ＣＴＢ産物がその機能を保有していることは、ＣＴ
Ｂの特性であるガングリオシドＧM1に対する融合タンパ
クの結合能力によって確認することができた。
【００７６】融合産物の発現レベルが高くなると、タン
パクの周縁細胞質への完全な移行を阻害するプロセシン
グまたは立体配置変化の割合が明らかに減少した。しか
し、複写数が少ない構成では、融合タンパクの約６０％
が周縁細胞質中に局在し、多量のタンパクが浸透圧衝撃
でＥ．ｃｏｌｉから容易に放出される。
パクの周縁細胞質への完全な移行を阻害するプロセシン
グまたは立体配置変化の割合が明らかに減少した。しか
し、複写数が少ない構成では、融合タンパクの約６０％
が周縁細胞質中に局在し、多量のタンパクが浸透圧衝撃
でＥ．ｃｏｌｉから容易に放出される。
【００７７】Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に加えて、融合
タンパクは無毒性のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１
中に低複写数構成が形質転換され、挿入複製変異株とし
てＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに発現される。このように
して、融合タンパクをコード化した遺伝子はＳ．ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅの染色体中に取り込まれ、その染色体に
より安定的に発現される。実施例１の場合はトランケー
トＰｓｐＡ分子が付加／アンカー領域を欠いているが、
この場合にはＰｓｐＡ−ＣＴＢ融合タンパクとして培養
液上清中に分泌された。融合タンパク産物は期待通りの
分子量（５４ｋＤａ）を有し、抗体と反応してＰｓｐ
Ａ、ＣＴＢ及び結合ＧM1を生成した。実施例７ 本実施例は、特に肺炎球菌の表面に発現されたＰｓｐＡ
−ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）の発現において
機能的な付加／アンカー配列を有するＳ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅまたはその他の細菌の表面に非相同タンパクを
発現させるＰｓｐＡ付加またはアンカー領域の使用につ
いて説明するものである。
タンパクは無毒性のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒｘ１
中に低複写数構成が形質転換され、挿入複製変異株とし
てＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに発現される。このように
して、融合タンパクをコード化した遺伝子はＳ．ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅの染色体中に取り込まれ、その染色体に
より安定的に発現される。実施例１の場合はトランケー
トＰｓｐＡ分子が付加／アンカー領域を欠いているが、
この場合にはＰｓｐＡ−ＣＴＢ融合タンパクとして培養
液上清中に分泌された。融合タンパク産物は期待通りの
分子量（５４ｋＤａ）を有し、抗体と反応してＰｓｐ
Ａ、ＣＴＢ及び結合ＧM1を生成した。実施例７ 本実施例は、特に肺炎球菌の表面に発現されたＰｓｐＡ
−ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）の発現において
機能的な付加／アンカー配列を有するＳ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅまたはその他の細菌の表面に非相同タンパクを
発現させるＰｓｐＡ付加またはアンカー領域の使用につ
いて説明するものである。
【００７８】Ｎ−末端をコード化しているＰｓｐＡの領
域は、その複写及び翻訳開始シグナル及びそのシグナル
ペプチドリーダー配列を含み、翻訳されたフレーム内遺
伝子融合を介して、複写及び翻訳開始及び終了シグナル
を欠失するＣＴＢコード化ｃｔｘＢフラグメントに結合
している。この配列は、フレーム内でＰｓｐＡ付加／ア
ンカードメインに続き、プロリンの反復及びＣ−末端ド
メインの一部または全てを含んでいる。得られる融合タ
ンパクはＰｓｐＡリーダー配列を介して細胞外に指向
し、膜を通して移行することにより清浄化され、Ｐｓｐ
Ａ付加／アンカー配列によって細胞に付加される。２つ
のＰｓｐＡフラグメントの間に位置する非相同タンパク
は、膜の外側の表面、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの場合
には細胞表面上に発現される。実施例８ 本実施例は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓのＢａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−
Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）株によるトランケート状の完全
な長さを有するＰｓｐＡの発現を説明するものである。
域は、その複写及び翻訳開始シグナル及びそのシグナル
ペプチドリーダー配列を含み、翻訳されたフレーム内遺
伝子融合を介して、複写及び翻訳開始及び終了シグナル
を欠失するＣＴＢコード化ｃｔｘＢフラグメントに結合
している。この配列は、フレーム内でＰｓｐＡ付加／ア
ンカードメインに続き、プロリンの反復及びＣ−末端ド
メインの一部または全てを含んでいる。得られる融合タ
ンパクはＰｓｐＡリーダー配列を介して細胞外に指向
し、膜を通して移行することにより清浄化され、Ｐｓｐ
Ａ付加／アンカー配列によって細胞に付加される。２つ
のＰｓｐＡフラグメントの間に位置する非相同タンパク
は、膜の外側の表面、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの場合
には細胞表面上に発現される。実施例８ 本実施例は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓのＢａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−
Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）株によるトランケート状の完全
な長さを有するＰｓｐＡの発現を説明するものである。
【００７９】ＢＣＧは、トランケート状ＰｓｐＡタンパ
クをコード化するｐｓｐＡ遺伝子に取り込まれるように
染色体を修飾した。４３ｋＤａのトランケート状Ｐｓｐ
Ａタンパクは、修飾ＢＣＧから総ＢＣＧタンパクの約１
５％に発現させた。その結果、５’−分泌シグナルを欠
く４３ｋＤａ領域をコード化したｐｓｐＡ遺伝子セグメ
ントを有する発現ベクター構成が得られた。発現は、Ｐ
ｓｐＡまたはミコバクテリア シグナル配列を含めても
ＢＣＧタンパクの約１％に過ぎなかった。いずれの場合
にも、発現されたＰｓｐＡのほとんど大部分は培地中に
分泌された。ミコバクテリアのリポタンパクシグナル配
列と融合した４３ｋＤａＰｓｐＡタンパクを発現させる
と、ＢＣＧのメンブラン画分中に組替えＰｓｐＡの発現
が得られた。
クをコード化するｐｓｐＡ遺伝子に取り込まれるように
染色体を修飾した。４３ｋＤａのトランケート状Ｐｓｐ
Ａタンパクは、修飾ＢＣＧから総ＢＣＧタンパクの約１
５％に発現させた。その結果、５’−分泌シグナルを欠
く４３ｋＤａ領域をコード化したｐｓｐＡ遺伝子セグメ
ントを有する発現ベクター構成が得られた。発現は、Ｐ
ｓｐＡまたはミコバクテリア シグナル配列を含めても
ＢＣＧタンパクの約１％に過ぎなかった。いずれの場合
にも、発現されたＰｓｐＡのほとんど大部分は培地中に
分泌された。ミコバクテリアのリポタンパクシグナル配
列と融合した４３ｋＤａＰｓｐＡタンパクを発現させる
と、ＢＣＧのメンブラン画分中に組替えＰｓｐＡの発現
が得られた。
【００８０】この後者の結果は、リポタンパク シグナ
ル配列の融合により組替えＰｓｐＡがアクリル化される
ことを暗示している。フルオロクロム共役単一クローン
ＰｓｐＡ抗体を用いたフルオレセント活性化細胞ソート
を行い、これらのバクテリアの表面にＰｓｐＡが表現さ
れていることを実証した。実施例９ 本実施例は、肺炎球菌の各種系統間でｐｓｐＡ遺伝子の
一部が相同性を有し、そのため分子（ＤＮＡ）的方法と
して、組織、体液または分泌物中の肺炎球菌の検出及び
患者から採取した試料から培養した肺炎球菌の同定に利
用できることを説明するものである。
ル配列の融合により組替えＰｓｐＡがアクリル化される
ことを暗示している。フルオロクロム共役単一クローン
ＰｓｐＡ抗体を用いたフルオレセント活性化細胞ソート
を行い、これらのバクテリアの表面にＰｓｐＡが表現さ
れていることを実証した。実施例９ 本実施例は、肺炎球菌の各種系統間でｐｓｐＡ遺伝子の
一部が相同性を有し、そのため分子（ＤＮＡ）的方法と
して、組織、体液または分泌物中の肺炎球菌の検出及び
患者から採取した試料から培養した肺炎球菌の同定に利
用できることを説明するものである。
【００８１】３種類のＤＮＡプローブ、すなわち完全な
長さのｐｓｐＡ、ＪＹ４３２３（Ｎ−末端ＨｉｎｄIII
からＣ−末端ＫｐｎＩまで）、Ｎ−末端を含むｐｓｐＡ
の半分、ＪＹ４３０６（Ｎ−末端ＨｉｎｄIII から９９
６位のＤｒａＩ（図３ないし５参照）まで）及びプロリ
ン及び反復領域の大部分、ＪＹ４２６２（１２２１位の
ＢｃｌＩから１８３２位のＢｓｔＮＩまで）を用いた。
９５％同一性を要求するストリンジェント条件下で、プ
ローブＪＹ４３２３及びＪＹ４２６２を、サザーンブロ
ット法で分離した２００系統以上のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅの細胞と反応させた。
長さのｐｓｐＡ、ＪＹ４３２３（Ｎ−末端ＨｉｎｄIII
からＣ−末端ＫｐｎＩまで）、Ｎ−末端を含むｐｓｐＡ
の半分、ＪＹ４３０６（Ｎ−末端ＨｉｎｄIII から９９
６位のＤｒａＩ（図３ないし５参照）まで）及びプロリ
ン及び反復領域の大部分、ＪＹ４２６２（１２２１位の
ＢｃｌＩから１８３２位のＢｓｔＮＩまで）を用いた。
９５％同一性を要求するストリンジェント条件下で、プ
ローブＪＹ４３２３及びＪＹ４２６２を、サザーンブロ
ット法で分離した２００系統以上のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅの細胞と反応させた。
【００８２】染色体ＤＮＡをＨｉｎｄIII で切断する
と、一般にこれらのプローブは、いずれも２つの明瞭な
バンドを検出することができ、各バンドの大きさは検査
した系統によって異なっていた。肺炎球菌Ｒｘ１株の場
合、各バンドの大きさは４．０及び９．１ｋｂであっ
た。４．０ｋｂのバンドはｐｓｐＡに相当し、ＰｓｐＡ
変異株では変性または欠失していた。一方、別のバンド
はＮ−末端またはＣ−末端を含むＰｓｐＡの半分をコー
ド化した領域とある程度の相同性を有し、ｐｓｐＡ突然
変異によって影響を受けない。ＪＹ４３２３及びＪＹ４
２６２は、その他のグラム陽性細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びグラム陰性細菌Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとは反応し
なかった。Ｎ−末端プローブのＪＹ４３０６は、検査し
た肺炎球菌の約１／３を識別することができた。
と、一般にこれらのプローブは、いずれも２つの明瞭な
バンドを検出することができ、各バンドの大きさは検査
した系統によって異なっていた。肺炎球菌Ｒｘ１株の場
合、各バンドの大きさは４．０及び９．１ｋｂであっ
た。４．０ｋｂのバンドはｐｓｐＡに相当し、ＰｓｐＡ
変異株では変性または欠失していた。一方、別のバンド
はＮ−末端またはＣ−末端を含むＰｓｐＡの半分をコー
ド化した領域とある程度の相同性を有し、ｐｓｐＡ突然
変異によって影響を受けない。ＪＹ４３２３及びＪＹ４
２６２は、その他のグラム陽性細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びグラム陰性細菌Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとは反応し
なかった。Ｎ−末端プローブのＪＹ４３０６は、検査し
た肺炎球菌の約１／３を識別することができた。
【００８３】これらの結果は、プロリン／反復領域に含
まれる配列は肺炎球菌の全ての系統で同じであり、その
他の細菌には存在しない。分子のＮ−末端を含む半分は
変化が大きいように思われる。実施例１０ 本実施例は、ＰｓｐＡのα−螺旋状Ｎ−末端領域におけ
るエピトープの検出及びその位置の決定について説明す
るものである。
まれる配列は肺炎球菌の全ての系統で同じであり、その
他の細菌には存在しない。分子のＮ−末端を含む半分は
変化が大きいように思われる。実施例１０ 本実施例は、ＰｓｐＡのα−螺旋状Ｎ−末端領域におけ
るエピトープの検出及びその位置の決定について説明す
るものである。
【００８４】図８、９及び１０に＊印で表示したマウス
モデルにおける肺炎球菌感染防御単一クローン抗体を用
いて、ＰｓｐＡのα−ら線状Ｎ−末端領域における各抗
体のエピトープの位置を決定した。その位置は、Ｐｓｐ
Ａのフラグメントにマップした。結果は図５〜７に示
す。図５はＰｓｐＡのＮ−末端領域の推定アミノ配列及
び単一クローン抗体によって識別されるエピトープの一
般的な位置を示し、図９は各種のｐｓｐＡを遺伝子セグ
メントによって生産されるＰｓｐＡフラグメントと抗体
の反応性を示す。図１０は各種のｐｓｐＡ遺伝子セグメ
ントによって生産されるＰｓｐＡフラグメントにおける
エピトープ地図を示す。
モデルにおける肺炎球菌感染防御単一クローン抗体を用
いて、ＰｓｐＡのα−ら線状Ｎ−末端領域における各抗
体のエピトープの位置を決定した。その位置は、Ｐｓｐ
Ａのフラグメントにマップした。結果は図５〜７に示
す。図５はＰｓｐＡのＮ−末端領域の推定アミノ配列及
び単一クローン抗体によって識別されるエピトープの一
般的な位置を示し、図９は各種のｐｓｐＡを遺伝子セグ
メントによって生産されるＰｓｐＡフラグメントと抗体
の反応性を示す。図１０は各種のｐｓｐＡ遺伝子セグメ
ントによって生産されるＰｓｐＡフラグメントにおける
エピトープ地図を示す。
【００８５】図８の数字１３８，１９３及び２６１は、
単一クローン抗体Ｘｉ１５２６，Ｘｉ１２６，ＸｉＲ３
５，ＸｉＲ３８，ＸｉＲ１２２４，ＸｉＲ１６，Ｘｉ６
４，ＸｉＲ２７８，Ｘｉ１３２５及びＸｉ１３２３によ
って検出されたエピトープの位置をマップするために用
いたＰｓｐＡフラグメントにおけるブレークポイントを
示す。＊印を示したいくつかの抗体は、肺炎球菌ＷＵ２
株による致命的肺炎球菌感染を防護することのできるも
のである。
単一クローン抗体Ｘｉ１５２６，Ｘｉ１２６，ＸｉＲ３
５，ＸｉＲ３８，ＸｉＲ１２２４，ＸｉＲ１６，Ｘｉ６
４，ＸｉＲ２７８，Ｘｉ１３２５及びＸｉ１３２３によ
って検出されたエピトープの位置をマップするために用
いたＰｓｐＡフラグメントにおけるブレークポイントを
示す。＊印を示したいくつかの抗体は、肺炎球菌ＷＵ２
株による致命的肺炎球菌感染を防護することのできるも
のである。
【００８６】さらに、図の右側の垂直な線は、高コイル
α−螺旋構造を有すると予想される領域を示す。図の左
側は各抗体のエピトープの地図を示す。
α−螺旋構造を有すると予想される領域を示す。図の左
側は各抗体のエピトープの地図を示す。
【００８７】
【発明の効果】本開示を要約すると、本発明はＰｓｐＡ
タンパクの防御エピトープを含むための免疫防御反応を
誘発することのできるトランケート状ＰｓｐＡ分子に関
する、本発明の範囲内で改良が可能である。
タンパクの防御エピトープを含むための免疫防御反応を
誘発することのできるトランケート状ＰｓｐＡ分子に関
する、本発明の範囲内で改良が可能である。
【図１】成熟ＰｓｐＡのドメインの模式図。
【図２】ＰｓｐＡのＮ−末端アミノ酸配列を示す図。こ
こで太い大文字は荷電した親水性アミノ酸を示し、小文
字は非極性の疎水性残基を示し、下線を引いた太い小文
字は非荷電の極性親水性残基を示す。
こで太い大文字は荷電した親水性アミノ酸を示し、小文
字は非極性の疎水性残基を示し、下線を引いた太い小文
字は非荷電の極性親水性残基を示す。
【図３】ＰｓｐＡタンパクの推測アミノ酸配列を有する
ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ並列を示す図。
ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ並列を示す図。
【図４】ＰｓｐＡタンパクの推測アミノ酸配列を有する
ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ並列を示す図。
ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ並列を示す図。
【図５】ＰｓｐＡタンパクの推測アミノ酸配列を有する
ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ並列を示す図。ここでアミノ酸
配列は図３から４および５に連続する。
ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ並列を示す図。ここでアミノ酸
配列は図３から４および５に連続する。
【図６】ｐｓｐＡの制限マップ。
【図７】ｐｓｐＡ遺伝子における突然変異株を構成する
ために挿入複製突然変異の利用を示す図。
ために挿入複製突然変異の利用を示す図。
【図８】ＰｓｐＡのＮ−末端部位における推測アミノ酸
配列及び単一クローン性抗体により識別されるエピトー
プの一般的位置を示す図。
配列及び単一クローン性抗体により識別されるエピトー
プの一般的位置を示す図。
【図９】各種のｐｓｐＡ遺伝子セグメントにより生産さ
れたＰｓｐＡフラグメントと抗体との反応性を示す図。
れたＰｓｐＡフラグメントと抗体との反応性を示す図。
【図１０】各種のｐｓｐＡ遺伝子セグメントにより生産
されたＰｓｐＡフラグメントにおけるエピトープの地図
上の位置を示す図。
されたＰｓｐＡフラグメントにおけるエピトープの地図
上の位置を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｆ // Ａ６１Ｋ 39/09 ＡＤＺ Ａ６１Ｋ 39/09 ＡＤＺ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジャネット エル． ヨーザー アメリカ合衆国 35242 アラバマ州 バ ーミンガム ハザーブロック ロード 2208 (72)発明者 ラリー エス． マックダニエル アメリカ合衆国 35210 アラバマ州 バ ーミンガム コルネル ドライヴ 5354
Claims (42)
- 【請求項１】 少なくともＰｓｐＡタンパクの一部をコ
ードし、かつ図３に規定した配列に含まれるコード化配
列を有するか、またはそれに実質的に相同的な配列を有
する生物学的に純粋なＤＮＡ分子。 - 【請求項２】 ＰｓｐＡタンパクのα−螺旋状高次コイ
ル領域の少なくとも一部をコードすることを特徴とする
請求項１に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 ＰｓｐＡタンパクのプロリン・リッチ領
域の少なくとも一部をコードすることを特徴とする請求
項１に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項４】 ＰｓｐＡタンパクの反復領域の少なくと
も一部をコードすることを特徴とする請求項１に記載の
ＤＮＡ分子。 - 【請求項５】 ｐｓｐＡ遺伝子で細菌の挿入重複突然変
異を起こさせることによりトランケート状発現ＰｓｐＡ
タンパクをコード化し、前記の細菌を培養してトランケ
ート状ＰｓｐＡタンパクを発現させ、前記のタンパクを
単離することから成る免疫防御性トランケート状Ｐｓｐ
Ａタンパクの製造方法。 - 【請求項６】 前記の細菌がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
の系統から成り、前記の突然変異株を制限培地中で培養
して培地中にトランケート状ＰｓｐＡタンパクを発現さ
せ、培地からタンパクを単離することを特徴とする請求
項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記の突然変異株がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅのＪＹ２００８株であることを特徴とする請求項
６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記の細菌がＥ．ｃｏｌｉの系統から成
り、前記の突然変異株を制限培地中で培養してトランケ
ート状ＰｓｐＡタンパクを前記突然変異株の周縁細胞質
中に発現させ、トランケート状タンパクを前記突然変異
株の周縁細胞質から単離することを特徴とする請求項５
に記載の方法。 - 【請求項９】 前記の突然変異株がＥ．ｃｏｌｉのＪＹ
４３０６株であることを特徴とする請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１０】 前記の細菌がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ａの系統から成ることを特徴とする請求項５に記載の方
法。 - 【請求項１１】 前記突然変異株が突然変異ＢＣＧであ
ることを特徴とする請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記の単離したタンパクをイオン交換
クロマトグラフィーによって精製することを特徴とする
請求項５に記載の方法。 - 【請求項１３】 トランケート状発現タンパクをコード
化したｐｓｐＡ遺伝子を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの突然変異株。 - 【請求項１４】 前記の株がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
のＪＹ２００８株であることを特徴とする請求項１３に
記載の変異株。 - 【請求項１５】 前記の株がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
のＪＹ４３１０株であることを特徴とする請求項１３に
記載の変異株。 - 【請求項１６】 前記の株がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
のＪＹ４２８５株であることを特徴とする請求項１３に
記載の変異株。 - 【請求項１７】 別のタンパクをコード化した遺伝子に
結合し、トランケート状ＰｓｐＡタンパクをコード化し
たｐｓｐＡ遺伝子を有することを特徴とする請求項１３
に記載の変異株。 - 【請求項１８】 前記の別のタンパクをコード化した遺
伝子がコレラ毒素のＢ−サブユニットをコード化したｃ
ｔｘＢ遺伝子であることを特徴とする請求項１７に記載
の変異株。 - 【請求項１９】 前記の株がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
のＪＹ２１８２株であることを特徴とする請求項１８に
記載の変異株。 - 【請求項２０】 トランケート状発現ＰｓｐＡタンパク
をコード化したｐｓｐＡ遺伝子を有するＭｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍの突然変異株。 - 【請求項２１】 前記の株が突然変異ＢＣＧであること
を特徴とする請求項２０に記載の変異株。 - 【請求項２２】 トランケート状発現ＰｓｐＡタンパク
をコード化したｐｓｐＡ遺伝子を有するＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉの突然変異株。 - 【請求項２３】 前記の株がＥ．ｃｏｌｉのＪＹ４３０
６株であることを特徴とする請求項２２に記載の変異
株。 - 【請求項２４】 前記の株がＥ．ｃｏｌｉのＪＹ４３５
３株であることを特徴とする請求項２２に記載の変異
株。 - 【請求項２５】 トランケート状ＰｓｐＡタンパクをコ
ード化したｐｓｐＡ遺伝子を別のタンパクをコード化し
た遺伝子と融合させて融合タンパククローンを形成さ
せ、前記融合タンパククローンで細菌の形質変換を行
い、形質変換細菌を培養してトランケート状ＰｓｐＡと
前記の別のタンパクから成る融合タンパクを発現させ、
前記の融合タンパクを単離することからなるクローン化
タンパクの製造法。 - 【請求項２６】 前記の細菌がグラム陽性細菌であり、
形質変換したグラム陽性細菌を制限培地で培養して融合
タンパクを前記の培地中に発現させ、融合タンパクを培
地から単離することを特徴とする請求項２５に記載の方
法。 - 【請求項２７】 前記のグラム陽性細菌がＳ．ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅの系統であることを特徴とする請求項２６
に記載の方法。 - 【請求項２８】 前記のグラム陽性細菌がＭｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍの系統であることを特徴とする請求項２
６に記載の方法。 - 【請求項２９】 前記の細菌がグラム陰性細菌であり、
形質変換グラム陰性細菌を制限培地中で培養して融合タ
ンパクを前記細菌の周縁細胞質内に発現させ、融合タン
パクを前記周縁細胞質から単離することを特徴とする請
求項２６に記載の方法。 - 【請求項３０】 前記のグラム陰性細菌がＥ．ｃｏｌｉ
の系統であることを特徴とする請求項２９に記載の方
法。 - 【請求項３１】 前記の別のタンパクをコード化した遺
伝子がコレラ毒素のＢ−サブユニット（ＣＴＢ）をコー
ド化した遺伝子であることを特徴とする請求項２５に記
載の方法。 - 【請求項３２】 前記の融合タンパクが前記のトランケ
ート状ＰｓｐＡタンパクとＣＴＢを接続する酸に不安定
な配列であり、前記のＰｓｐＡタンパクとＣＴＢが希釈
酸で処理することにより相互に分離することを特徴とす
る請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記の融合タンパクをＧM1アフィニテ
ィーカラムに吸着させることにより培地から分離し、カ
ラムから前記融合タンパクを溶出することを特徴とする
請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３４】 ｐｓｐＡ遺伝子の保存配列から成り、
試料中の肺炎球菌ＤＮＡを検出するためのＤＮＡプロー
ブ。 - 【請求項３５】 前記の保存配列が遺伝子のプロリン・
リッチ領域または遺伝子の反復領域またはその両方に存
在することを特徴とする請求項３４に記載のＤＮＡプロ
ーブ。 - 【請求項３６】 ＤＮＡプローブＪＹ４２６２。
- 【請求項３７】 ＤＮＡプローブＪＹ４３２３。
- 【請求項３８】 試料中の肺炎球菌の有無を検定するた
め、ｐｓｐＡ遺伝子の保存配列から成る肺炎球菌ＤＮＡ
のポリメラーゼ連鎖反応を起こさせるＤＮＡプライマ
ー。 - 【請求項３９】 前記の保存配列が遺伝子のプロリン・
リッチ領域、遺伝子の反復領域またはその両方に存在す
ることを特徴とする請求項３８に記載のＤＮＡプライマ
ー。 - 【請求項４０】 前記の保存配列が、図３のｐｓｐＡ配
列のニュクレオチド１３１２から１９９０にまで延びる
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｘ１株の６７８塩基対フ
ラグメントから成ることを特徴とする請求項３９に記載
のＤＮＡプライマー。 - 【請求項４１】 前記のプライマーが、５’−ＣＣＧＧ
ＡＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＡＡＣ−３’
（ＬＳＭ１）または５’−ＧＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣ
ＴＴＡＡＡＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧ−３’（Ｌ
ＳＭ２）のニュクレオチド配列を有することを特徴とす
る請求項３９に記載のＤＮＡプライマー。 - 【請求項４２】 固相免疫吸着体検定において、トラン
ケート状ＰｓｐＡタンパクを固体基質にコーティングす
ることから成り、前記のＰｓｐＡタンパクが前記の固体
基質をコーティングしているモノシアロガングリオシド
（ＧM1）に結合したコレラ毒素のＢ−サブユニット（Ｃ
ＴＢ）と融合していることを特徴とする改良検定法。
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| CA2116261A1 (en) * | 1993-04-20 | 1994-10-21 | David E. Briles | Epitopic regions of pneumococcal surface protein a |
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| CA2304128A1 (en) * | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Robert Becker | Improved method of production of pneumococcal surface proteins |
| US6224882B1 (en) | 1997-11-07 | 2001-05-01 | Protein Science Corp. | Insect cells or fractions as adjuvant for antigens |
| US20010016200A1 (en) * | 1998-04-23 | 2001-08-23 | Briles David E. | Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor |
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