EA025280B1 - Полиэпитопные конструкции и способы их получения и применения - Google Patents
Полиэпитопные конструкции и способы их получения и применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA025280B1 EA025280B1 EA201290813A EA201290813A EA025280B1 EA 025280 B1 EA025280 B1 EA 025280B1 EA 201290813 A EA201290813 A EA 201290813A EA 201290813 A EA201290813 A EA 201290813A EA 025280 B1 EA025280 B1 EA 025280B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- epitopes
- polyepitope
- constructs
- cells
- present
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 32
- 108010055325 EphB3 Receptor Proteins 0.000 claims description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 27
- 102100031982 Ephrin type-B receptor 3 Human genes 0.000 claims description 24
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 15
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 11
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 abstract description 81
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 38
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 17
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 abstract description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 68
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 64
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 64
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 47
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 44
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 37
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 37
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 29
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000013461 design Methods 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 11
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 10
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 10
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 10
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 7
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 7
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 7
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- -1 spacer amino acid Chemical class 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 5
- 101710116782 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 5
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 5
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 102000053262 human LAMP1 Human genes 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 108010028930 invariant chain Proteins 0.000 description 3
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 2
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 101100395310 Homo sapiens HLA-A gene Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N acetic acid;(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound CC(O)=O.C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 2
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTKYBFQVZPCGAO-LURJTMIESA-N (2s)-2-(pyridin-3-ylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1=CC=CN=C1 WTKYBFQVZPCGAO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- AHOKKYCUWBLDST-QYULHYBRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)[C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AHOKKYCUWBLDST-QYULHYBRSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100256278 Arabidopsis thaliana SCR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 1
- 101100027969 Caenorhabditis elegans old-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100537311 Caenorhabditis elegans tkr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 1
- 101100291915 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) MP65 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000006586 Ectromelia Diseases 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108010072051 Glatiramer Acetate Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010086377 HLA-A3 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006390 HLA-B Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102400000454 Insulin B chain Human genes 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010024503 Limb reduction defect Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000277269 Oncorhynchus masou Species 0.000 description 1
- 101100420928 Oryza sativa subsp. japonica SE14 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150027175 SGR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029807 SUMO-conjugating enzyme UBC9 Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 101100309053 Ustilago maydis (strain 521 / FGSC 9021) rua1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical compound OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 description 1
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 229960003776 glatiramer acetate Drugs 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000008902 immunological benefit Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000448 lactic acid Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 101800002723 p18 Proteins 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 102220000699 rs11909217 Human genes 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003412 trans-golgi network Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к новым иммуногенным полиэпитопным конструкциям, содержащим CTL- и/или Th-эпитопы и оптимизированные спейсерные последовательности, улучшающие процессинг и презентацию указанных эпитопов, что обеспечивает индукцию интенсивного CD4+- и CD8+-специфичного Т-клеточного ответа и специфичных типов цитокинов, а также высокие уровни защиты и терапевтической активности.
Description
(57) Изобретение относится к новым иммуногенным полиэпитопным конструкциям, содержащим СТЬи/или ТЬ-эпитопы и оптимизированные спейсерные последовательности, улучшающие процессинг и презентацию указанных эпитопов, что обеспечивает индукцию интенсивного СЭ4+- и СЭ8+специфичного Т-клеточного ответа и специфичных типов цитокинов, а также высокие уровни защиты и терапевтической активности.
025280 Β1
Изобретение относится к новым иммуногенным полиэпитопным конструкциям, содержащим СТЬи/или ТЬ-эпитопы и оптимизированные спейсерные последовательности, улучшающие процессинг и презентацию указанных эпитопов, что приводит к индукции интенсивного СИ4+- и СИ8+-специфичного Тклеточного ответа и специфичных типов цитокинов, а также высоким уровням защиты и терапевтической активности.
Уровень техники
Рак груди является наиболее распространенным типом рака у женщин. У приблизительно 13% женщин в США в течение жизни развивается рак груди. Около 30% этих случаев представляют собой распространенные формы рака, характеризующиеся повышенной экспрессией белка НЕК2 опухолевыми клетками (8ецие1га 8.1. е1 а1., ВМС Се11. ΒίοΙ. 2009, 10:64: На\\11югпе У.8. е1 а1., Мо1. Сапсег Кек. 2009, 7(4):592-600). НЕК2 - представитель семейства рецепторов эпидермального фактора роста (ЕОР), контролирующий пролиферацию и выживание клеток и присутствующий в нормальных клетках, но в значительно меньших количествах, чем в раковых клетках. Изменения в регуляции активности белка НЕК2 приводят к подавлению апоптоза и активной пролиферации клеток и могут вызывать рак (Аттоу I., Уагбеп Υ. 2000 Втеак! Όίκ. 11:31-48; Натай Ό., Уагбеп Υ. 2000 Опсодепе 19(53):6102-14; Нпб/1ак К.М. е1 а1., 1987 ΡΝΑ8, 84(20):7159-63). Сверхэкспрессия НЕК2 была обнаружена также при некоторых других видах рака, например в 80% случаев метастатического рака простаты (МоккоЬа М.Е. е1 а1., 2008, Мо1. ТЬег. 16(3):607-617).
Многие исследовательские группы в настоящее время пытаются разрабатывать противораковые вакцины на основе специфичных раковых антигенов, в том числе и НЕК2. Разработка противораковых вакцин является очень перспективным направлением, так как СТЬ-ответ на специфичные раковые антигены способен эффективно уничтожать раковые клетки, а механизмы иммунологической памяти предотвращают рецидивы рака. В разрабатываемых в настоящее время кандидатных противораковых вакцинах на основе НЕК2 используются как внеклеточные, так и внутриклеточные фрагменты указанного белка. В некоторых из указанных кандидатных вакцин используется только пептид Е75 (аминокислоты 369-377 НЕК2) (Оа1ек Ι.Ό. е1 а1., 2009 1. Ат. Со11. 8игд. 208(2): 193-201; МШепбогГ Е.А. е1 а1., 2008 Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1Ьег. 57(10): 1511-21; МШепбот! Е.А. е1 а1., 2006 Апп. 8игд. Опсо1. 13(8):1085-98), в других используется несколько различных пептидов, полученных из НЕК2 (Майнеба 8. е1 а1., 2009 АпИсапсет Кек. 29(7):2427-35; Ы Υ. е1 а1., 2009 АпИсапсет Кек. 29(1):41-58; Уейиаш 8. е1 а1., 2009 Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1Ье.г 58(5):653-64; 8сатбшо А. е1 а1., 2007 Сапсег Кек. 67(14):7028-36.), а некоторые содержат также эпитопы других антигенов (КауападЬ В. е1 а1., 2007 1. 1ттипо1Ьет. 30(7):762-72). Обнаружено несколько кандидатных вакцин, индуцирующих гуморальный иммунный ответ и достаточно безопасных для приматов (Кепагб V. апб ЬеасЬ И.К. 2007, Уассше, 25(2):В17-23). Несколько СТЬ-индуцирующих НЕК2-специфичных конструкций продемонстрировали низкую токсичность и отсутствие аутоиммунных реакций в клинических исследованиях, а также, в ряде случаев, развитие как клеточного, так и гуморального иммунного ответа (Όίκίκ М.Ь. е1 а1., 1998, Ргос. Ат. 8ос. С1ш. Опсо1., 17:97а.; 2акк ΚΖ. е1 а1., 1998, Сапсег Кек., 369-377; Кпи1коп К.Ь. е1 а1., 2001, 1. С1ш. 1пуекбд., 107: 477-484; Миггау 1.Ь. е1 а1., 2000, 8ет. Опсо1., 27:71-75; 8а1а/аг Ь.О. е1 а1., 2003, СЬп. Сапсег. Кек., 9:5559-5565; И1к1к М.Ь. е1 а1., 2004, 1. СЬп. Опсо1., 22:1916-1925; Ытеп1ат 8. е1 а1., 2005, А8СО Ргос., АЬк1г. 2520).
Показано, что пептид Е75 НЕК2 (аминокислоты НЕК2 369-377) был безопасен и эффективен в дозозависимом повышении НЕК2/пеи иммунитета у пациентов с раком груди НЬА-А2 и НЬА-А3 (Реор1ек О.Е. е1 а1., 2005, 1. СПп. Опсо1., 23(30):7536-45), а также что он предотвращает или задерживает рецидивы рака (Оа1ек Ι.Ό. е1 а1., 2009, 1. Ат. Со11. 8игд., 208(2): 193-201; Реор1ек О.Е. е1 а1., 2008, СПп. Сапсег. Кек., 14(3):797-803; Реор1ек О.Е. е1 а1., 2005, 1. СПп. Опсо1., 23(30):7536-45) и уменьшает количество циркулирующих опухолевых клеток (8ю)абто\ас А. е1 а1., 2007, Апп. 8игд. Опсо1., 14(12):3359-68). Оценка ш уЦто иммунного ответа лимфоцитов периферической крови, полученной от шести случайным образом отобранных пациентов с раком, иммунизированных Е75, показывает статистически значимое увеличение Е75-стимулированной пролиферации лимфоцитов. Е75-стимулированные лимфоциты демонстрировали Е75-специфичный цитолитический ответ и, более того, указанные Е75-специфичные лимфоциты также демонстрировали опухолеспецифичный лизис НЕК2/пеи-экспрессирующих линий раковых клеток (^Уо11 М.М. е1 а1., 2004, 1п1. 1. Опсо1., 25:1769-1780). Было показано, что вакцинация Е75 приводит к рекрутингу СИ4+ и связана со значительным уменьшением числа циркулирующих регуляторных Т-клеток (Тгед) и уровней ТОР-р (представляющих собой первичные посредники иммуносупрессии, приводящей к выживанию опухоли; см., например, Иеба К. е1 а1., 2009, СПп. Сапсег Кек., 15(21):6551-6559; Такаки 8. е1 а1., 2010, 1п1. 1. Сапсег, 126(7): 1666-1674) у большинства вакцинированных пациентов (Ниетап М.Т. е1 а1., 2006, Втеакк Сапсег Кек. ТгеаЬ 98(1): 17-29).
Несмотря на определенные успехи, описанные выше, до сих пор не существует одобренной вакцины против рака груди и большинства других типов рака. Таким образом, по-прежнему существует значительная потребность в специфичных раковых иммуногенах и вакцинах, обеспечивающих эффективную индукцию СИ4+- и СИ8+- Т-клеточного ответа и, таким образом, способных подавлять иммуносупрессию и обеспечивать защитный иммунитет и терапевтическую активность.
- 1 025280
Краткое описание изобретения
Как было отмечено выше, в данной области техники существует значительная потребность в разработке новых иммуногенных композиций для эффективной индукции иммунного ответа на различные клинически значимые антигены. Изобретение предназначено для удовлетворения этой и других потребностей путем предоставления новых полиэпитопных конструкций.
Таким образом, согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предложены иммуногенные полиэпитопные конструкции для стимуляции ответа Т-лимфоцитов, состоящие из последовательности, выбранной из группы, состоящей из
ΜΕΕΑΑΙΤΚ'νΟΕΙΙΑΕΕΡΡΟΑΡΜΕΝνΗΡνΑΙΚνΕΚΕΝΤΑΟΟΚΕΚΚνΕΟΟΙ,ΡΟΟΚΥδΕΟΡτνρΕΡΟΟΕΑΥνΜΑΟνΑΙΜ,Κ
0БТЕЬ¥ЕРЬТРИХЗКА5РЬТ8118АУУО111,1УУИЗУУЕРОАОМЕНЫ<ЕУКА1ХЗКИГНКММ(}ЬРОЬ0ге0Ь<}УЕЕПА0Е
У0СУУиРСЬАИ)ОВЬОМОАРО1ЛЗУ1КОК1ЕРОУКУЬО8ОАРОТУУР1ООЬТЬаЬЕРРОЬКА5С\ЧАСР¥АТЦг<!ЬО131У
Τ0ΤΚ8υ®ΤΟ8ΟΕΑΤΡΜ0ΙΑΚ6Μ8ΥΑΕΡ0ΡΕΑΙ)0ενΡΟΕΚΕ3ΥΜΡΠνΚΡΑΒΤΚΡΕ0ΚΕΚΐνΕΟΤ0υΕΟΝΥΑΕΑνΑΚΟΑΡ
Ρ5ΤΡΚΑ(4ννΚΓ)\ΤΑΡΚΓ?ΕνΚ1ΤΌΓ<ϋ.ΑΡ1.Ι.Ρ[.νΗΚηΐ.ΛΛΚΛ0νΛ'8ΥΓ;νΤνΡΓ)ΤΤΡ'.'ΤΓ,Λ5ΡΚΒΕΥΙ5Αν.ΤΓ).Ι:ΐ.ΚΤνεΛ0(3
ΟΑΕΒΟΚΙΡΟΒΕΑΡΕΡΟΕΗΟΡΑΕνΤΥΑΜβΤΡΥΚΒΕΕΑίκϋίΟΕΜΡΥΟΟΙΙΑΙΧΚϊδση,νεΡΕΑΚΡνΑΑΐνη,ΚΑΑΑΚΚΑννΟ
ΙΙ.Εν/νΕϋν/Κ.;ΐ1.ΙΚΚΚ0(5Κ1ΚΚΚΡΙίΤΙΙ7νΥΜΙ\ΐνΚ(':Λ'ΜΙΓΜΕΚΚΑ(3ΜΚΙΙ.ΚΚΙ'ΕΙ.({ΚνΚνΐ.Ο8ΟΛΚΚΙΚνίΜΑΙ.Ρ2ϊ11.
κρκΕΐΉ0ΚΓ>νκκριο™\ΎΜΜνκανΜΐϋ5ΚΚΚ5ΗΛΰΥζ>τι <5Ε<3 ГО ΝΟ: 456 - универсальная), №ΕΑΑΙΧ.:κνΛ4.1.ΕΑΠ.ΡΡΟΛΡΡΟΕΕΑ1.Ι.ΡΡ<ΜΡΤ>Απ.ΕΕΐταΥΙ_ΛΙΕϋΕΑΥνΜΑΡΙ1.ΗΝΟΛΥ.<;ΐ_Ρ0ΕΠΤ>ΝΥΑΙ.ίΠΙ,Αν νθΙΑΟΕΜΡΥ«:ΐ.Ι.ΚΙ.Ι.νν\1.θννΚΙ)ΙΥ)[.Κ.41.ΤΕΙΑΠ.Ι.νννΐ.(ΐνΡΓ>Αν/υ[ΕΙ.ννΑΓ)Α[.Γ:Κ\νσΐ.1.Ι.ΑΕΥΙ.8Αν,'ΡΓ)4[.ΚΓ)Κ ПЧЗВЕАРЕАКРУААУПЪКАААККАУУО^УУУЕОУУГОШКККОЦНЕККИСТЮУУМШУКС^МГОЗЕККАОМИЕ ΚΕΤΕΕΚΚνκνΕΟ5ΟΑΚΚ1Κν,'ΜΑίΕ51ΕΚΚΙΤΗ050νΚΚΡΙ(;ΤΙΒνΥΜΙΜνκε’Λ'Μ103Ρ.ΚΚ5ΗΑΟΥ<)Ί·1 (5Εζ> Ю ΝΟ: 457 - НЬА-А*0201-специфичная) и
ΜΕίΑΑΕΟΕνΟΕΙΙ,ΑΕΕΡΡΟΑΡΑϋΟΚΤΡΤΑΕΝΡΕΥΑΑΕΡΑδΡΕΤΗΕΡΙΕΚΥβΕΟΡΓνΡΕΡΟΟΑΕΡΤΗΟΡΒΡΕΑΟΝΚΕΙΕΟΕ ΑΥΑΒΕΠΠΕΑΥνΜΡΕνννΕΟννΡΑΒΜΟΙΑΚΟΜΒΥΑΕΜΤΡΟΑΚΡΥΡΕαΚΑΡΡΡΑΡΪΡΑΡΑΟΕΗΟΡΑΕνΤΥΆΜΡνΑΑίΑΤΕΚΑ ДАККА УУСПХУУУЬОУХРОПТКЕКООЫКККИСТЮУУМЕЧУКСтаПОКЕККАОМЫЕКЕТЕЕЕКУКУЕСХОАКМК ΛΤΗΑΕΕϊίΕΡΡΕΡΤΗΟϊονκκρίΕΤίονΥΜΕνίνκον,’ΜΟϊΚΚΕδΗΑΟΥΟΤί (8Εζ> Ю ΝΟ: 458 - ΗΕΑ-Β*3501спсцифичная).
Наряду с полиэпитопными конструкциями согласно настоящему изобретению предложены также фармацевтические композиции, содержащие такие полиэпитопные конструкции и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полиэпитопные конструкции, фармацевтические композиции, содержащие указанные нуклеиновые кислоты и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество, и клетки-хозяева, содержащие указанные нуклеиновые кислоты.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ индуцирования Т-клеточных ответов у млекопитающих, включающий введение указанным млекопитающим полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению или нуклеиновых кислот, кодирующих такие полиэпитопные конструкции.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения НЕК2положительного рака груди у млекопитающих, включающий введение указанным млекопитающим полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению или нуклеиновых кислот, кодирующих такие полиэпитопные конструкции.
Ниже приводится описание изобретения с подробным раскрытием и конкретными примерами. Указанное описание, материалы, способы и примеры приведены только в иллюстрации и не предназначены для ограничения. Все цитируемые литературные источники, патенты и патентные заявки полностью включены в настоящую заявку.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А-В показаны результаты тестов на цитотоксичность. Т-клеточный иммунитет стимулировали ех νίνο аутологичными дендритными клетками (НС), трансфицированными либо рНЕК2 (положительный контроль), или плазмидами, кодирующими полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению (рВСИ - универсальная - содержит эпитопы НЕК2, предположительно связывающие наиболее широкий диапазон ГКГС, или рКСА0201 - содержит эпитопы НЕК.2, ограниченные НЬА-А*0201), или плазмидой ргНА5, кодирующей неродственный белок гНА5, соответствующий фрагменту (АК 17346) гемагглютинина (НА) вируса гриппа А Н5Ы1. Нестимулированные неадгерентные мононуклеарные клетки (Ноие) использовали в качестве отрицательного контроля. В качестве клеток-мишеней использовали либо аутологичные ДК, трансфицированные рНЕК2 (А), либо клетки МСР-7 рака груди (НЕК2+/НЬАА *0201 +) (В). Цитотоксичность оценивали при разном отношении эффекторных клеток и клеток-мишеней (10:1, 20:1, 30:1). Статистическую значимость наблюдаемых различий между группами оценивали с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона. Р<0,05 рассматривали как значимый;
на фиг. 2А-В показаны уровни синтеза γΙΡΝ Т-клетками, определенные при помощи внутриклеточного окрашивания цитокинов и последующей проточной цитометрии. Результаты представлены в виде
- 2 025280 процента (%) двойных положительных Т-клеток относительно общего количества СЭ8+ (А) либо СЭ4+ (В) Т-клеток (1х105 клеток). Ыопе - нестимулированные неадгерентные мононуклеарные клетки (МЫС) (отрицательный контроль); ЭС:ргНА5 - МЫС, стимулированные с помощью ДК, трансфицированных ргНА5 (отрицательный контроль); ОС:рНЕК2 - МЫС, стимулированные с помощью ДК, трансфицированных рНЕК2; ЭС:рВСи - МЫС, стимулированные с помощью ДК, трансфицированных рВСИ; ЭС:рВСА0201 - МЫС, стимулированные с помощью ДК, трансфицированных рВСА0201. В качестве клеток-мишеней в этих экспериментах использовали раковые клетки МСР-7. Статистическую значимость наблюдаемых различий между группами оценивали с применением критерия суммы рангов Уилкоксона. Р<0,05 рассматривались как значимые.
Подробное описание изобретения
Изобретение основано на разработке новых способов размещения иммуногенных эпитопов в полиэпитопных конструкциях, направленных на оптимизацию протеасомного и/или иммунопротеасомного процессинга указанного полиэпитопа и оптимизацию связывания с ТАР высвобождаемых эпитопов. Новые способы согласно настоящему изобретению основаны на новом алгоритме размещения эпитопов, который позволяет отбирать подходящие сочетания эпитопов и спейсерные последовательности с учетом предполагаемой эффективности протеасомного процессинга, длины спейсера и числа предполагаемых нецелевых СТЬ-эпитопов, образующихся в результате искусственного соединения эпитопов спейсером. Указанные новые способы согласно настоящему изобретению обеспечивают образование новых НЕК2-специфичных полиэпитопных конструкций (также описываемых в настоящей заявке), характеризующихся существенной повышенной презентацией антигенов относительно природного антигена НЕК2.
Согласно настоящему изобретению предложены иммуногенные полиэпитопные конструкции, содержащие два или более различных Т-клеточных эпитопов, причем эпитопы представляют собой СТЬэпитопы или Т-хелперные (Тй) эпитопы, полученные из одного или более ассоциированных с болезнью антигенов или патогенов, при этом указанные эпитопы возможно соединены спейсерными последовательностями, улучшающими иммуногенность указанной полиэпитопной конструкции, что обеспечивает эффективный протеасомный и/или иммунопротеасомный процессинг указанных эпитопов и усиливает их взаимодействие с транспортёрами, связанными с процессингом антигенов (ТАР). По сравнению с применением целых белковых антигенов применение содержащих спейсеры полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению приводит к повышению эффективности презентации эпитопа антигенпрезентирующими клетками (АПК).
Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению могут содержать СТЬ-эпитопы или Тй-эпитопы. либо и те и другие, СТЬ- и Тй-эпитопы в составе конструкции могут быть перемешаны, либо могут располагаться в отдельных СТЬ- и Тй- кластерах эпитопов. Согласно отдельному варианту осуществления в настоящем изобретении предложена комбинация двух или более полиэпитопных конструкций, причем по меньшей мере одна из указанных конструкций содержит только СТЬ-эпитопы или только Тй-эпитопы. Указанные эпитопы в первую очередь подходят для стимуляции СЭ4+ Т-клеточных ответов, и СТЬ эпитопы в первую очередь подходят для стимуляции СЭ8+ Т-клеточных ответов. Настоящее изобретение также включает комбинации двух или более различных полиэпитопных конструкций. Для индуцирования эффективного Т-клеточного иммунного ответа важно индуцировать как СТЬ (СО88+), так и Тй (СЭ4+). Таким образом, предпочтительные полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению включают как СТЬ-, так и Тй-эпитопы.
Последовательности различных эпитопов в составе полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению могут быть получены из любой области полипептидного антигена и могут до определенной степени перекрываться (т.е. содержать от по меньшей мере одного общего аминокислотного остатка до всех общих аминокислотных остатков за исключением одного) или могут не перекрываться. Применяемые в составе указанной конструкции эпитопы могут быть расположены в любом порядке относительно антигена, из которого они получены. Эпитопы, входящие в состав полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению, могут быть любой заданной длины, но предпочтительно имеют длину по меньшей мере 8 аминокислот. СТЬ-эпитопы предпочтительно имеют длину 8-12 аминокислот. Тй-эпитопы предпочтительно имеют длину 9-25 аминокислот. Аллели ГКГС класса I, с которыми связываются эпитопы в составе полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению, могут представлять собой любые алломорфы класса I или II человека, например НЬА-А*01О1, НЬА-А*0201, НЬАА*0301 и т.д. Определенные эпитопы могут быть промискуитентными, т.е. связывать более чем один аллотип ГКГС. Предпочтительно, эпитопы, применяемые в полиэпитопных конструкциях согласно настоящему изобретению, промискуитентно связывают ГКГС. Репрезентативный перечень связывающих класс I эпитопов белка НЕК2, любые из которых могут быть включены в полиэпитопные конструкциии согласно настоящему изобретению, приведен в примере 2.1.1 ниже. Репрезентативный перечень связывающих класс II эпитопов белка НЕК.2, любые из которых могут быть включены в полиэпитопные конструкциии согласно настоящему изобретению, приведен в примере 2.3.1.1, ниже. Примеры эпитопов, отобранных для 30 аллелей ГКГС класса I человека, приведены в примере 2.2.1 ниже. Такие эпитопы могут применяться либо для конструирования универсальных полиэпитопных конструкций, предназначенных для индуцирования клеточного иммунного ответа у большинства людей, или для создания
- 3 025280 аллель-специфичных полиэпитопных конструкций, специфичных для определенных аллелей НЬА.
Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению могут быть специфичными для определенного ассоциированного с болезнью антигена или патогена (в том числе двух или более штаммов одного и того же патогена), или могут содержать эпитопы, полученные их двух или более различных антигенов или патогенов. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению содержат эпитопы белка НЕР2.
Применение индивидуальных эпитопов в конструкциях согласно настоящему изобретению позволяет добиться эффективной зависимой от ГКГС класса I и ГКГС класса II презентации антигена даже в тех случаях, когда доступна только часть последовательности ассоциированного с болезнью антигена или патогена (например, в случае вновь выявленных патогенов или опухолевых антигенов). Применение индивидуальных эпитопов в отличие от целых антигенов также позволяет избежать проблем, связанных с вмешательством в антигенную презентацию определенными белковыми антигенами (например, вирусными или бактериальными белками, понижающе регулирующими иммунные ответы хозяина, понижающе регулирующими экспрессию молекул ГКГС на поверхности клеток, вмешивающимся в цитокиновую сигнализацию и т.д.), или нежелательных эффектов (например, токсичности), связанных со сверхэкспрессией конкретных вирусных белков или опухолевых антигенов.
Важным дополнительным преимуществом настоящего изобретения является то, что разнообразие эпитопов в составе полиэпитопных конструкций увеличивает вероятность того, что по меньшей мере один эпитоп будет презентирован каждым из множества аллотипов НЬА. Это позволяет провести иммунизацию выборки индивидуумов, полиморфных по НЬА-локусу, с использованием одной полиэпитопной конструкции или нуклеиновой кислоты, кодирующей такую полиэпитопную конструкцию. В альтернативном варианте указанная полиэпитопная конструкция может быть специфичной в отношении конкретного аллотипа НЬА (например, она может содержать эпитопы, специфичные для определенного НЬА).
В одном из конкретных вариантов осуществления полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению также содержат ТЬ-эпитопы, полученные не из ассоциированного с болезнью антигена или патогена, но усиливающие СИ4+ Т-клеточные ответы на указанный антиген или патоген (например, эпитоп Рап ИР Т Не1рег [эпитоп РАИРЕ] АКЕУААГСТЬКААА |5ЕС ГО N0: 1]).
Применение спейсерных последовательностей в полиэпитопных конструкциях согласно настоящему изобретению не является обязательным, и два или более указанных эпитопов могут быть расположены последовательно друг за другом (т.е. соединены конец к концу) без спейсера между ними.
Спейсерные последовательности, применяемые в полиэпитопных конструкциях согласно настоящему изобретению, представляют собой вырожденные спейсерные мотивы, оптимизированные для каждой пары эпитопов для обеспечения наиболее эффективного процессинга с применением новых алгоритмов размещения эпитопов и оптимизации последовательностей. Спейсерные последовательности, подходящие для полиэпитопных конструкций, согласно настоящему изобретению могут состоять из единственного аминокислотного остатка или последовательности двух или более аминокислот, встроенных между соседними эпитопами (или между эпитопом и другими последовательностями) указанной конструкции. Предпочтительно, такие спейсерные последовательности содержат до 6 аминокислот. Тем не менее также приемлемы спейсерные последовательности, содержащие до 7, 8, 10, 15, 20, 30 или 50 аминокислот, а также даже более длинные последовательности. Спейсерные последовательности подходят для стимуляции протеолитического процессинга полиэпитопных конструкций для высвобождения индивидуальных эпитопов для антигенной презентации. Указанные последовательности спейсеров, как правило, удаляются из последовательностей эпитопов в результате протеолитического процессинга в антиген-презентирующей клетке (АПК). Таким образом, указанные эпитопы остаются интактными для связывания с молекулами ГКГС. Иногда спейсерная аминокислота или часть спейсерной последовательности может оставаться присоединенной к эпитопу в результате неполного процессинга. Это, как правило, не оказывает никакого влияния или оказывает незначительное влияние на связывание с молекулой ГКГС. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления спейсер, применяемый для соединения двух или более ТЬ-эпитопов в составе указанной полиэпитопной конструкции, имеет основную последовательность К/Р-К/Р, что соответствует сайтам расщепления, узнаваемым катепсинами В и Ь.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления спейсер, соединяющий два СТЬэпитопа, может быть получен из следующих аминокислот в соответствующих положениях:
[ΑΟΝΡΚ3)ΕΑΟΟΙΕΤν][ΑΕΟΚΕΝν][ΑΡΙΚΕΝ8ν][ΑΕΟΙΕΡ5ν][ΑΕΟΚΕ5ν] (ЗЕр ГО ΝΟ: 463).
Этот вырожденный мотив может применяться в качестве основы для отбора спейсерных последовательностей для оптимизации процессинга. В то время как предпочтительные длины спейсерных последовательностей составляют около 3-4 аминокислот, настоящее изобретение включает и более короткие, и более длинные последовательности. Например, два эпитопа могут быть соединены без спейсера (пустым спейсером), если они могут быть соединены конец к концу согласно оценочной функции.
В одном из конкретных вариантов осуществления полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению также содержат конъюгированный с Ν-концом модифицированный убиквитин (например, убиквитин с заменой С76У [ИЬУ76]), который дополнительно усиливает протеасомный процессинг эпитопов, содержащихся в указанной конструкции, а также усиливает СТЬ-ответы. ИЬУ76 может быть
- 4 025280 присоединен непосредственно к аминоконцу указанной полиэпитопной конструкции, либо между ИЪУ76 и полиэпитопной конструкцией могут быть встроены остатки Агд или Уа1 для стабилизации получаемых гибридных конструкций (Аибегккои Н.А., Ваггу М.А., 2004, Мо1. Тйег., 10(3):432-446).
В одном из конкретных вариантов осуществления полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению дополнительно содержат один или более нацеливающий сигнал, направляющий внутриклеточный транспорт указанной конструкции в определенный компартмент клетки. Неограничивающие примеры подходящих нацеливающих сигналов включают, например, (ί) гомологичные или гетерологичные сигнальные пептиды, направляющие конструкции в сигнальные пути через эндоплазматический ретикулум (ЕК) и сеть транс-Гольджи (например, сигнальный пептид белка НЕК.2) и (И) направляющие в ядрышко сигналы (например, фрагмент или вся последовательность инвариантной цепи, связанные с молекулами ГКГС класса II; С-концевой фрагмент белка ЬАМР-1 человека, тирозиновый мотив Υ-Χ-Χгидрофобная аминокислота, где X - любая аминокислота).
Предпочтительный направляющий сигнал, подходящий для полиэпитопных конструкций, согласно настоящему изобретению включает и С-концевой фрагмент ЬАМР-1 и сигнальный пептид белка НЕК2. Такой нацеливающий сигнал подходит для повышающей регуляции зависимой от ГКГС класса II презентации антигена и СТЬ-ответа (так как сигнальный пептид белка РГЕК2 содержит СТЬ-эпитопы). Нацеливающие сигналы, применяемые в конструкциях согласно настоящему изобретению, могут быть необязательно модифицированы для введения замены аминокислоты или спейсерных последовательностей в участок(ки) соединения между указанным направляющим сигналом и примыкающим(и) сегментом(ами) для стимуляции отщепления указанной(ых) направляющей(их) последовательности(ей) от эпитопов, например, при помощи сигнальной пептидазы. Указанные направляющие последовательности, подходящие для полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению, могут содержать замены любой аминокислоты кроме имеющих значение для нацеливания.
Наряду с полиэпитопными полипептидными конструкциями согласно настоящему изобретению предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полиэпитопные полипептидные конструкции, векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты (в частности, плазмидные, бактериальные и вирусные векторы), и клетки-хозяева, которые содержат такие нуклеиновые кислоты или векторы (например, дендритные клетки (ОС), клетки Лангерганса или другие антиген-презентирующие клетки). Когда полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению вводят в виде нуклеиновых кислот и/или с применением различных систем доставки (например, микрочастиц, вирусоподобных частиц и т.д.), такие нуклеиновые кислоты и/или системы доставки могут дополнительно усиливать антиген-специфичные иммунные ответы (например, стимулируя высвобождение ГЬ-12 и γ-интерферона (γΣΡΝ) из макрофагов, ΝΚ-клеток и Т-клеток).
Также согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие (ί) полиэпитопные полипептидные конструкции согласно настоящему изобретению или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полиэпитопные полипептидные конструкции, или векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты и (ίί) фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. Такие композиции могут дополнительно содержать систему доставки (носитель) (например, микрочастицы).
Полипептидные конструкции, конструкции из нуклеиновых кислот и композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены различными путями. Например, они могут быть введены в слизистую оболочку (например, влагалищна, носа, нижних дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта [в частности, прямой кишки]). В альтернативном варианте они могут быть введены системно, например внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, перорально или подкожно.
1.1. Определения.
В настоящей заявке термин опухолевый антиген относится к белку, который экспрессируется исключительно в опухолевых клетках или экспрессия которого сильно повышена в опухолевых клетках по сравнению с неопухолевыми гомологами опухолевых клеток. Такие опухолевые антигены часто служат маркерами, позволяющими отличить опухолевые клетки от аналогичных нормальных клеток.
В настоящей заявке термин эпитоп относится к Т-клеточному эпитопу, например олигопептиду, способному связываться либо с молекулами ГКГС класса I, либо с молекулами ГКГС класса II и стимулировать Т-клеточные иммунные ответы соответствующих Т-лимфоцитов. В настоящей заявке термины универсальный эпитоп и универсальная полиэпитопная конструкция относятся к эпитопам и полиэпитопным конструкциям, которые вызывают клеточные иммунные ответы у большей части иммунизированной популяции (например, людей). Термины аллель-специфичный эпитоп и аллель-специфичная полиэпитопная конструкция относятся к эпитопам и полиэпитопным конструкциям, вызывающим клеточные иммунные ответы у иммунизированных пациентов (например, людей) с определенным(и) гаплотипом(ами) ГКГС (например, определенными аллелями НЬА).
В настоящей заявке термин полиэпитоп или полиэпитопная конструкция относится к иммуногенной конструкции, включающей два или более различных эпитопа. Такие различные эпитопы могут содержать совершенно несходные или сходные последовательности, и их последовательности могут до определенной степени перекрываться (например, иметь по меньшей мере один общий аминокислотный
- 5 025280 остаток или иметь полностью общие остатки, кроме одного), или они могут не перекрываться. Конкретный эпитоп в составе полиэпитопа не обязательно имеет какую-либо определенную длину, но предпочтительно его длина составляет от 8 до 12 аминокислот для эпитопов, привязанных к ГКГС класса I, и предпочтительно от 8 до 25 аминокислот для эпитопов, привязанных к ГКГС класса II. В составе полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению два или более соседних эпитопа могут быть соединены конец к концу, без спейсера между ними. В альтернативном варианте любые два соседних эпитопа могут быть связаны посредством спейсерной последовательности согласно приведенному ниже описанию. Эпитопы в составе полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению могут быть расположены в любом порядке (в частности, этот порядок не обязательно соотвутствует порядку расположения указанных эпитопов в белке, из которого они получены). Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению могут содержать любое число эпитопов, но предпочтительно они содержат по меньшей мере 5 эпитопов (в случае аллель-специфичных конструкции) или по меньшей мере 20 эпитопов (в случае универсальных конструкции).
Термин поли-СТЬ относится к полиэпитопной конструкции, включающей либо известные, либо предполагаемые эпитопы для СЭ8+-Т-лимфоцитов.
Термины поли-Т-хелпер или поли-ТЬ относятся к полиэпитопной конструкции, включающей либо известные, либо предполагаемые эпитопы для СЭ +-Т-лимфоцитов.
Термин избыточный эпитоп относится к эпитопам, не обнаруживаемым в представляющем(их) интерес природном(ых) антигене(ах), образующимся в результате искусственного соединения выбранных эпитопов и/или спейсерных последовательностей в состав полиэпитопной конструкции.
Термин нацеливающий сигнал относится к последовательности, направляющей внутриклеточный транспорт указанной полиэпитопной конструкции в определенный компартмент антигенпрезентирующей клетки (АПК).
Термины спейсерная последовательность, спейсер и фланкирующая последовательность используются взаимозаменяемо и относятся к одиночному аминокислотному остатку или последовательности двух или более аминокислот, встроенных между двумя соседних эпитопами или эпитопом и другой последовательностью в составе полиэпитопной конструкции, увеличивающему(щим) иммуногенность указанной полиэпитопной конструкции, обеспечивая эффективный протеасомный и/или иммунопротеасомный процессинг указанных эпитопов и усиливая их взаимодействие с транспортёрами, связанными с процессингом антигенов (ТАР).
Термин терапевтически эффективный в отношении дозировки или количества относится к количеству полиэпитопной конструкции, фармацевтической композиции или вакцины, достаточное для требуемой активности при введении нуждающемуся в этом млекопитающему. В настоящей заявке в отношении содержащей композиции или вакцины полиэпитопной конструкции термин терапевтически эффективное количество/доза используется взаимозаменяемо с термином иммуногенно эффективное количество/доза и относится к количеству/дозе полиэпитопной конструкции, фармацевтической композиции или вакцине, достаточному для обеспечения эффективного иммунного ответа при введении млекопитающему. Согласно настоящему изобретению предпочтительное иммуногенно эффективное количество указанной полиэпитопной конструкции находится в диапазоне 1-950 мкг на кг массы тела.
Термин фармацевтически приемлемый в отношении композиций согласно настоящему изобретению относится к молекулярным субстанциям и другим ингредиентам таких композиций, физиологически приемлемым и обычно не вызывающим нежелательных реакций при введении человеку. Предпочтительно, в настоящей заявке термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регулирующим агентством федерального или государственного управления или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для использования у млекопитающих, и, в частности у человека.
Термин носитель в отношении фармацевтических или вакцинных композиций согласно настоящему изобретению относится к разбавителю, вспомогательному веществу или базовому веществу, вместе с которым вводится соединение (например, антиген или/или молекула ГКГС). Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая производные нефти, жидкости животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода или водный раствор, солевые растворы, и водные растворы декстрозы и глицерина предпочтительно использовать в качестве носителей, в особенности в растворах для инъекций. Подходящие фармацевтические носители описаны в КетшдЮп'к РЬагтасеибса1 Зсюпсс/'. Ε.ν. Магйп, 18 изд.
Термин примерно или приблизительно обычно означает в пределах 20%, более предпочтительно в пределах 10% и наиболее предпочтительно в пределах 5% от заданного значения или диапазона. В альтернативном варианте, в частности в биологических системах (например, при измерении иммунного ответа), термин примерно означает приблизительно в пределах порядка (т.е. одного порядка величины), предпочтительно в пределах заданного значения, умноженного/деленного на два.
В настоящем изобретении могут быть использованы стандартные для данной области техники методы молекулярной биологии, микробиологии и технологии рекомбинантных ДНК. Такие методы хорошо известны и подробно описаны в литературе. См., например, 8атЬгоок, РгбдсЬ апб МатаШ, Мо1еси1аг
- 6 025280
С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство), второе изд. (1989) Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Рге88, Со1б 8ргшд НагЬог, Ν.Υ. (здесь - 8атЬгоок е! а1., 1989); ΌΝΑ С1отпд: А Ргасбса1 АрргоасЬ (Клонирование ДНК: практическое руководство), т. I и II (Ό.Ν. С1оуег еб. 1985); ОНдопис1еоббе 8уп!Ье818 (Синтез олигонуклеотидов) (М.1. ОаИ еб. 1984); №с1ею Ас1б НуЬпб1/аПоп (Гибридизация нуклеиновых кислот) [Β.Ό. Нате8 & 8.1. Шддт8 еб8. (1985)]; ТгатспрИоп и Тгап81абоп (Транскрипция и трансляция) [Β.Ό. Нате8 & 8.1. Шддш8. еб8. (1984)]; Атта1 Се11 СиНиге (Культивирование животных клеток) [К.1. Рге8Нпеу, еб. (1986)]; ПптоЫП/еб Се118 апб Еп/уте8 (Иммобилизованные клетки и ферменты) [1КЬ Рге88, (1986)]; В. РегЬа1, А РгасИса1 Сшбе То Мо1еси1аг С1отпд (Практическое руководство по молекулярному клонированию) (1984); Р.МЬ Аи8иЬе1 е! а1. (еб8.), Сштеп! Рго!осо18 ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оНп АПеу & 8оп8, 1пс. (1994).
Все другие термины используются в настоящей заявке в их обычном смысле в определенных представляющих интерес областях: молекулярной биологии, иммунологии, цитологии, биоинформатике.
1.2. Антигены, используемые как источники эпитопов согласно настоящему изобретению.
Хотя конкретные описанные в настоящем документе полиэпитопные конструкции основаны на НЕК2-специфичных эпитопах и подходят для индукции иммунного ответа к НЕК2-экспрессирующим клеткам рака груди; те же описанные в настоящем документе принципы применимы ко всем другие болезнь-специфичным полиэпитопным конструкциям. Антигены, подходящие в качестве источника эпитопов в составе полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению, включают без ограничения различные специфичные для вирусов, бактерий, грибов, паразитов и опухолеспецифичные антигены. Неограничивающие примеры вирусных антигенов согласно настоящему изобретению включают антигены, полученные из вируса гриппа (например, поверхностные гликопротеины гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (ΝΆ)); вируса иммунодефицита (например, антигены вируса иммунодефицита человека (Н1У), такие как др120, др160, р18 антиген Сад р17/р24, Та!, Ро1, №Г и Епу); герпесвируса (например, гликопротеин вируса простого герпеса (Н8У), вируса болезни Марека, цитомегаловируса (СМУ) или вируса Эпштейна-Барра); вируса гепатита (например, поверхностный антиген гепатита В (НВ8Ад)); папилломавируса; Раус-ассоциированного вируса (например, КАУ-1 епу); вируса инфекционного бронхита (например, матрикс и/или пепломер); флавивируса (например, антиген вируса японского энцефалита (1ЕУ), антиген жёлтой лихорадки или антиген вируса Денге); морбилливируса (например, антиген вируса собачьей чумы, антиген кори или антиген чумы рогатого скота, такой как НА или Р); бешенства (например, гликопротеин С вируса бешенства); парвовируса (например, антиген собачьего парвовируса); поксвируса (например, антиген эктромелии, антиген поксвируса канареек или антиген птичьей оспы); вируса ветряной оспы (антиген уапсеИа /о81ег); вируса инфекционного бурсита (например, УР2, УР8 или УР4); вируса Хантаан и вируса свинки. Неограничивающие примеры бактериальных антигенов согласно настоящему изобретению включают липополисахариды, выделенные из клеточных стенок грамотрицательных бактерий и стафилококк-специфичные, стрептококк-специфичные, пневмококкспецифичные (например, Р8рА; см. публикацию РСТ № АО 92/14488), специфичные для №188епа допоггНеа. боррелия-специфичные (например, О8рА-, О8рВ-, О8рС- антигены боррелий, связанных с болезнью Лайма, таких как ВоггеБа ЬигдбогГегк ВоггеБа аЕгеШ и ВоггеБа даппн [см., например, патент США №5523089; публикации РСТ №: АО 90/04411, АО 91/09870, АО 93/04175, АО 96/06165, АО93/08306; РСТ/ϋδ 92/08697; Вегд81гош е! а1., Мо1. МюгоЬюЕ, 1999; 3: 479486; 1оНп8оп е! а1., 1пТес1. апб 1ттип. 1992; 60: 1845-1853; 1оНп8оп е! а1., вакцина 1995; 13: 1086-1094; ТНе 81х!Б 1п!ета!юпа1 СопТегепсе оп Ьуте Вогге1ю818: Ргодге88 оп !Не Оеуе1ортеп1 о! Ьуте О|8еа8е Уассте, Уассте 1995; 13: 133-135]), и белки или пептиды, специфичные для синегнойной палочки. Неограничивающим примером малярия-специфичного антигена является белок Ма1апа спсипърого/оНе (С8). Неограничивающие примеры грибных антигенов включают выделенные из Сапб1ба (например, МР65 из Сапб1ба а1Ысап8), ТпсБорЬу!оп и Р1уго8рогит. Неограничивающие примеры опухолеспецифичных антигенов включают антиген АХ-1 (лимфомы и других солидных опухолей), рецепторы ЕгЬВ, Ме1ап А [МАКТ1], др100, тирозиназу, ТКР-1/др 75 и ТКР-2 (меланомы); МАСЕ-1 и МАСЕ-3 (карциномы мочевого пузыря, головы и шеи, немелкоклеточной карциномы); белки НРУ ЕС и Е7 (рака шейки матки); муцин [МИС-1] (при раке груди, поджелудочной железы, толстой кишки и простаты); простатоспецифический антиген [Р8А] (при раке простаты); карциноэмбриональный антиген [СЕА] (при раке толстой кишки, груди и желудочно-кишечного тракта) и такие общие опухолеспецифичные антигены, как МАСЕ-2, МАСЕ-4, МАСЕ-6, МАСЕ-10, МАСЕ-12, ВАСЕ-1, САСЕ-1,2,8, САСЕ3 ТО 7, ЬАСЕ-1, NΥ-Е8О-1/^ΑСЕ-2, NΑ-88, СпТУ и ТКР2-ЮТ2. Неограничивающие примеры антигенов, специфичных для аутоиммунных заболеваний, включают САЭ 65, 1А-2 и В-цепь инсулина (для диабета 1 типа), основной миелиновый белок и глатирамера ацетат (СА) (для рассеянного склероза).
1.3. Алгоритм отбора эпитопов.
Эпитопы, подходящие для полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению, могут быть определены с применением вычислительных способов.
Подходящие вычислительные способы включают, например, оригинальное программное обеспечение ТЕргебю! (Ап!опе!8 О.У., Мак8уи!оу А./., 2010, Мо1.Вю1. 44(1): 330-139;
Нйр: //!ергебю!. 8оигсеГогде. пе!).
Прогностические модели для ТЕргебю! были построены с применением регрессии методом дроб- 7 025280 ных наименьших квадратов (РЬ§) на основе имеющихся данных относительно связывания пептидов с
НЬА, полученных из базы данных ШОВ (Пптипс Ерйорс ОШаЬахс. 1и1р://\\Т5\у.сриптипс.огд). В моделях, включенных в ТЕргсй1е!, применяются шкалы физико-химических свойств аминокислот для параметризации пептидов.
Прогностические модели, подходящие для целей настоящего изобретения, могут быть представлены следующей общей формулой:
р!С;<) = ^α>ιΡ; + сот!
,·=ι , где р1С5о представляет собой меру аффинности связывания ГКГС-пептид;
Р1 - вектор характеристик, кодирующий аминокислоту а в положении ί в указанном пептиде; ω1 - вектор весовых коэффициентов этих характеристик.
Существует множество других алгоритмов, которые могут применяться для определения Тклеточных эпитопов, подходящих для полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению. Одним из неограничивающих примеров являются способы на основе искусственных нейронных сетей, разработанные Ьипйсдаагй с! а1. (Еипйсдаагй С. с! а1., 2008. ΝΑΚ, 36:^509-512).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предсказания связывающих ГКГС класса I эпитопов были выполнены для 30 различных аллелей НЬА (НЬА-А*0101, А*0201, А*0202, А*0203, А*0206, А*0301, А*2301, А*2402, А*2403, А*2601, А*2902, А*3001, А*3002, А*3101, В*0702, В*0801, В* 1501, В* 1801, В*2705, В*3501, В*4001, В*4002, В*4402, В*4403, В*4501, В*5101, В*5301, В*5401, В*5701, В*5801). Предсказанное значение р1С50 выше 6,8 было выбрано для различения связывающих и несвязывающих эпитопов.
Показано, что осуществление предсказания аффинности связывания пептидов с ТАР перед предсказанием связывающих ГКГС класса I эпитопов понижает уровень ложноположительных результатов предсказания (Рс!сг8 В. с! а1., 2003, 1. 1ттипо1, 171: 1741-1749), таким образом, предсказание связывания пептидов с ТАР может применяться для отбора потенциальных Т-клеточных эпитопов в способах согласно настоящему изобретению. Предсказание связывания ТАР может применяться в качестве фильтра, чтобы избежать отбора эпитопов, неэффективно взаимодействующих с ТАР, либо в качестве функции ранжирования пептидов по весовым коэффициентам в соответствии с их предсказанной аффинностью связывания ТАР. Предсказание связывания пептидов с ТАР может быть выполнено с применением алгоритмов, реализованных в ТЕргсй1е!, или с применением других подходящих вычислительных средств. Например, согласно одному из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения из 1247 пептидов белка НЕК2 860 пептидов были отобраны с применением предсказания аффинности связывания ТАР. Предсказание связывания ТАР, реализованное в ТЕргсй1е!, основано на прогностической модели и алгоритмах, разработанных Рс!сг8 с! а1. (1. 1ттипо1, 2003, 171: 1741-1749).
Предсказание протеасомного и/или иммунопротеасомного расщепления представляющего интерес белкового антигена может применяться для выбора пептидов, содержащих сайт расщепления на С-конце (показано, что протеасома генерирует С-конец природных связывающихся с ГКГС I эпитопов). Предсказание протеасомного и/или иммунопротеасомного процессинга может также применяться как фильтр или как функция ранжирования. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с применением комбинации протеасомного и иммунопротеасомного фильтров было отобрано 338 пептидов из белка НЕК2. Алгоритмы для предсказания протеасомного и иммунопротеасомного процессинга белковых антигенов, реализованные в программном обеспечении ТЕргсй1е!, основаны на прогностических моделях, разработанных Тос8 с! а1 (Тос8 Р.Е. с! а1., 2001, 1. Ехр. Мсй., 194: 1-12). Определение пороговых уровней для предсказания протеасомного процессинга описано, например, 8шдй апй Кадкауа (8шдй Н. апй Кадкауа С.Р., 2003, Вюш&гтайек, 19: 1009-1014).
В то время как такие дополнительные этапы отбора могут приводить к ложноотрицательным результатам, они могут иметь преимущества в отношении иммунодоминирования. Например, пептиды, отобранные с применением этих фильтров, согласно предсказанию, связывающиеся с ТАР и содержащие сайт протеасомного расщепления на С-конце, предположительно, будут более эффективно высвобождаться ш у1уо. Действительно, Рс!сг8 с! а1. (1. 1ттипо1., 2003, 171 : 1741-1749) и Ноу!еЫпоуа с! а1. (1 1ттипо1., 2004, 173:6813-6819) показали, что предварительный отбор пептидов, согласно предсказанию, эффективно связывающихся с ТАР, понижает число ложноположительных результатов предсказания Тклеточных эпитопов.
Конкретные неограничивающие примеры предсказанных эпитопов, отобранных для включения в полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению, приведены в примерах ниже.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения промискуитентные эпитопы, связывающие ГКГС класса I или класса II, отбирали с применением жадного алгоритма. Этот алгоритм позволяет выбрать минимальное количество пептидов, покрывающее все разнообразие выбранных аллотипов ГКГС. Указанные эпитопы отбирали с пятикратной избыточностью, т.е. в созданном наборе содержалось не более пяти потенциальных эпитопов для каждого аллотипа ГКГС из применяемых для предсказаний. Было предположено, что это важно ввиду чрезвычайно высокого полиморфизма генов НЬА.
- 8 025280
Этот алгоритм был создан для того, чтобы охватить большинство индивидуумов в представляющих интерес популяциях с помощью наименьшего числа пептидов; для создания избыточного набора промискуитентных эпитопов для конструирования универсального набора пептидов, способного вызывать иммунные ответы у большинства людей. Неограничивающие примеры связывающих ГКГС класса I и класса II эпитопов приведены в примерах ниже.
В альтернативной группе вариантов осуществления НЬЛ-аллельспецифичные полиэпитопные конструкции были созданы для вакцинации индивидуумов с конкретными аллелями НЬЛ. Согласно одному из таких вариантов осуществления НЬЛ-аллельспецифичные наборы были созданы для 30 различных аллелей НЬЛ класса I. Для каждого аллеля были созданы два разных набора с применением двух разных алгоритмов предсказания. Эти наборы перечислены в табл. 3 ниже.
1.4. Алгоритмы для объединения эпитопов в полиэпитопные конструкции, предложенные в настоящем изобретении.
1.4.1. Способы оптимизации взаимодействия эпитопов с ТАР.
Чтобы сделать процессинг эпитопов в составе полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению более эффективным, авторы настоящего изобретения разработали новые спейсерные (фланкирующие) последовательности, предназначенные для оптимизации связывания пептида с ТАР. Согласно конкретным описанным в настоящей заявке вычислительным методам аффинность связывания с ТАР была предсказана для каждого эпитопа в составе указанной полиэпитопной конструкции, и спейсерные последовательности добавляли только к пептидам, неэффективно связывающимся с ТАР согласно предсказанию.
Согласно одному из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения алгоритм для выбора спейсерных последовательностей для оптимизации связывания ТАР основан на матрицах и способах, разработанных Ре1ег5 с1 а1. (1. Iттиηο1. 2003, 171:1741-1749), включенных в ТЕргебюЕ Согласно этому алгоритму аффинность связывания пептидов с ТАР вычисляют по формуле: Ν1+Ν2+Ν3+Ο, где 1 соответствует вкладу первой Ν-концевой аминокислоты, N2 - второй аминокислоты от Ν-конца указанного пептида, Ν3 - третьей аминокислоты от Ν-конца указанного пептида, и С - вкладу последней (Сконцевой) аминокислоты. Согласно этому алгоритму С-конец должен оставаться неизменным (так как было показано, что в эндоплазматическом ретикулуме (ЕР) нет активных карбоксипептидаз, и, таким образом, предполагается, что С-конец эпитопа обеспечивается за счет протеасомного процессинга, в то время как Ν-конец указанного пептида может быть отщеплен ЕРАР (ЕР-аминопептидазами)), и для улучшения связывания ТАР могут добавляться только Ν-концевые аминокислоты. Согласно одному из конкретных вариантов осуществления в качестве Ν-концевой спейсерной последовательности были выбраны мотив ΑΡΥ и его более короткие производные. Сначала А1а (А) остаток добавляли к указанному эпитопу и, если было предсказано, что этот пептид неэффективно связывает ТАР, к указанному эпитопу добавляли А1а-Агд (АР) мотив. Если предсказано, что этот пептид связывается с ТАР с низкой аффинностью, то к указанному эпитопу добавляли мотив А1а-Агд-Туг (ΑРΥ). Для многих из указанных эпитопов, применяемых в полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению, для эффективного взаимодействия с ТАР был необходим только один остаток А1а. Согласно другому варианту осуществления для оптимизации связывания пептида с ТАР применяли вырожденный мотив, например [ΑNРΚ] | ΗΟΥ\\'| [Υ^Ρνη (8ЕО ГО ΝΟ: 464).
1.4.2. Способы оптимизации протеасомного и/или иммунопротеасомного процессинга эпитопов.
В способах согласно настоящему изобретению для оптимизации протеасомного и/или иммунопротеасомного высвобождения эпитопов из полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению спейсерные последовательности необходимо определять для каждой пары эпитопов. Это может быть выполнено с применением, например, двух разных алгоритмов, описанных ниже.
Первый алгоритм основан на применении состоящей из 6 аминокислот консенсусной спейсерной последовательности АОБАКМ (8ЕО ГО ΝΟ: 2), оптимальной и для протеасомного, и для иммунопротеасомного процессинга. Для оптимизации высвобождения С-концевых эпитопов могут применяться матрицы РгоРгеб1 (Тоек Р.Е. е1 а1., 2001, I. Ехр., Меб., 194: 1-12; §шдй Р.Ь., Радйаха О.Р., 2003, ВюшГогтайс8, 19(8): 1009-14). Для анализа комбинаций и представления данных могут применяться направленные графы, где пептиды представляют собой вершины графа и ребра, соединяющие вершины А и В, определяют комбинации, где необходимый сайт расщепления присутствует на С-конце пептида А.
С тем же алгоритмом могут применяться другие спейсерные последовательности. Например, для оптимизации протеасомного процессинга может применяться последовательность АЭБААС (8ЕО ГО ΝΟ: 3), а для оптимизации иммунопротеасомного процессинга может применяться последовательность АЭЬА'УК (8ЕО ГО ΝΟ: 4). Также могут применяться вырожденные варианты этих спейсерных последовательностей, где любая аминокислота из указанной последовательности может быть замещена любой из 20 природных аминокислот. В спейсере могут быть замещены одновременно все аминокислоты. Кроме того, длина спейсера может быть меньше или больше, чем 6 аминокислот. Тем не менее отбор спейсеров не является случайным, так как отбор спейсерной последовательности для каждой пары эпитопов осуществляется согласно оценочной функции. При предсказании спейсерной последовательности между эпитопами А и В преимущество отдается аминокислотам, обеспечивающим наиболее эффективное высво- 9 025280 бождение С-конца эпитопа А. Определение может быть выполнено с применением моделей, включенных в ΤΕρτβάίεΐ, или любой другой модели для предсказания протеасомного и/или иммунопротеасомного процессинга.
Эта версия алгоритма для конструирования полиэпитопной конструкции согласно настоящему изобретению может быть представлена следующими последовательными этапами:
1. добавление спейсерных последовательностей (для оптимизации взаимодействия эпитопов с ТАР) для всех выбранных эпитопов (при необходимости);
2. тестирование спейсерных последовательностей из группы, состоящей из , А, АО, АОЬ, АОЬУ (δΕΟ ГО N0: 5), АОЬУК (δΕΟ ГО N0: 6), АОЬУКУ (δΕΟ ГО N0: 2), до тех пор, пока получаемая конструкция не будет содержать все необходимые выбранные эпитопы или до тех пор, пока не будут протестированы все спейсерные последовательности.
Если полученная конструкция не включает все необходимые выбранные эпитопы,
2.1. создается граф;
2.2. если указанный граф содержит смежные вершины, выбирается путь с максимальной длиной;
2.3. исключаются вершины, соответствующие пептидам, включенным в выбранный путь;
2.4. в указанный набор добавляе(ю)тся пептид(ы), соответствующие выбранному пути;
2.5. см. пункт 2.2;
2.6. если указанный граф не содержит смежных вершин, создается новый набор пептидов, состоящий из выбранных путей и оставшихся вершин указанного графа; начало нового цикла (п.2);
3. в результате должна получиться последовательность указанной полиэпитопной конструкции; если не выбран путь, включающий все эпитопы, алгоритм повторяется с п.2, с менее строгим протеасомным/иммунопротеасомным фильтром.
Настоящее изобретение также включает различные модификации описанного выше алгоритма. Например, может быть включен дополнительный цикл, в котором используется протеасомный/иммунопротеасомный фильтр других степеней строгости.
Второй подход основан на применении вырожденной оптимальной спейсерной последовательности |ΛΡΒδ| [ЭГОТ] [АОЬ] [АКУ] (δΕΟ ГО N0: 460) для оптимизации протеасомного и/или иммунопротеасомного процессинга. Эта последовательность применяется для создания набора спейсерных последовательностей длиной 1-4 аминокислоты, причем набор включает более чем 150 различных последовательностей. Могут также применяться и другие вырожденные оптимальные спейсерные последовательности. Например, [АКБРЖ] [ОМТОУ] |ЕОАУНК| [УКАΡδI] [АЬКБВТ] |Ο\ΊΜ.δΕ| (δΕΟ ГО N0: 461) может применяться как основа для набора спейсерных последовательностей для оптимизации протеасомного процессинга, а ^041+414 [О1АТУО] [^ОАNУΕ] [АδNУ^К] [У1КАОР] (КАОУЗБ] (δΕΟ ГО N0: 462) может применяться как основа для набора спейсерных последовательностей для оптимизации иммунопротеасомного процессинга. Хотя предпочтительная длина спейсерных последовательностей составляет около 3-4 аминокислот, настоящее изобретение включает также и более короткие, и более длинные последовательности. Могут также применяться вырожденные варианты спейсерных последовательностей, содержащие замены аминокислот в таких положениях, что это не влияет на протеасомный и/или иммунопротеасомный процессинг.
Если используется второй подход, отобранная для каждой комбинации эпитопов А и В спейсерная последовательность представляет собой последовательность, обеспечивающую эффективное протеасомное расщепление на С-конце эпитопа А, предсказанную при определенном уровне строгости протеасомного фильтра. Вкратце, указанный фильтр работает следующим образом: для любых перекрывающихся наномерных пептидов, выделенных из антигенной последовательности, предсказывают вероятность присутствия сайта протеасомного расщепления на С-конце; если предсказанный уровень меньше, чем выбранное пороговое значение, данный пептид исключается из дальнейшего анализа. См. также Тоек Κ.Ε. с1 а1., 2001, 1. Εχρ. Меб, 194: 1-12; δίη§Ε Н., Кадйауа О.Р., 2003, Вюш&ттайск, 19(8): 1009-14. Для всех отобранных вариантов проводят предсказание эпитопов и для каждой пары пептидов выбирают одно предсказание (с применением критериев, описанных ниже). Затем собирают полиэпитопную конструкцию, в которой первый пептид используют в качестве аргумента функции, либо выбирают автоматически (как наилучший согласно выбранным критериям). Если какой-либо определенный пептид не был включен в результирующую полиэпитопную конструкцию, указанный алгоритм ищет пептиды, которые могут быть использованы для встраивания этого исключенного пептида. Если место для встраивания не найдено, указанный исключенный пептид используют как стартовый пептид.
Следующие критерии можно применять для выбора спейсерной последовательности для пептидов А и В: число избыточных эпитопов, предсказанных для определенного спейсера; число алломорфов ГКГС, взаимодействующих с указанными избыточный эпитопы; длина указанного спейсера (обычно предпочтительными являются более короткие спейсеры). Все варианты спейсерных последовательностей расположены согласно предсказанной эффективности высвобождения С-конца пептида А. Эти критерии могут применяться в качестве фильтров; они могут применяться совместно или отдельно, в разной последовательности. Кроме того, можно варьировать строгость предсказания потенциальных Т-клеточных эпитопов и протеасомного и/или иммунопротеасомного процессинга пептидных фрагментов.
- 10 025280
Приведенные выше критерии применяют для выбора первой пары пептидов (если первый пептид не был выбран ранее) и для выбора каждого последующего пептида.
1.4.3. Способы минимизации числа избыточных эпитопов.
Хотя в литературе и описана индукция Т-клеточных иммунных ответов на все антигенные пептиды, которые могут быть предъявлены аллельными вариантами молекул ГКГС определенного организма, авторы настоящего изобретения полагают, что важно свести к минимуму число избыточных эпитопов, которые образуются при соединении эпитопов в составе полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению. Минимизация числа избыточных эпитопов важна, поскольку такие эпитопы могут получить иммунологическое преимущество, будучи гетерологичными для данного организма, и Тлимфоциты, способные взаимодействовать с ними, не подвергались отрицательному отбору. Описанный выше второй алгоритм получения полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению был отчасти создан для решения этой проблемы. См. также пример 2.1.2 ниже.
1.5 Алгоритм для отбора и соединения Тй-эпитопов.
Приведенные выше способы касаются отбора и расположения СТЬ-эпитопов, которые применяются для индукции СЭ8+-Т-лимфоцитов. Предпочтительно, полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению дополнительно содержат Тй-эпитопы. которые применяются для индукции СЭ4+- Тлимфоцитов.
Тй-эпитопы могут быть предсказаны с применением, например, ТЕргеШсЕ Кроме того, может применяться универсальный иммуногенный пептид РАОКЕ (эпитоп Рап ΌΚ Т-хелперов), так как он взаимодействует с большим количеством распространенных алломорфов НЬА-ΌΚ, а также с мышиным 1-Аь
Для предсказания были выбраны следующие фрагменты, содержащие Тй-эпитопы для большинства алломорфов ЕгйВ2 ГКГС II:
ΑννοαχνννπολνροίΓΒΚκκοοΜκ, нспоууммукстумгозе, аоммькетееккукуесзоа
ИСтаЛАкЕКШИККРТНОЗЦУ, РЮГГОУУМГМУКГЗУМГОК |5Ер ГО ΝΟ: 7, 8, 9, 10, 11, соответственно)
После того как были выбраны эти фрагменты, были включены 3-5 аминокислот, фланкирующих эпитоп, в качестве потенциально важных для взаимодействия с определенными Т-клеточными рецепторами.
Указанные пептиды были соединены КК-мотивами, которые соответствуют участкам расщепления лизосомальными катепсинами В и Ь.
АКГИАИТЕКДДДККАУУОЩЕУУУЬОУУЕОЩКККОрЫККЫ’етЮУУМПЙУКСУУМЮЗЕККАфМКЦ,
КЕТ
ЕГККУКУГ030АКК1КЛУМА1Е8П,ККЫТНЦ8ИУККР1СТ1ОУУМ1МУКСТМШБ (РАОКЕ выделен жирным шрифтом; спейсерные последовательности подчеркнуты) (8Е() ГО N0: 12)
1.6. Нацеливающие сигналы, подходящие для полиэпитопных конструкций, предложенных в настоящем изобретении.
Многочисленные исследования показали, что включение Ν-концевой сигнальной последовательности различных белков и С-концевой лизосомальной сортировочной последовательности белка ЬАМР-1 человека в иммуногенные конструкции приводит к высокому уровню Тй-ответа относительно конструкций, которые не содержат таких нацеливающих сигналов (Βοηίηί С. е1 а1. Огеепйегд Ρ.Ό. 1оиг. 1ттипо1., 2001, 166(8):5250-5257; 8и Ζ. е! а1. 2002, 62(17):5041-5048; ВопейШ А. е! а1. 1оиг. 1ттипо1., 2004, 172(11):6649-57; Ра88пасй1 М. е1 а1. Сйшса1 Сапсег Ке8., 2005, 11(15):5566-71). Применение Ν-концевой сигнальной последовательности обеспечивает нацеливание на ЕК и секреторный путь, в то время как применение С-концевой последовательности лизосомальной сортировки белка ЬАМР-1 человека обеспечивает направление связанного иммуногена из секреторного пути в лизосомы для разрушения, где пептидные фрагменты связываются с молекулами ГКГС-ΙΙ, что приводит к их презентации на поверхности клеток.
Предпочтительный Ν-концевой нацеливающий сигнал, применяемый в полиэпитопных конструкциях согласно настоящему изобретению представляет собой немного модифицированную версию сигнального пептида НЕК2
МЕЕААЕСК^СЕ1±АЕЬРРСАР (5Е<5 ГО ΝΟ: 13) или исходный сигнальный пептид НЕК. 2 МЕЬААЕСКЛУОЕЕЕАЬЬРРСААЗ (5ЕГ) ГО ΝΟ:
14).
Карбокси-концевой сигнал сортировки может представлять собой последние 11 аминокислот белка ЬАМР-1: ВКР5>НАСУОТ1 (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 15). В качестве сортирующего сигнала могут применяться и более длинные фрагменты ЬАМР-1, например последние 34 аминокислоты
ΙΡΙΑνΟΟΑΕΑΟΕνΕίνΕΙΑΥΕνΟΚΚΚδΗΑΟΥΟΤΙ (5Εζ> ГО ΝΟ: 16) трансмембранный и цитоплазматический домены.
Ниже приведены два неограничивающих примера предпочтительных полиэпитопных конструкций, предложенных в настоящем изобретении.
1. ^сигнал|ПолиТй|Поли-СТЕ|ЬАМР-1.
- 11 025280
2. Ы-сигнал|Поли-СТЬ |Поли-ТЬ|ЬАМР-1.
Как было указано выше, в настоящее изобретение также включены комбинации конструкций, состоящих полностью из СТЬ- и полностью из ТЬ-, а также смешанные системы СТЬ- и ТЬ-эпитопов.
Другим примером подходящего эндосомального нацеливающего сигнала является фрагмент (первые 110 аминокислот) или вся последовательность инвариантной цепи (И), связанной с молекулами ГКГС класса II. Этот сигнал усиливает эффективность индукции СЭ4+-Т-клеточного ответа. Также ТЬэпитопы могут быть связаны с иммунорегуляторным фрагментом й, ЬКМКЬРКРРКРУЗОМК (δΕΟ ГО N0: 17, й 77-92), или его более короткими фрагментами, такими как, например, ЬКМКЬРК (δΕΟ ГО N0: 18) или ЬКМК (8Е0 ГО N0: 19).
В полиэпитопных конструкциях согласно настоящему изобретению может применяться конъюгированный по Ν-концу убиквитин (например, убиквитин с заменой О76У |и'ЬУ76|) для дальнейшей стимуляции протеасомного процессинга эпитопов, содержащихся в указанных конструкциях, а также для стимуляции СТЬ-(СО8+) ответов.
ИЬУ76 может быть конъюгирован непосредственно с амино-концом полиэпитопной конструкции, либо между иЬУ76 и полиэпитопной конструкцией может быть встроен остаток Уа1 или Агд для дальнейшей стабилизации получаемых гибридных конструкций. См. пример 2.4.5. ниже.
1.7. Получение полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению.
Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению могут быть искусственно синтезированы с применением различных способов, хорошо известных в данной области техники (например, эксклюзионный твердофазный синтез, автоматизированный твердофазный синтез, частичный твердофазный синтез, метод конденсации фрагментов, классический синтез в растворе и т.д.; см., например, Метйе1б I. Ат. СЬет. 8ос. 1963 85:2149 и Метйе1б е! а1., 1982, ВюсЬет15йу, 21:502; 81е\уаг1. 8ойб Рйазе Рерйбе 8уи1Ьезе5 (Твердофазный синтез пептидов), Ргеетап и Со.: 8аи Ргаишзсо, 1969; 2002/2003, Общий каталог от ШуаЕюсЬет. Согр., 8аи Э1едо, США; Оообтап, 8уи1Ье515 оГ Рерйбез апб Рерйботшейсз (Синтез пептидов и пептидомиметиков), НоиЬеп-\УеуЕ 81ийдат1 2002) или могут быть экспрессированы в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах с использованием различных экспрессионных векторов, кодирующих такие конструкции. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены изолированные полинуклеотиды, кодирующие полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению, а также рекомбинантные векторы и клетки-хозяева (как эукариотические, так и прокариотические), генетически модифицированные для экспрессии или сверхэкспрессии полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению. Указанные клетки-хозяева могут культивироваться или поддерживаться иными способами в условиях, допускающих экспрессию полиэпитопного полипептида с кодирующей его нуклеиновой кислоты, например плазмиды.
Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы разнообразными способами для улучшения фармакокинетики и других качеств (например, с получением конструкций с более благоприятными растворимостью, стабильностью и/или чувствительностью к гидролизу и/или протеолизу). Полиэпитопные конструкции могут быть модифицированы по амино-(И-)концу и/или карбокси-(С-)концу и/или путем замены одной или более природной генетически кодированной аминокислоты нестандартной аминокислотой, модификацией боковой цепи одного или более аминокислотного остатка, фосфорилированием пептидов и т.п.
Амино-концевые модификации включают метилирование (например, -НСН3 или -Ν(ΟΗ3)2), ацетилирование (например, уксусной кислотой или ее галогенированными производными, такими как αхлоруксусная кислота, α-бромуксусная кислота или α-йодуксусная кислота, добавление бензилоксикарбонильной (СЬ/) группы или блокирование амино-конца любой блокирирующей группой, содержащей карбоксилатную функциональную группу, обозначаемую как КС00-, или сульфонильную функциональную группу, обозначаемую как Κ-δ02-, где К выбран из алкила, арила, гетероарила, алкиларила и т.п., и сходных групп. Можно также ввести дезаминокислоту на Ν-конце (так что Ν-концевая аминогруппа будет отсутствовать), чтобы уменьшить чувствительность к протеазам или ограничить конформации пептидного соединения.
Модификации карбокси-конца включают замену свободных кислот карбоксамидной группой или образование циклического лактама на карбокси-конце для введения структурных ограничений. Можно также ввести дезамино- или декарбоксиостатки на концах пептида таким образом, чтобы концевая амино- или карбоксильная группа отсутствовала, для снижения чувствительности к протеазам.
Можно также заменять любую из 20 природных аминокислот. Общие примеры стандартных аминокислотных замен включают стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) и синтетические аминокислоты, такие как, например, Ь-орнитин, Ь-гомоцистеин, Ь-гомосерин, Ь-цитруллин, 3-сульфино-Ь-аланин, ^(Ь-аргинино)сукцинат, 3,4-дигидрокси-Р-фенилаланин, 3-йод-Ь-тирозин, 3,5-дийод-Ь-тирозин, трийодтиронин, Ь-тироксин, Ь-селеноцистеин, ^(Ь-аргинино)таурин, 4аминобутилат, (К^)-3-амино-2метилпропаноат, α,α-дизамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочную кислоту, βаланин, 3-пиридилаланин, 4-гидроксипролин, О-фосфосерин, Ν-метилглицин, Ν-ацетилсерин, Νформилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, норлейцин и другие похожие аминокислоты и
- 12 025280 иминокислоты. Общий способ для сайт-специфичного включения синтетических аминокислот в белки и пептиды описан у Ыогеи е! а1., 8с1епсе, 244: 182-188 (апрель 1989 г.).
1.8. Фармацевтические и иммуногенные композиции и способы доставки полиэпитопных конструкций, предложенных в настоящем изобретении.
Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению могут быть введены непосредственно, но предпочтительно из вводят в виде части иммуногенных композиций, содержащих фармацевтически приемлемый(е) носитель(и) и/или вспомогательное(ые) вещество(а). В одном из конкретных вариантов осуществления полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению вводят совместно (вместе в одной композиции или отдельно в двух разных композициях, которые могут быть введены одновременно или последовательно в тот же участок или в разные участки) с адъювантом. Может быть применен любой известный в данной области техники адъювант. Неограничивающие примеры адъювантов, подходящих для иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению, включают основанные на масляных эмульсиях и эмульгаторах адъюванты, такие как полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, Л803, МР59 или 8ΑΡ; минеральные гели, такие как гидроксид алюминия (квасцы), фосфат алюминия или фосфат кальция; адъюванты микробного происхождения, такие как холерный токсин (СТ), коклюшный токсин, термолабильный токсин (ЬТ) ЕксйепсЫа сой. мутантные токсины (например, ЬТКбЗ или ЬТК.72), бацилла Кальмета-Герена (БЦЖ), СотупеЪас1егшт ратуит, СрС мотивы ДНК, мурамилдипептид или монофосфориллипид; дисперсные адъюванты, такие как иммуностимулирующие комплексы (18СОМ), липосомы, биоразлагаемые микросферы или сапонины (например, 08-21); цитокины, такие как ΙΡΝ-γ, 1Ь-2, 1Ь-12 или 0М-С8Р, синтетические адъюванты, такие как неионные блок-сополимеры, мурамиловые пептидные аналоги (например, Ν-ацетил-Ь-мурамилтреонил-Оизоглутамин [ТНК-МЭР], Ν-ацетилнормурамил-Ь-аланин-О-изоглутамин, Ν-ацетилмурамил-Ь-аланинП-изоглутаминил-Р-аланин-2-[1'-2'-дипальмитоил-5-и-глицеро-3-гидроксифосфорилокси]этиламин), полифосфазены, или синтетические полинуклеотиды и поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, углеводородные эмульсии или гемоцианин лимфы улитки (КЬН). Предпочтительно, эти адъюванты представляют собой фармацевтически приемлемые для применения у людей.
Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению также могут быть введены в виде нуклеиновых кислот, кодирующих такие полиэпитопные конструкции (например, плазмиды, вирусные или любые другие соответствующие векторы). Для получения экспрессии указанной полиэпитопной конструкции в клетке-мишени (например, дендритной клетке (ДК), клетке Лангерганса или другой антиген-презентирующей клетке (АПК), или любой другой клетке-хозяине такие векторы должны содержать одну или более регуляторную последовательность, обеспечивающую экспрессию в таких клетках. Такая(ие) регуляторная(ые) последовательность(и) может быть функционально связано с последовательностью, кодирующей полиэпитопную конструкцию, что обеспечивает запуск экспрессии последней.
Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению или нуклеиновые кислоты, кодирующие их, могут быть доставлены в микрочастице, включающей дополнительно полимерную матрицу, или в синтетическом вирусном векторе. Может применяться любой подходящий вирусный вектор (например, аденовирус, поксвирус, лентивирус, и т.д.). См. также 1ιΠρ://\ν\ν\γ.ικΝ.η1ιη.ηί1ι; доу/511е5/еп1ге7?ДЪ=риЪтеД&стД=Пе1а1158еагсЬ&1егт=т1сгорагИс1е+ро1утег1с+ап11деп.
Когда полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению вводят в виде нуклеиновых кислот и/или с применением различных систем доставки (например, микрочастиц, вирусоподобных частиц), такие нуклеиновые кислоты и/или системы доставки могут дополнительно усиливать антигенспецифичные иммунные ответы (например, путем стимуляции высвобождения 1Ь-12 и γ-интерферона (ИФН) из макрофагов, К-клеток и Т-клеток).
Полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению можно применять для получения антиген-презентирующих клеток (АПК, например, дендритных клеток (ДК), клеток Лангерганса или других типов), способных презентировать требуемые эпитопы лимфоцитам. Требуемые АПК могут быть получены с применением любого известного в данной области техники способа, например ίη уйго путем трансфекции, в частности ДК (полученных, в частности, из моноцитов пациента) полинуклеотидами (ДНК или РНК), кодирующими полиэпитоп, или примированием соответствующим полиэпитопным полипептидом, или инфицированием рекомбинантным вектором микроорганизма, несущего соответствующий ген, кодирующий указанный полиэпитоп, или некоторыми другими сходными методами, известными в данной области техники. Производимые АПК могут применяться либо в качестве терапевтических клеточных вакцин, либо для получения ех у1уо аутологичных эффекторных Т-клеток для применения их в качестве терапевтических клеточных вакцин.
Полипептидные конструкции, конструкции из нуклеиновых кислот и композиции согласно настоящему изобретению можно вводить различными путями. Например, их можно вводить в слизистую оболочку (например, влагалища, носа, нижних дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта [например, прямой кишки]). В альтернативном варианте их можно вводить системно, например, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, перорально или подкожно.
- 13 025280
1.9. Определение эффективной дозы и оценка безопасности.
Согласно предложенным в настоящем изобретении способам фармацевтические и иммуногенные композиции, описанные в настоящей заявке, вводят пациенту в иммуногенно эффективных дозах, предпочтительно, с минимальной токсичностью.
С применением общепринятых в данной области техники методов (см., например, Со1йеп1йа1 с1 а1., Ыайопа1 СооретаБуе Уаееше Оеуе1ортеЩ ХУогкищ Сгоир. ΆΙΌ8 Кее. Нит. Кс1гоу1гн5С5 1993, 9:545-9), эффективные дозы и токсичность соединений и композиций согласно настоящему изобретению могут быть сначала определены в ходе доклинических исследований с применением небольших животных моделей (например, мышей), которые могут быть воспроизводимо иммунизированы этими соединениями и композициями тем же путем, который предполагается для клинических испытаний на людях. В частности, для любой фармацевтической композиции или вакцины, применяемой в способах согласно настоящему изобретению, терапевтически эффективная доза может быть рассчитана сначала для животных моделей с получением диапазона циркулирующей в плазме концентрации, включающего 1С5о (т.е. концентрацию тестового соединения, обеспечивающая половину максимального ингибирования симптомов). Кривые доза-эффект, полученные для животных систем, затем используют для определения тестовых доз для начальных клинических исследований на людях. Для безопасного определения дозы и частоты иммунизации для каждого состава должны соответствовать или превышать предполагаемые для применения в клинических испытаниях.
Согласно описанию в настоящей заявке дозу полиэпитопных конструкций и других компонентов композиций согласно настоящему изобретению определяют для того, чтобы убедиться, что доза, вводимая непрерывно или с перерывами, не будет превышать определенный уровень с учетом результатов, полученных на лабораторных животных, и индивидуальных характеристик пациента. Конкретная доза естественно варьирует в зависимости от способа дозировки, характеристик пациента или подопытных животных, таких как возраст, масса тела, пол, чувствительность, питание, продолжительности приема, применяемых в комбинации лекарственных средств, тяжести заболевания. Подходящие при определенных условиях доза и время приема могут быть определены с помощью тестирования на основе описанных выше индексов и должны выбираться на основании мнения лечащего врача и особенностей каждого пациента, в соответствии со стандартными клиническими методами. В связи с этим предпочтительная доза полиэпитопной конструкции обычно находится в диапазоне от 1-950 мкг на кг массы тела в зависимости от способа доставки и иммунизации.
Токсичность и терапевтическая эффективность полиэпитопных конструкций в иммуногенных композициях согласно настоящему изобретению могут быть определены при помощи стандартных фармацевтических процедур на экспериментальных животных, например, определением ΕΌ50 (доза, летальная для 50% популяции) и ΕΌ50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз с токсическим и терапевтическим эффектом представляет собой терапевтический индекс, и он может быть выражен как отношение ΕΌ50/ΕΌ50. Композиции, которые демонстируют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Хотя могут применяться и терапевтические средства, которые проявляют токсические побочные эффекты (например, при лечении тяжелых форм рака, опасных для жизни инфекции или аутоиммунных заболеваний), необходимо позаботиться о разработке системы доставки, направляющей такие иммуногенные композиции в определенный участок, с тем чтобы свести к минимуму потенциальные повреждение других тканей и органы и, таким образом, уменьшить побочные эффекты. Согласно приведенному в настоящей заявке описанию, полиэпитопные конструкции согласно настоящему изобретению являются сильными иммуностимуляторами и обладают низкой токсичностью.
Как было указано выше, данные, полученные при исследованиях на животных, могут применяться при определении диапазона дозировок для применения у человека. Терапевтически эффективная дозировка полиэпитопных конструкций согласно настоящему изобретению для применения на людях находится предпочтительно в пределах диапазона концентраций в кровотоке, которые включают ΕΌ50 с небольшой или отсутствующей токсичностью. Дозировка может варьировать в пределах этого диапазона в зависимости от лекарственной формы и пути введения. В идеале, используют одну доза.
Примеры
Изобретение далее описано на конкретных примерах. Тем не менее эти примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема, или идеи настоящего изобретения, или любого описанного в примерах понятия. Настоящее изобретение также не ограничено каким-либо конкретным описанным в настоящей заявке предпочтительным вариантом реализации. Безусловно, многие модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники после прочтения данного описания, и такие эквиваленты могут быть реализованы без отступления от сути и объема настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения наряду с полным объемом эквивалентов, к которым применима формула изобретения.
2.0. Последовательность непроцессированного белка ЕгЬ82 (НЕК2) человека
- 14 025280 >£Ϊ II 19533ΙίρΙίΌ4ό26.1ΙΕΚΒΒ2_ΗυΜΑΝ КесИате : РиО-Еесергог (упвте-ргоВт Ипазе егЬВ-2; АИИате: ри11=р185егЬВ2 ζ АЦЦате: Ри11=С-егЪВ-2; А1№те:
ΓιιΙΙ=ΝΕυ рго1о-опсо£епе; А1Й4ате: Ри11=Туго81пе ИпажАуре ееИ аиНасе гесерЮТ НЕЕ2; ΑΙιΝϊπβ: риЯ=МШ 19; АШЧате: СО_алйреп=СВ340 ; Р1а§$: Ргесигзог
МЕЕААЬСЕтеОЕГЬАЫРРСААЗТОУСТОТОМКЬЕиАКРЕТНЬПМЬКНЕУООСфтеООМЕЕЬТУЬРТНАЗ
Е5РГОШОРУОС¥УЬЕАНМ9УЕОУРЬОЕ1,Е1УЕОТ<ЗЫТОЬТАЬАУЬОМООР12\'КШ,УТСА5РООЬЕЕЬ р£К5ЬТЕП.КСС\'ЫОКХРГ>1СУС>ОТ1Е\\'КП1ГНКМЧС)1.ЛГТиОТМК5НАСНРС8РМСКС8КСтЛ'ОЕ85Р.
ГСО5ЕТКТУСАСССАКСКОР1ДЧТССНЕ0СААССТСРКН5ОСЕАСЕНЕ19Н5С1СЕЕНСРАЕУТУОТ1УГЕЕ
ЗМРРТВСКУТРСАЗСУТАСРУЦУХЗТОУСЗСТЦУСРЕНЦОЕУГАЕИСТОКСЕКСЗКРСАКУСУСЕОМЕНЕ
ΚΕνΚΑνΤΪΑΕΊΟΕΡΑΟΕΚΚΠηΧΕΑΓΕΡΕΪΡϋΟΟΡΑΚΝΤΑΡΕςΡΕρίγνίΈΤΕΕΕΓΓίΙΥΕΥηΑλνΡΕΚΕΡ
ΟΕ3νΡφΝΕθνΐΕΟΕΙΕΗΝΟΑΥ5ΕΤΕΟΟΕσΚλνΕΟΕΕ5ΕΕΕΕσ56ΕΑΕΙΗΗΝΤΗΕΟΡνΗΓνρΐ™ΐΕΡΕΝΡΗ
0АЕЕНТАМКРЕИЕСУОЕС-1.ЛСН0ЕСАК<Л1(.Л\'ОРОРТ(>А'№’50РЕКС,0ЕСАЕЕСКУ10СЕРКЕУУЦЛКНС
ЕРСНРЕССРСКО5\'ТСРСРЕАО0С\'АСАНУКОРРРСУ.АЕСР5ОУКРОЕ5УМР№КРР0ЕЕОАСрРСР1НС
ΤΗ5€νϋΕϋΟΚΟΕΡΑΕ9ΕΑ3ΡΕΤ5ΙΙ5Αννθ[ΕΕνννΕθννΕΟΙΕΙΚΚΕΟΡΚΙΚΚΥΤΜΕΕΕΕί5ΕΤΕΕνΕΡΕ
ΤΡ8ΟΑΜΡΝ0Α0ΜΕΙΕΚΕΤΕΕΕΚνκνΕΟ5ΟΑΡΟΤνΥΚθηνΐΡϋΟΕΝνΚΙΡνΑΙΚνΕΚΕΝΤ5ΡΚΑΝΚΕ1ΕΟΕ
ΑΥνΜΑ0νθ5ΡΥν5ΚΕΤΓ0ΓΕΤ5ΤνΓ,ΗΛΤ0ΕΜΡΥΟ0ΕΕΓΛΐνΚΕΝΚΟΚΤΟ3<2ΟΕΕΝ\νΓΜ0ΙΑΚΟΜ8ΥΙΈθνΚ
ΕνΗΚϋΕΑΑΚΝνΕνΚ8ΡΝΗνΜΤΟΡ6ΕΑΕΙΕϋΙϋΕΊΈΥΗΑΙΧ3ΟΚνΡ1ΚΛνΜΑΕΕί; Η.ΚΚΚΡΤΗ03θν\ν3Υθν
ТУтеЕЕМТРОАКРУООГРАКЕШОЕЕЕКОЕЕЕРОРИСТГОУУММУКСтеМЮЗЕСЕРЕРКЕЕУКЕРБЕМА
ΕϋΡ<3ΚΡ1Υ10ΝΕΟΕΟΡΑ5ΡΕΙ>5ΤΡΥΕ5ΕΕΕΟΟΟΜΟΟΕνθΑΕΕΥΕνΡΟΟΟΡΚΡΟΡΑΡΟΑΟΟΜνΗΗΕΗΚ55
ЗТКЗСССОЕТЕОЕЕРЗЕЕЕАРКЗРЕАРЗЕОАСЗОУРОООЕОМОААКОЕОЗЕРТНОРЗРЕОКУЗЕОРТУРЕ
ΡδΕΤΟΟΥνΑΡΕΤΟδΡφΡΕΥνΝφΡΟνΗΡφΡΡΚΡΕΕΟΡΕΡΑΑΕΡΑΟΑΤΕΕΕΡΚΤΕδΡΟΚΝΟννΚϋνΡΑΡΟΟΑ νΕΝΡΕΥΕΤΡΟΟσΑΑΡφΡΗΡΡΡΑΡδΡΑΡΌΝΕΥΥλνίΧΙΟΡΡΕΕΟΑΡΡΚΤΡΚΟΤΡΤΑΕΝΡΕΥΕΟΕΟνΡν (5Εφ Ю ΝΟ; 20)
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.
2.1. Универсальные СТЬ-эпитопы.
2.1.1. Список универсальных СТЬ-эпитопов.
СКЛУСЕЕЬАЕ, ЕАЛЕСКтеОЕ, КЕЕС8С.ЕАЬ, ΎΟΕΙ.ЕАЬЬР, ЬУVУЬСУУР, ΚΙΤΰΕΟΕΛΚ, ΟΕΡΕΏΝΥΑΕ, ΥΙ3Α\νΡΟ8Ε, СОЬТЬОЕЕР, ϋνίνδΥΟντν, КЛРОЗЬАРЕ, Р1КГОЕОМСА, ЕУНКОЬААК, МЕЬААЕСКте, КАЗРЬТЗГО КОАРРЗТРК, ЗПЗАУУОЬ, ЕНСРАЬУТУ, ЬМУКСТфЕ, УКУЬСЗСАР, ЕфРЕфЕфУР, УК1РУА1 V, фЕМРУССЬЕ, фЕТЕЕУЕРЕ, ΟΙΡΗΚΝΜφΕ, АЗСУТАСРУ, ТЕЬУЕРЬТР, РЬ<ЭКЕК1УК, ЬОУТКСЮЕ. ОЕАУУМАОУ, ЕЕСКУЬООЕ, ТУСАООСАК, УЗЕОРТУРЬ, КтеОЕЬЕАЩ ΕΕϋΝΥΑΕΛν, фЕУООУУЕЕ ЕЕАЕЬРРОА, ОЗСАРСТУУ, ЬСТЗУУЕСЬК, 13АУУС1Щ Μ0ΙΑΚΟΜ5Υ, ЬЗУМРРУКР, СЗУКОУРАР, ΑΙΚνυΚΕ Т, 5Ж.ОЕКЗЬК, П.ЕУУУЕСУ, РСРЕЛПОСУ. ТЕОСЬСТЗХУ, ТОРСЬАКЬЕ, ОЗТРУКЗЬЬ, ПЗАУУСГО, ТТРУТОАЗР, СМЕНЬКЕУК, АЕСКУ/ОЫ.Е, К1УКСТ(2ЬР, СЗСТЬУСРЬ, ООЕ.МУКЕРУ (ЗЕф ГО ΝΟ: 21,22, 23, 24,25, 26, 27,28, 29, 30,
31,32,33,34, 35, 36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51, 52,53,54,55,56,
57, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70. 71, 72, 73, 74, 75, 76, и 77, соответственно)
2.1.2. Список пептидных фрагментов, содержащих перекрывающиеся эпитопы ЕтЬВ2
МЬЕААЕСКтеСЕЕЕАЕЕРРОА, ОЕУООУУЫ, РЬОКЕМУКСТОиЫЖУАЕАУ.
ТТРУТОАЗР, ϋΙΕΗΚΝΝΟΕ, ТУСАООСАК, ЕНСРАЕУТУ, АЗСУТАСРУ СЗСТЕУСРЕ,
СМЕНЬКЕУК, К1РОЗЕАН.,
ТЕООЕС181УЕОЕКЗЕКЕЕОЗОЕАЕ,
КАЗРЕТЗПЗАУУСГОЕУУУЕСУУР,
ЬОРЕфЕфУР, УиЛУТОЗЬ, ЕОУЖСЫЬ,
ЕЕСКУЕООЦ РОРЕАИОСУ, ЬЗУМРПУКР,
ОЕТЕЕУЕРЬТР, УКУЬОЗСАЕОТУУ,
ΟϋΕΝνΚΙΡνΑΙΚνΕΡΕΝΤ, ΟΕΑΥνΜΛΟν. ОЕМРУССТЬ, ΜφΙΑΚΟΜ5Υ, ЕУНКОЬААК, ΚΙΙΈΡΟΕΑΡΕΕ, О\Т75¥С.УТУ, Ο3ΤΡΥΚ5ΕΕ, СГОЕТ1.О1.ЕР, ΡΟΟΟΕΟΜΟΑ, ΥΒΕΟΡΤνΡΕ, ΟλνΚΟνΡΑΡ, КОАРРЗТРК (ЗЕф ГО ΝΟ: 78, 56, 79, 72, 45, 52, 38, 46, 76, 73, 1, 41, 28, 49, 80, 51, 67, 62, 81, 82, 83, 84, 50, 43, 61, 33, 85, 30,70, 29, 32, 53, 63 и 36, соответственно)
2.1.3. Несколько версий универсальной поли-СТЬ конструкции.
- 15 025280
Конструкции с постоянной оптимальной спейсерной последовательностью.
Для 33 пептидов, отобранных с 3-кратным избытком (общая длина последовательности 297 АК).
2.1.3.1. Поли-СТЬ конструкция со спейсерными последовательностями, оптимизирующими взаимодействие с ТАР и протеасомный процессинг αονΟΕΙΧΑΙΧν V УЕО V УР5115АУУО1ЕЕЕО5ОЕАЕМЕЕААЕСК У7АОЕАКИЕАУ νΜΑΟν АОЬ УЕЕСК να>ΟΕΑϋ Υ3ΕΟΡΤ νρ
ЬАУЫРУАХКУАОЬРЕОИУАЬАЦТОЯУСУТУА^ОШАЬЬРАТУСАООСАРАШРНКЦЦрЕАОАКСУТАСРУАОиЛСРА ЬУТУАТЕЕУЕРЪТРАОЕИТЦТОЬАКАКаАРР5ТРКАОЕУ15А1УРО51А0ЕТЕЦУЕРЬА1ХЗУ1ЕО1ЦЕАЬААЬСКТОЬАОЬРЕ РУООЕ1.А1)К[ЕГ|81.АН.АКООЕП.ОЕЕРА7К\Ч.08ОАРАГЛ.УНКГЛ.ААКА0Е<1РЕ9Е0УРАОЛРГХ1ГЛГтОЛЛИ,0КЕК1УК ΑϋΕΚίνΚΟΤΟΕΑΡΑϋΡΕΤΪΙΙ (5Εζ> ГО ΝΟ: 86) (полная длина составляет 349 АК; спейсеры составляют 17,5% последовательности).
2.1.3.1. Поли-СТЬ конструкция со спейсерными последовательностями, оптимизирующими взаимодействие с ТАР и иммунопротеасомный процессинг
0ЕТЕЕУЕРЕА£СУТАСРУАЦЕУКУСК'АСЕЕЕАЕ5ПКАУУО1ААКОЕАУУМА0УАОЕУКЕНСГАЕУТУАЕА5РЕТ511АЕ>1-У
ЕЕСЕУЕОСЕАРЦСОЕСМСААкСАРРЗТРКАОЕИГСЗЕАРЕМЕЕААЕСЕУ^АОЕУрЕМРУССЕЕАрЕРЕЦЦУАЕКГГОРОЕА
Е
АОУ15А\УРП5ЕТУСАСКЗСАРАОЕ\УСЕЕЕАЕЕРАПЕУНЕОЕААКАОЕУ5ЕОРТУРЕКЕЕО5СЕАЕАКСОЕТЕаЕЕРАУКУЕС
ΟΑΡΑηΤ.ΟΓΕΟΕΟνΡΑηΐ.ην'Λ'ΚΥΓ,Χ'ΤνΑηΐ.ΚίνΕΟΤρί,ΑΡΙ.ΟΚΤ.ΕΐνΡΑΟΙ.ΑΑΙΓΕΆ'Γ,Ι,ΑνΚΙΡνΑΙΚνΑΡΙ.ΟνίΕΟΚΠ.ΑΙ.ν ννΕΟννΡΑΟΙΡΗΚΝΝΟΕΑΤΕΕνΕΡΕΤΡ (δΕζ) ΙΟ ΝΟ: 87) (полная длина - 355 АК; спейсеры составляют 19,5% длины).
2.1.3.3. Поли-СТЬ-конструкция со спейсерными последовательностями, оптимизирующими взаимодействие с ТАР и протеасомный и иммунопротеасомный процессинг
ΕΕΐνΟΕΕΕΑΕΑίΕνΤΑΓΡΥΑΟΕΥΙΪΑνΥΡΟϊΕΑνΚΙΡνΑΙΚνΑΟΕΡΕϋΝΥΑΕΑΟνννΗΥαντνΑλΥΟΕΕΕΑΕΕΡΑΟΙΡΗΚΝΝρΕ
АТ
ЕЕУЪРЕТРАГЛЖНСРАЕ\ТУАРЕОКЕК1УЕАЕ>ЕГ,)ЕМРУОСЕЕАГ>К1РО$ЕАТЕМЕЕААЕСК,Л,АГЛ.УНКГ>1.ААКАГЛ.Г>РР<>Е <ϊ νΤΑΟΑΡΙΚ5ΟΕΟΜΟΑΑΕρνΐΕΟΕΙΕΑνκνΕΟ5ΟΑΡΑΟΕΕΐνΕατρΕΑΕΟΑΡΡ8ΤΡΚΑΜΛ}ΕΤΕΕνΕΡΕΚΕΕΟ8ΟΕΑυ.νννΕα УУГЗП5АУУГ,|АКОЕ)ЕТЕОЕР.РАИИТ[>РОЕАКАЕААЕСК'Л'ОЕАО¥5Е[Я>ТУРЕТУСЛОССАКАКА5РЕТЯ11АГ>ЕУЕЕСа уизсеааеоеау'/масу (5Е<3 ГО ΝΟ: 88) (полная длина - 345 АК; спейсеры составляют 16,1% длины). Для 57 пептидов, отобранных с 5кратной избыточностью:
2.1.3.4. поли-СТЬ конструкция со спейсерными последовательностями, оптимизирующими взаимодействие с ТАР и протеасомный процессинг
ΓΚνΓ,ΕΙΧΑΕΑΓΟΡΕΑΙΧ2€νΑηΕΟΕΜΡΥΓ<Ι.ΕΑΟΥΚΡΕΡΤνΡΕΑνΚΙΡνΑΤκνΑς>ΕΓΡΕ>ΝΥΑΕΑηνν.'ί;ΥαντνΑ\νΓ,Ε1.ΙΑΕ цр
ΑΤνΟΑίΚΚΑΚΑΒΑννοΙΕΕΑΤΕΟαΕΟΙΪλνΑΟΚΤνΕαΕΕΚΕΚΑΟΕνΚΕΤίνΟΕΙΧΑΕΕΕΕΑΕΕΡΡαΑΚΕΕαΒΟΕΑΕΕνννΕΟνν
Р
5П5 А V νΟΠΕΕ V ννίΧΤν А! 18 А V УСТЕ ΑΙΚνΕΚΕΝΤΑΟΕνΟΕΤΕΕ УЕРЕАЬрУ] КОК П. АО V νΚΕΙ УГАРАШАКЦЕА Υ УМА ОУАИЕРЬОКЕКI νΚΑΡΕΚΠΌΕ'ϋΕΑΚΑΕΟΙϋ νθ_ΟΕΚΑΟΕ()Ε νς>Ο Υ УЕ1А1Л.НСРАЕ ντ Υ А УК УЕОКО АРАООМЕНЕЕЕУЕА ϋ
ΤΤΡνΤΟΑίΡΑΟΑΒΟνΤΑΟΡΥΑΟΕΥΠΪΑν.ΤΟΚΕΑΚΟΓτΕΤΙ.ΟΙ.ΡΡΑηΕΟΑΡΡ'ΟΤΚΑΠΤ.ΕΙΥΕΟΤΟΕΑΤΕΙ.νΡ.ΡΙ.ΤΡΑΠΑΡηΓ,η 1ΌΟΑΑΕΑΑΕ0ΚνιΌΕΑΙ>Ε0ΡΕ0Ε0νΡΑΟΑΕΕΟΝΥΑΕΑνΑ0ΙΑΚΟ3ΥΑΐυΡϋΕΑΗΕΕΕΕΑΑΕΓΕν.’ΑΟΕνΗΚΟΕΑΑΡΑΟΟ8 ΟΑΡΟΤ\ΎΑΚΟΟΕΝνΚΙΡνΑϋΕνβ5ΤΡιΈ5ΕΕΑηΕνΕΕ€Ρ.νΕΟΟΕ.ΑΟΚ]Ρ05ΕΑΓΕΑΕΟΕΐνθΕΕΕΑΟΙΠΙΚΝΝ<}ΕΑΟΕ5ΥΜΡΙ '№КРАОЕУО5СТЕУСИ-АЕАЗРЕТ511АОЕЕ1УЕСТ0ЕР (8ЕС) ГО ΝΟ: 89) (полная длина - 612 АК; спейсеры составляют 19,3% длины).
2.1.3.5. Поли-СТЬ конструкция со спейсерными последовательностями, оптимизирующими взаимодействие с ТАР и иммунопротеасомный процессинг
- 16 025280
ГГРУТСАЗРАРкЮТкОкРЗкРАРкУСКСТкУСРкМКУкКЕМТАРУЗЕРРГУРкМЕкААкСК'УАРкР.тЛ'СткккАккП.к’Л’У!.
СУАРкТУОкккА1кРАРкУИКРкААРАРкРУ№3¥СУТУАРкО15\УкОкРАРкУКУ<ЗЕТЕкУЕРкТРЕСкАКкк11ЕкО30кА кА
ПЗАУУО1кАРСгеАР0СУАРкУКУСР^Ок1кАк18АУУС1ккСНеАРОТУУАРкЗУМРИУКРАРкУЕЕСКУк0акСУУКРУ
РАРАРкАГЕРМУАкАУАРкК1Р03кАРкА5СУТАСРУАРкУКУ<ЗкМРУССккААКРЕАУУМАСУАРкУКкНСРАкУТУАУ κν кСЗОАРАРизге<Зк<ЗУГАРкИУЕСТркРАРкУРЗТРУК5ккАРСЕНкКЕУКАРкК1УКСТркАТУСАООСАРАРкААкСК \УОкАРкрКкК1УКАРкрУ1КСК1кАкУУУкОУУРАР1РНК№1СкАТк0СкС15\УАркРЕРКУАкА11ОРкТкСкЕРААКРОЕ
N
УЫРУАРкУАкСК1УСкккАккАккРРСААКСАРРЗТРКАРкК1ТРРОкАРАРС1АКСМ5УАРАРСЮРкМООААУК1РУА[К УАЕАЗРкТ811АРк0ЕУ0ОУ\Л,1АРУТЗАУ/РР8к5П5ЛУУО1АТЕкУЕРкТР(5Е0 Ιϋ ΝΟ: 90) (полная длина - 627 АК; спейсеры составляют 22,2% длины).
2.1.3.6. Поли-СТЬ конструкция со спейсерными последовательностями, оптимизирующими взаимодействие с ТАР и протеасомный и иммунопротеасомный процессинг
СЮУОкккАЫЗ А V УС1ккАРСРЕАРрС УАРкОЕТЕкУЕРЬТРЕСк АКккКЕкОЗОкАккУУУкС V УЕЗНЗ А V УОШ I V УУ ко V ΑΙ13 АУ УСВЦСЗСАГСТУУ ΑΙΚ УкКККТАОкК! УЕОТОкЕАОк V КкНСР АкУТУ А V К УкСЗС АГАРСМЕНкКЕУРАРУ! ЗА\УРР5кАкСЮТОкккАУК1РУА1КУАкААкСЮТОкАРТТРУТСАЗРАИЮАРРЗТЕКАРкУ8ЕРРГУРкАЕРаРкСМСАк к
ΑΙΧΡΡΟΑΑΚΡΟΕΝνΚΙΡνΑΡΕνΡ8ΤΈΥΡ511ΑΡ08επ.ν€ΡΕΕΕΑΑ1Χ:κνΑΡ8\νΕαΕΚ3ίΡΑΡΕνΡΕρΜ.ΐυνΡΑΡΕΚΙΤΡ ГОЬАКАкО! 3\УкС.1.Е АПкрР. УрО Υ Ук1 АРИЕОЗкАЕк АЗСУТАСРУ АРкКАЗРкТЗН АОк УЕЕСК УкООкААКРЕАУ УМА СУАПкКгУОкккАккОУУКОУТАРАОкОкМР¥ССкк.'иЭкрРЕркрУТАОкЕ1УКОТркАр1АКС5У.гЩ'ЛУ5УОУТУАУ/Ск к
кА1ХРАТУСАСССАКАриЪРИУАкАКСРкТ1ХгкЕРАР1РНК№ЮкАТЕкУЕРкТРАРкУНКРкААРАРАРЕРУАкАУА
ЬЗ
УЖОИкАТкоОкОк^УАИкзумрИУКЕ (5Еф Ιϋ ΝΟ: 91) (полная длина - 602 АК; спейсеры составляют 17,3% длины).
Применение вырожденной спейсерной последовательности.
2.1.3.7. Перед отбором спейсерных последовательностей для оптимального протеасомного процессинга 57 отобранных эпитопов проводили отбор спейсеров, оптимальных для взаимодействия с ТАР. Набор оптимизировали для минимизации числа избыточных эпитопов и получения максимального числа взаимодействующих аллелей ГКГС I с сохранением спейсерных последовательностей минимального размера как предпочтительные
ТУСАООСАРАРСМЕНкКБУРАРОКЕЕСКУкООкАРОКЕкСЗОкАкРОкЕЕРИУАкЗРООЕТЕкУЕРкРкУУУкОУУРАКР
СЕ
Г-1УНРУАккАЦ.РРСААОЕУООУУк1РГЯ.АКОРкП.01.ЕРА1КУ1КЕМТАРАРПОРкСМСАРПАКАКРЕА¥УМАСУАР1ГН
К
ΝΝΡΕ АV К УкСЗС АРАТк0СкС15 IVА1АРСРЕ А РОС УРРкКЬЗ УМИХУКРАРкКРкОЕЦЦУЕΑ1Ι5 АУУС1кМЕкААкС ЮТА
ТОУУКРУГАЕАРкУК1РУА1КУ3113АУУ01Р15АУУСЦХПкОРЕОкОУГАРСКУЗЕРРТУРкАРМ01АКОМ5УАКОАРР
ЗТРКАРкОУ1ЕОКГкРРСРАЗИ.ТЗПАРкУНЕРкААРАР5\УкОкК5кКАРОКкО131|УкакРАРСУК1ТРРСкАКАТРГСкА
КккРРОРЗТЕУК5ккА1ккУУУкСУАРТТРУТОА5РКРкК1УКОТОкАТЕкУЕРкТРРРкКАЗСУТАСРУР1кААкСЮТСкА
РАГЕРКУАкАУА1РУ1У8УОУТУА№ОЦХАккРКРАКОШРУССккА1К1ГОЗкАРкАкСЮТОкккКРОК1УКОТОкРАРкУ
С
5ОАРСТУЛ'АРССЗСТкУСР1.РРСУ18А\УРС)5кКР1РСРАкУТУА|.кУСК^,С1.П..АкКУ/С1.1.1Акк (5Е<) ГО ΝΟ: 92) (полная длина - 639 АК со спейсерными последовательностями, занимающими 22% от общей длины; в этой конструкции, с выбранной строгостью протеасомного фильтра, 29 избыточных эпитопов были предсказаны, сохраняя все предсказанные эпитопы; спейсерные последовательности подчеркнуты).
2.1.3.8. Перед отбором спейсерных последовательностей для оптимального протеасомного процессинга из 34 отобранных перекрывающихся эпитопов был проведен отбор спейсеров, оптимальных для взаимодействия с ТАР. Набор был оптимизирован, чтобы свести к минимуму число избыточных эпитопов и максимизировать число взаимодействующих аллелей ГКГС I
МЕкААкСКЖЗЫ±.АккРРОАРРОЕЫУК]РУА]КУкКЕМТАРСКЕЕСКУкООкРРОКУ8ЕРРТУРкРРРЕАУУМАОУАРкК
ТЕкУЕРкТРРРОКА8РкТ5113АУУО1ккУУУкОУУЕРРАОМЕНкКЕУКАРОКР[ГНК1ЧИОкРРкОРЕОкОУГКРАОЕУООУ У1.|ГТЯ.АИ)О1Я.СМОАРМ.ОУ1КСЦ|1.Г*Г)УК VI ДЗОАГОТУУРЮП! II ОкЕРРРкКА8СУТАСРУАТЕОО1 О18\УкС,1 КЗЬ ν КЕкОЗСкАкРМ01АКОМ5УАкРС[ЕАРОСУРРкКкЗУМРПУКГАРкКИДКкК1УКСТОкЕЕРИУАкАУАКОАРРЗТЕКАС 5 УКРУТ АГКРкУК]ТРГОкАКки,кУНКРкААКАРУ1>УЗУСУТУКРТГРУТСАЗРКРкУ(5А\УРР8кКТУСАОССАКЗРЫРС кАРкРРкнсРАкУТУАРРЗттукзккдрококМРУСсккАВСсясткУСРк (ЗЕО ГО ΝΟ: 93)
- 17 025280 (полная длина - 461 АК со спейсерными последовательностями, составляющими 22% от общей длины, в этой конструкции с выбранной строгостью протеасомного фильтра 18 изначально выбранных эпитопов не предсказываются, но только 9 избыточных эпитопов не присутствуют в ЕгЬВ2; с минимальной строгостью протеасомного фильтра только 7 первоначально выбранных эпитопов не предсказываются, но число избыточных эпитопов увеличивается до 106; спейсерные последовательности подчеркнуты).
2.2. Аллель-специфичные СТЬ-эпитопы.
2.2.1. Таблица выбранных аллель-специфичных эпитопов и полиэпитопных конструкций.
| НЬА аллель | Пептиды | Пример полн-СТ!,-конструкции(й) |
| А*0101 | ЬТС5РОРЕУ, ОЗОАРОТУУ, ΕΟΑΟδϋνΡϋ. УКОРРРСУА. ΓΙϋνΥΜΙΜν. УСУППУЕЬМ. ΙΧΪΕΝνΚΙΡν, ΙΧΟΙϋΕΤΕΥ, ΟδϋνχνδΥον, ньпмькньу. ΏΟΡΡΑδΝΤΑ, ΝΑδίδΗΧΟ, ЕМЗОЬОМСАА, Ρ5ΡΑΡΟΝ1Λ, ϋδΤΡΎΚδΕΕ, ^СИЬДЬБР, ΥδΕΟΡΤνΡΕ. ЕНСРАЬУТУ, ΕΓΤΟΥΕΥΙ5, ϋϋϋΜΟΟΕνΠ, Н5Е>СЬАСЬН, ΟΙΠΕΓΕΥΗΑ (δΕ<? 1Ε> ΝΟ 3: _94, 58,95,96,97. 98,77,99.100,101,102,103,104, №5, 70. 24, 53, 38,106,107,108, и 109, соответственно) | \УОЕЕЕаЮР-ЕФА-У8ЕЕЕЧУРЕ-А1}10ЕГЕ¥НА-РОЕК- ΑΚΕΕ0Α<38ϋνΡϋ.ΑΥσντν3νΕΕΜ-ΑΕ(3Κ-ΑΚΙ>Ι>0ϋΜ00Ενϋ. ΕΙΟΚ-ΑΕΙΤΟΥΕΥΙδ-ΑΙΧΪΚ'ΗΕΟΜΕΚΗΕΥ-ΑϋΕΚ* АНЗЕХХАСЕН'АО'ЕТСЗРРРБУ'АОЕК-^ЗОЗТУЗУОУ’АО- АУКОРРРСУА-РРЕ-АЕСООЕОМСАА-ИАК-ЕЕОЮБГЕУ- Αϋ-ΑΚΕΗ3ΏΡΑ5ΝΤΑ·ΑΪ-ΑΚΠθΕΝ\ΓΚΙΡν-Α1Χ- ΟδΟΑΡΟΤνΎ-Ρϋ-ΝΑδίδΡΕςϋ-ΡΕΕΚ-ΕΗΕΡΑΕνΤΥ-ΑΏ- Ι35ΤπΥΚδΕΕ-ΑΟΕ-Ρ5ΡΑΡϋΝΕΥ-ΑΙΕΚ-Τ1Ο\ΎΜΙΜν (ЗЕО ΙΟ МО: 110) |
| А*0201 | ихАЫРРО, теоеауума» ΙΕΗΝΟΑΥδί. КШ5ЕТЕЬУ, СКУУСШ-АЬ. ΤΙϋνΥΜΙΜν. \αΜνκον/Μΐ, ьуоаёеуьу, ΚΙΛΉΙΦΕΑΑ. АЕСРЖЗЕЩ ИЬЛУСЬК^А. ΑΕΙΗΗΝΤΗΕ, ИАЕЕРРОА. ΟΕΡΕΟΝΥΑΕ, ΑννΟΙΙΧλν, ΚΙΡΟδίΑΡΕ, фЕМРУОСЕЕ, ΡΕϋΝΥΑΕΑν, νντοννΡΟΕ ПХУУУЬОУ, δΙΙδΑννσΐ, 5ΕΤΕΟΟΕΟΙ. ΥΙδΑΥ/ΡΟδί (δΕφΙΟΝΟ: 111, 112,113, 114, 21,97, 115,116,117,74,118,119, 57,27, 120,31,43,55,12 1,66,37, 122 в 28, соответственно) | Вйртгошп 1: ΤΙΕνΥΤνΓΙΜν-ΡϋΕΚ-ΟΚν/ϋΕΕΕΑΕ-Α- ЕЕАЬЕРРОА-.АГИЗ-АШЗЕАУЗТЧА-АЕШНМТНЕ-РОЕ- ΚΕΫΗΙΦΙΑΑΛΧίΑΙΙ,ΡΡΟ-ΑϋΟΚ-ςΕΡΕΟΝΥΑΕ-Ρ- ΙΕΗΝΟΑΥδΕ-Ρ-δΕΓίΟΟΕΟΓ-Β-ΕνϋΑΕΕΥΕν.β- ΙΕΕνννΕθν·ΑΠΑ-5ΙΙ8ΑννθΙ-Α-ίΙΕΕ<^ΤΕΕν·ΑΟ· ΑΡΕΟΝΎΑΕΑν-Αννθ1ΕΕνν-Α-ν\ΤΌννΚΉ-ΑΌ- ΑίΙΛ^νΕΜρίΑ-ΑΟΕν-ΑΕεκν/ΟΙΧΕ-ΑϋΛΊδΑν/ΡΟδΕ-ΚΙΗ К1РО5ЕАРЬ1ФЕ-^ЕМРУСХ:1Х-АОС-М1МУКС%ГМ1 (5Εζ)ΙϋΝΟ: 123) Вариант 2: МЕЕААЕСКЖ31ЛХАЕЕРРСАРРПЕЕАЕ1ДТСАРОАТЕЕЕ1ТС ΥΕΑΤΕΕΕΑΥνΜ.<\ΡΙΕΗΝ0ΑΥδΕΙ^ΕΡΕΕΝΥΑΕ5 I ΙδΑννΟίΑ ςυΗΡΥίΚΧΕΚΕΕλννΕΟννΚΠΕςΕΙΙδΕΤΈΙΑΙΕΕνννΕΟνΡΟ ΑννΟΙΕΕννΑΟΑΕΓΚΥ/ΟΕΕΕΑΠΥίδΑλνΡΒδΕβΟΚΙΡΟδΕΑΡΕ (8ΕΟ1Ι3ΝΟ: 124) |
| АЮ202 | СЕТ5ТУ<ЗЬУ, ΙίΟΕΑΥΥΜΑ, Π.ΗΝΟΑΥ5Ε, СНАКОМЗУЬ, РСАКУСУСЬ, ЕЕЬрЕТЕЕУ. КН51ХХАСЕ, ΜΙΆίνΚΟνΥΜΙ, КУ/ОЕЕЕАЩ ΤΥΕΡΤΝΑ5Ε. ЬУОАЕЕУЕУ, 5ЕРОЕ5\Т<}, ΡΚΝΡΗΟΑΕΕ. ΤΕΕΕ1ΤΟΥΕ. ОЕУОАЕЕУЬ. ΑΕΙΗΗΝΤΗΕ. ΟΕΡΕϋΝΥΑΕ, А¥5ЬТЕ0ОЕ, | ЕУР00ОЕГС*АОЬУ.рСАКУСУеЕ-РСЕК-КНЗС»СЕАСЕ= АТЕЕЕ1Т(1УЬ-А-ТЕ5РСЮЧОУ-РОЕ-ОЕ\Т)АЕЕУЬ-Р- Ι1ΉΝΟΑΥ5Ε-Α-5ΕΡΟΕ5νΤ^-ΚΟ·ρΐΑΚΟΜ8ΥΕ· ашэеауума-аыннктнь-ад-.'^рсреаоосу-кгьк- ΕνΟΑΕΕΥΕν-Α-φΕΡΕΟΝΥΑΕ-δΙ ΙδΑννΟΕΑΏΟ- ΤΉ^^Μ^кΗ^-ΑС^ΤδΤV^^V.Α^Сτ-ΡΚNΡΗ^Α^^-.Α^^- ΚΕΕΟΕΤΕΕν,ΑΟΕ-ΚΙΡαδΙΑΡΕ-Α-ΥΙ5Α'ΎΡΟδΕ-Μ>- ΑΥ5ΕΤΤ0ΟΕ-1ΦΕ-ΤΥΕΡΤΝΑ5Ε-5ΟΑ-Κ\νθΙΓΕΑΕΕ-Α- 0ШРУОСЕЬАГХЗ-М1МУКС\УМ1 |
- 18 025280
| юрозеарб, рьмруссьи ΥΙ5Α\νΡΟ5Ε, РОРЕАПОСУ, ЬУРОООРРС, δΙΚΑννΟΙ, ТНЬОМЕКНЦ ΤΈΒΡΟΚΝΟν (δΕφΙϋΝΟ: 125, 112. 123,115, 54.129,116,130.131,132,133. 119, 27.134,31,43,28.67,135, 37,136 н 137, соответственно) | (5Ε9ΙΠΝΟ: 138} | |
| А*0203 | ΗΥΚΟΡΡΡϋν. СЕТЗТУОЕУ, ΥΙ,ΤΡΟΟΟΑΑ, 91ΑΚΟΜ5ΥΕ, ЗЕКЕЬСЗОЬ, НЕУОСС^УУ, М1МУКС\¥М1, РБТ3115АУ, ργνκκυ,οι, ΡΚΝΡΗ<2ΑΕΕ, ΚΑ5ΡΕΤ5ΙΙ, ΚίνννΕαν, Ш№СМ<31А. АиНННТНЬ. 1ХАБЕРРОА, Ι9ΝΕΡ1.ΟΡΑ, К1РО5ЕАРБ, УЕЗТОУСЗС, (^ЕМРУОСЬБ, ίχνννίΧϊνν, ΤίδΡΟΚΝΟν, ΒΙΒΑννΟΙ, 8ЕТЕ0ОБО1, ΥΙχ4\νΡΟ5Ε (δΕζΙίΟΝΟ: 139,125, 140,126, 141,142, 115, 143,144, 131,35, 66,118.119,57, 145, 31, 146, 43, 147,137,37, 122и28_, соответственно) | НУКОРРРСУ-АЮК-А^ЖОЕСРА-КОЕ-фАКСМЗУБ-А- ΤίΒΡΟΚΝΟν-ΒΟΈΕΑΕΕΡΡΟΑ-ΑΟΟ’ΡΥνδΚΙΧΟί’ ΑΥΕ3Τϋνθ5€-Αϋ-ΙΕΕνννΕθν^ΑΕ>Α-5115Αννθί-Αθ- КЕКЕБСЗСЕ-РТО-КАЗРЕТЗ! 1-А-ЬЕУУУЕОУУ-КОЕ- ΑΪΧΤΡ9ΟΟΑΑ-ΑΕΙΗΗΝΤΗΕ-ΑΟ-ΑΚΡΕΤ5 I ВАУ-АОЕ- РИЧРН9АЕЕ- АООК-КГРОБЬАРЕ-.АШМ \УСМр! А-АОБК- АСЕТЗТУОЕУ-АОО-У^АТОРОЗЕ-А-НБУОССОУУ-АОЕ- 8ΕΓΕ0ΟΕΟΙ -Αη-91.ΜΡΥΟΕ1,1-ΑΓ>Ω-ΜΙΜνΚΓν»7ν|] (5Ε<3ΙϋΝΟ: 148) |
| А*0206 | РУРЕТЕЕЕЕ БСД-КбЕТЕ!, ΥνΈΙΑΗΝί^ν. О1АКСМ5¥Ь ΕΕνννΕΰνν, РИОЕТРЬУ. СКЛУОББЕАБ, ΤΙϋνΥΜΙΜν, М1МУКСТСМ1, ЕААБСЕ^ОЕ, АУИХЧСОРЕ. РЮЧРНфАЕБ, КА5РБТ5И, ΑΕ1ΗΗΝΤΗΕ, ηνΤΡϋΟΕΝν, ΤΟΕΕΕΟΝΥΑ. ЗАУУООЛ-У, ΪΟΝΕΟΕΟΡΑ, ΑννΟΙίΕνν, К1Ю5БАЩ 912ЛРУОСЕЕ, νΚΙΡνΑΙΚν, УУБСУУРО!, ΙΕΕΥννΕΟν, 5И5АУУО1 (8Ε9ΙΟΝΟ: 149,150, 151,126, 147, 114.21,97,115,22,152, 131. 35,119.153,154,155.145,120, 31,43,42,121,66 а 37, соответственно) | ΟΚν/ΟΕΙΕΑΕ-Ρϋ-ΑΐςιΝΕΟΕΟΡΑ-ΑνΕΟΝΟΟΡΕ- Ευ^ΕΤΕΕ ν·ΑΙΧΪ-ΡΚΝΡΗ9ΑΕΕ- РОБКО νΤΕΠΈΕΙ-ΡΟ- 9ΐΑΚΟΜ8ΥΕ-ΡΟ-ννΕθννΡ01 -ΑΟΑ^ΕΓΕΟΝΥΑ-ΑΓ>- АУУОИЛУУ-АО-КАЗРЬТЗ И -А-ЕЕУУУЕОУУ-ЫЭ- ЕОЕКЗЕТЕЬА-П-ЕУУУБСУ-АОА-ЗЦЗАУУСЬРО- ΥΥΕΙ ΑΗΝ^ν- ΑΟ- νΚΙΡΥΑϊ Κν»ΑΕϊΗΚΝΤΗΕ^Α- ЕААЕСКтеЕ.А-5АУУС1ЕЕУ.АОСК-К1РС5ЕАРЕ-А- №ΙΡ00Ε14ν-Α0-ΤΙ0νΥΜΙΜν-9ΕΜΡΥσ€ΕΕ-Α0σ· МТМУКСТМ1 (8Ε910ΝΟ: 156) |
| А*0301 | ίΑΑΚΝνΕνΚ, ννρΟΙΕΙΚΚ ΤΜΑΟνΟΒΡΥ, ΚΙΕΗΝΟΑΥ8, υΧΑίΕΡΡΟ, ΤΡΥΚ5ΕΕΕΙ}, УУУЬСУУРС, 9ЬУ1'9ЬМР¥, ΟΙΕ1 \'УУЕ<1, ΕΗ ΙΎΙ,ΡΤΝ. ΕνΚίΡΝΗνΚ, ΕΙΛίΤΡΓτΑΚΡ, ΤνΛΈΕΜΤΓΟ. ΥΕΥΙ5ΑΝΨΟ, 1БКЕТЕ1_КК. ΥΤΜΚΚΙΕ9Ε К5ЕТЕ1ЕКС. СУУРСХ1К. | ΕνΝ€59ΡΕΚ-Α0-ΕνΚ3ΡΝΗνΚ-Α-ΧΚΕΤΕΙΚΚ·Κ0ΕΚ- ΑΜΕΗΝ0ΑΥ8-ΑΟ43ννΡ0ϊΕΐΚ-Α00-ΑΕΕΜΤΡ0ΑΚΡ- ΡΟΟΚ-ΕΕΕΓΥΕΡΓΝΛΙ.ϋΚ-ΚΙΚΚΥΤΜΚΚΆΟίν- ЬЕКРКТЕВР'А-УЕКЕМТБРК-А-ЫХАЕЕРРС-АООК’ Κ8ΕΤΕΙΕΚΟ-ΑΕΕΗΤΑΝΚΡ-Α- ΪΕΪΚΚΚ<Κ>Κ-ΑΟΟΚ- ΑΟΙΕΕνννΕΟ-ΡΟΟΚ-ΤννΥΕΙΛΙΤΪΌ-Α- ΙΕΝΥΚΟίΡΗΚ- ΑΟΟΚ-ΚσΑΡΡδΤΡΚ-ΑΟΕ-ΡΕνΤΟΕΜΡΥ-Α-νννΕΟννΡΟ- ΡΟ-νΜΑΟνΟδΡΥ-ΑΙΕΚ-ΕΑΑΚΝνΕνΚ-ΑΟΕ-ΥΤΜΓίΚΕΙΛ^- ΑΠσΚ·ΤΡΥΡ5ΕΕΕΟ-ΚΟ-1ΑΤσΐΕΙΚΚ-Α·ΕΑΡΕΡΈ5ΡΟ-Α- |
- 19 025280
| УЕЕЕГЧТЗРК, СУМСЗОРБЕ, ШКЕЕООК, ЕЕЕГКП НГ, ΜΤΡΟΑΚΡΥΟ, АЬЬНГ.АЯЕР, ΚΙΚΚΥΓΜΚΕ, К0АРР5ТРК, ПЛУКГЛРНК. ЬАРЬРЕЗРЕ) (5Е<3 ΙΟ ΝΟ: ,.,157,158, 159,160, 111, 161,162,163,164, 165,166, 167,168,169,170,171,172,173, 174, 175, 176, 177,178, 179,180, 36,181 и 182,соответственво) | ΥΕΥΙδΑλΥΡΟ.ΑΟ-ΜΤΡΟΑΚΡΥΟ (8ΕΟ ΙΟ ΜΟ: 133) | |
| А*2301 | νΥΜΙΜνκσίν, οντνδγοντν. Κν/ΟίΓΓΛΕΕ. О1РНК№4{ЗЬ, 5Υθντ™ΕΕ, ММУКСтеМЬ ЕУЬУРООСР, ΤΥΈΡΤΝΑ3Ε, ΕΥΗΑΟΟΌΚν, ГАЧРОСЕЫУ. ΥΟντνννΕΙ.Μ, (^ΙΕΕΟΝΥΑΕ, КРКЕЬУЗЕР, ΕΥνΝ АЕНСЕ, КХУМАЕЕЗΙΕ. РЬЕЕКОЕЕЬ, Ι^ΥΜΡίν,'ΚΙ ΕΚ]νκυΤ<^Ι_, ννΖ8Υθντ™. ΐυ,νννΕΟν, Οί?νΝ<Ξ5ρΡΙ_, ЕААЬСЕУ/ОЬ (5Ε(2 ΙΟ ΝΟ: _184,30.54,45, 185, 115,186,129,187, 153,98, 27, 188,189,190, 191,62,39, 192. 66,193 β 22, соответственно) | ΕνΟΕΕΕΑΙΧ-Α-ΕΥνΝΑΕΗΟΕ-Ε-Μ,ΕΕΚΟΕΕΕ- ΑΕΥΗΑΟΟΟΚν-5-Ο1ΡΗΚΝΝ0Ε-Α43ΕΡΕΟΝΥΑΕ-Ρ- ΕΑΑΕΑ'ΚννΟΕ-ΑΙ -ΑΥοντννΈΕΜ-Αΐ -ешукотоб- ΙΕΕνννΕθν-ΑθΑ-ΤΥΕΡΤΝΑ8Ε-Α- ΙΥ/ΙΡΟΟΕΝνΚΕΕ- ν^5Υθντνλν-ΑΕΈΥΕνΡΟΟΟΡ-ΑϋΕΚ-ϋν\ν5Υθντν- ИЗЕК-КРКЕЕУКЕР-РОБК-ЕЗУМРГ^КР-АОЕ- δΥΟντνλνΕΕ-ΑΟΑ-ΟΟνΝΟδΟΕΕ-ΑΟΑΚ-νΥΜΙΜνΚΟ1^- А1ЕК-К\УМА1£51Е-А1-М1МУКСТ/М1 Ϊ5Ε<3ΙΟΝΟ; 194) |
| А*2402 | νΥΜίΜνκαν, Ενννταννρ, ΤΕ0ΟΙΧ3ΙΚ\ν, 8ΥΟντν™υ, ΕΥΤ. ν?<30ΟΕ 3ΕΑΡΕΡΕ3Ρ, ТУЬРТЫАЗЕ, ΡΥν5ΕΠΧ31, К1\'КСТ<Д.Р, №ΙΡΟΟΕΝV. Κ\νσΐ.Ι.ΐ ΑΪ.Τ., Κ\νΜΑΙ Ε3ΐΙ-, ΟΕΕΕΚϋΕΕΓ. ОШРУССЬЬ, ν\ν5Υ0ντν\ν, ΑννΟΪΙχνν, А^ТОЗБРОЕ (8Ε<3 ΙΟ ΝΟ: 184, 25, 68,18,186, 195, 129. 144.75, 153,54,190, 191,43,192, 120 η 196_, соответственно) | А\\ТО5ЕРОЕ-ОГЕЕК0ЕЕЕ-ЕЕС-РУ\г5КЕЕ01 -ΡΟΕ- ΤΜ3ΟΕΟΙ5ϊν-Α-5Ε ΑΡΕΡΕ8Ρ-ΡΟΟΚ-Α ννΟΙίΕνν -ΕΤ- ΕνννΕθννΕ-Α-ΠνΐΡΒΟΕΝν-ΕΕΕ-ν^5Υθντν\ν-ΑΕ- Е¥БУР0(ХЗР-АОЕК<)ШР¥ССЕЕ-АО-ЙУОУТУ)УЕЕ-АОЕ- ΤΎΕΡΤΝΑδΕ-Α-ΕΐνΕΟΤΟΕΡ-ΚλνΟΕΕΕΑΕΕ-Α- Κ3ΥΜΑΕΕ3ΐΕ-ΑΙθν-νΥΜΙΜνΚΟ« (5Ε9ΙΟΝΟ: 197) |
| А*2403 | νΥΜΙΜνΚΟΥ, ΓΥΕΝΕΕΕΟΟ, СУОЕСМЕНБ. 1,0ОШ13\\Ъ, ΪΕΟΑΟΒΟνρ, 5ΥθνΤνΛΈΓ, ΕΥΙΛΤ^ΟΟΓ, Ι^ΡΕζΙΙ^νΓ, ΤΥΈΡΤΝΑ5Ε, ΚΜΑΚΟΡζϊΕΡ, νΓνλνΕΙΜΓΡ, УЬУРОООРР, ΕλνουΧΑυ,, ΗΝΟΑΥδΕΠ,, ОЕСЕАСН0Е. КЕКЕБУЗЕР, ΕΥΥΝΑΚΗΟΕ, К%ЫАЕЕ51Ь, ΡΟίΝίΧ^νίΕΟ, АУЗЬТЬОСЬ, νλνΒΥΟντννν. ΕΡΤΗΟΕΟλΑΥ, ΡΝΗΒΟΙΟΕΕ, νΚΟΤΟΕΡΕΟ, А%ТЧ>ЗЬРОЬ | ΡΜΑΕΓ)ΡρΕΐ-Αθ-ΑνΕΟΤ(511·Μ7-ΚΓΜ.ΟΡΡΛ>Ι.φνΡΑίΧ}- ΕΥνΝ АКНСБ-АО А-Е^ОЕББАЕБ-А5ЕОАС50 УР- АОЕОЕАСН(}Е-РОЕК-ЕООЕО]$\УЕ-А1 -5Υθντν5νΕΕ-ΑΟ- А^РОЗБРОБ- ΡΕ-ΕΥΕνΡ00ΟΕ-ΑθΟΚ-ΗΝθΑΥ5ΕΤΕ- ΑΡΝΗ50Ι0ΕΕ-Α-ΥΕνΡ00ΟΨ-Α00ν-ΑΥ5ΕΤΕ00Ε- РОБК-КРКЕБУ5ЕР-АООК-АСУОБОМЕНБ-АБ- νΐν5Υθντν^-ΑΙ -ΑΡ9ΝΕςνΐΕΟ-ΑΟΟ-νΤ™ΕΕΜ1Ε- ΑΟΟΚ-ΑΡΥΕ3ΕΕΕΟΟ-ΚΟΕ-ΤΥΕΡΤΝΑ3Ε-ΑΙ’ УУМ1МУКСТ-А1ЕК-К\УМАЕЕ5 1Б-АО-КРТНОЗОТО (ΚΕφΙΟΝΟ: 211) |
- 20 025280
| 5Е<310 ΝΟ: 184.198.199, 200. 201, 185,186,41,129, 202.203, 204,54,205.206,188,189,190, 207, 134,192,208,209.210 в 196 , соответственно) | ||
| А*2601 | 5ЬКЕЬС5Ои 18иЪСЬК5Ц СКЛУОиХАЬ, ΕΤΣΕΕΠΌΥ, ЬфРЕфЬСЛТ, УТУХУЕЕМТР. ОТПЛДЖОПч НТУ1ЧА'1Х2И·. ЮЕЬНСРАЕ, уякееспсе, АЕСКТОШ. ςΕΡΕϋΝΥΑΕ, ОУИХЗПЬСМ, ЕТНЬОМЫШ, ПМДЭЬСМСА. КУР1К\УМАЦ ΠΕΑΥνΜΑΟν, ίΤΙΡνΥΜΙΜ, ТЕП.КОПУТ.. φΙ.νΤΟΙ.ΜΡΥ, 5Η5ΑννθΙ, ΡΕΟΝΥΑΣΑν {5Ε9ΙΟΝΟ: 141,212, 21,213,41,203,214, 215,216.217.74.27. 218,219.32,220.50, 221,222.163,223, 37 в 55 , соответственно) | СТ1 ΟνΥΜΙΜ- И -ΙΟΕΕΗΓΡΑΕ-Α-ΟΕντρΕΜΡΥ-ΑΟΟ- УЙКЬНЛСЬ-АЬСР.'Л'СтЕЕЕ РОЬК-АЕОЕАУУМАСУ-АО- ΕΠΕΕΙΤί;ϊΥΑ-ΙΕΙΕΚϋσνΕ·Ρ-<^υΕΟΝΥ;\ΕΡΓ)- 1^РЕ0Ь0УР-АО-КУР1К№МАЕ-5 II 5АХУО1 -ΕΟ- ОТ1Ь\УКБ1Р-АЕОУ-АЕТН1Л>МЕЕН*А-ОУШОСЬОМ- РОЬК-5ЬЕЕЬО5СЕ-5ГУрЬУТ9Е-РЬеК- 15ΨΕΟΕΡ5Ε~ АРЕЮОЕСМСА-АП-СЕЖШХАЕ- РО-УТУ\УЕЕМТР-АЕЮК- АЕЕБМУАЬАУ^КОЕК-НТУРТО9ЬР (5Ε91ΟΝΟ: 224) |
| А*2902 | ην^δΥΟντν, ЕТСЗРфРЕУ, ОЗСАРОТУУ, 1СЬТ5ТУ(Э1_, УМАСУОЗРУ, О1ГНКМЯ0Ь, УЕЕОУКЕУН, ΤΗ05θνλ¥3 Υ, οτνγκαηνι. ετςεειτόυ. ОУУИЛТАЕ 3ΜΡΝΡΕΟΕΥ, ΟΤ^ΕΡΕΟΝΥ, УСТСТОМКЬ, ΜΟΙΑΚΟΜ5Υ, ΗΤνρν,ΤΧΠ.Ρ, ΕΕΕΙΤΟΥΣΥ, ЕЕУНГСГЛ.АА, ЬУУУЬСУУР, ΕΜΤΡΟΑΚΡΥ, НЬОМЬЕНЬУ, <3 ννΟΟΝΕΕΕ, 5ЕТЕ0СЬО1, δΡΑΡΌΝΣΥΥ, ΡδΡΑΡΟΝΣΥ, РССЬКЕМ^Е, ЬНСРАЬУТУ, ϋνΤΑΟΡΥΝΥ, МЗУЬЕОУКЬ (3Κ3 ΙΟ ΝΟ: 30.94,58,225.159, 45,226. 227. 228.213. 63, 229, 230,231.61.215,232,117.25, 233,101,234,122,235.105.236, 38,237, и 238 , соответственно) | 1ЛСРАЬУТУ-8О-ЕТС8Р0те¥-АОЕ-КЬУНК1>ЬАА-АЕа- Η1Ί>ΜΕΕΗΕΥ-Αϋ-ΕνννΕθννΡ-ΡΙΧ3Κ-ϋΙΡΗΚΝΝρΕ,Αϋ- ΕΕΚΤΌΥΕΥ-ΑΟ^ννΚϋνΡΑΡ·ΑΡ·ΑΕΡσθΕΚΕΕ<3Ε-Αϋ- ΕΠΈΕΠΌΥΑΙΕ,^Ήίϊδϋν^Υ-ΑΟ-ΑΥΕΕΟνΚΕνΗ- ΡΟΕΚ-0νν0ΟΝΕΕΕ-ΑΙ-Ο5ΟΑΡΟΤνΥ-ΕΕ-\'ΜΑθνθ5ΡΥ- ΑΙΕΚ4Λ1ΤΊΌΑΚΡΎ’ΑΟ-ΟΤ0Ι_ΡΕΟΝΥ-ΑΙΧϊΚ- ΕνΤΑΕΡΥΝΥ-ΑΤΧϊ-ΟΤνγκσΤ\νϊ·ΑϋΕ·5ΜΡΝΡΕΟΕΥ- АПЕК-НТУРТО9ЕР-АОЕК-5ЕТЬ0ОЕО1-АО- Μ9ΙΑΚΟΜ5Υ-Α-ΙΕΕΤ8Τνς>Ε-50-θνν/5Υθντν-ΡΟΕΚ- Μ3ΥΕΕ0νΕΕ-ΕΕ>-ν€Τ0Τ0ΜΚΕ-Α0-Ρ5ΡΑΗ>ΝΕΥ-ΑΙΕ- ЗРАНЖЬУУ (5Ε<3ΙΟΝΟ: 239) |
| А*3001 | НУКОРРРСУ, ООКУРЮТМ, Е5ЯАСНРС5. ΗνΕΕΝΕΟΕΣ, МАЙПРОЕРУ, ΑΑΚΝ νί.νΚίχ 1.νΚ5ΡΝΗνΚ, ТфКСЕКСЗК, Ь<;>ЕЬК1УКО, ЗТРКОТРТА, КЬЕЬРА5РЕ. ΥΣΥΙδΑΤΥΡΟ, КЕЕ0ОК1ЕК, ΚΕΤΗ,ΕΚνΚ, ΝΥΚΙΡΥΑΙΚ, ЕРКТГ5РСК, ΚΙΡΟ5ΕΑΡΕ, УАЕСРЗСУК, | ΚΙΕΚΥΓΜΕΕ-Α-ΥΕΥΙδΑ^Τϋ-ЕУКЗИЧНУК-РИЖ- КУКУ1ХЗЗОА-РООКЕТЕЕККУК-РЕ>-А1КУЕКЕКГ-АО· ШКУР1ЮУМ-АЕЮ-КУК1РУА1К-АР-АКООСЕЕОНУЕЕ- АаЕЕ5ЕЕЕЕС-А1ХЗ-КРКЛТ5РСК-А1<1АгКЕЕ1УЕО- РООУ-КЕЕЕРА5РЕ-А-\УО1±ЕАЕЕР-АП-Е5ЕАСНРС5- ΑαΚ-Ι®Ε0<3Κ1ΕΚ-ΑϋΕΚ-ΗνΚΕΝΕΟΚΕ-ΑΟ- ΑΕΡΟΚΝΟ\νΚΟ-Α-ΡΕ0ΕΕΗΐνΕ-ΕΟΑΚ-ΑΑΕΝνΕνΚ5-Αϋ- МАЕПР0ЕРУ-А-\ЪКЕ,МТ5РК-А0Е-УАКСР5ОУК-АОЕ- НУКОРРГСУ-АО-ЫРОЗЕАРЕА-ЗТРКОТРТА-АОЕ- |
- 21 025280
А*3002
А*ЗЮ1
В*0702
А1КУШЕЧТ, ССШШУКЕ, УТОЕЬЬАЦР, ΚΙΚΚΥΤΜΚΚ, ΡΕςκΕΚίνκ. ΡΟΚΝΟννΚϋ, УЕКЕЫТЗРК, Ои^ЬКЕЬО. ΚνκνΕΟ&ΟΑ (ЗЕр И> ΝΟ: 139, 240, 24К 242, 243,244.166.245,246,247.248, 169,249,250,251,252.31.253, 64,254.24. 180,48,255,174,256 и 257, соотеетствеаио)
Е5ПХЗПРА8, КОМЗУЬЕОЧ ЬТСЗРфРЕУ, νΜΑθνθ3ΡΥ, ννΚΠνΡΑΡΟ, ОМСОЬУОАЕ, ТНрШУХУЗУ. ΟΟΑνΕΝΡΕΥ, ЗЬТЕШКОО, ΕΤΕΕΕΙΤΟΥ, 5ΜΡΝΡΕΟΚΥ, ΟΤΡΙΤΕΟΝΥ, ЙЬРОЕЗУК?, Ε338ΤΕ5ΟΟ. НЬОМЬКНЬУ, ЬМТРОАКРУ. ΥΡρΟΕΡΚΕΥ, РЬТЗПЗАУ, ΑδΟνΤΑΓΡΥ, ОУНХЗОЕСМ, 5ΑΤ¥ΟΙ1±ν, ТУТУЕЕМТРО. 5ΡΑΓΟΝΡΥΥ, РЯРАГОМЛХ Υ Υν/ГХЗБРРЕ, ИРОЬЕЕКС, АРК5РЕАР5, КН5ОСЕАСЕ,
ΟνΤΑΟΡΥΝΥ {3Ε9 ΓΟΝΟ: 259, 260, 94, 159, 261, 262. 227. 263, 264. 213,229, 230,130,265.101,233,266,143, 46,218.155,168,235,105.267, 268,269, 128и237_, соответственно) νντοιιικκ ΚΥΡΙΚν/ΜΑί, ОМЕНЕКЕУК. ΟΚ1ΚΚΥΓΜΚ, ТУСАООСАК, МАЬЕЗЩРК, ЗРЬОКТРУК, СУОЗРУУЗК. ЫТОРСЬАК, МЬКЕГЕРК, ЕУНКОРААК, ЬАСНфЬСАК, РЬрКЫУ νκ, У8ЕР8КМАК. ЕЕОУКЕУНК, νΡΟ'ί^νίΚ, ЬО^УЬОРК, ААЕСК^СЬЕ, (^ΑΙΧΗΤΑΝΚ, К1РО$ЬЛРЕ. <ΖνΝ<Ξ3ς>Η_Κ, КЕОРРРААК, ΚΙΚΚΥΤΜΚΚ, тьготжзк, Κ<γνΡΕΟΚ£Κ, ЯЧУЬОЬКЗЕК <8Е<3 ΙΟΝΟ:_ 158,220,73,271, 52.272,273,274,26,275,33,276, 48,277,278,279,59,280,281,31, 175,282, 180,283,284 и 65, соответствен ио)
КСЕКС5КРС, 5ΡΚΑΝΚΕΙΕ. 5РЕТНЕОМЕ, РР8РКЕОРЕ. ΟΑΥΕΝΡΕΥΕ, ОУУИЗУРАР,
Т9КСЕКС5К (ЗЕ<2Ю ΝΟ: 258)
5ΜΡΝΡΕΟΚΥ АОЬ’КНбПСЬАСЬ АПМООЬУПАЕ-ЫХЗКΟνΤΑΓΡΥΝΥ-ΑΕ-ΟΟΑνΕΝΡΕΥ-ΑΕ-ΑννΚΟνΡΑΡΟ-ΡΕΑΚΑΕΙ ΡΟΕΕΕΚΟ-ΡΟΟΚ-ΗΕΟΜΕΚΗΕΥ.ΑϋΕΚ-Τν^ΕΕΜΤΡΟАП-ЬТСЗР9РЕУ-АОЬК£55ТКЯСС-АОСК-ЕТЕЕЕ1ТС¥АО-УЬОСЬРКЕУ-АО-АКРЬТЗ1 КАУ-АЬАЗСУТАСРУИХ-ЗАТСаХУ-АЕЯ-У-АЕ5РОООРА5-К^ОУЕООБЬОМΗΕ-ΑΑΡΚ5ΡΕΑΡ5-ΑΙ-θΤζ>ΕΕΕΟΝΥ-ΑΙΟАЗЬТЕП-КОО-АО -КОМ5 ΥΕΕϋ V-АО-УМАО νΟδΡΥ- АТЕК5ΕΡΟΕ8νΡΟ-ΚΟΕΚ-ΤΗθδθνν5Υ.ΑθΑ-δΡΑΡΟΝΕΥΥАОЕ-Р^РАПЖЬУ-АОЬК-УУЖХ^ОРРЕ-АОЬУ· ЬМТЕОАКРУ (5ΕΦΙΟΝΟ: 270) (^АШРГАКК-АЮ.КОУРРОКЬК-АСОКОЮККУТМК^
АЕХЗК-СУСЗРУУЗК-ЫЬКЕТЕЬК-АОЕ-иЁОУКЕУНКΑϋΟ-ΤΕ1&ΤΝΚ3Κ-ΑΟΕ-ΟΜΕΗίΚΕνΚ-ΑΐΧΪΚΚΕΟΡίΡΑΑΚ-ΚΙΟ-ΜΑίΕΚΙ ΕΚΚ-ΡϋΟΚ-ΙΧίΚλνΕΟΕΚАГХЗУ-КПОРиЬАК-А-РЬ^КЫиУК-АОО-УУРОПЛКККООК’ЬУНКПЬААК'АТУСАООСАК-КЕХЗ-ИККУГМККАОО-ААЕСК\УС1Х-АЕСК-К]РО5ЕАРЬ-РСЮΚνΡΙΚ\νΜΑΕ·5Ο·Α8ΡΕΟ5ΤΡΥΚ-ΑΟΕ-ν8ΕΡ5ΚΜΑΚ·
АОЕУ-СУМС39РЕК*АОЕК-ЕАСН9ЕСАК-АОУР0МЕфУ1К-А1Ь-5ТОЕОЕК5ЕК (5Е0 ΙΓ>ΝΟ: 285)
Вариант Г. ААРК& РЕАР8 -АЬРААКРАСА- РООАЕРТН0Р5РЬА-АЕРА5РЕТНЕ-5О-А5РЕГЩХМЕΑΥΕΟΝΟΟΡΕτ -Α8ΡΚΑΝΚΕΙΕ-Ρ-θΑνΕΝΡΕΥΕ- 22 025280
| 5ΡΟΚΝθννΚ, АУЕОГКЗОРЬ, ΗνΚΕΝΚΟΚΕ, ААРРАОАТЬ. ΜΡΝ0Α0ΜΚ1, ΕΡΤΗϋΡ3ΡΕ, ЕАЗРЕТЗП, ΚΚΥΤΜΕΚΕί* ЗРКЕСРЬРА, СБСТЕУСРЬ, □ΡΑ3ΝΤΑΡΕ, ЬРААКРАОА, АРфРНРРРА, НРРРАР5РА, ΕΡΤΝΑ3Ε5Ρ, УРЬОКЕИУ, ЬРА5РЕТНЕ, АРК5РЕАР5, Εςνικοκίί (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 286, 287, 288,289, 290,63,291,152,242,292,293, 294,35,295,296.76,297,298, 299,300,301,302,303,269 и 49, соответственно) | Α3ΡΟΚΝΟ\νΚ-Αη-ΕΡΤΝΑ5Ι-3Ρ-ΑΟΡΑ5ΝΤΑΡΕ- .‘\АРРАСгАП,-ААР9РНРРРА-А1Х1У-Ер\ЧКСтКП,-РГХЗ- ΚΑ3 ΡΕΤ3 11 -ΑΟΕ-ΑΡΡ5 ΡΡΕΟΡΕ-ΕΟΕΚ-ΗνΚίΕΝΚΟΡΕ- 80Ε-ΑΗΡΡΡΑΡ3ΡΑ-ΡΟΕΚ-ΑΜΡΝ0Α0ΜΕΙ -АПЕУ- ΚΚΥΤΜΚΡΕΕ-Α-Γτν\ΓΚϋνΡΑΡ-ΑΟ-ΑνΡΕρΓ<ΕΕΐν-ΑΓΧ1Κ- СЗСТЕУСРЬАГ-АЙРкЕСРЕРА-АПЬКСЕКСВКРС (ЗЕО Ю МО :304) Вариант 2: μεεααεοε^οεεεαεερροαραβρκανκειεααεραοατεαε РГНОРЗРЕААЕРАЗРЕТНЕЗОАЗРЕТНЕОМЕАОАРРЗРКЕСР ЕЕЕ1.КНУЕЕЯКОЕЕАОЕАСРЗОУКРОЕА005ГЕ5СОООЕР1А 5ΡΕΤ3ΙΙ3Α (ЗЕОΙΟΝΟ: 305) | |
| В*0801 | ЕУ\УЕОУУР, УУООХУУУ, О.КККРГНС», VIΛΟΚΝΡΟί, ΟΟΚΙΚΚΥΓΜ, кауусящ 3ΡΚΑΝΚΕΓΕ, ϋΙΡΗΚΝΝΟΕ, РОБАКЬЕИ, М1МУКС\УМЕ ΥΟνΤνίΛΈΕΜ, 5ΕΑΡΕΡΕ5Ε, 1_АА1_СК\УСтЕ, ΕΟΚΙΚίνΚΟ, ЕОМЕНЕЕЕУ, МУННЕНЕ53, ЬОЗТРУКЗЕ, ΑΕΙΗΗΝΤΗΕ, ΜΚΠ.ΚΕΤΕΕ. УЗКЕЕО1СЕ, ЕСКРКРЕВЕ, ΕΡΕΝΡΗΟΑΕ, ΚνΡΙΚλΥΜΑΕ, ЕИУКОТрЦ νΡΙ ΟΚΙ ΡΙV, ΥΪ3ΑΐνΡΟ5Ε, ΕΙΚΡΚΟΟΚΓ ΕΟνίΚΟΚΙΕ УОПЕЛ’УУЕ, ПХУУУЕОУ (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: _25, 306, 307,308, 309,60,287,45.310,115,98.195, 22, 246, 311, 312,313, 119, 314, 217,315,316,220,39,302.28, 317,49,318 и 66, соответственно) | Вариант 1 г ΥΙ 5А\УРЕ>ЗЕ-РОЕ-ЕСКРКРКЕЕ-А1>- УО11.1.νννΐ.-ΓΌ-ΟΟΚΙΡΚΥΤΜ-ΑΓ>ΕΡΕΝΡΗΟΑ[.-ΑΕ- ΕΙΚΚΚΟΟΚΙ -АОЕК-АУОУТУтеЕМ-РВЬК-ЕОМЕНЕКЕУ- Α5ΡΚΑΝΚΕΠ.-ΑΕΙΗΗΝΤΗΕ-Α-ϋΙΙΉΚΝΝ0Ε-ΑΓ>- МУННКНЕЗЗ-АО-АУРЕОКЫиУ-А- ПХУУУЕОУ-АП- УЗКЕЕО1СЬ-АРСЕАЕЕЕ01 -АЕЕОКШУКС-АО- ννΟΙΕΕννν-ΡΟΟ-ΚνΡΙΚΛνΜΑΕ^ΕΑΡΕΡΕδΡ-Αΐ- Е0У1ЙОЕ1ЬЕТОЕО\УЕ-А-ММЕКЕТЕЕ-ЕГО- νΕΪ0ΕΝΡ0Ε-ΡΟΕΚ- ОЯЕКРТНО-АО-ЕААЕСК^ОЕ-АС- ЕО8ТР¥К5ЬКО*ЕК1УкОГ0Е-Р1АК. ΙδΑννΟΗΧ-ΑΝ ΜΙΜνΚίΑνΜΙ (ЗЕОЮМО: 319) Афмдом 2: ΜΕΕΑΑΐΧβλΑΌΕΕΕΑΕΕΡΡΟΑΡΑΐΰΡΗΚΝΝΟΕΑΕΑδΡΚΑΝΚΕΙ ΕΚΙΧΪΚϋΙΡΗΚΝΝ0ΕΡϋΟΚΕΟΜΕΗΕΕΕνΑΟΕΡ&ΝΡΗ0ΑΕΑΕΕΟ СКК1РСтЗЕРПЕК1 УКОТОБАОСт УМ ЕПКЕГЕЕЗПООГ+СЗЕТЕ 1ЕАООКЕСИРКРКЕЕАОООЕМРУОСЕЕРОЕК (ЗЕО ΙΟ N0:320) |
| В*1501 | ΧνΟΜρίΑΚΟΜ, БТСЗРОРЕУ, ΟδΟΑΡΟΤνγ, νΜΑΟνΟΒΡΥ, ΙΟΕΝΡΟΕΟΥ, ГЗиЫЗЬКЗЕ, 5ЕОАО5ОУР, ΥΟνΤΥΆΈΕΜ, ΤΟΟνΝΟΒΟΡ, ЗЬАРЕРЕЗР, ΕΟνίΕΟΡΙΕ, νΤ5ΑΝΙ<3ΕΡ, У0омш_ту, Είνκστοιτ, Μ0ΙΑΚΟΜ3Υ, ΑΕΙ1ΙΗΝΊΉΕ. ΕνννΕΟννΓ, ΕΜΤΡΟΑΚΡΥ. ΕΕίΟδΟΕΑΕ, А5СУТАСРУ, νΚνΕΟ.δΟΑΡ, КАСНРСЗРМ, 0УУ0С№ЬЕЕ, ν^ΒΥΟνΤνλν, ΟΕΡΕΟΝΥΑΕ, ΤΕΙΟΤΝΕ3Ε (5ΕΟ ГО ΝΟ: _321, 94, 58,159, 322,212.201.98,323,195,49, 324,325.75.61.119,25,233,23, 46, 40,326, 234,192, 27 в 283, | ЕУУУЕСУУР-А- ΐ0ΕΝΡ0ΕΟΥ-ΑΐΕν-Τ0σνΝ€50Ρ-ΑΙΧ3- ΤΕΙΟΤΝΚ5Ε-Α3ΕΟΑΟ5θνΡ-ΑΕ1ΗΗΝΤΗΕ-ΑΙ - ΑΥΟνΤλΑΥΕΕΜ-ΑίΟΚ- 18ЧУЕОЕЕЗЕ-5-УКУЕС50АР-А- 0ЕРЕ1ЖУАЕ-РЕО-КЕЕО5СЕАЕ-А5СУТАСРУ-А1Е- νΤΒΑΝίΟΈΕ-ΑίΟ-νΟσΝΕΕΕΤΥ-ΑΟΕΤεδΡΟΡΕΥ-ΛΟΕΚ- ΟννΟΟΝΙΕΕ-ΑΙ -050ΑΡΟΤνΥ·ΕΕ·νΜΑθνθ3ΡΥ-ΑΙΧ5ν· Ε0νΐΕΟΕ1Ε-3ΕΑΡΕ№3Ρ*ΑΙΧ;-νν3Υθντνν-ΑϋΑ- ΚίνΕΟΤΟΕΡΛνΟΜΟίΑΚΟΜ-ΑΟ-ΜΟΙΑΚΟΜΒΥ-Α- ίΜΤΈΟ АКРУ-КОЬ-КАСНРСЗРМ (ЗЕОΙΟΝΟ: 327) |
- 23 025280
| соответственно) | ||
| В*1801 | θν^5Υθντν, ЗЕСАОЗРУР, ΕΕΕΓΥΕΡΤΝ, ТЕЕУЕРЬТР, ОЕТЕЬУЕРЬ, ЕЕСКУЬОСЬ, Μ91ΑΚΟΜ5Υ, 1ΈΕΓΓΟΥΕΥ, ΕΡΙΡΕΤΕΥΗ, РЕУЬТРОСЮ, ОКРУУКДОЕ, ОРЬСМОААК, КЕЕОЗОЬАЕ, ЬИУКСТ<2Ь, УКУЕОЗСАР. ΕΕΙΤσΥϋΥΙ, ТЕПЖСС УЬ, ЕРЕОРА5РЕ (5Е<3 ΙΟ ΝΟ: 30, 201,165, 328,47, 44,51,61.232,329,330,331.332, 23,39, 40, 333, 222 и 334, соответственно) | ΕΚΐνΚΟΤ0>Ε-Α$ΕθΑθ3ΡνΕ’ΑΕΡίΡΕΤΕΥΗ-ΑΕ>ΕΚ- 0ΕΤΕΕνΕΡΕ-ΑΡ-ΑΚΡΕΥΕΤΡ0ΟΟ-ΑΡθν-ΕΕΠΌΥΕΥ1- РРОКЕЕСКУЕООЬ-АРО-КЕЕОЗОЬАЬ-АЕРЬОРАЗРЕЛ- ТЫЕКОСУЕ-Р-ЕЕЕГТОУЬУ-РЕОК-АОРЬСМОААК-АР- ЕЕЕТУЬРТК-ИОС-УКУЬОЗСАР-АР-ТЕЬУЕЕЪТР-КРЬК- 5Α\ΥΡΡ5ΕΡΡ-ΑΡ-ΡνΨ5ΥθνΤν-ΑΡ-Μ01ΑΚΟΜ5Υ-ΑΡ- ςκρννιοΝΕ (5Ε0ΙΡΝΟ: 335) |
| В*2705 | ΟΗΙΙΉΝΟΑΥ, ΚΕΙΤςΕΤΕΕ, ГЬОЕАУУМА, АКРАОАТЬЕ, ОЫЛЭДРЕЕ, УЕЕРУКЬУН. СК\УОЬЕЕАЬ, КЫТНфЗРУ, ΗΚΡΕΑΑΚΝν, ЕАОСКК1РО. ΡΕ09ΚΙΡΚΥ. ААОСТСРКН, ΡΚΝΡΗφΑίΕ, АКУСУСЕОМ. ККУТМККЬЬ. ρΚΡννΚ^ΝΕ, фКАЗРЬТЗЕ УТМККЬЬОЕ скуьооьрк. АКОЬОЗЬРТ. Ι0>Ρ10)Ες>νρ, νΚΟΤ<3ΕΡΕΟ, ΡΝρςυτγςϋ, γΐΎΐδΑΐνρο, ьиукотди оеоьасшзь, ΗΚΉΚ553ΤΚ, КЕЕО&СЬАЬ, &0УИЛ2КЬК (ЗЕО10 КО: 336,337,112,338, 339,226,21,340,341.342,343, 344, 131,345,295,331,346,171. 347,348.41.210.349, 169,39, 206.350.23 и 284, соответственно) | СКШНМСАУ-АЕЮ-СКтеШ-АЕ-ЕОРЕОЕОУР. АНТ>ЕАУУМА-КР-АКОЬ05ЕРТ-АР-ОКЕО50РЕЬ-АРО- КЕЕОЗОЕАЕ-АУЕЕРУКЕУН-КР-АРАОСКИРО-АРО- РЮЧРНОАЕЕ-РКЗК-АСЕСЕАСНОЕ-АР-АКРАСАТЕЕ-ЗЕ- ККЕЬОЕТЕЕ-ААОСТСРКН-АР-АУКОТОЕРЕР-КРЕУ- ΚΚΥΤΜΚΜύ^ΚΡ-ΕΚίνΚΟΤΟΕ-ΡΡΕΚ-ΚΝΡΟΕΟΥΟΟ- АРЕК-КОУРЕОКЕК-АРАК-АКУСУОЬОМ-АРОУ- ΗΚΡΕΑΑΚΝν-ΡΟ-ΟΚΑ5ΡΕΤ5[ РЕЕК-НКНК555ТК- ΑΡΕν-ΥΕΥΙ8Α^ΡΡ-ΑΡΑΚ-0ΚΡννΐ0ΚΕ-ΑΡΕν- ΚΚ00ΚΙΚΚΥ-ΑΡΕΚΐΚνΕ0ΟΕΡΚ-ΑΡΕ-ΥΤΜΚΚΕΕ0Ε- ΑΡΕΚ-ΚΚΡΓΗ05θν (8Ε01ΡΝΟ: 351) |
| В*3501 | ЬТСЗРОРЕУ, ЕАЬЕРРОАА, ЕРЬТРВДАМ, ΡΡΑ3ΝΤΑΡΕ, сктсьььаь, мруосььон, ЕМЗРЕСМСАА. ΟννΚΟνΡΑΡ. МАУЕЕРУК!.. ЫЮЕАУУМ, βνΤΥΝΤΟΤΡ, ΜΡΝφΑφΜΚΙ, ЬРТН0Р8РЬ, ΤΡΤΑΕΝΡΕΥ, ТСЕЕНСРАБ, ОРАРОАООМ. ЬУЖХЗУУР. Ρ3ΡΑΡΡΝΕΥ. ΕΜΤΡΟΑΚΡΥ, НТУР\УО9ЬЕ Εννΐζ>ΝΕΟΕ, К5ЕЕЕРРРМ, ΚΡΑΡΡΝίΥΥ, ΝΚΕΙΕΡΕΑΥ, ΕΡΤΝΑ5Ε5Ρ, ЕСУОЕОЬАС, ΥΥλΥΙΧ^ΡΡΡΕ, ΕΡΙΡΕΤΕΥΗ (5Ε0 ΙΡ ΝΟ: 94,352,353,297,21. | Вфиашн I: НТУР№Р0ЕР-АРЕУ-СК№СЕЕЕАЕ-К1- ΑΕΡΙΡΕΤΕΥΗ-ΑΡΕ-ΑΜΧ3ΡΕΟΜΟΑΑ-ΚΡ-ΕΡΤΝΑ5Ε3Ρ- ΑΡΡΑ8ΝΤΑΡΕ-ΑΕΡΤΗΡΡ8ΡΕ-ΑΟ.ΝΚΕΙΕΡΕΑΥ- АРРАРСАССМ-А1-АЕРЕГР5ОАМ-А-О1УКРУРАР-АР- ЕТСЗРОРЕУ-АРЕК-ЕУТУМРТЕ-АРЕАЕЕРРСАА-РР- ΕΙΕΡΕΑΥ УМ-Р-ЕУ УУЕОУУР.АЕС УОЕОЕАС-А- ΤΡΤΑΕΝΡΕΥ-ΑΡ-Κ5ΕΕΕΡΡΡΜ-ΑΕΕν-ΡννΐΟΝΕΡΕ-ΑΕ- АМРКОАОМЫ-АРЬУ-МЗ УЕЕРУКЬ-ΑΙ-ЕМТРС ΑΚΡΥ-ΑΡ- ΙΟΕΕΗΟΡΑΕ-ΑΕΟΚ-ΥΥΐνΡ0ΡΡΡΕ-ΑΡΕ-£ΡΑΡΡΝΕΥΥ- АЕЕ-РЗРАРРМА-АПЖ-АМРУССЕЕРН (5ΕΟΙΡΝΟ: 363) Вариант 2: МЕЬААЬСКТОЕЬЕАЬЬРРОАРАРОКТРТАЕМРЕУААЬРАЗРЕ ΤΗΙΤΙΚΚΥϊΕΟΡΤνΡΕΡΡΟΑΕΡΤΗΡΡΒΡΕΑΡΝΚΕΙΕΡΕΑΥΑΡ ΕΠ-ΡΕΑΥνΜΡΕνννΕΟννΡΑΡΜΟίΑΚΟΜδΥΑΕΜΓΡΟΑΚΡΥΡΕ |
- 24 025280
| 354.104.63.238.355,356.293. 294. 357.216,358,25,105.233, 215. 359, 360,235,361,301,362. 267 в 329, соответственно) | СКАРРРАРЗРАРАОЕНСРАЕУТУ (δΕφΙΟΝΟ: 364) | |
| В*4001 | КЕУКАУТЗА. ΒΕΤΟΟΥνΑΡ. ЗЕОАОЗОУР, <ЗУУ0О1ЧЬЕЬ, ΛΕΝΡΕΥίΟί, κυίΑΑΚΝνυ, ΕΕΟΠΙ)Μ(ίϋ1_ ОЁТЫЛ'ЬРЦ ЕЕЕАРЕ8РБ. КЕЬОЗОЕАи ΑΤ.Γ Ρν/ΟΕΙΧ, МЕЕААЬСКЛУ, ЕЕСКУБОСЕ, ΟΕΡΡ.ΌΝΥΑΕ. ОЕУООУУЕЕ ОЕРАОСКК1. Е9Ьр\ТЕГЕ- ΕΕΙΤΟΥΕΥΙ, ОЕОЕАСНЧЬ. ΙΈΧΚΟΟУЕ. СГР1.РОГРГ, ΡΕΟΝΥΑΕΑν (3Ε<} ΙΟ ΝΟ: 365,366,201. 234. 367,368.369.44.370,23,74.34. 51.27.56,37Ε 372,333, 206, 222, 373 и 55, соответственно) | ΜΕΕΑΑΕΟΚΧν-ΚΓΈΑΑΚΝΥΕ-ΡΌΑ^ΕΙΈΕνΈΡΕ- АЕЕЕАРК.ЗРЕ-РООК-ЕЕСКУЕООЕ-АОА-СЕКЕРОРР1- АОО-ЗЕТООУУАР-РОА’АСЕОЕАСНОЕ-АОС- ΚΕΕΟδϋΕΑΕ-Ρ-ΟΕΙΕϋΝΥΑΕ-Ρϋ-ΑΕΕϋϋΟΜϋΟΕ-Ι'ϋΕΚ- КЕУКАУТЗА-АЗЕОАОЗОУР-А-ТЫЕКСОУЕ-РЬ- ΕΕΙΤΟΥΕΥΙ -ΡΟΟΚ-ΑΕΝΡΕΥΕΟΕ-ΡϋΕΚ^ΕνΟΟΥνΕΙ- ΑΟ-ΕΟΕΟ\ΤΓπ.-Α-Ο^Ό(ΊΝΕΕΤ.-Α-ΟΕΡΑσ<:ΚΚ1- ΑΙΓΚΜΪΕΕΕ-ΚΟ-ΑΡΕΟΝΥΑΕΑν (ЗЕОЮМС: 374) |
| В*4002 | нукорррсу, ος$ΕΤΚΤ νο, ΕΕΕΟΕΚΞίΤ, КЕУКАУТЗА, ΤΡΥΚ3ίΕΕΟ, Ι5ν.ΕΟΕΚ5Ε, ΊΊ.Οί ίί.ΟΙίΛν, КН8БСЕАСЕ, ΑΕΝΡΕΥΕΟΕ, СЮУОкЕЕАЬ. ТКТУСАСОС, ТОМКЕКБРА, КОЕААКЕАЪ. ОЕТЕЕУЕРЬ, ЕЕЕАРЕЗИ., ΚΚΥΤΜΚΚΕΕ, МЕЕААЬСКЛУ, КЕХОЗОЬАЕ, 0ЕРАОСКК1. ΤΒΡΟΕΑΚΕΕ. ΟΕΝΥΚίρνΑ, ΕΟ5ΤΤΎΚ5Ε, ОЕУОСУУЫ, ΚΙΤΟΡΟίΑΚ, ТЕЕККУКУЕ ОЗКСЖ5Е55, ТОТОМКЬКЬ, ΕΕΥνΝΑΚΗΟ. ΟΕΚΕΡΟΡΡ1, Υ15ΑΥ/ΡΟ3Ε (5Ε<2 ΙΟ ΝΟ; 139. 375. 376,365, 161,212,68,123,367.21,377. 378. 368.44. 370. 295. 34, 23,371. 69,379.313.56. 26.380.381.382, 383.373 и 28. соответственно) | га^ОЕКЗЕ-АЕЕЕАРКЗРЬКОЕААЮЧУЬ-КЕС- СРЖК1РУА-НЛ-КБ51ХХАСЕ-А]О-ОЕКЕР9РР1 -АОЕ-. ТСТОМШ<ЬР0СК-АЕМРЕУЕСЕ-АОС-КЕЕ08ОЕАЕ» КЕУКАУТЗА-АОС-КЕУУНАКНС-А-ОЁРАССКК! -А- ОЁТЬЕУЕРЕ-А-ТЕЕККУКУЕ-ТОМКЕКЕРА-АОЬК- (ЗЕУОСУУи -РОЕ-АКСЗСЗКСтеЕЗЗ-АЕОУ-КГГОРСЕАЕ- А-ТОРСЕАКЕЬРОА-ККУТМККЕЕ.АЕЮ-КЕЕОЕКЗЕТ’ АОЕК‘ЕО5ТРУКЗЕ-МЕЕААЕСК)У-А-ТЕ0ОЕО13)У-АОЕ- СОЗЕТКТУС-АЕЕ-НУКОРРТСУ-АЮ-ПЗАЛУРОЗЕ-АП- СКЖЗЕЕЕАЬГЮЕ-ТКТУСАООС-АПЕК-ТРУКЗЕЕЕО (ЗЕО ΙΟΝΟ: 384) |
| В*4402 | ТКТУСАССС, ТЪ0СЕС15\У, УКУЕСЗСАР, рХГЕЕνΕΡΕ, ЕКОАРРЗТР, Ю5ЕСКРКР, КЕЕОЗОЕАЕ, ΜΕΕΑΑΙΧΚ’Λ’, ΡΟΟϋΕΟΜΟΑ, СОСОЕТЕОЕ, ОЕРАОСКК1. ОЕУООУУЫ, ΕΉΟΡΑΕνΤΥ, РЕАООСУАС, νΚΙΡνΑΙΚν, ϋϋΕΤΕΟΕΕΡ (5ЕС> Ю ΝΟ: _ 377. 68. 40. 44, 385, 386. 23.34.32,387.371.56. 38,388.42 н 29. соответственно; | ТЯГУСАС.С.С-ЛЕМЗ-ОССОЕГЕС.Е-ЛкРЕЛЕХ^СУЛС-Л- 1Ъ0СИ}15ЧУ-А1 -АРВСВЕСМСА-РОАК-АКСОЕТЕСЕЕР- РООК- ЮЗЕСКРКР-АВС-УКУЕОЗСАР-АВС- ОЕТЕЕУЕРЬАОС-ЕЕЕСЗСЕАЕ-АЧЗЕУОСУУи -АЕС- ЕКСАРРЗТР-А-0ЕРАОСКИ-МЕЕААЕСЕ\У-АЕО- УК1РУА1КУ-АЕ-ЕНСРАЕУГУ (3ΕΟ1ΒΝΟ: 389) |
| В*4403 | РОООЕСМСА, ТКТУСАССС, ЗЕОАСЗОУР, УКУЕСЗОАР, | ииУКСТрЕ- Р1АА-СтССгПЕП.СгЕ-АКРЕЛГЯ5СУЛС-А1 - АГООБЕОМОА-РОАК-АкООЕТЕОЬЕР-РОЕК- |
- 25 025280
| РОЕВ УРОКЕ. ОЕТЕЕУЕРЬ, ЕЕСКνΐ.ΟΟί.. ΕΕΕΙΤΟΥΕΥ. υϋνΕθτςυ, ееесхсьаь, МЕЕААЕСГСХУ, ООЬТЕОЕЕР, СОООЫЪОЦ ТОТОЬАКЬк, ΕΕΐΊΌΥί.ΥΙ. ^ΕνΟίίΥ УЫ, ТЫЬКССVI.. РЕАООСУАС (5Ё<2 ГО: 32,377. 201,40, 390,44, 51,232, 39,23, 34,29, 387,69, 3 33,56,222 и 388, соответственно) | ОЕТЕЕУЕРЬ- Ρ1 -УКУЕСЯСАР-АВЕОАОЗОУКРОС- ЕЕЬОЯСЬАЕ-А-ОЕУООУУЫ -АВСК-ЕЕСКУЕОСЕ- РОЕК- БЕЕ ГГСЮУ-А-ТЕП.КССУЬ- РЬ-ΕΕΙΤΟΥΣΥΙ -АО- МЕЕААЬСКАУ-АО-АКРОЬЗ УРрКЕ-АОЕ-ТОРОЕАКЕЬ-РО- ТКТУСАООС (3Ες)ΙΟΝ0: 391) | |
| В*4501 | ΡΕΟΚΥΤΡΟΑ, КЕЕОЕК5ЕТ. МЕНЬКЕУЕА. ГОООЬОМОА, КЕУКАУТЯА, УВРЕЕС51СЕ. ОЕКЕРОРР1. ЬСМОААКСЬ, ЬРААКРАСА, ΤΒΑΝΙφΕΡΑ, ЬОаТРУКЗЕ, ГОЗЕСЕРКР, ЕРЗЕТООУУ, КЕЕОЯОЕАЕ, АЯСУТАСРУ. ОЕУОСУУЫ, АЕС^КАЯРЬТ, ΜΕίΑΑΙΌΚνν, ΟΕΝνκίΡνΑ. ШСГНЗСУО. ΕΕ1ΤΟΥΕΥΙ, ОЕОЕАСНрЬ, ЬРАЗРЕТНЬ, ΡΕΠΝУАЬАУ. ЕЕАРКВРЬА, СЕиЗСРАЬУ, КЕГЬйЕАУУ, νΚΙΡνΑΙΚν, СЕКСЯ КРСА (ЯЕф И> КО: 392, 376,365, 217, 298,395,31,386,396,23,46,56, 397, 34, .379,398, 333, 206, 303, 55,399,400,4 01,42 и 402, соответственно) | СЕШСРАЕУ-АЕЮ-СЕЫУК! руа-аьраяретне-ко- АКРЕОКУТБОА-АОСК-103ЕСКРКР-АОЕК-ОЕКЕР9РР1 - ΑΐΕ-ΑΕΕΑΡΚΒΡΕΑ-ΑΙΧίΑ-ΕΕΙΤΓ,ΥΕΥΐ-ΑΙ.ΡΑΑΡΡΑ(ΊΑ- РООК-МЕНЬКЕУРА-РОО-КЕИ^ЕКВЕТ-АОЕК- КЕГ ЕОЕАУУ-АТ-АРОООЕСМСА- РОЕК-КЕУКАУТ5А- - АЕРЯЕГГХ1УУ-ЛГ>О-АЕ0КАЯРЕТ-А1Х1-АОЕ;СгЕЛСН0Е- АЕС-ЕЕЕОВОЕАЕ-АВ-СЕКСЯКРСА-АЕЮУ-ЧЕУООУУЫ- ΑΟΕ-ΤΒΑ>ΠΟΕΓΛ-Αθ-Τ.ΟΒΊΤΥΚ3Ε-ΜΡ.Ε.ΑΑΕΟΕν/-ΑΤΟΚ- АПЧСТНЗСУО-КО-АГЕОНУАЕАУ-КО-ЕОМОААКСЕ- УБКЬЕСНСЕ- РО-УК1РУА1КУ-А1 -АЗСУТАСРУ (8Е<3 Ш N0:403) |
| В*5101 | Τ.0Τ.Κ5ΕΤΈΙ. ЬРОРР1СТ1, ΚΟΜ5ΥΙ_Ε0ν. СКтЗШАЬ, РОЬЙУЕОХЬ, УОУТУЗУЕЬМ, ЕОМЕНЬКЕУ, ЬОМСААКОи ΜΡΝ<}Α(}ΜΚΙ, ЕРТНОР5РЕ, ΕΝνΚΙΡνΑΙ, 0ЕРАОСКК1, ТОБСЕАКЕЕ, ЕОЬОУРЕТЦ ЬРтаАЙЬЗР, ОЕУООУУЫ, ЬРАЗРЕТНЬ, ЬРЗЕТОСУУ, νΚΙΡΥΑΙΚν, УОШЕУУУЕ {5Εζ> ΙΟ ΝΟ: _150,404, 260, 2 1, 390, 98, 311,394, 293, 294,405, 371,69,372.301.56.30 3,396,42 в 318, соответственно) | СКХУОЕЕЬАЕ-РО-ЕНУК! РУА1 -АУОУТУТУЕШ-А- ΑΕΡΑ5ΡΕΤΗΕ-ΑΡΡΟΕ5νΕ0ΝΕ-Ρϋ-ΕΡΤΝΑ5Ε8Ρ-ΑΐΧί- ΑΕΡΤΗΟΡ5ΓΕ-ΡΟΕ·.ΑΕΡ5ΕΠΧ;γν.ΡΟΕΚ-υ3ΜΕΗΕΡΕν- ΑΟΕΡΟΡΡΚΤΙ-ΑΟΟν-ΟΕνΟΟΥνΕΙ-ΑΟ-ΕΟΕςνΤΕΤΕ- А-ЕОМОААКОЬ-РО-КОМВУЕЕОУ-А-ОЕРАОСККЕЯ- νθΙΙ.Τ.ν\νΐ.-ΑΜΡΝ9Α0ΜΡΙ-ΑΓ)Ι.Κ-Ε0ΕΡ8ΕΤΡ.Ι-Αθ- νκΐ ΡνΑΙΚν-Α-ΤΌΗϋΕΑΚΙΧ (ΚΕςίΟΝΟ: 406) |
| В*5301 | ОРМСМАОА. ЬРОРНСТ!, СКАУСИЬДЕ, $РЬО8ТРУК. КРЕОЕСУСЕ, ΜΡΝ0Α9ΜΚΙ. ЕРТНОРЗРЬ. ΤΡΤΑΕΝΡΕΥ. 5ΡρΡΕΥνΝ9, νΕΝΡΕΥΕΤΡ, АОУСЯРУУЯ, ЯРЬТЯПЯА, ГТЮМ-СМСА, 5ΡΑΡΟΝΕΥΥ, | ΑΒΡΕΟΒΊΤΥΚ-ΑΟΟνΕΝΡΕΥΕΤΡ-Α-ΑΕΡΑΒΡΕΤΗΕ- ΑΚΑ0ν05ΡΥν5-Κ0-ΕΡΤΝΑ5Ε5Ρ-Α00-ΑΕΡΤΗϋΡ8ΡΕ- АОЕ-ЬЕИРКТЪЗР-АЕ-АИХЗОЕОМОА-РОАК- АКООЕТЪОЕЕР-РОЕ-АКООМООЕУОА-РОЕ- ΑΚΡΕΟΕΟνΟΕ-Α-ΤΡΤΑΕΝΡΕΥ-ΑΕ-ΑΜΡΝφΑφΜΚΙ-ΑΟΕΚ- ЕРОРР1СП -АО-АБРЬТВ! 1ЙА-АО-СК^ЙШ.АЕ- ΑΟΡΕΡΑΑΚΡΑ-ΡΟ-ΑΑΡΚ3ΡΕΑΡ5·ΑΕΑ-ΑδΡ2ΡΕΥνΝΟ- |
- 26 025280
| ЬЕЕРКТЬЗР, ΕΡΤΝΑ5Ε8Ρ, ООЬТЬОЕЕГ, ЬРАЗРЕТНЬ, ЕНСРАЕУТУ, АРКЗРЬАРЗ. ΟΡίΡΑΑΚΡΑ, νιαρνΑΐκν, СРЗСУКРИ. (8Е0 Ш ΝΟ: 407,404, 21,273,408,293. 294, 357,409,410, 411,412,32,235, 177, 301.29, 303,38, 269, 413,42 и 414. соответственно) | ΑΕΟ-νΚΙ ΡνΑΙΚν-Αθ-ΑΕΡ5θνΚΡΡΕ-Αϋ-ΕΗΟΡΑΕνΤΥ- 8ΒΑ-8ΡΑΡΟΝΕΥΥ (ЗЕО ΙΟ МО: 415) | |
| В*5401 | ЬУЕРЕТГ'ЗО, ΐν/ΙΡϋΟΕΝν, КЕМХ-ЙДЕТ, ЕРрРПСП, КЕУКАУТЗА, ЕТЗПЗАУУ, ΚΚνκνίΌδΟ, ΥΚΡΡΡΡΟνΑ. ЗРЬАРЗЕСА. ЬОКЫиУКС. ΜΡΥΟΟΧΟΗ, ΚΟΚΙΕΗΝΟΑ, ΜΡΝ<>Λ9ΜΚ1, ΓΡΑΕνΤΥΝΤ, ΜΡίν,'ΚΕΡΟΕ, \νΚϋ1ΕΗΚΜΝ, ΕΡΑΑΚΡΑΟΑ. £ΪΤΤ5Π5Α, ИХлОЬСМСА, ϋΟΟΡΑ8ΝΤΑ, νΡΙ^ΠΕΚΤν, ХУСгЕЕЕАЕЕР, ΕΕΑΡΚ5ΡΕΑ, ΕΚΕΝΤ5ΡΚΑ (5Εφ ΙΟ ΝΟ; 416, 153+ 376, 404, 365,417,418,96,419, 246,354, 420, 293.421.422,423,298,412, 32, 102, 302,24,399 в 424, соответственно) | ΑλΥΚΟΙΡΗΚΝΝ-Αϋ-ΑΤυΟΟΕΟΜΟΑ-ΡΠΕΚ-ΚΕ УКА УТЗ Α- ΑΕΕ-ΑΕΕΑΡΚ5ΡίΑ.ΑΟΟΆΚΓΚ3ΠΡΑ3ΝΤΑΆΕΡΑΑΚΡΑθΑ- Α-ΐν/ΐΡΕ)ΟΕΝν-δϋ-ΕΕΕΝΤ3ΡΚΑ-ΡΡ-ΕνΕΡΕΤΡ3Ο-ΑΙΧ;- ΕΤ3 I Ι5Ανν-Α-ΕΚνκνΕΟ3Ο·ΑΙΧ3ν-ΚΕΕ0ΕΚ3ΕΤ-ΑΟΕΚ- ЬРОРРЮТ] -ΑΟ-ΕΟΚΕΚίνΕΟ-ΡΟΕΚ-ΚΟΕΙΕΗΝΟΑ-Αη- Α3ΡΕΤ3Ι Ι5Α-Α3ΡΕΑΡ3ΕΟΑ-ΑΟΡΑΕνΤΥΝΤ-ΑΟ- АУРЩКТЛиУ-АОАА-АМР^ЛрМКЕАПЕК- ΑΥΚΟΡΡΡΟνΑ-ΡΌΙ-ΑΜΡϊν/ΚΡΡΟΕ-ΑΟΟ-ΑΜΡΥΟΓΕΕηΗ- АОСКАУОЕЕЕАЕЕР (3Ε0 ΙΟ ΝΟ: 425) |
| В*5701 | Πν^5Υθντν, АТЕЕКРКТЦ ΟδΟΑΡΟΤνγ, ^ХУЕСЕКЗЕ, ΡΑΡΟΝΕΥΥν/. ΟΐΕΗΚΝΝςίΕ- Μ5ΥΕΕθνΚΕ, νΤ5ΑΝ^ΕΡ, ΗΤνρννίχίΕΡ, ΕΥνΥΈΟν ΥΕ ТЬОСИЛЗ^, АЬСКЖЛЕЕ, ОУНХЗОЕОМ, МЕЕААЬСК^, ΚΣΕΕΕΟΟϋΜ, Ε5ΥΜΡΠΥΚΡ, 9ЕМРУССЕЕ. ΕΝΎΚΙΡνΑΙ, ΕΡΓΗ08θν\ν, ΟΓφΕΕΕΟΝΥ ($Ε9 Ιϋ ΝΟ: 30,426,58,212,427, 45,238, 324, 215, 25,68,74,218, 34,360,62,43,405,208 η 230, соответственно) | ΜΕΕΑΑΕΟΕΥί·Α-νΤ3ΑΝΙ<^ΕΓ-ΑΕΟΚ-ΕΝνΚΙ РУАГ-АООК- ϋΙΕΗ ΚΝΝΟΕ-ΚΌ- ΑΤΕΕΚΡΚΤΈ-Ε νν ΥΕΟ V νρ.ρ. ТЕ0СЕО15У/-А-ОУИХЗОЕСМ-КОЕУ-АЕСКЧУСЕЕЕ-РЕ»СК- 15\νΕΟΕΡ5Ε-Κ5ΕΕΕΟΟΟΜ-ΑΟΟ-050ΑΕΟΤνΥ-ΑηΑ- ΟΤΟΕΡΕΠΝΥ.ΕϋΕΚ-Ε3ΥΜΡΙΛνΚΡ-ΑΒΕΚ-ΡΑΡΟΝΕΥΥΥν- ΑΟΕ-ςΕΜΡΥΟΟΕΕ-ΡΟΕΚ-Μ3ΥΕΕθνΐϊΕ-Κ.-ϋνΥν5Υθντν- ΡΟΕΚ-ΚΡΤΗ(^3θν\ν-ΛΟΤ.ν.ΗΤνΡ\νΐΧ>1.Ε <&Ες?ΙΟΝΟ: 428) |
| В*58О1 | ΚΚΟΟΟΟΕΤΤ, КСЕКС5КРС, νΤδΑΝίςΕΕ, ТКГУСАССС. ΡΑΕΟΝΕΥΥλν, ΙδΑννΟΙίΕ, ΚΜΑΚϋρςκρ, устотомке. ντνν^ΕΙΛΓΓΡ. ΚίνΚΟΤΟΕΡ. КАЗРЬТЗП. ΗΤνΡΧνΟΟΕΡ. | ΡΑΕΠΝΕΥΥ\ν-Α1ΕΐΤΓθνΥΜΙΜ-ΑΟΕν.ΚΜΑΚΒΡ0ΚΡ-ΑΟ- Κ00ΡΑΕ(5ΕΑ-Ρ0ΕΚ-ΕΟ39ΡΕΕ№ν-ΑΙ Ι3ΑУУСЛ^АЬ ЕСЕКС 5КРС-А1Ь- УТЗ ΑΝΙ<}ΕΡ- ΑΟί-Ο ΑΜΡΝζ>Α<?Μ- Αϋ- АУТОАЗРООЕ-Р-13АУУО!ЕЬРО-ЕЗООООЕТЕ- ΑΥΕ5Τϋνθ50-Α-ΕΑΑΕΟΚ\νθΕ-ΑΕ-Α5θνΤΑΟΡΥ-ΑΟΕ- ΗΤνρ\νΐΧ)ΕΡ-ΑΟΕΚ-Ε3ΥΜΡΡνΚΡ-ΑΠΟ-ΕΑ5ΡΕΤ5Ι I- |
| КОСРАЕрКА, 115АЖНЕ, ЬСУфОТПАУ, АЗСУТАСРУ, ΟΑΜΡΝφΑΟΜ. σηϋνΥΜΙΜ, УТОАЗРСОЕ, ϊΈ5Τϋνθ5Ε. Ε5ΥΜΡΓν/ΚΡ. ΕΟδΟϋΕΕΝλν, ЕААЕСКХУОЕ. КО^ЕСУЕЕС, Κ1ΡΟ5ΕΑΡΕ (5Ε<3 Ιϋ ΝΟ: 429,286,324,377, 427.60. 202, 231,203, 75, 35. 215, 430,71,431,46.432.221,433. 146,62,434,22.435 и 31, соответственно) | ΑΤΟ-ντνν/ЕЕМТЕ-АЕЮ У-АКОДЕС УЕЕС ΆΓ>Ε- ΡΠνΡΟΤ(^Η·'·ΤΚΤν0ΛΟΟ€-/ν0-ΚΙΡΟ8ΕΑΕΕ-ΡΟ- νΟΓΟΤΟΜΚΕ-ΑΟ-ΕΟΥΟϋΤΙΕν/ (3Ε0 ΙΟ ΜΟ: 436) |
- 27 025280
2.3. ТН-эпитопы.
2.3.1. Список ТН-эпитопов.
2.3.1.1.
ЕКНЬУОССО. ЕЕТУКСТОЬ, СЕНРЫН5О1СЕЕНСРАЕУ, ЕОУРЕТЦЕЕ, ЕК5ЕКЕЕО5,
ЬСРУНТУРУ/ОО, ШООЕСУЕЕ. СРШСТНЯС, ΙΚΚΥΤΜΚΚΕ,
ММЕКЕТЕЕККУКУЕСгЗ, УК1Р νΑΙΚνΕΚΕΝΤ 5РК,
УУМАСУСЗРУУЗКЕЕСаСЕТЗТУОЕУ, νΚΙΛΉΚϋΕΑ. ΕΟΕΑΚΕΕϋΙΟΕΤΕΥΗ, теМАЬЕ51ЕКККРТНр5, СТШУУМ1МУКС\\’МЕ СКРКРКЕЕУ8ЕР5, ΡννίςΝΕΟΕ (ХЕ() ю N0:437, 39,438,439,440,441,442,443,444,445,446,447,448,449,450,451,452 и 359, соответственно)
2.3.1.2.
АтеСНЕЕУУУЕС.УУ1Ю[Е1КККр0КТК,Р1СГ1ОУТМТМУКСтеМГО5Е,
А0МК1ЕКЕТЕЕККУКУЕС.5ОА, 1К1УМАЕЕ51ЕКККЕГН<38ОУ,
Р1СТ1Г)УУМ1МУКС\УМГО5 (8Е<3 го Ν0_7,8,9,10, и 11, соответственно)
2.3.1.3.
АКЕУАА\УТЕКААА (5Е<3 П> ΝΟ: 1)
2.3.2. Полиэпитопные ТН-конструкции
ΑΑΓΕΕΑΑΗΤΕΚΑΛΑΚΚΑννΟΙΕΕνννΕΟννΡΟΙΕΙΚΚΕΟΟΚΙΕΚΚΡίεΤΙΟνΥΜΙΜνΚ
СУ/МЮКЕККАрМЮЕКПТЕЕККУКУТ.О.адАККЖУЛМАЕЕХП.К.ККРТНОЗОУККР!
СТЮУУМ1МУКС\УМЮ811КК8НАС¥ОТ1 (8Е<2 ГС) ΝΟ: 453) (последовательность ΡΑΏΚΕ выделена жирным курсивом; С-концевой фрагмент ЬАМР-1 выделен жирным шрифтом)
2.4. Направляющие последовательности.
2.4.1. Лидерный пептид белка ЕгЬВ2 человека
2.4.2. Фрагмент лидерного пептида белка ЕгН82 человека, применяемый в направляемых полиэпитопных конструкциях
МЕЕААЕСКАСЕЕЕАЕЬРРОАР (5Е<> Ю N0; 13)
2.4.3. С-концевой фрагмент белка ЬАМР-1 человека (11 последних АК), применяемый в направляемых полиэпитопных конструкциях
ΚΚΚ8ΗΑΟΥ0Τ1 (5Εζ> ГО ΝΟ; 15)
2.4.4. Полная последовательность НЬА-К инвариантной цепи (γ-цепи, Ιί)
ΜΗΚΚΚ8Κ8Ε’ΚΕϋΟΚΡν.Μϋ[)ΰΚΓΕΙ8ΝΕζ)Ι..ΡΜΕΟΚΚΡΟΛΡΕ5Κσ3ΚΟΑΕΥΓΟΡ5ΙΕν
ΤΕ1.ΕΑΟ0ΑΊ·[·ΑΥΕΕΥ000ΟΚΕΟΚΕΤνϊ50ΝΕ0Ι.ΕΝΕΚΜΚΕΡΚΡΡΚΡν8ΚΜΚΜΑΤΡ
ΕΕΜ<2ΑΕΡΜΟΑΕΡ0ΟΡΜ<2ΝΑΤΚΥΟΝΜΤΕΟΗνΜΗΕΕς>ΝΑΟΡΕΚνΥΡΡΕΚΟ5ΓΡΕΝΕΡ
ΗΕΚΝΤΜΕΤω^ΚνΡΕ5ν/ΜΗΗ\νΕΕ1ΈΜ5ΚΗ3ΕΕ(3ΚΡΤϋΑΡΡΚνΕΤΚΕ<2ΕΕν5ΗΙΡΑν
ΗΡΟ5ΡΚΡΚϋΟΕΝΟΝΥΕΡΕ00ΥΟ5ΙΟΥΟλν0νΡΡΝ6ΤΕλΨΝΤΚ8ΚΟΗΗΝ€3Ε5ΕΕΕΕΏΡ3
3ΰΕΰνΤΚί)ϋΕ0ΡνΡΜ (5Ε<3 Ιϋ ΝΟ: 454) (иммунорегуляторный фрагмент Ιί-ключ выделен жирным шрифтом)
2.4.5. Убиквитин У76
Μ0ΙΡνΚΤΕΤσΚΤΓΓΕΕνΕΡ5ΟΤΙΕΝνΚΑΚΙ0ΟΚΕΟΙΡΡΟ00ΕΕΙΡΑσΚ0ΕΕθσΚ.ΤΕ5Ο УКЗКЕЗТЕНЕУЕКЬКОУ (ЗЕ<2 ГО ΝΟ: 455)
2.5. Готовые конструкции.
2.5.1. Универсальная полиэпитопная конструкция
- 28 025280
ОУАОЬКРЕТЕЕУЕРЬТРРООКАЗРЕТЗПЗАУУОПХУУУЬСУУРРОАСМЕНЕКЕУКАООКШРНКНКОЕРОЬО
РЕ0Е0УРКОАеЕУ0СЭТЕЕРОЕАПЭСОЕОМСАРОЕрУ1КСК1ЕРСУКУЕС5САГСТУУР1СПЕТЕСЕЕРРОЕКА
8€νΤΑ€ΡΥΑΤΕ0ΟΕΟΒΐνΕΟΕΚ5ΕΚΕΕΟ8ΟΕΑΕΡΜ0ΙΑΚΟΜ5ΥΑΕΡΟΡΕΑΙΧχ:νΡΟΕΚΕ5ΥΜΡηνΚΡΑΟΕΚΡΙΧ3
ΕΕΡΙΥΚσΤΟΕΡΕΟΝΥΑΕΑνΑΚΟΑΡΡδΤΡΚΑΟννκΟνΡΑΡβΟΕνΚΓΓΟΡΟΕΑΚΕΕΡΕνΗΕΟΕΑΑΒΑΟνίνδΥΟνΤ
КОТГРУТОАЗРКОЕУ15А№1>5ЕКТУСАСОСАК8ОК1РС8ЕАРЕРОЕНСРАЕУТУАОО8ТРУЕ5ЕЕА1ХгК0ЕМР
У«ЗЛЛЦ>СЮ8СТЕУСР1АЮЛЧАИТЕК4ЛККАУТО1ЕЕУУУЕетУРОГО1ККК0рКЖККР1СГГОУ¥М1МУК
С™ГО5ЕККА0МИЕКЕТЕЕККУКУЕО8ОАКК1К\УМАЕЕ81ЕКЕКРТН<Э8ОУККР1СГЮУУМ1МУКС5УМГО8
К
ΚΚΒΗΑΟΥζΠΙ (5Εζ> Ю ΝΟ: 456)
2.5.2. НЬА-А*0201-специфичная полиэпитопная конструкция ме1Ларску/с,1ла11.ррсарргл ε αι ι .ρροαροατι τρίτου ι ,αιι пр.ауумарп ηνπ αυκι ροι ,ρρρνυαι . 8118АУУО1А(ЗЕМР¥ОСЕЕКЕЕУУУЕО¥УМЭЕ0ЕК8ЕТЕ1А1ЕЕУУУЕСУРОАУУС1ЕЕУУАОАЕС1Ц¥ОЕЕЕАО ΥΙ5 Α\νΡΟ8 ШЕЖ1Р68 ЕАИЛАЕЕААИТЕЮиАККАУ νΟΙΙΧ,ν V νΕΰν\Τ01ΕΙΚΚΗ0Ε>ΚΙΚΚΚΡΚτωνΥΜΙ Μνκσ\νΜΙϋ8ΕΚΚΑ0ΜΚΠ,ΚΕΤΕΕΚΚνκνΕΟ8ΟΑΚΚΙΚ1ΥΜΑΕΕ8ΙΕΚΚΗΡΤΗ08θνΚΚΡΙϋΠθνΥΜΙΜνΚ0\ν ΜΙ Ο8ΚΚΚ5ΗΛΟΥ<3ΤΙ (£Ер ГО ΝΟ: 457)
2.5.3. НЬА-В *3501-специфичная полиэпитопная конструкция
ΜΕΙΑΑ ЕСПРОЕШЫ,ΡΡΟΑΡΑΡΟΚΤΡΤΑΕΝΡΕΥ А ΑΙΡ АКРЕТШЛЬКУЗЕРРТ V Р1РПС,АЬРТНРР5РЕ ΑΡΝ К
ЕШГ)ЕА¥АОЕП_Г)ЕАУУМРЕУУУЕО\УТАГ>Мр1АКОМ5УАЕМТГОАКРУРТОКАРРРАР5РАРАОЕНСРАЕУГУАА’РРАА
ΪΥΓΕΛΙ.ΥΑΚΚΑννΟΙΕΕνννΕΟννρΟΙΕΙΚΕΕΟΟΗΚΚΚΓΊΕΤΙΌνΥΜΙΜνΚΟΆΤ,ηϋϊΕΚΚΑΟΜΚΙΙ.ΚΙΤΈΕΚΚνκνί.ΟΛΟ
АКК1К\¥МАЕЕ81ЬКККГГНЦ5РУККР1СТЮУУМ1МУКС1УМЗО5ИСК5НАС¥0Т1 (5Е<> ГО N0:458)
2.5.4. Неродственный белок гНА5 (соответствующий фрагменту (АК 17-346) гемагглютинина (НА) вируса гриппа А Н5Ш, номер доступа в базе ОеиВаик АВЬ31766)
ЕХ31С1ОУНА№18ТЕ0УОТ1МЕКЧУТУГНА0О1ЕЕКТНИОКЕСОЕОСУКИ,1ЕКЕ)С8УАС)ИЕОМРМСОЕРП4УРЕ \ν5ΥΐνΕΚΑΝΡΤΝ0ΕΕΥΡΟ5ΡΝΕΥΕΕΕΚΗΙΕ5ΚΙΝΗΡΕΚΙ0ΠΡΚ55ν(·5Γ?ΚΕΑ85θν55ΑΓΡΥΙ.05Ρ5ΓΤΚΝνννΛ.1ΚΚ\5
ΤΥΡΓΙΚΚ5ΥΝΝΊΝ0ΕΟΙΤ.νΕ\νθΙΗΗΡΝΟΑΑΕ01ΤΤΥ0ΚΡΤΤΥ15ΙΟΓ3ΤΕΝ0Ι^νΡΜΑΤΚ5ΚνΝθς>5<3ΚΜΕΓΤν>ΓΑΙΕΚΡ
ΝϋΑΙΝΡΕ5ΝΟΝΠΑΡΕΥΑΥΚΐνΚΚΟ05ΑΙΜΚ3ΕΙΈΥΟΝΓΝΤΚΕ0ΤΡΜ0ΑΙΝ83ΜΡΡΗΝΙΗΡΕΤΐσΕσΡΚΥνΚ8ΝΕΕνΕΑΤ оью48Р0КЕЗККККЕ (5Εζ) Ιϋ N0:459)
Результаты и обсуждение
Для получения сконструированных полиэпитопных конструкций, описанных в примерах 2.5.1, 2.5.2 и 2.5.3, были получены соответствующие нуклеиновые кислоты, кодирующие такие конструкции. Указанные последовательности нуклеиновых кислот были оптимизированы для экспрессии в клетках человека путем исключения редких кодонов и минимизацией вторичной структуры мРНК.
Кодирующие нуклеиновые кислоты были встроены в плазмиду р^NАVАСС-υ1ί^а (р^NАVАСС5, ΝΕΟ’, США, 11Цр://\у\у\у.па1х.сот/). Также были получены две контрольные плазмиды: рНЕК2р^NАVАСС, кодирующая непроцессированный белок НЕК 2 (номер доступа в базе ОеиВаик Р04626) (положительный контроль) и р^NАVАСС-^НА5, кодирующая неродственый белок гНА5, соответствующий фрагменту (АК 17-346) гемагглютинина (НА) вируса гриппа А подтипа Н5Ш (номер доступа в базе ОеиВаик АВЬ31766) (отрицательный контроль). Еще один отрицательный контроль был представлен пустой плазмидой р^NАVАСС5.
Четыре конструкции были созданы и протестированы.
1. рВСИ - р^NАVАСС, содержащая последовательность, кодирующую универсальную полиэпитопную конструкция из примера 2.1.3.8;
2. рВСА0201 - р^NАVАСС, содержащая последовательность, кодирующую полиэпитопную конструкцию для НЬА-А*0201 (3.2-А*0201 - вариант 2);
3. рНЕК2 - р^NАVАСС, содержащая последовательность, кодирующую белок НЕК2 (3.2-В*3501 вариант 2);
4. ргНА5 - р^NАVАСС, содержащая последовательность, кодирующую фрагмент гемагглютинина вируса гриппа Н5№ (см. пример 2.5.4), неродственный НЕК2.
Для экспрессии общего С-концевого фрагмента полиэпитопных конструкций (ро1уЕС1) была также создана рекомбинантная плазмида рЦЕ30 (Цхадеи, Германия). Этот С-концевой фрагмент экспрессировали в клетках Е.соН, очищали и применяли для иммунизации животных (мышей ВЛЬВ/с) для получения поликлональных антител, распознающих полиэпитопные антигены, предложенные в настоящем изобре- 29 025280 тении. Эффективность связывания с антителами проверяли с применением ИФА. Эти антитела применяли для мониторинга эффективности трансфекции дендритных клеток (ЭС, ДК) и эффективности экспрессии полиэпитопных антигенов после трансфекции. Для детекции экспрессии НЕК2 и неродственного белка (гНА5) применяли соответствующие поликлональные мышиные антитела. Антитела получали иммунизацией мышей ВАЬВ/е введением интраперитонеально 20 пг соответствующего антигена (гНА5 или ро1уЕС!) в полном адъюванте Фрейнда (81дта, США) и повторно иммунизировали тем же количеством указанного антигена в неполном адъюванте Фрейнда (81дта, США) с интервалом 14 дней. Через 10 дней после последней иммунизации собирали кровь и готовили антисыворотку. Каждая группа состояла из шести животных; сыворотку смешивали. Оба антигена, использованных для иммунизации, синтезировали в прокариотической экспрессионной системе (Е.соН) и очищали аффинной хроматографией с применением Νί-ΝΉ агарозы (Ц1адеп, Германия). гНА5 также экспрессировали с применением экспрессионного вектора рЦЕ30.
Эффективность индукции Т-клеточного ответа каждой из указанных конструкций определяли с применением следующего ш уйго теста.
здоровых доноров, экспрессирующих НЬА-А*0201, отбирали с применением ПЦР-анализа АЬЬ8ЕТ™ СОШ ЖА А ЬОА КЕ8 88Р (1пуйгодеп, США). Этот алломорф ГКГС I представляет собой один из наиболее часто встречаемых в популяциях человека. Мононуклеарные клетки (МК) фракционировали из периферической крови НЬА-А2+-нормальных доноров путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-урографина (81дта-А1бпсН, США; 8сНегшд, Германия). Полученные МК высевали в пластиковые культуральные чашки (Жпс, Дания), и обогащенные моноцитами адгерентные клетки наблюдали после 1 ч инкубации при 37°С. Неадгерентные клетки удаляли и криоконсервировали, а адгерентные клетки культивировали в присутствии 50 нг/мл гНСМ-С8Р (ВюУ181оп, США) и 200 нг/мл гЫЬ-4 (ВюУК 81оп, США) в среде АГМ-У ОпуНгодеп, США) (ОЬегта1ег В. е! а1., Вю1. Ргосеб. ОпНпе, 2003, (5): 197-203). Через 24 ч добавляли ЛПС (Е.соН 055:В5, 81дта, США) (5 мкг/мл) для стимуляции созревания ДК. После 24-часовой инкубации обработанные ЛПС клетки собирали и использовали в качестве зрелых ДК. ДК были помечены с применением РГГС- или РЕ-конъюгированными тАЬ, специфичными для СЭ3, СЭ11с, СЭ14, СЭ83, СЭ86 и НЬА-ΌΚ (все от ВЦ Вю8с1епсе8, США). Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью РАС8СаНЬиг (ВЦ Вю8с1епсе8, США). Фагоцитирующую способность ДК оценивали с применением ПТС-меченого декстрана (81дта, США) (ЭеПа Ве11а 8. е! а1., 1. Вю1. Ьеикосу!е, 2004, 75 (1; 106-16; Ка!о М. е!.а1. Ш!. Iттиηо1., 2000, 11: 1511-1519).
Полученные зрелые ДК были трансфицированы указанными конструкциями с применением МАТга (трансфекция клеток при помощи магнитного поля, от Рготокше, Германия), следуя рекомендациям производителя (Нйр://\у\у\урготоктетпГо/Гбеабтт/РОР 8/Се11_Т гатГесйоп/МАТ га_НапбЬоок_ргото
Кше.рбТ). Эффективность трансфекции определяли с применением дот-блот анализа (с использованием поликлональных антител, специфичных в отношении общих С-концевых фрагментов полиэпитопов согласно настоящему изобретению см. выше) или с применением флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные плазмиды были подготовлены с применением набора для мечения методом ник-трансляции (РготоКше, Германия). ДК, трансфицированные мечеными плазмидами, анализировали с применением флуоресцентной микроскопии. На основе этих измерений достигалась эффективная трансфекция и экспрессия антигенов.
Синтезированные зрелые ДК совместно культивировали в течение 48 ч с ранее полученными фракциями аутологичных неадгерентных мононуклеарных клетках (МК) (в соотношении 1:10) в присутствии 40 нг/мл рекомбинантного человеческого Ш-18 и 10 нг/мл Ш-12 (ВюУ181оп, США), чтобы стимулировать клеточный иммунный ответ ш уйго. Было создано пять групп:
1. ЭС: ргНА5 + неадгерентные МК;
2. ЭС:рНЕК2 + неадгерентные МК;
3. ЦС:рВСи + неадгерентные МК;
4. ЦС:рВСА0201 + неадгерентные МК;
5. Нестимулированные неадгерентные МК.
Для изучения Т-клеточного ответа клетки рака груди МСР-7 (Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии Российской академии наук; идентификационный номер ЕСАСС 86012803; ЮЬС НТЬ95021) использовали в качестве клеток-мишеней (а также аутологичные ДК, временно трансфицированные рНЕК2). МСР-7 клетки экспрессируют и ЕгЬВ2, и НЬА-А*0201 (т.е. представляют собой НЬА-А*0201+/ЕгЬВ2+). Это важно, поскольку Т-лимфоциты большинства отобранных доноров экспрессируют ту же аллель НЬА-А.
Уровни синтеза антиген-специфичного γΣΡΝ и ТЬ-4 исследовали путем внутриклеточного окрашивания цитокинов с последующей проточной цитометрией. РВМС собирали и ресуспендировали до 2х106 кл./мл в КРМI 1640 и 10% Н8. Культуры рестимулировали либо МСР-7 раковыми клетками, либо аутологичными ДК, трансфицированными рНЕК2 при 2х106 кл./мл. После 2 ч инкубации добавляли раствор ингибитора белкового транспорта Со1д1Р1ид™ (содержащий брефелдин А) (ВЦ В1о8с1еп8е8, США), и инкубационный период продлевали до 12 ч при 37°С и 5% СО2. Для внутриклеточного мечения клетки
- 30 025280 фиксировали и пермеабилизовали в течение 30 мин при комнатной температуре с применением пермеабилизующего раствора ΒΌ РАС8 (ΒΌ Вю8с1епсе8, США) с последующей промывкой. Затем клетки метили РЕ-или ИТС-конъюгированными моноклональными антителами, специфичными для γΣΡΝ или !И-4, и ί'.Ό4 или СЭ8 (все - от ΒΌ Вюкиепсек, США) в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. После отмывки окрашенные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии (РАС8СаПЪиг, ΒΌ Вюкшепсек, США). (Описание протокола можно найти по ссылке
Ьйр://№№№.ЪДЪ1О8С1епсе8.сот/8ирроП/ге8оигсе8/рго1осо18/су1ок1пе8_Рса..|8р).
Индуцированные ех У1уо цитотоксические ответы анализировали посредством измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), высвобождаемой из лизированных клеток-мишеней (клеток МСР-7 рака груди либо аутологичных АПК, трансфицированных рНЕК2) в разных экспериментальных и контрольных группах. Нерадиоактивный анализ цитотоксичности СуЮох 96® Коп-КаШоасБуе Су1о1ох1сйу А88ау представляет собой колориметрическую альтернативу радиоактивным методам анализа на цитотоксичность. При помощи теста Су1о1о.х 96® количественно определяется лактатдегидрогеназа (ЛДГ), стабильный цитозольный фермент, который высвобождается при лизисе клеток, во многом сходным с высвобождением [51Сг] при радиоактивном анализе. Высвобождаемую ЛДГ в культуральном супернатанте определяли посредством 30-минутного сопряжённого ферментного анализа, что приводило к превращению соли тетразолия в красный формазан. (Описание протокола можно найти по ссылке 1Шр://\у\у\у.рго1педа.сот/1Ь8/1Ы63/1Ы63.рйГ). Количество образовавшегося красителя пропорционально количеству лизированных клеток. Данные по поглощению видимой области спектра регистрировали с применением мультимодального микропланшетного ридера ЬВ 941 Тп§1аг (ВеййоМ Тесйпо1од1е8, Германия). Статистическую значимость наблюдаемых различий между группами оценивали с применением критерия суммы рангов Уилкоксона. Р <0,05 считали значимым.
Указанные полиэпитопные конструкции демонстрировали более высокую эффективность индукции Т-клеточных иммунных ответов относительно рНЕК2-конструкций и отрицательных контрольных конструкций; при этом универсальная конструкция рВСИ проявляла немного более высокую эффективность по сравнению с аллель-специфичной конструкцией рВСА0201. В частности, в тестах на цитотоксичность все экспериментальные группы демонстрировали значимо (р < 0,001) более высокую цитотоксичность чем оба отрицательных контроля. В экспериментах с применением аутологичных ДК в качестве клетокмишеней (фиг. 1А) статистически значимые различия между каждым из рВСИ и рВСА0201 отсутствовали, тогда как в обеих экспериментальных группах цитотоксическая активность, как было обнаружено, была выше, чем в соответствующих группах НЕК2 (р < 0,001); кроме того, когда отношение эффекторных клеток и клеток-мишеней составляло > 20:1, обе экспериментальные группы демонстрировали результаты, превосходящие рНЕК2 (30:1) (р < 0,01). Применение клеток МСР-7 в качестве мишеней (фиг. 1В) показало, что рВСИ-конструкция индуцирует немного более высокую цитотоксичность по сравнению с рВСА0201 (с отношением эффекторы/мишени 10: 1 значение р составляло < 0,013, а с отношением 20: 1 - р < 0,042; при отношении эффекторы/мишени 30:1 обнаружено, что различия между этими двумя экспериментальными группы незначимы). Если отношение эффекторные клетки/клетки-мишени составляло > 20:1, обе экспериментальные группы демонстрировали результаты, превосходящие рНЕК2 (30: 1) (р<0,01). Количества продуцирующих γΣΡN СИ8+-Т-клеток, стимулированных присутствием раковых клеток МСР-7, значимо различалось между группами, стимулированными ДК, трансфицированными рНЕК2, рВСИ и рВСА0201 (р<0,01) (фиг. 2А). Обнаружено, что антиген-специфичный синтез γ^Ν (стимулированный присутствием клеток МСР-7) СИ4+-Т-лимфоцитами в группах, стимулированных ДК, трансфицированными либо рВСИ, либо рВСА0201, различался незначимо, в то время как обе эти группы демонстрировали значительно более высокие уровни секретирующих γΣΡN СИ4+-Т-клеток по сравнению с уровнями, обнаруживаемыми в СИ4+-Т-клетках, стимулированных ДК, трансфицированными рНЕК2 (р<0,001) (фиг. 2В). Таким образом, определенная ш уйго эффективность протестированных конструкций для индукции Т-клеточного ответа была следующей: рВСИ > рВСА0201 >> рНЕК2.
Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами реализации, описанными в настоящей заявке. Безусловно, различные модификации настоящего изобретения, помимо описанных в настоящей заявке, будут очевидны для специалистов в данной области техники, исходя из предшествующего описания и прилагаемых чертежей. Такие модификации подпадают под действие прилагаемой формулы изобретения.
Далее, следует понимать, что все значения являются приблизительными и приведены с целью описания.
В настоящей заявке цитируются патенты, патентные заявки, публикации, описания продуктов и протоколов, сущность которых включена в настоящую заявку посредством ссылок во всей их полноте и для любых целей.
Claims (9)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Изолированная полиэпитопная конструкция для стимуляции ответа Т-лимфоцитов, состоящая из последовательности, выбранной из группы, включающей- 34 025280МЕЬААЬСК\УОШ,АШ>РОАР1К}ЕМУК1РУА1КУЕКЕМТА1Х5КЕЕСКУЬОеЬРОеКУ8ЕОРГУРЬРООЕАУУМАОУАОЬКрЕТЕЬУЕРЬТРРРОКА8РЬТ8П8АУУС11ГУУУЬОУУГРПАОМЕНЬИЕУКАПСКОТГНККНОЕРОЬОРЕОЬОУГИЭАОЕУреУУиРОЬАРОСОЬСМОАРВЬОХТКСЖГОРОУКУтЗСАРОТХУРЮОЬТЬОЬЕРРПЬКАЗСУТАСРУАПуОЕО18\УЕОЕК8ЬКЕЬО£<ЖАЕРМ01АКСМ8УАЕР6РЕАВ0С\ТОЬ1<Ь$¥МР1\УКРАОЬКРЬОКЬК1УКОГОЬРЕПХУА£ЛУАКОАРР8ТТ'КАС\УК[}УРАГК01Л'КГТОРОЬАКЕЬРЬУ11№1ААЮЮУШУСУТ\ЖО'[ТРУТСА8Р№ЬУ13А\УР031,КТУСАС<Х’ЛК8ОК1РС;8ЬАРЕРПЬНСРАЬ\'’ТУАПВ8ТРУК8ЬЬАООКОЕМРУОСЬЬА1ХИ58СЛУСРЬАКРУАА\У1ЬКАААККАУУС1ЬЬУУУЬ<}УУРС1Ь1ККЕ00К1КККР1СТГОУУМ1МУКС\¥М1О8ЕККА0М1Ш,КЕТЕиЖУКУЬС8ОАККЖАУМАЬЕ81ЕКЕКРТН08ОУККР1СТГОУУМ1МУКС\УΜΟ8ΚΚΚ8ΗΑ0Υ0ΤΙ (8Ер ГО N0: 456),МЕЬААЬСЕ.\УОЬЬЬАЕЬРРОАРРОЬЬАЕЬРРОАРИАТЬЕЕ1ТО¥ЬАШЗЕАУУМАР1ЬНКОАУ8ЕР0ЕРЕОМУАЕ8П8АУУС1А01.МРУССЕЬРР1Л'УУЕСУУРГОЬ0ЕК8ЕТЕ1А1ЬЕ\УУЬСЛФВА\УС,1ЬЬ\УАБ.АЕСК'УаЬЬЕАПУ]8А\УРО8ЬКОК]РС8ЬА1ЪАКРЛ'АА'А’)ЪКАААККАУУО[иЛ'УУкСУАТСИиКК1«ЮК1КККР1СТГОУ¥М1МУКС'Л1МГО8ЕККА0МКГОКЕтеи<КУКУЬО8ОАКК1К)УМАЕЕ8ГОКЕКГТН08ПУККР1СПОУУМ1МУКС5РМ1О8ΡΚΚ8ΗΑΟΥ0ΤΙ (8Е<3 ГО N0: 457) иМЕЬААЕСКХУОЬЬЕАЕЬРРОАРАООКТРТАЕМРЕУААЬРАЗРЕТНЬРГОКУЗЕОРТУРЬРО ΟΑΕΡΤΕ®Ρ8ΡΕΑΙ>ΝΚΕΙΙΌΕΑΥΑΟΕΓΕΟΕΑΥνΜΡΕνννΕθννΡΑΟΜΟΙΑΚΟΜ8ΥΑΕΜΤ ΡΟΑΚΡΥΡΕαΚΛΡΙΜΓΑΡδΡΑΡΑϋΕΗΕ'ΡΑΙ.νΤΥΑΚΓνΑΑΧνΤΕΚΑΑΑΚΚΑννΟΠ.ΕνννΕα УУРОГОЖККООК1ЕККРКТГОУУМЛк1\’КС'Л'МШ8ЕККАС1МК1ЕКЕТЕЕККУКУЕС180 АКК1К\УМА1Е81ЕКККГТНС180УККР1СТГОУ5'М1М\'КС\УМГО8ККК8НАОУ{)[1 (8ЕЦ ГО N0: 458).
- 2. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая конструкцию по п.1.
- 3. Фармацевтическая композиция для стимуляции ответа Т-лимфоцитов, содержащая конструкцию по п.1 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
- 4. Фармацевтическая композиция для стимуляции ответа Т-лимфоцитов, содержащая нуклеиновую кислоту по п.2 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
- 5. Способ стимуляции ответа Т-лимфоцитов у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему конструкции по п.1 или нуклеиновой кислоты по п.2.
- 6. Способ стимуляции ответа Т-лимфоцитов у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции по п.3 или фармацевтической композиции по п.4.
- 7. Способ лечения рака молочной железы у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему конструкции по п.1 или нуклеиновой кислоты по 2.
- 8. Способ лечения рака молочной железы у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции по п.3 или фармацевтической композиции по п.4.
- 9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что рак молочной железы представляет собой НЕК2положительный рак молочной железы.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31198110P | 2010-03-09 | 2010-03-09 | |
| PCT/IB2011/000973 WO2011110953A2 (en) | 2010-03-09 | 2011-03-09 | Polyepitope constructs and methods for their preparation and use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201290813A1 EA201290813A1 (ru) | 2013-04-30 |
| EA025280B1 true EA025280B1 (ru) | 2016-12-30 |
Family
ID=44563931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201290813A EA025280B1 (ru) | 2010-03-09 | 2011-03-09 | Полиэпитопные конструкции и способы их получения и применения |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20130011424A1 (ru) |
| EP (1) | EP2545071A2 (ru) |
| EA (1) | EA025280B1 (ru) |
| WO (1) | WO2011110953A2 (ru) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012124631A1 (ja) | 2011-03-11 | 2012-09-20 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | シトルリンを含有するアジュバント組成物 |
| RU2520091C2 (ru) * | 2012-08-16 | 2014-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АваксисБио" | Способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной днк-конструкцией |
| WO2014157692A1 (ja) | 2013-03-29 | 2014-10-02 | 大日本住友製薬株式会社 | Ｗｔ１抗原ペプチドコンジュゲートワクチン |
| WO2014157704A1 (ja) * | 2013-03-29 | 2014-10-02 | 大日本住友製薬株式会社 | Ｅｒａｐ１によるトリミング機能をきっかけとしたコンジュゲートワクチン |
| RU2521506C1 (ru) * | 2013-04-01 | 2014-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоМедТех" (ООО "БиоМедТех") | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы |
| WO2015142963A1 (en) | 2014-03-17 | 2015-09-24 | Tapimmune Inc. | Nucleic acid molecule vaccine compositions and uses thereof |
| EP2959915A1 (en) * | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Institut Pasteur | A dengue virus chimeric polyepitope composed of fragments of non-structural proteins and its use in an immunogenic composition against dengue virus infection |
| JP2018508481A (ja) * | 2015-02-02 | 2018-03-29 | ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム | 複数のｔ細胞エピトープを有する標的化部分ペプチドエピトープ複合体 |
| EP3383427A4 (en) * | 2015-12-04 | 2019-11-27 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | METHODS AND VACCINES FOR INDUCING IMMUNE RESPONSES OF MULTIPLE DIFFERENT CMH MOLECULES |
| RU2684235C2 (ru) * | 2016-11-29 | 2019-04-04 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Полиэпитопная противоопухолевая вакцинная конструкция, содержащая эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов, фармацевтическая композиция и ее применение для стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа |
| JP2020524145A (ja) * | 2017-06-16 | 2020-08-13 | ナントバイオ，インコーポレイテッド | 細菌性ワクチン |
| AU2018346511A1 (en) * | 2017-10-05 | 2020-04-23 | Nantcell, Inc. | Multivalent antigens stimulating Th1 and Th2 |
| CN110904127A (zh) | 2018-09-18 | 2020-03-24 | 瓦赫宁恩研究基金会 | 非洲猪瘟病毒疫苗 |
| CN113480666B (zh) * | 2021-08-13 | 2024-01-26 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | Ca153融合蛋白及其制备方法和ca153检测质控品或校准品 |
| US20230145121A1 (en) * | 2021-08-31 | 2023-05-11 | Washington University | Neoantigen vaccines for triple negative breast cancer |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001019408A1 (en) * | 1999-09-16 | 2001-03-22 | Zycos Inc. | Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides |
| WO2001068677A2 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Genzyme Corporation | Derivatives of breast canacer antigen her-2 for therapeutical use |
| WO2005089164A2 (en) * | 2003-12-31 | 2005-09-29 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions |
| WO2005112969A2 (en) * | 2004-04-22 | 2005-12-01 | Oregon Health And Science University | Herstatin or intron 8-encoded domain thereof for modulating signaling mediated by igf-1 receptor and erbb receptors |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| DK0506868T4 (da) | 1989-12-22 | 2004-04-26 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Immunologisk aktive proteiner fra Borrelia burgdorferi, tilhørende testkits og vaccine |
| ZA921025B (en) | 1991-02-15 | 1992-11-25 | Uab Research Foundation | Structural gene of pneumococcal protein |
| WO1993004175A1 (en) | 1991-08-15 | 1993-03-04 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| EP0540457A1 (en) | 1991-10-22 | 1993-05-05 | Symbicom Ab | Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis |
| EP0773993A4 (en) | 1994-08-19 | 2000-07-05 | Gen Hospital Corp | PORCINE CELLS TREATED BY GENETIC ENGINEERING |
| JP5782775B2 (ja) | 2011-03-29 | 2015-09-24 | ソニー株式会社 | 情報表示装置および情報表示方法、並びにプログラム |
-
2011
- 2011-03-09 WO PCT/IB2011/000973 patent/WO2011110953A2/en active Application Filing
- 2011-03-09 EP EP11725956A patent/EP2545071A2/en not_active Withdrawn
- 2011-03-09 US US13/583,439 patent/US20130011424A1/en not_active Abandoned
- 2011-03-09 EA EA201290813A patent/EA025280B1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001019408A1 (en) * | 1999-09-16 | 2001-03-22 | Zycos Inc. | Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides |
| WO2001068677A2 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Genzyme Corporation | Derivatives of breast canacer antigen her-2 for therapeutical use |
| WO2005089164A2 (en) * | 2003-12-31 | 2005-09-29 | Pharmexa Inc. | Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions |
| WO2005112969A2 (en) * | 2004-04-22 | 2005-12-01 | Oregon Health And Science University | Herstatin or intron 8-encoded domain thereof for modulating signaling mediated by igf-1 receptor and erbb receptors |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201290813A1 (ru) | 2013-04-30 |
| EP2545071A2 (en) | 2013-01-16 |
| WO2011110953A2 (en) | 2011-09-15 |
| WO2011110953A3 (en) | 2012-07-05 |
| WO2011110953A8 (en) | 2012-05-10 |
| US20130011424A1 (en) | 2013-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA025280B1 (ru) | Полиэпитопные конструкции и способы их получения и применения | |
| JP2024045573A (ja) | 腫瘍特異的なネオ抗原を同定する組成物および方法 | |
| EP2089423B1 (en) | Antigen specific multi epitope vaccines | |
| ES2373055T3 (es) | Péptido antígeno de rechazo de cáncer derivado de glipican-3 (gpc3) para uso en pacientes positivos a la hla-a2 y producto farmacéutico que comprende el antígeno. | |
| US20220111030A1 (en) | Antigen specific multi epitope-based anti-infective vaccines | |
| US20160022791A1 (en) | Cytotoxic T Lymphocyte Inducing Immunogens For Prevention Treatment and Diagnosis of Cancer | |
| JP2019502360A (ja) | Ｃｌｌおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ | |
| JP6259983B2 (ja) | Ｔｈ１細胞のＫＩＦ２０Ａエピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン | |
| JP6255593B2 (ja) | Ｔｈ１細胞のＣＤＣＡ１エピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン | |
| US11819542B2 (en) | Immunotherapeutic method for treating lung cancer by administering a polypeptide comprising an epitope of hZP3 | |
| US9808504B2 (en) | Immunogenic epitopes as targets for universal cancer vaccines | |
| TW201416374A (zh) | 對於ｔｈ１細胞之ｌｙ６ｋ抗原決定位胜肽及含此之疫苗 | |
| Adamina et al. | Heterologous prime-boost immunotherapy of melanoma patients with Influenza virosomes, and recombinant Vaccinia virus encoding 5 melanoma epitopes and 3 co-stimulatory molecules. A multi-centre phase I/II open labeled clinical trial | |
| RU2793972C2 (ru) | Иммунотерапевтический способ лечения и/или профилактики рака легких | |
| US9394352B2 (en) | Immunogenic POTE peptides and methods of use | |
| JP4961706B2 (ja) | Ｈｌａクラスｉｉ拘束性新規癌抗原ペプチド | |
| Abu | Identification of Glypican3-derived Long Peptides Capable of Inducing both CTL and Th cells and Useful for Immunotherapy of Hepatocellular Carcinoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |