KR101278221B1

KR101278221B1 - Ρｔｄ－ｕｑｃｒｂ 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101278221B1
Application number: KR1020100051892A
Authority: KR
Inventors: 권호정; 장정화
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2013-06-24
Also published as: KR20110132077A; WO2011152662A2; US8729021B2; US20130072432A1; WO2011152662A9; WO2011152662A3

Abstract

본 발명은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 매우 효과적으로 세포막을 통과하여 혈관신생을 유도할 뿐만 아니라 세포 독성을 일으키지도 아니하므로 허혈성 질환의 예방 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ΡＴＤ－ＵＱＣＲＢ 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물{PTD-UQCRB Fusion Polypeptide and Pharmaceutical Composition for Preventing and Treating Ischemic Diseases Comprising the Same}

본 발명은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

허혈이란, 혈관이 협착 또는 수축하거나, 정상적인 혈관 생성이 충분히 이루어지지 않아 혈류의 공급이 중단되어 세포 손상이 일어나는 부분적 혈액 부족 증상을 말한다. 대표적인 허혈성 질환의 하나인 만성적 허혈성 심장질환의 경우, 심근에 혈액을 공급하는 관상 순환계의 이상으로 심근이 충분한 양의 산소와 영양분을 받지 못해서 흉통, 심부전으로 인한 호흡곤란, 허약감, 실신 등의 증상을 수반하는데, 최근 발생빈도가 급격히 증가하고 있다. 또한, 모근 및 모낭에 혈액의 공급이 원활하지 못하게 되면 모낭의 형성 즉 모발 형성이 되지 않아 탈모자 백발증을 유발할 수 있다. 그 밖에도, 허혈로 인한 혈핵 공급의 중단은 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 안질환, 허혈성 하지질환 등의 각종 허혈성 질환을 유발하게 된다. 따라서, 혈관신생을 유도하여 이러한 허혈성 질환을 치료하고자 하는 시도들이 있다.

VEGF(vascular Endothelial Growth Factor:혈관내피세포 성장인자)는 내피세포에 특이적인 유사분열 촉진제로서, 호모 다이머 구조를 가진 당단백질이다. 사람에는 발현된 단백질의 아미노산 길이에 따라 4가지 유사체가 존재하며, VEGF-121, 165는 분비 단백질이고, VEGF-189, 206은 세포 표면이나 세포 외 기질에서 프로테오글리칸을 포함한 헤파린에 결합하여 성장인자로 작용한다. VEGF와 결합하는 대표적인 수용체에는 Flt-1(Fml-like tyrosine kinase-1)과 KDR(kinase domain-containing receptor)이 있다. 이들은 모두 내피세포에서 발현하며, Flt-1은 주로 세포의 이동, 세포와 세포간의 상호작용에 관여하고, KDR은 세포증식과 생존에 관여한다. VEGF는 수용체와의 결합에 의한 신호전달을 통해서 내피세포의 증식과 이동, 모세혈관의 형성과 같은 혈관신생(angiogenesis)을 일으키고, 이는 배아 발생 동안에 기관의 발생과 분화뿐만 아니라 상처의 재생에 필수적이다. VEGF가 혈관신생을 유도한다는 사실은 당업자에게 있어 널리 알려진 사실이며 여러 문헌(Bruce I. et al, VEGF and Tumor Angiogenesis, Einstein Quart . J. Biol . and Med . 18:59-66(2001); Oettgen P, The role of ets factors in tumor angiogenesis, J Oncol ., 2010:767384. Epub 2010 May 4; Berse B. et al, Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors, Mol Biol Cell ., 3(2):211-20(1992))에 의해 명백히 뒷받침되고 있다. 따라서, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)를 직접 투여하여도, 혈관신생을 유도하여 허혈성 질환을 치료할 수 있다. 그러나, VEGF만을 단독으로 투여하는 것만으로는 기저막 분열, 상피세포의 증식, 이동 및 분화를 포함하는 혈관신생의 모든 단계를 효과적으로 유도할 수 없으므로 자연적인 혈관신생보다 덜 조직적으로 혈관신생이 일어나게 된다. 자연적으로는 저산소증이 혈관 신생을 유도한다고 알려져 있으므로, 저산소증의 조절자를 사용한다면 하나 또는 그 이상의 혈관신생인자의 생성을 동시에 자극할 수 있으며 그 결과 개별인자가 유도하는 것보다 더 조직적이고 건강하게 혈관신생을 유도할 수 있으리라 기대되고 있다.

한편, 미토콘드리아 복합체 Ⅲ의 구성요소 중 하나인 UQCRB은 혈관신생을 저해하는 저분자 화합물인 터페스타신(terpestacin)의 표적 단백질이다(1). 구체적으로, UQCRB은 핵 내에 인코딩되어 있으며(2), 복합체 Ⅲ 구조를 조립하고 이를 유지하는데 중요한 역할을 한다(3). 또한, UQCRB는 간암 및 위암에서 과발현되며, 저혈당증, 락트산 산성증 및 근질환과 같은 여러 질병과 관련이 있다(4).

여러 보고에 의하면, 미토콘드리아 호흡 체인의 복합체 III는 세포 내 산소 감지를 통해 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)을 생성하여, 저산소-유도성 혈관신생 조절에 있어 중요한 역할을 수행한다(5-8). 저산소 상태에서 미토콘드리아 복합체 III에 의해 생성된 ROS는 혈관신생의 주 조절자인 저산소-유도인자 1-α(HIF-1α; hypoxia-inducible factor 1-α) 단백질을 안정화시킨다(9)(도 1). 저산소-유도인자(HIF)는 저산소 상태에서 세포 생존 및 혈관신생 개시에 중요한 역할을 하는 점에서 주목 되어왔다(10-11). HIF는 HIF-1α 및 HIF-1β의 헤테로 다이머 복합체로 구성되는데, 특히 HIF-1α 단백질은 혈관 내피세포 증식인자(VEGF)와 같은 호-혈관신생 인자 발현의 개시를 일으킨다(13-14).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 UQCRB를 세포 내로 운반할 수 있는 신규한 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 설계하고, 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드가 혈관신생을 효과적이면서도 안전하게 일으킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드 생산 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 단백질 전달 도메인(PTD)의 아미노산 서열 및 인간 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)의 아미노산 서열을 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 융합 폴리펩타이드는 단백질 전달체(protein transduction domain: PTD)에 융합된 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)를 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드”는 단백질 전달체(PTD)의 C-말단 또는 N-말단에 UQCRB가 융합된 융합 폴리펩타이드를 의미한다.

본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 구성요소 중 하나인 UQCRB은 혈관신생을 저해하는 저분자 화합물인 터페스타신(terpestacin)의 표적 단백질이로서 구체적으로, UQCRB은 핵 내에 인코딩되어 있으며, 복합체 Ⅲ 구조를 조립하고 이를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 UQCRB의 세포 내 도입이 미토콘드리아 내 활성산소종(ROS) 발생을 유도하고 HIF-1α를 안정화시킴을 밝혀내었다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 인간 UQCRB의 아미노산 서열은 서열목록 제 1 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 융합 폴리펩타이드에 이용되는 단백질 전달체(protein transduction domain: PTD)는 UQCRB의 세포 내로의 유입을 보다 효과적으로 하기 위하여 부가된 것이다. 상기 단백질 전달체에 의하여, 본 발명의 UQCRB는 수지상 세포에 수용체(receptor) 및 수송체(transporter) 의존적 방식으로 세포막을 통과한다. 즉, 세포 흡수 작용(pinocytosis), 식세포 작용 (phagocytosis) 및 수용체-매개 세포내 취입 작용 (endocytosis)이 아닌 세포막 투과 기작을 통해 유입된다. 따라서, UQCRB의 세포 내로의 유입이 다른 기전과 비교하여 보다 효율적으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 단백질 전달체는 Hph1, Tat, 페네트라틴(Penetratin), 트랜스포탄(Transportan), VP-22, 양쪽 친매성 펩타이드(Amphipathic peptides), MPG, Pep-1, MAP, SAP, PPTG1, 양이온성 펩타이드(Cationic peptides), 올리고알기닌(Oligoarginine), hCT(9-32), SyrB 및 Pvec를 포함하는 펩타이드이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 단백질 전달체는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 가지는 Hph1이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 단백질 전달 도메인(PTD)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 인간 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드”는 DNA 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 인간 UQCRB를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 3 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 벡터에서 상기 인간 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열목록 제 3 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에서, 상기 단백질 전달 도메인(PTD)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 4 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 효율적으로 발현하게 하기 위하여 PTD 인코딩 뉴클레오타이드 서열과 UQCRB 인코딩 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 상기 PTD 인코딩 뉴클레오타이드 서열과 UQCRB 인코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.

본 발명의 발현 컨스트럭트는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 바람직하게는 원핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 본 발명의 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토 그래피, 바람직하게는 HisPur 코발트 수지 친화성 크로마토그래피 또는 Ni-친화성 컬럼에 의해 정제된다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 숙주세포를 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 벡터로 형질전환 시키는 단계; 및 (b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 수집하는 단계를 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 바람직하게는 starpLysS E. coli이다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 융합 단백질을 얻게 된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 약제학적 유효량 ; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 서열목록 제 1 서열로 표시되는 아미노산 서열 및 서열목록 제 2 서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 유효성분인 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드가 세포 속을 통과할 때, 미토콘드리아 복합체 III-유래 ROS 발생이 유도된다. 미토콘드리아 ROS는 HIF 하이드록실라제인 PHD를 억제하여 HIF-1α를 안정화시킨다. 안정화된 HIF-1α는 HIF-1β와 다이머를 이룰 수 있고, 이러한 헤테로 다이머 복합체는 핵 내로 이동하여 HRE 프로모터에 결합한다. 결과적으로, VEGF와 같은 타겟 유전자가 전사되어 혈관신생을 유도할 수 있다. 실제 실험결과, 본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 정상 산소 조건에서도 혈관 내피세포 증식인자(VEGF)의 발현을 유도하여 혈관신생을 유도하는 것으로 확인되었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 질환인 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

용어, “약제학적 유효량”은 혈관 신생을 적절히 유도하여 상기 허혈성 질환 치료제의 약리학적 효과를 나타내는 데 필요한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드 및 그를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 매우 효과적으로 세포막을 통과하여 혈관신생을 유도할 뿐만 아니라 세포 독성을 일으키지도 아니하므로 허혈성 질환의 예방 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1. 저산소 및 정상산소 상태에서 HIF 의 조절에 대한 개략적 도식
미토콘드리아 전자 전달 체인에서 발생된 ROS는 저산소 상태에서 HIF-1α를 안정화시킨다. PHD: 프롤릴 하이드록시라제, FIH: HIF 억제 인자, VHL: 폰 히펠 린다우.
도 2. PTD - UQCRB 융합 단백질의 유전자 클로닝
(A) 좌: PTD-UQCRB의 DNA 컨스트럭트, 우: 제한효소 절단 후 DNA 젤 전기영동 이미지
(B) 서브클로닝 된 DNA 컨스트럭트의 서열. 보라색: PTD 서열, 청색: 제한효소부위(첫번째: EcoRI를 위한 GAATTC, 두번째: XhoI를 위한 CTCGAG), 적색: UQCRB 전장 유전자.
도 3. PTD - UQCRB 융합 단백질의 발현 및 정제
(A) PTD-UQCRB 융합 단백질 시리즈를 BL21 세포주에서 발현하였다(B: BL21, S: BL21 starpLysS, P: BL21 pLysS). PTD-UQCRB 융합 단백질의 분자량은 43 kDa이었다.
(B) IPTG 유도에 의해 녹색 형광을 발하는 배양된 BL21 starpLysS.
(C) IPTG 유도 후 EGFP로 태그된 발현된 PTD-UQCRB 융합 단백질과 결합한 Ni-NTA 아가로스 비드.
(D) 정제된 PTD-UQCRB 융합 단백질(43 kDa).
도 4. PTD - UQCRB 융합 단백질의 세포 내 위치
(A) 1시간 동안 0.5 μM의 PTD-UQCRB 융합 단백질을 HT1080 세포 내로 도입한 후에, PTD-UQCRB 포함 상등액을 제거하였다. 세포를 그 즉시 고정시키고, 공초점 현미경을 사용하여 PTD-UQCRB 융합 단백질의 위치를 확인하였다(NT: non-treated, PC: phase contrast). 스케일 바, 20 ㎛.
(B) 1시간 동안 2 μM의 PTD-UQCRB 융합 단백질을 HT1080 세포 내로 도입한 후에, PTD-UQCRB 포함 상등액을 제거하였다. 세포를 고정하고 Hoechst 및 미토트랙커로 염색하고 공초점 현미경을 사용하여 PTD-UQCRB 융합 단백질의 위치를 관찰하였다(NT: non-treated). 스케일 바, 20 ㎛.
도 5. PTD - UQCRB 의 세포 성장에 대한 생물학적 영향
세포 성장은 MTT 색도 분석법을 사용하여 HeLa 세포, HepG2 세포 및 HUVEC 세포에서 관찰하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험값의 평균±SD을 나타낸다.
도 6. 미토콘드리아 ROS 발생에 대한 PTD - UQCRB 의 효과
MitoSOX^TM으로 20분간 선-처리하고 2시간 후 PTD-UQCRB 또는 안티마이신 A로 처리한 HeLa 세포 내 미토콘드리아 ROS 레벨을 MitoSOX^TM 형광을 사용하여 측정하였다. 두시간 배양 후, 세포를 고정하고 Hoechst로 염색하였다. 이미지를 HCS 시스템 소프트웨어로 정량화하였다.
(A) 4 μM의 PTD-UQCRB로 처리한 후 미토콘드리아 ROS 탐지를 위한 형광 이미지(NT: non-treated),
(B) 한 세포의 평균 강도에 대한 막대 그래프.
(C) HCS 시스템에 의해 얻은 이미지의 정량화. 청색 원: 핵, 녹색 원: 세포질(HCS 시스템 시스템 소프트웨어는 세포의 핵을 인식하고 핵으로부터 고정된 면적을 설정하여 세포질 면적을 결정한다).
(D) 양성적 대조군으로서 10 ㎍/㎖의 안티마이신 A를 HeLa 세포에 처리하였다(NT: non-treated, Ant: antimycin A). 막대 그래프는 형광의 총 강도를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험의 평균값±SD으로 나타내었다.
도 7. HIF -1α 안정성에 대한 PTD - UQCRB 의 영향
(A) HIF-1α 단백질 레벨은 PTD-UQCRB(2 및 4 )으로 4시간 또는 12시간 동안 처리한 HeLa 세포 내 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 측정하였다(NT: non-treated). 하부 그래프는 밀도측정기로 측정한 웨스턴 블롯 분석에 대한 정량적 데이터를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험에 대한 평균값±SD으로 나타내었다.
(B) HIF-1α 단백질 레벨은 PTD-UQCRB(2 및 4 ) 및 대조군으로서 PTD-EGFP(2 및 4 )을 24시간 동안 처리한 HeLa 세포 내 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 측정하였다(NT: non-treated). 하부 그래프는 밀도측정기로 측정한 웨스턴 블롯 분석에 대한 정량적 데이터를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적 실험에 대한 평균값±SD으로 나타내었다.
도 8. PTD - UQCRB 에 의한 HRE 수용체 유전자 발현 활성의 정량적 분석
HepG2 세포는 일시적으로 HRE-루시페라제 DNA 벡터로 형질전환하였다. 세포를 PTD-UQCRB (1 및 2.5 )로 4시간 동안 처리하였다(NT: non-treated). 생물학적 활성을 비교하기 위하여 루시페라제 발광을 시험하였다. 데이터는 3개의 독립적 실험에 대한 평균값±SD으로 나타내었다.
도 9. VEGF 발현에 있어 PTD - UQCRB 의 영향
PTD-UQCRB(2 및 4 )으로 12 또는 24시간 동안 처리한 세포 내 VEGF 단백질 레벨을 웨스턴 블롯으로 분석하였다(NT: non-treated).
(A) HeLa 세포 내 VEGF 유도
(B) HepG2 세포 내 VEGF 유도
(C) 막대 그래프는 밀도측정기로 측정한 웨스턴 블롯 분석에 대한 정량적 데이터를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험값의 평균±SD을 나타낸다.
(D) PTD-UQCRB(2 및 4 ) 및 대조군으로서 PTD-EGFP(2 및 4 )으로 24시간 동안 처리한 HeLa 세포 내 VEGF 단백질 레벨을 웨스턴 블롯으로 분석하였다(NT: non-treated). 낮은 패널은 밀도측정기로 측정한 웨스턴 블롯 분석에 대한 정량적 데이터를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험값의 평균±SD을 나타낸다.
(E) HUVEC 내 PTD-UQCRB의 혈관신생에 대한 영향. HeLa 세포는 CM을 수집하기에 앞서 올 프리 배지에서 12시간 또는 24시간 동안 PTD-UQCRB(2 및 4 )로 처리하였다(NT: non-treated). HUVEC는 CM에서 16시간 배양하였고, 세포 형태를 사진 그래프화 하였다. 수집된 CM은 HUVEC의 침입을 유도하였다. 대조군 및 VEGF를 양성적 대조군으로 사용하였다.
(F) 밀도분석기를 이용한 침습 분석. 데이터는 3개의 독립적인 실험값의 평균±SD을 나타낸다.
도 10. PTD - UQCRB 기능에 대한 개략적 도식
PTD-UQCRB 융합 단백질이 세포 속을 통과할 때, 미토콘드리아 복합체 III-유래 ROS 발생이 유도된다. 미토콘드리아 ROS는 HIF 하이드록실라제인 PHD를 억제하여 HIF-1α를 안정화시킨다. 안정화된 HIF-1α는 HIF-1β와 다이머를 이룰 수 있고, 이러한 헤테로 다이머 복합체는 핵 내로 이동하여 HRE 프로모터에 결합한다. 결과적으로, VEGF와 같은 타겟 유전자가 전사되어 혈관신생을 유도할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

1. PTD - UQCRB 융합 단백질의 분자적 클로닝 , 발현 및 정제

박테리아로부터 PTD-UQCRB를 얻기 위하여, UQCRB의 PCR-증폭 전장 cDNA(accession no. NM_006294)를 pRSET-B를 포함하는 세포 투과성 단백질 도입 도메인(Hph1 domain, 연세대학교 이상규 교수 제공)의 EcoRI/XhoI 부위에 삽입하였다. PTD-UQCRB 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질전환시킨 BL21(DE3) starpLysS E. coli 균주(Invitrogen, NY, USA)를 앰피실린(50 /mL) 및 클로앰페니콜(34 /mL)을 포함하는 37℃의 LB(Luria-Bertani) 배지에서 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양하였다. 0.1 M의 IPTG(isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside)로 단백질 발현을 유도하고 세포를 16시간 동안 추가적으로 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 라이시스 완충액(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 프로테아제 억제제 칵테일 정제, pH 8.0)에 재현탁시키고, 초음파로 분쇄하였다. 그 다음 13,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하고, 상층액에 Ni-NTA 아가로스 비드(Qiagen, Hilden, Germany)를 첨가하고 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 비드와 배양한 후, 상층액을 폴리-프렙 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 걸었다. 결합단백질을 세척 완충액(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8.0)으로 씻어내고 용리 완충액(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0)으로 용리하였다. 용리된 단백질을 PD-10 세파덱스 G-25(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 탈염하고 10% 글리세롤을 보충하여 등분으로 분배한 후 -20℃에서 순간적으로 동결시켰다.

2. 세포 배양

HeLa 세포를 10% 우태아혈청(FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 보충한 DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC: Human umbilical vein endothelial cell)를 10% FBS을 보충한 내피 세포 기저 배지(EBM-2, Cambrex Walkersville, MD, USA)로 코팅된 젤라틴 플레이트에 접종하였다. HepG2 세포는 10% FBS을 보충한 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지(RPMI, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. HT1080 세포는 10% FBS을 보충한 MEM 배지(Minimum essential medium, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 상기 세포들은 5% CO₂가 공급되는 습한 배양기에서 유지배양되었다.

3. 형광 이미지화

PTD-UQCRB 위치를 모니터하기 위하여, HeLa 세포를 4 의 PTD-UQCRB와 함께 1시간 동안 배양하고 세포를 4% 포름알데하이드(Sigma, St. Louis, MO)로 고정하였다. PBS로 세정한 후, 세포를 1 ㎍/㎖ Hoechst 용액 및 0.5 ㎍/㎖ 미토트랙커(Mitotracker) 용액으로 30분 동안 공동 염색하였다. 마지막으로 세포를 증류수로 세척하고 공초점 현미경(Carl Zeiss LSM 510 META, Germany)으로 관찰하였다.

4. 세포성장분석

HUVEC는 10% FBS으로 보충한 EBM-2에서 37℃ 및 5% CO₂의 습한 대기환경에서 배양하였다. HeLa세포는 HUVEC와 동일한 조건에서 10% FBS으로 보충한 DMEM에서 배양하였다. 세포성장은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 분석법을 사용하여 측정하였다. 세포(3 x 10³ 세포/웰)를 96-웰 배양 플레이트에 접종하고 안정화를 위해 24시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 PTD-UQCRB를 각 웰에 첨가하고 2일간 배양한 후 MTT 분석을 수행하였다. 50 ㎕의 MTT(2 mg/㎖ 저장액, Sigma)를 첨가하고 플레이트를 추가적인 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 100 ㎕의 DMSO를 첨가하였다. 플레이트를 유니버설 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 540 nm에서 읽었다.

5. 미토콘드리아 ROS 의 측정

미토콘드리아 ROS 레벨을 적 미토콘드리아 수퍼옥사이드 인디케이터인 MitoSOX^TM(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 측정하였다. HeLa 세포는 현미경 커버 유리(Decklaser, Lauda-Konlgshofen, Germany) 상에서 배양하였고 1 μM의 MitoSOX^TM로 처리하였다. 37℃에서 20분간 배양한 후 세포를 PBS로 세척하고 PTD-UQCRB 처리하고 다시 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후 샘플을 1 ㎍/㎖의 Hoechst 용액으로 염색하여 핵을 시각화하였다. 세포를 PBS로 세척하고 4% 포름알데하이드로 37℃에서 15분간 고정하였다. PBS 세척 3시간 후, 샘플을 마지막으로 증류수로 세척하고, 형광 현미경(Olympus America, Inc., Melville, NY, USA)에 탑재하여 관찰하였다.

6. SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯 분석법

6-웰 플레이트에서 배양한 HeLa 세포를 용해하고, 용출액을 10% SDS-PAGE로 분리한 후 표준 전기블롯 절차에 따라 PVDF 막(Milipore, Bedford, MA)으로 이전시켰다. 블롯을 블록시키고 항-HIF-1α(BD, Bedford, MA, USA), 항-VEGF(Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA,) 및 항-튜블린(Upstate, Lake Placid, NY) 항체를 포함하는 일차 항체를 사용하여 4℃에서 밤새 면역 표지하였다. 항체 표지는 ECL(enhanced chemiluminescence) 키트(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 제조사 지시에 따라 탐지하였다.

7. HRE 수용체 유전자 분석

HepG2 세포는 10% FBS로 보충한 DMEM에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 형질전환 시약인 리포펙타민 LTX(Invitrogen, NY, USA)를 사용하여 제조사 지시에 따라 세포를 형질전환시키기 24시간 전에 세포를 6-웰 플레이트에 접종하였다. 정상 산소 조건은 5% CO₂ 조건으로 설정된 반면, 저산소 조건은 N₂-O₂-CO₂ 배양기 내에서 2% O₂ 및 5% CO₂ 조건으로 37℃에서 4시간 동안 수행되었다. 루시페라제 리포터 분석(HRE-luciferase)을 위한 리포터 플라스미드 컨스트럭트는 후토시 시바사키 박사(Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Japan)가 제공해주었다. HepG2 세포는 배양 24시간 후 0.5 ㎍ 컨스트럭트로 형질전환시키고 수집한 후 라이시스 완충액(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0.5% Triton X-100, pH 8.0)으로 용출시키고 원심분리하였다. 세포 용출액에 대하여 Steady-Glo루시페라제 분석 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하고 상기 활성을 FL600 마이크로플레이트 형광 리더(Bio-Tek Instrument, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 읽었다.

8. 침습 분석

8.0 ㎛ 공극 크기 폴리카보네이트 필터 삽입물(Corning Costar, Cambridge, MA)을 구비한 트랜스웰 챔버 시스템을 사용하여 HUVEC의 침입능력을 인 비트로에서 시험하였다. 필터의 저면은 10 ㎕의 젤라틴(1 mg/mL, Sigma, MO, USA)으로 코팅한 반면, 상층면은 10 ㎕의 매트리젤(3 mg/mL, BD, Bedford, MA, USA)으로 코팅하였다. HUVEC 세포(1x10⁵세포)를 필터의 상층면에 위치시키고 CM 배지(conditioned medium)를 저면에 적용하였다. 그 다음 챔버를 37℃에서 16시간 동안 배양하고 메탄올로 고정시킨 후 헤마톡실린 및 에오신(Sigma, MO, USA)으로 염색하였다. 필터의 저면 상에 침습한 세포를 x100 배율의 광학 현미경으로 관찰하였다.

실험결과

1 PTD - UQCRB 융합단백질의 생성.

1.1 PTD - UQCRB DNA 컨스트럭트의 유전자 클로닝

터페스타신-결합 미토콘드리아 단백질(UQCRB)의 생물학적 기능을 연구하기 위하여, 세포 투과성 UQCRB을 발현하는 DNA 컨스트럭트를 디자인하였다(도 2A). UQCRB의 전장 유전자를 단백질 전달 도메인(PTD)의 유전자를 포함하는 pRSET-B 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 상기 단백질 전달 도메인의 유전자는 그의 융합 파트너를 세포 속으로 전달할 수 있도록 세포 투과성 펩타이드(Hph1)를 인코딩한다. 또한 Ni-NTA를 이용한 단백질 정제를 위해 6x His 태그를 삽입하였고, PTD-UQCRB 융합 단백질의 세포 내 전달을 탐지하기 위하여 증진된 녹색 형광 단백질(EGFP)도 포함시켰다. PTD-UQCRB DNA 컨스트럭트가 적절하게 구성되었는지를 확인하기 위하여 이를 제한 효소인 EcoRI 및 XhoI으로 절단하였다. 그 다음 DNA 젤 전기영동을 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2A를 보면, 그 제한 효소 부위에 따라 UQCRB가 올바르게 PTD-포함 벡터 내로 삽입되었음을 확인할 수 있다. 또한 도 2B를 보면, PTD-UQCRB DNA 컨스트럭트를 시퀀싱한 결과 PTD 및 UQCRB가 완벽하게 삽입되었음을 확인할 수 있다.

1.2 PTD - UQCRB 융합 단백질의 발현 및 정제

PTD-UQCRB 융합단백질을 얻기 위하여, 단백질 발현을 위한 6개의 박테리아 균주를 시험하였다. 6개의 균주 중, 다른 균주와 비교하여 BL21 starpLysS가 PTD-UQCRB 융합 단백질의 발현에 있어 탁월한 능력을 나타냈기 때문에 상기 균주를 선택하였다(도 3A). PTD-UQCRB 융합 단백질은 그의 하이드로포빅한 성질 때문에 발현 조건을 설정하기가 까다로운 단백질이다. 이러한 PTD-UQCRB 융합 단백질 발현의 어려움에도 불구하고, BL21 starpLysS는 IPTG 유도에 의해 18 ℃의 낮은 온도에서 용해된 형태로 상기 단백질을 잘 발현해냈다. IPTG로 유도 후, 상기 배양된 E. coli 는 EGFP로 태그된 발현 단백질로 인하여 녹색 형광을 나타내었다(도 3B). 또한 세포 용출액의 상등액을 비드와 함께 2시간 배양시키자, Ni-NTA 아가로스 비드에서도 녹색 형광이 탐지되었다(도 3C). PTD-UQCRB 융합 단백질은 완충액을 포함하는 이미다졸을 사용하는 일련의 표준 정제 과정을 통하여 정제되었고 그 다음 탈염 과정을 거치었다. 이미다졸은 탈염과정을 통해 제거되었고 정제된 PTD-UQCRB 융합 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 확인한 결과 잘 발현되고 정제된 PTD-UQCRB 융합 단백질을 43 kD 밴드에서 확인할 수 있었다(도 3D).

2. PTD - UQCRB 융합 단백질의 세포내 전달

PTD-UQCRB 융합 단백질의 세포 내 기능을 분석하기 전, 그 단백질의 세포 내 이동 능력을 시험하였다. 세포 내 PTD-UQCRB 융합 단백질 위치를 결정하기 위하여, 공초점 현미경 분석법을 수행하였다. 미토콘드리아 디텍터인 Hoechst 및 미토트래커와 공동 염색한 EGFP를 사용하여, HT1080 세포 내 PTD-UQCRB 융합 단백질의 막투과 능력을 관찰하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, PTD-UQCRB 융합 단백질로 처리한 샘플에서 1시간 이내에 녹색 형광이 탐지되었는데, 이는 대조군과 비교되는 것이다. 상기 결과는 PTD-UQCRB 융합 단백질이 세포 속으로 전달될 수 있음을 의미한다.

놀랍게도, 녹색 형광은 핵보다는 세포질 내에서 주로 탐지되었다. Hph1 PTD은 본래 그의 융합 파트너를 BBB(blood-brain barrier)를 포함하는 모든 세포막을 통과시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기와 같은 현상은 UQCRB의 특성에서 비롯된 것이다. 앞서 언급한 바와 같이, UQCRB는 핵에 인코딩되어 있으며 미토콘드리아 복합체 III의 한 구성요소이다(2). 이는 UQCRB가 미토콘드리아-타겟 서열을 가질 수 있음을 의미하며, 실제 MitoProt Ⅱ± 1.0a4 소프트웨어에 의할 때 UQCRB를 구성하는 총 111개의 아미노산 중 이들 서열로 예측되는 1-35개의 아미노산이 미토콘드리아 타겟 시그날로서의 역할을 할 가능성이 크다. 이러한 점에서 PTD-UQCRB 융합 단백질은 미토콘드리아를 향하는 것이며, 본 발명의 미토트래커를 사용한 미토콘드리아와의 공동 염색 결과는 이러한 가능성을 확인해 주었다.

3. 세포 성장에 대한 PTD - UQCRB 융합 단백질의 영향

PTD-UQCRB 융합 단백질의 세포 내 활성을 조사하기 앞서, PTD-UQCRB 융합 단백질이 세포 성장에 미치는 영향을 체크하는 것이 중요한데, 만일 상기 융합 단백질이 세포에 독성을 나타낸다면 이를 실제 세포에 적용하기 곤란하기 때문이다. PTD-UQCRB 융합 단백질의 세포 성장에 대한 영향을 시험하기 위하여, 다양한 포유류 세포주에 대하여 MTT 색도 분석을 수행하였다. 3가지 다른 농도의 PTD-UQCRB 융합 단백질을 세포에 처리하고 2일간 배양한 다음 MTT 분석을 수행하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과 PTD-UQCRB 융합 단백질의 도입은 세포 성장에 그 어떠한 중대한 영향도 나타내지 않았다.

4. 미토콘드리아 ROS 발생에 대한 PTD - UQCRB 의 영향

UQCRB을 타겟으로 하는 작은 분자인 터페스타신은 저 산소 조건에서 미토콘드리아 ROS 발생을 억제하고 및 HIF-1α 안정성을 저해하는 것으로 알려져 있다(Jung et al . manuscript in submission). 저 산소 조건하 세포 내 ROS 발생은 일차적으로 미토콘드리아 호흡 체인의 복합체 III에 의한 것이다. UQCRB가 터페스타신의 타겟일 뿐만 아니라 미토콘드리아 호흡 체인의 복합체 III의 서브유닛이기도 하기 때문에, 본 발명자들은 PTD-UQCRB의 도입이 ROS 발생시키고 HIF-1α 안정성에 영향을 줄 것이라는 가설을 세우고 이를 실험을 통해 확인해 보았다.

본 발명자들은 PTD-UQCRB가 복합체 III-유래 ROS 발생을 변경시키는지 여부를 시험하기 위하여, HeLa 세포의 미토콘드리아 ROS을 적 미토콘드리아 수퍼옥사이드 지시자인 MitoSOX^TM를 사용하여 결정하였다. 미토콘드리아 내에서 MitoSOX^TM시약은 미토콘드리아 수퍼옥사이드에 의해 산화되어 붉은 형광색을 나타낼 수 있다. 실험 결과, 태그된 EGFP에 의한 녹색 형광에 의해, PTD-UQCRB가 세포 내로 운반된 것을 확인 할 수 있었다(도 6A). PTD-UQCRB 전달은 증가된 적색 형광에 의해 표시되는 것과 같이 미토콘드리아 ROS 레벨의 증가를 유발하였다. 게다가, PTD-UQCRB 농도가 증가함에 따라 미토콘드리아 ROS 레벨도 증가하는 것이 관찰되었다(도 6B). 또한, 산화적 스트레스를 유발하는 소분자인 안티마이신 A도 대조군과 비교하여 세포 내 ROS 레벨을 증대시켰다. 결국, PTD-UQCRB가 복합체 III-유래 ROS 발생을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었다.

5. HIF -1α 안정성에 대한 PTD - UQCRB 의 영향

세포 내 ROS가 증가하면 HIF-1α의 안정도가 증진되고 VEGF의 발현이 유도된다. 또한, 미토콘드리아에서의 저 산소-유도 ROS 생성은 저 산소-의존성 HIF-1α 축적을 위해 필요충분하다(6 및 23-27). 따라서, 본 발명자들은 HeLa 세포 내 HIF-1α 안정성에 대한 PTD-UQCRB의 영향을 조사하였다. 정상 산소 조건 하 HIF-1α 단백질은 자연적으로 분해되지만, HeLa 세포 내로 PTD-UQCRB을 4시간 동안 도입한 결과 양 의존적으로 HIF-1α 단백질이 축적되었다(도 7A). 그러나, PTD-UQCRB 처리 12시간 후에는 4시간 후와 비교하여 HIF-1α 단백질이 덜 유도되는 것으로 관찰되었다.

HIF-1α 안정성에 대한 PTD-UQCRB의 신규한 생물학적 활성을 밝히기 위하여, UQCRB를 결여한 PTD-EGFP를 대조군으로서 사용하였다(도 7B). 기대한 바와 같이 PTD-UQCRB가 HIF-1α 단백질을 현저하게 안정화 시킨 반면, PTD-EGFP는 HIF-1α 안정성에 대한 그 어떠한 영향도 나타내지 않았다.

HIF-1 활성화 과정은 다단계로 이루어지기 때문에, HIF-1 복합체의 HIF-1 반응성 프로모터에 대한 결합은 HIF-1α 단백질 안정성과 함께 고찰되어야 한다. 이를 시험하기 위하여, 저산소-반응성 요소(HRE) 리포터 유전자 분석법을 HepG2 세포를 사용하여 수행하였다(도 8). HRE-루시페라제 DNA 벡터로 일시적으로 형질전환시킨 세포로의 PTD-UQCRB 도입은 저산소 조건과 동일한 정도의 높은 활성을 유도하였다. 이러한 결과는 정상 산소 조건 하에서 미토콘드리아 ROS에 의한 HIF-1α 안정화로 인해 HIF-1β와의 다이머 형성이 촉진되고, 활성화된 전사 복합체를 형성시켜 이들이 핵 내로 전달되어 HIF-1 반응성 프로모터에 결합함으로써 VEGF와 같은 다운스트림 유전자를 발현하게 할 수 있음을 암시한다. 아래에서는 이를 실험을 통해 확인해보았다.

6. 정상 산소 조건 하 VEGF 발현에 대한 PTD - UQCRB 융합 단백질의 영향

이전에 언급한 바와 같이 HIF-1α의 안정화는 HIF-1α 타겟 유전자의 중대한 조절 단계이다. VEGF는 HIF-1α의 주요 타겟이고 저산소-유도성 혈관신생에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 그러므로, VEGF 발현에 대한 PTD-UQCRB의 영향을 HeLa 세포(도 9A) 및 HepG2 세포(도 9B)에 대하여 분석하였다. 두 세포주 모두에 대하여 PTD-UQCRB의 전달은 양-의존적으로 VEGF 단백질 레벨을 증가시켰으며, 이는 대조군과 대비되는 것이다(도 9C).

VEGF 유도에 대한 PTD-UQCRB의 신규한 생물학적 활성을 확인하기 위하여, UQCRB를 결여한 PTD-EGFP을 대조군으로서 사용하였다(도 9D). 그 결과 PTD-UQCRB는 현저하게 VEGF를 유도한 반면, PTD-EGFP는 VEGF 발현에 그 어떠한 중요한 영향도 나타내지 않았다.

그 다음, PTD-UQCRB의 혈관 신생 활성을 조사하기 위하여, 각각의 배양 조건에서 배양된 HeLa 세포로부터의 CM(conditioned medium)을 수집하여 인 비트로 혈관신생 분석을 수행하였다(도 9E). 올 프리 배지 내 CM을 여과로 농축하여 증류수에 준비하였다. PTD-UQCRB와 함께 배양된 HeLa 세포로부터의 CM는 HUVEC의 침습을 강하게 활성화시켰다. 결국 상기 데이터들은 PTD-UQCRB가 UQCRB의 생물학적 기능을 탐구하는데 있어 효율적인 도구임을 명백히 나타내고 있다.

추가논의

본 발명자들은, 세포 내 UQCRB 전달을 달성하기 위하여 신규한 PTD-UQCRB 융합 단백질을 구성하였다. 그리고, 미토콘드리아 복합체 III에 대한 세포 내 활성을 측정하기 위하여, 정제된 PTD-UQCRB를 세포에 처리하였다. 항-혈관신생 인자 터페스타신의 타겟 단백질인 UQCRB는 미토콘드리아 복합체 III의 구성요소이기 때문에, PTD-UQCRB의 도입은 혈관신생을 유도할 것으로 기대되었다. 실제로, PTD-UQCRB 처리는 미토콘드리아 수퍼옥사이드의 발생을 유도하고, HIF-1α의 안정성 또한 증진시켰다. 게다가, PTD-UQCRB 도입은 인 비트로에서 VEGF의 발현 및 HUVEC의 침습을 유도하였다. 상기 실험결과들을 종합해보면, PTD-UQCRB 융합 단백질이 세포 속을 통과할 때 미토콘드리아 복합체 III-유래 ROS 발생이 유도되며, 이렇게 발생된 미토콘드리아 ROS는 HIF 하이드록실라제인 PHD를 억제하여 HIF-1α를 안정화시키고, 안정화된 HIF-1α는 HIF-1β와 다이머를 이룰 수 있고, 이러한 헤테로 다이머 복합체는 핵 내로 이동하여 HRE 프로모터에 결합하여 결과적으로, VEGF와 같은 타겟 유전자가 전사되어 혈관신생을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었다(도 10). 이러한 발견은 혈관신생 증진으로 인한 상처 치료 또는 당뇨병 마우스 모델에서의 사지 형성과 같은 치료적 적용에까지 확장될 수 있다. 또한 PTD-UQCRB의 특이적인 생물학적 활성을 더욱 깊이 확인하기 위해, 터페스타신과 함께 PTD-UQCRB를 세포에 처리한 후 HIF-1α 안정성 및 VEGF 발현의 변화를 탐지하는 추가 연구가 가능할 것이다.

결론적으로, 본 발명의 모든 연구 결과는 PTD-UQCRB가 UQCRB의 세포 내 활성을 시험 할 수 있는 의미 있는 수단일 수 있음을 제시한다. 게다가, 상기 결과들은 혈관신생과 관련 있는 ROS 발생을 매개하는 PTD-UQCRB의 미토콘드리아에 대한 작용에 대한 통찰을 제공할 것이며 생물학적으로 활성 있는 단백질 개발을 위한 PTD 적용에 대해 새로운 기초를 열 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

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서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질 전달 도메인(PTD) 및 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)를 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드.
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(a) 단백질 전달 도메인(PTD)을 코딩하는 서열목록 제 4 서열의 뉴클레오타이드; 및
(b) 인간 UQCRB(Ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein)를 코딩하는 서열목록 제 3 서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 발현 벡터.
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다음의 단계를 포함하는 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 생산하는 방법:
(a) 숙주세포를 제 5 항의 발현 벡터로 형질전환 시키는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드를 수집하는 단계.
(a) 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로 구성된 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드의 약제학적 유효량 ; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
삭제
제 9 항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 PTD-UQCRB 융합 폴리펩타이드는 혈관신생을 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.