EA024497B1

EA024497B1 - Пептид, связывающийся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека i класса, и его применение для лечения рака

Info

Publication number: EA024497B1
Application number: EA201201306A
Authority: EA
Inventors: Тони Вайншенк; Йенс Фриче; Штеффен Вальтер; Петер Левандровский; Харприт Сингх
Original assignee: Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2016-09-30
Also published as: CN102905721B; KR102324498B1; BR112012023692A2; CN112409452A; HUE027036T2; KR102388577B1; PL2547354T3; US20190321442A1; JP6535040B2; SI2845604T1; US9717774B2; KR102388761B1; CN112409453A; ES2642562T3; TWI681967B; EP3195873A1; MX2020011672A; JP7007504B2; US11969455B2; UA122047C2

Abstract

Изобретение относится к пептиду, связывающемуся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека I класса, нуклеиновой кислоте, его кодирующей, вектору экспрессии, клетке-хозяину, способу получения указанного пептида, активированному цитотоксическому Т-лимфоциту и способу его получения in vitro, a также к применению указанных Т-лимфоцита, пептида, нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии и клетки для лечения рака, где рак представляет собой рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек. Более конкретно, пептид по изобретению имеет общую длину от 10 до 14 аминокислот и содержит последовательность, которая выбирается из группы, включающей (а) последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 1; (b) вариант SEQ ID NO: 1, который индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом, где указанный вариант выбирается из группы последовательностей LFQILQGIVF, LYQILQGIVL, LYQILQGIVI, LFQILQGIVL и LFQILQGIVI.

Description

Изобретение относится к пептиду, связывающемуся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека I класса, нуклеиновой кислоте, его кодирующей, вектору экспрессии, клетке-хозяину, способу получения указанного пептида, активированному цитотоксическому Т-лимфоциту и способу его получения т уйго, а также к применению указанных Т-лимфоцита, пептида, нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии и клетки для лечения рака, где рак представляет собой рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек. Более конкретно, пептид по изобретению имеет общую длину от 10 до 14 аминокислот и содержит последовательность, которая выбирается из группы, включающей (а) последовательность, состоящую из 8Е(.) II) \О: 1; (Ь) вариант 8 Ей.) II) \О: 1, который индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом, где указанный вариант выбирается из группы последовательностей ЕЕ(,)1!,(,)(И УЕ, ЕА Α,)ΙΕ(,)( И УЬ, ЕА4,)1Е(,)(г1 VI, ЕЕ(,)11,(,)О1УЕ и ЬЕР1ЬРО1У1.

Настоящее изобретение относится к пептидам, нуклеиновым кислотам и клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится далее к опухолеассоциированным эпитопам Т-клеток СЭ8'. в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты композиций вакцины, стимулирующей противоопухолевые иммунные ответы. Настоящее изобретение относится к пептидам, образованным из молекул НЬЛ класса I человеческих опухолевых клеток, которые могут быть использованы в вакцинных композициях в целях вызывания противоопухолевых иммунных ответов, в частности ответов цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ).

Уровень техники

Рак желудка является заболеванием, при котором злокачественные клетки формируются в слизистой оболочке желудка. Рак желудка может развиваться в любой части желудка и может распространяться по всему желудку и проникать в другие органы; в частности пищевод, легкие и печень. Рак желудка занимает четвертое место по частоте распространения в мире, в 2002 г. этот диагноз был поставлен в 930000 случаев. Это заболевание связано с высокой смертностью (~800000 случаев в год), из-за чего оно является второй по частоте причиной летального исхода от рака после рака легких. Оно более распространено среди мужчин и возникает чаще в странах Азии и развивающихся странах. (1Шр://\у\у\у.\у1ю.т1/теФасеп1ге/Гас15пее15/Г5297/еп/).

На него приходятся ежегодно 2% (25500 случаев) всех новых случаев заболевания раком в США, однако данное заболевание больше распространено в других странах. Это самый распространенный вид рака в Корее, на который приходятся 20,8% всех злокачественных новообразований. В Японии рак желудка остается наиболее распространенным видом рака у мужчин. В США диагноз рак желудка ежегодно ставится около 13000 мужчин и 8000 женщин, большинству из которых больше 70 лет.

Рак желудка занимает четвертое место по частоте распространения в мире после рака легких, молочной железы, рака толстой и прямой кишки. Кроме того, рак желудка продолжает быть второй по частоте причиной летального исхода от рака. По прогнозу Американского общества по борьбе с раком число новых случаев заболевания в 2007 г. предположительно составило 1 млн, около 70% из которых приходится на развивающиеся страны и с ними связано около 800000 летальных исходов (Ьйр://№№№.сапсег.ог§/4о№п1оа48/8ТТ/О1оЬа1_Рас18_ап4_р1диге8_2007_геу2.р4Г).

В отношении частоты заболеваемости по всему миру существуют колоссальные географические различия. Наиболее высокий процент распространения заболевания приходится на Азию и части Южной Америки, наиболее низкий - на Северную Америку. Наиболее высокий уровень смертности зарегистрирован в Чили, Японии, Южной Америке и в странах бывшего Советского Союза.

Зачастую диагноз рака желудка ставится на поздней стадии, так как скрининговое обследование не проводится в большинстве стран мира, за исключением Японии (и в ограниченной степени в Корее), где обнаружение зачастую происходит на ранней стадии. Таким образом, это продолжает оставаться наиболее сложной задачей для специалистов здравоохранения. Фактором риска для заболевания раком желудка является бактериальная инфекция НейсоЬас1ет ру1оп (Н.ру1оп), курение, потребление соли в больших количествах и другие факторы, связанные с питанием. Небольшое число случаев рака желудка (1-3%) связаны с синдромом наследственной предрасположенности к раку желудка. Мутации гена Е-кадхерина происходят приблизительно у 25% семей с аутосомным доминантным геном предрасположенности к раку желудка диффузного вида. Этот подвид рака желудка получил название наследственный диффузный рак желудка. Целесообразным может быть проведение генетического консультирования и принятие во внимание профилактической гастрэктомии в юном возрасте при бессимптомном протекании усечения зародышевой линии.

Стенки желудка состоят из трех слоев тканей: слизистого (глубинного) слоя, мышечного (среднего) слоя и серозного (крайнего) слоя. Рак желудка развивается в клетках, выстилающих слизистую оболочку, и распространяется во время роста во внешние слои. Применяются четыре стандартных способа лечения. Лечение рака желудка может включать хирургическую операцию, химиотерапию, лучевую терапию или химиолучевую терапию. Операция является основным способом лечения рака желудка. Целью операции является проведение полной резекции с отрицательным хирургическим краем (резекция типа К0). Однако приблизительно 50% пациентов, больных местно-распространенным раком желудка, не могут быть подвергнуты резекции типа К.0. Тип К1 указывает на микроскопические признаки неполной резекции (положительные края); и К2 указывает на макроскопические признаки неполной резекции, но без отдаленного распространения заболевания. Исход для пациента зависит от стадии рака во время постановки диагноза (Руководство по клинической практике в онкологии Национальной онкологической сети США (Νί'.’ί'.’Ν СПшса1 РгасОсе Ошбейпек ίη Опсо1оду™).

Процент выживаемости в течение 5 лет в случае радикальной резекции составляет 30-50% для пациентов на II стадии заболевания и 10-25% для пациентов на III стадии заболевания. Для этих пациентов существует высокая вероятность появления локальных и системных рецидивов. Метастазы появляются у 80-90% лиц, больных раком желудка, а показатель шестимесячной выживаемости равен 65% для тех, кому диагноз был поставлен на ранних стадиях, и менее 15% для тех, кому диагноз был поставлен на поздних стадиях.

- 1 024497

Таким образом, до сих пор существует потребность в новом, эффективном и безопасном способе лечения рака желудка, карциномы предстательной железы, карцином полости рта, плоскоклеточной карциномы полости рта (О8СС), острой миелоидной лейкемии (ЛМЬ), вызываемом Н.ру1оп МЛЬТлимфомы, карциномы толстого кишечника/колоректального рака, глиобластомы, немелкоклеточного рака легких (Ы§СЬС), карциномы шейки матки, рака молочной железы человека, рака предстательной железы, рака толстого кишечника, рака поджелудочной железы, протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, рака яичника, почечно-клеточной карциномы, рака печени, опухолей головного мозга различных фенотипов; лейкемии, такой как острая лимфобластная лейкемия (ЛЬЬ); рака легких, саркомы Юинга, эндометриального рака, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, эпителиального рака гортани, карциномы пищевода, карциномы ротовой полости, карциномы мочевого пузыря, карцином яичника, почечно-клеточной карциномы, атипической менингиомы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухолей головного мозга, карциномы слюнного протока, рака шейки матки, экстранодальных Τ/ΝΚ-клеточных лимфом, нехожкинской лимфомы и злокачественных солидных опухолей легких и молочной железы, а также других видов опухолей, в целях улучшения самочувствия пациентов без применения химиотерапевтических средств или же других препаратов, которые могут вызывать серьезные побочные эффекты.

В настоящее изобретение включены пептиды, которые стимулируют иммунную систему и выполняют функцию противоопухолевых препаратов неинвазивного способа воздействия.

Краткое изложение сущности изобретения

Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в природной иммунной защите против рака. В частности, СЭ8-положительные Т-клетки (ТСЭ8+), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, состоящими обычно из 8-10 аминокислотных остатков, образованных из белков или дефектных рибосомных продуктов (ΌΚΓΡ), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬЛ).

Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, встречающиеся на большинстве клеток, имеющих ядро. Молекулы МНС состоят из альфа-тяжелой цепи и бета-2-микроглобулина (рецепторы МНС класса I) или альфа- и бета-цепи (рецепторы МНС класса II) соответственно. Их трехмерная конформация образует связывающую бороздку, которая используется для нековалентного взаимодействия с пептидами. МНС класса I презентируют пептиды, образующиеся при протеолитическом расщеплении преимущественно эндогенных белков, продуктов ΌΚΓΡ и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК). В первую очередь, они презентируют пептиды экзогенных или трансмембранных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и молекул МНС I класса распознаются СО8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, несущими подходящий Т-клеточный рецептор (ТКР), тогда как комплексы из пептида и молекул МНС II класса распознаются СО4-положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС часто встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС I класса, как правило, имеют 8-12 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка (якори) в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет связывающий мотив, определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой.

В зависящей от МНС I класса иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС I класса, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими специфические Т-клеточные рецепторы (ТКР).

Антигены, которые распознаются опухолевыми специфическими ЦТЛ, т.е. их эпитопы, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые экспрессируются и по сравнению с не измененными клетками того же происхождения находятся в повышенном количестве в клетках соответствующей опухоли.

- 2 024497

Актуальная классификация опухолеассоциированных антигенов (ТАА) включает следующие основные группы:

a) раково-тестикулярные антигены: первые в истории идентифицированные ТАА, которые могут распознаваться Т-клетками, принадлежат к этому классу, называвшемуся первоначально раковотестикулярные антигены (СТ), так как его члены экспрессируются в отличных по гистологической структуре опухолях человека, а среди нормальных тканей - только в сперматоцитах/сперматогониях семенника и, изредка, в плаценте. Так как клетки семенника не экспрессируют молекулы НЬА I и II класса, то эти антигены не могут быть распознаны Т-клетками в нормальных тканях и поэтому могут рассматриваться как иммунологически опухолеспецифические. Хорошо известными примерами антигенов СТ являются члены семейства МАСЕ или ΝΥ-ΕδΟ-1;

b) антигены дифференциации: данные ТАА встречаются в опухолевых и нормальных тканях, из которых образуется опухоль; большинство из них обнаружено в меланомах и нормальных меланоцитах. Многие из этих линиеспецифических белков меланоцитов участвуют в биосинтезе меланина и поэтому не являются опухолеспецифическими, однако, несмотря на это, они широко применяются в противораковой терапии. Примеры включают, но без ограничения, тирозиназу и Ме1аи-А/МАКТ-1 для меланомы или Р8А для рака предстательной железы;

c) гиперэкспрессированные ТАА: гены, кодирующие широко экспрессированные ТАА, были обнаружены в отличных по гистологической структуре опухолях, а также во многих нормальных тканях, в основном с более низким уровнем экспрессии. Возможно, что многие эпитопы, процессируемые и потенциально презентируемые нормальными тканями, находятся ниже порогового уровня для распознавания Т-клетками, в то время как их гиперэкспрессия в опухолевых клетках может инициировать противораковый ответ, нарушая установившуюся ранее толерантность. Известными примерами ТАА этого класса являются Нег-2/иеи, сурвивин, теломераза или \УТ1;

й) опухолеспецифические антигены: данные уникальные ТАА образуются в результате мутаций нормальных генов (таких как β-катенин, СИК4 и т.д.). Некоторые из этих молекулярных изменений ассоциированы с неопластической трансформацией и/или прогрессией. Опухолеспецифические антигены, как правило, способны вызвать сильные иммунные ответы, не вызывая риска аутоиммунных реакций по отношению к нормальным тканям. С другой стороны, данные ТАА в большинстве случаев имеют отношение только к определенной опухоли, на которой они были идентифицированы, и обычно не являются общими для многих отдельных опухолей;

е) ТАА, образующиеся в результате аномальных посттрансляционных модификаций: такие ТАА могут образоваться из белков, которые не являются ни специфическими, ни гиперэкспрессированными в опухолях, однако, несмотря на это, становятся опухолеассоциированными в ходе посттрансляционных процессов, происходящих преимущественно в опухолях. Примеры для этого класса возникают в результате изменения характера гликозилирования, приводящего к появлению новых эпитопов в опухолях, как в случае МИС1, или при таких, как белковый сплайсинг во время деградации, который может или может не быть опухолеспецифическим;

ί) онковирусные белки: данные ТАА являются вирусными белками и могут играть ведущую роль в онкогенном процессе, и, так как они являются чужеродными (не человеческого происхождения), они могут провоцировать Т-клеточный ответ. Примерами таких белков являются вирусные белки человеческой папилломы типа 16, Е6 и Е7, которые экспрессированы в клетках карциномы шейки матки.

Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками и не экспрессироваться или экспрессироваться в сравнительно малом количестве здоровыми тканями. Далее желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или подавлении апоптоза. Кроме того, нисходящие мишени белков, непосредственно являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, опосредованно опухолеассоциированными. Такие опосредованно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (8шдй1а8И)а Н., ЕттепсН Ν.Ρ., Раттещее Н.С., Сапсег 1ттипо1. 1ттипое1йег. 2004 Маг; 453 (3): 187-95). В обоих случаях необходимо, чтобы эпитопы присутствовали в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίΐτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.

По существу, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίΐτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.

- 3 024497

Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть выделены из крови пациентов или здоровых субъектов, или же они могут быть основаны на генерировании дифференциальных транскрипционных профилей или дифференциальных паттернов пептидной экспрессии между опухолевыми и нормальными тканями.

Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не дает точной информации об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Это обусловлено тем, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Тклетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена посредством клонирования и способна к выполнению эффекторных функций (эффекторная Т-клетка).

Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа Т_Н1, поддерживают эффекторные функции СО8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоциированные комплексы из пептидов и МНС на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Пример масс-спектра СИС2-001, демонстрирующий его презентацию на образце первичной опухоли ОС2464.

A. Анализ с помощью ЖХ-МС с системой ионизации в наноэлектроспрее (ЫапоЕ§1-ЕСМ§) производили на пептидном пуле, элюированном из образца ткани РЖ 2464. Масс-хроматограмма для т/ζ 597,3501±0,001 Да, ζ=2 показывает пик пептида со временем удержания 151,63 мин.

B. Выявленный пик в масс-хроматограмме при 151,63 мин обнаружен сигналом для т/ζ 597,3501 на масс-спектре.

C. Индуцированный столкновением масс-спектр затухания из выбранного предшественника т/ζ 597,3501, записанный при эксперименте папоЕ§1-ЬСМ§ при заданном времени удержания, подтвердил присутствие СИС2-001 в опухолевом образце ОС2464.

И. Шаблон фрагментации синтетического контрольного пептида СИС2-001 записывали и сравнивали с шаблонами фрагментации генерированных природных пептидов ТиМАР, представленных на фиг. 1С для верификации последовательности.

Фиг. 2. Профили экспрессии мРНК выбранных белков в нормальных тканях и 25 образцах тканей рака желудка:

a) СИС2 (Идентификатор набора проб: 203213_а1);

b) А8РМ (Идентификатор набора проб: 219918_8_а1).

Фиг. 3. Отдельные результаты пептид-специфической иммуногенности ίη νίίτο пептидов ТИМАР I класса. С'П8' Т-клетки примировали с помощью искусственных АПК, нагруженных релевантным (левая секция) и нерелевантным пептидами (правая секция) соответственно. После трех циклов стимуляции обнаружение клеток, реагирующих с пептидом, производилось с помощью двойного окрашивания релевантными и нерелевантными А*2402-мультимерами. Среди показанных клеток проводили гейтирование живых лимфоцитов С'П8'. и цифрами на точках обозначена процентная доля мультимер-положительных клеток.

Подробное описание изобретения

Все термины, используемые в контексте данного изобретения, если не указано иное, имеют значения, данные ниже. Понятие пептид в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Предпочтительно, чтобы пептиды имели длину в 9 аминокислот, но они могут быть короче, длиной в 8 аминокислот, и длиннее - 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислот в длину.

Понятие олигопептид в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока в нем сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды, как правило, состоят примерно менее чем из 30 аминокислотных остатков в длину и более чем примерно 14 аминокислот в длину.

- 4 024497

Понятие полипептид обозначает серии аминокислотных остатков, связанных один с другим типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от понятий пептид или олигопептид, понятие полипептид введено для обозначения молекул, содержащих более чем приблизительно 30 аминокислотных остатков.

Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий такую молекулу, является иммуногенным (и, таким образом, иммуногеном в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В контексте настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, иммуноген будет представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать Т-клеточный ответ.

Для Т-клеточного эпитопа необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I класса, образующим трехчленный комплекс (альфа-цепь МНС класса I, бета-2-микроглобулин и пептид), который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, как правило, имеют длину в 8-14 аминокислот и, в особенности, как правило, длину в 9 аминокислот.

У человека имеется три различных генетических локуса, которые кодируют молекулы МНС I класса (молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬЛ)): НЬЛ-Л, НЬА-В и НЬЛ-С. НЬЛ-Л*01, НЬЛ-Л*02 и НЬЛ-Л*024 являются примерами различных аллелей МНС I класса, которые могут экспрессироваться из этих локусов.

Табл. 1: Частоты экспрессии Р НЬЛ*Л024 и наиболее частые серотипы НЬЛ*Л02402. Частоты экспрессии выведены из частот гаплотипа С_й среди населения США, адаптированных из публикации (Мой с1 а1. 1017-27) с использованием формулы Харди-Вейнберга Р=1-(1-О_г)² Более подробная информация представлена в работе (Сйапоек с1 а1. 1211-23).

Таблица 1

Частоты экспрессии НЬЛ*24 и серотипов А*2402 по всему миру

Аллел	Популяция	Фенотип, рассчитанный из частоты
ь		аллеля
А‘24	Филиппины	65%
А‘24	Русские	61%
А‘240	ненцы Япония	59%
2 А‘24	Малайзия	53%
А‘240	Филиппины	54%
2 А‘24	Индия	47%
А‘24	Южная	40%
А‘24	Корея Шри-Ланка	37%
А‘24	Китай	32%
А‘240	Индия	29%
2 А‘24	Западная	22%
А‘24	Австралия США	22%
А‘24	Россия,	20%
А‘24	Самара Южная	20%
А‘24	Америка Европа	13%

Используемая в контексте данного описания ссылка на последовательность ДНК включает как однонитевую, так и двунитевую ДНК. Таким образом, специфическая последовательность, если в контексте не указано иное, относится к однонитевой ДНК такой последовательности, дуплексу такой последовательности с его комплементом (двунитевая ДНК) и комплементу такой последовательности. Понятие

- 5 024497 кодирующая область относится к тому участку гена, который в естественных или обычных условиях кодирует продукт экспрессии того гена в его естественном геномном окружении, т.е. участку, кодирующему ίη νίνο нативный продукта экспрессии гена.

Кодирующая область может быть из не мутировавшего (нормального), мутировавшего или измененного гена или может даже быть из последовательности ДНК, или же гена, целиком синтезированного в лаборатории с использованием методов, хорошо известных специалистам области синтеза ДНК.

Понятие нуклеотидная последовательность относится к гетерополимеру дезоксирибонуклеотидов.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный пептид, олигопептид или полипептид, может быть встречающейся в природе или может быть синтезирована. В целом, сегменты ДНК, кодирующие пептиды, полипептиды и белки данного изобретения, собраны из фрагментов кДНК и коротких олигонуклеотидных линкеров или же из серий олигонуклеотидов для получения синтетического гена, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице, включающей регуляторные элементы, образованные из микробного или вирусного оперона.

Понятие продукт экспрессии означает полипептид или белок, являющийся природным продуктом трансляции гена любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует эквиваленты, образующиеся в результате вырождения генетического кода и, таким образом, кодирует ту/те же самую(ые) аминокислоту(ы).

Понятие фрагмент, если относится к кодирующей последовательности, означает участок ДНК, включающий меньше, чем полную кодирующую область, продукт экспрессии которого, по существу, сохраняет ту же самую биологическую функцию или активность, что и продукт экспрессии полной кодирующей области.

Понятие сегмент ДНК относится к полимеру ДНК в виде отдельного фрагмента или в качестве компонента более крупной конструкции ДНК, которая была образована из ДНК, выделенной по меньшей мере один раз, по существу, в чистой форме, т.е. без контаминирующих эндогенных материалов и в количестве или с концентрацией, позволяющей идентификацию, манипуляцию и восстановление сегмента и его составных нуклеотидных последовательностей стандартными биохимическими методами, например, с использованием вектора для клонирования. Такие сегменты предлагаются в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними нетранслированными последовательностями или интронами, которые обычно присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслированной ДНК могут присутствовать по нисходящей от открытой рамки считывания, где она не интерферирует с манипуляцией или экспрессией кодирующих областей.

Понятие праймер означает короткую последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть спарена с одной нитью ДНК с получением свободного конца 3'ОН, на котором ДНК-полимераза начинает синтез дезоксирибонуклеотидной цепи.

Понятие промотор означает участок ДНК, задействованный в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции.

Понятие выделенный означает, что материал удален из его исходного окружения (к примеру, естественного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живых организмах, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих материалов природной системы, является выделенным. Такие полинуклеотиды могли быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли быть частью композиции и все-таки могли быть выделены, так что такой вектор или композиция не являются частью своего естественного окружения.

Полинуклеотиды и рекомбинантные или иммуногенные полипептиды, раскрытые в соответствии с настоящим изобретением, могут также быть в очищенной форме. Понятие очищенный не требует абсолютной чистоты; скорее оно предназначено для дачи относительного определения и может включать препараты с высокой очисткой или препараты только с частичной очисткой в соответствии с тем, как эти термины понимаются специалистами соответствующей области. Например, отдельные клоны, выделенные из библиотеки кДНК, как обычно очищались до электрофоретической чистоты. Очистка исходного материала или природного материала от примесей по меньшей мере на один порядок величины, предпочтительно два или три порядка и более предпочтительно четыре или пять порядков величины определенно рассматривается в изобретении. Более того, определенно рассматривается заявленный полипептид, чистота которого составляет предпочтительно 99,999% или по меньшей мере 99,99 или 99,9% и даже желательно 99 мас.% или более.

Нуклеиновые кислоты и продукты экспрессии полипептида, раскрываемые в соответствии с настоящим изобретением, в равной степени, как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или такие полипептиды, могут быть в обогащенной форме. Используемый здесь термин обогащенный означает, что концентрация материала по меньшей мере приблизительно в 2, 5, 10, 100 или 1000 раз выше его естественной концентрации (например), преимущественно 0,01 мас.%, предпочтительно по меньшей мере около 0,1 мас.%. Рассматриваются также обогащенные препараты с концентрацией примерно 0,5, 1, 5, 10 и 20 мас.%. Последовательности, конструкции, векторы, клоны и другие материалы, включенные в настоящее изобретение, могут быть предпочтительно в обогащенной форме или выделенными.

- 6 024497 выделенными.

Понятие активный фрагмент означает фрагмент, который дает иммунный ответ (т.е. обладает иммуногенной активностью), если он введен отдельно или факультативно с подходящим адъювантом животному, такому как млекопитающее, например кролику или мыши, также включая человека; таковой иммунный ответ, принимающий форму стимуляции ответа Т-клетки, у животного-реципиента, такого как человек. Альтернативно, активный фрагмент может также быть использован для инициации ответа Т -клетки ίη νίίτο.

В контексте настоящего описания понятия участок, сегмент и фрагмент, если они использованы по отношению к полипептидам, относятся к непрерывной последовательности остатков, таких как аминокислотные остатки, последовательность которых формирует подкласс более крупной последовательности. Например, если полипептид был подвергнут обработке любой из известных эндопептидаз, таких как трипсин или химотрипсин, то полученные в результате такой обработки олигопептиды будут представлять участки, сегменты или фрагменты исходного полипептида. Это означает, что любой таковой фрагмент будет обязательно содержать как часть его аминокислотной последовательности сегмент, фрагмент или участок, который, по существу, идентичен, если не в точности идентичен последовательности §ЕЦ ГО N0: 1 по 33, которая соответствует встречающимся в природе или материнским белкам последовательностей с 8ЕЦ ГО N0: 1 по 33. При использовании по отношению к полинуклеотидам эти понятия относятся к продуктам, полученным при обработке указанных полинуклеотидов любой из известных эндонуклеаз.

В соответствии с настоящим изобретением понятие процентная доля идентичности или идентичный с процентной долей, если оно относится к последовательности, означает, что последовательность сравнивается с заявленной или описанной последовательностью после выравнивания сравниваемой последовательности (Сравниваемая последовательность) с описанной или заявленной последовательностью (Контрольная последовательность). Процентная доля идентичности определяется затем по следующей формуле:

Процентная доля идентичности = 100 [I - (С/К)], в которой С является числом различий между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью по длине выравнивания между Контрольной последовательностью и Сравниваемой последовательностью, где:

(ΐ) каждое основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые не имеют соответствующего выравненного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, и (ΐΐ) каждая брешь в Контрольной последовательности и (ίίί) каждое выравненное основание или аминокислота в Контрольной последовательности, которые отличаются от выравненного основания или аминокислоты в Сравниваемой последовательности, представляют собой различие;

К - это число оснований или аминокислот в Контрольной последовательности по длине выравнивания со Сравниваемой последовательностью с любой брешью, образующейся в Контрольной последовательности, считающейся также за основание или аминокислоту.

Если существует выравнивание между Сравниваемой последовательностью и Контрольной последовательностью, для которых процентная доля идентичности, по расчетам выше, приблизительного равна или выше установленной минимальной Процентной доли идентичности, тогда Сравниваемая последовательность имеет установленную минимальную процентную долю идентичности с Контрольной последовательностью, если даже могут существовать выравнивания, в которых подсчитанная здесь выше Процентная доля идентичности меньше, чем установленная Процентная доля идентичности.

Исходные пептиды, раскрываемые в данном описании, могут быть модифицированы путем замены одного или нескольких остатков в различных, возможно отобранных, участках по длине пептидной цепи, если не заявлено иное. Такие замены могут носить консервативный характер, например, где одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, так же как при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Еще более консервативным будет замена аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, такое как при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определенные замены аминокислот допускаются чаще, чем другие, и они часто связаны со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и ее заменой; и таковой является основа определения консервативных замен.

Консервативные замены определены в контексте настоящего описания как обмены внутри одной из последующих пяти групп:

группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабополярные остатки (А1а, §ег, ТЬг, Рго, С1у); группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Акр, Акп, С1и, С1п); группа 3 - полярные, положительно заряженные остатки (Ηίκ, Агд, Ьук);

группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (Ме1. Ьеи, 11е, Уа1, Сук); группа 5 - крупные, ароматические остатки (РЬе, Туг, Тгр).

Менее консервативные замены могут охватывать замену одной аминокислоты другой, имеющей

- 7 024497 похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замены аланина остатком изолейцина. Высоконеконсервативные замены могут охватывать замену кислой аминокислоты другой, которая имеет полярность, или даже такой, которая имеет основной характер. Такие радикальные замены не могут, однако, быть отвергнуты как потенциально неэффективные из-за того, что химические эффекты не полностью предсказуемы, и радикальные замены могут неожиданно привести к благоприятным эффектам, не предсказуемых исходя из обычных химических принципов.

Разумеется, в таких заменах могут участвовать другие структуры, отличающиеся от обычных Ь-аминокислот. Таким образом, Ό-аминокислоты могут быть заменены Ь-аминокислотами, обычно встречающимися в антигенных пептидах по изобретению и также охватываемые настоящим раскрытием сущности изобретения. Кроме того, аминокислоты, содержащие нестандартные К-группы (т.е. К-группы, отличающиеся от обнаруженных в повсеместно встречающихся 20 аминокислотах природных белков), могут быть также использованы в целях замены для получения иммуногена и иммуногенных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.

Если были произведены замены более чем на одной позиции с получением пептида с практически эквивалентной или большей антигенной активностью, чем та, что определена ниже, то комбинации таких замен будут проанализированы для определения того, приведут ли эти комбинации замен к дополнительным или синергетическим эффектам по отношению к антигенности пептида. По большей части замены должны производиться не более чем на 4 позициях внутри пептида одновременно.

Понятие Т-клеточный ответ означает специфическую пролиферацию и активацию эффекторных функций, индуцированных пептидом ίη νίΐτο или ίη νίνο. Для ЦТЛ, рестриктированных по МНС I класса, эффекторными функциями может быть лизис клеток-мишеней, нагруженных пептидом, нагруженных предшественником пептида или клеток-мишеней, естественно презентирующих пептид; секреция цитокинов, предпочтительно интерферона-гамма, ΤΝΤ-альфа или ИЛ-2, индуцированная пептидом; секреция эффекторных молекул, предпочтительно гранзимов или перфоринов, индуцированная пептидом, или дегрануляция.

Предпочтительно, чтобы ЦТЛ, специфичные для пептида с 8ЕЦ ГО N0: 1 по 33, были испытаны относительно замещенных пептидов; концентрация пептида, при которой замещенные пептиды достигают половины максимального роста лизиса относительно фона, составляет не более чем около 1 мМ, предпочтительно не более чем около 1 мкМ, более предпочтительно не более чем около 1 нМ, еще более предпочтительно не более чем около 100 пМ и наиболее предпочтительно не более чем около 10 пМ. Также предпочтительно, чтобы замещенный пептид распознавался ЦТЛ более чем одного индивида, по меньшей мере двух и более предпочтительно трех индивидов.

Таким образом, эпитопы настоящего изобретения могут быть идентичны встречающимся в природе опухолеассоциированным или опухолеспецифическим эпитопам или могут включать эпитопы, отличающиеся не более чем 4 остатками от контрольного пептида при условии, что они имеют, по существу, идентичную антигенную активность.

Иммунотерапевтические подходы в лечении.

Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознаваемых иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Отдельные элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухольинфильтрирующих клеток или из периферической крови позволяет предположить, что такие клетки играют важную роль в природной иммунной защите против рака. В частности, СО8-положительные Т-клетки, которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), связанные с пептидами, имеющими обычно 8-12 аминокислотных остатков, образованных из белков или дефектных рибосомных продуктов (ΌΡΙΡ), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека также являются человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬА).

Молекулы МНС I класса могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся после протеолитического расщепления преимущественно эндогенных, цитозольных или ядерных белков, ΌΚΣΡ8, и более крупных пептидов. Однако пептиды, образованные из эндосомальных компартментов или экзогенных источников, также часто встречаются на молекулах МНС I класса. Этот неклассический способ презентации классом I в литературе называется кросспрезентацией.

Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена, и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. Далее желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифи- 8 024497 ческие и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или в апоптозе. В дополнение также нисходящие мишени белков, непосредственно являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести ίη νίΐτο или ίη νίνο к Т-клеточному ответу.

В основном любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа ίη νίΐτο или ίη νίνο является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.

Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть выделены у пациентов или здоровых субъектов, или же они основаны на генерировании различных профилей транскрипции или различном характере экспрессии пептидов опухолевыми и нормальными тканями (Ьетте1 с1 а1. 450-54; \νοίη5θ1ιοη1< с1 а1. 5818-27).

Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не дает точной информации об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Это обусловлено тем, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции конкретным антигеном может быть клонирована и способна выполнять эффекторные функции (эффекторная Т-клетка).

Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции СЭ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих комплексы опухолеассоциированный пептид/МНС на их клеточной поверхности. Таким образом, эпитопы опухолеассоциированных пептидов Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Так как оба вида ответов, зависящие от СЭ8 и от СЭ4. вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и синергически, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как СЭ8-положительными ЦТЛ (молекула МНС I класса), так и СЭ4-положительными ЦТЛ (молекула МНС II класса) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому задачей настоящего изобретения является предложение композиций пептидов, которые содержат пептиды, связывающиеся с комплексами МНС любого класса.

Ввиду серьезных побочных эффектов и расходов, связанных с лечением рака, крайне необходимы улучшенные методы прогнозирования и диагностики. Поэтому существует необходимость в идентификации других факторов, представляющих собой биомаркеры рака вообще и рака желудка, в частности. Кроме того, существует необходимость в идентификации факторов, которые могут быть использованы при лечении рака вообще и рака желудка в частности.

Более того, не существует стандартного способа лечения пациентов, больных раком желудка с биохимическим рецидивом после радикальной простатэктомии, обычно вызываемым резидуальным остатком опухоли ίη 5йи при наличии локально прогрессирующего роста опухоли. Желательны были бы новые терапевтические подходы, которые бы сопровождались низкой смертностью с адекватной терапевтической эффективностью по сравнению с имеющимися на данный момент терапевтическими подходами.

В настоящем изобретении предложены пептиды, которые пригодны для лечения рака желудка и других видов опухолей, которые гиперэкспрессируют пептиды по изобретению. Как показал массспектрометрический анализ образцов первичного рака желудка человека, эти пептиды презентировались в естественных условиях молекулами НЬА(см. пример 1 и фиг. 1).

Исходный ген, из которого образованы пептиды, был представлен в гиперэкспрессированном состоянии при раке желудка, почечно-клеточной карциноме, раке толстой кишки, немелкоклеточной карциноме легких, аденокарциноме, раке предстательной железы, доброкачественных новообразованиях и злокачественной меланоме по сравнению с нормальными тканями (см. пример 2 и фиг. 2), демонстри- 9 024497 рующие высокую степень взаимосвязи пептида с опухолью, т.е. эти пептиды в большом количестве презентируются на опухолевой ткани, но не на нормальных тканях.

Связанные с НЕЛ пептиды могут распознаваться иммунной системой, специфически Т-лимфоцитами/Т-клетками. Т-клетки могут разрушать клетки, презентирующие распознанный комплекс НБЛ/пептид; к примеру, опухолевые клетки рака желудка, презентирующие полученные пептиды.

Все пептиды настоящего изобретения, которые были совместимы с методикой валидации, см. пример 3, как было показано, в состоянии стимулировать Т-клеточные ответы (см. пример 3 и фиг. 3). Таким образом, эти пептиды пригодны для генерирования иммунного ответа в организме пациента для уничтожения опухолевых клеток. Иммунный ответ у пациента может быть индуцирован при непосредственном введении описанных пептидов или подходящих веществ-предшественников (к примеру, удлиненных пептидов, белков или нуклеиновых кислот, кодирующих эти пептиды) пациенту, в идеальном случае в комбинации с веществом, усиливающим иммуногенность (т.е. адъювантом). От иммунного ответа, вызванного такой терапевтической вакцинацией, может ожидаться, что он будет высоко специфическим против опухолевых клеток, так как целевые пептиды настоящего изобретения не презентируются на нормальных тканях со сравнимыми количествами копий, предотвращая, тем самым, риск нежелательных аутоиммунных реакций против нормальных клеток у пациента.

Кроме того, пептиды настоящего изобретения пригодны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из клеток рака желудка, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для диагностики наличия рака.

Присутствие заявленных пептидов на тканевых биоптатах может помочь патоморфологу в постановке диагноза рака. Выявление конкретных пептидов с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, могут дать знать патоморфологу, что ткань является злокачественной или воспаленной или же пораженной заболеванием вообще. Присутствие групп пептидов может позволить классифицировать или выделить подклассы пораженных тканей.

Выявление пептидов на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о целесообразности терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного контроля. Таким образом, присутствие пептидов показывает, что этот механизм не используется проанализированными клетками.

Пептиды могут использоваться в анализе ответов лимфоцитов против этих пептидов, таких как Т-клеточные ответы или ответы антител против пептида или пептида в комплексе с молекулами МНС. Такие иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, аутологичными материалами, адоптивным переносом лимфоцитов. В условиях, когда проводится генная терапия, в целях оценки побочных эффектов могут быть проанализированы ответы лимфоцитов на пептиды. Мониторинг реакций лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований после трансплантации, к примеру, для выявления реакций хозяин против трансплантата и трансплантат против хозяина.

Пептиды могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть нацеливание радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как РЕТ (позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точной локализации пораженных тканей.

Кроме того, пептиды могут быть использованы для подтверждения диагноза рака, поставленного патологом, на основании биоптата.

В табл. 2 описан пептид в соответствии с настоящим изобретением, соответствующая ему 8ЕО ГО N0 и исходный белок, из которого может быть образован данный пептид. Указанный пептид связывается с аллелями НЕЛ-Л*024.

Таблица 2

Пептид настоящего изобретения

ЗЕО ΝΟ:	ГО	Код пептида	Последовате льность	Исходный белок (белки)
1	СОС2-001	Ι-ΥΟΙΙ-ΟΘίνΡ	С0К1

Белок цикла клеточного деления 2 (СИС2).

Сериновая/треониновая киназа СЭС2. также известная как Сйк1 (циклин-зависимая киназа 1), играет ключевую роль в контроле клеточного цикла. Он известен как основной регулятор перехода от 02 к

- 10 024497 фазе М. В конце интерфазы он связывается с циклинами А-типа. После разрушения ядерной оболочки циклины А-типа заменяются циклином В, который образует фактор стимуляции митоза (МРР) с Сйс2. МРР необходим для прохождения клетками фазы митоза.

Функция белка Сйс2 в митозе не является избыточной и не может быть компенсирована активностью других Сйкъ, таких как Сйк2, 4 и 6. Напротив, об Сйс2 сообщалось, что он задействован в других фазах клеточного цикла, таких как переход 01-8, и он способен заменить Сйкк периода интерфазы. Таким образом, как было предложено, Сйс2 является единственным Сйк, незаменимым для клеточного цикла.

Г иперэкспрессия Сйс2 была обнаружена при нескольких видах рака и часто соотносилась с плохим прогнозом. Среди них находятся карцинома предстательной железы, карциномы ротовой полости, плоскоклеточные карциномы ротовой полости (08СС), острая миелоидная лейкемия (АМЬ) (Οίαη е! а1., 2009), Н.ру1от1-индуцированная МАЬТ-лимфома (Вапедее е! а1., 217-25) и карцинома толстой кишки (Уакш е! а1., 36-41). При раке желудка сообщалось о гиперэкспрессии и/или повышенной активности, и это может быть его причиной. Ингибиторы Сйс2 и другие белки Сйкк рассматривали в качестве кандидатов для лекарственных средств для леченияя рака (ЗЪарио, 1770-83).

Настоящее изобретение поэтому относится к пептиду, связывающемуся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса, обладающему общей длиной от 10 до 14 аминокислот, содержащему последовательность, которая выбирается из группы, включающей:

(a) последовательность 5>Е0 ГО N0: 1;

(b) вариант 5>Е0 ГО N0: 1, выбранный из группы последовательностей ΕΕΟΙΕΟΟίνΕ.

ЕУ01Е001УЕ. ΕΥΟΠ ,С)0\Е ΕΕΟΙΕΟΟίνΕ и ΕΕΟΙΕΟΟίνί.

Настоящее изобретение далее относится к пептидам, описанным ранее, где пептид включает непептидные связи.

Настоящее изобретение далее относится к пептидам, описанным ранее, где пептид является частью слитого белка, в частности, включающим Ν-терминальные аминокислоты НЬА-ИР антигенассоциированной инвариантной цепи (Ιί).

Настоящее изобретение далее относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей описанные ранее пептиды.

Настоящее изобретение далее относится к нуклеиновой кислоте, описанной ранее, которая является ДНК, кДНК, ПНК, РНК или их комбинациями.

Настоящее изобретение далее относится к вектору экспрессии, включающему описанную ранее нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение далее относится к пептиду, описанному ранее, к нуклеиновой кислоте, описанной ранее, или к вектору экспрессии, описанному ранее, для применения в медицине.

Настоящее изобретение далее относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту, описанную ранее, или вектор экспрессии, описанный ранее.

Настоящее изобретение далее относится к описанной клетке-хозяину, которая является антигенпрезентирующей клеткой.

Настоящее изобретение далее относится к описанной клетке-хозяину, где антигенпрезентирующая клетка является дендритной клеткой.

Настоящее изобретение далее относится к способу получения описанного пептида, причем способ включает культивирование описанной клетки-хозяина и выделение пептида из клетки-хозяина или из культуральной среды.

Настоящее изобретение далее относится к способу получения активированных цитотоксических Тлимфоцитов (ЦТЛ) ίη νίίτο, причем способ включает обеспечение контактирования ЦТЛ ίη νίίτο с нагруженными антигеном молекулами человеческого МНС I класса, экспрессированными на поверхности описанной ранее антигенпрезентирующей клетки в течение периода времени, достаточного для активации антигенспецифическим образом указанных ЦТЛ, где указанный антиген является любым описанным пептидом.

Настоящее изобретение далее относится к описанному способу, где антиген нагружен на молекулы МНС I класса, экспрессированные на поверхности описанной ранее антигенпрезентирующей клетки при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой.

Настоящее изобретение далее относится к описанному способу, где антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии, экспрессирующий описанный ранее пептид.

Настоящее изобретение далее относится к активированным цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ), полученным описанным способом, которые селективно распознают ранее описанный пептид.

Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ) для лечения рака путем уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клеткимишени аберрантно презентируют любой из ранее описанных пептидов. Причем лечение включает введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) в соответствии с определением.

- 11 024497

Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного пептида для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек. Более конкретно, указанный пептид может быть включен в состав вакцины.

Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанной нуклеиновой кислоты для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного вектора экспрессии для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

Настоящее изобретение далее относится к применению описанной ранее клетки для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ) для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

Настоящее изобретение далее относится к применению ранее описанного пептида получения антител, специфических к комплексу МНС/пептид, включающему указанный пептид.

Белки, кодируемые генами АВБ1, ΛΌΛΜ10, АНК, СС\1)2. СИС6, СИК1, СЕАСАМ1, СЕАСАМ5, СЕАСАМ6, СЕАСАМ6, СОЬбАЗ, Е1Р283, БОС255308, ЕРНА2, ЕКВВ2, ЕКВВ3, Р2К, РАК НММК, Н8Р90В1, 1СР2ВР3, ГГ0В4, К1Р2С, ККА8, БАМС2, ЬСЮ, ΜΕΤ, ММР11, ММР12, ММР3, М8Т1К, ΝυΡ2, ОБРМ4, РКОМ1, ККМ2, ΤΗΥ1, ТМРК884, ТОР2А, Τ8ΡΑΝ1, №ΝΤ5Α, НГР1А и РТК2, как было описано в литературе, экспрессируются в избытке клетками рака желудка по сравнению с нормальными тканями желудка или другими жизненно важными тканями (к примеру, печени, почек, сердца).

Было показано, что белки, кодируемые генами АВЬ1, ΑΌΑΜ10, ΑΌΑΜ8, АНК, А8РМ, ΑΤΑΌ2, ССЭС88А, СС№В1, ССМЖ СС\ТЛ СЭС6, СИК1, СЕАСАМ1, СЕАСАМ5, СЕАСАМ6, СЕАСАМ6, СЬСТО, СОБ6А3, ЕРНА2, ЕКВВ2, ЕКВВ3, Р2К, РАК НГР1А, НММК, Н8Р90В1, 1СР2ВР3, 1ЦОАР3, 1ТСВ4, КГР11, К1Р2С, ККА8, БАМС2, ЬС№, ΜΕΤ, ММР11, ММР3, Μ8Τ1Ρ, МИС6, ^АРС, №УВ, N^2, ОБРМ4, РВК, РБК4, РРАР2С, РКОМ1, РТО2, ККМ2, 81АН2, ΤΉΥ1, ТОР2А, ΤΡX2, Τ8ΡΑN1, Τ8ΡΑN8, ИВЕ28, иСНЬ5 и №ΝΤ5Α, играют важную роль в онкогенезе, так как они задействованы в злокачественной трансформации, клеточном росте, пролиферации, ангиогенезе или инвазии нормальной ткани. Также существуют некоторые доказательства активности, связанной с заболеванием раком, у белков, кодируемых генами ϋΝΑΙϋ10, Е1Р283, Е1Р3Б, РОТИ3, Р8МС2, Р8МИ14 и ΤΜΡК884.

Было показано, что белки, кодируемые генами РКОМ1, №ΝΤ5Α, 8МС4, РРАР2С, СРК38, ОБРМ4 и ГНУТ, экспрессируются в избытке и/или являются функционально важными в стволовых клетках и/или раковых стволовых клетках. РКОМ1 был предложен в качестве маркера стволовых клеток рака желудка, хотя данные противоречивы. Раковые стволовые клетки являются субпопуляцией опухолевых клеток с потенциалом самообновления, что необходимо для постоянного роста опухоли. Эти клетки находятся в специализированных и высокоорганизованных структурах, так называемых нишах раковых стволовых клеток, которые требуются для сохранения потенциала самообновления раковых стволовых клеток.

Было показано, что гиперэкспрессия белков АНК, А8РМ, ΑΤΑΌ2, СС'ЖВР ΟΡΝΌΣ, СС№2, СИК1 (СИС2), СЕАСАМ1, СЕАСАМ5, СЕАСАМ6, СЕАСАМ6, СОБ6А3, ЕРНА2, ЕКВВ2, ЕКВВ3, Р2К, РАК НГР1А, НММК,Н8Р90В1, 1СР2ВР3, 1ТСВ4, К1Р11, К1Р2С, ККА8, БАМС2, ЬС№, БММИ, МЕЦ ММР11, ММР3, Μ8Τ1Ρ, МИС6, ^АРС, ТОР2, ОБРМ4, РВК, РРАР2С, РКОМ1, РТО2, ΤΜΡК884, ΤΡX2, Τ8ΡΑN1 и №ΝΤ5Α в опухолях связана с поздними стадиями заболевания и плохим прогнозом для пациентов.

Идентификация животного, предпочтительно человека, который, скорее всего, болен раком желудка включает определение уровня по меньшей мере одного из белков Μ8Τ1Ρ, иСНЬ5, 8МС4, №УВ, РРАР2С, АУЪ9, ИЦСКВ и МИС6 в опухолевом образце животного субъекта. Образец может изыматься методом радикальной хирургии или методом игольной биопсии.

Если уровень Μ8Τ1Ρ, иСНЬ5, 8МС4, ОТУВ, РРАР2С, АУЪ9, ИЦСКВ или МИС6, как установлено, в клетках выше на 20% или более относительно уровня, установленного в доброкачественных эпителиальных клетках того же самого образца, то у животного субъекта, скорее всего, имеется рак желудка.

Чем выше уровень различных белков группы, включающей Μ8Τ1Ρ, иСНЬ5, 8МС4, №УВ, РРАР2С, АУЪ9, иЦСКВ и МИС6, тем выше вероятность того, что будет установлено, что у животного субъекта имеется рак желудка.

Осуществление определение уровня Μ8Τ1Ρ, иСНЬ5, 8МС4, №УВ, РРАР2С, АУЪ9, ИЦСКВ или МИС6 производится ίη 8Йи. Осуществление определение уровня Μ8Τ1Ρ, иСНЬ5, 8МС4, №УВ, РРАР2С, АУЪ9, иЦСКВ или МИС6 также может производиться ίη νίίτο. Осуществление определение уровня Μ8Τ1Ρ, иСНЬ5, 8МС4, №УВ, РРАР2С, АУЪ9, ИЦСКВ или МИС6 также может производиться ίη νίνο. Или осуществление определения уровня Μ8Τ1Ρ, иСНЬ5, 8МС4, №УВ, РРАР2С, АУЬ9, ИЦСКВ или МИС6 может производиться методом лазерной захватывающей микроскопии вместе с анализом №сх1сгп Ыоб

- 12 024497

Определение уровня МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, ЛУЪ9, ΒΌί'ΒΒ или МиС6 производится с помощью антитела, специфического для МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΎΒ, РРАР2С, ЛУЬ9, ИЦСРВ или МИС6. Или осуществление определение уровня МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΎΒ, РРАР2С, ЛУЬ9, ЕОСНВ или МИС6 производится с помощью ПЦР с праймером, специфическим для мРНК, кодирующей МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, ЛУЬ9, ИЦСКВ или МИС6. Или осуществление определение уровня МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЪ9, υΟί',’ΡΒ или МИС6 производится с помощью нуклеотидного зонда, специфического для мРНК, кодирующей МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЕ9, υΟί',’ΡΒ или МИС6. Или осуществление определение уровня МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЕ9, υΟΕ’ΡΒ или МИС6 производится с помощью анализа ЖоПйсгп Ыо1. Или осуществление определения уровня МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЕ9, υΟί',’ΡΒ или МИС6 производится методом анализа с помощью защиты от рибонуклеазы. Осуществление для выявления полипептидов МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЕ9, υΟΕ’ΡΒ и МИС6 в жидкой пробе организма (такой как кровь, сыворотка, мокрота, моча или перитонеальная жидкость) могут быть использованы такие иммунологические методы, как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕИ1§А), радиоиммунный анализ (К1А) и иммунный блоттинг (ХУсЧсгп Ыо1). Биоптаты, тканевые и клеточные образцы (такие как из яичника, лимфатических узлов, соскобы эпителиальных клеток с поверхности яичника), биоптаты легких, биоптаты печени и любые жидкостные пробы, содержащие клетки (такие как перитонеальная жидкость, мокрота и плейральный секрет), могут быть проанализированы посредством дезагрегации и/или растворения ткани или клеточного образца и проведения иммуноанализа на присутствие полипептида, такого как ЕБЕА, К1А или иммунного блоттинга (ХУсЧсгп ЫоШпд). Такие клеточные или тканевые образцы могут быть также проанализированы методами на основе нуклеиновых кислот, к примеру, полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с амплификацией, гибридизации Нозерн-блоттинг или слот- или дот-блоттинг. Для визуализации распределения опухолевых клеток в образцах тканей для выявления полипептидных маркеров рака желудка или мРНК, соответственно, могут быть применены диагностические тесты, которые сохраняют структуру ткани, например, иммуногистологическое окрашивание, ίη δίίυ гибридизация РНК или ίη δίίυ ОТ-ПЦР. Для локализации опухолевой массы ίη νίνο могут применяться методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ) посредством введения в субъект антитела, которое специфически связывается с полипептидами МЗТ1К, иСНЬ5, 8МС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУБ9, υΟΕ’ΡΒ или МИС6 (в особенности полипептидом, находящимся на клеточной поверхности), где антитело конъюгировано или по-другому связано с парамагнитным индикатором (или другой подходящей выявляемой единицей в зависимости от используемого метода визуализации); альтернативно локализацию не меченого опухолевого маркер-специфического антитела можно определить с помощью вторичного антитела, связанного с выявляемой единицей.

Кроме того, описаны химерные/слитые белки/пептиды, включающие полипептиды МЗТ1К, иСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУБ9, υΟΕ’ΡΒ или МИС6 и их фрагменты, включая функциональные, протеолитические и антигенные фрагменты.

Партнер по слиянию или сегменты гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют СИ4' Т-клетки. Стимулирующие эпитопы СИ4' хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в столбнячном токсине. В еще одном предпочтительном варианте осуществления пептид является слитым белком, в частности, включающим Ν-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Ιί) НЕА-ЭК В одном варианте осуществления пептид по изобретению является усеченным белком человека или слитым белком белкового фрагмента и другого полипептидного участка при условии, что человеческий участок включает одну или более аминокислотную последовательность по изобретению.

Кроме того, могут быть получены антитела к полипептидам МЗТ1К, иСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУБ9, υΟΕ’ΡΒ или МИС6, к химерным/слитым белкам, включающим полипептиды МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУБ9, υΟΕ’ΡΒ или МИС6, в равной степени как и фрагменты полипептидов МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУБ9, υΟΕ’ΡΒ или МИС6, включая протеолитические и антигенные фрагменты, и к химерным/слитым белкам/пептидам, включая эти фрагменты, которые могут быть использованы в способах прогнозирования заболевания раком и рака желудка.

Антитела по настоящему изобретению могут быть поликлональными антителами, моноклинальными антителами и/или химерными антителами. Бессмертные линии клеток, которые вырабатывают моноклональное антитело по настоящему изобретению, являются также частью настоящего изобретения.

Среднему специалисту в данной области будет понятно, что в некоторых частных случаях более высокая экспрессия МЗТ1К, иСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЕ9, υΟΕ’ΡΒ или МИС6 в качестве опухолевого гена-маркера будет указывать на худший прогноз для субъекта, имеющего рак желудка. Например, относительно более высокие уровни экспрессии МЗТ1К, иСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУБ9, υΟΕ'ΡΒ или МИС6 могут указывать на относительно крупную первичную опухоль, более высокую тяжесть заболевания (к примеру, больше метастазов) или относительно более злокачественный фенотип опухоли.

Чем больше различных белков группы, включающей МЗТ1К, иСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУБ9, υΟΕ’ΡΒ и МИС6, экспрессированы в избытке, тем хуже прогноз.

- 13 024497

Диагностические и прогностические способы охватывают использование известных способов, к примеру, основанных на антителах способов выявления полипептидов М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, ΝΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЬ9, ИЦСРВ и МИС6, а также способов, основанных на гибридизации и/или амплификации нуклеиновых кислот для выявления мРНК М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, ΝΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЬ9, ИЦСРВ и МИС6.

Кроме того, в связи с тем, что быстрое уничтожение опухолевых клеток часто приводит к образованию аутоантител, опухолевые маркеры рака желудка по изобретению могут использоваться в серологических анализах (например, в тесте ЕЫБЛ для сыворотки субъекта) для обнаружения аутоантител против М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, ΝΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЬ9, ИЦСРВ или МИС6 у субъекта. Уровни полипептидспецифического аутоантитела для М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, NΡΥΒ, РРАР2С, ЛУЪ9, ИЦСРВ и МИС6, которые по меньшей мере приблизительно в 3 раза выше (и предпочтительно по меньшей мере в 5 или 7 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 или 20 раз выше), чем в контрольном образце, являются признаком рака желудка.

Находящиеся на поверхности клетки, внутриклеточные и секретируемые полипептиды М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, NΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЬ9, ИЦСРВ и МИС6 могут быть также все использованы в анализе биоптатов, например, ткани или клеточных образцов (включая клетки, полученные из жидкостных образцов, таких как перитонеальная жидкость), для определения, содержит ли тканевый или клеточный биоптат клетки рака желудка. Биоптат может быть проанализирован как интактная ткань или образец цельной клетки, или же ткань или клеточный образец могут быть дисагрегированы и/или растворены, как это необходимо для конкретного вида используемого диагностического анализа. Например, биоптаты или образцы могут подвергаться цельнотканевому или цельноклеточному анализу для определения уровня полипептида или мРНК М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, NΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЪ9, ИЦСРВ и МИС6 ίη зйи, например используя иммуногистохимический метод, гибридизацию мРНК ίη Ши или ОТ-ПЦР ίη Ши. Опытному специалисту известно, как приготавливать ткани или клетки к анализу для определения уровня полипептида или мРНК с использованием иммуногистохимических методов, таких как ЕШЗЛ, иммунный блоттинг или равноценные методы, или же методов анализа уровня мРНК посредством аналитических методов, основанных на нуклеиновых кислотах, таких как ОТ-ПЦР, нозерн-гибридизация или слот- или дот-блоттинг.

Диагностические наборы для измерения уровней экспрессии М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, NΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЪ9, ИЦСРВ и МИС6.

Кроме того, существует оборудование для обнаружения повышенного уровня экспрессии М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, NΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЪ9, ИЦСРВ и МИС6 в качестве гена-маркера рака желудка у субъекта. Набор для выявления полипептидного маркера рака желудка предпочтительно содержит антитело, которое специфически связывается с выбранным полипептидным маркером рака желудка. Набор для выявления мРНК-маркера рака желудка предпочтительно содержит одну или более нуклеиновых кислот (к примеру, один или более олигонуклеотидный праймер или зонд, зонды ДНК, зонды РНК или матрицы для синтеза зондов РНК), которые специфически гибридизируются с мРНК М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, ЯРДОВ, РРЛР2С, ЛУЪ9, ИЦСРВ и МИС6.

В частности, набор на основе антител может использоваться для выявления присутствия и/или определения уровня полипептида М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, NΡΥΒ, РРАР2С, ЛУЪ9, ИЦСРВ и МИС6, который специфически связан с антителом или его иммунореактивным фрагментом. Набор может включать антитело, активное по отношению к антигену, и реагент для выявления продукта реакции антитела с антигеном. Такой набор может быть комплектом ЕЫЗЛ и может содержать контроль (например, специфицированное количество конкретного полипептидного маркера рака желудка), первичные и вторичные антитела, когда это целесообразно, и любые другие необходимые реагенты, такие как выявляемые элементы, субстраты ферментов и цветные реагенты, как описывалось выше. Диагностический набор альтернативно может быть набором для иммуноблоттинга, как правило включающим компоненты и реагенты, описываемые в настоящем изобретении.

Набор на основе нуклеиновой кислоты может использоваться для выявления и/или определения уровня экспрессии М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, NΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЬ9, ИЦСРВ и МИС6 посредством выявления и/или определения количества мРНК М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, NΡΥΒ, РРЛР2С, ЛУЪ9, ИЦСРВ и МиС6 в образце, таком как тканевый или клеточный биоптат. Например, набор для проведения ОТ-ПЦР для выявления повышенной экспрессии М8Т1Р, ИСНЬ5, 8МС4, ОТДОВ, РРЛР2С, ЛУЬ9, ИЦСРВ и МиС6 предпочтительно содержит олигонуклеотидные праймеры, которых достаточно для проведения обратной транскрипции мРНК-маркера рака желудка до кДНК и амплификацию кДНК-маркера рака желудка посредством ПЦР, и будет также предпочтительно содержать матричные молекулы и праймеры для проведения соответствующих контрольных ПЦР-реакций, а также внутреннего контроля для количественного определения. Средний специалист в данной области в состоянии отобрать подходящие праймеры для проведения реакций обратной транскрипции и ПЦР, а также соответствующие контрольные реакции, которые необходимо провести. Такое руководство приводится, например, в работе Р. Ли8иЬе1 с1 а1., Сштей Рто1осок ίη Мо1еси1аг В|о1оду. ίοΐιη ДОПеу & δοηδ, №ν Υογ1<. Ν.Υ., 1997. Многочисленные разновидности ОТ-ПЦР известны из уровня техники. Целенаправленная доставка иммунотоксинов в

- 14 024497

М8Т1К, ИСНЬ5, 8МС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, ЛУЪ9, иЦСКБ и МиС6 как до терапевтических мишеней может осуществляться как метод лечения или профилактики рака желудка. Например, молекула антитела, которая специфически связывается с находящимся на поверхности клетки полипептидом М8Т1К, ИСНЬ5, §МС4, ΝΡΎΒ, РРАР2С, ЛУЪ9, иЦСКБ и МИС6, может быть конъюгирована с радиоизотопом или другим токсическим соединением. Конъюгаты антител вводят в субъект, так что связывание антитела с родственным ему полипептидом рака желудка приводит к нацеленной доставке терапевтического соединения в клетки рака желудка, тем самым производя лечение рака яичника.

Терапевтическим элементом может быть токсин, радиоизотоп, лекарственное, химическое средство или белок (см., например, Бега с1 а1. Рйагтасокшебск апб апШитот αοίίνίΐν о£ а Ыуа1сп1 бРиШбе-ЧаЫП/еб Ρν иптипоЮхт \νί11ι ипрго\'еб апбдеп Ъшбшд 1о егЪБ2, Сапсег Кек. 59:4018-4022 (1999)). Например, антитело может быть связано или конъюгировано с бактериальным токсином (например, токсин дифтерии, экзотоксин псевдомонас А, холерный токсин) или растительным токсином (например, рициновый токсин) для нацеленной доставки токсина к клетке, экспрессирующей М8Т1К, ИСНЬ5, §МС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЪ9, иЦСКБ и МИС6. Этот иммунотоксин может быть доставлен в клетку, и при соединении с находящимся на поверхности клетки полипептидным маркером рака желудка токсин, конъюгированный с антителом, специфическим для маркера рака желудка, будет доставлен в клетку.

Кроме того, для любого полипептида М8Т1К, ИСНЬ5, §МС4, ΝΡΥΒ, РРЛР2С, АУЪ9, иЦСКБ и МиС6, для которого существует специфический лиганд (например, лиганд, который связывается с находящимся на поверхности клетки белком), может быть использован лиганд вместо антитела для нацеливания токсичного соединения на клетки рака желудка, как описывалось выше.

Понятие антитело используется в контексте данного изобретения в широком смысле и включает как поликлональные, так и моноклональные антитела. В дополнение к интактным молекулам иммуноглобулина в понятие антитела включены также фрагменты или полимеры таких молекул иммуноглобулина и гуманизированные версии молекул иммуноглобулина при условии, что они проявляют одно из желаемых свойств (например, специфически связываются с полипептидным маркером рака желудка, доставляют токсин к клетке рака желудка, экспрессирующей раковый ген-маркер рака желудка на повышенном уровне и/или ингибируют активность ракового полипептида-маркера), описанных в настоящем изобретении.

Если возможно, антитела могут быть куплены в коммерческих источниках. Антитела могут быть также получены при использовании хорошо известных методов. Опытному специалисту будет понятно, что для получения антител могут использоваться как полипептидные маркеры рака желудка полной длины, так и их фрагменты. Полипептид, необходимый для получения антитела, может быть частично или полностью очищенным из природного источника или же может быть получен с использованием методики рекомбинантной ДНК. Например, кДНК, кодирующая полипептид М8Т1К, иСНЬ5, §МС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЪ9, υρΡΡΒ или МИС6 или его фрагмент, может быть экспрессирована в прокариотических клетках (например, бактерий) или эукариотических клетах (например, клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих), после чего рекомбинантный белок может быть очищен и использован для получения препарата из моноклонального или поликлонального антитела, которое специфически связывается с полипептидным маркером рака желудка, использованным для получения антитела.

Специалисту данной области будет известно, что получение двух или более различных наборов моноклональных или поликлональных антител увеличивает вероятность получения антитела со специфичностью и аффинностью, необходимыми для предназначенного для него использования (например, ЕЫ§А, иммуногистохимия, визуализация ίη νί\Ό. терапия на основе иммунотоксина). Антитела испытаны на желаемую для них активность с помощью известных методов в соответствии с целью применения антител (например, ЕЫ§А, иммуногистохимия, иммунотерапия и т.д.; для получения дальнейшей информации по генерированию и испытанию антител см., например, Наг1о\у апб Ьапе, АпбЪобгек: А ЬаЪота1оту Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЪогаЮту Ргекк, Со1б 8ртшд НагЬог, Ν.Υ., 1988). А ЬаЪогаЮту Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЪог ЬаЪогаЮту Ргекк, Со1б 8ртшд НагЪог, Ν.Υ., 1988). Например, антитела могут быть испытаны с помощью анализов ЕЫ§А, метода иммунного блоттинга (№е81егп-Ъ1о1), иммуногистохимического окрашивания законсервированных формальдегидом образцов рака желудка или замороженных тканевых срезов. После их первоначальной характеристики ш νίΙΐΌ антитела, предназначаемые для терапевтического или диагностического применения ш νί\Ό испытывают в соответствии с известными клиническими методами анализа.

Понятие моноклональное антитело в контексте настоящего изобретения обозначает антитело, полученное, по существу, из гомогенной популяции антител, т. е. отдельные антитела внутри популяции идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут быть представлены в небольших количествах. Моноклональные антитела в контексте настоящего изобретения специфически включают химерные антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен с соответствующими последовательностями антител, полученных из конкретных видов или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) с или гомологична(ы) с соответствующими последовательностями антител, полученных из других видов

- 15 024497 или относящихся к другому классу или подклассу антител, в равной степени, как и фрагменты таких антител, пока они проявляют желаемую антагонистическую активность (патент США 4816567).

Моноклональные антитела могут быть получены при использовании гибридомного метода. В рамках гибридомного метода мышь или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируется иммунизирующим веществом, чтобы инициировать лимфоциты, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим веществом. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы ίη νίΐτο.

Моноклональные антитела могут быть также получены с помощью методов с рекомбинантной ДНК, таких как описываемые в патенте США 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела по изобретению, может быть легко выделена и секвенирована с помощью стандартных методик (например, при использовании олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител).

ίη νίΐτο методы также подходят для получения моновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в особенности РаЬ-фрагментов, может быть произведено при использовании стандартных техник, известных из уровня техники. К примеру, расщепление может производиться при использовании папаина. Примеры расщепления под воздействием папаина описываются в заявке \УО 94/29348, опубликованной 22.12.1994 г., и в патенте США 4342566. Расщепление антител под воздействием папаина обычно приводит к двум идентичным фрагментам, связывающимся с антигеном, называемым РаЬ-фрагментами, каждый из которых имеет отдельный антигенсвязывающий сайт и остаточный Ре-фрагмент. В результате воздействия пепсином получается фрагмент, который имеет два антигенкомбинирующих сайта и все еще способен к поперечной сшивке антигена.

Фрагменты антитела, как связанные с другими последовательностями так и не связанные, могут также включать инсерции, делеции, замены или другие выбранные модификации конкретных участков или специфических аминокислотных остатков при условии, что активность фрагмента незначительно изменена или повреждена по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела. Данные модификации могут внести некоторые дополнительные свойства, такие как добавление/удаление аминокислот, способных к дисульфидному связыванию, увеличение их биологической стойкости, изменение их секреторных характеристик и т.д. В любом случае фрагмент антитела должен обладать свойством биоактивности, таким как активностью связывания, регуляцией связывания на связывающем домене и т.д. Функциональные или активные участки антитела могут быть идентифицированы при мутагенезе специфического участка белка с последующей экспрессией и контролем экспрессированного полипептида. Такие методы полностью очевидны для опытного специалиста данной области и могут включать сайт-специфический мутагенез нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антитела.

Антитела могут далее включать гуманизированные антитела или человеческие антитела. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител - это химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Ρν, РаЬ, РаЬ' или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющего комплементарность участка (СОК) реципиента замещены остатками из СОК нечеловеческих видов (донорское антитело), таких как мыши, крысы или кролики, имеющими желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки Ρν-каркаса (РК) человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные антитела могут также включать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортированном СОК или каркасных последовательностях. Как правило, гуманизированное антитело будет включать по сути все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки СОК соответствуют таковым из нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по сути все из участков РК являются таковыми консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Оптимально, чтобы гуманизированное антитело содержало также по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Рс), как правило, человеческого иммуноглобулина.

Способы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны из уровня техники. В целом, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотный остаток, введенный в него из источника, являющегося нечеловеческим. Такие нечеловеческие аминокислотные остатки называются часто импортированными остатками, которые обычно берутся из импортированного вариабельного домена. Гуманизация может быть, по существу, произведена посредством замены участков СОК или последовательностей СОК грызунов на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами (патент США 4816567), где, по существу, менее чем один интактный человеческий вариабельный домен был заменен соответствующей последовательностью нечеловеческого вида. На практике гуманизированные антитела являются обычно человеческими антителами, в которых некоторые остатки СОК и, возможно, остатки РК заменены на остатки аналогичных сайтов антител грызунов.

- 16 024497

Использоваться могут трансгенные животные (например, мыши), которые способны при иммунизации вырабатывать полный спектр человеческих антител при отсутствии выработки эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена участка присоединения тяжелой цепи антитела у химерных и мутантных мышей зародышевой линии приводит к полному ингибированию выработки эндогенных антител. Перенос генной матрицы иммуноглобулина клеток зародышевой линии человека в таких мутантных мышей зародышевой линии будет приводить к выработке человеческих антител с антигенной стимуляцией. Человеческие антитела могут быть также получены в библиотеках фагового дисплея.

Антитела предпочтительно вводятся в субъект в фармацевтически приемлемом носителе. Подходящее количество фармацевтически приемлемой соли обычно используется в составе для усиления изотонности состава. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Уровень рН раствора составляет предпочтительно от около 5 до около 8 и более предпочтительно от около 7 до около 7,5. Кроме того, носители включают препараты пролонгированного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, матрицы которых имеют вид профилированных изделий, к примеру, пленки, липосомы или микрочастицы. Для специалиста в данной области будет очевидно, что определенные носители могут быть более предпочтительными в зависимости от, например, способа введения и концентрации вводимого антитела.

Антитела могут вводиться в субъект, пациенту или клетку посредством инъекции (например, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно) или другими способами, такими как вливание, которое гарантирует доставку к кровотоку эффективным образом. Антитела также могут вводиться внутритуморальными или перитуморальными способами, чтобы вызвать локальные, а также и системные терапевтические эффекты. Предпочтительными являются локальная или внутривенная инъекция.

Эффективная дозировка и график введения антител могут быть определены эмпирически, а принятие таковых решений под силу специалисту данной области. Специалистам данной области будет понятно, что дозировка антител, которые должны быть введены, будет варьироваться в зависимости от, например, субъекта, которому будет вводиться антитело, способа введения, конкретного типа используемого антитела и других вводимых медикаментов. Типичная дневная дозировка антитела, используемого отдельно, может варьироваться от около 1 мкг/кг вплоть до 100 мг/кг по весу тела или более в день, в зависимости от факторов, упоминаемых выше. После введения антитела для лечения рака желудка эффективность терапевтического антитела может быть оценена различными способами, известными компетентному специалисту в данной области. Например, размер, количество и/или распределение рака желудка у субъекта, проходящего лечение, может контролироваться с помощью стандартных методов визуализации опухоли. Введенное в терапевтических целях антитело, которое блокирует рост опухоли, приводит к уменьшению размера и/или предотвращает развитие новых опухолей в сравнении с течением болезни, которое бы имело место без введения антитела, и является эффективным антителом для лечения раковых заболеваний.

Так как белки АВЫ, АЭАМ10, АНК, 00ΝΌ2, СОС6, 0ΌΚ1, СЕАСАМ1, СЕАСАМ5, СЕАСАМ6, СЕАСАМ6, СОЬ6А3, ЕГР283, ЬОС255308, ЕРНА2, ЕКВВ2, ЕКВВ3, Р2К, РАК НММК, Н8Р90В1, ЮР2ВР3, ГГОВ4, К1Р2С, ККА8, ЬАМС2, ЬСЮ, МЕТ, ММР11, ММР12, ММР3, М8Т1К, ΝυΡ2, ОЬРМ4, РКОМ1, ККМ2, ТНУ1, ТМРК884, ТОР2А, Т8РАМ, №ЭТ5А, НГР1А и РТК2, как было показано, высокоэкспрессированы, по меньшей мере, в подвиде тканей рака желудка в сравнении с нормальными тканями, ингибирование их экспрессии может быть интегрировано в любую терапевтическую стратегию для лечения или профилактики рака желудка.

Принцип антисмысловой терапии основан на гипотезе, что последовательность-специфическое подавление генной экспрессии (посредством транскрипции или трансляции) может быть достигнуто при внутриклеточной гибридизации между геномной ДНК или мРНК и комплементарными антисмысловыми видами. Образование такого гибридного дуплекса нуклеиновых кислот интерферирует с транскрипцией геномной ДНК-мишени, кодирующей антиген, или процессингом/транспортом/трансляцией и/или стабильностью антигенной мРНК-мишени опухоли.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты могут быть доставлены с использованием различных подходов. Например, антисмысловые олигонуклеотиды или антисмысловая РНК могут вводиться непосредственно (например, внутривенной инъекцией) в субъект в форме, которая позволяет поглощение опухолевыми клетками. Альтернативно, в клетки могут вводиться вирусные или плазмидные векторы ίη νίνο, которые кодируют антисмысловую РНК (или фрагменты РНК). Антисмысловые эффекты также могут быть вызваны смысловыми последовательностями; однако степень фенотипических изменений крайне различна. Фенотипические изменения, индуцированные эффективной антисмысловой терапией, оценивались в соответствии с изменениями, например, уровнями мРНК-мишени, уровнями белка-мишени и/или уровнями активности белка-мишени.

В конкретном примере ингибирование функции опухолевого маркера рака желудка с помощью генной терапии с применением антисмысловых конструкций может быть выполнено посредством прямого введения антисмыслового РНК-маркера рака желудка в субъект. Антисмысловой опухолевый РНК- 17 024497 маркер может быть получен и выделен с помощью любого стандартного метода, но наиболее просто его получить с помощью транскрипции ίη νίΐτο с использованием антисмыслового опухолевого кДНКмаркера под контролем высокоэффективного промотора (например, Т7-промотора). Введение антисмыслового опухолевого РНК-маркера в клетки может быть произведено любым способом для прямого введения нуклеиновых кислот, описываемых ниже.

Альтернативная стратегия ингибирования функции М8Т1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, БОСИВ или МИС6 при использовании генной терапии включает внутриклеточную экспрессию антител к М8Т1К, ИСНЬ5, 8МС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, ВОСКВ или МИС6 или участка антител к М8Т1И, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, ирС’КВ или МИС6. Например, ген (или фрагмент гена), кодирующий моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом М8Т1К, ИСНЬ5, 8МС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, ирСКВ или МИС6 и ингибирует его биологическую активность, помещают под транскрипционным контролем специфической (например, ткане- или опухолеспецифической) регуляторной последовательности генов внутрь вектора экспрессии нуклеиновой кислоты. Вектор вводится затем в субъект, так чтобы он поглощался клетками рака желудка или другими клетками, которые затем секретируют антитела к М8Т1И, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, υρΟΡΒ или МИС6 и, тем самым, блокируют биологическую активность полипептида М8Т1И, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, υρΟΡΒ и МИС6. Предпочтительно, если полипептиды МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, υρΟΚΒ и МИС6 присутствуют на внеклеточной поверхности клеток рака желудка.

В способах, описываемых выше, которые включают введение и поглощение экзогенной ДНК в клетках субъекта (т.е. генную трансдукцию или трансфекцию), нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть в форме обнаженной ДНК, или же нуклеиновые кислоты могут быть в векторе для доставки нуклеиновых кислот к клеткам для ингибирования экспрессии белка-маркера желудочной опухоли. Вектор может представлять собой имеющийся в продаже препарат, такой как аденовирусный вектор (ОиаШит ΒίοΕθιηο1ο^8, 1пс. (Ьауа1, Квебек, Канада). Доставка нуклеиновой кислоты или вектора к клеткам может производиться посредством различных механизмов. Например, доставка может производиться с помощью липосомы с использованием имеющихся в продаже липосомных препаратов, таких как ОРОБЕСНЫ, Е1РО1^;ЕСТЛ\П\Е (СШСО-25 ΒΚΒ. 1пс., СапПекЬигу. Мй.), ЗиРЕКБЕСТ (О1адег1. 1пс. Хильден, Германия) и ТИАИЗГЕСТАМ (Рготеуа Β^οΐес, 1пс., Май^8οη, ^18.), в равной степени как и других липосом, разработанных в соответствии со стандартными процедурами уровня техники. Кроме того, нуклеиновая кислота или вектор в соответствии с настоящим изобретением может быть доставлен ίη νίνο посредством электропорации, технология для которой имеется в наличии в компании Οεηεΐτοηίθ8, 1пс. (Зан ^^едο. штат Калифорния, США), в равной степени как и с помощью устройства ЗОНОРОКАТЮЫ тасПте (1таКх РНагтасеи11са1 Οοτρ., Тис8οη, штат Аризона, США).

Одним из примеров является доставка вектора посредством вирусной системы, такой как ретровирусная векторная система, которая способна упаковывать рекомбинантный ретровирусный геном. Рекомбинантный ретровирус может быть затем использован для инфицирования и, таким образом, доставки в инфицированные клетки антисмысловой нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, υρΟΡΒ или МИС6. Точный способ введения измененной нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающего, разумеется, не ограничивается использованием ретровирусных векторов. Имеется широкий спектр других методик для данной процедуры, включая использование аденовирусных векторов, аденоассоциированных вирусных (ААУ) векторов, лентивирусных векторов, псевдотипичных ретровирусных векторов. Также может применяться методики физической трансдукции, такие как липосомная доставка и рецептор-опосредованные и другие эндоцитозные механизмы. Данное изобретение может быть использовано вместе с любым из этих или других, используемых обычно, способов генного переноса.

Антитела могут также применяться для диагностических анализов ίη νίνο. Как правило, антитело помечают радионуклеотидом (таким как ^1ΠΙη, ⁹⁹Тс, ¹⁴С, ¹³¹Ι, ³Н,³²Р или ³⁵З), так что опухоль может быть локализована с помощью иммуносцинтиграфии. Антитела или их фрагменты связываются с внеклеточными доменами двух или более мишеней МЗТ1К, ИСНЬ5, ЗМС4, ΝΡΥΒ, РРАР2С, АУЬ9, υρΟΡΒ и МИС6 при показателе аффинности (Кй) ниже чем 1x10 мкМ.

Антитела для диагностического применения могут помечаться зондами, подходящими для обнаружения различными способами визуализации. Способы обнаружения зондов включают, но без ограничения, флуоресценцию, свет, конфокальную и электронную микроскопию; магнитно-резонансную томографию и спректроскопию; флюороскопию, компьютерную томографию и позитронно-эмиссионную томографию. Подходящие зонды включают, но без ограничения, родамин, эозин и другие флюорофоры, радиоизотопы, золото, гадолиний и другие лантаноиды, парамагнитное железо, фтор-18 и другие позитронно-активные радионуклиды. Более того, зонды могут быть би- или мультифункциональными и обнаруживаться более чем одним из приведенных способов. Данные антитела могут быть помечены напрямую или опосредованно указанными зондами. Присоединение зондов к антителам включает ковалентное присоединение зонда, внедрение зонда в антитело и ковалентное присоединение комплексообразующего соединения для присоединения зонда, широко признанное среди прочих в данной области. Для иммуногистохимических исследований образец пораженной ткани может быть свежим или заморожен- 18 024497 ным или может быть залит парафином и законсервирован таким консервантом, как формалин. Законсервированный или заделанный срез содержит образец, контактировавший с помеченным первичным антителом и вторичным антителом, где антитело используется для выявления экспрессии белков М8Т1К, ИСНЬ5, 8МС4, ΝΡΎΒ, РРАР2С, АУЪ9, ЕОСНВ и МИС6 ίη кйи.

В настоящем изобретении предложен, таким образом, пептид, связывающийся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса, обладающий общей длиной от 10 до 14 аминокислот, содержащий последовательность, которая выбирается из группы, включающей:

(a) последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1;

(b) вариант 8ЕЦ ГО N0: 1, выбранный из группы последовательностей ^Ρ^I^^ΟIVΡ,

БУРГО-ОСШЕ БУРШОСМ. ^Ρ^I^^СIV^ и ЕРЦГОрШУ!, который будет индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом.

Пептиды по изобретению обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I.

В контексте настоящего изобретения понятие гомологичный относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последовательностей, т.е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упоминавшееся ранее понятие гомология определяется при сравнении двух последовательностей, выравниваемых в оптимальных условиях со сравниваемыми последовательностями. Сравниваемые последовательности в контексте данного изобретения могут иметь инсерцию или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном выравнивании двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с помощью создания выравнивания, например, по алгоритму С1ик1а1\У. Широко распространено программное обеспечение для анализа последовательностей, в частности, Уес1ог ΝΤΣ, СЕ№)ТУХ или аналитические инструменты, предоставляемые общественными банками данных.

Специалист в данной области будет в состоянии оценить, будут ли Т-клетки, индуцированные вариантом специфического пептида, способны к перекрестной реакции с самим пептидом (Роп§ с1 а1., 880914); (2атетЬа е! а1., 1805-14; Со1отЬе!И е! а1., 2730-38; Аррау е! а1., 4570-77).

Вариантом данной аминокислотной последовательности авторы изобретения обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬЛ, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности с 8ЕЦ ГО N0: 1 по 33. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по меньшей мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связываться со связывающей бороздкой подходящей молекулы МНС, такой как НЕА-А*02 или -ЭК, и, таким образом, он, по меньшей мере, сохранит, если не улучшит, способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ.

Данные ЦТЛ могут затем вступать в перекрестную реакцию с клетками и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит природную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах этого изобретения. По информации из научной литературы (Каттепкее е! а1., 1997) и банков данных (Каттепкее е! а1., 213-19) конкретные позиции связывающихся с НЬЛ пептидов являются типичными якорными остатками, формирующими ключевую последовательность, подходящую к связывающему мотиву рецептора НЬЛ, который определяется полярными, электрофизическими, гидрофобными и пространственными свойствами полипептидных цепей, образующих связывающую бороздку. Так, специалист данной области будет в состоянии модифицировать аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО N0: 1 по 95, сохраняя известные якорные остатки, и будет в состоянии определить, сохранят ли такие варианты способность связываться с молекулами МНС I или II класса. Варианты настоящего изобретения сохраняют способность связываться с ТКР активированных ЦТЛ, которые могут впоследствии вступать в перекрестную реакцию и уничтожать клетки, экспрессирующие полипептид, который содержит природную аминокислотную последовательность родственного пептида, как определено в аспектах настоящего изобретения.

Те аминокислотные остатки, которые необязательно вносят вклад во взаимодействие с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы заменой на другую аминокислоту, включение которой, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связывание с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого авторы изобретения включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.

- 19 024497

Таблица 3

Варианты и участок пептида в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 1

класса, хотя они обычно имеют длину между 8-11 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к истинному эпитопу, по существу, не влияли на протеолитическое расщепление, необходимое для выявления истинного эпитопа во время процессинга.

Соответственно, в настоящем изобретении предложены также пептиды и варианты эпитопов МНС класса I, в которых указанный пептид или вариант имеет общую длину от 10 до 14.

Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено способами, известными из уровня техники.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид состоит или по существу состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 1.

Состоящий по существу из подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с 8ЕЦ ГО N0: 1 или одним из ее вариантов, содержит дополнительные находящиеся на N и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются, по существу, формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для эпитопа молекул МНС.

Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептид является слитым белком, который включает, например, 80 ^терминальных аминокислот НЬАГОК антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем Ιί), как взятый из банка данных NСΒI, инвентарный номер - СепВапк Ассеккюп-питЪег Х00497.

Кроме того, пептид или вариант может быть далее модифицирован для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение реверсированных пептидных или непептидных связей.

В реверсированной пептидной связи аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-С0-МН-), а пептидная связь реверсируется. Такие ретроинвертированные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Ме/1еге еί а1. (1997), I. 1ттипо1. 159, 3230-3237, включенной в описание путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Ме/1еге еί а1. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для связывания с МНС и ответов Т-хелперных клеток. Ретроинвертированные пептиды, которые содержат связи ИН-С0 вместо пептидных связей С0-ЫН, намного более устойчивы к протеолизу.

Непептидной связью, являются, например, -СН₂-ЯН, -СН₂§-, -СН₂СН₂-, -СН=СН-, -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂- и -СН₂§0-. В патенте США 4897445 предложен способ твердофазного синтеза непептидных связей (-СН2-ИН) в полипептидных цепях, которые включают полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии №СИВН₃.

Пептиды, включающие последовательности, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, дансильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминоконцам пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметоксикарбонильная группа может быть введена в аминные концы пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа могут быть добавлены к карбоксильным концам пептидов.

Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, может быть использован Ό-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида, а не обычный Ь-изомер. Более того по меньшей мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в

- 20 024497 природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.

Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции отдельных аминокислот как до, так и после синтеза пептида. Примеры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе К. ЬипйЫай, Сбетюа1 Кеадейк Гог Рго1еш МоШПсаОоп, 3¹'¹ ей. СКС Рге88, 20 05, которая включена в описание путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но без ограничения, модификацию с помощью ацилирования, амидинирование, пиридоксилирование лизина, восстановительное алкилирование, тринитробензилирование аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ΤΝΒδ), амидную модификацию карбоксильных групп и сульфгидрильную модификацию с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образование ртутных производных, образование смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцию с малеимидом, карбоксиметилирование йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилирование цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист в данной области может проконсультироваться в Сиггей РгоЮсоЕ Ш Рго1еш §аепсе, ЕЙ8. СоНдап е1 а1., глава 15 (4о1т АПеу & §оп§, ΝΥ 19952000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.

Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вицинальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион, с образованием аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. Веб-сайты компаний, таких как Зфта-ЛИпсН (1Шр:/Лу\у\у.5181па-а1йпс11.со1п), предоставляют информацию по специфическим веществам.

Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и окислены во время тепловой обработки биофармацевтических средств.

К-реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютаминовой кислоты. ^3-(Диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимид может использоваться для образования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты.

Например, диэтилпирокарбонат является реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала.

Реакция остатков лизина и других α-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или поперечной сшивке (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликозилировании белков.

Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида, бромэтиламина и хлорамина Т.

Тетранитрометан и Ν-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тирозила. Поперечная сшивка через образование дитирозина может быть произведена с ионами перекиси водорода/меди.

В последних исследованиях по модификации триптофана используются Ν-бромсукцинимид, 2-гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-индол (ΒΡΝδскатол).

Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с РЕО (полиэтиленгликолем) часто связана с увеличением полупериода циркуляции при поперечной сшивке белков с глутаральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для получения гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоилировании цианатом калия.

Пептид или вариант, в котором пептид модифицирован или включает непептидные связи, является предпочтительным вариантом осуществления изобретения. Как правило, пептиды и варианты (по меньшей мере те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Ртос-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи е1 а1. (1981) и в прилагающихся ссылках. Временная защита Ν-аминогруппы производится группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Ртос). Повторное расщепление этой высокощелоче-лабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина), где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты функциональности боковой амидоцепи используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель основан на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бисакрилоилэтилендиамина (кросс-линкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий

- 21 024497 агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотнолабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного НН-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители включают этандитиол, фенол, анизол и воду, окончательный выбор зависит от составляющих аминокислот синтезируемого пептида. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, ВгискбогГег, Магбег и А1Ъепсю, с1 а1., 29-43 и прилагаемые ссылки).

Трифторуксусную кислоту удаляют выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии, например в СаШюскет-ШуаЪюскет (Великобритания) Ыб, Ноттингхэм, N07 201 Великобритания.

Очистка может быть произведена любой методикой или комбинацией таких методик как рекристаллизация, эксклюзионная (по размеру) хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения в системе ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при бомбардировке быстрыми атомами (РАВ), а также масс-спектрометрического анализа МАЮ! и Е810-Т0Р.

В еще одном аспекте изобретения предлагается нуклеиновая кислота (например, полинуклеотид), кодирующая пептид или вариант пептида по изобретению. Полинуклеотид может быть, например, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями, как одно-, так и/или двухнитевыми; природными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, например, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом, и может содержать или не содержать интроны при условии, что полинуклеотид кодирует пептид. Разумеется, только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные встречающимися в природе пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще в одном аспекте изобретения предложен вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.

Был разработан ряд способов для связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.

Синтетические линкеры, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ присоединения сегмента ДНК к векторам. Синтетические линкеры, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая [п1егпа11опа1 Вю1ес11по1още5 Ыс, №ν Науеп, СН США.

Желаемый способ модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто в работе (8а1к1 е1 а1. (487-91)). Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например, при конструировании в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Если используются векторы, то предпочтительными являются оспенные или аденовирусные векторы.

Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) может экспрессироваться в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего пептид или вариант по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая пептид или вариант по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом раскрытых в данном описании идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают те, что раскрыты в патентах США 4440859, 4530901, 4582800, 4677063, 4678751, 4704362, 4710463, 4757006, 4766075 и 4810 648

ДНК (или в случае ретровирусных векторов - РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли поддержание в эписомальной или интеграционной

- 22 024497 форме.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с соответствующей ориентацией и правильной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть соединена с адекватными нуклеотидными последовательностями, обеспечивающими координацию транскрипции и трансляции, распознаваемыми желательным хозяином, хотя такие контрольные элементы обычно имеются в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клетки-хозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, которая кодирует выбранный признак в трансформированной клетке, такой как устойчивость к антибиотикам.

В качестве альтернативы ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина.

Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируют затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, с учетом раскрытых в данном описании идей, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть выделен.

Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е.сой и ВасШик киЬййк), дрожжи (например, 8ассйаготусек сегеу181ае), мицелиальные грибы (например, АкрегдШик крес), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была клетками млекопитающих, такими как клетки СНО, имеющимися в наличии в АТСС Се11 Вю1оду Со11ес11оп.

Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих для конститутивной экспрессии включает промотор СМУ или 8У40 с подходящим концевым участком поли-А и маркером устойчивости, таким как неомицин. Одним примером является р§УЪ, имеющимся в наличии в Рйагтаиа, Р15са1а\\ау, Νί, США. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является рМ§0, имеющийся также в наличии в Рйагтааа. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются рК8403-406 и рК8413416, и они, как правило, имеются в наличии в §1га!адеие С1отп§ §ук1етк, Ьа Эо11а, СА 92037, США. Плазмиды рК§403, рК§404, рК§405 и рК8406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (У1рк) и включают дрожжевые селектируемые маркеры Н1§3, ТКР1, ЬЕИ2 и ИКА3. Плазмиды рК§413416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Усрк). Основанные на промоторе СМУ векторы (например, из 5ндта-А1йпс1ц обеспечивают кратковременную или устойчивую экспрессию, цитоплазмическую экспрессию или секрецию и Ν-терминальную или С-терминальную маркировку в различных комбинациях РЬА0, 3хРЬА0, с-тус или МАТ. Данные слитые белки позволяют выявление, очистку и анализ рекомбинантного белка. Слияния с двойной меткой обеспечивают гибкость при выявлении.

Сильный промоторный регуляторный участок цитомегаловируса человека (СМУ) стимулирует конститутивные уровни белковой экспрессии, достигающие 1 мг/л в клетках С08. Для менее активных клеточных линий белковые уровни обычно составляют ~0,1 мг/л. Присутствие точки начала репликации §У40 будет приводить к высоким уровням репликации ДНК в подверженных репликации §У40 клетках С08. Векторы СМУ, например, могут содержать точку начала для репликации рМВ1 (производное рВК322) в бактериальных клетках, ген Ь-лактамазы для отбора устойчивости к ампициллину у бактерий, Ь0Н ро1уА и точку начала £1. Векторы, содержащие лидерную последовательность препротрипсина (РРТ), могут направлять секрецию слитых белков РЬА0 в культуральную среду для очистки с использованием антител А№П-РЬА0, смол и чашек. Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.

Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной конструкции настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть предпочтительно прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и обычно являются штаммом Е.сой, таким как, например, Е.сой штамма ЭН5, имеющимся в наличии в ВеШекйа Кекеагсй ЬаЬогаФпек 1пс., ВеШекйа, ΜΌ, США, и КК1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур (Атепсап Туре СиЙиге Со11ес1юп (АТСС)), КоскуШе, ΜΌ, США (№. АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и клеточные линии толстого кишечника. Дрожжевые клетки-хозяева включают УРН499, УРН500 и УРН501, которые, как правило, имеются в наличии в 5>1га1адепе С1отп§ §ук1етк, Ьа Эо11а, СА 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как ССЬ61, N14 эмбриональные клетки швейцарской мыши №Н/3Т3, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЕ 1658, почечные клетки обезьяны С08-1, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЕ 1650 и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки δ£9, которые могут трансфицироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии. Обзор в отношении выбора подходящих клеток-хозяев для экспрессии представлен, например, в пособии авторов Раийпа Ва1Ьак и Агдейа йогепсе МеШойк ίη Мо1еси1аг Вю1оду КесотЬшаШ 0епе Ехргеккюп, Ре\ае\У5 апй РгоЮсоЕ, часть первая, 2-е изд., IδВN 978-1-58829-262-9, и

- 23 024497 другой литературе, известной специалисту в данной области.

Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения производится при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, работу С'оНсп еΐ а1. (1972) Ргос. №6. Асаб. δα. И8А, 69, 2110 и δатЪгоοк еΐ а1. (1989), Μο^ουΙαΓ Οοηίη§, А Ба^тай^ Магшак Сой δρπη§ Η-ιγΕογ Ра^тай^, Сей δρπη§ Нат^т, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается в работе δίκπικιη еΐ а1. (1986), Ме11юб8 Ιη Υеа8ΐ СспсИсх, А Ба^тай^ Маша1, Сой δρπη§ Η-ιΛοη Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Ведд8) (1978), Найте, 275,104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например фосфат кальция и ОЕЛЕ-декстран или липосомальные составы, имеются в наличии в δΙπιΕι^η; 0οηίη§ δу8ΐет8 или Ьбе ΤесНηο1οд^е5 Ιηο., СаПНегвЬигд, ΜΌ 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат конструкцию ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, такими как ПЦР Альтернативно, наличие белка в супернатанте может выявляться с применением антител.

Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например, бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее, другие клетки-хозяева могут быть пригодны в конкретных терапевтических методах. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут быть с пользой использованы для экспрессии пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на подходящие молекулы МНС. Таким образом, в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с изобретением.

В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин является антигенпрезентирующей клеткой, в частности, дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой. Для АПК, нагруженных рекомбинантным слитым белком, содержащим простатическую кислую фосфатазу (РАР), сейчас проводятся исследования в целях лечения рака предстательной железы (Ыри1еисе1-Т) (Ъта11 Е.Е еΐ а1. 67-74; Κίηί еΐ а1. 3089-94).

В другом аспекте изобретения предложен способ получения пептида или его варианта; причем способ включает культивацию клетки-хозяина и выделение пептида из клетки-хозяина или его культуральной среды.

В другом варианте осуществления пептид, нуклеиновая кислота или вектор экспрессии по изобретению используются в медицине. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (ί.ν.) инъекции, подкожной (8.с.) инъекции, внутрикожной (ί.6.) инъекции, внутрибрюшинной (ΐ.ρ.) инъекции, внутримышечной (1.т.) инъекции. Предпочтительные способы введения пептидной инъекции включают 8.с, ί.6., ΐ.ρ., 1.т. и ί.ν. Предпочтительные способы введения инъекции ДНК включают ί.ά., кт., 8.с, ΐ.ρ. и ί.ν. Вводиться могут, к примеру, дозы, объемом между 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозировка в данных пределах успешно использовалась в предыдущих клинических исследованиях (Вгшъущ еΐ а1. 1553-64; δΕκΙιΚΓ еΐ а1. 2007).

Другой аспект настоящего изобретения включает способ получения активированных Т-клеток ίη νίΐτο, причем способ включает контактирование Т-клеток ίη νίΐτο с нагруженными антигеном молекулами МНС I или II класса человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антигенспецифическим образом Т-клетки, где антиген является пептидом в соответствии с изобретением. Предпочтительно, если достаточное количество антигена применяется с антигенпрезентирующей клеткой.

Предпочтительно, если в клетке млекопитающих не имеется или имеется пониженный уровень или недостаточная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых нет пептидного транспортера ТАР, включают Т2, КМА-δ и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, связанный с процессингом антигена.

Не способная нагружать пептидом клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Лте^^саη Туре Сййте ίΌ1Καίοιτ 12301 Рагк1а\\п Опус, ^скубк, Магукий 20852, США под каталоговым № СКЬ 1992; клеточная линия дрозофилы линия δсНηе^6е^ 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СКЕ 19863; клеточная линия мыши КМА-δ описывается в работе Кагге еΐ а1. 1985.

Предпочтительно, если указанная клетка-хозяин до трансфекции, по существу, не экспрессирует молекулы МНС I класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для обеспечения сигнала костимуляции для Т-клеток, такую как любая из В7.1, В7.2, ЮАМ-1 и ЬРА 3. Последовательности нуклеиновых кислот многочисленных молекул МНС I класса и костимуляторных молекул общедоступны в банках данных ОеиВаик и ЕМВЬ.

Аналогично, в случае использования эпитопа МНС I класса в качестве антигена, Т-клетки являются СЭ8-положительными ЦТЛ.

- 24 024497

Если антигенпрезентирующая клетка трансфицирована для экспрессии такого эпитопа, то предпочтительно, чтобы клетка включала вектор экспрессии, способный экспрессировать пептид, содержащий 8Е0 ГО N0: 1 по 8Е0 ГО N0: 95 или их вариантную аминокислотную последовательность.

Для получения ЦТЛ ίη νίίτο могут быть использованы многие другие способы. Например, в способах, описанных в работах Реор1ек е! а1. (1995) и Катакат е! а1. (1992), используются аутологичные опухоль-инфильтрующие лимфоциты при получении ЦТЛ. Р1еЪап8к1 е! а1. (1995) для получения ЦТЛ используют аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). 1осЪти8 е! а1. (1997) описывают получение аутологичных ЦТЛ посредством нагрузки пептидом или полипептидом на дендритны клеток или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. НШ е! а1. (1995) и Кготе е! а1. (1993) для получения аутологичных ЦТЛ используют В-клетки. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги, нагруженные, пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. 8. ^а1!ет е! а1. (2003) описывают прайминг Т-клеток ίη νίΙΐΌ с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАПК), что является также подходящим способом получения Т-клеток против выбранного пептида. В данном исследовании, аАПК были получены при соединении преформированных комплексов МНС-пептид с поверхностью полистироловых частиц (микросферы) с помощью биохимического способа с биотином-стрептавидином. Данная система допускает точный контроль плотности МНС на аАПК, который позволяет селективно вызвать высоко- или низкоавидные антигенспецифические Т-клеточные ответы с высокой эффективностью в пробах крови. Кроме комплексов МНС-пептид аАПК должны нести другие белки с костимуляторной активностью, такие как антитела к СО28, соединенные с их поверхностью. Кроме того, такая основанная на аАПК система часто требует добавления соответствующих растворимых факторов, к примеру, цитокинов, таких как интерлейкин-12.

При получении Т-клеток могут быть также использованы аллогенные клетки, и способ для этого подробно описывается в патентной заявке \У0 97/26328, включенном в контекст путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), бакуловирус-инфицированные клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, работу Рог!а е! а1. (1994), в которой описывается развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивная система для презентации чужеродных пептидов).

Активированные Т-клетки, которые направлены против пептидов по изобретению, пригодны для терапии. Таким образом, в другом аспекте изобретения предложены активированные Т-клетки, получаемые вышеупомянутыми способами по изобретению.

Активированные Т-клетки, полученные с помощью приведенного выше способа, будут селективно распознавать клетку, которая аберрантно экспрессирует пептид, включающий аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 1, ΓΕΟΙΕΟΟίνΕ, ΕΥρίΕρΟίνΣ, ΕΥΟΙΕΟΟίνΕ ΕΕΟΙΕΟΟίνΕ или ΕΕΟΙΕΟΟίνί.

Предпочтительно, чтобы Т-клетка распознавала клетку при взаимодействии посредством ее ТКР с комплексом НЬА/пептид (например, соединение). Т-клетки пригодны для способа уничтожения клетокмишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, где пациенту вводится эффективное число активированных Т-клеток. Т-клетки, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными Т-клетками). Альтернативно, Т-клетки получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. Здоровым индивидом авторы изобретения обозначают, что индивид имеет, в общем, хорошее здоровье, предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить.

Клетками-мишенями для 008-положительных Т-клеток ίη νί\Ό в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса I) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса I (^еηд^е1 е! а1., 4163-70)).

Т-клетки настоящего изобретения могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтической композиции. Таким образом, в изобретении предложен также способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, причем способ включает введение пациенту эффективного числа Т-клеток, как определено выше.

Под понятием аберрантно экспрессированный авторы изобретения понимают, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальными уровнями экспрессии, или что ген является молчащим в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием гиперэкспрессирован авторы изобретения понимают, что полипептид представлен на уровне, который по меньшей мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно, по меньшей мере в 2 раза и, более предпочтительно, по меньшей мере в 5 или 10 раз выше уровня, пред- 25 024497 ставленного в нормальной ткани.

Т-клетки могут быть получены способами, известными из уровня техники, к примеру, теми, что описаны выше.

Протоколы для этого т.н. адоптивного переноса Т-клеток хорошо известны из уровня техники, и с ними можно ознакомиться, например, в работах (КокепЬегд е! а1., 850-54; КокепЬегд е! а1., 2346-57; Эиб1еу е! а1., 889-97; Уее е! а1., 1676-80; Оиб1еу е! а1, 16168-73); обобщенных в (ОаШпот е! а1., 383-93) и (Могдап е! а1., 2006).

Любая молекула по изобретению, т.е. пептид, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка, активированные ЦТЛ, Т-клеточный рецептор или нуклеиновая кислота, кодирующая его, пригодна для лечения нарушений, характеризующихся клетками, ускользающими от иммунного ответа. Поэтому любая молекула настоящего изобретения может применяться в качестве медикамента или при изготовлении медикамента. Молекула может быть использована сама по себе или в комбинации с другой(ими) молекулой(ами) по изобретению или известной(ыми) молекулой(ами).

Предпочтительно, если медикамент настоящего изобретения является вакциной. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или системно ί.ά., 1.ш., 8.с, ί.ρ. и ί.ν. или вноситься ех νίνο в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ίη νίΐτο для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ίη νίΐτο, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфицированными, чтобы совместно экспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или же вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгирован с подходящим носителем, таким как гемоцианин фиссуреллы (КЬН) или маннан (см. \УО 95/18145 и ^οη§еηеске^ (1993)). Пептид может быть также меченым или может быть слитым белком или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют Т-клетки СЭ4 или С'.О8. Тем не менее, стимуляция СЭ8 ЦТЛ более эффективна в присутствии поддержки, предоставляемой СЭ4 хелперными Т-клетками. Таким образом, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют СЭ8 ЦТЛ, партнеры в слиянии или участки гибридной молекулы надлежащим образом предоставляют эпитопы, которые стимулируют СО4-положительные Т-клетки. СЭ4- и СО8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.

В одном аспекте вакцина включает по меньшей мере один пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ГО N0: 1, и по меньшей мере один дополнительный пептид, предпочтительно от двух до 50, более предпочтительно от двух до 25, еще более предпочтительно от двух до 15 и, наиболее предпочтительно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или тринадцать пептидов. Пептид(ы) может(могут) быть образован(ы) из одного или более специфических ТАА и может(могут) связываться с молекулами МНС I класса.

Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинацией. Методы конструирования и введения такой нуклеиновой кислоты хорошо известны из уровня техники. Обзор представлен, к примеру, в работе (Ракток е! а1. 117-22). Полинуклеотидные вакцины просто получить, однако способ действия этих векторов по индуцированию иммунного ответа понят не полностью. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные ДНК и/или РНК, такие как системы, которые основаны на аденовирусе, вирусе коровьей оспы, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры и хорошо известны из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством генной пушки. Пептид или пептиды, закодированные нуклеиновой кислотой, могут быть слитым белком, например, с эпитопом, который стимулирует Т-клетки для соответствующего противоположного гипервариабельного участка (СОК), как описывается выше.

Медикамент по изобретению может также включать один или более адъювант. Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (Т_Н) на антиген) и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте по настоящему изобретению. Подходящие адъюванты включают, но без ограничения, 1018 Ιδδ, соли алюминия, АтрПуа.х®. Ά815, ВСС, СР-870,893, СрС7909, СуаА, 6§ЫМ, флагеллин или лиганды ТЬК5, полученные из флагеллина, лиганд РЬТ3, СМ-С8Р, 1С30, 1С31, имиквимод (АЬОАКА®), резимиквимод, 1тиРас! 1МР321, интерлейкины, такие как ИЛ-2, ИЛ-13, ИЛ-21, интерферон-альфа или бета или их пегилированные производные, Ιδ Ра!сЬ, Ιδδ, КСОМАТКЕХ, иммуностимулирующие комплексы КСОМ, Гну^ти^, Είρον;κ, МАЬР2, МР59, монофосфорил липид А, Монтанид ^δ 1312, Монтанид КА 206, Монтанид КА 50ν, Монтанид КА-51, эмульсии вода в мас- 26 024497 ле и масло в воде, ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОЭТАК, ОкрА, векторная система РерТе1®, основанные на поли(лактидкогликолиде) [РЬО] и декстране микрочастицы, талактоферрин 8КБ172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, ΥΡ-17Ό, УЕОР 1гар, К848, Бета-глюкан, Рат3Сук, стимулон Ацш1а 0821, который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитаторы бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как ЭеЮх компании КлЫ'к, Οιιίΐ или 8ирегГо5. Предпочтительными адъювантами являются такие, как адъювант Фрейнда или ОМС8Р. Несколько иммунологических адъювантов (например, МР59), специфических для дендритных клеток, и их получение были описаны ранее (АШкоп апб Кгитте1, 932-33). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были непосредственно соотнесены с влиянием на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, ТОТ¹-), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ОМ-С8Р, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США 5849589, отдельно включенный в описание во всей полноте путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-23, ИЛ-7, ΙΡΝ-альфа, ΙΡΝ-бета) (ОаЬгПоУсН 1996).

Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах СрО также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, СрО-олигонуклеотиды при активации врожденной (не приобретенной) иммунной системы действуют с помощью То11-подобных рецепторов (ТЬК), в основном, ТЬК9. Вызванная СрО активация ТЬК9 усиливает антигенспецифические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к повышенной активации Т_Н1-клеток и интенсивной выработке цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи ί'Ό4 Т-клеток. Активация Т_Н1, вызванная стимуляцией ТЬК9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (ГРА), которые обычно способствуют активации Т_Н2- СрО-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся в организм вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или в подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммунную реакцию и позволяют снизить дозы антигена приблизительно на два порядка в сравнении с ответами антитела на полную дозу вакцины без СрО в некоторых экспериментах (Кпед, 471-84). В патенте США 6406705 В1 описывается комбинированное применение СрО-олигонуклеотидов, адъювантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антигенспецифического иммунного ответа. Антагонистом СрО ТЬК9 является 68ЫМ (иммуномодулятор со структурой типа двуцепочечный стебель-петля) компании Мо1одеп (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с ТЬК, такие как РНК, связывающаяся с ТЬК 7, ТЬК 8 и/или ТЬК 9.

Другие примеры пригодных к использованию адъювантов включают, но без ограничения, химически модифицированные СрО (например, СрК, Гбега), аналоги бкРНК, такие как поли(1:С) и их производные (например, АтрПСеп®, НШопо1®, поли-(ГСЬС), поли(ГС-К), поли(1:С1211), бактериальные ДНК или РНК, отличные от СрО, а также иммуноактивные малые молекулы и антитела, такие как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NСX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, темозоломид, темсиролимус, ХЬ-999, СР-547632, пазопаниб, УЕОР Тгар, ΖΌ2171, А2П2171, антиСТЬА4, другие антитела, нацеленные на основные структуры иммунной системы (например, антитела к ί'Ό40, ТОР-бета, рецептору ТОТ-альфа) и 8С58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъюванты. Количества и концентрации адъювантов и добавок, пригодных для использования в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов.

Предпочтительными адъювантами являются имиквимод, резимиквимод, ОМ-С8Р, циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, интерферон-альфа, олигонуклеотиды СрО и производные, поли-(1:С) и производные, РНК, силденафил и составы из твердых частиц с РЬО или виросомы.

Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р, сарграмостим), имиквимод, резиквимод и интерферон-альфа.

Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р, сарграмостим), имиквимод и резиквимод.

Адъювантом может являться имиквимод и резиквимод.

Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяют или суспендируют в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Кроме того, композиция может содержать такие вспомогательные вещества, как буферы, связующие агенты, раз- 27 024497 рушающие агенты, разбавители, ароматизаторы, смазывающие вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список вспомогательных веществ, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из работы А. КЪЪе, НапйЪоок οί РЬагтасеи11са1 Ехс1р1еп1к, 3. Ей., 2000, изд. Атепсап РЬагтасеи11са1 Аккоиайоп апй рЬагтасеи11са1 ргекк. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний. Отдельные примеры составов могут быть взяты, например, из ЕР2113253.

Кроме того, может быть медикамент, который пригоден для лечения рака, в частности рака желудка, почечно-клеточной карциномы, рака толстой кишки, немелкоклеточной карциномы легких, аденокарциномы, рака предстательной железы, доброкачественных новообразований и злокачественной меланомы.

Настоящий состав подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, глазной, подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный способ. Предпочтительно, чтобы введение было к.с, и, наиболее предпочтительно, 1.й. Введение может производиться инфузионным насосом.

Теперь настоящее изобретение будет описано с помощью последующих примеров, которые описывают его предпочтительные варианты осуществления, тем не менее, не ограничивая ими изобретение. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Примеры

Пример 1.

Идентификация опухолеассоциированных пептидов, презентируемых на поверхности клетки.

Образцы тканей.

Опухолевые ткани пациентов были предоставлены Медицинским университетом префектуры Киото (КРИМ), Киото, Япония, Школой медицины Осакского университета (0СИ), Осака, Япония и Университетским госпиталем г. Тюбинген, Германия. Перед проведением хирургической операции было получено информированное согласие всех пациентов в письменной форме. Сразу же после операции ткани были подвергнуты шоковой заморозке в жидком азоте и хранились до изоляции ТИМАР-пептидов при -80°С.

Выделение пептидов НЬА из образцов тканей.

Пулы комплексов пептид-НЬА из подвергнутых шоковой заморозке образцов тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Ра1к еί а1. 1991; §еедег, Р.Н. еί а1. 1999) при использовании НЬА-А, -В, -С-специфического антитела \У6/32, НЬА-А*02-специфического антитела ВВ7.2, СНВг-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.

Методы.

Полученные пулы комплексов пептид-НЬА были разделены в соответствии с их гидрофобностью ОФ хроматографией (папоАсцийу ИРЬС кук1ет, \Уа1егк) и элюированные пептиды анализировали на гибридном масс-спектрометре ЕТО-0гЬйгар (ТЬегтоИкЬег ЗаепЕПс), снабженном источником Е§1. Пулы пептидов загружали непосредственно на аналитическую микрокапиллярную колонку из плавленого кварца (75 мкм внутр.д.х250 мм) с материалом для обратнофазовой хроматографии 1,7 мкм С18 (\Уа1егк) с применением скорости потока в 400 нл/мин. Затем пептиды разделяли с использованием двухэтапного 180-минутного бинарного градиента от 10 до 33% В при скорости потока 300 нл/мин. Градиент был составлен из растворителя А (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворителя В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Позолоченный стеклянный капилляр (РюоПр, Ее\у 0Ь|ес1Ае) использовали для введения в источник нано-Е§1. Масс-спектрометр ЕТО-0гЬйгар работал в зависимом от данных режиме с применением стратегии ТОР5. Вкратце, цикл сканирования начинался с полного сканирования с высокой точностью масс на спектрометре 0гЪйгар (К=30000), за чем следовало сканирование М8/М8 на 0гЫ1гар (К=7500) на 5 особенно многочисленных ионах-предшественниках с динамическим исключением отобранных ранее ионов. Тандемные масс-спектры интерпретировали на ЗЕЦИЕЗТ с дополнительным ручным управлением. Идентифицированную пептидную последовательность подтверждали сравнением генерированной картины фрагментации природного пептида с картиной фрагментации синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. На фиг. 1 представлен образец спектра, полученный из опухолевой ткани для пептида СЭС2-001, ассоциированного с МНС класса I, и его профиля элюции на системе ИРЬС.

Пример 2.

Профили экспрессии генов, кодирующих пептиды по изобретению.

Не все пептиды, идентифицированные как презентируемые на поверхности опухолевых клеток молекулами МНС, подходят для иммунотерапии, потому что большинство этих пептидов образованы из нормальных клеточных белков, экспрессируемых многими видами клеток. Только немногие из этих пептидов являются опухолеассоциированными и, вероятно, способны индуцировать Т-клетки с высокой специфичностью распознавания для опухоли, из которой они были получены. В целях идентификации

- 28 024497 таких пептидов и минимизации риска аутоиммунности, вызванной при вакцинации, авторы данного изобретения сосредоточили свое внимание на тех пептидах, которые получены из белков, гиперэкспрессированных на опухолевых клетках в сравнении с большинством нормальных тканей.

Идеальный пептид может быть получен из белка, являющимся уникальным для опухоли и не присутствующим ни в одной другой ткани. Для идентификации пептидов, которые образованы из генов с профилем экспрессии, близким к идеальному, идентифицированные пептиды соотносили с белками и генами, соответственно, из которых они были образованы, и строили профили экспрессии этих генов.

Источники и приготовление РНК.

Хирургически удаленные образцы тканей были предоставлены различными клиническими центрами (см. пример 1) после получения письменной формы информированного согласия от каждого пациента. Образцы опухолевой ткани были мгновенно заморожены в жидком азоте после операции и гомогенизированы позже с помощью ступки и пестика в жидком азоте. Суммарная РНК была приготовлена из данных образцов с использованием реагента ТЫ (АтЫоп, Дармштадт, Г ермания) с последующей очисткой на К№аку (ОМСЕН Хильден, Германия); оба метода осуществлялись в соответствии с указаниями производителей.

Суммарная РНК здоровых человеческих тканей была куплена (АтЫоп, Хантингдон, Великобритания; С1оп!есЬ, Гейдельберг, Германия; 81та1адепе, Амстердам, Нидерланды; ВюСЬаЫ, Хейвард, Калифорния, США). РНК нескольких индивидов (от 2 до 123 индивидов) была смешана таким образом, что РНК каждого индивида имела равную массу. Лейкоциты были выделены из образцов крови 4 здоровых добровольцев.

Качество и количество образцов суммарной РНК оцененивали на биоанализаторе АдЬеп! 2100 (АдЬеп!, Вальдбронн, Германия) с использованием набора КNЛ6000 Рко ЬаЬСЫр Κί! (АдЬеп!).

Эксперименты с микроматрицами

Анализ экспрессии генов всех образцов РНК из опухолевой и нормальной ткани был произведен с помощью олигонуклеотидных микроматриц АГГуте1п\ Нитап Сепоте (НС) И133А или НС-Ш33 Р1ик 2.0 (АГГуте1п\, Санта Клара, Калифорния, США). Все этапы были выполнены в соответствии с руководством АГГуте1п\. Вкратце, двунитевую кДНК синтезировали из 5-8 мкг суммарной РНК с использованием 8ирегксг1р! КТП ОтЬгодеп) и олиго-6Т-Т7 праймера (МАС Вю!есЬ, Эберсберг, Германия), как описывается в руководстве. Транскрипцию ш \Ьго производили с использованием набора для мечения РНКтранскриптов ВюАггау ШдЬ У1е1б КNЛ Тгапкспр! ЬаЬеШпд Κί! ΟΖΟ И1адпокЬск, Ыс., Фармингейл, Нью-Йорк, США) для матриц И133А или набора СепеСЫр ТУТ ЬаЬеШпд Κί! (АГГуте1п\) для матриц И133 Р1ик 2.0 с последующей фрагментацией, гибридизацией кРНК и окрашиванием стрептавидинфикоэритрином и биотинилированным антистрептавидиновым антителом (Мо1еси1аг РгоЬек, Лейден, Нидерланды). Изображения сканировали на АдЬеп! 2500А СепеАггау 8саппег (И133А) или АГГуте1п\ СепеСЫр 8саппег 3000 (И133 Р1ик 2.0), а данные анализировали в программе ССО8 (АГГуте1п\) с использованием настроек по умолчанию для всех параметров. Для нормализации использовались 100 служебных генов, предоставленных АГГуте1п\. Относительные значения экспрессии были подсчитаны из отношений зарегистрированных сигналов, полученных компьютерной программой, а значение для образца нормальной почки было произвольно задано значением 1,0.

Профили экспрессии исходных генов, предложенных в настоящем изобретении, которые в высокой степени гиперэкспрессированы в клетках рака желудка, представлены на фиг. 2.

Пример 3.

Иммуногенность ш уйго для пептидов, презентируемых МНС I класса, в ГМА941.

Для получения информации об иммуногенности пептидов ТИМАР по настоящему изобретению были проведены исследования с использованием хорошо известных методов стимуляции, уже описанных в работе (АаНег, 8., Неггдеп, Ь., 8сНоог, О., Ыпд, С., АегпеЕ Ό., ВиНттд, Н.Т, Каттепкее, Н.С., апб 8!еуапоу1с, 8.; 2003, СиЫпд ебде: ргебе!егттеб а\аЬПу оГ Ьитап СГО8 Т се11к ехрапбеб оп саИЬга!еб МНС/апП-СП28-соа!еб нисгокрНегек, ЫттипоЕ, 171, 4974-4978). С использованием этой системы была показана положительная иммуногенность (т.е. размножение специфических Т-клеток) для 47 из 54 проанализированных пептидов ТИМАР, рестриктированных по НБА-А*2402, и для 3 из 3 проанализированных пептидов ТИМАР по изобретению, рестриктированных по НЕА-А*020Е демонстрируя, что эти пептиды являются Т-клеточными эпитопами, против которых у человека существуют СГО8' Т-клеткипредшественники (табл. 4).

Прайминг СЭ8' Т-клеток ш уЬто.

В целях проведения стимуляций ш уЬто искусственными антигенпрезентирующими клетками (иАПК), нагруженными комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом к СЭ28, сначала были выделены СГО8 Т-клетки из свежего продукта лейкафереза НБА-А*24 или из лейкоцитарной пленки НБА-А*2 здоровых доноров, полученных из Банка крови г. Тюбингена, Германия.

СГО8 Т-клетки, непосредственно обогащенные либо из продукта лейкафереза, либо из РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) сначала выделяли с помощью среды градиентного разделения стандартной плотности (РАА, Кёльбе, Германия). Выделенные СИ8-лимфоциты или РВМС инкубировали до использования в Т-клеточной среде (ТСМ), состоящей из КРМИСЫЫтах (ШуЬтодеп, Карлс- 29 024497 руэ, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РЛ№ ВюйсЬ, Эйденбах, Германия), 100 Ед/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (СатЬгех, Вервье, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Рго, Нойштадт, Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (СатЬгех). Цитокины с концентрацией 2,5 нг/мл ИЛ-7 (РготоСе11, Гайдельберг, Германия) и 10 Ед/мл ИЛ-2 (ШуагШ РЬагта, Нюрнберг, Германия) также добавляли в среду ТСМ на этом этапе культивирования. Выделение лимфоцитов СЭ8' производили методом позитивной селекции с помощью микросфер СЭ8 (М111спу1 В|о1ес, Бергиш-Гладбах, Германия).

Получение микросфер, покрытых рМНС/анти-СП28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (ДОаЙег е1 а1., 4974-78), с минимальными модификациями. Вкратце, были получены биотинилированные нагруженные пептидом рекомбинантные молекулы НЬЛ-Л*2402 и НЬЛЛ*0201, без трансмембранного домена, и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи. Очищенный костимулированный ЬдО2а мыши к антителам человека СЭ28 ЛЬ 9,3 (ип§, ЬебЬейег, апб Ми11ег-ЕЬегЬаг6 4611-15) был биотинилирован химическим способом с использованием сульфо-^гидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (РегЫо, Бонн, Германия). Использованные микросферы представляли собой полистироловые частицы размером 5,6 мкм, покрытые стрептавидином (Вандх ЬаЬога1опе8, Иллиной/США). рМНС, использованные в качестве положительного и отрицательного контроля иммуногенности, были А*0201/М1_А-001 (пептид ЕЬЛОЮШТУ из модифицированного Ме1аη-А/МАΚТ-1) и Л*0201/ППХ5-001 (Υ^^РАIVНI из ΌΌΧ5) соответственно.

800000 микросфер/200 мкл помещали в лунки 96-луночного планшета в присутствии 600 нг биотинилированных анти-СЭ28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные микросферы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при совместной инкубации 1х10⁶ СЭ8' Т-клеток с 2х 10⁵ промытых микросфер с покрытием в 200 мкл среды ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (РготоСе11) в течение 3-4 дней при 37°С, 5% СО₂ и 95% относительной влажности. Половина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 Ед/мл ИЛ-2 и инкубация была продолжена в течение 3-4 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций производили в общей сложности три раза.

Наконец, проводили анализы мультимеров окрашиванием клеток с помощью флуоресцентных мультимеров А*0201 или А*2402 НЬЛ (полученными, как описывается в работе {ЛИтай 1996 А^ТМЛN1996/^ά}) и клоном δΚ1 антитела СЭ8-ПТС (ВО, Гейлельберг, Германия) или дополнительно с помощью маркера жизнеспособности (веществом Ыуе/беаб-Лдиа или фиолетовым красителем (Iηνй^οдеη, Карлсруэ, Германия)) и измерения проводили на четырехцветном цитометре РЛСЗСаЪЬиг (ВО) или цитометре ЬЗРП ЗОРР (ВО; 18 цветов, оснащенных синим (488 нм), фиолетовым (405 нм), красным (640 нм) и зеленым (532 нм) светофильтрами соответственно. Пептидспецифические клетки были подсчитаны как процентная доля всех СЭ8' Т-клеток. Оценку результатов мультимерно го анализа проводили с помощью компьютерной программы Р1о\\2о (Тгее 81аг, Орегон, США). Прайминг ίη уйго специфических мультимер-положительных СЭ8' лимфоцитов оценивали установкой подходящего дискриминационного окна и сравнением со стимуляциями отрицательного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была определена, если было обнаружено, что по меньшей мере в одной подлежащей оценке простимулированной ίη уйго лунке одного здорового донора содержалась специфическая СЭ8+ Т-клеточная линия после стимуляции ίη уйго (т.е. когда данная лунка содержала по меньшей мере 1% специфичных мультимер-положительных среди СО8-положительных Т-клеток) и процентная доля специфических мультимер-положительных клеток была по меньшей мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций соответствующего отрицательного контроля (стимуляция несоответствующими и окрашивание соответствующими мультимерами) и клетки не находились на диагонали диаграммы).

Иммуногенность ίη уйго для пептидов ГМЛ941.

Для 47 из 54 исследованных пептидов НЬЛ-Л*2402 и для 3 из 3 исследованных пептидов НЬЛ-Л*0201 могла быть продемонстрирована иммуногенность ίη уйго за счет получения пептидспецифических Т-клеточных линий. Пример результатов цитометрии после ТиМЛР-специфического мультимерного окрашивания для двух пептидов по изобретению показаны на фиг. 3 вместе с соответствующим отрицательным контролем. Результаты для 54 пептидов А*2402 и 3 А*0201 по изобретению обобщаются в табл. 4.

- 30 024497

Таблица 4

Иммуногенность пептидов НЬА1 класса по изобретению ш \Ьго. Результаты экспериментов по иммуногенности ш ν^ι^о. проведенных фирмой 1ттабс8, показывают процентную долю доноров и лунок с положительными результатами и лунок среди тех, что подлежали оценке. По меньшей мере четыре донора и 48 лунок каждого пептида подлежали оценке

№ последовательное ти	Антиген	Доноры положительных/ оцениваемых [%]	Лунки положительных/ оцениваемых [%]
1	СОС2-001	83	28
2	А5РМ-002	67	32
18	ММРЗ-001	11	1
4	МЕТ-006	67	21
3	11СН1.5-001	75	12
7	МЗТ1 Р-001	50	13
33	К1Е2С-001	17	2
9	5МС4-001	73	10
17	ЕРНА2-005	0	0
5	РРОМ1-001	83	26
6	ММР11-001	33	11
8	ΝΕΥΒ-001	50	7
16	А5РМ-001	17	3
20	РЬК4-001	60	5
14	АВИ-001	83	18
26	ΑΤΑϋ2-001	33	3
21	ΑΤΑϋ2-002	17	1

- 31 024497

27	АТА02-003	0	0
12	ΑΥ/Ι.9-001	100	31
22	СОИ2А1-001	0	0
23	СОЬбАЗ-001	0	0
24	ΡΑΝΟ1-001	17	1
28	Н5Р90В1-001	50	7
15	мисб-001	83	22
13	ΝΙΙΡ2-001	100	50
19	ΝΙΙΡ2-002	50	6
11	РРАР2С-001	83	29
25	РР511-001	17	3
29	5ΙΑΗ2-001	50	8
30	8Ю6А6-001	17	1
10	иосрв-001	83	24
31	ЮСАРЗ-001	100	24
32	ЕРВВЗ-001	83
	ССОС88А-001	0	0
	ССЫВ1-003	33	3
	ССЫ02-001	17	10
	ССЫЕ2-001	0	0
	СЕА-010	40	3
	С1_СЫЗ-001	33	6
	ϋΝΑΧ10-001	50	15
	ϋΝΑΧ10-002	33	3
	ΕΙΡ253-001	17	1
	Е1РЗЮ01	100	29
	ЕРРК1-ОО1	17	1
	ΘΡΡ39-001	50	6
	1ТСВ4-001	67	20
	ЬС N2-001	17	1
	50НС-001	33	3
	РВК-001	0	0
	РОЮЗ-001	67	7

Ρ3Μϋ14-001	17	1
РТК2-001	17	4
Τ5ΡΑΝ1-002	17	1
ΖΝΡ598-001	83	17

Приведенные ниже пептиды уже были описаны в других патентных заявках фирмы Питайся и включены в вакцины ПМА901 (МЕТ-001 и ТОР-001), ПМА910 (МЕТ-001 и ТОР-001) и ПМА950 (ЮР2ВР3001). Поскольку, например, пептид МЕТ-001 приводит к чрезвычайно хороших реакциям ш νίνο, данные могут рассматриваться как сведения пригодности пептидов по изобретению для клинического применения.

№ последовательное ти	Антиген	донорская положител ьных/о цениваемых [%]	Лунки положительных/ оцениваемых [%]
	ΙΘΡ2ΒΡ3-001	50	21
	МЕТ-001	67	42
	ТОР-001	40	10

- 32 024497

Список литературы

АРтеР, А. и., е1 а1. ЕЯес( οί <к5гирЬпд 5еуепчп-аЬ5еп1|а 1юто1од 2 ίιιηοΐίοη оп 1ипд сапсег се11 дгоуИР. ϋ ЫаЦ.Сарсег 1рз(.100.22 (2008): 1606-29.

ΑΙΙίεοη, ! Р. апй Μ. Р. Кгитте1. ТРе Υίη апй Уапд οί Τ сеП соз(1ти1а11оп. Зрелее 270.5238 (1995): 932-33.

АИтеуег, А., е1 а1. Титог-зресЖс сеН зигТасе ехргез81ОП οί ΙΡθ-ΚϋΕΙ. соп1а1П1пд, еп<)ор1а5ггнс геЬси1аг Реа1 зРоск ρΓΟίβίη др96. Ιηΐ ΰ Сапсег 69.4 (1996): 340-49.

Аррау, V., е! а1. 0есгеа5ей зреете СО8+- Т сеН сгоэз-геасМу οί апЬдеп гесодпКюп 1о11оутд уасйпаРоп ννί«» Ме1ап-А рер1Ие. ЕигЛ 1ттипо1. 36.7 (2006): 1805-14.

Вапедее, 3. К., е! а1. Ехргезз1оп οί сбс2 апб сусНп Β1 ΐη Не1юоЬас1ег ру1оп-аз5ОС1а1е<1 даз1пс МАИ ап<1 МАП 1утрРота : ге1аЬопзР|р ίο сеН с1еа(Р, ргоНТегаРоп, апб 1гапзТоппа(10п. Ат ϋ РаТРок 156.1 (2000):217-25.

ВаПтап, А. Е., е1 а1. АЬеггап! ехргеааюп οί М11С5АС апб М11С6 да51пс тист депеа ΐη со1огес!а1 Р01УР5. ΙηΙ Л Сапсег 80.2 (1999): 210-18.

Ва5и, 5., е( а1. ЫесгоРс Ьи1 ηοί арор(оРс сеН (1еа1Р ге1еазез Реа1 зРоск ρΐΌΐβΐηε, ννΡΐοΡ ϋβΐίνβί а рагРа! та1игаРоп з1дпа1 ίο йепбпРс се11з апс) асруа1е (Ре ΝΕ-карра В ра1Р«,ау. Ιηί 1ттипо1.12.11 (2000): 1539-46.

Ваиег, В., 5. ВагНеИ, ап<1 Τ. Е. Меуег. И. ру!оп зе1есруе!у Ыоскз ЕСЕР. епс1осу1оз13 \ла 1Ре попгесер!ог ктаге с-АЫ апб СадА. СеН ΜίΟΓοΡΐοΙ. 11.1 (2009): 156-69.

Вепа1Р, Р., е1 а1. А Ьа1апсе Ьеруееп ΝΡ-Υ апй р53 доуегпз 1Ре рго- апо апО-арорЮРс РапзспрРопа! гезропзе. Νίΐοΐβίο АсМз Р.еа 36.5 (2008): 1415-28.

ΒβΓίοΡηΐ, С., е1 а1. ЕРдР1у 1итопдеп1С 1ипд сапсег СО133+ сеИз сРзр!ау з1ет-Рке 1еа1иге$ апР аге зрагей Ьу с1зр1а11п 1геа1теп1. Ргос Ыа11.Аса<3.5сШ.5.А 106.38 (2009): 16281-86.

В!епе, В. ап<1 Н. Ι-. Мозез. ТСЕ-Ье1а апй сапсег Су1ок1пе Οιόϋ/ΙΙί Еас1ог Кеу. 17.1-2 (2006): 2940.

ВНоип, Е. апс) К. Ε. ϋβνίθε. ТРе гоЬоРс тоизе: ипгауеШпд 1Ре йтсРоп οί АР4 ΐη 1Ре сегеЬеНит. СегеЬеИит. 4.4 (2005): 250-60.

Во1Раззап1. А. апс1 5. Ка1аР. НеаЕзРоск рго!е1пз аэ роууегТи! у/еаропз ίη уасапе с1еуе1ортеп1. ЕхреП.Кеу.Уасапез. 7.8 (2008): 1185-99.

Вогзе(, М., е1 а1. ТРе го1е οί Рера1осу1е дгоуЛР Тас(ог апб Из гесер1ог с-Ме( ΐη πιιιΙΡρΐβ туе1ота апб о1Рег Ыоос1 таНдпапс1ез. ЬеикХутрРота 32.3-4 (1999): 249-56.

ВгайЬигу, Р. А., е1 а1. Ма(их те1а11орго1е1пазе 1, 3 апб 12 ро1утогрр1зтз апР езорРадеа! аРепосагапота пзк апс! ргодпоз13. Сагаподепез13 30.5 (2009): 793-98.

Вгоууп, С. Е., е1 а1. ЕесодпРюп апс1 кИНпд οί Ьгат 1итог 51ет-Ике т№аРпд се115 Ьу СО8+ су!о1уРс Т се115. Сапсег КезеагсР 69.23 (2009): 8886-93.

ВгисШогТес, Т, О. Магбег, ап<1 Е. А1Ьепс1О. Егот ргойисРоп οί рерРРез ίη тИНдгат атоипь Ьг гезеагсР ίο тиРМопз диапРРез ΐοι скиде οί ТРе кПиге. Сигг.РРапп.В|о1есРпо1. 5.1 (2004): 29-43. Вгипзу|д, Ρ. Е., е( а1. Те1отегазе рерШе уасапаЬоп: а рРазе Ι/ΙΙ з!ис!у ΐη раРепй ’λ'ϊΙΙί поп-зта11 сеН 1ипд сапсег. Сапсег 1ттипо1.1ттипо1Рег. 55.12 (2006): 1553-64.

- 33 024497

СаЬапез, ϋ., е! ак СрЭб Ϊ5 а гесер(ог Тог а ηονβί ίίβΙβΓίβ топосуЮдепез νϊΓοίβηοβ 1ас1ог, νίρ, а аигТасе ρπΛβΐη. ΕΜΒΟ Ί 24.15 (2005): 2827-38.

Са1гас1о, М. А., е( а1. Ап ίηΰиаЫе аи(огеди1а(огу Ιοορ Ьемееп ΗΙΡΚ2 апс! 3ίβΠ2 а( (Ие арех οί 1Ие НурохЮ гезропзе. ИаТСеН ΒίοΙ. 11.1 (2009): 85-91.

Саз(е1П, С., е( ак Неа1 зИоск рго(ешг: Ыо1од1са1 ТипсИопа апй сПпюа1 аррНсаПоп аг регзопаПгед уасапег Тог Иитап сапсег. Сапсег 1ттипо1.1ттипо1Иег. 53.3 (2004): 227-33.

СазШсот, Р., е1 ак Во(И СР133+ апс! С. ЕигД 1ттипо1. 37.11 (2007): 3190-96.

СИапоск, 5. ϋ., е1 ак НЬА-А, -В, -Су/, -РОА1 апО -РРВ1 АНе1ез ίη а Саисаз1ап Рори1аИоп Ггот ВеШезЬа, иЗА. Нит.1ттипо1. 65 (2004): 1211-23.

СИеп. С. Н., е( а1. ΙηΓιϊΙοϊΙϊοη οί ИегедиНп з1дпаНпд Ьу ап ар1атег (Иа( ргеТегепПаНу Ып<1з ίο (Пе оНдотепс Тот οί Питап ерк1егта1 дгоуЛП 1ас(ог гесер(ог-3. Ргос МаЦ.АсаскЗсШ.З.А 100.16 (2003): 9226-31.

СПеп, Ζ. апО ϋ. ϋ. О'ЗПеа. РедиЮНоп οί И-17 ргоОисИоп ίη Питап 1утрИосу(ез. Су(ок1пе 41.2 (2008): 71-78.

СПо, 3. О., е( ак НеПсоЬас(ег руЮп ίη а Когеап 1зо1а(е Ехргеззей Рго1етз РНТегепЬаНу ίη Нитап 6аз(пс ЕркПеНа! Се11з. Ρία.Ρί3.5οί. (2009).

СПпзПапзоп, Т С., е1 ак 05-9 апс1 СРР94 йеНуег ти(ап( а1рНа1-ап(#гур51п (о 1Пе НгсП-ЗЕии иЫдиШп Ндазе сотр1ех ίοτ ЕРАР. НаТ.СеК ΒίοΙ. 10.3 (2008): 272-82.

С1зек, ί. ϋ. ап<1 3. Ь. СогОеп. РИозрПогу1аПоп οί ΡΝΑ ро1утегазе Ьу 1Пе типпе Пото1одие οί 1Ие се11-сус1е соп(го1 ριοίβίη сс1с2. Ыа(иге 339.6227 (1989): 679-84.

Со1отЬеШ, 3., е1 ак Рго1опде<1 ТСР/СР28 епдадетеп! Ьпуез Н--2-Юс1ерепс1еп1 Т сеП сЮпа! ехрапзюп (ПгоидП 31дпаНпд тесЛа(ес1 Ьу (Пе таттаПап (агде! οί гаратусю Ц 1ттипо1. 176.5 (2006): 2730-38.

Соп1а1оп1еп, 5., е( а1. АНегаНопз οί иЫдиШп Ндазез ίη Питап сапсег апс) Паек аззоаайоп ννίΤΤ» (Пе па(ига1 И 13(огу οί (Пе (итог. Опсодепе 28.33 (2009): 2959-68.

Согзо, 5., е( ак ЗНепстд (Пе МЕТ опсодепе 1еа0з (о гедгеззЮп οί ехрептеп(а1 (итога апс! те(аз(азез. Опсодепе 27.5 (2008): 684-93.

Сох, С. V., е( а1. Ехргеззюп οί СР133 оп 1еикет1а-Ю|НаЦпд сеНз ίη οΠίίύΗοού ΑΙ±. ΒΙοού 113.14 (2009): 3287-96.

СипНа-Реггека, I., βί ак ТИе ЗСР/ЗПтЬ иЬк,иН|г« Ндазе ΙίιηίΙϊ сеШгозоте атрННсаПоп ШгоодП с1едгас1а(юп οί 3ΑΚ/ΡΙ.Κ4 Сигг.В1о1. 19.1 (2009): 43-49.

РеЬиса, и. С., е! ак Нес1 ап<1 пи12 аге соге сотропеп!з оТ1Пе к1пе(осИоге ои1ег р1а(е еззепИа! Юг огдатгтд тюго(иЬи1е аИасПтеп! зНез Мо1.ВЮ1.Се1116.2 (2005): 519-31.

Репд, Н„ е1 а1. Ма1пх теОНоргоГеЮазе 11 ύβρίβίίοη ίηΗίΠίίΒ сеП рго1Иега(Юп ίη даз1пс сапсег сеНз. ВЮсИет.ВЮрНуз.Рез Соттип. 326.2 (2005): 274-81.

Репд]е1, 3., е1 а1. ипехрес(ес1 АЬипЦапсе οί ΗίΑ С1азз II Ргезеп(ес1 Рер1Иез ίη Рптагу Репа1 СеН СагсЮотаз. СПп Сапсег Рез. 12.14 (2006): 4163-70.

Регетег, Р. 1_, С. к15(ип, апй К. 1\1а1ага)ап. ΜίίοΙίηίΡ: а 5есоп<1-депега1Юп (угоз1пе кЮазе ЮНЮНог (ог 1Ие (геа!теп( оТсНгопЮ туе1одепоиз 1еикет1а. СНп ТИег. 30.11 (2008): 1956-75.

- 34 024497 ϋϊ Ρβηζο, Μ. Ρ, θί а1. Оуегехргеззюп апй атрНЛоаИоп οί 1Ме тебНСР гесер!ог депе йийпд 1Ье ргодгеккюп οί со1огес!а1 сапсег. СНп.Сапсег Рее. 1.2 (1995): 147-54.

Оопд, с„ е1 ак НераюсуТе дгоуДЬ ТасЮг/зсаиег ТасЮМпйисей асЬуаЬоп οί МЕК ап<1 ΡΙ3Κ $|дпа1 раЮууауз соп1пЬи(ез 1о ехргеззюп οί рюапдюдепю суЮМпез 1П1ег1еиМп-8 апй уазсШаг епйо1ЬеПа1 дгоМЬ 1ас1ог ϊη Ьеай апй песк здиатоиз сеН сагапота.” Сапсег Кее. 61.15 (2001): 5911-18.

Оий1еу, М. Е._; е! ак Сапсег гедгезаоп апй аикнттипйу ϊη раИепЮ аПег с1опа1 герори1а!юп ννϊίΐΊ апМитог 1утрЬосу1ез. Зс1епсе 298.5594 (2002): 850-54.

Оий1еу, Μ. Е., е( ак ΑΟορίίνβ сеН 1гапз1ег Юегару ίοΙΙον/ϊηη поп-туе1оаЫаЬуе Ьи11утрЬойер1еЬпд сЬето1Ьегару Тог 1Ье 1геа1теп1 οί раЬеп!з ννϊίίι геТгасЮгу те!аз1аЬс те1апота. Й.СИп.Опсо1. 23.10 (2005): 2346-57.

Оиопд, С., е1 а1. Рге1геа1теп1 депе ехргеззюп ргоЫез сап Ье изей 1о ргейю! гезропзе 1о пеоафиуап) сЬетогайюЮегару ΐη езорЬадеа! сапсег. Апп Зига Опсо! 14.12 (2007): 3602-09. Ед1апй, К. А., е1 а1. Ηίρίι ехргезз1оп οί а су№кегаЬп-аззос1а1ей ριοίοιιι ίη тапу сапсегз. Ргос Ыа11.АсаЙ.ЗС1.и.З.А 103.15 (2006): 5929-34.

Егато, А., е( ак 1йеп1|(1саЬоп апй ехрапзюп о11Ье 1итопдепю 1ипд сапсег з1ет сеН рори1а1юп. СеН РеаШ Р1Яег15.3 (2008): 504-14.

ЕзазЫ, Р., е( ак СЭК-йерепйет рЬозрЬогу!аЬоп οί ВР.СА2 аз а геди1а!огу тесЬап13т Гог гесотЫпаЬопа! геьагг. ЫаТиге 434.7033 (2005): 598-604.

ЕзсоЬаг, Μ. А„ βί а1. РюЛНпд οί пис1еаг ех1гас1 ргоЮигз Бот Ьитап пеигоЫазЮта сеН Нпез: 1Ье зеагсЬ 1ог ПпдегрппЮ Й Рей1а1г.5игд 40.2 (2005): 349-58.

Реггас1П1, Р., е1 а1. ТЬе МебНСР гесер1ог 13 оуег-ехргеззей ϊη Ьитап оз!еозагсотаз апй Ϊ3 асЬуа(ей Ьу еКЬег а рагасппе ог ап аиЮсппе с1гсиИ. Опсодепе 10.4 (1995): 739-49. р|5сЬег, й,, е( ак ОирНсаЬоп апй оуегехргеззгоп оНЬе ти1ап1 а11е1е оПЬе МЕТ ргою-опсодепе ϊη ти10р1е ЬегейИагу рарШагу гепа! сеН (итоига. Опсодепе 17.6 (1998): 733-39.

Р1ападап, Й. М., е! а1. Οβηοιτιίοε зсгееп ϊη БапзТогтей з!ет сеНз геуеа1з Ρ.ΝΑ5ΕΗ2Α, РРАР2С, апй ΑϋΑΡΒΙ аз риЮЬуе апЬсапсегйгид 1агде1з. МокСапсег ТЬег. 8.1 (2009): 249-60.

Ропд, б., е1 а1. АИегей рерййе Идапй уасапаОоп у/НЬ РИЗ Идапй ехрапйей йепйгИю сеНз Тог Ютог |ттипо1Ьегару, Ргос.На11.АсаЙ.5сШ.З.А 98.15 (2001): 8809-14,

Ргазог, й„ е( ак Ез(годеп йоууп-геди1а1к>п оИЬе согергеззог Ν-СоР: тесЬап1зт апй 1тр||саЬопз 1ог езЬодеп йегергеззюп οί Ь1-СоР-геди1а1ей депез. Ргос Ыа11.Асай.5сШ.5.А 102.37 (2005): 13153-57.

Рге«, I. й., е1 а1. Сепега1юп апй апа1у513 οί 5гаЬ2 ти(ап1 тюе. Мо1.Се11 ΒίοΙ. 23.24 (2003): 915061.

Ри, Υ. апй А. 3. бее. С1исо5е геди!а(ей ριυίθΐηε ΐη сапсег ргодгеззЮп, йгид ге5151апсе апй |ттипо1Ьегару. Сапсег ВЫ.ТЬег. 5.7 (2006): 741-44.

Ригде, К. А., е1 ак Зирргеззюп οί Раз-тей1а1ей 1итопдеп1сйу апй те1а51а515 ШгоидЬ ϊηήίΡΗίοη оПЬе Ме1 гесеьЮг 1угоз<пе ктазе. Ргос.МаИ.Асай.ЗсШ.З.А 98.19 (2001): 10722-27.

Ригде, К. Α., Υ. νν. ИЬапд, апй С. Р. Уаггйе Моийе. Ме1 гесерЮг (угозИе к1пазе: епЬапсей згдпаНпд 1ЬгоидЬ айар1ег ρΓΟίθΐηε. Опсодепе 19.49 (2000): 5582-89.

- 35 024497

Сай1П0П1, I.., е( а1. ΑΡορίΐνβ 1ттипо1Ьегару <ог сапсег: ΡιιιΙΡιηρ оп зиссезз. Ма1.Р.еу.1гпгги.1ПО1 6.5 (2006): 383-93.

СЬегагР|, Е. апР М. 51окег. Нера1осу1е дгоуЛЬ Тас(ог-зса11ег 1ас1ог: тЬодеп, то(одеп. апР тек Сапсег СеНз 3.6 (1991): 227-32.

С1еп, А., е( а1. ίΤΡΑΟ-ίθοίΙίΟίθΡ рго(еот1с апа1уз(5 οί йитап ргоз1а1е сапсег сеНз ΐρθηΐΐίίθε рго(еи15 аз50С1а1еР ννίΐίι ргодгезз1оп. ϋ Рго1еоте.Рез 7,3 (2006): 897-907,

Сп|а)1с, 3., е! ак ΝΥ-ΟΘ-58/ΚΙΡ2Ο ί$ оуегехргеззеР ίη а уапе(у οί βοΙϊΡ 1итогз апР 1ПРисез 1гедиеп1 Т се11 гезропзез ίη раЛеп1з ’лгРЬ со1огес(а1 сапсег. ΙηΙ ΰ Сапсег (2009).

Сио, № С., е! а1. Ехргеззюп апР Нз сНпюа! згдшЛсапсе οί Ьеа1 зЬоск рго1ею др96 ίη йитап О51еозагсота. Ыеоо1азта 57.1 (2010): 62-67.

НаЬе1ЬаЬ, Н., е! а1. ЗкгеззчпРисеР Ресгеазе ίη ТРАР2 81аЫ1йу Ϊ5 теР|а1еР Ьу 3|аЬ2. ЕМВО ϋ 21.21 (2002):5756-65.

Натато1о, А., е! ак АЬеггап! ехргеззюп οί 1Ье дазЮс тист М1РС6 ίη Питай ри1топагу аРепосагапота хеподгаПэ. ΙηΙ ΰ Опсо! 26.4 (2005): 891-96.

НагаРа, Т„ е( ак Сепоте-ν/ίΡθ апа1уз1з οί рапсгеаЬс сапсег из1пд тюгоаггау-ЬазеР ТесЬтдиез РапсгеаЮ1оду. 9.1-2 (2009): 13-24.

Нагрег, Ь. X, е1 а1. 51ет се11 райетз ίη се11 Ипез РегтуеР Тгот ЬеаР апР песк здиатоиз се11 сагапота. ΰ Ога! РаШокМаР 36.10 (2007): 594-603.

Науата, 5., е! аI. ΑοΙίνβΙίοη οί СОСА1-КМТС2, тетЬегз οί сепЬотеге ρωίθϊη сотр!ех, ϊηνοΙνθΡ ίη ри!топагу сагаподепез15. Сапсег РезеагсЬ 66.21 (2006): 10339-48.

НауазЬ|, М., е1 а1. ННдИ ехргезз1оп οί НЕРЗ ί5 аззос1а1еР ννίίΐι а РесгеазеР зипта! ίη даз1пс сапсег. СИпка! Сапсег РезеагсЬ 14.23 (2008): 7843-49.

Не1ке, Μ., е! а1 Ехргеззюп οί з1гезз ρΓΟίβίη др96, а 1итог ге)ес1юп апЬдеп, ίη Ьитап со1огейа1 сапсег. Ιηί ϋ Сапсег 86.4 (2000): 489-93.

НоРогоуа, I., е! а1. <3р96 апР ί(5 РНТегеп! ехрге55юп ίη Ьгеаз! сагапотаз Ыеор1азта 55.1 (2008): 31-35.

НоРоп, Р. А., е1 аI. А 5иЬз(га1е ϊογ РеиЬк)иП1паИпд епгутез ЬазеР оп Ьте-гезокеР Лиогезсепсе гезопапсе епегду 1гапз1ег Ье1ууееп (егЬЮт апР уеНоуу Ьиогезсеп! ρΓΟίβίη. Апа1.Вк>сЬет. 360.1 (2007): 138-43.

Ноизе, С. М.. А. МоНег, апР Ο. ϋ. ВоуЛеН. Б|аЬ рго1е1пз: ηονβΙ Ргид 1агде1з ίη 1Ье Раз апР Ьурох1а оа(Ьууауз. Сапсег РезеагсЬ 69.23 (2009): 8835-38.

НоууагР, Е. №/., е! а1. ОесгеазеР аРЬез1уепезз, гез151апсе ίο апо1к15 апР зирргезз1оп οί СРР94 аге 1П1едга1 Ю (Ье зиглта! οί с1гси1аНпд (итог сеНз ίη ргоз1а1е сапсег. СМп Ехр.Ме(аз(аз13 25.5 (2008): 497-508.

Ни, С. апР Е. Р. Ееагоп. 3|аЬ-1 Ы-1егт1па1 ΡΙΝΟ Ротат 15 гедшгеР ίοΓ рго(ео1уз13 ТипсЛоп, апР С-1егт1па1 зециепсез геди1а(е оНдотепгаЛоп апР ЫпР|пд № 1агде1 рго(е1ПЗ. Мо1.Се11 ΒίοΙ. 19.1 (1999): 724-32.

Ниапд, Υ., е( а1. СЬагайепгаЬоп οί СРР56 ρΓΟίβίη апР ίίε зирргеззеР ехргез51оп ίη Ьитап рапсгеаЬс сапсег сеНз. Мо1.СеН ВгосЬет. 308.1-2 (2008): 133-39.

- 36 024497

Лапзеп, Μ. Р, е! ак Ро\упгеди1аПоп οί 3ΙΑΗ2, ап иЫциШп ЕЗ Ндазе, Ϊ3 аззоаа1еР ул1Ь гез1з!апсе (о епРосппе (Пегару ίη Ьгеаз1 сапсег. Вгеаз< Сапсег Рез Тгеа(. 116.2 (2009): 263-71.

Ла, Н. 1_, е! ак Сепе ехргезз1оп ргоЯПпд геуеа!з ро!епЛа1 Ыотагкегз οΐ Питап Пера1осе11и1аг сагс1пота. СПгиса1 Сапсег РезеагсП 13.4 (2007): 1133-39.

Лискег, М, е1 а1. ТПе Ме1/Пера(осу1е дгоуЛП 1ас1ог гесер1ог (НСЕК) депе 13 оуегехргеззеР ϊη зоте сазез οί Питап 1еикепЛа апР1утрПота. ЬеикВез. 18.1 (1994): 7-16.

Липд_Т С., и. А. ЬеРЬеЛег, апР Η. Л. МиНег-ЕЬегПагР. 1пРисЛоп οί су1о1охгсИу ίη гезЛпд Питап Т 1утрПосу1ез Поппе!1о (итог се11з Ьу апЛЬоРу Пе1егосоп)ида(е5. Ргос Ыа(1 АсаВ 5Ы Ц 5 А 84.13 (1987):4611-15.

Липд, Η. М, 5. Л. ΟΠοί, апР Л. К. Кат. Ехрге55юп ргоШе5 οί 3\/40-1ттоРа112а1юп-а55ос1а1еР депез иргеди1а(еР ίη уапоиг Питап сапсеге Л Се11 ВюсПет· 106.4 (2009): 703-13.

Капеко, N.. е! а1. 5|Р1\1А-теР|а1еР кпоскРоу/п ада1пз1 СРСА1 апР КМТС2, Ьо1П ГгециепПу оуегехргеззеР ίη со1огес1а1 апР даз1ис сапсегз, зирргеззез се11 рго1ИегаНоп апР гпРисез аоор(оз13. В1осПет.В|0рПуз.Рез Соттип. 390.4 (2009): 1235-40.

Капд, Η. М., е! а1. Е1Гес1з οί НеЛсоЬас1ег ру1ог! 1п1есНоп оп даз(пс тист ехргеззюп. Л ΟΙίη 6аз1гоеп1его1. 42.1 (2008):29-35.

Ко, М. А, е! а1. Р1к4 Пар1о1пзи1Лс1епсу саизез ткоЛс 1пЛРеЛ1у апР сагс1подепез1з Ма1.Сепе(. 37.8 (2005): 883-88.

КоЬауазМ, М, е1 а1. АсЛуаНоп οΐ ЕгЪВЗ-Р13-к1пазе раШууау ί3 согге1а1еР ννίΐΗ таЛдпаШ рПепо!урез οί аРепосагапотаз. Опсодепе 22.9 (2003): 1294-301.

КоосПекроиг, 3, е1 а1. Ме1 апР Пера1осу1е дго«1П 1ас1ог/зсайег 1ас1ог ехргеззюп ίη Питап дЛотаз. Сапсег Вез. 57.23 (1997): 5391-98.

Κοιζθηίθνι/5Μ, Ν., е1 а1. ΟυΙΙίη 1 ЛтсЛопз аз а сеп(гозота1 зирргеззог οί сеп(по1е ти1ЛрЛсаЛоп Ьу геди1аЯпд ροίο-Нке Мпазе 4 рго1е<п 1еуе1з. Сапсег РезеагсП 69.16 (2009): 6668-75.

Кпед, А. М. ТПегареиЛс ро1епЛа1 οί ТоП-Нке гесер(ог 9 асЛуаЛоп, Ыа1.Реу.Ргид Р|зсоу. 5.6 (2006): 471-84.

Китто1о, К., е! а1. ΊηνοΙνβιηβηΙ οί ЮСАРЗ, а геди1а(ог οί Раз/ЕРК-ге1а1еР сазсаРе, ίη Пера1осу1е ргоЛ1егаЯоп ίη тоизе Луег гедепегаЛоп апР Реуе1ортеп1. Л Се11 РПузю! 220.3 (2009): 621-31.

Кипуата, К, е1 а1. Сатта-(иЬиЛп-соп1а1П1пд аЬпогта! сеп(по1ез аге тРисеР Ьу ίηβυΐΓίοίθηί Р1к4 ίη Ьитап НСТ116 со1огес(а1 сапсег се115. Л Се11 5сг 122.Р112 (2009): 2014-23.

Ьее, Н. 5., е! а1. М1ЛС1, М1ЛС2, МЫС5АС, апР М1ЛС6 ехргеззюпэ ίη да51пс сагапотаэ: (Пек го1ез аз ргодпоэПс 1пР|са1оге Сапсег 92.6 (2001): 1427-34.

ίβινο, I., е( а1. СПагас1епгаЛоп οί депе ехргезз1оп ίη тагог (урез οί заЛуагу д1апР сагапотаз ννίΙΠ ерНПеЛа! РКГегепПаПоп. Сапсег СепеЬСуЮдепе!. 156.2 (2005): 104-13.

1_етте1, С, е! ак Р|ЛегепЯа1 диапЫаПуе апа1уз!з οΐ МНС НдапРз Ьу тазз зресЬотеЛу из1пд з(аЫе 1зо1оре 1аЬеПпд Ыа1.Вю1есПпо1. 22.4 (2004): 450-54.

и, ¢3., е! а1. ТЮуупгеди1аПоп οίΕ-саРПепп апР Резтод1ет 1 Ьу аиЮсппе Пера(осу1е дгоуРП 1ас1ог Риппд те1апота Реуе1ортеп<. Опсодепе 20.56 (2001): 8125-35.

- 37 024497

Шт, 3. О., е( а1. Ехргезз10б οί беа1 зЬоск μιοΙΝηκ (НЗР27, Н5Р60, НЗР70, НЗР90, СРР78, СРР94) ίη бераббз В У1ги5-ге1а1еб бера1осе11и1аг сагс1пота5 апб бузр1азбс поби1е5. УУог1б б ОазбоегПегок 11.14 (2005): 2072-79.

ип, νν., е! ак Тугозте ктазез апс! дазЮс сапсег. Опсоаепе 19.49 (2000): 5680-89.

Ыи, В. апб Ζ. И. Епбор1азт1С гебси!ит НЗР90Ы (др96, дгр94) орМггнгез В-се11 ίιιηοίίοπ У1а сМарегоп1пд нЯедпп апб ТЬР Ьи1 по11Гптипод1оЬиЛп. В1ооб 112.4 (2008): 1223-30.

Ыи, 3. Υ., е1 ак Редикетеп! οί ММР-3 ίη апсбогаде-1пберепбеп1 дгоубб οί ога1 здиатоиз се11 сагапотаз. б Ога! РабюкМеб 36.7 (2007): 430-35.

ЬосМег, А., е1 а1. Тбе 51дшЛсапсе οί таб1х те1а11орго1ета5е5 биппд еабу з1аде5 οί 1итог ргодгевз1оп. Апп М.У.Асаб.Зск 857 (1998): 180-93.

1_ипб, С. V.. е! ак Ζίηο Лпдег капзспрбоп ТасЮгз без1дпеб ίοτ βΐ&ρθοίίίο согеди1а11оп οί ЕгЬВ2 апб ЕгЬВЗ гесерЮгз: 1П51дб13 ίηΐο ЕгЬВ гесерЮг ΟΐοΙοαν. Мо1.Се11 ΒίοΙ. 25.20 (2005): 9082-91.

Ма. 3., е! а1. 1бепбЛсабоп апб сЬагас!ег1габоп οί 1итобдешс Цуег сапсег з(ет/ргодепИог сеНэ. Саз1гоеп[егс1оду 132.7 (2007): 2542-56.

МасЬеоб, Р. б„ М. Науез, апб I. Расбесо. Мп15а зесгебоб збти1а1еб Ьу 1Ье ех(гасе11и1аг са1с1шТ1-зепз1пд гесерЮг ϊη6ϊΡίΐ3 беТесбуе ννηί 31дпаЛпд ίη со1оп сапсег се11з. Ат б РЬузЮ! Оаз1ГО1П1е51.1.1Уег Ρίιν&ίοί 293.1 (2007): С403-0411.

МаспбНап, б. С., е! а1. Сотрагабуе ехргеззюп оПбе тйобс геди1аЮгз ЗАК апб ΡΙ_Κ ίη со1огес(а1 сапсег. Апп Зигд Опсо! 8.9 (2001): 729-40.

Мапеу, Т. е! ак Тбе к1пе(осбоге οί Ыдбег еисагуо!ез: а то1еси1аг νίβ«. Ιηί Ρθν.ΟνΙοΙ. 194 (2000):67-131.

ΜβΠίη, С. М., е1 а1. Сепе ехргезз1оп ргоЛЛпд ίη се™са1 сапсег: 1бепбЛсабсп οί ηονβί тагкегз Тог б15еазе б1адпоз15 апб (бегару. Мебюбз ΜοΙ.ΒϊοΙ. 511 (2009): 333-59.

Ма1зикка, 3., е! а1. Ехргеззюп οί тис1пз (М16С1, М16С2, М11С5АС апб М11С6) ϊη тиапоиз сагапота οί 1бе Ьгеа5(: сотрапзоп ννίίίι 1пуа5|уе бис(а1 сагапота. Нб51ора1бо1оду 42.1 (2003): 26-36.

МаиНк, С., βί а1. Ро1е οί 1бе бераюсу1е дгоубб 1ас1ог гесерЮг, с-Ме1, ίη опсодепез15 апб роюпба! Юг (бегареибс ίηίιίΡίΙίοη. СуЮккю Сгоубб РасЮг Реу. 13.1 (2002): 41-59.

Мгггак. ϋ., М. Впбап, апб М.АЛзоп. СО133: то1еси1е оПбе тотеп!. б Ра1бо1. 214.1 (2008): 3-9. МопЮзапо. Р., е! ак О1бегепба1 ебес!з οί Ьера1осу1е дгоу/16 ГасЮг 1зо1огтз оп ерИЬеЛа! апб епбо1беНа11иЬи1оаепез13. Се11 СютбЬ РИТег. 9.5 (1998): 355-65.

Мопгапк Е., е< ак Ме1апота οοηίβίηβ Οϋ133 апб АВСС2 ροείίίνθ сеИз ννΐΐΐι епбапсеб блпоипдепЮ ро!епба1. Еиг.б Сапсег 43.5 (2007): 935-46.

Мооге, А. апб 1_ Убогбетап. Тбе тесбап15т, Типсбоп апб геди1абоп οί беро1утепгтд к1пез1пз биппд тИ0515. Тгепбз Се11 ΒίοΙ. 14.10 (2004): 537-46.

Могдап, Р. А., е( а1. Сапсег Редгезз1оп ίη РабеШз АЛег ТгапзТег οί СепебсаНу Епд1пеегеб 1_утрбосу1ез. Здепсе (2006).

Μοπ, Μ., βί а1. НЬА депе апб Ьар1о1уре бедиепаез ΐη ί Не N066 Атепсап рорШабоп: (бе Ыабопа! Маггоуу Оопог Ргодгат ϋοηοΓ Κβοί5ίιν. Тгапзр1ап1абоп 64.7 (1997): 1017-27.

- 38 024497

Миггау, С. I., е1 а1. Макх текНоргокказез ап<1 кек 1пЬ|ЬНогз ίη дазкс сапсег. Си! 43.6 (1998):791-97.

МигзЬй, А., Э, Сопд, апЬ 5, К. СаИетооЬ. Неа1-зЬоск рго!е1пз ΐη сапсег уасскез: адеп!з οί апЬдеп сгоьз-огезетаЬоп.'’ Ехрег!.Реу.Уасс1пез. 7.7 (2008): 1019-30.

Ыака|да\уа, Ν., е1 ак 1пасЬуа!юп οί νοη Н|рре1-1_1п<1аи депе ксксес οοηεΐίΐιιΐίνβ рЬо5рЬогу1аЬоп οί МЕТ ρΐΌίθίη ίη с1еаг сеИ гепа! сагапота. Сапсег Кее. 66.7 (2006): 3699-705.

Ыакатига, Υ., е1 а1 СИп1сорако1од1са1 апй Ью1одка1 51дп|Исапсе οί ткоЬс секготегеа$$ог1а1е<.1 к1пе51П оуегехргеззкп ίη Ьитап дазкс сапсег. Вг4 Сапсег 97.4 (2007): 543-49. Ыакауата, К., Α Οί, агн.1 Ζ. Ропак ТЬе ι.ι!>ΐ<μιί(ΐη Идазе 3ΐθΜ2 апс1 ке Мурома гезропзе. МокСапсег Рез 7.4 (2009): 443-51.

ЫакЬпк Ь., е1 ак Нера1осу1е дгоМЬ Тас1ог (Н6Р) зЬти1а1ез 1Ье 1угоз1пе кюазе ас!м1у οί ке гесеркг епсоЬеЬ Ьу 1Ье ргок-опсодепе оМЕТ. Опсодепе 6.4 (1991): 501-04.

Ыдиуеп, О. Ν., е! ак идМ соШгоИаЫе 3ίΡΝΑ3 геди1а1е депе зирргеззкп агк рЬепо(урез ϊη се11з. Вк>сЬкП.В|0рЬуз.Ас!а 1758.3 (2006): 394-403.

ΝϊξΙίϊο, К., е( ак Сгуз1а1 з(гис1иге οί ке йе-иЬ|диН1па11пд епгуте исн37 (Ьитап ЫСН-1-5) са1а1у!ю Ьота1п. ВюсЬет.ВкрЬуз.Рез Соттип. 390.3 (2009): 855-60.

Ыорта, Н., е! ак ЮСАРЗ геди1а1ез сеИ ргоНТегаИоп кгоидЬ ке Раз/ЕРК 31дпаШпд сазсаск. ЫаТСеН ΒίοΙ. 10.8 (2008): 971-78.

Ыотига, Н., е! а1. ЕпЬапсеЬ ргоЬийюп οί такх теОНоргоктазез апЬ асЬуаЬоп οί та(пх те1а11орго!е1пазе 2 (де1аЬпазе Α) ΐη Ьитап дазкс сагскотаз. Ιη! ϋ Сапсег 69.1 (1996): 9-16. Ыотига, Н., е! ак Не1«огк-Ьазес1 апа1у515 οί са1с1ит-Ыпкпд ρΓοίεΐη депез йепОЛеэ Сгр94 аэ а !агде! ΐη Ьитап ога1 сагс1подепез15. ВгМ Сапсег 97.6 (2007): 792-801.

ОЬпита, 3., е1 а1. Сапсег-аззоаакЬ зрИскд уапакз οί (Ме СОСА1 апс! МЗМВ депез ехргеззег! ίη сапсег сеИ Ипез апЬ зигд1саИу гезескЬ дазкс сапсег Ьззиез. Зигаегу 145.1 (2009): 57-68. Рагк, Υ. Н„ ек а1. СаресНакпе ίη сотЬкаЬоп ννϊΐίι ОхаПр1аЬп (Х.ЕЬОХ) аз а ЯгзЫке 1Ьегару Тог айуапсес! дазкс сапсег. Сапсег СЬетокег.РЬагтасо!. (2007).

Разсо1о, 5., е1 ак ТЬе поп-с1а551са1 ΗΙ.Α с1а55 I то1еси1е НЕЕ Ьоез по! 1пЯиепсе ке ΝΚ-Нке аск/Ну сока1пе<1 ΐη кезЬ Ьитап РВМС5 апЬ Ьоеэ по! к1егас! усНЬ ΝΚ се115. 1пк1ттипок 17.2 (2005): 117-22.

Рее1, Ν., е( ак Оуегехргеззкд сеп(по1е-герНса(к>п рго!екз ΐη νίνο пиксез сеп!по!е оуекирНсаЬоп ап<1 Ье ηονο кгтаЬоп. Сигг.Вюк 17.10 (2007): 834-43.

Регека, М. В., е! ак 1ттипокзксЬет1са1 з!ис!у οί ке ехргеззюп οί М11С5АС апй мисв ίη Ьгеаз! сагйпотаз апй аО)асеп! Ьгеаз! Ьззиез. ύ СНп Ракок 54.3 (2001): 210-13.

Р|е!га, С., е! а1. Мэ(игэ1 кН1ег сеИз кН1 Ьитап те!апота сеНз ννίίή сЬагаскпзЬсз οί сапсег 51ет сеНз. к! !ттипок 21.7 (2009): 793-801.

РоИег, ϋ. N.. е! ак РгоЬисЬоп апЬ сЬагакепгаЬоп оТа ро1ус1опа1 апНЬо<1у 1о1Ье с-егЬВ-3 рго!ет: ехагкпаЬоп οί с-егЬВ-3 ρΓοίεΐη ехргеззюп ίη аЬепосагскютаз. ϋ Ракок 168.3 (1992): 275-80. Ропз, Е., С. С. ирЬок апс! Η. С. Огех1ег. Ехргеззюп οί Ьера1осу1е дгоуЛЬ !ас1ог апс! Из гесеркг с-те1 ΐη Ьитап 1еикет1а-1утрЬота сеИ Нпез. Ьеик.Рез. 22.9 (1998): 797-804.

- 39 024497

РопгеТЮ, С., еТ а1. Α ηονβΙ гесодпЖоп то1И Тог рПозрИаМуНпозНо! З-кИазе ЫпсЛпд тесИаЮй Из а550С1аТюп ννϊΤΗ ТНе Нера1осу1е дгоу/ТН ТасТог/зсаНег Тас(ог гесерТог. МокСеН ΒίοΙ. 13.8 (1993): 4600-08.

Рорре, М., еТ а1. РНозрНогу1а1юп οί НеНсоЬасТег ру1оп СадА Ьу с-АЫ 1еас1з То се11 тоТНйу. Опсооепе 26.24 (2007): 3462-72.

РуТе1, Э., еТ а1. Туго51пе к1пазе Ыоскегз: ηβνν Норе Тог зиссе5зТи1 сапсег ТНегару. АпНсапсег АаепТз Меб СНет. 9.1 (2009):66-76.

Οί, Т, еТ ак ТНе иЫдиШп Пдазе 5|аН2 геди1а1ез Титопдепегь апО теТазТаз15 Ьу Н1Р-с1ерепс1еп1 апб -тОерепОепТ раТНууау5. Ргос 1ЧаН.Асас1.5сЩ.5.А 105.43 (2008): 16713-18.

СПап. С. N.. е1 а1. Ме( ρΐΌΐβίη ехргезз1оп 1е\ге1 согге1аТез ν/ΝΗ зип/П/а1 ίη раНепТз ννίΐΗ 1а1е-зТаде пазорНагупдеа! сагснюта Сапсег Вез. 62.2 (2002): 589-96.

О1ап, 2., еТ а1. СуЮдепеНс ап<1 депеНс раТНх1/ауз ϊη (Пегару-ге1а1е<1 аси(е туе1ой 1еикет1а. СНет.ВюЦпТегасТ. (2009).

Раткег, Р„ еТ а1. Оуег-ехргеззюп оТ НераТосу1е дго\лгТН ТасТог/зсаТТег ТасТог (НСР/ЗР) апс! 1Не НСР/ЗР гесерТог (СМЕТ) аге аззойатеб адТН а МдП пзк οί ше1аз1аз!з апб гесиггепсе Тог сПНОгеп апО уоипд айиНз ννϊΙΙι рарМагу (Нугок! сагс1пота. ΟΙίη Епс1осппо1.(ОхТ) 53.5 (2000): 635-44. Раттепзее, Н, С.. еТ а1, 3ΥΡΡΕΙΤΗΙ: ОаТаЬазе Тог МНС НдапОз апб рерНОе тоНТз. 1ттиподепеНсз 50.3-4 (1999): 213-19.

Раттепзее, Н. 6., ΰ ВасНтапп, апй 5. ЗТеуапоую. МНС идапбз апО РерТИе МоТИз. Зрппдег\/ег1ад, Нейе1Ьегд, Сегтапу, 1997.

Карра, С„ О. РоОзТаб, апт) А. Ьопсо. ТНе з1ет се11-аз5ос1ате<1 апНдеп СО133 (ΡΓοηιίηίη-1) ί$ а то1еси1агТНегареиТю ТагдеТ Тог тетазтатк те1апота. ЗТет Се11з 26.12 (2008): 3008-17. РюНагОзоп, С. ϋ., еТ ак СО133, а ηονβΙ тагкег Тог Нитап рго5(аНс ерНПеПа! зТет сеНз. Ц_Се11 5сг. 117.РТ16 (2004): 3539-45.

Ρίηί, В. I., еТ ак СотЫпаТюп 1ттипо1Негару «ИН ргоэТаНс аск1 рН05рНа1азе ри1зес1 апНдепргезепНпд сеНз (ргоуепде) р1из ЬеуаагитаЬ ίη раИепТз ν^ΐΤΗ зего1од1С ргодгезз1он оТ ргозТаТе сапсег аТТег άβίΐηΐΐϊνβ 1оса1 ТНегару. Сапсег 107.1 (2006): 67-74.

РоОпдиез-МагНпз, А., еТ ак Реу|5гинд (Не го1е оТ ТНе то1Пег сеп(по1е ίη сепТпо1е Ыодепез15. Зсгепсе 316.5827 (2007): 1046-50.

РозепЬегд, 5. А., е! а1. А ргодгезз герог! оп 1Не (геаТтеп! οί 157 раПепТз ννίΙΗ айуапсей сапсег и31пд 1утрПок1пе-ас1кга1е<1 кЛ1ег сеНз апО 1ПТег1еик1П-2 ог Н|дН-Розе 1ПТег1еик1П-2 акте. Ν.Εηαυ,Μθό. 316.15 (1987): 889-97.

РозепЬегд, 3. А., е( а1. Ызе οί Титог-1ПИ1(гаТ1пд 1утрПосуТез а по 1ПТег1еик1П-2 ίη ТНе |ттипо1Негару οί раНеп15 \νί(Η теТазТаНс те1апота. А ргеНттагу герогТ. Ы.ЕпдЦ Меб 319.25 (1988): 1676-80.

РоП, Р„ е! а1. МопоиЫдиНу1аИоп οί а1рНа-зупис1е!П Ьу зеуеп ίη аЬзепНа Пото1од (3ΙΑΗ) рготоТез Из аддгедаНоп ίη 0орат1пегдк сеНз. ϋ Вк>1.СПет. 283.6 (2008): 3316-28.

РиТеНа, 3., е1 ак СеНз ννίΙΗ сПагас1епзНсз оТ сапсег зТет/ргодепИог сеНз ехргезз ТНе СЭ133 апНдеп ϊη Нитап епОотеТпа!1итогз. СИтса! Сапсег РеэеагсН 15.13 (2009): 4299-311.

- 40 024497

За1к1, Р. К., е1 а1. Рптег-Рпес1еР епгутаНс атрЬЯсаНоп οί ϋΝΑ ν^ϋΐΊ а 1Ьегтоз1аЫе ϋΝΑ ро1утегазе. Зс1епсе 239.4839 (1988): 487-91.

Батат, С. V. апР Р. \Л/. Зу|уез1ег. датта-Тосо1пепо1 ίηΚίϋίΟ ЕгЬВЗ-РерепРет ΡΙ3Κ/ΑΙΡ тЬодепю 31дпа11|пд ΐη поор1а51Ю таттагу ер№е1!а1 се115. СеП ΡτοΙΐί. 39.6 (2006): 563-74. Зап1Раз, Е. Е., е! а1. Ехргеззюп оНЬе с-егЬВ-3 депе ргоРис! ίη дазЮс сапсег. ΙηΙ ΰ Сапсег 54.6 (1993): 935-40.

Бсой, О. К., е! ак СоогР|па1е зирргеззюп οί ЕРВВ2 апР ЕРВВЗ Ьу епГогсеР ехргеззюп οί тЮгоΚΝΑπηίΡ-125θ ог т1К-125Ь, Э ВЮ1.СЬет. 282.2 (2007): 1479-86.

Зегдта, N. V., е1 а1. Езсаре Ггот НЕРЛатНу 1уг031пе Юпазе ίηΙιίΟΝΟΓ 1Ьегару Ьу 1Ье к1пазе1пасИуе НЕРЗ. ЫаГиге 445.7126 (2007): 437-41.

ЗЬаЬ. М„ е! ак 1пЫЫНоп οί 31аЬ2 иЫдиШп Ндазе Ьу уНат1п КЗ (тепаРюпе) а!1епиа!ез Ьурох1а апР МАРК 31дпаНпд апР Ыоскз те1апота 1итоРдепез15 Р1атеп1 СеП Ме1апота Рез 22.6 (2009): 799-808.

ЗЬарЮо, С, I. СусНп-РерепРеп! к1пазе раНглюуз аз 1агде<з ίοτ сапсег 1геа1теп1. Р СНп Опсо! 24.11 (2006): 1770-83.

5Ьегтап-Ваиз1, С. А., е! ак РетоРеИпд οί 1Ье ех(гасе11и1аг та(пх (ЬгоидЬ оуегехргеззюп οί соНадеп VI соп1пЬи1ез 1о С1зр1арп гез1з1апсе ίη оуапап сапсег сеПз Сапсег СеП 3.4 (2003): 37786.

ЗЬеи, М. 1_., 3. Н. Ыи, апР К. Н. Бап. ΉοηοΜοΙ 1ПРисез са1ра1п-теР|а1еР д1исозе-геди1а1еР ρΓ0ΐβΐη-94 с1еауаде апР арор(оз13 ίη Ьитап даз(пс сапсег се115 апР геРисе5 1итог дгоМЬ. РБоЗ.ОЫЕ. 2.10 (2007): е1096.

ЗМто, А., е1 а1. 1пуо1уетеп1 οί к1пе51п 1атНу тетЬег 2С/тИоЬс сеп1готеге-аззос1а1е0 к1пе51п оуегехргеззюп ίη таттагу сагс1поаепез1з. Сапсег Зег 99.1 (2008): 62-70.

ЗЮдЬ, 3. К., е1 а1. МепЯЯсаЬоп οί а сапсег з1ет сеП ίη Нитап ЬгаЮ 1итогз. Сапсег Рез. 63.18 (2003): 5821-28.

Б1пдЬ, 5. К., е1 а1. ЮепИЛсаЯоп οί Ьитап Ьга1п 1итоиг ίηίΐϊβίϊηρ сеПз. Ыа(иге 432.7015 (2004): 396-401.

БНЬапапРат, С. апР Б. М. АпРегзоп. ТЬе ЕРВВЗ гесер1ог ίη сапсег апР сапсег депе 1Ьегару. Сапсег Оепе ТЬег. 15.7 (2008): 413-48.

ЗКЬапапРат, С., е1 а1. 1пасЯуаИоп οί ЕгЬВЗ Ьу 3ΪΡΝΑ ргото1ез арор1оз1з апР акепиа(ез дгочлЛЬ апР 1пуаз|уепезз οί Ьитап 1ипд аРепосагстота сеП Ппе А549. Опсодепе 24.11 (2005): 1847-59. Бкажгап, В., е! ак Сене ехргеззюп ргоГШпд ίη Ьера1осе11и1аг сагстота: иргедШаЯоп οί депез ίη атрНЯеР сЬготозоте гедюпз. МоР.Ра1Ьо1. 21.5 (2008): 505-16.

51езак, В., е( а1, Ехргозз1оп οί ер|Рогта1 дгоуЛЬ ТасЮг гесерЮг ГатНу ргоЮЮз (ΕΘΡΡ, с-егЬВ-2 апР с-егЬВ-3) ΐη даз1пс сапсег апР сЬгопЮ дазЫЬз. АпИсапсег Рез 18.4А (1998): 2727-32.

Этан, Е. Л. е1 а1. Р1асеЬо-соп1го11еР рЬазе III 1па1 οί 1ттипо1одю 1Ьегару ννιίίι 51ри1еисе1-Т (АРС8015) ίη раЬепГз «ПЬ те1аз1а1Ю, азутрЮтаЬс Ьогтопе гекасЮгу ргоз1а1е сапсег. ΰ СНп Опсок 24.19 (2006): 3089-94.

ЗтЬЬ, Б. М., е1 а1. СО133/ргот1п1п-1 Ϊ5 а ро1епка1 (ЬегареиЯс 1агде( Тог апИЬоРу-Ргид соп)ида1ез ίη ЬераЮсе11и1аг апР даз1пс сапсегз. ВгУ Сапсег 99.1 (2008): 100-09.

- 41 024497

ЗткЬ. Μ. ΰ., θί а1. Апа1у515 οί ОИегепЬа! депе ехргеззюп ίη со1огес(а1 сапсег апб з1гота изтд Яиогезсепсе-асЬуа1ес) сеН зогЬпд рипЯсаЯоп. ВгЛ Сапсег 100.9 (2009): 1452-64.

Зтодоггеуузка, А., е1а1. МепЯЯсаЯоп οί 1Ье ΡΑΝΟΙ рго!е<п, а топоиЫдигипакей ΡΑΝΟΟ2 рага1од годииес! ίΟΓ ϋΝΑ герагг. СеН 129.2 (2007): 269-301.

31аеЫег, Μ., 31βηζΙ, Α., ϋίβίποίι, Ρ. Υ., Εί3βη, Т., НаГегкатр. А., Веек, А, Мауег, А., УУаНег, 3., 31пдЬ-Эазща, Н., апг! 31ίβί, С. А рЬазе I зПк1у 1о еуа1иа!е за(е(у, |ттиподепюНу ап<1 апШитог ас!м!у οί 1Ье ти1Ь-рер1Юе уаейпе ΙΜΑ901 ίη гепа! сеН сагснюта раЯеШз (РСС). ϋοιίΓηβΙ οί СНпюа! Опсо1оду, 2007 АЗСО Аппиа! МееЯпд РгосеесНпдз Рагк I νοί 25, Νο. 183 Пипе 20 Зирр1етеп1), 2007: 5098 . 6-20-2007.

НеГТуре: АЬз1гас(

31еттапп, О., е! а1. Оиа1 ίηΟίΡίίίοη οί 31з1ег сЬготаЯй зерагаЬоп а! те(арЬазе. СеН 107.6 (2001): 715-26.

Зие1зиди, А., е1 а1, СЬагаЫепгаЯоп οί СО133+ Ьера<осеНи1аг сагснюта сеПз аз сапсег 51ет1ргодеп1(огсе11з. В|ОсЬет.ВЮрЬуз.Рез.Соттип. 351.4 (2006): 820-24.

Зиуа, Μ. ί., е1 а1. ЮепЯЯсаЯоп οί Сапсег 31ет СеПз ίη ЕМпд'з Загсота. Сапсег РезеагсЬ (2009).

ЗууэНоуу, С. ύ., βί а1. Зак/Р1к4 апб тИоНеЯ0е1ку. Опсодепе 24.2 (2005): 306-12.

Згсгерапоуузкк М., е1 а1. Реди1аЯоп οί геррвб з1аЬННу Ьу Ьитап 5|аЬ2. В|ОсЬет.ВЮьЬуз.Рез Соттип. 362.2 (2007): 485-90.

Талгпа. Υ., е( а1. Саз1пс апО 1И1езЬпа1 рЬепо1ур1С тагкег ехргезз1ОП ίη еаг1у (ЫГегепНа1е<1-1уре 1итогз οί 1Ье з1отасЬ: сИпюора1Ьо1одю 51дшЯсапсе апй депеЬс Ьаскдгоипск СПпюа1 Сапсег РезеагсЬ 12.21 (2006):6469-79.

Така15Ы, 3., е1 а1.ИепЬЯсаЯоп οί дазМс сапсег з1ет сеПз и31пд 1Ье сеН зиг(асе тагкег СО44. 3<ет СеПз 27.5 (2009): 1006-20.

Такауата, Н., е1 а1. Οίνθίΐθ 1итопдепез13 аззос1а1еО ууНЬ аЬеггаЫ 0еуе1ортеы ίη ггНсе оуегехргеззтд Ьера1осу1е дгоуЛЬ Гайог/зсаЯег ГасЮг. Ргос.№11.Асас1.5сШ.5.А 94.2 (1997): 70106.

ТеоЯН, 1_, е( а1. Ехргеззюп оКИе с-те! рго(о-опсодепе апй Нз Ндапй, Ьера1осу1е дгоуЛЬ Гайог. ίη Нойдк1П сЯзеазе. ΒΙοοά 97.4 (2001): 1063-69.

ТЬогзеп, К., е1 а1. АНетаЯуе зрНсЮд ίη со1оп, ЫасИег, апс1 ргоа(а1е сапсег ЮепЬЯес! Ьу ехоп аггау апа1уз1£. Мо1.Се11 Рго1еот1С5. 7.7 (2008): 1214-24.

ΤίΠηο, V., е1 а1. ТЬе го1е οΐθϋ133 ίη 1Ье ИеьЯПсаЬоь апП сЬагайепзаЬоп οί 1итоиг4п№аЯпд сеПз ίη ηοη-зтаН-сеП1ипд сапсег. Еиг.Ц СагПкЯЬогас.Зига 36.3 (2009): 446-53.

Тобаго, М,, е, а1. Со1оп сапсег з1ет сеПз <Лс(а(е 1итог дгоуЛЬ а па гез151 сеН 0еа1Ь Ьу ргоОисЯоп οί |Шег1еик1П-4. СеН 31ет СеН 1.4 (2007): 389-402.

ΤοροΙ, ί., е! а1. УУп(-5а тМЬНз 1Ье сапопюа! 1Л/п1 ра1Ь\уау Ьу рготоЬпд С5К-34ь<1ереп<1еп1 Ье1аса!еп1п Педга<1а1юп. ϋ СеН ΒίοΙ. 162.5 (2003): 899-908.

ТопЬага, Ν. №, е! а1. Нитап дазШс тист. ЮепЯЯсаЯоп οί а игндие зреаез Ьу ехргеззюп с!оп1пд. ϋ ВЮкСЬет. 268.8 (1993): 5879-85.

- 42 024497

Тзап, Μ. Р. апй В. <3ао. Неа1 зНоск ρτοίθΐη апй ίηηβίβ ΐιηιηυηίίγ. Се11 Мо1.1ттипо1, 1.4 (2004): 274-79.

Тиск, А. В., е! а1. Соехргеззюп οί Ьера1осу1е дгоуЛН 1ас(ог апй гесер!ог (Ме1) ίη Нитап Ьгеаз! сагапота. Ат.й.РаЦю!. 148.1 (1996): 225-32.

УакакОпз, Е., е! а1. АввоиаНоп οί -1171 ριοιηοίοι ροΙγπιοιρίιίΒΐη οί та1пх те1а11орго1е1пазе-3 ννίΙΐΊ 1Псгеазей пзк!огога1 сапсег. АпНсапсег Рев 27.6В (2007): 4095-100.

УапйепЬгоеск, К., Е. Майепз, апй I. АНога. МиИнсНарегопе сотр!ехез геди!а(е Ле (окНпд οί 1п1ег1егоп-датта ίη (Не епйор1азтю геНси1ит. Су1ок1пе 33.5 (2006): 264-73.

1Л/а11ег, 5., е! а1. СиШпд ейде: ргейе1ептйпей амййу οί Нитап СЭ8 Т сеПз ехрапйей оп саНЬга1ей МНС/апН-СО28-соа1ей пгнсгозрИегез. Й.1ттипо1.171.10 (2003): 4974-78.

1Л/апд, О., е1 а1. Оуегехргеззюп οί епйор1азт1С геНси1ит то1еси1аг сНарегопе СР.Р94 апй СКР78 ίη Нитап 1ипд сапсег Нззиез апй Из з1дпгПсапсе. Сапсег Ре1ес1Ргеу. 29.6 (2005): 54451.

1Л/апд, Р., е1 а1. АсНуаНоп οί 1Не Ме! гесер1ог Ьу се11 аИасПтеШ тйисез апй зиз!а1пз Нера1осе11и1агсагс1потаз ίη 1гапздеп1С тке. й.СеН ΒίοΙ. 153.5 (2001): 1023-34.

1Л/апд, Р. О. апй О. С. Рапд. Е1Тес1з οί Не1|СоЬас1ег ργίοπ ίηίβοΐΐοη оп тиск ехргеззюп ίη дазЛс сагапота апй репсапсегоиз йззиез. Й Саз1гоеп1его1.НераЮ1. 21.2 (2006): 425-31.

1Л/апд, 5., е1 ак ЮСАРЗ, а ηονβΙ е(!ес1ог οί Кас1 апй Сйс42, геди1а1ез пеиЛе оЛдгоуДН. й Се11 За. 120.Р1 4 (2007): 567-77.

1Л/апд, X., е! а1. 1ттипо1осаНза1юп οί Ьеа! зНоск ρωΐθϊη 72 апй д1усорго1е1п 96 ίη οοίοηίο айепосагс!пота. Ас1а Н131осИет. 110.2 (2008): 117-23.

1Л/апд, X. Р., е1 а1. Ехргезз1оп апй 31дп№сапсе οί Неа1 зНоск ρΓΟίβίη 70 апй д1исозе-геди1а1ей ргоГек 94 ίη Нитап езорНадеа! сагапота. УУог1й й Саз1гоеп1его1.11.3 (2005): 429-32.

1Л/апд, X. Р., е( а1. Согге1а1юп ЬеКуееп сИтсора1По1оду апй ехргеззюп οί Неа! зНоск ριοίβίη 70 апй д1исозе-геди1а1ей ρΓοΙβίη 94 ίη Нитап οοίοηίο айепосагапота. УУойй й Саз1гоеп1его1. 11.7 (2005): 1056-59.

УУапд, X. Ρ., О. X. УУапд, апй X. Ρ. Утд. Сопге1а11он ЬеНмееп сНп1СораЛо1оду апй ехргеззкп οί Неа1 зНоск ρΓΟίβίη 72 апй д1усорго(ек 96 ίη Нитап дазЛс айепосагапота. ТоЬоки й Ехр.Мей 212.1 (2007): 35-41.

УУе1пзсЬепк, Т., е! а1. 1п1едга1ей Лпсйопа! депотюз арргоасН Гог 1Не йез|дп οί раНепМпймйиа! апШитог уасапез. Сапсег Кез. 62.20 (2002): 5818-27.

ΥΛ/ΙιίΙθ, С. β., Μ. ϋ. Вгоууп, апй О. В. Заскз. ЮСАРз ίη сапсег: а ГагиНу οί зсаЛо1й рго(е1П5 ипйейу1пд Лтопаепез1з. РЕВ5 Ьеи. 583.12 (2009): 1817-24.

УМскз, 3. й., е! а1. Реуегз|Ые иЫдиШпаНоп геди1а!ез 1Ье Зтай/ТСР-Ье1а 31дпаШпд раНмау. ВюсНет.Зос Тгапз. 34.Р15 (2006): 761-63.

УУккз, 5. Й„ е1 а1. ТНе йеиЫдшйпаНпд епгуте 1ЙСН37 |Шегас1з ννϊίΗ Зтайз апй геди1а1ез ТСРЬе1а 3ίαпаН|пдОпсоаепе 24.54 (2005): 8080-84.

Уэрта, 5., е1 а1. Ехргезз1оп ргоЦМпд οί Геса1 со1опосу1ез Лг ΚΝΑ-Ьазей зсгеепкд οί со1огес1а1 сапсег. ΙηΙ й Опсо! 31.5 (2007): 1029-37.

- 43 024497

Уапд, 1.., βί а1. ΊΙ_-21 апй ТСР-Ье1а аге гедипей ГогйОТегепНаРоп οί Нитап Т(Н)17 сеИз Ма1ше (2008).

Уапд, 3., е( а1. Мо1еси1аг Ьаз13 οί 1Пе «Жегепсез ЬеЪлюеп погта! апй1итог Иззиез οί даз(пс сапсег. ВЮсЫт.ВЮрИуз.АсЮ 1772.9 (2007): 1033-40.

Уао, Ρ. Р., е1 а1. АЬпогта! ехргеззюп οί Н5Р др96 аззоааЮй ννϋΐΊ ΗΒν герПсаНоп ίη Нитап НераЮсеНи 1аг сагстота. НераЮЬШагу.Рапсгеа1.Р15.1п1 5.3 (2006): 381-86.

Уазш, \Л/„ е1 а1. 1псгеазей ехргеззюп οί р34сйс2 апй кз ктазе асНуку ίη Питай даз(гЮ апй со1опЮ сагсЮотаз. Ιηί Й Сапсег 53.1 (1993): 36-41.

Уее, С., е1 а1. ΑύορΙίνβ Т сеН (Негару изЮд апНдеп-зресМс СР8+ Т сеН сЮпез ЮПНе 1геа1теп1 οί раПеп1з мкН те(аз1аНс теЮпота: ίη νίνο регз1з1епсе, гтдгаНоп, апй агккитог е(Тес( οί 1гапзГеггес1 ТсеНз Ргос.Ыа11.Асай.6С1.и.5.А 99.25 (2002): 16168-73.

Υίη, 3., е1 а1. СР133 розШуе Нера1осе11и1аг сагапота се11з роззезз НгдН сараску Юг ЮтопоепЮку. 1п(.Й Сапсег 120.7 (2007): 1444-50.

Уокогакг Η., νν. Уазш, апй Е. ТаНага. СепеРс апй ер|депе(Ю сПапдез ίη зЮтасН сапсег. Ιηί РеУ.СуТО!. 204 (2001): 49-95.

Уиап, νν., е1 а1. Ехргеззюп οί ЕрНА2 апй Е-сайНепп ίη даз(гЮ сапсег: согге1а1ей ννίίΗ (итог ргодгеззЮп апй |утрНодепоиз те(аз1аз13 Ра1Но!.Опсо1 Рез 15.3 (2009): 473-78.

Уиап, \Л/. Й., е( а1. Оуег-ехргеззЮп οί ЕрНА2 апй ЕрНппА-1 ίη Нитап даз1пс айепосагсЮота апй кз ргодпозйс уа1ие Юг розЮрегаРуе иаНепЮ. Ρίο.Ρί3.5οί. 54.11 (2009): 2410-17.

ИагетЬа, 3., е1 а1. 1йепРЯсаРоп οί ап епНапсег адоп131 суЮЮхю Т 1утрНосу1е рерНйе (гот Нитап сагапоетЬгуопю апРдеп. Сапсег Рез. 57.20 (1997): 4570-77.

гНапд, X., К. М. К.ей1, апй Й. Х1апд. СР40 НдаРоп сопуейз ТСР-ЬеЮ-зесгеРпд Ю1егодепЮ СР48- йепйгШс се11з ίηΐο 1Ь-12-зесге(1пд кптиподепю опез. ВЮсНет.ВЮрНу5.Рез Соттип. 379.4 (2009): 954-58.

ИНапд, X. ί„ е1 а1. СотрагаРуе з(ийу оп оуегехргеззЮп οί НЕР2/пеи апй НЕРЗ ίη дазЮс сапсег. УУогИ Й Зигд 33.10 (2009): 2112-18.

ΖΗβο, С., е! а1. НейдеНод 31дпа1кпд ί3 еззепРа! Юг ташЮпапсе οί сапсег з!ет се11з ίη туеЮИ 1еикает1а. ЫаЮге (2009).

ИНепд, Н„ е1 а1. Сек зийасе ЮгдеРпд οί Неа, зНоск ρΓΟίβίη др96 Юйисез йепйпРс сеН таШгаИоп апй апШитог йптипку. Й 1ттипо1.167.12 (2001): 6731-35.

гНепд, Н., е( ак МиСб йошп-гедиЮРоп согге1а!ез ννίΙΗ даз!пс сагстота ргодгеззЮп апО а роог ргодпоз1з: ап 1ттипоП|£1осПетЮа1 з1и0у мкН Рззие тЮгоаггауз. Й Сапсег Рез С1|п Опсо! 132.12(2006):817-23.

ИНепд, Н. С., е1 а1. ОуегехргеззЮп οί СРР78 апй СРР94 аге тагкегз Юг аддгезз1уе ЬеНауЮг апй роогргодпо513 ίη даз1пс сагсЮотаз Нит.Ра1Но1. 39.7 (2008): 1042-49.

гнои. О., е! а1. 2Р 0кТегепРа! ίη-де! е1ес(горНоге513 Юг 1Не НепРПсаРоп οί езорНадеа! зсапз сеН сапсег-зресИЮ рго1еЮ тагкегз. Мо1.Се11 РгоЮотюз. 1.2 (2002): 117-24.

гнои, Ь., е! а1. ТСЕ-Ьекыпйисей РохрЗ ίηΗίΡίΙβ Т(Н)17 сек йШегепРаРоп Ьу аШадошапд

РОРдатта! (ипсРоп. №(иге 453.7192 (2008): 236-40.

гни, К. Й„ е( а1. 1пРдштой ίηΗίΡί(3 (Не йШегепРаРоп Ьи1 епНапсез (Не таЮгаРоп οί Нитап топосуЮ-Репуей ЙепйпРс се11з. Ιηί 1ттипорНагтасо1. 9.4 (2009): 412-17.

- 44 024497

Список последовательностей <110> хттаЫсз ЫоЬесЬпо1одхез СтЬН <120> Новые способы иммунотерапии нескольких видов опухолей, в том числе рака желудочно-кишечного тракта и рака желудка <130> 131890РСТ <150> СВ1004551.6 <151> 2010-03-19 <150> 03 61/315,704 <151> 2010-03-19 <160> 95 <170> РаЬепЫп νθΓ3χοη 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> РРТ <213> Ното зархепз <400> 1

Ьеи Туг С1п 11е Ьеи С1п 61у 11е Уа1 РЬе

10 <210> 2 <211> 9 <212> РРТ <213> Ното зархепз <400> 2

Зег Туг Азп Рго Ьеи Тгр Ьеи Агд 11е 1 5 <210> 3 <211> 9

- 45 024497 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 3

Азп Туг Ьеи Рго РЬе	11е	МеЬ	С1и	Ьеи
1	5
<210>	4
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	4
Зег Туг	11е	Азр Уа1	Ьеи	Рго	СЬи	РЬе
1		5
<210>	5
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЬепз
<4 00>	5
Зег Туг Не	11е Азр	Рго	Ьеи	Азп	Ьеи
1		5
<210>	б
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	б
Уа1 Тгр Зег	Азр Уа1	ТЬг	Рго	Ьеи	ТЬг РЬе

10 <210> 7

- 46 024497 <211> 9 <212> РРТ <213> Ното зархепз <400> Ί

Азп Туг Ьеи Ьеи Туг Уа1	Зег	Азп	РЬе
1	5
<210>	8
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<400>	8
Уа1 Туг	ТЬг ТЬг Зег Туг	С1п	С1п	11е
1	5
<210>	9
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<400>	9
Нхз Туг Ьуз Рго ТЬг Рго	Ьеи	Туг	РЬе
1	5
<210>	10
<211>	10
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<400>	10
Туг Туг Азп А1а А1а С1у	РЬе	Азп	Ьуз Ьеи

10

- 47 024497

<210>	11
<211>	9
<212>	ΡΚΤ
<213>	Ното
<400>	11

А1а Туг Ьеи Уа1 Туг ТЬг Азр Агд Ьеи
1	5
<210>	12
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зархепз
<400>	12
РЬе Туг	' 11е Зег Рго Уа1 Азп Ьуз Ьеи
1	5
<210>	13
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зар!епз
<400>	13
Уа1 Туг С1у Не Агд Ьеи С1и НЬз РЬе
1	5

<210>	14
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зариепз
<400>	14
ТЬг Туг С1у Азп Ьеи Ьеи Азр Туг Ьеи
1	5

- 48 024497

<210>	15
<211>	9
<212>	ΡΚΤ
<213>	Ното
<400>	15

Азп Туг С1и С1и ТЬг	РЬе	Рго	Нгз	11е
1	5
<210>	16
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЪепз
<400>	16
Агд Туг	Ъеи	Тгр А1а	ТЬг	Уа1	ТЬг	11е
1		5
<210>	17
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зартепз
<400>	17
Уа1 Туг РЬе	Зег Ъуз	Зег	С1и	С1п	Ъеи
1		5
<210>	18
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЪепз
<400>	18
Уа1 РЬе 11е	РЬе Ъуз	С1у	Азп	С1п	РЬе

5

- 49 024497

<210> <211> <212> <213> <400> Агд РЬе 1	19
9	11е	Азп	РЬе
РРТ Ното 19 ; Ьеи	заргепз
Зег С1у 5	11е
<210>	20
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	20
Οίη Туг А1а	Зег Агд	РЬе	Уа1	С1п	Ьеи
1		5
<210>	21
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	21
Ьуз Туг Ьеи	ТЬг Уа1	Ьуз	Азр	Туг	Ьеи
1		5
<210>	22
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	22
Уа1 Туг Азп	Рго ТЬг	Рго	Азп	Зег	Ьеи

- 50 024497 <210> 23 <2Ы> 9 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 23

Зег Туг Ьеи СЬп А1а АЬа	Азп	АЬа	Ьеи
1	5
<210>	24
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зарЬепз
<4 00>	24
РЬе Туг С1п Рго Ьуз Ые	СЬп	СЬп	РЬе
1	5
<210>	25
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното зарЬепз
<400>	25
Туг Туг Ьуз Азп 11е СЬу	Ьеи	СЬу	РЬе

5 <210> 26 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 26

- 51 024497

А1а Туг А1а 11е 11е	Ъуз	С1и	С1и	Ъеи
1	5
<210>	27
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	27
Ъеи Туг Рго С1и Уа1	РЬе	С1и	Ъуз	РЬе
1	5
<210>	28
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<4 00>	28
Ъуз Туг Азп Азр ТЬг	РЬе	Тгр	Ъуз	С1и РЬе
1	5				10
<210>	29
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	29
УаЪ РЬе Азр ТЬг А1а	11е	А1а	Нгз	Ъеи РЬе
1	5				10
<210>	30
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз

<400> 30

- 52 024497

УаЬ Туг Рго Азп Тгр АЬа 11е СЬу Ьеи Ь 5 <2Ь0> ЗЬ <2ЬЬ> 9 <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> ЗЬ

УаЬ Туг Ьуз УаЬ УаЬ СЬу Азп Ьеи Ьеи Ь 5 <2Ь0> 32 <2ЬЬ> 9 <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> 32

УаЬ Туг ЬЬе СЬи Ьуз Азп Азр Ьуз Ьеи Ь 5 <2Ь0> 33 <2ЬЬ> ЬО <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> 33

Ые Туг Азп СЬу Ьуз Ьеи РЬе Азр Ьеи Ьеи Ь 5 ЬО <2Ь0> 34 <2ЬЬ> 9 <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> 34

- 53 024497

С1п Туг Не Азр Ьуз Ьеи	Азп 61и Ьеи
1	5
<210>	35
<211>	11
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<400>	35
МеЬ Туг МеЬ ТЬг Уа1 Зег	11е 11е Азр Агд РЬе
1	5	10

<210>	36
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<4 00>	36
Агд Туг Ьеи Рго С1п Суз Зег Туг РЬе
1	5

<210>	37
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<4 00>	37
11е Туг А1а Рго Ьуз Ьеи С1п С1и РЬе
1	5

<210>	38
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното

- 54 024497 <400> 38

11е Туг Рго Азр А1а Зег Ьеи Ьеи	11е
1	5
<210> 39 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното	заргепз
<400> 39
Уа1 Туг Ьеи 1	Ьеи Азп 5	Зег	ТЬг	ТЬг	Ьеи

<210>	40
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	40
11е Туг Ьеи С1и Уа1 11е Нгз Азп Ьеи
1	5

<210>	41
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	41
АЬа Туг Рго ТЬг Уа1 Ьуз РЬе Туг РЬе
1	5

<210>

<211>

<212>

<213>

РКТ

Ното заргепз

- 55 024497 <400> 42

11е РЬе Зег Ьуз 11е УаЬ	Зег	Ьеи	РЬе
1	5
<210>	43
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЬепз
<4 00>	43
Туг Туг	Туг	УаЬ СЬу	РЬе	АЬа	Туг	Ьеи
1		5

<2Ь0>	44
<2ЬЬ>	9
<2Ь2>	РКТ
<2ЬЗ>	Ното зарЬепз
<4 00>	44
Агд Туг Ьеи СЬи СЬу ТЬг Зег Суз ЬЬе
Ь	5

<2Ь0>	45
<2ЬЬ>	ЬЬ
<2Ь2>	РКТ
<2ЬЗ>	Ното	зарЬепз
<400>	45
ТЬг Туг Ьеи	Рго ТЬг Азп АЬа	Зег Ьеи Зег РЬе
Ь		5	ЬО

<210> 46 <211> 9 <212> РКТ

- 56 024497 <213> Ното зархепз <400> 46

Зег Туг А1а ТЬг Ьеи Ьеи Нхз Уа1	Ьеи
1	5
<210>	47
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<4 00>	47
Азр Туг ТЬг	11е С1у	РЬе	С1у	Ьуз	РЬе
1		5
<210>	48
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	48
Зег Туг Азп	Уа1 ТЬг	Зег	Уа1	Ьеи	РЬе
1		5
<210>	49
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<4 00>	49
Зег Туг Ьеи	С1и Ьеи	Уа1	Ьуз	Зег	Ьеи

5 <210> 50 <211> 9

- 57 024497 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 50

Зег Туг СЬп Ьуз Уа1	11е	СЬи	Ьеи	РЬе
1	5
<210>	51
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	51
Ьеи Тух	• Ьеи С1и Азп	11е	Азр	СЬи	РЬе
1	5
<210>	52
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	52
Уа1 Туг 11е Зег Зег	Ьеи	А1а	Ьеи	Ьеи
1	5
<210>	53
<211>	11
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	53
Агд Туг Ьеи Рго Ьуз	СЬу	РЬе	Ьеи	Азп СЬп РЬе

10 <210> 54

- 58 024497

<2ЬЬ>	9
<2Ь2>	РКТ
<2ЬЗ>	Ното
<400>	54

Туг Туг Ьуз Азп Ые СЬу Ьеи СЬу РЬе Ь 5 <2Ь0> 55 <2ЬЬ> 9 <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> 55

УаЬ Туг ТЬг ТЬг МеЬ АЬа СЬи НЬз РЬе Ь 5 <2Ь0> 56 <2ЬЬ> 9 <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> 56

Азр Туг АЬа Туг Ьеи Агд СЬи НЬз РЬе Ь 5 <2Ь0> 57 <2ЬЬ> ЬО <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> 57

Ьеи Туг ЬЬе СЬп ТЬг Азр НЬз Ьеи РЬе РЬе Ь 5 ЬО

- 59 024497

<210> 59 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 59

Туг РЬе ЬЬе Зег НЬз УаЬ Ьеи АЬа РЬе Ь 5 <2Ь0> 60 <2ЬЬ> 9 <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> 60

УаЬ Туг ТЬг Ьуз УаЬ Зег АЬа Туг Ьеи Ь 5 <2Ь0> 6Ь <2ЬЬ> 9 <2Ь2> РКТ <2ЬЗ> Ното зарЬепз <400> 6Ь

УаЬ Туг Ьуз СЬи ТЬг Суз ЬЬе Зег РЬе Ь 5

- 60 024497

<210>	62
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното
<400>	62

А1а Ьеи Туг Азр Зег	Уа1	11е Ьеи Ьеи
1	5
<210>	63
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<4 00>	63
Ьуз 11е	! С1п	С1и Не	Ьеи	ТЬг	С1п	Уа1
1		5
<210>	64
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<4 00>	64
Ьеи А1а Азр	С1и ТЬг	Ьеи	Ьеи	Ьуз	Уа1
1		5
<210>	65
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	65
А1а МеЬ Зег	Зег Ьуз	РЬе	РЬе	Ьеи	Уа1

5

- 61 024497

<210>	66
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	66

Туг Уа1 Туг С1п Азп Азп Не Туг Ьеи 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 67

Уа1 Ьеи С1и Азр Ьеи С1и Уа1 ТЬг Уа1 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 68

РЬе Ьеи Ьеи Азр С1у Зег А1а Азп Уа1 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 69

Азп Ьеи Ьеи Азр Ьеи Азр Туг 61и Ьеи <210> 70 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 70

РЬе Ьеи Не Азр Зег Зег СЬи СЬу УаЬ 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 71

АЬа Ьеи Азр СЬи СЬу Азр 11е А1а Ьеи 1 5 <210> 72 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 72

А1а Ьеи Азп С1и С1и А1а С1у Агд Ьеи Ьеи Ьеи 15 10 <210> 73 <211> 9 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 73

- 63 024497

Ые Ьеи Зег Рго ТЬг УаЬ	УаЬ	Зег	ЬЬе
Ь	5
<2Ь0>	74
<2ЬЬ>	9
<2Ь2>	РКТ
<2ЬЗ>	Ното	зарЬепз
<400>	74
Ьуз Ьеи	. Ьеи	ТЬг СЬи	УаЬ	НЬз	АЬа	АЬа
Ь		5

<2Ь0>	75
<2ЬЬ>	9
<2Ь2>	РКТ
<2ЬЗ>	Ното	зарЬепз
<400>	75
АЬа Ьеи УаЬ	СЬп Азр Ьеи АЬа Ьуз АЬа
Ь		5

<2Ь0>	76
<2ЬЬ>	9
<2Ь2>	РКТ
<2ЬЗ>	Ното зарЬепз
<400>	76
ЬЬе Ьеи СЬп Азр Агд Ьеи Азп СЬп УаЬ
Ь	5

<2Ь0>	77
<2ЬЬ>	9
<2Ь2>	РКТ
<2ЬЗ>	Ното

<400> 77

ТЬг Ьеи Азр Рго Агд Зег РЬе Ьеи Ьеи
1	5
<210>	78
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<400>	78
ТЬг Ьеи Азр Азр Ьеи Ьеи Ьеи Туг 11е
1	5

<210>	79
<211>	11
<212>	РКТ
<213>	Ното	заргепз
<4 00>	79
Зег Ьеи Ьеи	АЬа С1п Азп ТЬг	Зег Тгр Ьеи Ьеи
1		5	10

<210>	80
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното заргепз
<4 00>	80
Зег Ьеи А1а С1и Уа1 Азп ТЬг СЬп Ьеи
1	5

<210>	81
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното з

- 65 024497 <400> 81

АЬа Ьеи Азр СЬу РЬе	УаЬ	Меб УаЬ	Ьеи
1	5
<210>	82
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	82
СЬу УаЬ	. Азр	Азр АЬа	РЬе	Туг	ТЬг	Ьеи
1		5
<210>	83
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	83
Туг УаЬ	. Азр	Рго УаЬ	Не	ТЬг	Зег	Не
1		5
<210>	84
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	84
Туг Ьеи Ьеи	Зег Туг	Не	СЬп	Зег	Не
1		5

<210>	85
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното

- 66 024497 <400> 85

С1п 11е Азр Азр Уа1 ТЬг	11е	Ьуз	Не
1	5
<210>	86
<211>	10
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<400>	86
Туг Ьеи	ι Туг С1у С1п ТЬг	ТЬг	ТЬг	Туг Ьеи
1	5			10
<210>	87
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<4 00>	87
Ьуз Ьеи Азр С1и ТЬг С1у	Азп	Зег	Ьеи
1	5
<210>	88
<211>	9
<212>	РРТ
<213>	Ното зархепз
<400>	88
Агд Ьеи Азр Азр Ьеи Ьуз	МеЬ	ТЬг	Уа1
1	5

<210> 89 <211> 9 <212> РРТ

- 67 024497 <213> Ното зархепз <400> 89

Ьеи ТЪг Азр С1и 11е	Ьеи	ТЪг Туг	Уа1
1	5
<210>	90
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	90
11е Ьеи 11е	Азр Тгр	Ьеи	Уа1	С1п	Уа1
1		5
<210>	91
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	91
Уа1 Ьеи Туг	С1у Рго	Азр	Уа1	Рго	ТЪг	11е
1		5					10
<210>	92
<211>	11
<212>	РКТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	92
Зег 11е РНе	61у С1и	Азр	А1а	Ьеи	А1а	Азп Уа1

10 <210> 93 <211> 9

- 68 024497 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 93

Ьуз Ьеи 1	Ьеи	СЬи Туг 5	ЬЬе	СЬи	СЬи	ЬЬе
<210>	94
<211>	9
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарЬепз
<4 00>	94
Ьуз ЬЬе	! Ьеи	СЬи Азр	УаЬ	УаЬ	СЬу	УаЬ
1		5

<2Ь0>	95
<2ЬЬ>	ЬО
<2Ь2>	РКТ
<2ЬЗ>	Ното зарЬепз
<4 00>	95
Ьуз ЬЬе РЬе Азр СЬи ЬЬе Ьеи УаЬ Азп
Ь	5

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Пептид, связывающийся с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I класса, обладающий общей длиной от 10 до 14 аминокислот, содержащий последовательность, которая выбирается из группы, включающей:

(a) последовательность 8Ε^ ГО N0: 1;

(b) вариант 8Ε^ ГО N0: 1, выбранный из группы последовательностей ^Ρ^I^^ΟIVΡ, ^γ^I^^ΟIV^, ьургьрсгуг, ^ρ^I^^ΟIV^ и ьрргорсгуг

2. Пептид по п.1, включающий непептидные связи.

3. Пептид по любому из пп.1, 2, который является частью слитого белка, в частности, включающего Ν-терминальные аминокислоты НЕАГОК антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Ιί).

4. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1, 2.

5. Нуклеиновая кислота по п.4, которая является ДНК, кДНК, ПНК, РНК или их комбинацией.

6. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по любому из пп.4, 5.

7. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по любому из пп.4, 5 или вектор экспрессии по п.6, являющаяся антигенпрезентирующей клеткой.

8. Способ получения пептида по любому из пп.1, 2, включающий культивирование клетки-хозяина по п.7 и выделение пептида из клетки-хозяина или из культуральной среды.

9. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ΐη уйго, включающий обеспечение контактирования ЦТЛ ΐη уйго с нагруженными антигеном молекулами МНС I класса человека, экспрессированными на поверхности антигенпрезентирующей клетки по п.7 в течение периода времени, достаточного для активации указанных ЦТЛ антигенспецифическим образом, где указанный антиген является пептидом по любому из пп.1, 2.

10. Способ по п.9, где антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии, экспрессирующий указанный пептид по любому из пп.1, 2.

11. Активированный цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ), полученный с помощью способа по любому из пп.9, 10, который селективно распознает пептид по любому из пп.1, 2.

12. Применение цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ) по п.11 для лечения рака путем уничтожения клеток-мишеней у пациента, где клетки-мишени аберрантно презентируют пептид по любому из пп.1, 2.

13. Применение пептида по любому из пп.1, 2 для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

14. Применение по п.13, где указанный пептид включен в состав вакцины.

- 69 024497

15. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп.4, 5 для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

16. Применение вектора экспрессии по п.6 для лечения рака, такого как рак желудка, желудочнокишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

17. Применение клетки по п.7 для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

18. Применение цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ) по п.11 для лечения рака, такого как рак желудка, желудочно-кишечного тракта, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, легких или почек.

19. Применение пептида по любому из пп.1, 2 для получения антител, специфических к комплексу МНС/пептид, включающему указанный пептид.