KR101644599B1 - 미토콘드리아 단백질 uqcrb 관련 질환 유전자발현 세포 구축 및 이를 활용한 uqcrb 기능조절 활성평가계 구축 - Google Patents

Abstract

본 발명은 UQCRB (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB 변이 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 신규한 미토콘드리아 UQCRB 변이 세포주를 사용한 UQCRB 활성 평가의 새로운 연구방법으로서, 항암 활성 평가방법, 혈관신생 억제활성 평가방법 및 UQCRB 활성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 세포주는 세포 증식 및 혈관신생 유도 활성을 가진 신규한 세포주로서, UQCRB 활성 억제 기전을 통한 혈관신생 억제물질 또는 항암 물질의 스크리닝 방법을 제공하여, 혈관 신생 또는 미토콘드리아-매개성 질환 및 각종 암에서의 치료제 개발에 적용될 수 있다.

Description

미토콘드리아 단백질 UQCRB 관련 질환 유전자발현 세포 구축 및 이를 활용한 UQCRB 기능조절 활성평가계 구축 {Construction of mitochondrial UQCRB mutant expressing cells and utilization of the cells for UQCRB assay system thereof}

본 발명은 미토콘드리아 단백질 UQCRB 관련 질환 유전자발현 세포 구축 및 이를 활용한 UQCRB 기능조절 활성평가계 구축에 관한 것이다.

미토콘드리아의 전자수송체인(electron transport chain, ETC)은 5개의 복합체로 구성되며, ATP 합성에 의한 에너지 생산에 있어 중요한 역할을 한다[1]. 대사질환 및 암과 같은 질병에서의 다양한 미토콘드리아 단백질의 역할과 관련하여 많은 연구가 있었다[1,2,3,4]. 그러나 복합체 Ⅲ 및 혈관신생의 연관성에 관한 정보는 제한되어 있다.

유비퀴놀-시토크롬 c 환원효소 결합 단백질 (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein, UQCRB)은, 복합체 Ⅲ의 핵-코딩 13.4-kDa 서브유닛으로서, 전자 수송 및 복합체 Ⅲ의 유지와 관련된 기능을 하는 것으로 나타났다[5]. 최근, 천연 항-혈관신생 억제제 테르페스타신(terpestacin)의 타겟으로서 동정됨으로써, 혈관신생에 있어 UQCRB의 잠재적인 역할이 밝혀졌다[6]. UQCRB은 저산소 반응을 조절하는 산소-센싱(sensing) 메카니즘을 조절함으로써 미토콘드리아 활성 산소종(mROS)- 및 HIF (hypoxia-inducible factor)-매개 혈관신생에 관여한다. 또한, UQCRB은 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2)-시그널링-유도성 혈관신생을 조절한다[7]. 최근 연구에서는 간세포 암종[8], 난소암[9], 췌장 관세포암[10], 및 대장암[11]을 포함한 다양한 암에서 UQCRB의 유전적 다양성이 나타나는 것으로 밝혀졌다. 이러한 질병을 유발하는 UQCRB의 가능성은 혈관 신생 및 다른 미토콘드리아-매개성 질환에서 중요한 것으로 나타났다.

UQCRB 유전자의 유전적 결함에 대한 최근 연구에서, UQCRB 및 분리된 복합체 Ⅲ 결함을 가진 터키 여아는 유아기(babyhood)의 대사적 고비가 있는 동안 저혈당증(hypoglycemia) 및 젖산혈증(lactic acidosis)을 나타내었으나, 아동기(childhood) 동안은 정상적인 성장을 나타내었다[12]. 이러한 결과에 근거하여, 본 발명자들은 UQCRB 돌연변이 세포주인 MT1 및 MT2를 구축하여 혈관신생에 있어 이들의 생물학적 기능을 연구하였다. 특히, MT1 및 MT2는 미토콘드리아의 구조적 이상과 함께 성장 및 pro-혈관형성 활성이 현저히 증가되었다. 한편, UQCRB 돌연변이의 세포 증식은 UQCRB 억제제인 테르페스타신 및 A1938의 처리에 의해 현저히 감소되었다.

요약하면, 본 발명에서의 이러한 결과들은 UQCRB 및 이의 돌연변이는 혈관신생에서 중요한 역할을 하고, UQCRB 돌연변이 세포주는 인간 세포에서 UQCRB의 기능을 연구하는데 있어 유용한 도구가 될 것임을 시사한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 혈관 신생 및 세포 증식성 질환에서의 UQCRB 및 이의 돌연변이의 역할을 연구하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, UQCRB 돌연변이 세포주를 새로이 구축하고, 본 UQCRB 돌연변이 세포주가 신생혈관 생성 및 세포 증식 증가 활성이 나타남을 확인하였다. 또한 UQCRB 저해제 처리에 의해 그 증가 활성이 억제됨을 확인함으로써, 본 UQCRB 돌연변이 세포주를 새로운 UQCRB 활성 평가 세포주로 새로이 제공한다.

따라서 본 발명의 목적은 미토콘드리아 UQCRB 변이 세포주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 UQCRB 변이 세포주를 이용한 항암 활성 평가방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 UQCRB 변이 세포주를 이용한 혈관신생 억제활성 평가방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 UQCRB 활성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) 변이 동물세포주를 제공한다.

본 발명자들은 혈관 신생 및 세포 증식성 질환에서의 UQCRB 및 이의 돌연변이의 역할을 연구하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, UQCRB 돌연변이 세포주를 새로이 구축하고, 본 UQCRB 돌연변이 세포주에서 신생혈관 생성 및 세포 증식 증가 활성이 나타남을 확인하였다. 또한 UQCRB 저해제 처리에 의해 그 증가 활성이 억제됨을 확인함으로써, 본 UQCRB 돌연변이 세포주를 새로운 UQCRB 활성 평가 세포주로 새로이 제공한다.

유비퀴놀-시토크롬 c 환원효소 결합 단백질(UQCRB)은 미토콘드리아 복합체 Ⅲ의 서브유닛 중 하나이며, 천연 혈관신생 소분자 테르페스타신의 표적 단백질이다. 이전 연구에서 UQCRB의 생물학적 역할은 복합체 Ⅲ을 유지하는 것에 한정되어 생각되어 왔다. 그러나, UQCRB가 테르페스타신의 타겟 단백질로서 동정 및 검증됨으로써 UQCRB의 산소 감지(sensing) 및 혈관신생에서의 기능이 설명되었다. 이 단백질의 기능을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 UQCRB 돌연변이 안정화 세포주를 구축하였으며, 이러한 세포주가 미토콘드리아 활성 산소종(mROS)-매개 HIF1 시그널 전달을 통하여 pro-혈관신생 활성을 나타냄을 밝혔다. 또한, 상기 UQCRB 돌연변이 세포주에서 미토콘드리아의 형태학적 이상이 관찰되었으며, UQCRB 돌연변이에서 증식 효과는 UQCRB 억제제인 테르페스타신 및 A1938에 의해 조절되었다. 이를 종합하면, 상기 결과들은 UQCRB-조절된 생물학적 과정의 분자적 기반을 제공하고, 혈관신생 및 미토콘드리아-매개 대사질환에 있어서 UQCRB의 중요한 역할을 나타낸다.

이에 본 발명자들은 혈관신생 및 미토콘드리아-매개 대사질환 또는 암에서의 기전 연구를 위한 미토콘드리아 UQCRB 변이 세포주를 구축하였으며, 이를 활용한 UQCRB 활성 평가의 새로운 연구방법을 제시하고자 한다.

본 발명에서 용어 “변이(mutation)”는 UQCRB을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시킨 것을 의미한다. 예컨대, 유전자의 결실 및 유전자로의 이형 서열(heterogenous sequence)의 삽입은 유전자의 절단(truncation), 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutation), 미스센스 돌연변이(missense mutation) 등을 초래할 수 있다. 이러한 유전자의 특이적 변이는 당 분야에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있다.

한편, 뉴클레오타이드 서열의 결실은 당업계에 공지된 다양한 변이유발(mutagenesis) 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예컨대, UQCRB 코딩 서열의 결실은 PCR 돌연변이유발법 및 카세트 돌연변이유발법으로 실시할 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명에 따르면, 본 발명의 동물세포주는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 인간 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환 되어 상기 인간 UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB 변이 동물세포주이다.

본 발명에서 이용되는 벡터는 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 컨스트럭트를 포함한다. 상기 발현 컨스트럭트는 “동물세포에서 작동하는 프로모터-UQCRB 코딩 뉴클레오타이드 서열-폴리아데닐화 서열”를 포함한다. 본 명세서에서 서열목록 제 1 서열로 표시되는 인간 UQCRB는 실질적으로 인간 UQCRB의 아미노산 서열이 변이된 폴리펩타이드로서, 인간 UQCRB 유전자(Accession number: NM_006294)의 뉴클레오타이드 서열 중 338-341 번째 서열인 4-bp가 결실되어 있다. 즉, 본 발명의 UQCRB 돌연변이 서열의 단백질 산물은 C-터미널 말단에서 7가지 아미노산 잔기의 변화(alteration) 및 추가적인 14개의 아미노산 스크래치(stretch)를 나타낸다(도 1a 참조).

본 발명의 UQCRB은 혈관신생을 저해하는 저분자 화합물인 터페스타신(terpestacin)의 표적 단백질로서 구체적으로, UQCRB은 핵 내에 인코딩되어 있으며, 복합체 Ⅲ 구조를 조립하고 이를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 UQCRB 변이 단백질의 발현으로 인하여 미토콘드리아 내 활성산소종(ROS) 발생을 유도하고 HIF-1α를 안정화시켜, 결과적으로 신생혈관 형성 및 세포 증식 효과를 나타냄을 밝혀내었다.

본 발명의 UQCRB 변이 단백질을 효율적으로 발현하게 하기 위하여 UQCRB 인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 상기 UQCRB 인코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.

본 발명의 발현 컨스트럭트는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명에 따르면, 상기 인간 변이 UQCRB의 아미노산 서열은 서열목록 제 1 서열로 표시되는 것을 특징으로 하며, UQCRB의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 2 서열로 표시된다. 한편, 본 발명의 형질전환 동물세포주는 지속적/안정적으로 인간 UQCRB 변이 단백질을 발현한다.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드”는 DNA 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 벡터에서 상기 인간 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열목록 제 2 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 발현 벡터는 재조합 발현 벡터로서 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명에 있어서 프로모터는 동물세포에서 발현하기에 적합한 프로모터가 선택된다. 예컨대, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40(Simian Virus 40) 프로모터, SV40E1 프로모터, HSV(Herpes simplex virus)의 tk 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF1(elongation factor-1 alpha) 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2(interluekin-2) 유전자의 프로모터, 인간 IFN(interferon) 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 또는 인간 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 유전자의 프로모터가 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서 벡터는 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 포함하며, 소성장 호르몬 터미네이터, HSV(Herpes simplex virus) 유래 TK(Thymidine kinase) 또는 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리 아데닐화 서열이 바람직하다.

본 발명에서 이용되는 벡터는 선택마커로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포에 작용하는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 제네티신(G418), 퓨로마이신, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명에서 이용되는 인간 변이 UQCRB 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 동물세포에 형질전환되어 작동한다. 본 발명에 이용되는 동물세포는 예컨대, 포유류, 설치류, 조류 또는 곤충세포이다. 본 발명에 따르면, 상기 동물세포는 포유동물 세포이다.

본 발명의 발현 벡터를 세포에 도입하여 형질전환 동물세포를 제조하는 경우, 다양한 방법으로 벡터를 세포에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 또는 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990))이다.

형질전환된 동물세포의 배양은 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지에서도 가능하며 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium), α-MEM, Iscove's MEM, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium), Way-mouth's MB752/1, McCoy's 5A 및 MCDB 시리즈 등이 이용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 배양 배지는 DMEM이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 항암 활성 평가방법을 제공한다:

(a) UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) 변이 동물세포주를 제조하는 단계;

(b) 상기 형질전환된 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험물질의 항암 활성을 분석하는 단계.

본 발명의 항암 활성 평가방법은 시험물질의 항암 활성을 분석하는 방법으로서, 항암 물질의 스크리닝 방법과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 한편, 본 발명의 항암 활성 평가방법은 상술한 본 발명의 미토콘드리아 UQCRB 변이 동물세포주를 이용한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따르면, 상기 항암 활성은 상기 시험물질의 UQCRB 억제 활성을 분석하여 실시할 수 있다. 즉, 상기 단계 (c)에서 시험물질에 의해 UQCRB 활성이 억제되는 경우, 항암 활성이 있는 것으로 판단한다.

본 발명을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 미토콘드리아 UQCRB 변이 동물세포주의 제조

우선, UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB 변이 세포주를 제조한다. 본 발명에 따르면, 상기 세포주는 미토콘드리아 UQCRB을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이되어 UQCRB 변이 단백질을 발현한다. 보다 상세하게는 상기 UQCRB 변이 세포주는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 인간 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환 된 것이다.

본 발명에 있어서, 상술한 본 발명의 발현 벡터는 동물세포에 형질전환되어 작동한다. 본 발명에 따르면, 상기 동물세포는 포유동물세포로서, HEK293 세포이다.

본 발명의 형질전환된 동물세포를 배양하는 경우에 이용 가능한 배지로는 Eagles's MEM, α-MEM, Iscove's MEM, CMRL 1066, RPMI 1640, F12, F10, DMEM, Way-mouth's MB752/1, McCoy's 5A 및 MCDB 시리즈를 포함하고, 가장 바람직하게는 DMEM이다.

단계 (b): 형질전환된 동물세포와 시험물질의 접촉

이어, 형질전환된 동물세포와 시험물질을 접촉시킨다. 상기 시험물질은 상기 형질전환된 동물세포와 접촉하여, 세포 증식 및 혈관신생과 관련된 신호전달(예컨대, mROS-매개 또는 HIF-1α-매개 혈관신생 신호전달 및 세포 증식 신호전달)에 영향을 준다.

상기 접촉은 인 비트로 또는 인 비보 상에서 수행될 수 있으며, 예컨대 상기 방법이 (1) 인 비트로 분석방법일 경우에는 상기 형질전환된 동물세포 및 시험물질을 인 비트로 상(예컨대, 세포 배양 플레이트)에서 결합시켜 수행할 수 있고, (2) 인 비보 분석방법일 경우에는 상기 형질전환된 동물세포를 포함하는 인 비보 상의 개체에 상기 시험물질을 투여하여, 상기 형질전환된 동물세포와 시험물질을 접촉을 유도할 수 있다.

본 발명의 항암 활성 평가방법(또는 항암 물질의 스크리닝 방법)에 의해 분석되는 시험물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), miRNA, 펩타이드, 단백질, 항체 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항암 활성 평가방법에 의해 분석되는 시험물질이 화합물인 경우, 상기 화합물은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)일 수 있다. 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem . 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

단계 (c): 상기 시험물질의 항암 활성 분석

최종적으로 상기 형질전환 동물세포에 대한 시험물질의 항암 활성을 분석한다. 항암 활성 분석은 공지된 다양한 항암 관련 분자기전을 이용한 분석법에 의해 실시될 수 있으며, 예컨대, 유전자의 전사체 발현, 단백질 발현, 단백질간의 결합, 세포이동성, 세포 침윤(invasion) 분석 등에 의해 실시될 수 있다.

유전자의 전사체 발현분석의 경우, PCR(polymerase chain reaction), RT(reverse transcription)-PCR, 실시간-PCR 또는 마이크로어레이 분석 등이 가능하며, 단백질 발현의 경우 웨스턴 블럿, 형광현미경 등에 의해 분석 가능하며, 단백질간의 결합의 경우, ELISA, 형광현미경, 이스트-투 하이브리드 분석법을 통해 분석가능하다.

한편, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질은 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.

검출가능한 표지가 레이블링된 시험물질을 이용하는 경우, 시험물질의 세포 내 위치 또는 특정 단백질과의 결합 여부는 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌와 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 혈관신생 억제활성 평가방법을 제공한다:

(a) UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) 변이 동물세포주를 제조하는 단계;

(b) 상기 형질전환된 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험물질의 혈관신생 억제활성을 분석하는 단계.

본 발명의 혈관신생 억제활성 평가방법은 시험물질의 혈관신생 활성을 분석하는 방법으로서, 혈관신생 억제물질의 스크리닝 방법과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 한편, 본 발명의 혈관신생 억제활성 평가방법은 상술한 본 발명의 미토콘드리아 UQCRB 변이 동물세포주를 이용한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따르면, 상기 혈관신생 억제활성은 상기 시험물질의 UQCRB 억제 활성을 분석하여 실시할 수 있다. 즉, 상기 단계 (c)에서 시험물질에 의해 UQCRB 활성이 억제되는 경우, 혈관신생 억제 활성이 있는 것으로 판단한다.

상기 혈관신생 억제활성은 미토콘드리아 활성산소종(mitochondrial reactive oxygen species, mROS)-매개 또는 HIF-1α-매개 혈관신생 활성을 측정함으로써 실시할 수 있으며, 보다 상세하게는 미토콘드리아 활성산소종(mitochondrial reactive oxygen species, mROS) 생성 또는 HIF-1α 단백질의 안정화(발현)를 측정함으로써 실시할 수 있다. 또한, 상기 혈관신생 억제활성은 세포이동성 또는 세포 침투력을 측정함으로써 실시할 수 있다. 시험물질에 관한 내용은 상술한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 UQCRB 활성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) 변이 동물세포주를 제조하는 단계;

(b) 상기 형질전환된 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 시험물질의 UQCRB 억제 활성을 분석하는 단계.

본 발명의 UQCRB 활성 억제 물질의 스크리닝 방법에서, 상기 단계 (c)는 상기 형질전환된 세포주의 세포 증식 또는 혈관신생 활성을 측정하여 실시할 수 있다.

본 발명의 UQCRB 활성 억제 물질의 스크리닝 방법은 상술한 본 발명의 미토콘드리아 UQCRB 변이 동물세포주를 이용한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다. 시험물질에 관한 내용은 상술한 바와 같다.

본 발명의 UQCRB 변이 세포주는 미토콘드리아 활성산소종(mitochondrial reactive oxygen species, mROS)-매개 또는 HIF-1α-매개 기작을 통하여 혈관신생을 유도한다. 또한, 미토콘드리아의 구조적 이상(structural abnormality) 또는 형태학적 이상을 유도하지만(예컨대, swelling), 세포의 신생혈관 유도 또는 세포 증식에는 영향을 주지 않는다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB 변이 세포주에 관한 것이다.

(b) 본 발명은 신규한 미토콘드리아 UQCRB 변이 세포주를 사용한 UQCRB 활성 평가의 새로운 연구방법으로서, 항암 활성 평가방법, 혈관신생 억제활성 평가방법 및 UQCRB 활성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(c) 특히, 본 발명의 세포주는 세포 증식 및 혈관신생 유도 활성을 가진 신규한 세포주로서, UQCRB 활성 억제 기전을 통한 혈관신생 억제물질 또는 항암 물질의 스크리닝 방법을 제공하여, 혈관 신생 또는 미토콘드리아-매개성 질환 및 각종 암에서의 치료제 개발에 적용될 수 있다.

도 1: UQCRB 돌연변이 세포주의 구축 및 확인. 도 1a에서 UQCRB MT는 UQCRB 돌연변이 유전자 컨스트럭트 및 이의 DNA 서열을 나타낸 것이고, UQCRB WT는야생형 UQCRB 유전자 컨스트럭트 및 이의 DNA 서열(서열목록 제 3 서열)을 나타낸 것이다. 도 1b는 돌연변이 UQCRB 및 내생적(endogenous) UQCRB의 발현 레벨을 RT-PCR로 측정한 결과이다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용하였다. 도 1c는 돌연변이 세포주를 항-UQCRB 및 항-Myc 항체를 사용한 웨스턴블롯으로 확인한 결과이다. 액틴은 내부 대조군으로 사용하였다.
도 2: 세포 증식 및 미토콘드리아 형태에 있어 UQCRB 돌연변이의 효과. 도 2a는 UQCRB 돌연변이의 세포 증식효과는 시간-의존적 MTT 분석한 결과이다. 도 2b는 ATP 레벨을 시간-의존적으로 정량화한 결과이다. 도 2c는 세포의 미토콘드리아 형태를 나타낸다. 대조군과 비교하여 부풀어 오른 미토콘드리아가 관찰되었다. 스케일 바는 각각 2000 nm (20000 x) 및 500 nm (50000 x)를 나타낸다.
도 3: mROS-매개 HIF-1α 발현을 통한 VEGF 발현 유도. 도 3a는 mROS 레벨을 MitoSOXTM로 측정한 결과이다. 스케일 바는 10 μm를 나타낸다. 도 3b는 HIF-1α 및 VEGF mRNA 레벨에 있어서의 UQCRB 돌연변이의 효과를 나타낸다. 도 3c는 HIF-1α 단백질 안정화 및 VEGF 단백질 발현에 있어서의 UQCRB 돌연변이의 효과를 나타낸다. 도 3d는 돌연변이 세포주에서의 분비된 VEGF의 증가된 레벨을 나타낸다.
도 4: UQCRB 돌연변이 세포주에서의 신생혈관 생성 활성 및 UQCRB 억제자에 의한 조절. 도 4a는 HUVECs에서 배양배지(conditioned media, CM)-유도된 침윤을 통한 UQCRB 돌연변이의 신생혈관 생성 활성을 나타낸다. 도 4b는 세포 이동성에 대한 UQCRB 돌연변이의 효과를 나타낸다; 검은색 실선은 갭(gap)의 가장 자리를 나타낸다. 도 4c는 UQCRB 돌연변이 세포주 또는 대조군을 이용한 콜로니 형성 분석에서의 광학적 밀도를 나타낸다. 도 4d 및 도 4e는 UQCRB 돌연변이 세포주의 성장이 UQCRB 억제자인 테르페스타신 (T) 및 A1938 (A)에 의해 조절됨을 나타낸다. 세포를 테르페스타신 (50 μM) 또는 A1938 (10 μM)로 처리하고, 세포 성장을 MTT 분석으로 측정하였다. 도 4f는 UQCRB MT1 세포에서 증가된 mROS가 테르페스타신에 의해 감소됨을 나타낸다. mROS는 MitoSOXTM를 이용하여 측정하였다. 테르페스타신(20 μM)은 UQCRB MT1 세포에 1 시간동안 처리하였다. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

분자적 클로닝

UQCRB 돌연변이의 PCR-증폭된 전체 길이 cDNA(forward primer: 5′-ATGTGAATTCATGGCTGGTAAGCAGGC-3′; reverse primer: 5′-CTCGAGGCCGTCCTCGTAGCAGCTGCAGCCGCACACCTCCACCACGTG GTTGCTGCGCTGGCCGTTCTTTTCTTTTCTTTCCCGAAT-3′)를 pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen, Grand Island, NY)의 EcoRI/XhoI 부위에 클로닝함으로써 전체 길이의 인간 UQCRB 돌연변이 발현벡터를 구축하였다. PCR은 다음 조건으로 수행하였다: 초기 변성 94℃, 5분; 이후 94℃, 1분, 60℃, 1분, 72℃, 1분, 30 사이클.

UQCRB 돌연변이 안정화 세포주의 구축 및 세포 배양

리포펙타민^TM LTX 트랜스펙션 시약(Invitrogen, Grand Island, NY)을 이용하여 HEK293 세포에 UQCRB 돌연변이 발현벡터 1 μg을 주입하였다. 돌연변이 콜로니를 선별하기 위하여, 1 mg/mL G418 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)을 2주 동안 처리하고, 단일 세포 콜로니를 유리 실린더로 분리하였다. 대조군(HEK293) 및 돌연변이 세포주는 10% 소태아혈청(FBS; Invitrogen, Grand Island, NY) 및 1% 항생제(Invitrogen, Grand Island, NY)를 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s 배지 (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY)에서 배양하였다. 돌연변이 세포주를 유지하기 위하여, 1 mg/mL G418을 지속적으로 첨가하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO₂의 습윤 인큐베이터에서 배양되었다.

투과전자현미경(Transmission electron microscopy)

세포를 모아 PBS로 세척한 뒤, 2% 포름알데하이드/2% 글루타르알데하이드/0.5% CaCl₂에 6시간동안 고정하였다. 이어 0.1 M 인산버퍼로 세척하고, 1% OsO₄ 고정한 후, 세포를 95% 알콜에서 탈수시켰다. 상기 세포를 프로필렌 옥사이드에서 10분간 배양하고, EPON 혼합물 및 프로필렌 옥사이드의 1:1 용액에서 하루동안(overnight) 함침시켜(embedded) 두었다. LKB 8800 Ultratome Ⅲ으로 아주 얇은 절편을 준비하고 JEM-1011 JEOL 투과 전자 현미경으로 관찰하였다.

mROS 레벨 측정

mROS 레벨은 적색 형광 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 표지자 MitoSOXTM (Invitrogen, Grand Island, NY)에 의해 관찰되었다. 세포를 MitoSOX (5 μM) 및 Hoechst 33342 (Life Technologies, Grand Island, NY)로 10분간 처리한 후, PBS로 세척하고, 4% 포름알데하이드로 고정하였다. MitoSOXTM 및 Hoechst 염색 결과는 공초점 현미경(Zeiss LSM 710; Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) 하에서 관찰하였으며, MitoSOXTM의 형광 강도는 ImageJ로 측정하였다.

ATP 레벨의 결정

세포를 96-웰 플레이트에 분주하고 24-72시간 동안 배양하였다. ATP 레벨은 ATPliteTM (Perkin Elmer, Waltham, MA)를 이용하여 측정하였다.

세포 증식 시험(Cell proliferation assay)

대조군 및 돌연변이 세포주를 96-웰 플레이트에 분주하여 24-72시간 동안 배양하였다. 세포 증식은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT; Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) 비색법을 사용하여 측정하였다.

RNA 추출 및 역전사-PCR (RT-PCR)

전체 RNA는 트라이졸(Invitrogen, Grand Island, NY)-기반 방법을 이용하여 분리하였다. RT-PCR 분석은 각 mRNA의 발현 레벨을 측정하기 위하여 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: wild-type UQCRB, forward: 5′-ATGTGAATTCATGGCTGGTAAGCAGGCC-3′, reverse: 5′-ATGCCTCGAGCTTCTTTGCCCATTCTTC-3′; HIF-1a, forward: 5′-GCTGGCCCCAGCCGCTGGAG-3′, reverse: 5′-GAGTGCAGGGTCAGCACTAC-3′; VEGF, forward: 5′-ACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3′, reverse: 5′-GACACCAGAGTCCGACCCGG-3′;and GAPDH, forward: 5′-AACAGCGACACCCACTCCTC-3′, reverse: 5′-GGAGGGGAGATTCAGTGTGGT-3′). 유전자의 발현 레벨은 Image LabTM software (Bio-Rad, Hercules, CA)로 정량하였다.

웨스턴블럿 분석

세포 용해물(lysate)로 8%, 10%, 및 12.5% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 실시한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Millipore, Billerica, MA)에 트랜스퍼하였다. 상기 블럿(blots)을 다음의 1차 항체로 4℃, overnight 처리하였다: anti-UQCRB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), anti-Myc (Medical & Biological Laboratories Corp., Nagano, Japan), anti-HIF-1α (BD Bioscience, Bedford, CA), anti-VEGF (Abcam, Cambridge, MA), anti-튜불린 (Millipore, Billerica, MA), and anti-액틴 (Abcam, Cambridge, MA). 면역라벨링은 화학발광 키트(ECL kit, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 측정하였다. 이미지는 Image LabTM software (Bio-Rad, Hercules, CA)로 정량하였다.

인간 VEGF ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

UQCRB 돌연변이 세포주 및 대조군 세포를 6-웰 플레이트에 각각 25 × 10⁴ 세포/웰(ml)로 분주한 후, 37℃에서 24시간 배양하였다. 이후 배지를 수거한 뒤, 상층액의 VEGF (vascular endothelial growth factor) 단백질의 농도를 VEGF ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다. VEGF 단백질의 발현 레벨은 대조군 샘플에 대하여 정규화(normalized) 하였다.

인 비트로 침윤 분석

UQCRB 돌연변이 세포주의 신생혈관 유발 활성(Pro-angiogenic activity)은 8.0 μm 공극 사이즈의 폴리카보네이트 필터가 있는 Transwell chamber system (Corning Costar, Cambridge, MA)을 이용하여 세포의 상층액을 HUVECs (human umbilical vascular endothelial cells) 세포에 처리함으로서 측정하였다. 상기 HUVECs은 10% FBS가 첨가된 EBM-2 배지(Cambrex Bio Science, Baltimore, MD)에서 7 내지 10 계대 배양하였다. 전체 침윤 세포 수는 현미경(IX71; Olympus America Inc., Center Valley, PA)을 이용하여 계수하였다(배율: 100 x).]

세포 이동 분석( Cell migration assay )

세포를 6-웰 플레이트에 고농도로 분주한 후, 일정 간격의 갭(gap)을 형성하기 위하여 멸균된 마이크로피펫 팁을 이용하여 웰의 가운데 부분을 스크래칭하였다. 상기 세포를 DMEM에서 17시간 배양한 후, 현미경을 이용하여 이동한 세포를 분석하였다.

콜로니 형성 분석( Colony formation assay )

세포(5×10²)를 6-웰 플레이트에 분주하고 콜로니가 형성될 때 까지 2주간 배양하였다. 이후 세포를 4% 포름알데하이드로 고정하고, 0.25% 크리스탈 바이올렛으로 10분간 염색한 후, 멸균수로 2번 세척하였다. 염색된 세포는 비색측정 전 70% 메탄올로 처리하였다.

통계 분석

결과는 평균 ± 표준편자(SD)로 나타내었다. 모든 데이터는 적어도 3번의 독립적인 실험의 대표값을 나타낸다.

실험결과

UQCRB 돌연변이 세포주는 인간 사례 보고에 기반하여 구축되었다

UQCRB의 생물학적 기능을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 인간 cDNA에서 동정된 UQCRB 돌연변이를 이용하였다[12]. 인간 사례 보고에 근거하면, 이러한 돌연변이는 UQCRB 유전자의 뉴클레오타이드 338-341 번째 서열에서 4-bp가 결실되었으며, 포유동물 세포에서 단백질 발현을 위하여 서브 클로닝되었다. UQCRB 돌연변이 단백질 산물은 C-터미널 말단에서 7가지 아미노산 잔기의 변화(alteration) 및 추가적인 14개의 아미노산 스크래치(stretch)를 나타내었다(도 1a). HEK293 세포로 형질감염되기 전, 유전자 컨스트럭트의 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 단일 세포 콜로니 선별이후, 같은 돌연변이를 가지고 있지만 다른 발현 레벨을 나타내는 2개의 UQCRB 돌연변이 세포주를 각각 MT1 및 MT2로 명명하고 각각의 세포주에서의 mRNA 및 단백질 레벨을 측정하였다(도 1b, 1c). MT1은 돌연변이 단백질의 높은 발현양상을 나타내었으며, 반면 MT2는 상대적으로 낮은 발현양상을 나타내었다. 상기 돌연변이 세포주는 야생형 UQCRB 단백질 발현 레벨에서는 차이를 나타내지 않았다.

UQCRB 돌연변이 세포주는 미토콘드리아 이상에도 불구하고 세포 증식 활성을 나타낸다

UQCRB 돌연변이 세포주인 MT1 및 MT2의 특성을 알아보기 위하여, MTT 분석법으로 세포 증식정도를 측정하였다. 놀랍게도, 대조군과 비교하여, MT1은 시간-의존적으로 성장이 현저히 증가하였다(도 2a). MT2의 성장은 MT1보다 약하게 나타났으나 대조군보다는 강하게 나타났다. 또한 UQCRB 돌연변이 세포주에서 ATP 레벨이 증가되었다(도 2b). 특히 MT1 및 MT2의 미토콘드리아 형태가 현저히 부풀어 오르는(swelling) 구조적인 이상이 발견되었다(도 2c).

UQCRB 돌연변이 세포주는 mROS - 매개된 HIF1 신호전달을 유도한다

이전 연구에서(Jung et al.), UQCRB는 저산소 조건에서 mROS- 및 HIF-매개 혈관신생을 조절함으로써, 산소-감지 메카니즘에 있어서 중요한 역할을 할 것이라는 보고가 있었다[6]. 따라서, 본 발명자들은 mROS-특이 적색 형광 표지자 MitoSOXTM를 이용하여 MT1 및 MT2 세포에서 mROS의 생성을 측정하였다. 특히, mROS 생성은 대조군과 비교하여 돌연변이 세포주에서 증가되었다(도 3a). 증가된 mROS 생성은 증가된 HIF-1α의 안정성에 필수적이다[13]. mROS의 생성 증가가 HIF-1α의 안정성에 영향을 줄 수 있는지 실험하기 위하여 HIF-1α 단밸질 레벨을 웨스턴블롯으로 측정하였다. 예상한 바와 같이, HIF-1α 단백질은 MT1 및 MT2 세포주에서 안정화되었으며, mRNA는 그러하지 않았다(도 3b, 3c). 또한, MT1 및 MT2 세포주에서 HIF-1α의 다운스트림에 있는 VEGF 유전자[14,15]의 발현이 증가됨을 웨스턴블롯 및 RT-PCR로 확인하였다(도 3b, 3c). VEGF의 분비 레벨은 인간 VEGF ELISA로 측정하였다. 대조군과 비교하여, MT1은 VEGF 발현이 4배 이상 증가된 것으로 나타났다(도 3d). 이러한 결과는 UQCRB 돌연변이 세포주는 mROS-매개 HIF-1α 신호전달을 통하여 VEGF 발현을 현저히 유도함을 나타낸다.

UQCRB 돌연변이의 혈관신생 유도 효과( pro - angiogenic effect )는 UQCRB 억제자에 의해 조절된다

VEGF는 혈관신생 시그널링에 있어 중요한 사이토카인 중의 하나이므로, 본 발명자들은 다양한 인 비트로 혈관신생 분석법을 이용하여 MT1 및 MT2 세포주의 신생혈관 형성 활성을 측정하였다. 우선, HUVECs을 MT1 및 MT2 세포주로부터 수득한 배양액으로 처리하고, 하부 챔버에서 16시간 배양하였다. VEGF 발현이 증가됨에 따라, HUVECs의 침윤 활성 또한 대조군과 비교하여 현저히 증가되었다(도 4a).

이어, MT1 및 MT2 세포주의 세포 이동성을 측정하였다. 대조군과 비교하여, 양 세포주는 17시간 이내에 현저한 세포이동을 나타내었다(도 4b). 또한, 콜로니 형성 실험에서, MT1 및 MT2 세포주는 대조군과 비교하여 콜로니 형성이 증가됨을 보여주었다(도 4c). 이러한 결과들은 대조군과 비교하여 MT1 및 MT2 세포주가 현저히 높은 신생혈관 형성(pro-angiogenic) 활성을 나타냄을 의미한다.

UQCRB는 천연 화합물인 테르페스타신의 분자적 타겟이므로[6], 본 발명자들은 UQCRB 돌연변이 세포주에서 테르페스타신의 효과를 실험하였다. 테르페스타신이 MT1 및 MT2 세포주에 영향을 주는지 실험하기 위하여, 테르페스타신을 처리(3일) 또는 무처리한 세포에서의 세포 성장을 측정하였다. 흥미롭게도 테르페스타신은 50 μM 농도에서 MT1 및 MT2 세포주의 증식을 현저히 억제하였으며, 대조군의 세포증식에는 영향을 주지 않았다(도 4d). 또한, 본 발명자들은 UQCRB 억제자인 [16] A1938의 효과를 실험하기 위하여, MT1 및 MT2 세포주의 세포증식을 측정하였다. 도 4e에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조군과 비교하여, MT1 및 MT2 세포주는 10 μM A1938 처리에 대하여 감응성을 나타내었다. 특히, 테르페스타신 처리는 MT1에서 mROS 유도를 약화시켰다(도 4f). 이러한 결과들은 MT1 및 MT2 세포주의 세포증식 및 신생혈관 형성 활성이 UQCRB 억제제에 의해 조절될 수 있음을 보여준다.

논의

미토콘드리아는 ATP의 주요 생성장소인 세포의 중요 발전소(powerhouse)일 뿐만 아니라[17], 세포의 산소-감지 시스템의 필수적인 멤버이다[13]. 5가지 미토콘드리아 전자 전달 체인 복합체 중, 복합체 Ⅲ는 ROS 생성 장소로서 널리 알려져 있다. 최근, 복합체 Ⅲ의 서브유닛 중 하나인 UQCRB가 저산소-유도[6] 및 VEGF-유도[7] 혈관신행에 있어 산소 감지자로서 규명되었다. 또한, 제브라피쉬에서 유전자 녹다운(knock-down)에 의한 UQCRB의 기능 억제는 혈관신생을 억제시켰다[18]. 아직까지 병리학적 효과와 관련된 UQCRB의 생물학적 기능에 대해서는 불분명하다. 따라서 본 발명자들은 UQCRB 돌연변이 안정화 세포주를 구축하였다. 두 가지의 세포주, MT1 및 MT2는 미토콘드리아의 형태학적 이상과 함께, 현저한 세포 성장 및 신생혈관 형성 활성을 나타내었다. 본 발명자들은 또한 mROS-유도된 HIF-1α 신호전달 경로에서 VEGF가 유도되고 이로써 MT1 및 MT2 세포주의 신생혈관 형성 활성을 나타냄을 증명하였다. 한편, 세포 증식 및 미토콘드리아의 형태학적 이상 간의 상관관계는 추후 연구가 필요하다. 미토콘드리아의 이상은 종양형성에 있어 중요한 기능을 하는 것으로 언급되어 왔다[19,20]. Baysal 외는 미토콘드리아 복합체 Ⅱ 유전자 SDHD에서의 돌연변이가 어떻게 종양형성에 기여하는지 증명하였다[21]. 이는 미토콘드리아에서 mROS 생성 증가를 나타내는 산화환원 스트레트 메카니즘이 유사-저산소(pseudo-hypoxia) 상태를 가져오고, 이는 미토콘드리아의 이상(abnormality)과 혈관신생-관련 질병 및 암을 서로 연관시키는 본 발명의 결과와 일치한다[22]. 흥미롭게도, 본 발명자들은 MT1 및 MT2의 증식이 UQCRB 억제자인 테르페스타신 및 A1938에 의해 조절될 수 있음을 증명하였다. UQCRB 억제자에 의한 mROS의 억제는 세포 성장에 영향을 줄 수 있다.

요약하면, 본 발명의 결과는 UQCRB 돌연변이-연관 생물학적 과정의 분자적 기반을 제안한다. 또한, UQCRB의 돌연변이에 의해 유도되는 미토콘드리아의 이상과 혈관신생- 또는 미토콘드리아-관련 질병의 연관성을 제시하며, UQCRB 억제자에 의한 UQCRB 돌연변이의 병리학적 영향을 교정할 수 있는 대안으로 제시된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

[1] J. Nunnari, A. Suomalainen, Mitochondria: in sickness and in health, Cell 148 (2012) 1145-1159.

[2] D.C. Wallace, Mitochondria and cancer, Nat Rev Cancer 12 (2012) 685-698.

[3] P. Dromparis, E.D. Michelakis, Mitochondria in vascular health and disease, Annu Rev Physiol 75 (2013) 95-126.

[4] K.F. Petersen, S. Dufour, D. Befroy, R. Garcia, G.I. Shulman, Impaired mitochondrial activity in the insulin-resistant offspring of patients with type 2 diabetes, N Engl J Med 350 (2004) 664-671.

[5] H. Suzuki, Y. Hosokawa, H. Toda, M. Nishikimi, T. Ozawa, Cloning and sequencing of a cDNA for human mitochondrial ubiquinone-binding protein of complex III, Biochem Biophys Res Commun 156 (1988) 987-994.

[6] H.J. Jung, J.S. Shim, J. Lee, Y.M. Song, K.C. Park, S.H. Choi, N.D. Kim, J.H. Yoon, P.T. Mungai, P.T. Schumacker, H.J. Kwon, Terpestacin inhibits tumor angiogenesis by targeting UQCRB of mitochondrial complex III and suppressing hypoxia-induced reactive oxygen species production and cellular oxygen sensing, J Biol Chem 285 (2010) 11584-11595.

[7] H.J. Jung, Y. Kim, J. Chang, S.W. Kang, J.H. Kim, H.J. Kwon, Mitochondrial UQCRB regulates VEGFR2 signaling in endothelial cells, J Mol Med (Berl) 91 (2013) 1117-1128.

[8] H.L. Jia, Q.H. Ye, L.X. Qin, A. Budhu, M. Forgues, Y. Chen, Y.K. Liu, H.C. Sun, L. Wang, H.Z. Lu, F. Shen, Z.Y. Tang, X.W. Wang, Gene expression profiling reveals potential biomarkers of human hepatocellular carcinoma, Clin Cancer Res 13 (2007) 1133-1139.

[9] K.O. Wrzeszczynski, V. Varadan, J. Byrnes, E. Lum, S. Kamalakaran, D.A. Levine, N. Dimitrova, M.Q. Zhang, R. Lucito, Identification of tumor suppressors and oncogenes from genomic and epigenetic features in ovarian cancer, PLoS One 6 (2011) e28503.

[10] T. Harada, C. Chelala, T. Crnogorac-Jurcevic, N.R. Lemoine, Genome-wide analysis of pancreatic cancer using microarray-based techniques, Pancreatology 9 (2009) 13-24.

[11] J. Lascorz, M. Bevier, W.V. Schonfels, H. Kalthoff, H. Aselmann, J. Beckmann, J. Egberts, S. Buch, T. Becker, S. Schreiber, J. Hampe, K. Hemminki, A. Forsti, C. Schafmayer, Polymorphisms in the mitochondrial oxidative phosphorylation chain genes as prognostic markers for colorectal cancer, BMC Med Genet 13 (2012) 31.

[12] S. Haut, M. Brivet, G. Touati, P. Rustin, S. Lebon, A. Garcia-Cazorla, J.M. Saudubray, A. Boutron, A. Legrand, A. Slama, A deletion in the human QP-C gene causes a complex III deficiency resulting in hypoglycaemia and lactic acidosis, Hum Genet 113 (2003) 118-122.

[13] T. Klimova, N.S. Chandel, Mitochondrial complex III regulates hypoxic activation of HIF, Cell Death Differ 15 (2008) 660-666.

[14] D.E. Richard, E. Berra, J. Pouyssegur, Angiogenesis: how a tumor adapts to hypoxia, Biochem Biophys Res Commun 266 (1999) 718-722.

[15] J.A. Forsythe, B.H. Jiang, N.V. Iyer, F. Agani, S.W. Leung, R.D. Koos, G.L. Semenza, Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1, Mol Cell Biol 16 (1996) 4604-4613.

[16] H.J. Jung, K.H. Kim, N.D. Kim, G. Han, H.J. Kwon, Identification of a novel small molecule targeting UQCRB of mitochondrial complex III and its anti-angiogenic activity, Bioorg Med Chem Lett 21 (2011) 1052-1056.

[17] C. Desler, L.J. Rasmussen, Mitochondria in biology and medicine--2012, Mitochondrion 16 (2014) 2-6.

[18] Y.S. Cho, H.J. Jung, S.H. Seok, A.Y. Payumo, J.K. Chen, H.J. Kwon, Functional inhibition of UQCRB suppresses angiogenesis in zebrafish, Biochem Biophys Res Commun 433 (2013) 396-400.

[19] J.S. Park, L.K. Sharma, H. Li, R. Xiang, D. Holstein, J. Wu, J. Lechleiter, S.L. Naylor, J.J. Deng, J. Lu, Y. Bai, A heteroplasmic, not homoplasmic, mitochondrial DNA mutation promotes tumorigenesis via alteration in reactive oxygen species generation and apoptosis, Hum Mol Genet 18 (2009) 1578-1589.

[20] S. Ohsawa, Y. Sato, M. Enomoto, M. Nakamura, A. Betsumiya, T. Igaki, Mitochondrial defect drives non-autonomous tumour progression through Hippo signalling in Drosophila, Nature 490 (2012) 547-551.

[21] B.E. Baysal, R.E. Ferrell, J.E. Willett-Brozick, E.C. Lawrence, D. Myssiorek, A. Bosch, A. van der Mey, P.E. Taschner, W.S. Rubinstein, E.N. Myers, C.W. Richard, 3rd, C.J. Cornelisse, P. Devilee, B. Devlin, Mutations in SDHD, a mitochondrial complex II gene, in hereditary paraganglioma, Science 287 (2000) 848-851.

[22] E. Gottlieb, I.P. Tomlinson, Mitochondrial tumour suppressors: a genetic and biochemical update, Nat Rev Cancer 5 (2005) 857-866.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY <120> {Construction of mitochondrial UQCRB mutant expressing cells and utilization of the cells for UQCRB assay system thereof <130> PN140501 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human UQCRB mutant amino acid sequence <400> 1 Met Ala Gly Lys Gln Ala Val Ser Ala Ser Gly Lys Trp Leu Asp Gly 1 5 10 15 Ile Arg Lys Trp Tyr Tyr Asn Ala Ala Gly Phe Asn Lys Leu Gly Leu 20 25 30 Met Arg Asp Asp Thr Ile Tyr Glu Asp Glu Asp Val Lys Glu Ala Ile 35 40 45 Arg Arg Leu Pro Glu Asn Leu Tyr Asn Asp Arg Met Phe Arg Ile Lys 50 55 60 Arg Ala Leu Asp Leu Asn Leu Lys His Gln Ile Leu Pro Lys Glu Gln 65 70 75 80 Trp Thr Lys Tyr Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Leu Glu Pro Tyr Leu Lys 85 90 95 Glu Val Ile Arg Glu Arg Lys Glu Lys Asn Gly Gln Arg Ser Asn His 100 105 110 Val Val Glu Val Cys Gly Cys Ser Cys Tyr Glu Asp Gly 115 120 125 <210> 2 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human UQCRB mutant nucleotide sequence <400> 2 atggctggta agcaggccgt ttcagcatca ggcaagtggc tggatggtat tcgaaaatgg 60 tattacaatg ctgcaggatt caataaactg gggttaatgc gagatgatac aatatacgag 120 gatgaagatg taaaagaagc cataagaaga cttcctgaga acctttataa tgacaggatg 180 tttcgcatta agagggcact ggacctgaac ttgaagcatc agatcttgcc taaagagcag 240 tggaccaaat atgaagagga aaatttctac cttgaaccgt atctgaaaga ggttattcgg 300 gaaagaaaag aaaagaacgg ccagcgcagc aaccacgtgg tggaggtgtg cggctgcagc 360 tgctacgagg acggc 375 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human UQCRB wild type amino acid sequence <400> 3 Met Ala Gly Lys Gln Ala Val Ser Ala Ser Gly Lys Trp Leu Asp Gly 1 5 10 15 Ile Arg Lys Trp Tyr Tyr Asn Ala Ala Gly Phe Asn Lys Leu Gly Leu 20 25 30 Met Arg Asp Asp Thr Ile Tyr Glu Asp Glu Asp Val Lys Glu Ala Ile 35 40 45 Arg Arg Leu Pro Glu Asn Leu Tyr Asn Asp Arg Met Phe Arg Ile Lys 50 55 60 Arg Ala Leu Asp Leu Asn Leu Lys His Gln Ile Leu Pro Lys Glu Gln 65 70 75 80 Trp Thr Lys Tyr Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Leu Glu Pro Tyr Leu Lys 85 90 95 Glu Val Ile Arg Glu Arg Lys Glu Arg Glu Glu Trp Ala Lys Lys 100 105 110

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 다음의 단계를 포함하는 항암 활성 평가방법:
   (a) UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) 변이 동물세포주를 제조하는 단계로서, 상기 동물세포주는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 인간 UQCRB을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되어 상기 인간 UQCRB 변이 단백질을 발현하며;
   (b) 상기 동물세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 시험물질의 항암 활성을 분석하는 단계.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 항암 활성은 상기 시험물질의 UQCRB 억제 활성을 분석하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 다음의 단계를 포함하는 혈관신생 억제활성 평가방법:
   (a) UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) 변이 동물세포주를 제조하는 단계로서, 상기 동물세포주는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 인간 UQCRB을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되어 상기 인간 UQCRB 변이 단백질을 발현하며;
   (b) 상기 동물세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 시험물질의 혈관신생 억제활성을 분석하는 단계.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 혈관신생 억제활성은 상기 시험물질의 UQCRB 억제 활성을 분석하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 혈관신생 억제활성은 미토콘드리아 활성산소종(mitochondrial reactive oxygen species, mROS)-매개 또는 HIF-1α-매개 혈관신생 활성을 측정함으로써 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 다음의 단계를 포함하는 UQCRB 활성 억제 물질의 스크리닝 방법:
   (a) UQCRB 변이 단백질을 발현하는 미토콘드리아 UQCRB (Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein) 변이 동물세포주를 제조하는 단계로서, 상기 동물세포주는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 인간 UQCRB을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되어 상기 인간 UQCRB 변이 단백질을 발현하며;
   (b) 상기 동물세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 시험물질의 UQCRB 억제 활성을 분석하는 단계.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 세포의 세포 증식 또는 혈관신생 활성을 측정하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
    

Images