KR102178945B1 - 암 모델 및 관련 방법 - Google Patents

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Abstract

포도당 저하 활성 및/또는 항비만 활성을 갖는 섬유아세포 성장인자(FGF) 19 변이체 폴리펩타이드가 유리한 종양학 관련 프로파일도 나타내는지를 측정하는데에 유용한 모델, 이와 관련된 방법 및 용도가 제공된다. 또한 대상체에서의 FGF19의 발암활성의 길항방법이 제공되고, 특정 실시양태에서는 질병, 장애 또는 병태, 예를 들어 FGF19 의존성 질병, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상을 예방하거나 치료하는 방법도 제공된다.

Description

암 모델 및 관련 방법{CANCER MODELS AND ASSOCIATED METHODS}
본원은 2013년 10월 28일에 출원된 미국 특허원 제61/896,473호, 2013년 12월 31일에 출원된 미국 특허원 제61/922,586호 및 2014년 10월 22일에 출원된 미국 특허원 제62/067,273호를 우선권으로 주장하며, 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 도입된다.
본 발명은 무엇보다도 포도당을 저하시키는 활성을 갖는 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor: FGF)의 폴리펩타이드 변이체가 유리한 종양학 관련 프로파일도 나타내는지를 측정하는데에 유용한 모델, 이와 관련된 방법 및 용도에 관한 것이다. 또한 본원은 대상체에서의 FGF19의 발암활성(oncogenic activity)의 길항방법을 제공하고, 특정 실시양태에서는 질병, 장애 또는 병태, 예를 들어 FGF19 의존성 질병, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상을 예방하거나 치료하는 방법도 제공한다.
당뇨병은, 인슐린을 식사 후의 방출을 위해 생산하고 저장하는 내분비 세포인 췌장 β 세포로부터의 인슐린 생산의 부재(타입 1), 또는 인슐린 내성 또는 불충분한 인슐린 생산(타입 2)에 의해 야기되는 쇠약하게 만드는 대사 질환이다. 고혈당 수준은 췌장 β 세포에 의한 인슐린의 분비를 자극한다. 인슐린은 결국 포도당의 근육 및 지방세포로의 유입을 자극하여 글리코겐 및 트리글리세라이드의 축적 및 단백질 합성을 야기한다. 다양한 세포 종류에서의 인슐린 수용체의 활성화는 포도당 흡수 및 이용을 증가시킴으로써 및 간 포도당 배출을 감소시킴으로써 순환 포도당 수준을 감소시킨다. 이 조절 네트워크내에서의 장애는 당뇨병 및 관련된 병리학적 상태를 초래할 수 있다.
포도당 대사 장애를 갖는 개체는 고혈당증, 고인슐린혈증 및/또는 포도당 불내성과 다수의 관련 장애로 고통받을 수 있다. 예를 들어, 보통 포도당 및/또는 인슐린의 이상 수준과 관련된 장애인 인슐린 내성은 간, 지방 및 근육 세포가 정상 혈중 인슐린 수준에 반응하는 능력을 상실하는 것이 특징이다. 이러한 포도당 대사 장애는 전 세계적으로 많은 그리고 증가하는 개체에 악영향을 준다.
제한된 에너지 소비 및/또는 운동 결여와 함께 과잉의 식품 섭취에 의해 가장 흔히 야기되는 비만은 보통 다양한 포도당 대사 장애를 동반한다. 비만은 개체에서 당뇨병, 고혈압, 아테롬성 동맥경화증, 관상 동맥 질환, 통풍, 류머티즘 및 관절염과 같은 다양한 질환이 일어날 가능성을 증가시킨다. 게다가, 사망 위험은 비만과 직접적으로 연관성이 있어서, 예를 들어, 40 이상의 체질량지수는 평균 기대수명을 10년 이상 감소시킨다.
특정한 약리학적 치료 방식이 다양한 정도로, 포도당 항상성 및 항비만 활성 둘 다를 나타낸 바 있다. 불행히도, 이러한 방식은 흔히 심각하고 자주 쇠약하게 하는 역효과와 연관된다.
현행 치료 옵션의 단점과 함께 당뇨병, 비만, 및 관련된 대사 및 비대사 장애의 만연 및 심각성을 고려할 때, 대안적 치료 방식이 필요하다.
비만 수술이 당뇨병에 대한 대안적인 비약리학적 치료로서 제안되어 왔다. 수술 후 창자 호르몬 분비의 변화가 당뇨병 상태의 해소를 책임지고 있는 것으로 가정되었다. 사람에 있어 섬유아세포 성장인자(FGF) 19의 혈청 수준은 위 우회로조성술(gastric bypass surgery) 후에 증가된다. FGF19는 말단 소장에서 고도 발현되고, FGF19의 형질전환 과발현은 포도당 항상성을 개선시킨다(Tomlinson, E. (2002) Endocrinology 143(5):1741-47). FGF19의 증가된 발현 및 분비는 수술 후 관찰되는 당뇨병의 차도를 적어도 부분적으로 설명할 수 있다.
FGF19에 의한 바람직한 대사 효과(예를 들어, 혈당 저하 효과)에도 불구하고, FGF19 수준을 증가시키는 치료(예를 들어, FGF19 발현의 증강 또는 외인성 FGF19의 투여를 통한 치료)는 간세포 암종(HCC)의 유도와 연관된다. 따라서, HCC와 같은 암 병태를 유도하지 않으면서 FGF19의 유리한 특성을 갖는 작용제를 찾기 위한 노력이 계속 진행중이다. 본 기재는 부분적으로 동물 모델 및 관련 방법을 기초로 하여 후보 작용제가 이러한 속성을 갖는지, 또한 대상체가 이러한 치료를 위한 실행가능한 후보인지를 정확하고 효율적으로 측정하는 것을 지원한다.
추가의 실시양태에서, 대상체의 치료 용도 또는 방법은 감소된 혈당, 증가된 인슐린 민감도, 감소된 인슐린 내성, 감소된 글루카곤, 포도당내성, 포도당 대사 또는 포도당 항상성의 개선, 개선된 췌장 기능, 또는 감소된 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 중밀도 지단백(IDL), 저밀도 지단백(LDL) 또는 초저밀도 지단백(VLDL), 또는 혈압의 감소, 혈관 내막 비후의 감소 또는 체질량 또는 체중 증가의 감소를 의도하거나 초래한다.
하나의 실시양태에서, 본 기재는 a) 대사 장애를 갖는 시험 대상체에 FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 공동투여하고, 시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하며, b) 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 관찰되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 부재는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보임을 나타내는, 대사 장애를 갖는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 고려한다.
본원에 사용된 용어 "FGF19 대용품"은 FGF19와 동일하거나 유사한 효과를 끌어낼 수 있는 임의 분자(예를 들어, 폴리펩타이드)를 포함하고자 하며, 상기 효과는 일반적으로 암과 관련된 것이다(예를 들어, 종양 생성의 유도 또는 암성 병태의 기타 임의 징후). FGF19 대용품은 주로, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 하나의 약 150개의 아미노산 내지 약 160개의 아미노산, 약 160개의 아미노산 내지 약 170개의 아미노산, 약 170개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 180개의 아미노산 내지 약 190개의 아미노산, 또는 약 194개 이상의 아미노산의 인접한 스트레치와 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 93% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열이 동일한 활성 단편을 포함하는 FGF19 변이체이다.
본 발명에서, "암성 병태의 징후"는 넓게는 암성 질환, 장애 또는 병태가 생성되었거나, 생성되고 있거나 생성될 가능성이 있는 임의 징후를 말한다. 대부분의 암은 초기에는 징후 또는 증상의 출현으로 인해 또는 선별을 통해 인식된다. 최종 진단은 보통 다른 수단들보다도 조직 샘플, 혈액 시험, x선, CT 스캔 및 내시경검사의 병리학적 검사 중 하나 이상을 필요로 한다. 암성 병태는 암종, 육종, 림프종, 백혈병 및 모세포종을 포함한, 암의 종류 또는 분류를 말한다.
암 질환, 장애 및/또는 병태가 체중 감소 또는 피로와 같은 보다 일반적인 증상을 일으킬 수 있더라도, 암 증상은 대개 암이 생성되는 신체 일부에서의 암의 영향에 의해 일어난다(예를 들어, 유방의 이상 종괴, 피부에서의 사마귀(mole)의 변화). 본원에 기재된 방법 및 모델에서, 암성 병태(또는 장애 또는 질환)의 징후는 주로 종양(예를 들어, 결장 종양 또는 간 종양)이다. 종양 수, 종양 크기 또는 종양 중량의 감소의 관찰 및 측정은 흔히 치료 양식이 긍정적인 효과를 갖고 있음을 가리킨다.
특정 실시양태에서, 암성 병태의 징후는 간암의 가장 일반적 유형인 간세포 암종(HCC, 악성 간암으로도 불림)과 관련된다. HCC는 황달, 복수로 인한 고창(bloating), 혈액응고 이상으로 인한 빈번한 타박상, 식욕 부진, 체중 감소, 복통, 구역질, 구토 또는 피로와 함께 존재한다. HCC는 이후 추가로 논의한다.
다른 실시양태에서, 본 기재는 a) 암성 병태의 징후를 갖고 대사 장애를 갖는 시험 대상체를 제공하고, b) FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고, 시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하며, c) 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 증가되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 증가의 부재는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보임을 나타내는, 대사 장애를 갖는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 고려한다.
추가 실시양태에서, 본 기재는 a) 암성 병태의 징후를 갖고 대사 장애를 갖는 시험 대상체를 제공하고, b) FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고, 시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하며, c) 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 감소되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 감소는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보임을 나타내는, 대사 장애를 갖는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 고려한다.
본 기재는 또한 대사 장애를 갖는 시험 대상체에 FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 공동투여하고, 시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하며, 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 관찰되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 부재는 FGF19 변이체가 시험 대상체의 치료를 위한 후보임을 나타내는, FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 시험 대상체의 치료를 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 고려한다.
본원에 고려된 다른 실시양태는 대사 장애를 갖고 암성 병태의 징후를 갖는 시험 대상체를 제공하고, FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고, 시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하며, 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 증가되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 악화의 부재는 FGF19 변이체가 시험 대상체의 치료를 위한 후보임을 나타내는, FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 시험 대상체를 치료하기 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 도출한다. 특정 실시양태에서, 암성 병태의 징후 중 하나 이상이 시험 대상체에서 감소된다.
다른 추가 실시양태에서, 본 기재는 대사 장애를 갖는 대상체를 제공하고(상기 대상체는 FGF19 유도된 암성 병태(FGF19-induced cancerous condition)의 징후를 나타낸다), 본원에 기재된 바와 같은 후보 FGF19 변이체 폴리펩타이드의 풀로부터 확인된 FGF19 변이체의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 대사 장애가 개선되는, 대사 장애를 갖는 대상체를 치료(또는 특정 환경에서는 예방)하는 방법을 고려한다.
위에서 시사한 바와 같이, 본 기재는 또한 다양한 모델을 고려한다. 한 실시양태는 FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 대상체에서 암성 질환, 장애 또는 병태를 예방하기 위한 후보인지를 측정하기 위한 모델에 관한 것이고, 상기 모델은 i) 유효량의 FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여 전에 암성 병태의 징후를 나타내지 않고 ii) FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여 후에 암성 병태의 징후를 나타내는 대상체를 포함하고; 암성 병태의 징후는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 유효량의 투여시에 개선된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
본 기재는 또한 FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 대상체에서 암성 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 후보인지를 측정하기 위한 모델을 고려하며, 상기 모델은 FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여로부터 야기되는 암의 징후 중 하나 이상을 갖는 대상체를 포함하고; 암의 징후는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 유효량의 투여시에 개선된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
제한되지는 않지만, 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 본 기재의 방법 및 모델에서 M70(서열 번호 1)이다. FGF19 변이체는 후보 FGF19 변이체 폴리펩타이드의 풀로부터 확인될 수 있고, 확인된 FGF19 변이체는, 예를 들어, 고혈당 병태(예를 들어, 당뇨병), 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 대사증후군, 비만 또는 바람직하지 않은 체질량의 병태 중 하나 이상을 개선시킨다. 대사성 장애, 질환 및 병태의 추가 예는 아래에 기재된다.
본원에 기재된 방법 및 모델의 특정 실시양태에서, 대상체(예를 들어, 시험 대상체)는 마우스(예를 들어, db/db 마우스)와 같은 동물(예를 들어, 설치류 또는 원숭이)이다. 상기 용어가 사용되는 문맥에 따라, 대상체는 사람일 수도 있다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 샘플군에서의 성숙 FGF19의 수준에 비해 증가된 수준의 성숙 FGF19를 갖고, 여기서 샘플군은 기준선, 참조용 등으로서 유용한 임의 그룹의 멤버일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 성숙 FGF19의 증가된 수준은 과발현때문이다.
몇몇 실시양태에서, FGF19 또는 FGF19 대용품 및/또는 FGF19 변이체는, 예를 들어 탐지, 정제 등을 용이하게 하기 위해 표지된다. 특정 실시양태에서, FGF19 또는 FGF19 대용품 및/또는 FGF19 변이체는 공유 결합을 통해 표지된다. 숙련가에게 상이한 유형의 표지 및 이의 용도는 친숙하다. 표지화는 폴리펩터이드의 N 말단 및/또는 C 말단에서 가장 빈번히 일어나지만, 폴리펩타이드 내에서도 일어날 수 있다. 본 기재는 생체내(in vivo), 시험관내(in vitro) 등에서 수행될 수 있는 임의의 직접적 및 간접적 표지화 기술의 사용을 고려한다.
본 기재의 방법 및 모델에서, 암성 병태, 장애 또는 질환의 징후를 측정하는 것과 관련된 단계들을, 암성 병태, 장애 또는 질환 자체가 분명해져서 탐지할 수 있는 임의 시점에서 수행할 수 있다. 예로서, 상기 측정은 전술한 공동투여 단계 후 3개월 이상, 20주 이상, 6개월 이상, 9개월 이상 또는 12개월 이상이 지나 발생할 수 있다. 특정 실시양태에서, FGF19가 FGF19 변이체와 공동투여된다.
본 기재는 또한 FGF19의 발암활성의 길항방법을 고려한다. 특정 실시양태에서, 본원은 치료적 유효량의 FGF19 변이체를 대상체에 투여함으로써 대상체에서의 FGF19의 발암활성을 길항시키는 것을 포함하는, 대상체에서의 FGF19의 발암활성의 길항방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 대사 장애 및/또는 암성 병태의 징후를 갖는다.
본 기재는 또한 치료적 유효량의 FGF19 변이체를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 대상체에서의 FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태가 예방되거나 치료되는, 대상체에서의 FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태의 예방 또는 치료 방법을 고려한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서의 상기 질환, 장애, 병태 또는 증상이 개선된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 대사 장애 및/또는 암성 병태의 징후를 갖는다. 특정 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 암 또는 종양이다. 몇몇 실시양태에서, 암 또는 종양은 간암 또는 간 종양이다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 결장암 또는 결장 종양이다. 다른 실시양태에서, 암 또는 종양은 전립선암 또는 전립선 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 암 또는 종양은 폐암 또는 폐 종양이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 예방 또는 치료가 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 1(M70)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩타이드이다.
도 1은 성숙 사람 FGF19의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 플래그 에피토프(flag epitope)에 상응하는 아미노산 잔기에 밑줄을 그었다.
도 2는 AAV 매개된 유전자 전달 후 5주에 ELISA db/db 마우스를 사용해 측정한 혈장 FGF19 농도를 도시한 것이다(대조군으로서의 GFP; FGF19; M70).
도 3은 AAV 매개된 유전자 전달 후 24주에 GFP; FGF19-플래그; 및/또는 M70에 연속 노출시킨 후 db/db 마우스에서의 간 종양결절의 총 생성을 도시한 것이다.
도 4는 AAV 매개된 유전자 전달 후 GFP; FGF19-플래그; 및/또는 M70에 연속 노출시킨 후 db/db 마우스에서의 주사 전, 및 주사 후 3주, 5주 및 23주에 측정한 체중에 대한 영향을 도시한 것이다.
도 5는 AAV 매개된 유전자 전달 후 GFP; FGF19-플래그; 및/또는 M70에 연속 노출시킨 후 db/db 마우스에서의 주사 전, 및 주사 후 3주, 5주 및 23주에 측정한 포도당 농도에 대한 영향을 도시한 것이다.
도 6a 내지 6e는 간세포 전이유전자(transgene)의 연구를 위한 AAV 매개된 전이유전자 시스템을 도시한 것이다. 도 6a: 실험 프로토콜의 다이아그램. 6 내지 12주령의 마우스에게 AAV-FGF19의 3×1011 유전체 복제물(genomic copy)을 꼬리 정맥을 통해 단일 주사하였다. 마우스를 간 종양 분석을 위헤 24주 또는 52주에 희생시켰다. ITR(inverted terminal repeat): 역 말단 반복부위; EF1α(elongation factor 1 promoter): 스트레치(stretch) 인자 1α 촉진자. 도 6b: AAV-FGF19를 투여한지 24주 후의 db/db 마우스의 대표적인 간. 간 표면으로부터 돌출된, 주변보다 높은 다수의 대형 종양이 FGF19를 발현하는 db/db 마우스에서 관찰되었다. 이 실험에서 대조용 바이러스(AAV-GFP)가 주사된 동물에서는 어떠한 간 종양도 관찰되지 않았다. 기준자는 10mm. 도 6c: db/db 마우스(n=5)에 AAV를 투여한지 1, 4, 12 및 24주에 ELISA에 의해 측정된 FGF19의 혈청 수준. 모든 값은 평균±SEM을 나타낸다. 도 6d: FGF19 전이유전자를 발현하는 db/db 마우스에서의 간 종양 수, 크기 및 스코어. 간마다 종양수를 계수하고 최대 종양 크기를 측정하였다. 각 그룹의 평균을 수평선으로 표시한다(그룹당 n=15, 각각의 도트는 개별 동물을 나타낸다). 모든 값은 평균±SEM을 나타낸다. ***p<0.001, *p<0.05는 양방 t 시험에 의한 대조군 대비 유의적 차이를 나타낸다. 도 6e: db/db 마우스에서의 FGF19 유도된 간 종양의 조직학적 및 면역조직화학 특징. 칼럼들은 위로부터 아래로 간 절단면의 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색; Ki-67의 면역조직화학적 검출, PCNA, 글루타민 합성효소 및 β-카테닌을 나타낸다. FGF19 유도된 종양 세포는 글루타민 합성효소에 강한 양성이다. 종양(T)은 점선으로 나타냈다. 기준자는 100㎛.
도 7a 내지 7h는 db/db 마우스를 24주 동안 연속 노출시킨 후의, 종양 비함유 FGF19 변이체인 M70을 도시한 것이다. 도 7a는 N-터미널 부위에서의 M70 및 FGF19의 단백질 서열의 배열이다. M70에 도입된 돌연변이에 밑줄을 그었다. 도 7b 내지 7f는 24주 동안 FGF19 또는 M70을 발현하는 db/db 마우스(그룹당 n=5)의 간마다의 종양수(도 7b), 간 중량(도 7c) 및 체중에 대한 간의 비율(도 7d)을 도시한 것이다. 성장 곡선(도 7e) 및 전이유전자 발현의 혈청 수준(도 7f)도 또한 측정하였다. 도 7g: 전이유전자 발현 24주 후의 db/db 마우스로부터의 대표적인 간 절단면. 간 패널 칼럼들은 위로부터 아래로 간 조직 절단면의 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색; Ki-67의 면역조직화학적 검출 및 글루타민 합성효소를 나타낸다. 종양(T)은 점선으로 나타냈다. 기준자는 100㎛. 도 7h: 연구 종결 전 측정한 간 효소의 혈청 수준(ALKP: 알칼리성 포스파타제; ALT: 알라닌 아미노트랜스퍼라제; AST: 아스파타제 아미노트랜스퍼라제; 그룹당 n=5). 모든 값은 평균±SEM을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001은 일원 ANOVA에 이은 던넷(Dunnett) 포스트 시험에 의한 대조군 대비 유의적 차이를 나타낸다. 표 3 및 4를 또한 참조한다.
도 8a 내지 8g는 52주 동안 M70으로 처리된 rasH2 마우스에서의 간 종양 무생성을 도시한 것이다. 도 8a 내지 8e는 52주 동안 FGF19 또는 M70 전이유전자를 발현하는 rasH2 마우스(그룹당 n=9)의 성장 곡선(도 8a), 간마다의 종양수(도 8b), 간 중량(도 8c), 간 대 체중 비율(도 8d) 및 M70 또는 FGF19의 혈청 수준(도 8e)을 도시한 것이다. 도 8f: AAV를 투여한지 52주 후 간을 수집하고 H & E 또는 FGF19 유도된 간 종양의 마커인 항글루타민 합성효소로 염색한 것을 나타낸 것이다. 글루타민 합성효소로 염색된 절단면을 H & E로 염색된 짝을 이루는 절단면 부근에서 취했고 이들은 동일한 간문맥(p) 및 중심정맥(c)을 보였다. 종양(T)은 점선으로 나타냈다. 기준자는 100㎛. 도 8g: 간에서의 Ki-67 및 AFP 발현의 qRT-PCR 분석. 풍부한 mRNA를 GAPDH 발현으로 정상화하였다. 모든 값은 평균±SEM을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001은 일원 ANOVA에 이은 던넷 포스트 시험에 의한 대조군 대비 유의적 차이를 나타낸다.
도 9a 내지 9g는 시함관내 FGFR4의 M70 결합 및 활성화를 도시한 것이다. 도 9a: 유동 세포에 부동화된 FGF19와 FGFR4-Fc 키메릭 단백질 간의 상호작용의 Biacore SPR 분석. 왼쪽 칼럼은 FGF19 농도(2배 희석시 15.62 내지 2000nM) 범위에 걸쳐 수득된 결합 곡선을 나타내는 반면, 오른쪽 칼럼은 KD 값을 수득하기 위한 데이터의 정상상태를 나탄내다. 도 9b: Biacore에 의한 M70의 FGFR4로의 결합. 도 9a와 유사한 절차를 사용하였다. 도 9c: M70 또는 FGF19의 FGFR4-KLB 수용체 복합체로의 고체상 결합. 결합된 리간드를 바이오티닐화 FGF19-특이적 다클론 항체를 사용하여 검출하였다. 도 9d: KLB의 존재 또는 부재하에 FGFR4로 일시적으로 형질감염된 L6 세포에서의 M70 또는 FGF19를 사용한 자극 후의 상대적 루시퍼라제 활성. 도 9e: M70이 Hep3B 세포에서 ERK 인산화반응을 유도한다. 도 9f: M70이 마우스, 래트 및 사람 기원의 원발성 간세포에서의 Cyp7α1 발현을 억제하였다. 간세포에서의 Cyp7α1 mRNA의 상대적 발현을 qRT-PCR로 측정하였고 18S RNA(마우스 및 래트) 또는 액틴(사람) mRNA 수준으로 정상화하였다. 도 9g: 마우스에서 M70에 의한 간 Cyp7α1 발현의 억제. 12주령의 db/db 마우스에 재조합 M70 또는 FGF19 단백질을 복막내 주사하였다. 마우스를 투여한지 4시간 후 안락사시키고 간 Cyp7α1 발현을 qRT-PCR로 평가하였고 18S RNA 발현으로 정상화하였다. 마우스에서의 Cyp7α1 억제의 용량 반응 곡선을 도시하였다. 모든 값은 평균±SEM을 나타낸다.
도 10a 내지 10c는 생체내 M70 및 FGF19에 의한 세포 신호화 경로의 차등 활성화를 도시한 것이다. 도 10a: 복막내로 염수와 함께, 1mg/kg FGF19 또는 1mg/kg M70 단백질이 주사된 db/db 마우스(그룹당 n=6)로부터 주사된지 2시간 후 간을 수확하였다. 간 용해물을 제시된 단백질의 발현 및 인산화반응을 위해 웨스턴 블롯(Western blot)으로 검사하였다. 각각의 레인은 개별 마우스를 나타낸다. Rab11이 부하 대조군으로 제공된다. 간 STAT3이 M70이 아니라 FGF19에 의해 활성화됨을 주목한다. 도 10b: FGF19로 처리된 마우스는 IL-6(STAT3 유도자)의 상승된 발현을 나타냈다. 도 10a에서와 같이 db/db 마우스로부터 간을 수확하였다. 간의 IL-6 mRNA 양을 qRT-PCR로 측정하였고 GAPDH 발현으로 정상화하였다. 결과를 염수 처리된 동물에 대해 배(fold)로 표시하였다. 표시된 결과는 조건당 5마리의 개별 마우스에 대한 것이다. 동일한 동물로부터의 간 용해물을 면역블롯팅한 STAT3 인산화반응 상태를 아래쪽 패널에 나타냈다. 도 10c: FGF19 또는 M70 전이유전자를 발현하는 AAV 벡터의 투여 후 52주에 rasH2 마우스에서의 STAT3 표적 유전자(서비빈(survivin), Bcl-XL 및 사이클린 D1)에 대한 mRNA의 발현을 나타내는 qPCR. 모든 값은 평균±SEM을 나타낸다. **p<0.01, ***p<0.001은 일원 ANOVA에 이은 던넷 포스트 시험에 의한 대조군 대비 유의적 차이를 나타낸다.
도 11a 내지 11j는 M70이 db/db 마우스 및 이종 이식 모델에서의 FGF19 의도된 종양을 억제하는 것을 도시한 것이다. 도 11a 내지 11d: 11주령의 마우스에 AAV-FGF19(3×1010 유전체 복제물)를 M70(3×1011 유전체 복제물)의 존재 또는 부재하에 주사하였다. 간 종양 스코어(도 11a), 간 중량(도 11b), 체중에 대한 간의 비율(도 11c) 및 전이유전자 발현의 혈청 수준(도 11d)을 24주 후에 측정하였다. *p<0.05는 일원 ANOVA에 이은 던넷 포스트 시험에 의한 대조군 대비 유의적 차이를 나타내고; ##p<0.01은 양방 t 시험에 의한 유의적 차이를 나타낸다. 도 11e: FGF19를 발현하거나 M70으로 공동 처리된 마우스의 간의 조직학. 간 절단면을 H & E 또는 FGF19 유도된 간 종양의 마커인 항글루타민 합성효소로 염색하였다. 종양(T)은 점선으로 나타냈다. 기준자는 100㎛. 도 11f: FGF19가 생성되고 사람 암세포주로부터 분비된다. 배지 상청액 중의 FGF19 수준을 ELISA로 측정한다. 도 11g 내지 11j: M70은 생체내 사람 암 이종이식편 종양 성장을 억제한다. 8주령의 무흉선 nu/nu 마우스에 5×106개의 Huh-7(n=10)(도 11g) 또는 HCT-116(n=5)(도 11h 내지 11j) 세포를 피하 이식하였다. 동일 부피(~100㎣)의 종양이 확립된 마우스를 무작위로 그룹화하고 AAV 매개된 유전자 전달을 통해 M70으로 처리하였다. 대조군 바이러스(GFP)를 또한 이 연구에 포함시켰다. 종양 성장을 15일의 처리 기간에 걸쳐 측정하였다. 이미지는 15일의 처리 기간 종결시에 해부한 HCT-116 고형 종양을 나타낸다(도 11i). HCT-116 종양 이종이식편을 갖는 마우스의 체중 증가를 또한 측정하였다(도 11j). ***p<0.001은 이원 ANOVA에 이은 본페로니(Bonferroni) 포스트 시험에 의한 대조군 대비 유의적 차이를 나타낸다. 모든 값은 평균±SEM을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 FGF19 의존적 종양을 치료하기 위한 FGF19 변이체를 성장시키는 모델을 도시한 것이다. 도 12a: 만성 간 손상(담즙울혈, 경화증 등)은 간에서의 FGF19의 축적을 초래한다. 담즙산 합성의 조절에 중요함에도 불구하고, FGF19는 또한 간 발암 촉진에서의 주요 전사인자인 STAT3을 활성화한다. 이는 종양 개시, 촉진 및 HCC로의 진행의 원인이다. 도 12b: M70은 FGF19의 가공된 변이체이다. 선택적 조절자로서 M70은 특정 FGFR4 신호화 경로(즉, pERK Cyp7α1)에 편향되고다른 것들(즉, 종양)은 상대적으로 제외한다. 또한, M70은 FGF19 의존적 종양의 성장을 억제할 수 있다.
도 13a 및 13b는 M70이 CT26 결장암 동계(syngenic) 마우스 모델에서 종양 성장을 지연시킴을 도시한 것이다. 도 13a: M70은 10mg/kg 용량 투여 후 종양 성장을 지연시킨다. 도 13b: M70은 3mg/kg 용량 투여 후 종양 성장을 지연시킨다. p-값은 비히클 처리된 마우스 대비 이원 ANOVA로 측정하였다. ***p<0.001; **p<0.01. 도 14a 및 14b는 M70이 CT26 결장암 동계 마우스 모델에서 체중을 감소시킴을 도시한 것이다. 도 14a: M70은 10mg/kg 용량 투여 후 체중을 감소시킨다. 도 14b: M70은 3mg/kg 용량 투여 후 체중을 감소시킨다. p-값은 비히클 처리된 마우스 대비 이원 ANOVA로 측정하였다. ***p<0.001; **p<0.01.
본 기재를 추가로 설명하기 전에, 본 기재가 본원에 제시된 특정 실시양태로 제한되는 것으로 이해해서는 안되고, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태를 단지 설명하기 위함이지 제한할 의도가 아님을 또한 이해해야 한다.
개요
본 기재는 본원에 기재된 모델 및 방법을 사용한 작용제 및 이의 조성물의 확인을 고려한다. 상기 모델 및 관련 방법은 암성 병태(예를 들어, 간세포 암종)를 유도하지 않는 작용제의 확인을 위한 정확하고 효율적인 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 모델 및 방법은 FGF19의 발암활성을 길항하는 작용제를 확인하는데에 유용하다. 특정 실시양태에서, 이러한 작용제는, 예를 들어, 포도당 대사 장애 및/또는 체중 장애에 관한 다양한 질환, 장애 및 병태, 및/또는 이의 증상의 치료 및/또는 예방에 치료적 유용성을 갖는다. 예로서, 작용제 및 이의 조성물은 타입 2 당뇨병, 인슐린 내성, 및 인슐린 내성, 감소된 인슐린 생산, 고혈당증, 대사 증후군 또는 비만을 특징으로 하는 질환, 장애 및 병태의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 작용제는 또한 FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상의 예방 또는 치료에 유용하다.
본원에 기재된 모델 및 관련 방법은 FGF19의 암 관련 효과(예를 들어, HCC)를 유도하지도 악화시키지도 않는 작용제(예를 들어, 폴리펩타이드 및 항체)를 확인하는데에 유용하다. 아래에 상세히 기재하는 바와 같이, 특정 실시양태는 유용한 대사 특징을 갖는 FGF19 변이체 폴리펩타이드가 바람직한 "암 관련" 프로파일도 가질 것인지를 측정하기 위한 모델 및 방법의 용도를 고려한다. 또한 본원은 대상체에서 FGF19의 발암활성의 길항방법을 제공하고, 특정 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 결장, 전립선 또는 폐의 암 또는 종양과 같은 암 또는 종양이다.
정의
용어 "환자" 또는 "대상체"는 사람 또는 사람이 아닌 동물(예를 들어, 포유동물)을 지칭하는데에 교환적으로 사용된다.
용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상이 진단되고 관찰되는 등의 후에 개시된, 대상체를 괴롭히는 질환, 장애 또는 병태의 근본 원인 중 하나 이상 또는 대상체를 괴롭히는 질환, 장애 또는 병태와 관련된 증상 중 하나 이상을 일시적으로 또는 영구히 제거, 감소, 억제, 완화 또는 개선시키기 위한 행동 과정(예를 들어, 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 투여)을 말한다. 따라서, 치료는 (예를 들어, 혈류의 인슐린 및/또는 포도당의 수준 감소, 포도당 수준의 변동을 최소화하기 위한 포도당 내성의 증가 및/또는 포도당 항상성의 붕괴에 의해 야기된 질환에 대한 보호를 위한) 활성 질환의 억제(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 또는 이와 관련된 임상적 증상의 진행 또는 추가 진행의 중지)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료가 필요한"은 대상체에 필요하거나 치료가 유리할 것으로 의사 또는 기타 의료 전문가가 행한 판단을 일컫는다.
용어 "예방하다", "예방하는", "예방" 등은 일반적으로 특정 질환, 장애 또는 병태를 갖는 성향이 있는 대상체에서, (예를 들어, 임상적 증상의 부재에 의해 측정된) 질환, 장애, 병태 등이 진행되거나 이의 개시가 지연될 대상체의 위험성을 일시적으로 또는 영구히 예방, 저지, 억제 또는 감소시키기 위한 방식으로 (예를 들어, 질환, 장애, 병태 또는 이의 증상의 개시 전에) 개시된 행동 과정(예를 들어, 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 투여)을 말한다. 특정 경우에, 상기 용어는 또한 질환, 장애 또는 병태의 유해하거나 바람직하지 않은 상태로의 진행의 감속 또는 억제를 말한다.
본원에 사용된 용어 "예방이 필요한"은 대상체에 필요하거나 예방적 관리가 유리할 것으로 의사 또는 기타 의료 전문가가 행한 판단을 일컫는다.
구 "치료적 유효량"은 환자에게 투여되었을 때 질환, 장애 또는 병태의 임의 증상, 양태 또는 특징에 대한 임의의 탐지가능한 긍정적 효과를 가질 수 있는, 대상체에 약제학적 조성물 단독 또는 이의 부분으로서 단일 용량으로 또는 용량 시리즈의 일부로서 투여되는 작용제의 양을 말한다. 치료적 유효량은 관련된 생리학적 효과를 측정함으로써 알 수 있다. 고혈당증 병태의 경우, 혈당의 저하 또는 감소나 포도당 내성 시험에서의 개선이, 작용제의 양이 고혈당증 병태를 치료하는 데 효과적인지를 측정하는데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 치료적 유효량은 공복 혈장 포도당(FPG)의 수준(예를 들어, 기준선 수준)을 감소시키거나 저하시키는 데 충분한 양이여, 예를 들어, 이 양은 200mg/dl 초과의 FPG 수준을 200mg/dl 미만으로 감소시키기에 충분하며, 이 양은 175mg/dl 내지 200mg/dl의 FPG 수준을 출발 수준 미만으로 감소시키기에 충분하며, 이 양은 150mg/dl 내지 175mg/dl의 FPG 수준을 출발 수준 미만으로 감소시키기에 충분하며, 이 양은 125mg/dl 내지 150mg/dl의 FPG 수준을 출발 수준 미만으로 감소시키기에 충분한 등이다(예를 들어, FPG 수준을 125mg/dl 미만, 120mg/dl 미만, 115mg/dl 미만, 110mg/dl 미만 등으로 감소시킴). 또한, HbAIc 수준의 경우, 상기 유효량은 상기 수준을 약 10 내지 9% 초과, 약 9 내지 8% 초과, 약 8 내지 7% 초과, 약 7 내지 6% 초과, 약 6 내지 5% 초과 등까지 저하시키거나 감소시키기에 충분한 양이다. 보다 특별히, 약 0.1%, 0.25%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과의 HbAIc 수준의 감소 또는 저하가 본 기재에 의해 고려된다. 치료적 유효량은 투여 섭생 및 대상체의 병태의 진단 분석 등과 관련하여 조절될 수 있다.
구 "변화시키기에 충분한 양"은 특정 치료제의 투여 전(예를 들어, 기준선 수준) 및 후에 측정된 지표의 수준 사이에 탐지가능한 차이가 있음을 의미한다. 지표는 임의의 객관적 매개변수(예를 들어, 포도당 또는 인슐린의 수준) 또는 주관적 매개변수(예를 들어, 대상체의 행복의 느낌)를 포함한다.
본원에 사용된 구 "포도당 내성"은 포도당 섭취가 변동되는 경우 혈장 포도당 및/또는 혈장 인슐린의 수준을 조절하는 대상체의 능력을 말한다. 예를 들어, 포도당 내성은 혈장 포도당의 수준을 감소시켜 약 120분 내로 포도당 섭취 전에 측정된 수준으로 되돌리는 대상체의 능력을 포함한다.
넓게 말하자면, "당뇨병"은 주로 고혈당증 및 당뇨를 특징으로 하는, 인슐린의 부적합한 생산 또는 이용을 포함하는 탄수화물 대사의 진행성 질환을 말한다. 용어 "전당뇨병(pre-diabetes)"은 대상체가 전형적으로 당뇨병에서 관찰되는 특징, 증상 등을 갖지는 않지만, 치료되지 않는 경우, 당뇨병으로 진행될 수 있는 특징, 증상 등을 갖는 상태를 말한다. 이러한 병태의 존재는, 예를 들어, 공복 혈장 포도당(FPG) 시험 또는 경구 포도당 내성 시험(OGTT)을 사용하여 측정할 수 있다. 두 시험 모두 시험 개시 전에 대상체를 8시간 이상 동안 절식시켜야 한다. FPG 시험에서, 다상체의 혈당은 절식 종료 후 측정하고; 일반적으로, 대상체는 밤새 절식시키고 혈당은 대상체가 식사하기 전에 측정한다. 건강한 대상체는 일반적으로 약 90 내지 약 100mg/dl의 FPG 농도를 가질 것이고, "전당뇨병"을 갖는 대상체는 일반적으로 약 100 내지 약 125mg/dl의 FPG 농도를 가질 것이고, "당뇨병"을 갖는 대상체는 일반적으로 약 126mg/dl 이상의 FPG 농도를 가질 것이다. OGTT에서, 대상체의 혈당은 절식 후에 측정하고 포도당-풍부 음료의 음용 후 2시간째에 다시 측정한다. 포도당-풍부 음료의 소비 후 2시간째에, 건강한 대상체는 일반적으로 약 140mg/dl 미만의 혈당 농도를 갖고, 전당뇨병 대상체는 일반적으로 약 140 내지 약 199mg/dl의 혈당 농도를 갖고, 당뇨병 대상체는 일반적으로 약 200mg/dl 이상의 혈당 농도를 갖는다. 상기 혈당치는 사람 대상체에 관한 것이고, 정상 혈당, 중간 정도의 고혈당 및 과잉 고혈당이 쥐과 대상체에서는 다르게 등급화된다. 4시간 절식 후 건강한 쥐과 대상체는 일반적으로 약 100 내지 약 150mg/dl의 FPG 농도를 가질 것이고, "전당뇨병"을 갖는 쥐과 대상체에서는 약 175 내지 약 250mg/dl의 FPG 농도를 가질 것이고, "당뇨병"을 갖는 쥐과 대상체에서는 약 250mg/dl 이상의 FPG 농도를 가질 것이다.
본원에 사용된 용어 "인술린 내성"은 정상 양의 인슐린이 정상적인 생리학적 또는 분자 반응을 생성할 수 없는 상태를 말한다. 몇몇 경우에, 내생적으로 생성되거나 외부적으로 투여된 인슐린의 초생리학적 양은 인슐린 내성을 전제적 또는 부분적으로 극복할 수 있고 생물학적 반응을 생성시킬 수 있다.
용어 "대사 증후군"은 고인슐린혈증, 이상 포도당 내성, 비만, 복부 또는 상체의 지방 재분포, 고혈압, 섬유소분해이상, 및 높은 트리글리세라이드, 낮은 고밀도 지단백(HDL) 콜레스테롤 및 고함량의 작은 빽빽한 저밀도 지단백(LDL) 입자를 특징으로 하는 이상지질혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는, 관련된 특성들을 말한다. 대사 증후군을 갖는 대상체는 타입 2 당뇨병 및/또는 기타 장애(예를 들어, 아테롬성동맥경화증)로 진행될 위험이 있다.
구 "포도당 대사 장애"는 건강한 개체에 비해 대상체에서 증가된 수준의 포도당 및/또는 증가된 수준의 인슐린과 관련된 임상적 증상 또는 임상적 증상들의 조합을 특징으로 하는 임의의 장애를 포함한다. 증가된 수준의 포도당 및/또는 인슐린은 무엇보다도 다음 질환, 장애 및 병태를 나타낼 수 있다: 고혈당증, 타입 2 당뇨병, 임신당뇨병, 타입 1 당뇨병, 인슐린 내성, 손상된 포도당 내성, 고인슐린혈증, 손상된 포도당 대사, 전당뇨병, 기타 대사성 장애(예를 들어, 증후군 X로도 불리는 대사 증후군) 및 비만. 본 기재의 폴리펩타이드 및 이의 조성물은, 예를 들어, 포도당 항상성을 성취 및/또는 유지하는데, 예를 들어, 혈류의 포도당 수준을 감소시키고/시키거나 인슐린 수준을 건강한 대상체에서 발견되는 범위로 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "고혈당증"은 건강한 개체에 비해 대상체의 혈류에서 증가된 양의 포도당이 순환되는 병태를 말한다. 고혈당증은 본원에 기재된 바와 같은 공복혈당의 측정을 포함한 당해 기술 분야에 공지된 방법들을 사용하여 진단할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "고인슐린혈증"은, 부수적으로 혈당 수준이 증가되거나 정상인 경우, 순환하는 인슐린의 수준이 증가된 병태를 말한다. 고인슐린혈증은 높은 트리글리세라이드, 높은 콜레스테롤, 높은 저밀도 지단백(LDL) 및 낮은 고밀도 지단백(HDL)과 같은 이상지질혈증; 높은 요산 수준; 다낭성 난소 증후군; 타입 II 당뇨병 및 비만과 관련된 인슐린 내성에 의해 일어날 수 있다. 고인슐린혈증은 약 2μU/mL 초과의 혈장 인슐린 수준을 갖는 것으로 진단될 수 있다.
본원에 사용된 구 "체중 장애"는 과잉의 체중 및/또는 증가된 식욕과 관련된 병태를 말한다. 대상체가 기준의 건강한 개체에 비해 과체중인지를 측정하는데는 대상체의 나이, 키, 성별 및 건강 상태를 포함한 다양한 매개변수가 사용된다. 예를 들어, 대상체의 체질량지수(BMI)(대상체의 체중(kg)을 대상체의 키(m)의 제곱으로 나누어 계산)를 평가하여 대상체를 과체중 또는 비만으로 간주할 수 있다. BMI 범위가 ~18.5 내지 ~24.9kg/㎡인 성인은 정상 체중으로 여겨지고; BMI가 ~25 내지 29.9kg/㎡인 성인은 과체중(비만 전단계)로 간주될 수 있고; BMI가 ~30kg/㎡ 이상인 성인은 비만으로 간주될 수 있다. 증가된 식욕은 흔히 과도한 체중을 야기한다. 예를 들어, 종종 불면증과 연관된 조간 거식증 및 야간 다식증을 특징으로 하나 시상하부 손상과 관련될 수 있는 야식증후군을 포함한, 증가된 식욕과 관련된 몇몇 병태가 있다.
본원에서 교환적으로 사용되는 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 말하고, 유전적으로 암호화된 아미노산 및 비유전적으로 암호화된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질되거나 유도체화된 아미노산, 및 개질된 폴리펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 용어들은 N 말단 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않는, 이종 아미노산을 갖는 융합 단백질, 이종 및 동종 리더 서열을 갖는 융합 단백질; 면역학적으로 태그된 단백질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 융합 단백을 포함한다. 본 기재 전반에 걸쳐 단일 문자 또는 3개의 문자 코드에 따르는 아미노산을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는 자연 발생적 변이체(예를 들어, 동족체 및 대립형질 변이체) 및 비자연 발생적 변이체(예를 들어, 돌연변이)를 포함한다. 자연 발생적변이체는 동족체, 즉 한 종이 다른 종과 각각 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 상이한 핵산 및 폴리펩타이드를 포함한다. 자연 발생적변이체는 대립형질 변이체, 즉 종 내에서 하나의 개체가 다른 개체와 각각 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 상이한 핵산 및 폴리펩타이드를 포함한다. 비자연 발생적 변이체는 각각 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열상의 변화를 포함하는 핵산 및 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 서열상의 변화는 인위적으로 유도되고, 예를 들어 상기 변화는 사람이 개입됨으로써("hand of man") 실험실에서 또는 기타 시설에서 생성된다.
FGF19와 관련된 용어 "천연(native)"은 생물학적으로 활성인 자연 발생적 FGF19 변이체를 포함한, 생물학적으로 활성인 자연 발생적 FGF19를 말한다. 상기 용어는 194 아미노산 사람 FGF19 성숙 서열을 포함한다.
본 기재의 폴리펩타이드 또는 핵산(또는 적절한 경우 항체)의 문맥에서 사용되는 경우, 용어 "표지", "표지화" 등은 넓게는, 예를 들어, 폴리펩타이드 정체, 확인, 분리 및 합성에 유용한 임의 수단을 지칭하기 위함이다. 표지는 일반적으로 관심 폴리펩타이드에 공유 결합되고, (일반적으로 N- 또는 C-말단에서) 성숙 폴리펩타이드로의 결합, 고체상 폴리펩타이드 합성 동안의 도입, 또는 재조합 수단을 통한 도입을 포함한, 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법으로 도입될 수 있다. 예에는 형광 발광, 바이오티닐화 및 방사능 아이소토프가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 폴리펩타이드 및 핵산 분자는 시험관내 및 생체내 방법 둘 다에 의해 표지화될 수 있다. 표지화 시약 및 키트는 다수의 시판사(예를 들어, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL; 및 Molecular Probes/Life Technologies; Grand Island, NY)로부터 구입가능하다.
본원에 사용된 용어 "플래그-태그", "플래그 옥타펩타이드" 등은 재조합 DNA 기술을 사용하여 폴리펩타이드에 추가될 수 있는 8개의 아미노산(DYKDDDDK)(서열 번호 2) 펩타이드 태그(표지)를 말한다. 폴리펩타이드의 플래그 성분에 대한 항체를, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피 및 면역 형광 발광에 의한 또는 SDS PAGE 단백질 전기영동에 의한 검출에 의한 세포 국소화 연구에 사용할 수 있다. 플래그태그는 기타 친화도 태그(예를 들어, 폴리히스티딘 태그(His-태그) 또는 myc-태그)와 함께 사용될 수 있고 폴리펩타이드의 C 말단 또는 N 말단에 융합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "뮤테인"은 넓게는 돌연변이 재조합 단백질, 즉 아미노산 서열에 인위적으로 도입된 변화, 예를 들어, 사람이 개입됨으로써 실험실에서 또는 기타 시설에서 생성된 아미노산 서열상의 변화를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이들 단백질은 대개 단일 또는 다수의 아미노산 치환체를 나르고 빈번히 위치 지정된 또는 무작위의 돌연변이를 겪은 클론 유전자로부터 유도되거나 완전히 합성된 유전자로부터 유도된다.
천연 사람 FGF19 또는 FGHF19 뮤테인과 관련하여 사용된 용어 "개질된", "개질" 등은 사람 FGF19, 자연 발생적 FGF19 변이체 또는 FGF19 뮤테인의 바람직한 성질을 향상시키는 변화 중 하나 이상을 말하는 것이고, 상기 변화는 FGF19의 주요 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 이러한 바람직한 성질은, 예를 들어, 용해도 향상, 순환 반감기 연장, 안정성 증가, 청소율 감소, 면역원성 또는 알러지항원성 변화, 생산성 양태(예를 들어, 비용 및 효율)의 개선 및 (예를 들어, 독특한 에피토프의 도입에 의한) 검출 분석에 사용되는 특정 항체의 양식을 포함한다. 실시할 수 있는 사람 FGF19, 자연 발생적 FGF19 변이체 또는 FGF19 뮤테인에 대한 변화는 페길화(폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유도체의 하나 이상의 분자의 공유 결합); 글리코실화(예를 들어, N-글리코실화), 폴리실릴화 및 헤실화; 알부민 융합; 예를 들어, 콘쥬게이트된 지방산 쇄(아실화)를 통한 알부민 결합; Fc-융합; 및 PEG 유사체를 사용한 융합을 포함한, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 특정 실시양태는 폴리에틸렌 글리콜과 관련된 개질을 수반하고, 다른 특정 실시양태는 알부민과 관련된 개질을 수반하고, 또 다른 특정 실시양태는 글리코실화와 관련된 개질을 수반한다.
용어 "DNA", "핵산 분자", "폴리뉴클레오타이드" 등은 본원에서 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체인, 임의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭하는데에 교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예는 선형 및 환형 핵산, 메신저 RNA(mRNA), 상보적 DNA(cDNA), 제조합 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 프로브, 프라이머 등을 포함한다.
용어 "프로브"는 관심 유전자 또는 서열에 상응하는 DNA 또는 RNA의 단편을 지칭하고, 상기 단편은 (예를 들어, 32P 또는 35S를 도입함으로써) 방사능 표지된 것이거나 바이오틴, 디곡시겐(digoxygen) 또는 플루오레세인과 같은 몇몇 기타 검출가능한 분자를 사용하여 표지된 것이다. 상보적 서열을 갖는 DNA 또는 RNA의 스트레치가 하이브리드화될 것이기 때문에, 프로브를, 예를 들어, 바이러스성 플라크, 세균 콜로니 또는 밴드를 관심 유전자를 함유하는 겔에 표지화하는 데 사용할 수 있다. 프로브브는 복제(cloned) DNA일 수 있거나 합성 DNA 스트랜드일 수 있고; 후자는 cDNA 또는 유전체 클론을 분리된 단백질로부터, 예를 들어, 상기 단백질의 일부를 미세서열화하고 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 추론하고 그 서열을 수반하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 그 서열을 방사능표지하고 이를 프로브로서 cDNA 라이브러리 또는 유전체 라이브러리를 선별하는데에 사용함으로써, 수득하는데에 사용될 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 공급원으로부터 유도된 구조에 의해 정의되는 2개의 성분을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 문맥에서, "이종" 폴리펩타이드는 상이한 폴리펩타이드들로부터 유도된 사용가능하게 연결된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 키메릭 폴리펩타이드를 코드화하는 폴리뉴클레오타이드의 문맥에서, "이종" 폴리펩타이드는 상이한 유전자로부터 유도될 수 있는 사용가능하게 연결된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 "이종" 핵산은 코드화 서열을 포함하는 핵산이 상기 코드화 서열과는 상이한 유전 기원으로부터의 조절 요소(예를 들어, 촉진자)에 사용가능하게 연결된 발현 구조를 포함한다(예를 들어, 상기 촉진자, 상기 코드화 서열 또는 이들 둘 다와는 유전 기원이 상이할 수 있는 관심 숙주 세포에서의 발현을 제공하기 위해). 재조합 세포의 문맥에서, "이종"은 핵산이 존재하는 숙주 세포와는 상이한 유전 기원의 것인 핵산(또는 폴리펩타이드와 같은 유전자 생성물)의 존재를 지칭할 수 있다.
용어 "사용가능하게 연결된"은 바람직한 기능을 제공하기 위한 분자들간의 결합을 말한다. 예를 들어, 핵산의 문맥에서 "사용가능하게 연결된"은 핵산 서열들 간의 기능적 결합을 말한다. 예로서, 핵산 발현 조절 서열(예를 들어, 촉진자, 신호 서열, 또는 전사인자 결합 위치의 어레이)은 제2 폴리뉴클레오타이드에 사용가능하게 연결되어 있을 수 있고, 상기 발현 조절 서열은 제2 폴리뉴클레오타이드의 전사 및/또는 번역에 영향을 미친다. 폴리펩타이드의 문맥에서, "사용가능하게 연결된"은 폴리펩타이드의 기재된 활성을 제공하기 위한 아미노산 서열들(예를 들어, 상이한 도메인들)간의 기능적 결합을 말한다.
폴리펩타이드의 구조의 문맥에서 본원에 사용된 "N-말단"(또는 "아미노 말단") 및 "C-말단"(또는 카복실 말단)은 폴리펩타이드의 맨 끝의 아미노 및 카복실 말단을 지칭하는 반면, 용어 "N-터미널" 및 "C-터미널"은 각각 N-말단 및 C-말단을 향한 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서의 상대적 위치를 말하고, 각각 N-말단 및 C-말단에서의 잔기를 포함할 수 있다. "N-터미널 바로 옆" 및 "C-터미널 바로 옆"은 제1 및 제2 아미노산 잔기가 공유결합되어 연속 아미노산 서열을 제공하는 경우 제2 아미노산 잔기에 대한 제1 아미노산 잔기의 위치를 말한다.
아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 문맥의 "로부터 유도된"(예를 들어, FGF19 폴리펩타이드"로부터 유도된" 아미노산 서열)은 폴리펩타이드 또는 핵산이 기준 폴리펩타이드 또는 핵산(예를 들어, 자연 발생적 FGF19 폴리펩타이드 또는 FGF19 코드화 핵산)의 서열을 기초로 한 서열을 갖고 있음을 가리키기 위함이고, 단백질 또는 핵산이 만들어지는 공급원 또는 방법으로 제한하려는 것은 아니다. 예로서, 용어 "로부터 유도된"은 기준 아미노산 또는 DNA 서열의 동족체 또는 변이체를 포함한다.
폴리펩타이드의 문맥에서, 용어 "분리된"은 자연 발생적일 수 있는 환경과는 다른 환경에 있는, 자연 발생적인 경우의 관심 폴리펩타이드를 말한다. "분리된"은 실질적으로 관심 폴리펩타이드가 풍부하고/하거나 관심 폴리펩타이드가 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 샘플 내에 있는 폴리펩타이드를 포함하려고 한다. 폴리펩타이드가 자연 발생적이 아닌 경우, "분리된"은 합성 또는 재조합 수단에 의해 만들어진 환경으로부터 분리된 폴리펩타이드를 가리킨다.
"풍부"는 샘플이 (예를 들어, 과학자 또는 임상의에 의해) 비자연적으로 가공되어 관심 폴리펩타이드가 a) 생물학적 샘플(예를 들어, 폴리펩타이드가 자연 발생적으로 존재하거나 투여 후에 존재하는 샘플)과 같은 초기 샘플 중의 폴리펩타이드의 농도보다 높은 농도(예를 들어, 적어도 3배 이상, 적어도 4배 이상, 적어도 8배 이상, 적어도 64배 이상, 또는 그 초과)로 존재하거나, b) 폴리펩타이드가 (예를 들어, 세균 세포에서) 만들어진 환경보다 높은 농도로 존재하는 것을 의미한다.
"실질적으로 순수한"은 한 성분(예를 들어, 폴리펩타이드)이 조성물의 전체 함량의 약 50% 이상을 구성하고, 전형적으로 전체 폴리펩타이드 함량의 약 60% 이상을 구성하는 것을 가리킨다. 보다 일반적으로, "실질적으로 순수한"은 전체 조성물의 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 그 초과가 관심 성분인 조성물을 말한다. 몇몇 경우에, 폴리펩타이드는 조성물의 전체 함량의 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과를 구성할 것이다.
용어 "분석" 및 "측정" 및 이의 문법적 변형은 본원에서 교환적으로 사용되고 정성적 측정 또는 정량적 측정, 또는 정성적 측정 및 정량적 측정 둘 다를 지칭한다. 상기 용어가 검출과 관련하여 사용되는 경우, 본원에 제시되고 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 포함하는 상대적 양의 임의 평가 수단이 고려된다. 예를 들어, 유전자 발현은 노던 블롯(Northern blot), 웨스턴 블롯, 면역침전 분석에 의해 또는 발현된 단백질의 활성, 기능 또는 양의 측정에 의해 분석되거나 측정될 수 있다.
용어 "항체"(Ab) 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백을 말한다. 항체가 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 항원, 및 항원 특이성이 결핍된 항원 유사 분자 둘 다를 포함한다.
용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동종인 항체군으로부터 수득된 항체를 말하고, 항체군에 포함된 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지정된다. 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함할 수 있는 다클론 항체 제제와는 대조적으로 각각의 단클론 항체는 항원에 대한 단일 결정인자에 대해 지정된다.
항체의 문맥에서, 용어 "분리된"은 자연 환경의 오염 성분으로부터 단리 및/또는 회수된 항체를 지칭하고; 이러한 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질을 포함하고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "FGF19 의존적" 및 유사 용어는, 질환, 장애 또는 병태의 문맥에서와 같이, FHGF19의 발현에 의해 전부 또는 부분적으로 야기되는 질환, 장애 또는 기타 병태를 말한다. 특정 실시양태에서, FHGF19의 발현은 대조군에 비해 증폭된다. 몇몇 실시양태에서, FHGF19의 발현은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 또는 이의 임의의 수치 범위로 증폭된다. 몇몇 실시양태에서, FHGF19의 증폭된 발현은 직접적으로 상기 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상을 야기한다. 다른 실시양태에서, FHGF19의 증폭된 발현은 간접적으로 상기 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상을 야기한다.
섬유아세포 성장인자 19(FGF19)
섬유아세포 성장인자(FGF)는 세포 증식 및 분화에 중요한 역할을 하는 성장인자 패밀리이다. 모두 구조적으로 관련된 신호화 분자인, FGF 패밀리의 22개 구성원이 사람에서 확인되었다. FGF의 FGF19 서브패밀리는 사람 FGF21, FGF23 및 FGF19, 및 마우스 FGF15로 이루어진다.
FGF 패밀리 구성원의 생리학적 효과는 각각 티로신 키나제 도메인을 갖는 4개의 구성원(FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4)을 포함하는 FGF 수용체 티로신 키나제(FGFR) 패밀리의 하나 이상의 구성원으로의 헤파인 의존적 결합의 결과이다. 추가로, 각각의 FGFR1, FGFR2 및 FGFR3은 또한 "b" 및 "c" 변이체(즉, FGFR1b, FGFR2b, FGFR3b, FGFR1c, FGFR2c 및 FGFR3c)로서 지정된 2개의 스플라이스(splice) 변이체를 갖는다.
FGF19는 지방 세포와 간세포 둘 다를 표적으로 하고 둘 다에 영향을 미친다. 재조합 사람 FGF19로 처리된 마우스는 고지방 식이에도 불구하고 증가된 대사율, 증가된 지방 산화, 보다 낮은 호흡지수 및 체중 감소를 보인다. FGF19의 대사 효과는 이의 FGFR1c, FGFR2c 및 FGFR3c 수용체에 대한 결합을 통해 일어나고, 이중 FGFR1c 및 FGFR2c에 대한 결합이 가장 중요하다. 이들 수용체에 대한 FGF19 결합은 보조 수용체 Klotho-β(KLB)를 필요로 한다.
FGF19는 또한 간에 의한 담즙 생성을 조절하는 것으로 나타났다. 따라서, FGF19 유사 작용제는 담즙산 항상성에 중요한 역할을 할 수 있다. 결과는 FGF19 조절된 간 담즙산 대사가 이의 포도당 저하 효과와 독립적일 수 있음을 시사한다.
본원의 다른 곳에서 시사한 바와 같이, 당뇨병의 치료를 위한 위 우회로조성술의 사용은 대부분의 환자에서 완전히 및 영구히 타입 II 당뇨병을 치유하는 것으로 나타났다. 이 "비만 효과"는 수술 후 및 현저한 체중 감소가 성취되기 훨씬 전에만 명백하다. FGF19 수준은 비만 수술 후에 증가되고 비만 효과의 원인일 수 있다.
FGF19는 22 잔기 신호 펩타이드를 포함하는 216 아미노산 폴리펩타이드로서 발현된다(GenBank: AAQ88669.1). 성숙 사람 FGF19(야생형)는 다음 아미노산 서열을 포함하는 194 아미노산 폴리펩타이드이다:
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (서열 번호 3).
FGF19 및 간세포 암종
본원에 기재된 바와 같이, FGF19는 암, 특히 간암 중 가장 통상적인 유형인 HCC의 유도와 관련이 있다. 특정 양태에 따르면, 본원은, 본원에 기재된 바와 같이, 바람직한 대사 활성(예를 들어, 포도당 저하 활성)을 가지나 실질적인 HCC 활성은 결여되거나 없는 폴리펩타이드, 또는 이의 서열, 변이체 또는 개질된 형태를 확인하는 모델 및 방법을 제공한다. 암의 검출방법과 함께 다양한 대사 장애 및 관련 방법(예를 들어, 포도당 수준의 측정방법)이 본원의 다른 곳에 기재되어 있고 당해기술 분야에 공지되어 있다.
다양한 방법들이 HCC를 선별하고 진단하는데에 사용될 수 있고 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. HCC에 대한 지표는 상승된 알파-태아단백질(AFP) 또는 des-감마 카복시프로트롬빈(DCP) 수준과 같은 종양 마커의 검출을 포함하나, 이에한정되지 않는다. 초음파촬영술, CT 스캔 및 MRI를 포함한 다수의 상이한 선별 및 조영화 기술을 또한 이용할 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 모델의 특정 실시양태와 관련하여, 폴리펩타이드(예를 들어, 후보 폴리펩타이드)가 HCC 유도의 증거를 나타내는지의 평가를, 예를 들어, 야생형 FGF19에 의해 유도된 HCC 결절 생성과 비교해 폴리펩타이드가 투여된 동물 모델(예를 들어, db/db 마우스 모델)에서의 HCC 결절 생성을 정량화함으로써, 생체내에서 측정한다. 육안으로는 HCC가 결절성일 수 있는 반면, 종양 결절(이들은 흔히 원형 내지 타원형, 회색 또는 녹색이고 잘 싸여져 있으나 캡슐화되어 있지는 않다)은 하나의 보다 큰 덩어리로 또는 다수의 작은 덩어리로 출현된다. 그렇지 않으면, HCC는 미만성이고 불량하게 싸여져 있고 간문맥을 빈번히 침윤시키는 침윤성 종양으로서 존재할 수 있다. HCC에 대한 위험 인자는 타입 2 당뇨병(자주 비만에 의해 악화됨)을 포함한다. 타입 2 당뇨병에서의 HCC의 위험은 당뇨병 기간 및 치료 프로토콜에 따라 더 클 수 있다(비당뇨병 위험의 ~2.5 내지 ~7배).
간 조직 샘플의 병리학적 평가는 일반적으로 상기한 방법들 중 하나 이상의 결과가 HCC의 존재 가능성을 나타낸 후에 수행한다. 따라서, 본원에 제공된 방법의 특정 실시양태는 폴리펩타이드 서열이 HCC 유도 증거를 나타내는지를 측정하기 위해 HCC 연구에 유용한 생체내 동물 모델로부터의 간 조직 샘플을 평가하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 생체내 동물 모델은 db/db 마우스 모델이다. 현미경 평가에 의해, 병리학자가 HCC의 일반적인 4가지의 구조적 및 세포학적 유형(패턴)(즉, 섬유층판, 거짓샘(아데노이드), 다형태(거대세포) 및 투명세포)이 존재하는지를 측정할 수 있다.
바람직한 특성을 갖는 FGF19 변이체 폴리펩타이드를 확인하기 위한 방법 및 모델
적어도 몇몇 측면에서 FGF19의 활성을 모방하는 FGF19 변이체 폴리펩타이드 및 기타 작용제가 과학 문헌 및 특허 문헌 모두에 기재되어 있다. 예를 들어, "Wu et al., PLos One, 6:e17868 (March 11, 2001)", 미국 특허 제8,324,160호, 및 미국 공개공보 제2011/0195895호, 제2011/0207912호 및 제2011/0104152호를 참조한다. 어떤 식으로든 제한할 의도는 아니지만, 후보 FGF19 변이체 서열은 FGF19(서열 번호 3)의 아미노산 16-20의 WGDPI 서열에 상응하는 WGDPI(서열 번호 4) 서열 모티프를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 고려된 특정 폴리펩타이드는 다음 아미노산 서열 또는 상기한 펩타이드 서열 중 하나의 서브서열 또는 단편을 갖는다:
MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M70, 서열 번호 1).
다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 다음과 같은 아미노산 서열 또는 이들 펩타이드 서열 중 임의의 서브서열 또는 단편을 포함하거나 이로 이루어진다:
RHPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M5, 서열 번호 5);
RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M6, 서열 번호 6);
RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M7, 서열 번호 7);
RHPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M14, 서열 번호 8);
RPLAFSDAGPHVHYGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M15, 서열 번호 9);
RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M32, 서열 번호 10);
RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M36, 서열 번호 11);
RPLAFSDAGPHVHYGGDIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M43, 서열 번호 12);
RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M50, 서열 번호 13);
RDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M52, 서열 번호 14);
MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M53, 서열 번호 15);
RPLAFSDAGPHVWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M67, 서열 번호 16);
RPLAFSDAGPHVHYWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M68, 서열 번호 17);
RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M69, 서열 번호 18);
MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M70, 서열 번호 1 또는 19);
RVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M75, 서열 번호 20);
RGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M76, 서열 번호 21);
RRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M77, 서열 번호 22);
RPLAFSDAAPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M83, 서열 번호 23);
RPLAFSDAGAHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M84, 서열 번호 24);
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIREDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M140, 서열 번호 25);
HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M144 (M5-R), 서열 번호 26);
DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M145 (M6-R), 서열 번호 27);
HPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M146 (M50-R), 서열 번호 28);
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M160, 서열 번호 29). 상기 펩타이드 서열 중 하나의 특정 실시양태에서, N-터미널의 R 잔기가 삭제된다.
전술한 바와 같이, 본 기재의 한 양태는 (a) 암성 병태의 징후를 갖고 대사 장애를 갖는 시험 대상체를 제공하고, (b) FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고(시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하다), (c) 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 증가되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 증가의 부재는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보임을 나타내는, 대사 장애를 갖는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 고려한다.
본 기재의 다른 양태는 (a) 암성 병태의 징후를 갖고 대사 장애를 갖는 시험 대상체를 제공하고, (b) FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고(시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하다), (c) 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 감소되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 감소는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보임을 나타내는, 대사 장애를 갖는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 고려한다.
본 기재는 또한 (a) FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 대사 장애를 갖는 시험 대상체에 공동투여하고(시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하다), (b) 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 관찰되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 부재는 FGF19 변이체가 시험 대상체의 치료를 위한 후보임을 나타내는, FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 시험 대상체의 치료를 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 고려한다.
본원에 고려된 추가의 실시양태는 (a) 대사 장애를 갖고 암성 병태의 징후를 갖는 시험 대상체를 제공하고, (b) FGF19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고(시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 악화시키기에 충분하다), (c) 암성 병태의 징후가 시험 대상체에서 증가되는지를 측정하는 것을 포함하고, 암성 병태의 징후의 부재는 FGF19 변이체가 시험 대상체의 치료를 위한 후보임을 나타내는, FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 시험 대상체의 치료를 위한 후보인지를 측정하기 위한 방법을 고려한다. 특정 실시양태에서, 암성 병태의 하나 이상의 징후가 시험 대상체에서 감소된다.
본원에 제공된 방법의 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 M5, M6, M7, M14, M15, M32, M36, M43, M52, M53, M67, M68, M69, M70, M75, M76, M77, M83, M84, M140, M144, M145, M146 및 M160으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M5이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M6이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M7이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M14이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M15이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M32이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M36이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M43이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M52이다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M53이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M67이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M68이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M69이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M70이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M75이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M76이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M77이다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M83이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M84이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M140이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M144이다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M145이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M146이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M160이다. 다른 실시양태에서, 상기한 FGF19 변이체의 2개 이상의 조합이 또한 고려된다.
본원에 제공된 방법의 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5 내지 29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 서브서열 또는 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, N-터미널 R 잔기가 생략된다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5를 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 6을 포함한다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 7을 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 8을 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 9를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 10을 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 11을 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 12를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 13을 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 14를 포함한다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 15를 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 16을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 17을 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 18을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 19를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 20을 포함한다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 21을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 22를 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 23을 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 24를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 25를 포함한다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 26을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 27을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 28을 포함한다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 29를 포함한다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 N-터미널 R 잔기가 생략된, 상기한 서열 중 어느 하나를포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 상기한 서열 중 어느 하나의 서브서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기한 FGF19 변이체 중 2개 이상의 임의의 조합이 또한 고려된다.
본원에 제공된 방법의 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5 내지 29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 서브서열 또는 단편으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, N-터미널 R 잔기가 생략된다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 6으로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 7로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 8로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 9로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 10으로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 11로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 12로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 13으로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 14로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 15로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 16으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 17로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 18로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 19로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 20으로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 21로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 22로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 23으로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 24로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 25로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 26으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 27로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 28로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 29로 이루어진다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 N-터미널 R 잔기가 생략된, 상기한 서열 중 어느 하나로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 상기한 서열 중 어느 하나의 서브서열로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 상기한 FGF19 변이체 중 2개 이상의 임의의 조합이 또한 고려된다.
위에 시사한 바와 같이, 본 기재는 또한 다양한 모델을 고려한다. 신뢰성있고 재현가능한 결과를 제공하는 임의의 모델이 사용될 수 있다. 숙련가는 본 기재의 내용과 연합하여 사용할 수 있는 모델에 익숙하다. 몇몇 실시양태에서, 설치류 모델, 특히 마우스 모델이 사용된다. 실험 부분의 실시에에 사용된 ob/ob 마우스 모델뿐만 아니라 db/db, db/ob 및 DIO 모델이 본 기재의 양태를 실행하는 데 사용될 수 있다.
이러한 한 실시양태는 FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 대상체에서 암성 질환, 장애 또는 병태를 예방하기 위한 후보인지를 측정하기 위한 모델에 관한 것이고, 상기 모델은 (i) 유효량의 FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여 전에 암성 병태의 징후를 나타내지 않고 (ii) FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여 후에 암성 병태의 징후를 나타내는 대상체를 포함하고; 암성 병태의 징후는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 유효량의 투여시에 개선된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
본 기재는 또한 FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 대상체에서 암성 질환, 장애 또는 병태를 예방하기 위한 후보인지를 측정하기 위한 모델을 고려하고, 상기 모델은 FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여로 인한 암의 징후를 하나 이상 갖는 대상체를 포함하고, 암의 징후는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 유효량의 투여시에 개선된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
몇몇 실시양태에서, 본원은 FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 대상체에서 암성 질환, 장애 또는 병태를 예방하기 위한 후보인지를 측정하기 위한 모델을 제공하고, 상기 모델은 i) 유효량의 FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여 전에 암성 병태의 징후를 나타내지 않고 ii) FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여 후에 암성 병태의 징후를 나타내는 대상체를 포함하고; 암성 병태의 징후는 FGF19 변이체의 유효량의 투여시에 개선된다.
다른 실시양태에서, 본원은 FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 대상체에서 암성 질환, 장애 또는 병태를 예방하기 위한 후보인지를 측정하기 위한 모델을 제공하고, 상기 모델은 FGF19 또는 FGF19 대용품의 투여로 인한 암의 징후를 하나 이상 갖는 대상체를 포함하고, 암의 징후는 FGF19 변이체의 유효량의 투여시에 개선된다.
본원에 제공된 모델의 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5 내지 29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 서브서열 또는 단편을 포함한다. 본원에 제공된 모델의 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5 내지 29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 서브서열 또는 단편으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, N-터미널 R 잔기가 생략된다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 6을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 7을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 8을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 9를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 10을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 11을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 12를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 13을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 14를 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 15를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 16을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 17을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 18을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 19를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 20을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 21을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 22를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 23을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 24를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 25를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 26을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 27을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 28을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 29를 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 N-터미널 R 잔기가 생략된, 상기한 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 상기한 서열 중 어느 하나의 서브서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 상기한 FGF19 변이체 중 2개 이상의 임의의 조합이 또한 고려된다.
FGF19 변이체와 공동투여된 FGF19의 효과 평가
실험 부분에 제시된 실시예에서, 단독 투여되거나 FGF19 변이체 M70과 공동투여된 FGF19의 db/db 마우스에 대한 영향을 평가하였다. 아데노연관 바이러스(AAV)를, 마우스에서 관심 외인성 유전자를 전달 및 발현하고 전이유전자에 의해 코드화된 단백질에 연속적, 영구적 및 전신 노출을 가능하게 하기 위한 비히클로서 사용하였다.
도 2는 GFP(대조군); FGF19(2회의 별도 투여); 및 FGF19와 FGF19 변이체 M70(각각 2회의 별도 투여)의 AAV 매개된 유전자 전달 후 5주에 ELISA db/db 마우스를 사용해 측정한 혈장 FGF19 농도를 도시한 것이다. FGF19와 M70의 공동투여 후 관찰된 높은 FGF19 농도는 FGF19 변이체 M70과 FGF19 둘 다의 발현으로부터 기인한 것임을 반영한다. 실험 결과의 정량화를 돕기 위해 FGF19-플래그를 실시예에 사용하였고; 실험 부분에 제시된 바와 같이, c-플래그 성분은 강력한 FGF19의 항당뇨병 효를 가졌음에도 불구하고 FGF19의 종양형성 효과에 영향을 미치지 못한다.
FGF19 단독 투여와 비교하여 FGF19와 FGF19 변이체 M70의 공동투여의 HCC에 대한 잠재적 영향을 평가하였다. 도 3에 도시한 바와 같이, db/db 마우스에서의 FGF19의 이소성(ectopic) 발현은 간 표면으로부터 돌출된, 주변보다 높은 다수의 대형 종양 결절의 생성을 촉진시키는 반면, FGF19 및 M70 둘 다를 발현하는 마우스로부터 분리된 간은 (사용된 조건하에서) 간 결절이 전혀 없었다. 또한, 간 병변의 출현에 의해 증명되는 바와 같이, FGF19 매개된 종양형성은 FGF19 및 M70 전이유전자가 공동 발현되는 경우 완전히 억제된다. 이러한 데이터는 가공된 FGF19 변이체 M70이 야생형 단백질과 관련된 마우스에서의 종양형성 잠재성이 부족할 뿐만 아니라 야생형 단백질의 증식 효과를 효과적으로 방해할 수 있음을 제안한다는 점에서 놀라운 것이다. 이 현상과 관련된 작용의 근본 기전에 대한 정확한 이해가 본 발명을 실시하는데에 필요하지는 않지만, 적어도 부분적으로는 FGF19 결합 위치에서 야생형 FGF19에 대한 M70의 경쟁에 기인한 것일 수 있다.
실시예 4는 제시된 전이유전자의 주입 전에 측정된 초기 마우스 체중 및 주입 후 3주, 5주 및 23주에 측정된 마우스 체중에 대한 영향을 개진한다. 도 4에 도시한 바와 같이, 체중에서의 극적인 효과는 FGF19 전이유전자만을 발현하는 마우스에서 덜 관찰되는 반면, FGF19 변이체 M70 및 FGF19를 공동발현하는 형질전환 db/db 마우스는 대조용이 투여된 동물에 비해 현저한 체중 감소를 보인다. FGF19 변이체 M70 및 FGF19를 공동발현하는 마우스에서 관찰된 체중의 변화는 또한 대조군의 동물로부터 수확된 간의 중량에 비해 감소된 간 중량으로도 반영된다.
체중 측정에 대한 것과 유사한 방식으로, 혈당에 대한 전이유전자 발현의 효과를 또한 전이유전자의 주입 전 및 주입 후 32주, 5주 및 23주에 평가하였다. 도 5에 제시된 결과는 FGF19 변이체 M70 및 FGF19를 공동발현하는 유전자 이식된 db/db 마우스가 대조군 마우스에 비해 혈당 농도가 현저히 감소됨을 나타낸다.
상기 연구 및 데이터의 확장으로서, 또한 실험 섹션의 실시예 6 내지 11에 제공된 바와 같이, 생체내 종양형성 모델을, 종양형성에서의 FGF19를 표적화하기 위한 노력으로 FGF19 유도된 간 발암성 물질을, 예를 들어, 담즙산 항상성에서의 이의 필수 역할의 타협없이 평가하기 위해 마우스에서 확립하였다. 실시예 7은 생체내 간세포 종양형성의 평가를 위한 AAV 유도된 전이유전자 시스템을 개진한다. FGF19 전이유전자 발현을, AAV 유도된 전달 방식을 사용하여 유도하였다(Zhang et al., 2009, Hum. Gene Ther. 20, 922-929). 실시예 8에 개진한 바와 같이, FGF19 변이체 패널을 생체내에서 평가하였고 M70을 포함하는 종양 비함유 변이체를 확인하였다. 놀랍게도, 실시예 8 및 9에 제공된 바와 같이, M70은 담즙산 항상성을 조정하는 유리한 활성을 유지하는 것으로 나타났고; M70은 또한 FGFR4를 결합 및 활성화시키는 것으로 나타났으며, 이는 FGF19 연관된 종양형성을 중재하는 것으로 추정된다(French et al., 2012, PloS one 7, e36713; Wu et al., 2010, J. Biol. Chem. 285, 5165-5170). 실시예 10에 제공된 바와 같이, FGF19는 M70에서 제거된 활성인 STAT3 경로를 활성화함으로써 기계론적으로 종양 진행을 자극하는 것으로 나타났다. 추가로, 실시예 11에 제공된 바와 같이, M70은 다수의 종양 모델에서 FGF19 의존적 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 실시예 12에 제공된 바와 같이, M70은 동계 마우스 모델에서 결장 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
따라서, 본원에 제공된 실시예에서, 유리한 기능(즉, 담즙산 대사)은 그대로 유지시키면서 잠재적인 유해 활성(즉, 종양형성)을 선택적으로 제거하기 위해 자연 호르몬이 가공된다. 대규모의 구조 활성 분석을 통해, M70은 FGFR4 수용체 복합체를 결합시키고 선택적으로 활성화시켜 담즙산 항상성을 유지시키는, 종양 비함유 FGF19 변이체로서 확인되었다. 위의 M70의 생리학적 수준에 장기간 노출된 마우스(db/db 마우스의 경우 24주, rasH2 마우스의 경우 52주)는 간 종양이 없었다(실시예 8; 도 7 및 8). M70은 또한 마우스 및 사람 암 이종이식편에서 FGF19 연관된 종양형성을 차단하는 것으로 나타났다(실시예 11, 도 11). 종양 비함유 FGF19 변이체가 이전에 확인되었지만(Wu et al., 2011, PloS one 6, e17868; Wu et al., 2010a, PNAS, 107, 14158-14163), 이들 변이체는 FGFR4 결합을 제거하도록 특수하게 설계되었고, 확장(extension)에 의해 담즙산 대사 조절을 악화시켰다. 대조적으로, M70은 FGFR4의 결합, 및 FGFR4의 Cyp7α1 및 pERK 경로 다운스트림의 조절에 유사한 효능 및 효율을 나타낸다(실시예 9 및 10; 도 9 및 10). 이들 결과는 간세포 종양형성을 야기하지 않는, FGFR4/KLB 수용체 복합체의 선택적 활성화의 생체내 증거를 제공한다.
M70과 FGF19 사이의 주요 차이점은 단백질의 N-말단에 있다. 각각의 FGF 패밀리 단백질은 구조적으로 보존된 중심 구형 도메인, 및 구조적으로 유연하고 1차 서열이 갈라진 측방 N-터미널 및 C-터미널 분절로 이루어져 있다(Beenken and Mohammadi, 2009, Nat. Rev. Drug Discov. 8, 235-253). 다수의 FGF/FGFR 복합체의 X선 결정 구조에서, FGF 분자의 N-터미널 분절은 FGFR과 특정 접촉을 만들고 FGF-FGFR 상호작용의 특이성을 측정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다(Beenken and Mohammadi, 2009, Nat. Rev. Drug. Discov. 8, 235-253). 우리의 전신성 생체내 선별의 노력을 통해, 5aa 결손과 커플링된 N-터미널에서 3개의 아미노산의 변화가 담즙산 조절과 같은 FGFR4 의존적 과정을 활성화하는 활성을 손상시키지 않으면서 종양형성을 제거하는 것으로 나타났다.
이론에 의해 제한하려는 것은 아니지만, 몇몇 증거들은 M70이 "바이어스(biased) 리간드" 또는 선택적 조절자의 약리학적 특성을 나타냄을 가리킨다. 예를 들어, 실시예 9 및 도 9에 제공된 바와 같이, M70은 야생형 FGF19와 유사한 효능 및 효율로 FGFR4의 세포외 도메인에 결합한다. M70은 FGFR4-KLB 또는 FGFR4로 형질전환된 세포 또는 내생적으로 FGFR4-KLB를 발현하는 세포에서의 ERK 인산화를 활성화한다. FGF19와 같이, M70은 원발성 간세포 및 마우스에서 잠재적으로 Cyp7α1을 억제한다. FGF19와 달리, M70은 간 종양 생성을 촉진하지 않는다. 이론에 의해 제한하려는 것은 아니지만, M70에 의한 종양형성의 결여는 간세포 발암 경로의 중요 신호화 분자인 pSTAT3의 활성화의 결여에 의해 설명될 수 있다.
실시예 10 및 도 10에 제공된 바와 같이, M70이 아니라 FGF19가 간에서 STAT3을 활성화하는 것으로 나타났다. STAT3은 간세포 종양발생의 주요 참가자이다(He and Karin, 2011, Cell Res. 21, 159-168). 인산화된(즉 활성화된) STAT3은 사람 HCC의 약 60%에서 발견된다(He et al., 2010, Cancer Cell 17, 286-297). STAT3 활성화는 또한 HCC 환자의 불량한 예후와 상관이 있다(alvisi et al., 2006, Gastroenterol. 130, 1117-1128). 구성적으로 활성인 STAT3은 세포 변환에서 종양 유전자로서 작용한다(Bromberg et al., 1999, Cell 98, 295-303). STAT3의 간세포-특이적 차단은 마우스에서의 HCC 진행을 방지하였다(He et al., 2010, Cancer cell 17, 286-297). STAT3 활성화의 억제제는 사람 암세포의 성장을 막고, HCC를 포함한 다양한 암의 치료를 위해 임상적으로 시험되었다(Chen et al., 2010, Clin. Cancer Res,16, 5189-5199; Karras et al., 2000, Cellular immunol. 202, 124-135; Lin et al., 2009, Oncogene 28, 961-972). 염증성 사이토킨 중에서 IL-6이 간에서의 주요 STAT3 활성화제인 것으로 상정된다(He et al., 2010, (He et al., 2010, Cancer cell 17, 286-297). IL-6 신호화가 간암 전구체의 악성 진행을 자극하는 것으로 나타났다(He et al., 2013, Cell 155, 384-396). 증가된 IL-6 생산이 증가된 HCC 위험과 연관된 담즙울혈성 병태인 원발성 담관경화증을 갖는 환자에서 관찰되었다(Kakumu et al., 1993, Gastroenterologia Japonica 28, 18-24). FGF19는 또한 생체내 STAT3 신호화를 활성화하는 것으로 실시예 10 및 도 10에서 보여진다. 이 효과는 FGFR4 수용체 복합체에 의해 직접 조정될 수 있거나 사이토카인 또는 성장인자의 도입을 통해 간접적으로 조정될 수 있다. 사실, IL-6의 발현은 우리의 연구에서 FGF19 처리된 동물의 간에서 증가된다(실시예 10; 도 10).
M70은 FGF19 결합을 대체하거나 방해할 수 있고 FGF19 연관된 종양형성을 억제하기 때문에, M70은 FGFR4의 오르토스테릭(orthosteric) 위치에 결합할 수 있다. 하지만 M70은 무차별로 동일한 정도로 모든 경로를 차단하지는 않는다. M70은 알로스테릭(allosteric) 조정자에 대해 관찰되는 바와 같이(도 12), 특정 FGFR4의 신호화 경로(즉, Cyp7α1, pERK)에 편향되고 다른 것들(즉, 종양)은 상대적으로 제외한다.
치료적 관점에서, 우리의 연구는 또한 만성 간 질환 및 간암에서의 M70의 사용에 대한 실험적 지원을 제공한다. M70은 FGF19 의존적 종양의 치료를 위한 항암제로서 유용할 수 있다(예를 들어, 실시예 8 및 11; 도 7, 8 및 11 참조). 이는 FGF19가 ~15% 사람 HCC에서 증폭되고 자주 종양 진행을 야기하는 경화증 및 담즙울혈성 병태에서 상향조절된다는 것을 고려하면 특히 그렇다. 선행 리포트는 이종이식편 모델에서 항종양 활성을 나타낸 항-FGF19 단클론 중화항체의 발달을 나타낸 반면(Desnoyers et al., 2008, Oncogene 27, 85-97), 이러한 전략은 심각한 역효과를 일으켰다. 이 항체를 시노몰구스 원숭이에게 투여하면 내인성 FGF19를 겨냥한 억제로 인해 심각한 설사를 동반한 용량-관련된 간 독성을 야기하고, 증가된 간 담즙산 합성, 상승된 혈청 담즙산, 장간순환의 교란, 및 설사와 간 독성의 발전을 초래한다((Pai et al., 2012, Toxicological sciences,126, 446-456).
실험 섹션에 제공된 바와 같이, 또한 중화항체와는 대조적으로, 우리의 연구는 M70이 종양형성성을 제거하는 반면, 담즙산 조절에 대한 FGF19의 활성을 유지시키는 것을 보여준다(예를 들어, 실시예 8, 9 및 11; 도 8, 9 및 11 참조). 이는 항암제로서 사용된 경우 담즙산 항상성의 보존을 보장한다. 중요하게, 본원에 제공된 실험 데이터는 M70이 종양형성 잠재성을 결여시킬 뿐만 아니라 야생형 FGF19와 연관된 종양형성 효과를 효과적으로 방해할 수 있음을 나타낸다. 게다가, M70은 FGF19 매개된 HCC 이외에도 결장암 이종이식편 종양의 성장을 억제한다. M70은 또한 동종 마우스 모델에서의 결장암의 성장도 억제한다(예를 들어, 실시예 12 및 도 13 참조). 이들 결과는 M70이 선택적 FGFR4 조절자로서 FGF19의 발암활성을 길항한다는 것을 확인해준다.
실험 섹션에 제공된 바와 같이, 강력한, 높은 처리량 시스템이 또한 성체 마우스에서 AAV 매개된 유전자 전달을 사용하여 간세포 종양형성에서의 다수의 단백질을 평가하기 위해 확립되었다. 정위(orthotopic) 위치(간)에서의 FGF19의 과발현은 다수의 마우스 계통에서 간 형성이상 및 HCC의 발달을 야기하는 것으로 나타났다. 이는 배아형성에서의 교란인자 및 전통적인 형질전환 마우스 처리방법의 발전을 저해한다. 디에틸니트로스아민(DEN) 또는 페노바르비탈과 같은 화학적 종양 촉진자가 종양 개시 또는 촉진에 필요하지 않다. 동일한 처리방법을 기타 종양유전자, 신호화 단백질 뿐만 아니라 자연 단백질의 변이체를 평가하는데에 적용할 수 있다.
FGF19는 생물학적 효과군을 나타낸다. FGF19에 대한 치료적 잠재성은 만성 간질환 뿐만 아니라 비만 및 당뇨병의 치료를 포함한, 간세포 증식 및 암종 가능성의 촉진은 만성적 사용을 위한 FGF19의 개발을 곤란하게 한다. 그러나, 잠재적 대사 특성은 유지하면서 종양형성성은 없는 가공된 FGF19 변이체로서의 M70의 확인으로, 원치않는 부작용없이 치료적 이점이 성취될 수 있었다. 우리의 결과는 FGFR4-KLB 수용체 복합체의 선택적 활성화가 간 종양 생성을 유도하지 않지만, 암, 담즙산 조절이 해제된 질환, 타입 2 당뇨병 및 기타 대사 장애를 치료하기 위해 이 경로를 사용할 새로운 방법을 추가로 제공하는 것을 확인해준다.
폴리펩타이드 및 핵산 분자
본 기재는 또한 본원에 기재된 폴리펩타이드 서열로부터 유도된 인접한 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 활성 단편(예를 들어, 서브서열)을 고려한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 인접한 아미노산 잔기의 길이는 서브서열이 유도되는 특정한 자연 발생적 아미노산 서열에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 펩타이드 및 폴리펩타이드는 약 5개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 75개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 또는 약 100개의 아미노산 내지 전장 폴리펩타이드이다.
본원에 제공된 FGF19 변이체 폴리펩타이드의 특정 실시양태에서, 아미노산 잔기(또는 이의 미메틱)의 총 수는 약 250개 미만이다. 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기의 수는 약 190 내지 약 230개, 약 200 내지 약 225개, 또는 약 210 내지 약 220개이다. 다른 추가의 실시양태에서, 아미노산 잔기의 수는 180개 초과, 185개 초과, 190개 초과, 195개 초과, 200개 초과, 205개 초과, 210개 초과, 215개 초과, 220개 초과 또는 225개 초과이다.
추가로, 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 인접한 아미노산의 한정된 길이에 걸친 기준 서열과 비교하여 한정된 서열 정체성을 갖는다(예를 들어, "비교 윈도우"). 비교 서열의 배열 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 비교 서열의 최적의 배열은, 예를 들어, 국소적 상동 알고리즘(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))에 의해, 상동 배열 알고리즘(Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))에 의해, 유사성 방법의 검색에 의해(Pearson & Lipman, Proc. Nat?l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), 이들 알고리즘의 전산화된 구현에 의해(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, the Wisconsin Genetics Software Package, Madison, Wis), 또는 수동 배열 및 시각적 검사에 의해(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)) 수행될 수 있다.
예로서, 몇몇 실시양태에서, 적합한 폴리펩타이드는 본원에 기재된 아미노산 서열 중 하나의 약 5개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 12개의 아미노산, 약 12개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 35개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 45개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 70개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 80개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산, 약 110개의 아미노산 내지 약 120개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 130개의 아미노산, 약 130개의 아미노산 내지 약 140개의 아미노산, 약 140개의 아미노산 내지 약 150개의 아미노산, 약 150개의 아미노산 내지 약 160개의 아미노산, 약 160개의 아미노산 내지 약 170개의 아미노산, 약 170개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 180개의 아미노산 내지 약 190개의 아미노산, 또는 약 194개의 아미노산의 인접한 스트레치와 아미노산 서열이 약 75% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연 공급원(예를 들어, 자연 발생적 환경 이외의 환경)으로부터 분리되고, 또한 (박테리아, 이스트, 피치아(Pichia), 곤충 세포 등과 같은 유전적으로 개질된 숙주 세포에서) 재조합적으로 합성될 수 있으며, 유전적으로 개질된 숙주 세포는 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로 개질된다. 폴리펩타이드는 또한 (예를 들어, 세포 비함유 화학적 합성에 의해) 합성적으로 생성될 수 있다. 생산 방법은 아래에 보다 상세히 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 코드화할 수 있는 구조를 제공하는 것으로 당해 기술 분야에 알려진 상이한 FGF19 관련 핵산을 다루는 재조합 기술을 사용하여 생성한다. 특정 아미노산 서열이 제공되는 경우, 통상의 숙련가가, 예를 들어, 분자 생물학에서의 배경 및 경험 면에서 이러한 아미노산 서열을 코드화하는 다양한 상이한 핵산 분자를 인지할 것이라는 것을 알게 될 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 기재는 또한 아미노산 서열이 기준 서열(예를 들어, 상응하는 야생형 서열)과 비교해 (예를 들어, 변이체 또는 종에 걸쳐 보존되지 않는 위치가) 하나 이상 변경된 아미노산을 제공한다. 이러한 폴리펩타이드는 종들 중에서 보존되고 자연 발생적 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 활성을 갖는 도메인을 흔히 보유한다. 이러한 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 구 "보존적 아미노산 치환"은 일반적으로 아미노산 잔기의 치환이 다음 그룹 내인 것을 말한다: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; 및 6) D, E. 보존적 아미노산 치환은 단백질 중의 아미노산(들)을 산성, 염기성, 전하, 극성 또는 측쇄의 크기가 유사한 측쇄로 대체함으로써 단백질의 활성을 보존한다. 치환, 삽입 또는 결손의 가이드는 상이한 변이체 단백질 또는 상이한 종으로부터의 단백질의 아미노산 서열의 배열을 기초로 한다.
특정 실시양태에서, FGF19의 루프(Loop)-8 영역으로의 개질이 고려된다. 여기서, FGF19 127-129(서열 번호 3)는, 문헌에서 루프-8 영역이 종종 다른 잔기(예를 들어, 125-129)를 포함하거나 이로 이루어지는 것으로 정의되더라도, 루프-8 영역을 구성하는 것으로 정의된다. FGF19 프레임워크(framework)에 대한 R127L 및 P128E 치환의 특정 조합은 HCC 생성에 대해 예상치않게 긍정적인 효과가 있었다. FGF19 코어 영역에서의 R127L 및 P128E 치환의 조합, 및 Leu(L)에 대한 Gln(Q)의 치환이 또한 HCC 생성을 방지하는데에 큰 효과가 있었다.
따라서, FGF19의 루프-8 영역의 변이체는 상당한 측정가능한 또는 제거가능한 HCC 생성을 줄이거나 제거할 수 있기 때문에 포함된다. 추가로, HCC 생성의 감소 효과는 루프-8 영역 밖의 아미노산 잔기로의 개질(예를 들어, 서열 번호 3의 아미노산 21-29에 상응하는 영역과 같은 코어 영역에서의 아미노산 잔기의 치환)에 의해 증가될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 루프-8 개질된 변이체는 FGF19 루프-8 영역에서의 치환(밑줄친 부분)을 포함하는 M70이다: MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDS16MDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(서열 번호 70). 특정 실시양태에서, 루프-8 개질된 M70 변이체는 (i) R127L 치환, (ii) P128E 치환 또는 (iii) R127L 치환 및 P128E 치환에 상응하는 FGF19 루프-8 영역에서의 치환(밑줄친 부분)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 루프-8 개질된 M70 변이체는 FGF19 코어 영역에서의 치환을 포함하거나 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 루프-8 개질된 M70 변이체는 L18Q 치환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 루프-8 개질된 변이체는 M5(서열 번호 5), M6(서열 번호 6), M7(서열 번호 7), M14(서열 번호 8), M15(서열 번호 9), M32(서열 번호 10), M36(서열 번호 11), M43(서열 번호 12), M50(서열 번호 13), M52(서열 번호 14), M53(서열 번호 15), M67(서열 번호 16), M68(서열 번호 17), M69(서열 번호 18), M70(서열 번호 1 또는 19), M75(서열 번호 20), M76(서열 번호 21), M77(서열 번호 22), M83(서열 번호 23), M84(서열 번호 24), M140(서열 번호 25), M5-R(서열 번호 26), M6-R(서열 번호 27), M50-R(서열 번호 28) 또는 M160(서열 번호 29)이다. 몇몇 실시양태에서, 루프-8 개질된 변이체는 서열 번호 3의 아미노산 127-129에 상응하는 FGF19 루프-8 영역에서의 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 루프-8 개질된 변이체는 (i) R127L 치환, (ii) P128E 치환 또는 (iii) R127L 치환 및 P128E 치환에 상응하는 FGF19 루프-8 영역에서의 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 3의 아미노산 21-29에 상응하는 코어 영역에서의 치환을 포함하거나 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 L22Q 치환에 상응하는 코어 영역에서의 치환을 포함하거나 추가로 포함한다.
본원에 기재된 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산 분자가 이들의 자연 발생적 및 비자연 발생적 이소폼(isoform), 대립유전자 변이체 및 스플라이스 변이체를 포함하여 본 기재에 의해 고려된다. 본 기재는 또한 자연 발생적 DNA 서열과 하나 이상의 염기가 다르나 유전 코드의 변성으로 인해 폴리펩타이드에 상응하는 아미노산 서열로 여전히 번역되는 핵산 서열을 포함한다.
아미드 결합 치환
몇몇 경우에서, 폴리펩타이드는 펩타이드 결합 이외에 하나 이상의 결합을 포함하고, 예를 들어, 적어도 2개의 인접한 아미노산이 아미드 결합 이외의 결합을 통해 연결된다. 예를 들어, 바람직하지 않은 단백질분해 또는 기타 분해 수단을 저하시키거나 제거하기 위해 및/또는 혈청 안정성을 증가시키기 위해 및/또는 형태 유연성을 제한하거나 증가시키기 위해 폴리펩타이드의 백본 내의 하나 이상의 아미드 결합이 치환될 수 있다.
다른 예에서, 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 아미드 결합(-CO-NH-)이 -CH2NH-, CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 또는 -CH2SO-와 같은 아미드 결합의 등배전자체(等倍電子體, isostere)인 결합으로 대체될 수 있다. 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 아미드 결합은 또한, 예를 들어, 환원된 등배전자체 슈도펩타이드 결합에 의해 대체될 수 있다(Couder et al. (1993) Int. J. Peptide Protein Res. 41:181-184 참조). 이러한 대체 및 수행 방법은 당해 기술 분야의 통상의 숙련가에게 알려져 있다.
아미노산 치환
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환이 폴리펩타이드 내에서 있을 수 있다. 다음은 비제한적 예이다:
a) 측쇄, 사이클릭 및 직쇄 알킬, 알케닐 또는 알키닐 치환을 포함한 C1-C10 탄소로부터의 지방족 측쇄에 의해 치환된 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 노르류신, (S)-2-아미노부티르산, (S)-사이클로헥실알라닌 또는 기타 단순한 알파-아미노산을 포함하는, 알킬 치환된 소수성 아미노산의 치환;
b) 하기 방향족 아미노산의 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아자, 할로겐화(플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도) 또는 알콕시(C1-C4) 치환된 형태, 예를 들어, 2-, 3- 또는 4-아미노페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-클로로페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-메틸페닐알라닌, 2-, 3- 또는 4-메톡시페닐알라닌, 5-아미노, 5-클로로, 5-메틸 또는 5-메톡시트립토판, 2'-, 3'- 또는 4'-아미노-, 2'-, 3'- 또는 4'-클로로-, 2-, 3- 또는 4-바이페닐알라닌, 2'-, 3'- 또는 4'-메틸-, 2-, 3- 또는 4-바이페닐알라닌, 및 2- 또는 3-피리딜알라닌을 포함하는, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 설포티로신, 바이페닐알라닌, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 2-벤조티에닐알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 히스티딘을 포함하는, 방향족 치환된 소수성 아미노산의 치환;
c) 하기 아미노산의 알킬, 알케닐 또는 아릴 치환된(C1-C10 측쇄, 선형 또는 사이클릭) 유도체를 포함하는(치환체가, 예를 들어, 프로-R 위치에서 헤테로원자(알파 질소 또는 원위 질소)에 있던지 또는 알파 탄소에 있던지), 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 호모아르기닌을 포함하는, 염기성 측쇄를 함유하는 아미노산의 치환. 예로서 제공되는 화합물은 다음을 포함한다: N-ε-이소프로필-리신, 3-(4-테트라하이드로피리딜)-글리신, 3-(4-테트라하이드로피리딜)-알라닌, N,N-γ,γ'-디에틸-호모아르기닌. 또한 α-메틸-아르기닌, α-메틸-2,3-디아미노프로피온산, α-메틸-히스티딘, α-메틸-오르니틴과 같은, 알킬 그룹이 알파-탄소의 프로-R 위치를 차지하는 화합물들이 포함된다. 또한 알킬, 방향족, 헤테로방향족(여기서 헤테로방향족 그룹은 하나 이상의 질소, 산소 또는 황원자를 단독으로 또는 조합으로 갖는다) 카복실산, 또는 산 클로라이드, 활성 에스테르, 활성 아졸라이드 및 관련 유도체와 같은 다수의 잘 알려진 임의의 활성화 유도체 및 리신, 오르니틴 또는 2,3-디아미노프로피온산으로부터 생성된 아미드도 포함된다;
d) 아스파르트산, 글루탐산, 호모글루타민산, 티로신, 2,4-디아미노프로피온산의 알킬, 아릴, 아릴알킬 및 헤테로아릴 설폰아미드, 오르니틴 또는 리신 및 테트라졸 치환된 알킬 아미노산을 포함하는, 산성 아미노산의 치환;
e) 아스파라긴, 글루타민, 및 아스파라긴 또는 글루타민의 알킬 또는 방향족 치환된 유도체를 포함하는, 측쇄 아미드 잔기의 치환; 및/또는
f) 세린, 트레오닌, 호모세린, 2,3-디아미노프로피온산, 및 세린 또는 트레오닌의 알킬 또는 방향족 치환된 유도체를 포함하는, 하이드록실 함유 아미노산의 치환.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩타이드는 자연 발생적인, 비유전적으로 코드화된 L-아미노산, 합성 L-아미노산 또는 아미노산의 D-거울상이성질체를 하나 이상 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 다음 잔기 중 하나 이상을 포함한다: 하이드록시프롤린, β-알라닌, o-아미노벤조산, m-아미노벤조산, p-아미노벤조산, m-아미노메틸벤조산, 2,3-디아미노프로피온산, α-아미노부티르산, N-메틸글리신(사르코신), 오르니틴, 시트룰린, t-부틸알라닌, t-부틸글리신, N-메틸이소류신, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 노르류신, 나프틸알라닌, 피리딜알라닌, 3-벤조티에닐 알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 페니실아민, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, β-2-티에닐알라닌, 메티오닌 설폭사이드, 호모아르기닌, N-아세틸 리신, 2,4-디아미노 부티르산, rho-아미노페닐알라닌, N-메틸발린, 호모시스테인, 호모세린, ε-아미노헥산산, ω-아미노헥산산, ω-아미노헵탄산, ω-아미노옥탄산, ω-아미노데칸산, ω-아미노테트라데칸산, 사이클로헥실알라닌, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, δ-아미노 발레르산 및 2,3-디아미노부티르산.
추가 개질
몇몇 실시양태에서, 시스테인 잔기 또는 시스테인 유사체가 폴리펩타이드로 도입되어 다이설파이드 결합을 통해 다른 펩타이드로의 결합을 제공하거나 폴리펩타이드의 환화를 제공한다. 시스테인 또는 시스테인 유사체의 도입방법은 당해 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,067,532호를 참조한다.
다른 실시양태에서, 폴리펩타이드가 환화된다. 예를 들어, 하나 이상의 시스테인 또는 시스테인 유사체가 폴리펩타이드로 도입될 수 있고, 도입된 시스테인 또는 시스테인 유사체는 두 번째로 도입된 시스테인 또는 시스테인 유사체와 다이설파이드 결합을 생성시킬 수 있다. 다른 환화 방법은 옥심 링커 또는 란티오닌 링커의 도입을 포함하고, 예를 들어 미국 특허 제8,044,175호를 참조한다. 환화 결합을 생성시킬 수 있는 아미노산(또는 비아미노산 잔기)의 임의 조합이 사용될 수 있고/있거나 도입될 수 있다. 환화 결합은 브릿지의 도입을 가능하게 하는 관능성 그룹과 아미노산의(또는 아미노산과 -(CH2)n-CO- 또는 -(CH2)n-C6H4-CO-의) 임의 조합으로 생성될 수 있다. 몇몇 예는 다이설파이드, -(CH2)n- 카바(carba) 브릿지와 같은 다이설파이드 미메틱, 티오아세탈, 티오에테르 브릿지(시스타티오닌 또는 란티오닌), 및 에스테르와 에테르를 함유하는 브릿지이다. 이들 예에서, n은 임의 정수일 수 있으나, 주로 10 미만이다.
다른 예시적 개질은, 예를 들어, N-알킬(또는 아릴) 치환(ψ[CONR]), 또는 락탐 및 기타 사이클릭 구조를 구성하는 백본 가교결합을 포함한다. 본 기재의 조절자 화합물의 기타 유도체는 C-터미널 하이드록시메틸 유도체, O-개질된 유도체(예를 들어, C-터미널 하이드록시메틸 벤질 에테르), 알킬아미드 및 하이드라지드와 같은 치환된 아미드를 포함하는 N-터미널 개질된 유도체를 포함한다.
몇몇 경우에, 폴리펩타이드의 하나 이상의 L-아미노산이 D-아미노산으로 대체된다.
몇몇 경우에, 폴리펩타이드는 레트로-인버소(retro-inverso) 유사체이다(Sela and Zisman (1997) FASEB J. 11:449). 레트로-인버소 펩타이드 유사체는, 아미노산 서열의 방향이 뒤집히고(retro) 하나 이상의 아미노산의 D- 또는 L-이 반대인(invers), 예를 들어, L-아미노산보다는 D-아미노산을 사용하는, 선형 폴리펩타이드의 아이소머이다(예를 들어, Jameson et al. (1994) Nature 368:744; 및 Brady et al. (1994) Nature 368:692 참조).
폴리펩타이드는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 탄수화물, 또는 유기 또는 무기 화합물이 지방 이중층, 교질 입자, 세포막, 세포기관막 또는 소낭막을 횡단하는 것을 용이하게 하는 것을 지칭하는 "단백질 변환 도메인(PTD)"을 포함할 수 있다. 다른 분자에 부착된 PTD는 분자가 막을 횡단하는 것을, 예를 들어, 세포외 공간에서 세포내 공간으로 또는 시토졸이 세포기관으로 가는 것을 용이하게 한다. 몇몇 실시양태에서, PTD는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 공유결합되고, 다른 실시양태에서는 PTD는 폴리펩타이드의 카복실 말단에 공유결합된다. 예시적 단백질 변환 도메인은 미니멀 운데카펩타이드 단백질 변환 도메인(YGRKKRRQRRR(서열 번호 30)을 포함하는 HIV-1 TAT의 잔기 47-57에 상응); 세포로 직접 유입되기 충분한 다수의 아르기닌(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 내지 50개의 아르기닌)을 포함하는 폴리아르기닌 서열; VP22 도메인(Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); Drosophila antennapedia 단백질 변환 도메인(Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); 절단된 사람 칼시토닌 펩타이드(Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); 폴리리신(Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR(서열 번호 31); 트란스포르탄 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(서열 번호 32); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(서열 번호 33); 및 RQIKIWFQNRRMKWKK(서열 번호 34)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적 PTD는 YGRKKRRQRRR(서열 번호 30), RKKRRQRRR(서열 번호 35); 3 내지 50개의 아르기닌 잔기의 아르기닌 단독중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적 PTD 도메인 아미노산 서열은 다음 중 어느 하나를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: YGRKKRRQRRR(서열 번호 30); RKKRRQRR(서열 번호 36); YARAAARQARA(서열 번호 37); THRLPRRRRRR(서열 번호 38); 및 GGRRARRRRRR(서열 번호 39).
폴리펩타이드의 C-터미널 종점의 아미노산의 카복실 그룹 COR3은 유리 형태(R3=OH)로, 또는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염과 같은 생리학적으로 허용되는 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토금속 염의 형태로 존재할 수 있다. 카복실 그룹은 또한 메탄올, 측쇄 또는 비측쇄 C1-C6 알킬 알콜, 예를 들어, 에틸 알콜 또는 3급 부탄올과 같은 1급, 2급 또는 3급 알콜과 에스테르화될 수 있다. 카복실 그룹은 또한 암모니아, 측쇄 또는 비측쇄 C1-C6 알킬아민, 예를 들어, 메틸아민 또는 디메틸아민과 같은 1급 또는 2급 아민과 아미드화될 수 있다.
폴리펩타이드의 N-말단의 아미노산 NR1R2의 아미노 그룹은 유리 형태(R1=H 및R2=H)로, 또는 클로라이드 또는 아세테이트와 같은 생리학적으로 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다. 아미노 그룹은 또한 산과 아세틸화되어 R1=H 및 R2=아세틸, 트리플루오로아세틸 또는 아다만틸이 될 수 있다. 아미노 그룹은, 예를 들어, Fmoc, 벤질옥시카보닐(Z), Boc 또는 Alloc과 같은, 펩타이드 화학에 통상 사용되는 아미노 보호 그룹에 의해 보호된 형태로 존재할 수 있다. 아미노 그룹은 N-알킬화되어 R1 및/또는 R2= C1-C6 알킬, C2-C8 알케닐 또는 C7-C9 아르알킬일 수 있다. 알킬 잔기는 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭(예를 들어, 각각 에틸, 이소프로필 및 사이클로헥실)일 수 있다.
폴리펩타이드의 생성 방법
본 기재의 폴리펩타이드는 재조합 및 비재조합 방법을 포함한 적합한 방법(예를 들어, 화학적 합성)으로 생성시킬 수 있다.
A. 화학적 합성
폴리펩타이드를 화학적으로 합성하는 경우, 합성은 액상 또는 고형상을 거쳐 진행될 수 있다. 고형상 펩타이드 합성(SPPS)은 비천연 아미노산 및/또는 펩타이드/단백질 백본 개질의 도입을 가능케 한다. Fmoc 또는 Boc와 같은 다양한 형태의 SPPS가 본 기재의 폴리펩타이드를 합성하는데에 이용가능하다. 화학적 합성의 상세한 사항은 당해 기술 분야에 알려져 있다(예를 들어, Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; 및 Camarero J.A. et al., 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8).
고형상 펩타이드 합성은 이후 기재하는 바와 같이 수행할 수 있다. α 관능기(Nα) 및 임의의 반응성 측쇄를 산 불안정성 또는 염기 불안정성 그룹으로 보호시킨다. 보호 그룹은 아미드 결합을 연결시키는 조건하에서 안정하지만 생성된 펩타이드 쇄를 손상시키지 않으면서 쉽게 분리될 수 있다. α-아미노 관능기를 위한 적합한 보호 그룹은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: t-부틸옥시카보닐(Boc), 벤질옥시카보닐(Z), o-클로로벤질옥시카보닐, 바이-페닐이소프로필옥시카보닐, 3급-아밀옥시카보닐(Amoc), α,α-디메틸-3,5-디메톡시-벤질옥시카보닐, o-니트로설페닐, 2-시아노-t-부톡시-카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸(Dde) 등.
적합한 측쇄 보호 그룹은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 아세틸, 알릴(All), 알릴옥시카보닐(Alloc), 벤질(Bzl), 벤질옥시카보닐(Z), t-부틸옥시카보닐(Boc), 벤질옥시메틸(Bom), o-브로모벤질옥시카보닐, t-부틸(tBu), t-부틸디메틸실릴, 2-클로로벤질, 2-클로로벤질옥시카보닐(2-CIZ), 2,6-디클로로벤질, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸(Dde), 이소프로필, 4-메톡시-2,3-6-트리메틸벤질설포닐(Mtr), 2,3,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc), 피발릴, 테트라하이드로피란-2-일, 토실(Tos), 2,4,6-트리메톡시벤질, 트리메틸실릴 및 트리틸(Trt).
고형상 합성에서, C-터미널 아미노산을 적합한 지지체 물질에 커플링시킨다. 적합한 지지체 물질은 합성 방법의 단계적 축합 및 분리 반응을 위한 시약 및 반응 조건에 대해 불활성이고 사용되는 반응 매질에 용해되지 않는 물질이다. 시판중인 지지체 물질의 예는 반응성 그룹 및/또는 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체; 클로로메틸화된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체; 하이드록실메틸화 또는 아미노메틸화된 스티렌/디비닐벤젠 공중합체 등을 포함한다. 펩타이드산을 제조하고자 하는 경우 4-벤질옥시벤질-알콜(Wang-앵커) 또는 2-클로로트리틸 클로라이드로 유도체화된 폴리스티렌(1%)-디비닐벤젠 또는 TentaGel®이 사용될 수 있다. 펩타이드 아미드의 경우, 5-(4'-아미노메틸)-3',5'-디메톡시페녹시)발레르산(PAL-앵커) 또는 p-(2,4-디메톡시페닐-아미노 메틸)-페녹시 그룹(Rink 아미드 앵커)으로 유도체화된 폴리스티렌(1%)-디비닐벤젠 또는 TentaGel®이 사용될 수 있다.
중합체성 지지체로의 결합은 실온 또는 승온(예를 들어, 40 내지 60℃)에서, 예를 들어, 2 내지 72시간의 반응 시간으로 에탄올, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄, 테트라하이드로푸란, N-메틸피롤리돈 또는 유사한 용매 중에서 활성화 시약을 첨가하면서 C-터미널 Fmoc-보호된 아미노산을 지지체 물질과 반응시킴으로써 성취할 수 있다.
Nα 보호된 아미노산(예를 들어, Fmoc 아미노산)의 PAL, Wang 또는 Rink 앵커로의 커플링은, 예를 들어, 1-하이드록시벤조트리아졸 또는 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸의 존재 또는 부재하에 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC) 또는 기타 카보디이미드, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU) 또는 기타 우로늄염, o-아실-우레아, 벤조트리아졸-1-일-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP) 또는 기타 포스포늄염, N-하이드록시석신이미드, 기타 N-하이드록시이미드 또는 옥심과 같은 커플링 시약의 도움으로, 예를 들어 HOBT를 첨가하면서, 예를 들어 디이소프로필에틸아민(DIEA), 트리에틸아민 또는 N-메틸모르폴린과 같은 염기, 예를 들어, 디이소프로필에틸아민을 첨가하거나 하지 않으면서 TBTU의 도움으로 2 내지 72시간의 반응 시간으로 수행할 수 있다(예를 들어, 1.5 내지 3배 과잉의 아미노산과 커플링 시약 중에서, 예를 들어, 2배 과잉으로 약 10 내지 50℃의 온도, 예를 들어 25℃에서 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 또는 디클로로메탄과 같은 용매, 예를 들어, 디메틸포름아미드 중에서 3시간).
커플링 시약 대신에, 위에 기재한 조건하에서 활성 에스테르(예를 들어, 펜타플루오로페닐, o-니트로페닐 등), Nα-Fmoc-아미노산의 대칭 무수물, 이의 산 클로라이드 또는 산 플루오라이드를 사용할 수도 있다.
Nα 보호된 아미노산(예를 들어, Fmoc 아미노산)은 디클로로메탄 중에서 DIEA를 첨가하면서 10 내지 120분, 예를 들어, 20분의 반응 시간으로 2-클로로트리틸 수지에 커플링시킬 수 있으나, 이 용매 및 이 염기의 사용으로 제한되지 않는다.
보호된 아미노산의 연속 커플링을 통상의 펩타이드 합성 방법에 따라 전형적으로는 자동화 펩타이드 합성기에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 5 내지 20분 동안 디메틸포름아미드 중 피페리딘(10% 내지 50%)을 사용한 처리, 예를 들어, DMF 중 50% 피페리딘으로 2×2분 또는 DMF 중 20% 피페리딘으로 1×15분 처리에 의한 고형상의 커플링된 아미노산의 Nα-Fmoc 보호 그룹의 분리 후, 3 내지 10배 과잉, 예를 들어 10배 과잉의 다음 보호된 아미노산을 디클로로메탄, DMF 또는 이들의 혼합물과 같은 불활성, 비수성 극성 용매 중에서 약 10 내지 50℃, 예를 들어, 25℃에서 이전 아미노산에 커플링시킨다. 최초 Nα-Fmoc 아미노산을 PAL, Wang 또는 Rink 앵커로 커플링시키기 위한 위에 언급된 시약이 커플링 시약으로서 적합하다. 보호된 아미노산의 활성 에스테르, 또는 이의 클로라이드 또는 플루오라이드또는 대칭 무수물이 또한 대체물로서 사용될 수 있다.
고형상 합성의 종결시에, 펩타이드를 지지체 물질로부터 분리하면서 동시에 측쇄 보호 그룹을 분리한다. 분리는 5 내지 20% V/V의 디메틸설파이드, 에틸메틸설파이드, 티오아니솔, 티오크레졸, m-크레졸, 아니솔, 에탄디티올, 페놀 또는 물과 같은 스캐빈저, 예를 들어 15% V/V의 디메틸설파이드/에탄디티올/m-크레졸 1:1:1을 첨가하면서 0.5 내지 3시간, 예를 들어 2시간 내에 트리플루오로아세트산 또는 기타 강산성 매질을 사용하여 수행할 수 있다. 완전히 보호된 측쇄를 갖는 아미노산은 빙초산/트리플루오로에탄올/디클로로메탄 2:2:6을 사용하여 2-클로로트리틸 앵커를 분리함으로써 수득한다. 보호된 펩타이드는 실리카겔에서 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 펩타이드가 Wang 앵커를 통해 고형상에 결합되어 있고 C-터미널 알킬아미드화된 펩타이드를 수득하고자 한다면, 상기 분리는 알킬아민 또는 플루오로알킬아민을 사용한 아미노분해로 수행할 수 있다. 아미노분해는 약 -10 내지 50℃(예를 들어 약 25℃)의 온도에서 약 12 내지 24시간(예를 들어 약 18시간)의 반응 시간으로 수행한다. 또한, 펩타이드는, 예를 들어, 메탄을 사용한 재에스테르화에 의해 지지체로부터 분리될 수 있다.
수득된 산성 용액을 3 내지 20배 과잉의 찬 에테르 또는 n-헥산, 예를 들어, 10배 과잉의 디에틸 에테르와 혼합하여 펩타이드를 침전시키고, 이에 따라 상기 에테르에 남아 있는 스캐빈저 및 분리된 보호 그룹을 분리시킨다. 펩타이드를 빙초산으로 수 회 재침전시켜 추가 정제를 수행할 수 있다. 수득된 침전물을 물 또는 3급-부탄올 또는 이들 두 용매의 혼합물, 예를 들어, 3급-부탄올/물의 1:1 혼합물에 용해시키고 냉동건조시킬 수 있다.
수득된 펩타이드를 아세테이트 형태의 약염기성 수지에서의 이온 교환; 비유도체화된 폴리스티렌/디비닐벤젠 공중합체(예를 들어, Amberlite® XAD)에서의 소수성 흡착 크로마토그래피; 실리카겔에서의 흡착 크로마토그래피; 예를 들어, Sephadex® G-25에서의 이온 교환 크로마토그래피; 역류 분배 크로마토그래피; 또는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 예를 들어, 옥틸 또는 옥타데실실릴실리카(ODS) 상에서의 역상 HPLC를 포함한 다양한 크로마토그래피 방법으로 정제할 수 있다.
B. 재조합 생산
폴리펩타이드를 재조합 기술을 사용하여 생성시키는 경우, 각각 세균성 세포(예를 들어, 대장균) 또는 이스트 숙주 세포와 같은 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있는 임의의 적합한 구조 및 임의의 적합한 숙주 세포를 사용하여 세포내 단백질 또는 분비된 단백질로서 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 숙주 세포로서 사용될 수 있는 진핵생물 세포의 기타 예는 곤충 세포, 포유동물 세포 및/또는 식물 세포를 포함한다. 포유동물 숙주 세포가 사용되는 경우, 이들 세포는 사람 세포(예를 들어, HeLa, 293, H9 및 Jurkat 세포); 마우스 세포(예를 들어, NIH3T3, L 세포 및 C127 세포); 영장류 세포(예를 들어, Cos 1, Cos 7 및 CV1) 및 햄스터 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 발현에 적합한 다양한 숙주-벡터 시스템을 당해 기술 분야에 알려진 표준 방식에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어, "Sambrook et al., 1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press, New York; 및 Ausubel et al. 1995 Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Wiley and Sons"를 참조한다. 유전 물질을 숙주 세포로 도입하는 방법은, 예를 들어, 형질전환, 전기천공, 컨주게이션, 인산칼슘 방법 등을 포함한다. 전달 방법은 도입된 폴리펩타이드 코드화 핵산의 안정한 발현을 제공하도록 선택할 수 있다. 폴리펩타이드 코드화 핵산은 유전되는 에피솜 구성요소(예를 들어, 플라스미드)로서 제공될 수 있거나, 유전암호가 통합될 수 있다. 관심 폴리펩타이드의 생성에 사용하기 위한 다양한 적합한 벡터는 시판중이다.
벡터는 숙주 세포에서 염색체외 유지를 제공할 수 있거나 숙주 세포 유전체로의 통합을 제공할 수 있다. 발현 벡터는 전사 및 번역 규제 서열을 제공하고, 코드화 영역이 전사 개시 영역, 및 전사 및 번역 종결 영역의 전사 조절하에서 사용가능하게 연결되는 유도가능한 발현 또는 구성적 발현을 제공할 수 있다. 일반적으로, 전사 및 번역 규제 서열은 촉진자 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 중지 서열, 번역 개시 및 중지 서열, 및 증강자 또는 활성자 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 촉진자는 구성적이거나 유도가능한 것일 수 있고, 강한 구성적 촉진자일 수 있다(예를 들어, T7).
발현 구조는 일반적으로 관심 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 촉진자 서열 근처에 위치한 편리한 제한 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 가동되는 선택가능한 마커가 벡터를 함유하는 세포의 선택을 용이하게 하기 위해 존재할 수 있다. 게다가, 발현 구조는 추가의 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 하나 또는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있어서, 상기 벡터가 발현을 위해 유기체, 예를 들어, 포유동물 또는 곤충 세포에 및 클론화 및 증폭을 위해 원핵생물 숙주에 유지되는 것이 가능하다. 또한, 발현 구조는 선택가능한 마커 유전자를 함유하여 형질전환된 숙주 세포의 선택을 가능케 한다. 선택가능한 유전자는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고 사용된 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
단백질의 분리 및 정제를 당해 기술 분야에 알려진 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 단백질을, 구조적으로 및/또는 도입시 단백질을 발현하도록 유전적으로 개질된 세포의 용해물로부터 또는 합성 반응 혼합물로부터 샘플을 항단백질 항체와 접촉시키고 비특이적으로 결합된 물질을 제거하기 위해 세척하고 특이적으로 결합된 단백질을 용출시킴을 일반적으로 포함하는 면역친화성 정제에 의해 분리할 수 있다. 분리된 단백질은 단백질 정제방법에 통상 사용되는 투석 및 기타 방법으로 추가로 정제할 수 있다. 한 실시양태에서, 단백질을 금속 킬레이트 크로마토그래피 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 단백질은 분리를 용이하게 하기 위해 개질될 수 있다.
폴리펩타이드는 실질적으로 순수한 형태 또는 분리된 형태(예를 들어, 기타폴리펩타이드 비함유)로 제조할 수 있다. 폴리펩타이드는, 존재하는 다른 성분들(예를 들어, 기타 폴리펩타이드 또는 기타 숙주 세포 구성성분)에 비해 폴리펩타이드가 풍부한 조성물에 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제된 폴리펩타이드가 제공되어 상기 폴리펩타이드가 기타 발현된 단백질이 실질적으로 없는 조성물에 존재하고, 상기 조성물의 90% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만이 기타 발현된 단백질을 구성한다.
치료적 및 예방적 용도
또한 본원은 작용제 또는 이의 조성물의 투여에 의한 고혈당증, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 포도당 대사장애, 비만 및 기타 체중 장애 뿐만 아니라 기타 대사성 및 대사 관련 질환, 장애 및 병태의 치료방법 또는 예방방법을 제공한다. 게다가, 본원에 기재된 바와 같이, 본 기재는 기타 질환, 장애 및 병태의 숙주를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 또한, 예를 들어, 증상의 중증도 또는 빈도를 저하시킴으로써, 질환, 장애 및 병태와 관련된 하나 이상의 증상에 유리한 효과를 미칠 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 질환 또는 장애의 치료방법이다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 질환 또는 장애의 예방방법이다.
특정 실시양태에서, 본 기재는 대사 장애를 갖는 대상체의 치료(또는 특정 환경에서는 예방) 방법을 고려하며, 상기 방법은 대사 장애를 갖는 대상체(대상체는 FGF19 유도된 암성 병태의 표시를 나타낸다)를 제공하고, 본원에 기재된 바와 같은 후보 FGF19 변이체 폴리펩타이드 풀로부터 확인된 FGF19 변이체의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 대상체에서의 대사 장애가 개선된다.
질환, 장애 및 병태의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 당뇨병(타입 1 및 2), 임신성 당뇨병, 고혈당증, 인슐린 내성, 이상 포도당 대사, "전당뇨병"(공복 혈당장애(IFG) 또는 포도당 내성장애(IGT)) 및, 예를 들어, 췌장 β 세포 파괴와 같은 병리조직적 변화를 포함한 고혈당 장애와 관련된 또는 이로부터 야기된 기타 생리학적 장애를 포함하는, 포도당 이용 장애 및 이와 관련된 후유증. 추가의 고혈당 관련 장애는 신장 손상(예를 들어, 세관 손상 또는 신증), 간 변성, 눈 손상(예를 들어, 당뇨병성 망막증 또는 백내장) 및 당뇨병성 발 장애를 포함한다; 2) 예를 들어, 아테롬성 동맥경화증, 관상 동맥질환, 뇌혈관 장애 등과 같은 이상지질혈증 및 이의 후유증; 3) 비만 및 증가된 체질량과 같은 대사증후군과 관련될 수 있는 기타 병태(비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 비알콜성 지방간염(NASH) 및 다낭성 난소 증후군(PCOS)) 및 또한 혈전증, 응고항진 및 부혈전 상태(동맥 및 정맥), 고혈압, 심혈관 질환, 뇌졸중 및 심부전; 4) 아테롬성 동맥경화증, 만성 염증성 장 질환(예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염), 천식, 홍반성 루푸스 또는 기타 염증성 류마티스 장애를 포함하는, 염증 반응이 관련된 장애 또는 병태; 5) 지방 세포 종양, 지방 암종, 예를 들어 지방 육종, 고형암 및 신생물과 같은 세포 주기 또는 세포 분화 과정의 장애; 6) 중추 및 말초 신경계의 신경퇴행성 질환 및/또는 탈수 장애, 및/또는 알츠하이머 질환, 다발성 경화증, 파킨슨병, 진행성 다초점 백질뇌증 및 길랑 바레 증후군을 포함하는 기타 신경병적 질환; 7) 홍반성-편평 피부병을 포함하는, 피부 및 피부과적 장애 및/또는 상처 치유 과정의 장애; 및 8) 증후군 X, 골관절염 및 급성 호흡 곤란 증후군과 같은 기타 장애.
본원에 제공된 방법을 사용하여 대상체가 고혈당증, 고인슐린혈증, 포도당 불내성 및/또는 포도당 장애의 치료 또는 예방을 위한 후보일 수 있는지를 측정하기 위해, 당해 기술 분야에 알려진 다양한 진단방법을 사용할 수 있다(예를 들어, 공복 혈당(FPG) 평가 및 경구 포도당 내성 시험(oGTT)).
본원에 제공된 방법을 사용하여 대상체가 체중 장애의 치료 또는 예방을 위한 후보일 수 있는지를 측정하기 위해, 병인학 및 대상체 상태의 정도(건강한 기준 개체에 비해 대상체가 얼마나 과체중인지)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 매개변수를 평가해야 한다. 예를 들어, BMI가 ~25 내지 ~29.9kg/㎡인 성인은 과체중(전비만)인 것으로 간주될 수 있는 반면, BMI가 ~30kg/㎡ 또는 그 초과인 성인은 비만인 것으로 간주될 수 있다. 과체중인 대상체 및/또는 불량한 식사(예를 들어, 고지방 및 고칼로리 식이)를 하는 대상체의 경우, 본 기재의 폴리펩타이드를 하나 이상 포함하는 치료 코스를 개시하기 전에 개선된 식습관 및/또는 운동 요법을 먼저 수행하고 그 효과를 평가하는 것이 보통이다.
또한 본원은 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)의 치료방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) 대사 장애를 갖는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보인지를 측정하는 것을 포함하고, 상기 방법은 (a) 암성 병태의 표시를 갖고 대사 장애를 갖는 시험 대상체를 제공하고, (b) FGF 19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고(시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하다), (c) 암성 병태의 표시가 시험 대상체에서 증가하는지를 측정하는 것을 포함하며, 암성 병태의 표시의 증가 부재는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보임을 나타내고, 시험 대상체에서 암성 병태의 표시의 증가가 부재하면, 상기 방법은 (ii) 후속적으로 FGF19 변이체를 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체의 후속 투여는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)에서의 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료를 제공하는 치료적 유효량이다.
또한 본원은 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)의 치료방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) 대사 장애를 갖는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보인지를 측정하는 것을 포함하고, 상기 방법은 (a) 암성 병태의 표시를 갖고 대사 장애를 갖는 시험 대상체를 제공하고, (b) FGF 19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고(시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하다), (c) 암성 병태의 표시가 시험 대상체에서 감소되는지를 측정하는 것을 포함하며, 암성 병태의 표시의 감소는 시험 대상체가 FGF19 변이체를 사용한 치료를 위한 후보임을 나타내고, 시험 대상체에서 암성 병태의 표시가 감소하면, 상기 방법은 (ii) 후속적으로 FGF19 변이체를 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체의 후속 투여는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)에서의 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료를 제공하는 치료적 유효량이다.
또한 본원은 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)의 치료방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 시험 대상체의 치료를 위한 후보인지를 측정하는 것을 포함하고, 상기 방법은 (a) FGF 19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 대사 장애를 갖는 시험 대상체에 공동투여하고(시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하다), (b) 암성 병태의 표시가 시험 대상체에서 관찰되는지를 측정하는 것을 포함하며, 암성 병태의 표시의 부재는 FGF19 변이체가 시험 대상체의 치료를 위한 후보임을 나타내고, 암성 병태의 표시가 부재하면, 상기 방법은 (ii) 후속적으로 FGF19 변이체를 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체의 후속 투여는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)에서의 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료를 제공하는 치료적 유효량이다.
또한 본원은 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)의 치료방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) FGF19 변이체가 대사 장애를 갖는 시험 대상체의 치료를 위한 후보인지를 측정하는 것을 포함하고, 상기 방법은 (a) 대사 장애를 갖고 암성 병태의 표시를 갖는 시험 대상체를 제공하고, (b) FGF 19 또는 FGF19 대용품과 FGF19 변이체를 시험 대상체에 공동투여하고(시험 대상체에 투여되는 FGF19 또는 FGF19 대용품의 양은 기준집단에서 암성 병태를 유도하기에 충분하다), (c) 암성 병태의 표시가 시험 대상체에서 증가하는지를 측정하는 것을 포함하며, 암성 병태의 표시의 악화의 부재는 FGF19 변이체가 시험 대상체의 치료를 위한 후보임을 나타내고, 암성 병태의 표시의 악화가 부재하면, 상기 방법은 (ii) 후속적으로 FGF19 변이체를 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체의 후속 투여는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)에서의 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료를 제공하는 치료적 유효량이다. 몇몇 실시양태에서, 암성 병태의 하나 이상의 표시가 시험 대상체에서 감소된다.
또한 본원은 (a) 대사 장애를 갖고 FGF19 유도된 암성 병태의 표시를 나타내는 대상체를 제공하고, (b) 본원에 제공된 방법 또는 모델 중 임의의 하나에서 확인된 FGF19 변이체의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 대상체에서의 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태가 개선되는, 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체(예를 들어, 사람과 같은 동물)의 치료방법을 제공한다.
본원에 제공된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 동물이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 사람이다. 몇몇 실시양태에서, 암성 병태는 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장 종양 또는 간 종양이다. 몇몇 실시양태에서, 대사성 또는 대사 관련 질환, 장애 또는 병태는 대사 장애이다. 몇몇 실시양태에서, 대사 장애는 고혈당 병태, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 비만 및 대사증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 고혈당 병태는 당뇨병이다. 다른 실시양태에서, 치료는 대사 장애의 개선을 초래한다. 특정 실시양태에서, 대사 장애의 개선은 혈당 감소이다. 다른 실시양태에서, 대상체에서의 대사 장애의 개선은 체중 저하이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서의 대사 장애의 개선은 인슐린 감소이다.
다른 양태에서, 본원은 FGF19의 발암활성을, 예를 들어 본원에 제공된 FGF19 변이체를 사용하여 길항시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, FGF19를 발현하는 세포를 본원에 제공된 FGF19 변이체와 접촉시킨다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M70이다. 특정 실시양태에서, 본원은 대상체에 치료적 유효량의 FGF19 변이체를 투여함으로써 대상체에서의 FGF19의 발암활성을 길항시킴을 포함하는, 대상체에서의 FGF19의 발암활성의 길항방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본원은 대상체에 치료적 유효량의 FGF19 변이체를 투여하는 것을 포함하고, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상이 대상체에서 예방되는, 대상체에서의 FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상을 예방하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본원은 대상체에 치료적 유효량의 FGF19 변이체를 투여하는 것을 포함하고, 특정 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상이 대상체에서 치료되는, 대상체에서의 FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 대상체는 대사 장애 및/또는 암성 병태의 표시를 갖는다. 특정 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 암 또는 종양이다. 몇몇 실시양태에서, 암 또는 종양은 간, 결장, 전립선 또는 폐의 암 또는 종양이다. 몇몇 실시양태에서, 암 또는 종양은 양성이다. 다른 실시양태에서, 암 또는 종양은 악성이다.
특정 실시양태에서, 대상체는 FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이것이 진행될 위험을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 경화증 또는 담즙울혈과 같은 간(간세포) 질환, 장애 또는 병태이다. 몇몇 실시양태에서, 간 질환 또는 장애는 만성 간 질환 또는 장애이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 HCC와 같은 암 또는 종양이다. 다른 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 경화증 또는 담즙울혈과 같은 간 질환, 장애 또는 병태가 아니다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 HCC와 같은 암 또는 종양이 아니다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 결장암 또는 결장 종양이다. 특정 실시양태에서, 결장암 또는 결장 종양은 결장 샘암종이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 전립선암 또는 전립선 종양이다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 폐암 또는 폐종양이다. 특정 실시양태에서, 폐암 또는 폐종양은 폐 편평세포 암종이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19는 원발성 또는 전이성 암 또는 종양 세포에서 발현된다. 특정 실시양태에서, FGF19 의존적 질환, 장애 또는 병태는 전암이다. 예를 들어, 경화증 또는 담즙울혈은 종종 HCC와 같은 간암을 야기하고, 이러한 간 질환 및 장애의 치료 또는 예방 방법이 고려된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 이러한 예방 또는 치료가 필요한 대상체이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체의 투여는 대상체에서의 담즙산 항상성을 유지시킨다.
또한 본원은 대상체에 치료적 유효량의 FGF19 변이체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 FGF19 의존적 암 또는 종양과 같은 암 또는 종양, 또는 이의 증상의 치료방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 투여 결과 대상체에서의 암, 종양 또는 이의 증상이 개선된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 종양 수, 종양 크기 또는 종양 중량을 감소시킨다. 또한 본원은 대상체에 치료적 유효량의 FGF19 변이체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 FGF19 의존적 암 또는 종양과 같은 암 또는 종양, 또는 이의 증상의 예방방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 투여 결과 대상체에서의 암, 종양 또는 이의 증상을 예방한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 종양 수, 종양 크기 또는 종양 중량을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 FGF19 의존적 암 또는 종양이다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 간세포 암종이다. 몇몇 실시양태에서, 암 또는 종양은 간세포 암종이 아니다. 한 실시양태에서, 암 또는 종양은 결장암 또는 결장 종양이다. 몇몇 실시양태에서, 암 또는 종양은 전립선암 또는 전립선 종양이다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 폐암 또는 폐종양이다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 위에 언급된 것이 필요한 대상체이다.
본원에 제공된 치료적 또는 예방적 방법 중 어느 하나가 본원에 제공된 모델 또는 기타 방법의 어느 하나와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 제공된 방법의 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 M5, M6, M7, M14, M15, M32, M36, M43, M52, M53, M67, M68, M69, M70, M75, M76, M77, M83, M84, M140, M144, M145, M146 및 M160으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M5이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M6이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M7이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M14이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M15이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M32이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M36이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M43이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M52이다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M53이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M67이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M68이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M69이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M70이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M75이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M76이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M77이다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M83이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M84이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M140이다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M144이다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 M145이다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 M146이다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 M160이다. 다른 실시양태에서, 상기한 FGF19 변이체의 2개 이상의 조합이 또한 고려된다.
본원에 제공된 방법의 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5 내지 29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 서브서열 또는 단편을 포함한다. 본원에 제공된 방법의 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5 내지 29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 서브서열 또는 단편으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, N-터미널 R 잔기가 생략된다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 5를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 6을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 7을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 8을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 9를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 10을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 11을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 12를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 13을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 14를 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 15를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 16을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 17을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 18을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 19를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 20을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 21을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 22를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 23을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 24를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 25를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 26을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 27을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 28을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, FGF19 변이체는 서열 번호 29를 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, FGF19 변이체는 N-터미널 R 잔기가 생략된, 상기한 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, FGF19 변이체는 상기한 서열 중 어느 하나의 서브서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 상기한 FGF19 변이체 중 2개 이상의 임의의 조합이 또한 고려된다.
약제학적 조성물
본 기재의 폴리펩타이드는 대상체에 투여하기에 적합한 조성물의 형태일 수 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 하나 이상의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 또는 생리학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 첨가제를 포함하는 "약제학적 조성물"이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 치료상 허용되는 양으로 존재한다. 약제학적 조성물은 본 기재의 방법에 사용될 수 있고; 따라서, 예를 들어, 약제학적 조성물을 본원에 기재된 치료적 및 예방적 방법 및 용도를 실현하기 위해 대상체에 생체외 및 생체내로 투여할 수 있다.
본 기재의 약제학적 조성물은 의도된 투여 방법 또는 경로와 양립할 수 있도록 제형화될 수 있고; 예시적 투여 경로는 본원에 제시되어 있다. 추가로, 약제학적 조성물은 본 기재에 의해 고려된 바와 같은 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 기타 치료적 활성제 또는 활성 화합물(예를 들어, 포도당 저하제)과의 조합으로 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 통상 본 기재에 의해 고려된 하나 이상의 폴리펩타이드의 치료적 유효량, 및 약제학적으로 및 생리학적으로 허용되는 하나 이상의 제형화제를 포함한다. 적합한 약제학적으로 허용되는 또는 생리학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 첨가제는 항산화제(예를 들어, 아스코르브산 및 중황산나트륨), 보존제(예를 들어, 벤질 알콜, 메틸 파라벤, 에틸 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트), 유화제, 현탁제, 분산제, 용매, 충전제, 벌크제, 세제, 완충제, 비히클, 희석제 및/또는 보조제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 적합한 비히클은 비경구 투여용 약제학적 조성물에서 통상적인 기타 물질이 보강될 수도 있는, 생리학적 염수 또는 시트레이트 완충 염수일 수 있다. 천연 완충 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 추가의 예시적 비히클이다. 당해 기술 분야의 숙련가는 약제학적 조성물 및 투여형에 사용될 수 있는 다양한 완충제를 쉽게 알 것이다. 통상의 완충제는 약제학적으로 허용되는 약산, 약염기 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예로서, 완충제 성분은 인산, 타르타르산, 락트산, 석신산, 시트르산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 글루탐산 및 이의 염과 같은 수용성 물질일 수 있다. 허용되는 완충제는, 예를 들어, Tris 완충제, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)(HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 나트륨염(MES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS) 및 N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS)을 포함한다.
약제학적 조성물을 제형화한 후, 이를 용액, 현탁액, 겔, 유화액, 고체 또는 탈수되거나 동결건조된 분말로서 멸균병에 저장할 수 있다. 이러한 제형은 즉시 사용가능한 형태, 사용 전에 복원이 필요한 동결건조된 형태, 사용 전에 희석이 필요한 액체 형태 또는 기타 허용되는 형태로 저장할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 약제학적 조성물은 일회용 용기(예를 들어, 일회용 병, 앰플, 주시가 또는 자기주사기(예를 들어, EpiPen®과 유사))로 제공되는 반면, 다른 실시양태에서는 다중 사용 용기(예를 들어, 다중 사용 병)가 제공된다. 숙련가에게 잘 알려진 임플란트(예를 들어, 삽입되는 펌프) 및 카테테르 시스템을 포함하는 임의의 약물 전달 기구가 폴리펩타이드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로 피하 또는 근육내로 투여되는 데포(depot) 주사가 또한 한정된 기간에 걸쳐 본원에 기재된 폴리펩타이드를 방출하는데에 사용될 수 있다. 데포 주사는 보통 고체 또는 오일을 기초로 하고, 일반적으로 본원에 제시된 제형화 성분을 하나 이상 포함한다. 당해 기술 분야의 숙련가는 데포 주사의 가능한 제형 및 사용에 친숙하다. 특정 실시양태에서, Nano Precision Medical의 데포 주사 기술(Nano Precision Medical; Emeryville, CA)이 고려된다. 상기 기술은 단백질 및 펩타이드 치료제와 같은 거대분자의 영차 방출 속도를 생성하는 티타니아 나노튜브 막을 사용한다. 생체적합성 막은 치료적 거대분자의 장기간(예를 들어, 1년까지)의 항속 전달을 제공하는 작은 피하 임플란트에 저장된다. 상기 기술은 현재, 예를 들어, 타입 II 당뇨병의 치료를 위한 GLP-1 작용제의 전달에 대해 평가되고 있다.
약제학적 조성물은 멸균 주사가능한 수성 또는 지성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 본원에 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 비경구적으로 허용되는 비독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 희석제, 용매 및 분산 매질은 물, 링거액, 등장성 염화나트륨 용액, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 염수(PBS), 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 포함한다. 또한, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 무자극성 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사용 제제의 제조에 사용된다. 특정한 주사용 제형의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴)를 포함시킴으로써 성취할 수 있다.
활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물은 적합한 경구용 형태, 예를 들어, 정제, 캡슐, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분제 또는 과립, 유화액, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽, 용액, 마이크로비드 또는 엘릭시르일 수 있다. 경구용 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 대해 당해 기술 분야에 알려진 임의의 방법에 따라 제조될 수 있고, 이러한 조성물은 약제학적으로 우아하고 맛있는 제제를 제공하기 위해, 예를 들어, 향미제, 착색제 및 보존제와 같은 작용제를 하나 이상 함유할 수 있다. 정제, 캡슐제 등은 정제의 제조에 적합한 약제학적으로 허용되는 비독성 첨가제와의 혼합물로 활성 성분을 함유한다. 이들 첨가제는, 예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토즈, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 희석제; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 수 있다.
경구 투여에 적합한 정제, 캡슐제 등은 피복되지 않거나 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시키는 공지된 기술에 의해 피복되어 지속 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간-지연 물질이 사용될 수 있다. 이들은 또한 당해 기술 분야에 공지된 기술에 의해 피복되어 제어 방출을 위한 삼투성 치료 정제를 생성할 수 있다. 추가의 작용제는 폴리에스테르, 폴리아민산, 하이드로겔, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 에틸렌-비닐아세테이트, 메틸셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈, 프로타민 설페이트, 또는 락타이드/글리콜라이드 공중합체, 폴리락타이드/글리콜라이드 공중합체 또는 에틸렌비닐아세테이트와 같은 생분해성 또는 생체적합성 입자 또는 중합체성 물질을 투여된 조성물의 전달을 제어하기 위해 포함한다. 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에 포획되거나, 각각 하이드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 또는 폴리(메틸메타크롤레이트) 마이크로캡슐의 사용에 의해 포획되거나, 콜로이드 약물 전달 시스템 내에 포획될 수 있다. 콜로이드 분산 시스템은 수중유 유화액, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포좀을 포함한, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 마이크로비드 및 지질 기초 시스템을 포함한다. 리포좀의 제조방법은, 예를 들어, 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호에 기재되어 있다. 상기한 제형의 제조방법은 당해 기술 분야의 숙련가에게는 명백할 것이다.
경구용 제형은 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘, 카올린 또는 미정질 셀룰로즈와 혼합되어 있는 경질 젤라틴 켑슐로서 존재하거나, 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어, 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브유와 혼합되어 있는 연질 젤라틴 켑슐로서 존재할 수 있다.
수성 현탁액은 활성 성분을 이의 제조에 적합한 첨가제와의 혼합물로 함유한다. 이러한 첨가제는 현탁제, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 하이드록시-프로필메틸셀룰로즈, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아; 분산제 또는 습윤제, 예를 들어, 자연 발생적 포스파티드(예를 들어, 레시틴), 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산(예를 들어, 폴리옥시-에틸렌 스테아레이트)의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜(예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세탄올)의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시놀(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트)로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시놀 무수물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트)로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제를 함유할 수 있다.
유성 현탁액은 활성 성분을 식물성유, 예를 들어, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유에, 또는 액체 파라핀과 같은 광유에 현탁시킴으로써 제형화할 수 있다. 유성 현탁액은 증점제, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 위에 제시된 바와 같은 감미제, 및 향미제가 또한 맛있는 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다.
물을 첨가함으로써 수성 현탁액을 제조하는 데 적합한 분산성 분제 및 과립은 활성 성분을 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와의 혼합물로서 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 본원에 예시되어 있다.
본 기재의 약제학적 조성물은 또한 수중유 유화액의 형태일 수 있다. 유성상은 식물성유, 예를 들어, 올리브유 또는 땅콩유, 또는 광유, 예를 들어, 액체 파라핀, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 자연 발생적 검, 예를 들어, 검 아카시아 또는 검 트라가칸트; 자연 발생적 포스파티드, 예를 들어, 대두, 레시틴, 및 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르; 헥시톨 무수물, 예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트; 및 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트의 축합 생성물일 수 있다.
임플란트, 리포좀, 하이드로겔, 전구약물(prodrug) 및 미소캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같은 제형은 또한 신속한 분해 또는 신체로부터의 제거에 대해 조성물을 보호하기 위해 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트 단독 또는 왁스와의 조합과 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다.
본 기재는 약물의 직장 투여용 좌제 형태로 폴리펩타이드의 투여를 고려한다. 좌제는 약물을, 상온에서는 고체이나 직장 온도에서는 액체여서 직장에서 약물을 녹여서 방출시키는 적합한 비자극성 첨가제와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 기재에 의해 고려되는 폴리펩타이드는 현재 공지되어 있거나 추후 개발될 임의의 기타 적합한 약제학적 조성물(예를 들어, 코 또는 흡입 용도의 스프레이)의 형태일 수 있다.
제형에서의 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 농도는 크게 달라질 수 있고(예를 들어, 약 0.1중량% 미만, 보통 약 2중량% 이상부터 20중량% 내지 50중량% 또는 그 초과) 대개는 유체 부피, 점도 및, 예를 들어 선택된 특정 투여 양식에 따른 대상체 기초 인자를 기초로 하여 일차적으로 선택될 수 있다.
투여 경로
본 기재는 기재된 폴리펩타이드 및 이의 조성물을 임의의 적합한 방식으로 투여하는 것을 고려한다. 적합한 투여 경로는 비경구(예를 들어, 근육내, 정맥내, 피하(예를 들어, 주사 또는 임플란트), 복막내, 천자내, 관절내, 복막내, 뇌내(조직내) 및 뇌실내), 경구, 코, 질, 설하, 안내, 직장, 국소(예를 들어, 경피), 설하 및 흡입을 포함한다.
일반적으로 피하 또는 근육내로 투여되는 데포 주사가 또한 본원에 기재된 폴리펩타이드를 한정된 기간에 걸쳐 방출하는데에 사용될 수 있다. 데포 주사는 대개 고체 또는 오일을 기초로 하고, 일반적으로 본원에 제시된 제형화 성분을 하나 이상 포함한다. 당해 기술 분야의 숙련가는 데포 주사의 가능한 제형 및 사용이 친숙하다.
항체에 관해, 예시적 실시양태에서 본 기재의 항체 또는 항체 단편이 4℃에서 주사용 멸균 등장성 수성 염수 10mg/ml에 저장되고 대상체에 투여하기 전에 주사용 0.9% 염화나트륨 100ml 또는 200ml에 희석된다. 항체는 1시간에 걸쳐 0.2 내지 10mg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 다른 실시양태에서, 항체는 15분 내지 2시간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 투여 절차는 피하 일시 주사를 통한다.
병용 요법
본 기재는 본원에서 확인된 FGF19 변이체 폴리펩타이드를 하나 이상의 활성 치료제 또는 기타 예방적 또는 치료적 양식과 병용하는 것을 고려한다. 이러한 병용 요법에서, 다양한 활성제는 자주 상이한 작용 기전을 갖는다. 이러한 병용 요법은 하나 이상의 작용제의 용량을 저하시킬 수 있어서 하나 이상의 작용제와 관련된 부작용을 감소시키거나 제거하므로 특히 유리하고; 또한, 이러한 병용 요법은 근본적인 질환, 장애 또는 병태에 대해 상승적인 치료적 또는 예방적 효과를 가질 수 있다.
본원에 사용된 "병용"은, 예를 들어, (예를 들어, 키트로 제공될 수 있는 바와 같은) 별도 투여용으로 별도로 제형화된 것을 별도로 투여할 수 있는 요법 또는 단일 제형으로 함께 투여(즉, "공동투여")할 수 있는 요법을 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 모델을 사용하여 확인된 폴리펩타이드와 하나 이상의 활성 치료제 또는 기타 예방적 또는 치료적 양식의 병용은 연속적으로(예를 들어, 하나의 작용제를 투여한 후 하나 이상의 다른 작용제를 투여하는 경우) 또는 동시에(예를 들어, 2개 이상의 작용제를 동시에 또는 거의 동시에 투여하는 경우) 투여하거나 적용할 수 있다. 2개 이상의 작용제가 연속적으로 또는 동시에 투여되는지에 상관없이, 상기 작용제는 본 기재의 목적을 위해 병용 투여되는 것으로 여겨진다.
따라서, 본원에 기재된 방법 및 모델을 사용하여 확인된 폴리펩타이드의 방법 및 사용은 다른 치료 전에, 다른 치료와 실질적으로 동시에 또는 다른 치료에 이어서 수행할 수 있고, 기타 치료 형태가 보강될 수 있다. 보강 치료는 인술린, 인술린 감도 증강제 및 기타 약물 치료, 식이 변화(저당, 지방 등), 체중 감소 수술(위장 접합술에 의한 위 용적 감소, 위절제술), 위 밴드 삽입술, 개스트릭 벌룬(gastric balloon), 개스트릭 슬리브(gastric sleeve) 등과 같은 기타 포도당 저하 및/또는 체중 감소 치료를 포함한다.
본 기재는 다수의 작용제(및 이의 등급)를 사용한 병용 요법을 고려한다: 1) 인슐린, 인슐린 미메틱, 및 설포닐우레아(예를 들어, 클로르프로파미드, 톨라자미드, 아세토헥사미드, 톨부타비드, 글리부리드, 글리메피리드, 글리피지드) 및 메글리티니드(예를 들어, 레파그리니드(PRANDIN)) 및 나테글리니드(STARLIX))를 포함하는, 인슐린 분비의 자극을 수반하는 작용제; 2) 비구아니드(예를 들어, 메트포르민(GLUCOPHAGE)), 및 포도당 이용을 촉진하고, 간의 포도당 생산을 저하시키고/시키거나 장 포도당 배출을 감소시키는 기타 작용제; 3) α-글리코시다제 억제제(예를 들어, 아카르보스 및 미글리톨), 및 탄수화물 소화를 둔화시켜 결과적으로 장으로부터의 흡수를 둔화시키고 식후 고혈당을 저하시키는 기타 작용제; 4) 티아졸리딘디온(예를 들어, (예를 들어 인슐린 감작화에 의해) 인슐린 작용을 증강시켜 말초 조직에서의 포도당 이용을 촉진시키는 로시글리타존(AVANDIA), 트로글리타존(REZULIN), 피오글리타존(ACTOS), 글리피지드, 발라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, 트로글리타존, 엔글리타존, 시글리타존, 아다글리타존, 다르글리타존); 5) DPP-IV 억제제를 포함하는 글루카곤 유사 펩타이드(예를 들어, 빌다글립틴(GALVUS) 및 시타글립틴(JANUVIA)), 및 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 GLP-1 작용제 및 유사체(예를 들어, 엑세나티드(BYETTA) 및 ITCA 650(12개월에 걸쳐 엑세나티드 유사체를 전달하는, 피하로 삽입되는 삼투성 펌프; Intarcia, Boston, MA)); 6) 및 DPP-IV 내성 유사체(인크레틴 미메틱), PPAR 감마 작용제, 이중 작용 PPAR 작용제, 범용 PPAR 작용제, PTP1B 억제제, SGLT 억제제, 인슐린 분비촉진제, RXR 작용제, 글리코겐 합성효소 키나제-3 억제제, 면역 조절제, β-3 아드레날린 작용성 수용체 작용제, 11β-HSD1 억제제 및 아밀린 유사체.
추가로, 본 기재는 대사를 자극하거나 식욕을 저하시키는 작용제와 같은 작용제와 체중 감량을 촉진시키는 개질된 식이 및/또는 운동 요법의 병용 요법, 및 체중 감량의 촉진방법을 고려한다. 식욕 억제제는 잘 알려져 있고 본원에 제공된 방법과 함께 사용할 수 있다.
본 기재의 FGF19 변이체 폴리펩타이드는 하나 이상의 기타 작용제와 환경하에 적합한 방식으로 병용될 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 활성제와 본 기재의 하나 이상의 폴리펩타이드를 사용한 치료는 일정 기간에 걸쳐 유지된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 활성제를 사용한 치료는 (예를 들어, 대상체가 안정한 경우) 축소되거나 중단되는 반면, 본 기재의 하나 이상의 폴리펩타이드를 사용한 치료는 일정한 용량 섭생으로 유지된다. 추가 실시양태에서, 하나 이상의 활성제를 사용한 치료는 (예를 들어, 대상체가 안정한 경우) 축소되거나 중단되는 반면, 본 기재의 하나 이상의 폴리펩타이드를 사용한 치료는 축소된다(예를 들어, 보다 낮은 용량, 투여 빈도 감소 또는 보다 짧은 치료 섭생). 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 활성제를 사용한 치료는 (예를 들어, 대상체가 안정한 경우) 축소되거나 중단되고, 본 기재의 하나 이상의 폴리펩타이드를 사용한 치료는 증가된다(예를 들어, 보다 높은 용량, 투여 빈도 증가 및 보다 긴 치료 섭생). 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 활성제를 사용한 치료는 유지되고 본 기재의 하나 이상의 폴리펩타이드를 사용한 치료는 축소되거나 중단된다(예를 들어, 보다 낮은 용량, 투여 빈도 감소 또는 보다 짧은 치료 섭생). 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 활성제를 사용한 치료 및 본 기재의 하나 이상의 폴리펩타이드를 사용한 치료는 축소되거나 중단된다(예를 들어, 보다 낮은 용량, 투여 빈도 감소 또는 보다 짧은 치료 섭생).
투여량
본 기재의 폴리펩타이드는, 예를 들어, 투여 목적(예를 들어, 목적한 해결 정도); 치료되는 대상체의 연령, 체중, 성별, 및 건강 및 신체 상태; 투여되는 폴리펩타이드 및/또는 제형의 특성; 투여 경로; 및 질환, 질병, 병태 또는 이의 증상의 특성(예를 들어, 포도당/인슐린의 이상조절의 심각성 및 장애의 단계)에 의존적인 양으로 대상체에 투여할 수 있다. 투여량 섭생은 또한 투여되는 작용제와 관련된 임의의 부작용의 존재, 특성 및 정도를 고려할 수 있다. 효과적인 투여량 및 투여 섭생은, 예를 들어, 안전성 및 용량 확대 시험, 생체내 연구(예를 들어, 동물 모델), 및 숙련가에게 알려진 기타 방법으로부터 쉽게 결정할 수 있다.
일반적으로, 투여량 매개변수는 투여량이 대상체에 비가역적으로 독성일 수 있는 양(즉, 촤대 내량(maximum tolerated dose: MTD)) 미만이고 대상체에서 측정가능한 효과를 생성시키는 데 필요한 양 미만임을 지시한다. 이러한 양은 투여 경로 및 기타 인자를 고려하여, 예를 들어, 흡수, 분배, 대사 및 분비(ADME)와 관련된 약력학 및 약동학 매개변수에 의해 결정된다.
유효 용량(ED)은 작용제를 섭취한 대상체의 일부분에서 치료적 반응 또는 바람직한 효과를 생성시키는 작용제의 용량 또는 양이다. "중앙 유효 용량" 또는 작용제의 ED50은 작용제가 투여된 집락의 50%에서 치료적 반응 또는 바람직한 효과를 생성시키는 작용제의 용량 또는 양이다. 비록 ED50이 작용제 효과의 타당한 기대 척도로서 통상 사용되지만, 이것이 반드시 임상의가 모든 관련 인자를 고려하여 적합하다고 간주할 수 있는 용량은 아니다. 따라서, 몇몇 상황에서는 유효 용량이 계산된 ED50보다 크고, 다른 상황에서는 유효 용량이 계산된 ED50보다 작고, 또 다른 상황에서는 유효 용량이 계산된 ED50과 동일하다.
또한, 본 기재의 폴리펩타이드의 유효 용량은 대상체에 1회 이상의 용량을 투여하였을 때 건강한 대상체와 비교해 목적한 결과를 초래하는 양일 수 있다. 예를 들어, 유효 용량은 상승된 혈당 및/또는 혈장 인슐린을 갖는 대상체에 투여하였을 때 건강한 대상체와 비교해 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상 또는 80% 초과의 목적한 감소를 성취하는 양일 수 있다.
적합한 투여량 수준은 일반적으로 약 0.001 내지 100mg/kg(환자 체중)/일(day)일 것이고, 이는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 투여량 수준은 약 0.01 내지 약 25mg/kg/일일 것이고, 다른 실시양태에서는 약 0.05 내지 약 10mg/kg/일일 것이다. 적합한 투여량 수준은 약 0.01 내지 25mg/kg/일, 약 0.05 내지 10mg/kg/일 또는 약 0.1 내지 5mg/kg/일일 수 있다. 이 범위내에서, 투여량은 0.005 내지 0.05, 0.05 내지 0.5 또는 0.5 내지 5.0mg/kg/일일 수 있다.
경구 작용제의 투여의 경우, 조성물은 활성 성분을 1.0 내지 1,000mg, 특히 활성 성분을 1.0, 3.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0 및 1000.0mg 함유하는 정제, 캡슐제 등의 형태로 제공될 수 있다. 폴리펩타이드는, 예를 들어, 1일 1 내지 4회로, 종종 1일 1회 또는 2회의 섭생으로 투여될 수 있다.
본 기재의 폴리펩타이드의 투여량은 적합한 빈도로 반복할 수 있고, 이는 폴리펩타이드의 약력학(예를 들어, 반감기) 및 약동학 반응(예를 들어, 폴리펩타이드의 치료 효과의 기간)에 따라 1일 1회 내지 3개월당 1회의 범위일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩타이드가 항체 또는 이의 단편이거나 폴리펩타이드 또는 이의 변이체인 경우, 투여는 주로 1주 1회 내지 3개월당 1회로 반복된다. 다른 실시양태에서, 이러한 폴리펩타이드는 대략적으로 1개월에 1회 투여된다.
특정 실시양태에서, 기재된 폴리펩타이드의 투여량은 "단위 투여량 형태"로 함유된다. 구 "단위 투여량 형태"는 물리적으로 별개의 단위로서, 각각의 단위가 본 기재의 폴리펩타이드의 예정된 양을 목적한 효과를 생성하기에 충분하게 단독으로 또는 하나 이상의 추가 작용제와의 조합으로 함유한다. 단위 투여 형태의 매개변수가 특정 작용제 및 성취하고자 하는 효과에 좌우될 것임을 인식할 것이다. 예시적인 단위 투여량은 약 25-250; 250-500; 500-1,000; 1,000-2,500; 2,500-5,000; 5,000-25,000 또는 25,000-50,000ng; 또는 약 25-250; 250-500; 500-1,000; 1,000-2,500; 2,500-5,000; 5,000-25,000; 25,000-50,000㎍; 또는 약 25-250; 250-500; 500-1,000; 1000-2,500; 2,500-5,000; 5,000-25,000 또는 25,000-50,000mg의 범위일 수 있다.
단일 용량 또는 다중 용량이, 예를 들어, 1일 다수회로, 연속 일수로, 격일로, 매주 또는 간헐적으로(예를 들어, 매주 2회, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주당 1회, 또는 2, 3, 4, 5 또는 6개월당 1회) 투여될 수 있다.
키트
본 기재는 또한 기재된 폴리펩타이드 및 이의 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 고려한다. 키트는 일반적으로 아래에 기재하는 바와 같이 다양한 성분들을 수용하는 물리적 구조 형태이고, 예를 들어, 위에 기재한 방법을 실행(예를 들어, 포도당 항상성 복구가 필요한 대상체로의 폴리펩타이드의 투여)하는 데 사용할 수 있다.
키트는 본원에 기재된 (예를 들어, 멸균 용기에 제공된) 폴리펩타이드를 하나 이상 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 대상체에 투여하기 적합한 약제학적 조성물의 형태일 수 있다. 폴리펩타이드는 즉시 사용가능한 형태로 또는, 예를 들어, 투여 전에 재구성 또는 희석이 필요한 형태로 제공될 수 있다. 폴리펩타이드가 사용자에 의해 재구성되어야 하는 형태인 경우, 키트는 또한 완충제, 약제학적으로 허용되는 첨가제 등을 폴리펩타이드와 함께 포장된 형태로 또는 폴리펩타이드와 별도로 포함할 수도 있다. 병용 치료가 고려되는 경우, 키트는 몇몇 작용제를 개별적으로 함유할 수 있거나 상기 작용제는 이미 키트 내에서 배합되어 있을 수 있다. 키트의 각각의 성분은 개별 용기 내에 들어 있을 수 있고 다양한 용기가 모두 단일 패키지로 있을 수 있다. 본 기재의 키트는 거기에 수용된 성분들을 적합하게 유지시키는데 필요한 조건(예를 들어, 냉장 또는 냉동)을 위해 디자인될 수 있다.
키트는 키트 내의 성분들의 확인 정보 및 이들의 사용을 위한 지시서(예를 들어, 작용 메카니즘, 약력학 및 약동학, 부작용, 사용 금지 사유 등을 포함하는 활성 성분(들)의 투여 매개변수, 임상적 약리학)를 포함하는 라벨 또는 패키징 인서트(packaging insert)를 함유할 수 있다. 라벨 또는 인서트는 로트 번호 및 유효 기간과 같은 제조 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 패키징 인서트는, 예를 들어, 성분들을 수용하는 물리적 구조 내에 통합되어 있거나, 물리적 구조 내에 별도로 들어 있거나, 키트의 성분(예를 들어, 앰플, 튜브 또는 병)에 부착되어 있을 수 있다. 예시적인 지시는 기재된 폴리펩타이드 및 이의 약제학적 조성물을 사용한 혈당의 감소 또는 저하, 고?l당증의 치료, 당뇨병의 치료 등을 위한 지시를 포함한다.
라벨 또는 인서트는 추가로 컴퓨터 판독가능한 매체, 예를 들어, 디스크(예를 들어, 하드 디스크, 메모리 디스크), CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD와 같은 광디스크, MP3, 자기 테잎, RAM 및 ROM과 같은 전기 저장 매체, 또는 자기/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리형 카드와 같은 이들의 하이브리드를 포함하거나 이에 통합되어 있을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 실제 지시는 키트 내에 존재하지 않지만, 원격 소스로부터, 예를 들어, 인터넷을 통해 지시를 얻을 수 있는 수단이 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 동일하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명을 실행하거나 시험하는 데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
이해관계가 충돌하는 경우, 정의를 포함하는 명세서가 제어할 것이다. 본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥이 분명히 다른 것을 기재하지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "펩타이드 서열" 또는 "치료"에 대한 언급은 다수의 이러한 서열, 치료 등을 포함한다. 추가로 특허청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있음을 주목한다. 이를 근거로, 이러한 언급은 청구범위 요소와 관련하여 "오로지", "단지" 등과 같은 배타적 용어의 사용 또는 "부정적인" 한정의 사용에 대한 선행 기초를 제공하기 위함이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 값의 상한과 하한 사이의 각각의 사이값(문맥이 분명히 다른 것을 기재하지 않는 한 하한 단위의 10분의 1까지) 또는 언급된 범위에서의 사이값이 본 발명에 포함된다. 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위내의 임의의 구체적으로 배제되는 한계에 적용되는 본 발명에 포함된다. 언급된 범위는 양쪽 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 포함된 한계들 중 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 수치는 자주 본원 전체에 걸쳐 범위 형식으로 존재한다. 범위 형식의 사용은 단지 편리함과 간결성을 위한 것이고, 문맥이 분명히 다른 것을 기재하지 않는 한 본 발명의 범위에 대한 변경할 수 없는 제한으로서 이해해서는 안된다. 따라서, 범위의 사용은 문맥이 분명히 다른 것을 기재하지 않는 한 분명히 모든 가능한 서브범위, 그 범위 내의 모든 개별적 수치, 및 이러한 범위 내의 정수 및 그 범위 내의 수치 또는 정수의 분수를 포함하는 모든 수치 또는 수치 범위를 포함한다. 이 해석은 범위의 폭에 상관없이 본 명세서 전반에 걸쳐 모든 문맥에 적용된다. 따라서, 예를 들어, 90-100%의 범위라 함은 91-99%, 92-98%, 93-95%, 91-98%, 91-97%, 91-96%, 91-95%, 91-94%, 91-93% 등을 포함한다. 90-100%의 범위라 함은 또한 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 등 뿐만 아니라 91.1%, 91.2%, 91.3%, 91.4%, 91.5% 등, 92.1%, 92.2%, 92.3%, 92.4%, 92.5% 등을 포함한다. 또한, 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250의 범위라 함은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등을 포함한다. 추가 실시양태에서, 25-250, 250-500, 500-1,000, 1,000-2,500, 2,500-5,000, 5,000-25,000 또는 5,000-50,000의 범위라 함은 이러한 값들 내의 또는 이를 포함하는 임의의 수치 또는 수치 범위, 예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29... 250, 251, 252, 253, 254 ... 500, 501, 502, 503, 504... 등을 포함한다. 일련의 범위의 사용은 상한 및 하한 범위의 조합을 포함하여 다른 범위를 제공한다. 이 해석은 범위의 폭에 상관없이 본 명세서 전반에 걸쳐 모든 문맥에 적용된다. 따라서, 예를 들어, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100, 100-150과 같은 일련의 범위라 함은 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 5-75, 5-100, 5-150, 및 10-30, 10-40, 10-50, 10-75, 10-100, 10-150, 및 20-40, 20-50, 20-75, 20-100, 20-150 등과 같은 범위를 포함한다.
간결함을 위해, 특정 약어가 본원에 사용된다. 한 예는 아미노산 잔기를 나타내기 위한 단문자 약어이다. 아미노산 및 이들의 상응하는 3문자 및 단문자 약어는 다음과 같다:
Figure 112016048463691-pct00001
본 발명은 일반적으로 다수의 실시양태를 기재하기 위해 긍정적 언어를 사용하여 기재된다. 본 발명은 또한 물질 또는 재료, 방법의 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 분석 시험 또는 분석과 같은 특정 기재 내용이 전체적으로 또는 부분적으로 배제되는 실시양태를 구체적으로 포함한다. 따라서, 본 발명이 무엇을 포함하지 않는지에 대해 본 발명이 일반적으로 나타내지 않더라도, 본 발명에 분명히 포함되지 않는 양태가 본원에 기재된다.
본 발명의 다수의 실시양태를 기재하였다. 그럼에도 불구하고, 다양한 수정이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 실험 섹션의 기재는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니라 설명하고자 함이다.
실험
다음 실시예는 당해 기술 분야의 숙련가에게 본 발명을 어떻게 성취하고 사용하는지에 대한 완전한 기재를 제공하기 위한 것이며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 여기는 범위를 제한하려는 것도, 하기 실험들이 모든 또는 일부 수행된 실험들임을 나타냄을 의도하고자 하는 것도 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 몇몇 실험 오차 및 분산이 고려되야 할 것이다.
달리 제시된 것이 없는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨(℃)이고, 압력은 대기압이거나 그 부근이다. 다음을 포함하는 표준 약어가 사용된다: bp= 염기쌍(들); kb= 킬로베이스; pl= 피코리터; s 또는 sec= 초; min= 분; h 또는 hr= 시간; aa= 아미노산; kb= 킬로베이스; nt= 뉴클레오타이드; ng= 나노그램; ㎍= 마이크로그램; mg= 밀리그램; g= 그램; kg= 킬로그램; dl 또는 DL= 데시리터; ㎕ 또는 μL= 마이크로리터; ml 또는 mL= 밀리리터; l 또는 L= 리터; μM= 마이크로몰; mM= 밀리몰; M= 몰; kDa= 킬로달톤; i.m.= 근육내; i.p.= 복막내; s.c.= 피하; bid= 1일 2회; HPLC= 고성능 액체 크로마토그래피; BW= 체중; U= 단위; ns= 통계학적으로 유의하지 않음; PG= 공복 혈장 포도당; FPI= 공복 혈장 인슐린; ITT= 인슐린 내성 시험; PTT= 피루베이트 내성 시험; oGTT= 경구 포도당 내성 시험; GSIS= 포도당 자극된 인슐린 분비; AAV= 아데노연관 바이러스; PBS= 인산염 완충 염수; PCR= 폴리머라제 쇄 반응; NHS= N-하이드록시석신이미드; DMEM= 둘베코의 개질된 이글 배지; GC= 유전체 복제물; EDTA= 에틸렌디아민테트라아세트산; FGF19CF= C-말단에 플래그-태그를 갖는 FGF19; GFP= 녹색 형광 단백질; ELISA= 효소 결합 면역흡수 분석; ANOVA= 분산의 분석; SEM= 평균의 표준 오차.
실시예 1
실시예 2 내지 5를 위한 재료 및 방법
다음 방법 및 재료가 아래 실시예 2 내지 5에 사용되었다:
동물. 치료 초기에 대략 15주령의 마우스로서 체중이 대략 36 내지 48g인 db/db 마우스(The Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME)를 복지 지침에 따라 제어된 조명(12시간 명 및 12시간 암 주기, 암조명 6:30p.m. ~ 6:30 a.m.), 온도(22±4℃) 및 습도(50%±20%) 조건하에 있게 했다. 마우스가 오토클레이브 증류수에 자유롭게 접급하도록 하였고, 지방 18kcal%, 단백질 24kcal% 및 탄수화물 58kcal%를 함유하는 시판용 식이(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, Irradiated 2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet)를 무제한적으로 공급하였다. 모든 동물 연구는 NGM 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.
핵산 및 아미노산 서열. FGF19 ORF(hFGF19를 코드화하는 ORF의 cDNA(GenBank Accession No. NM_005117.2)) 및 이에 의해 코드화된 단백질 서열(GenBank Accession No. NP_005108.1))을 사람 소장 조직으로부터 제조된 재조합 DNA(cDNA)를 사용하여 PCR을 통해 증폭시켰다. Phusion® 고정확도 DNA 폴리머라제를 함유하는 PCR 시약 키트(F-530L; New England BioLabs; Ipswich, MA)를 다음 프라이머와 함께 사용하였다: 전위(forward) PCR 프라이머: 5' CCGACTAGTCACCatgcggagcgggtgtgtgg(서열 번호 40), 및 역전(reverse) PCR 프라이머: 5' ATAAGAATGCGGCCGCTTACTTCTCAAAGCTGGGACTCCTC(서열 번호 41).
증폭된 DNA 단편을 Spe I 및 Not I와 함께 다이제스트시키고(제한 부위는 각각 5' 및 3' PCR 프라이머에 포함되었다), 이어서 동일한 제한 효소로 다이제스트된 AAV 전이유전자 벡터와 결찰하였다. 발현에 사용된 벡터는 복제된 코드화 서열의 삽입을 위한 부위의 강한 진핵세포 촉진자 5'에 이어 3' 비번역된 영역 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 테일로 이루어진 선택적 마커 및 발현 카셋트를 함유하였다. 발현 구조는 또한 측면에 5' 및 3' 말단에서의 내부 터미널 반복이 있었다.
FGF19 및 FGF19 변이체를 코드화하는 AAV의 생산 및 정제. AAV293 세포(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 10% 태아 소 혈청 및 1×항생-항진균성 용액((Mediatech)이 보충된 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM, Mediatech, Herndon, VA)에서 배양하였다. 상기 세포를 1일(Day 1)에 150mm 세포 배양 플레이트에 50% 밀도로 플레이팅하고, 다음 3가지의 플라스미드(20㎍/각 플레이트)로 인산칼슘 침전법을 사용하여 2일에 세포감염시켰다: i) AAV 전이유전자 플라스미드, ii) pHelper 플라스미드(Agilent Technologies) iii) AAV2/9 플라스미드(Rabinowitz et al. 2002). 세포감염 후 48시간에, 상기 세포를 플레이트에서 회수하고, 3000×g에서 원심분리하여 펠렛화한 다음, 20mM Tris pH　8.5, 100mM NaCl 및 1mM MgCl2를 함유하는 완충제에 재현탁시켰다. 상기 현탁액을 알콜 드라이아이스 욕에서 냉동시킨 다음, 37℃ 수욕에서 해동시켰고; 냉동-해동 주기를 3회 반복하였다. Benzonase®(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)를 50단위/mL로 첨가하였고 데옥시콜레이트를 최종 농도 0.25%로 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 항온시킨 후, 세포 잔해를 5000×g에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액의 바이러스성 입자를 이전에 기재한 바와 같이(Zolotukhin et al., (2002) Endocrinology 143(5):1741-47) 불연속 이오딕사날(iodixanal, Sigma-Aldrich) 구배를 사용하여 정제하였다. Vivaspin® 20(분자량(MW) 컷오프 100,000　Da, Sartorius Stedim Biotech; Aubagne, France)을 사용하여 바이러스성 스톡을 농축시키고, 10% 글리세롤을 함유하는 인산염 완충 염수(PBS)에 재현탁시키고 -80℃에서 저장하였다.
바이러스성 유전체 복제물(GC) 수를 측정하기 위해, 2μL의 바이러스성 스톡을 37℃에서 30분 동안, 50단위/mL 벤조나제, 50mM Tris-HCl pH　7.5, 10　mM MgCl2 및 10　mM CaCl2를 함유하는 6μL의 용액 내에서 항온시켰다. 이후, 2mg/mL의 프로테이나제 K, 0.5% SDS 및 25mM EDTA를 함유하는 15μL의 용액을 첨가하고 혼합물을 추가로 20분 동안 55℃에서 항온시켜 바이러스성 DNA를 방출시켰다. 바이러스성 DNA를 mini DNeasy® Kit(Qiagen; Valencia, CA)로 세정하고 40μL의 물로 용출시켰다. 정량적 PCR을 사용하여 바이러스성 GC를 측정하였다. 바이러스성 스톡을 바람직한 CG/mL로 염수로 희석하고 작용 용액(200μL)을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입하였다.
혈당 분석. 혈액 샘플을 각각의 절식시키지 않은 동물로부터 꼬리를 잘라 수집하고, 글루코미터(glucometer, Accu-Chek® instruments; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 혈당 수준을 측정하였다.
혈청 FGF19 및 FGF19 변이체 노출 수준 분석. 마우스 꼬리 절단으로부터의 전혈(~50㎕/마우스)을 보통의 모세관(BD Clay Adams SurePrep™, Becton Dickenson; Sparks, MD)에 수집하였다. 혈청 및 혈구를 Autocrit™ Ultra 3 원심분리기(Becton Dickinson)로 10,000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리시켜 분리하고 -80℃에서 즉시 냉동시켰다. FGF19 및 FGF19 변이체의 수준을 시판중인 ELISA(Biovendor; Asheville, NC)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 혈청 내에서 측정하였다. 사람 FGF19를 표준으로서 사용하고 M70의 상대 농도를 측정하였다. 이에 따라 다른 FGF19 변이체의 상대 농도를 측정할 수 있다.
지방 질량 및 근육량(lean mass) 측정. 마취시키지 않은 동물을 개별적으로 플라스틱 홀더 내에 넣고 NMR-MRI(전신 조성 분석기, EchoMRI™, Houston, TX)를 사용하여 체 조성을 측정하였다. 지방 질량, 근육량 및 수분 함량(데이터는 기재하지 않음)을 기록하였다. 전제 과정은 각 동물에 대해 2분을 넘지 않았다.
전체 간 결절 평가. AAV 주입 후 24주에, 동물을 안락사시키고 각각의 간을 전체 결절 생성에 대해 검사하였다. 가시성 간 결절(직경 2mm 초과)의 수를 세고 기록하였다.
통계적 분석. 모든 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 일원 ANOVA에 이어 던넷 포스트 시험(Dunnett's post test)을 사용하여 다수의 그룹으로부터의 데이터를 비교하였다(GraphPad Prism®; San Diego, CA). 지시된 경우, unpaired Student's t-test를 사용하여 시간 경과 연구를 위해 다수의 그룹을 비교하였다. 0.005 이하의 p값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
실시예 2
유전자 전달에 따른 db/db 마우스에서의 혈장 FGF19 수준
FGF19 변이체 M70이 db/db 마우스에서 FGF19 유도된 종양형성을 차단할 수 있는지를 평가하기 위해 24주 연구를 수행하였다. 전달의 통상적인 방법의 대안으로서, AAV가 이 실시예(및 이어지는 실시예 2 내지 4)에서 마우스에서의 관심 외래성 유전자의 전달 및 발현을 위한 비히클로서 및 이러한 전이유전자에 의해 코드화된 단백질로의 연속적, 영구적 및 전신 노출을 가능하게 하는 비히클로서 사용되었다.
유전자 전달 전에, 마우스를 표 1에 제시된 바와 같이 6개의 그룹으로 나누고(5마리의 마우스/그룹) 혈당 및 체중 측정치를 각 마우스에 대해 기록하였다.
표 1
Figure 112016048463691-pct00002
0주에, 마우스에 0.2mL의 염수 또는 0.2mL의 그룹 2 내지 6으로부터의 AAV 구조 중 하나를 주사하였다. 3주 및 5주에, 그룹 1 내지 6의 각각의 마우스에 대해 혈당 및 체중 측정치를 다시 기록하였다.
유전자 전달 후 5주에, FGF19 농도를 염수(그룹 1) 또는 AAV 구조(그룹 2 내지 6)가 주사된 마우스로부터의 분리된 혈청으로 측정하였다. 약물 농도 측정을 위해 사용된 ELISA가 FGF19와 M70을 정확히 구별할 수 없었기 때문에, 그룹 5 및 6에 대해 측정된 혈장 수준은 두 단백질의 총 혈장 농도를 나타낸다.
결과를 도 2에 나타냈다. 저용량(3e9; 그룹 3)의 재조합 FGF19-플래그 바이러스를 투여받은 마우스와 고용량(3e10; 그룹 4)의 재조합 FGF19-플래그 바이러스를 투여받은 마우스에서 검출된 FGF19 수준은 AAV 용량(각각 1.4±0.5ng/mL 및 93.6±12.6ng/mL)에 비례하였다. FGF19-플래그 및 M70 전이유전자가 둘 다 주입된 마우스에서, M70 바이러스(3e11)는 FGF19-플래그 구조 단독에 비해 100배 또는 10배 과잉으로 존재하였다. 두 전이유전자의 공동투여 결과, FGF19의 높은 혈청 수준이 저용량 및 고용량의 FGF19-플래그(각각 734.0±61.1ng/mL(그룹 5) 및 453.4±169.4ng/mL(그룹 6))에서 검출되었고, 이는 M70 및 FGF19-플래그 둘 다의 발현에 의한 것임을 나타낸다. 대조적으로, FGF19는 염수 또는 AAV-GFP가 주입된 db/db 마우스로부터 분리된 샘플에서 검출되지 않았다.
23주에, 혈당 및 체중 측정치를 각각의 마우스에 대해 다시 기록하였다. 유전자 전달 후 24주에, 모든 동물을 안락사시키고 해부하였다.
실시예 3
FGF19 변이체 M70의 부재 및 존재하 db/db 마우스에서의 전체 간 결절의 FGF19 매개된 생성
실시예 2로부터의 안락사된 마우스를 사용하여, 개별 마우스로부터의 간을 검사하고 가시적 간 결절의 수를 측정하였다. 결과를 도 3에 나타냈다. 그룹 번호는 표 1을 참조한다.
도 3에 도시한 바와 같이, db/db 마우스 모델에서의 FGF19-플래그의 이소성 발현은 낮은 바이러스 용량(3e9; 그룹 3) 및 높은 바이러스 용량(3e10; 그룹 4)(각각 2.4±1.4 병변/간 및 7.8 병변/간) 둘 다에서 간 표면으로부터 돌출된, 주변보다 높은 다수의 대형 결절의 생성을 촉진시켰다. 비교해 보면, FGF19-플래그 및 M70을 둘 다 발현하는 마우스로부터 분리된 간은 간 결절이 전혀 없었다(그룹 5 및 6). 결과는 동일 연구 그룹 내의 모든 동물에 대해 평균 및 SEM으로 표시하였다. c-플래그 성분이 FGF19의 항당뇨병 효과에는 영향을 미칠 수 있지만, FGF19의 종양형성 효과에는 영향을 미치지 않았음을 주목해야 한다.
FGF19-플래그의 이소성 발현은 1ng/mL와 같은 낮은 농도에서 db/db 마우스에서의 간 결절의 생성을 촉진시킨다. 그러나, 간 병변의 출현에 의해 증명되는 바와 같이, FGF19 매개된 종양형성은 FGF19-플래그 및 M70 전이유전자가 이 모델에서 공동 발현되는 경우 완전히 억제된다. 이러한 데이터는 가공된 FGF19 변이체 M70은 야생형 단백질과 연관된 마우스에서 종양형성 잠재성을 결핍시킬 뿐만 아니라 야생형 단백질의 증식 효과를 효과적으로 방해할 수 있음을 시사한다.
실시예 4
db/db 마우스에서 체중 및 체 조성에 대한 전이유전자 발현의 효과
실시예 2에서 시사한 바와 같이, 15주령의 숫컷 db/db 마우스(n= 5)에 표 1에 제시된 바와 같이 0.2mL의 염수 또는 재조합 AAV 전이유전자를 주입하였다. 주입 전(-1주) 및 주입 후 3주, 5주 및 23주에 각 마우스의 체중을 측정하였다. 결과는 도 4에 제시된 바와 같이 모든 동물로부터의 각 측정치의 평균과 SEM으로서 표시하였다.
M70 및 FGF19-플래그를 공동 발현하는 형질전환 db/db 마우스(그룹 5 및 6)는 염수가 투여된 마우스(그룹 1)에 비해 체중이 현저히 감소하였다. 체중 감소는 용량 의존적으로 보이고 보다 높은 용량이 주입된 동물(그룹 3 및 4)에서는 3주 및 5주에 체중 감소가 현저했지만, FGF19-플래그 전이유전자를 발현하는 마우스에서는 체중에 대해 덜 극적인 효과가 관찰되었다.
두 대조군(염수 투여군(그룹 1) 또는 AAV-GFP 투여군(그룹 2))에서 마우스는 유전자 전달 후 3주 및 5주에서의 이들의 최대 체중에 비해 연구 종결까지 체질량의 현저한 감소를 보이는 경향이 있었다. 이들 동물에서의 체중 감소는 통상 db/db 마우스에서 관찰되는 심각한 고혈당증 및 24주 연구 기간 동안의 타입 2 당뇨병의 진행과 연관이 있다.
FGF19-플래그 및 M70 전이유전자를 공동 발현하는 마우스에서 관찰된 체중의 변화는 염수 그룹의 동물로부터 수확된 간 중량(데이터는 표시하지 않음)과 비교하여 감소된 간 중량으로 반영되고; 특히, 감소된 기관 크기는 이들 마우스에서의 보다 낮은 체중에 직접 비례한다. 대조적으로, 체중이 정상화된 경우(데이터는 표시하지 않음) 이러한 변화가 유사하게 현저하지는 않더라도 상대적 간 중량이 FGF19-플래그를 발현하는 마우스에서 증가하였다.
또한, 체 조성에 대한 치료 효과를 주입 후 23주에 NMR-MRI를 사용하여 측정하였다. 관찰된 체중 감소와 일관되게, M70 및 FGF19-플래그 전이유전자의 이소성 공동 발현은 염수로 처리된 마우스(데이터는 표시하지 않음)에 비해 db/db 마우스에서 지방 질량 및 제지방 질량 둘 다의 감소를 초래하였다. FGF19-플래그의 발현은 저용량 또는 고용량의 전이유전자를 투여받은 db/db 마우스에서 체 조성에 거의 영향을 미치지 않았다(데이터는 표시하지 않음).
실시예 5
db/db 마우스에서 비공복시 혈당에 대한 전이유전자 발현의 효과
실시예 2에서 시사한 바와 같이, 15주령의 숫컷 db/db 마우스(n= 5)에 표 1에 제시된 바와 같이 0.2mL 염수 또는 재조합 AAV 전이유전자를 주입하였다. 주입 전(-1주) 및 주입 후 3주, 5주 및 23주에 각 마우스의 혈당을 측정하였다. 결과는 도 5에 제시된 바와 같이 모든 동물로부터의 각 측정치의 평균과 SEM으로서 표시하였다.
M70 및 FGF19-플래그를 공동 발현하는 형질전환 db/db 마우스(그룹 5 및 6)는 대조군 동물(그룹 1)에 비해 혈당이 현저히 감소하였다. 혈당 수준은 FGF19-플래그 및 M70을 공동 발현하는 마우스에서 급격히 저하되었고, 유전자 전달 후 대략 3주까지 안정 수준에 도달했다(고용량(그룹 6)의 FGF19-플래그 전이유전자 및 저용량(그룹 5)의 FGF19-플래그 전이유전자에서 각각 160 및 141mg/dL). FGF19-플래그를 발현하는 마우스(그룹 3 및 4)에서의 혈당 수준은 대조군보다 현저히 낮았고, 24주의 연구 기간 동안 초기 기준선 수준(대략 400-450mg/dL)에서 유지되었다. 미리 제시한 바와 같이, c-플래그 성분은 FGF19의 종양형성 효과에는 영향을 미치지 않았지만, FGF19의 항당뇨병 효과에는 영향을 미칠 수 있다. 이들 마우스에서 검출된 FGF19-플래그의 낮은 전신 수준은 염수 또는 AAV-GFP로 처리된 마우스에서 관찰된 악화중인 혈당증에 대한 어느 정도의 보호를 제공하는 것으로 보이나, 기준선 수준보다 낮은 포도당 수준으로는 만들지 못한다.
예상되는 바와 같이, 염수(그룹 1) 또는 대조용 바이러스인 AAV-GFP(그룹 2)가 주입된 후 연구 기간 동안 포도당 저하가 관찰되지 않았다. 중요한, 대조군에서 글루코미터에 의해 특정된 혈당 농도(~600mg/dL)는 기구에 의한 검출의 상한을 나타내고 이들 샘플에서의 실제 포도당 농도보다 적게 표시될 수 있다.
실시예 6
실시예 7 내지 11을 위한 재료 및 방법
다음 방법 및 재료가 아래 실시예 7 내지 16에 사용되었다:
DNA 구조. 사람 FGF19(NM_005117), 사람 FGFR4(NM_022963), 마우스 FGFR4(NM_008011), 사람 KLB(NM_175737) 및 마우스 KLB(NM_031180) cDNA를 Genecopoeia에서 구입하였다. QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis 키트 (Stratagene)를 사용하여 FGF19 구조에서 돌연변이를 유도하였다.
FGF19 및 FGF19 변이체를 코드화하는 AAV의 생산 및 정제. AAV293 세포(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 10% 태아 소 혈청 및 1×항생-항진균성 용액((Mediatech)이 보충된 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM, Mediatech, Herndon, VA)에서 배양하였다. 상기 세포를 1일(Day 1)에 150mm 세포 배양 플레이트에 50% 밀도로 플레이팅하고, 다음 3가지의 플라스미드(20㎍/각 플레이트)로 인산칼슘 침전법을 사용하여 2일에 세포감염시켰다: i) AAV 전이유전자 플라스미드, ii) pHelper 플라스미드(Agilent Technologies) iii) AAV2/9 플라스미드(Rabinowitz et al. 2002). 세포감염 후 48시간에, 상기 세포를 플레이트에서 회수하고, 3000×g에서 원심분리하여 펠렛화한 다음, 20mM Tris pH　8.5, 100mM NaCl 및 1mM MgCl2를 함유하는 완충제에 재현탁시켰다. 상기 현탁액을 알콜 드라이아이스 욕에서 냉동시킨 다음, 37℃ 수욕에서 해동시켰고; 냉동-해동 주기를 3회 반복하였다. Benzonase®(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)를 50단위/mL로 첨가하였고 데옥시콜레이트를 최종 농도 0.25%로 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 항온시킨 후, 세포 잔해를 5000×g에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액의 바이러스성 입자를 이전에 기재한 바와 같이(Zolotukhin et al., (2002) Endocrinology 143(5):1741-47) 불연속 이오딕사날(iodixanal, Sigma-Aldrich) 구배를 사용하여 정제하였다. Vivaspin® 20(분자량(MW) 컷오프 100,000　Da, Sartorius Stedim Biotech; Aubagne, France)을 사용하여 바이러스성 스톡을 농축시키고, 10% 글리세롤을 함유하는 인산염 완충 염수(PBS)에 재현탁시키고 -80℃에서 저장하였다.
바이러스성 유전체 복제물(GC) 수를 측정하기 위해, 2μL의 바이러스성 스톡을 37℃에서 30분 동안, 50단위/mL 벤조나제, 50mM Tris-HCl pH　7.5, 10mM MgCl2 및 10mM CaCl2를 함유하는 6μL의 용액 내에서 항온시켰다. 이후, 2mg/mL의 프로테이나제 K, 0.5% SDS 및 25mM EDTA를 함유하는 15μL의 용액을 첨가하고 혼합물을 추가로 20분 동안 55℃에서 항온시켜 바이러스성 DNA를 방출시켰다. 바이러스성 DNA를 mini DNeasy® Kit(Qiagen; Valencia, CA)로 세정하고 40μL의 물로 용출시켰다. 정량적 PCR을 사용하여 바이러스성 GC를 측정하였다. 바이러스성 스톡을 바람직한 CG/mL로 염수로 희석하고 작업 용액(200μL)을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입하였다.
동물 실험. 모든 동물 연구는 NGM 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 마우스를 제어된 12시간 명/12시간 암 주기하에 22℃에서 병원균 부재 동물 시설에 수용하였다. 모든 마우스에 표준 식이((Harlan Laboratories, Teklad 2918)를 계속 공급하고 오토클레이브 물을 무제한으로 공급하였다. 달리 특정되지 않는 한 숫컷 마우스를 사용하였다. C57BL/6J, FVB/NJ, BDF, ob/ob 및 db/db 마우스를 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory)에서 구입하였다. 이형 rasH2 유전자 삽입 마우스를 Taconic에서 구입하였다. -7일에, 10 내지 12주령의 ob/ob 또는 db/db 마우스, 또는 6 내지 8주령의 C57BL/6J, FVB/NJ, BDF 또는 rasH2 마우스의 코호트를 체중을 근거로 하여 무작위로 처리 그룹으로 나누었다. 1일에 모든 동물에게 꼬리 정맥을 통해 AAV의 3×1011개의 유전체 복제물을 단일 정맥내 주사로 200μL 투여하였다. 체중을 기록하고 혈청 FGF19 수준의 측정을 위해 꼬리를 절단하여 혈액을 수집하였다. 동물을 안락사시키고 AAV의 투여 후 24주 또는 52주에 간을 수집하였다.
총체적, 조직학적 및 면역조직화학적 분석. AAV-FGF19가 주입된 마우스에서의 간 변화의 개시를 측정하기 위해, 총체적 및 조직학적 평가를 1년의 기간에 걸쳐 지정된 간격으로 수행하였다. 체중, 간 중량 및 간 종양 결절수를 해부시 기록하였다. FGF19 변이체에 대한 종양 스코어 계산을 위해, 종양 스코어= 변이체를 발현하는 간의 전체 표면 상의 종양 결절수/야생형 FGF19를 발현하는 간의 전체 표면 상의 종양 결절수이다. 그러므로, FGF19 발현 마우스에는 임의값 1의 종양 스코어가 주어진다. 포르말린 고정된 파라핀 봉입 조직 부분을 간세포 과다형성, 비대 또는 종양형성의 조직학적 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하였다. 지시된 경우, 간 부분을 항원 복구(antigen retrieval)를 위해 시트레이트 완충제(Vector Laboratories)를 사용하여 처리한 다음, 10㎍/mL 항-PCNA(Dako), 항-Ki67(Dako), 항글루타민 합성효소(Thermofisher) 또는 항-β-카테닌 항체(Cell Signaling)와 함께 항온시켰다. 바이오티닐화 2차 항체, ABC-HRP 시약 및 DAB 칼로리메트릭 퍼옥시다제 기질(Vector Laboratories)을 검출을 위해 사용하였다. LacZ 염색의 경우, 간을 OCT에 넣고 크리오스탯(Cryostat)에서 절단하였다. 조직 부분을 4% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드를 함유하는 PBS에서 10분 동안 고정시키고 5mM 칼륨 페로시아나이드 및 5mM 칼륨 페리시아나이드 중의 1mg/mL X-gal(Promega)과 함께 37℃에서 2시간 동안 항온시켰다.
루시퍼라제 분석. Rat L6 근육모세포를 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 입수하고, 5% CO2하 37℃에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM, Mediatech, Herndon, VA)에서 배양하였다. 96-웰 플레이트의 세포를, FuGENE® 6 세포감염 시약(Roche Applied Science)을 사용하여 마우스 KLB, 마우스 FGFR4, GAL4-Elk-1 전사 활성화제(pFA2-Elk1, Stratagene), 파이어플라이 루시퍼라제 리포터(firefly luciferase reporter) 작동된 GAL4 결합 부위(pFR-luc, Stratagene) 및 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase)(pRL-SV40, Promega)로 일시적으로 세포감염시켰다. 세포감염 다음날, 세포를 20㎍/mL 헤파린(Sigma)을 함유하는 혈청 비함유 배지 중의 리간드로 6시간 동안 자극하였다. 세포를 용해 완충제(Promega)로 용해시키고, Dual-Glo® Luciferase Assay System(Promega) 및 EnSpire® Plate Reader(Perkin Elmer)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 파이어플라이 루시퍼라제 활성을 공동 발현된 레닐라 루시퍼라제 활성으로 표준화하고 3개의 복제물의 평균±SEM으로 나타냈다.
원발성 간세포에서의 Cyp7α1의 발현. 마우스, 래트 또는 사람 간((Life Technologies)으로부터의 원발성 간세포를 콜라겐 I 코팅된 96-웰 플레이트((Becton Dickinson) 상에 플레이팅하고 100nM 덱사메타손 및 0.25mg/mL 마트리겔이 보충된 윌리암(Wiliam)의 E 배지에서 밤새 항온시켰다. 세포를 재조합 FGF19 또는 M70 단백질로 24시간 동안(마우스 또는 래트 간세포) 처리하거나 6시간 동안(사람 간세포) 처리하였다. 세포 용해물에서의 Cyp7α1의 발현을 QuantiTect 멀티플렉스 qRT-PCR 마스터 믹스(Qiagen) 및 미리제조된 프라이머와 프로브(Life Technologies; 마우스 Cyp7α1: Mm00484150_m1; 래트 Cyp7α1: Rn00564065_m1; 사람 Cyp7α1: Hs00167982_m1)를 사용하여 qRT-PCR 분석으로 측정하였다. 반응을 Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection System으로 3회 실시하였다. 내부 표준으로서 18S RNA(마우스 및 래트) 또는 액틴(사람)을 사용하여 비교 역치 주기 방법으로 상대적 mRNA 수준을 계산하였다.
생체내 신호화 분석. db/db 마우스(9 내지 11주령)(Jackson Laboratories)에 FGF19 또는 M70 재조합 단백질을 복막내(i.p.) 주사(1mg/kg)하였다. 주사 후 15분, 2시간 또는 4시간에 간을 수집하고 액체 질소에서 순간 냉동시켰다. 냉동된 간 샘플을 프로테아제 억제제(Roche) 및 포스파타제 억제제(Sigma)를 함유하는 RIPA 용해 완충제(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 1% NP40 및 0.5% 나트륨 데옥시콜산, 1mM 디티오테레이톨, 1mM PMSF, 2mM 불화나트륨 및 2mM 나트륨 오르토바나데이트)에서 균질화시켰다. BCA 분석(Thermo Fisher)에 의해 측정된 바와 같이, 등량의 단백질(15㎍)을 4-20% 폴리아크릴아미드 겔(Bio-Rad) 상에서 분리하고 니트로셀룰로즈 막(Bio-Rad)으로 이동시켰다. 막을 PBS/0.05% Tween 20 중의 5% 무지방 분유로 막고, pSTAT3(Cell Signaling), STAT3(Cell Signaling) 또는 항체 칵테일 I(Cell Signaling)에 대한 항체와 함께 항온시켰다. 결합된 항체를 겨자무과산화효소(HRP) 결합된 2차 시약으로 검출하고 Odyssey® 스캐너(Li-Cor Biotechnology)로 시각화하였다.
이종이식 실험. 6 내지 8주령의 무흉선 nu/nu 암컷 마우스(Charles River Laboratories) 옆구리에 5×106 세포(200μL/마우스)를 피하 주사하였다. 비슷한 부피(~ 100㎣)의 종양을 갖는 마우스를 무작위로 그룹으로 나누고 1회 꼬리 정맥 주사를 통해 3×1011 AAV-M70 또는 대조군 바이러스(AAV-GFP)로 처리하였다. 전자 칼리퍼로 종양을 측정하고, 식: (W2×L)/2(W 및 L은 각각 보다 작은 직경 및 보다 큰 직경이다)를 사용하여 평균 종양 부피를 계산하였다.
통계적 분석. 모든 결과를 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표현한다. 일원 ANOVA에 이은 던넷 포스트 시험을 사용하여 다수의 그룹으로부터의 데이터를 비교하였다(GraphPad Prism®). 지시된 경우, unpaired Student's t-test를 사용하여 두 처리 그룹을 비교하였다. 이원 ANOVA에 이은 본페로니(Bonferroni) 포스트 시험을 사용하여 시간 경과 연구를 위해 다수의 그룹을 비교하였다. 0.005 이하의 p값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
실시예 7
생체내 간세포 종양형성의 평가를 위한 AAV 매개된 전이유전자 시스템
AAV 매개된 유전자 전달은 주로 기타 바이러스성 벡터와 연관된 염증성 반응 없이 연속의 전이유전자 발현을 성취하기 위한 수단을 제공한다(Zaiss et al., 2002, J. Virol. 76, 4580-4590). 1년까지의 지속된 발현이 성체 마우스에 도입되는 경우의 AAV 유전자 전달 방법으로 알려졌다((Rivera et al., 1999, PNAS 96, 8657-8662). 첫 번째 AAV 벡터가 사람의 유전 질환에 대한 치료로서 최근 승인되었다(Wirth et al., 2013, Gene 525, 162-169).
이전에 보고된 FGF19 전이유전자 모델에서, FGF19가 FGF19 발현의 비생리학적 부위인 골격근에서 이소성으로 발현되었다(Inagaki et al., 2005, Cell Metabol. 2, 217-225; Nicholes et al., 2002, Amer. J. Pathol. 160, 2295-2307). 경화증 또는 담즙울혈과 같은 병리학적 상태하에서, FGF19 발현이 간에서 유도된다((Desnoyers et al., 2008, Oncogene 27, 85-97; Hasegawa Y, 2013, Hepatol. 58, 802A; Schaap et al., 2009, Hepatol. 49, 1228-1235). 형질전환 마우스를 생성시키는 통상의 방법에 대한 대안으로서, FGF19가 6 내지 12주령 마우스에서 AAV를 통해 유도되었다(도 6a). 전이유전자 발현의 원발성 조직은 이 접근법을 사용하는 간이며 심장 및 근육에서 단지 미미한 발현이 있다(데이터는 표시하지 않음). AAV의 단일 투여에 따른 간세포의 100% 형질도입 및 장기간 유전자 발현이 이미 보고되었다(Zincarelli et al., 2008, Mol. Ther. 16, 1073-1080)(데이터는 표시하지 않음).
다수의 마우스 계통을 FGF19 매개된 간 종양 생성의 잠복 및 강인성에 대해 평가하였다(표 2). 대조군 AAV 바이러스(AAV-GFP, 녹색 형광성 단백질)는 어떠한 간 종양도 생성시키지 않았다(표 2).
표 2에 나타낸 바와 같이, FGF19는 다수 마우스 모델에서 간암 발생을 촉진시킨다. 다양한 계통의 마우스(6 내지 12주령)에 FGF19를 코드화하는 AAV 벡터의 3×1011 유전체 복제물 또는 대조군 유전자(GFP, 녹색 형광성 단백질)를 주사하였다. AAV 투여 후 24주 또는 52주에 종양 발생정도를 측정하였다. n.d.: 측정되지 않음
표 2
Figure 112016048463691-pct00003
일반적으로, AAV-GFP가 주입된 마우스는 염수 주입된 마우스와 유사한 표현형을 나타냈다(데이터는 표시하지 않음). 간결함을 위해, AAV-GFP가 주입된 마우스로부터의 결과만을 다음 연구에서 대조군으로서 나타냈다.
흥미롭게도, 종양 잠복은 마우스의 유전적 배경에 따라 달랐다. 렙틴(leptin) 수용체에서의 돌연변이가 흔히 경화성 간에서 발견되고 사람에서는 HCC와 연관된다(Ikeda et al., 2014, Gastroenterol., 146:222-232; Wang et al., 2010, World J. Gastroenterol. 16, 5801-5809). 렙틴 수용체에 유전적 결함이 있는 db/db 마우스(Tartaglia et al., 1995, Cell 83, 1263-1271)는 후보 HCC 촉진 유전자를 평가하기 위한 임상적으로 관련된 유전적 맥락을 제공한다. 사실, 시험된 몇몇 마우스 계통 중에서, db/db 마우스가 AAV-GFP 전달 후 24주에 간 표면으로부터 돌출된, 주변보다 높은 다수의 대형 종양 결절의 출현과 함께 최단 잠복 및 높은 종양 발현(penetrance)을 나타냈다(도 6b).
db/db 마우스에서 AAV-FGF19의 3×1011 유전체 복제물의 단일 꼬리 정맥 주사 후 1주에 혈청 FGF19 수준이 ~ 1㎍/ml에 도달했다(도 6c). FGF19는 대조군 바이러스가 주입된 마우스에서는 검출되지 않았다. FGF19의 높은 순환 수준이 24주 연구 기간을 통해 계속되었다(도 6c). 간의 전체 표면상의 시각적 종양 결절을 계수하였다(도 6d). 간 종양 결절의 최대 직경을 기록하였다(도 6d). 가끔 어느 정도의 간 종양 결절이 대조군 바이러스 또는 염수가 주입된 db/db 마우스에서 관찰되었는 데, 이는 아마도 이 유전자 모델에서의 종양형성의 증가된 배경을 반영하는 것이다(도 6d 및 데이터는 표시하지 않음). 종양 스코어 시스템을 재료 및 방법에서 기재한 바와 같이(실시예 6) 간 종양 결절의 다양성을 기초로 하여 확립하였다(도 6d).
현미경 검사로 고형 HCC로서의 AAV-FGF19 유도된 정위 간 종양을 분류하였고, 이는 FGF19 형질전환 동물에서 보고된 것과 유사하다(도 6e). Ki-67 또는 PCNA에 대한 면역조직화학 염색에 의해 검사한 세포 증식 상태는 종양이 매우 증식성이었음을 나타냈다. FGF19 형질전환 동물에서 관찰된 것과 유사하게, AAV-FGF19 마우스에서의 간 종양은 글루타민 합성효소 양성이고 중심주위 기관을 암시한다(Nicholes et al., 2002, Amer. J. Pathol. 160, 2295-2307)(도 6e). AAV-FGF19 마우스로부터의 간 종양은 또한 β-카테닌에 대해 증가된 핵 염색을 나타냈다(도 6e). 따라서, AAV 매개된 이식 유전자 발현은 생체내 FGF19 유도된 간암 발생의 평가를 위한 양호한 시스템이다.
실시예 8
M70은 가공된 종양 비함유 FGF19 변이체이다
FGF19 및 FGF21은 동일한 FGF 패밀리에 속하며, 34% 아미노산 동일성을 공유한다. 흥미롭게도, FGF19와 달리, FGF21은 AAV 매개된 이식 유전자 모델에서 간 종양 생성을 유도하지 않는다(데이터는 표시하지 않음). FGF19에 의해 유도된 종양생성에 결정적인 구조적 요소를 확인하기 위해, FGF19와 FGF21 사이의 다수의 키메릭 구조를 α-스트랜드 및 β-헬릭스를 포함한 예측된 2차 구조적 요소를 조직적으로 바꿔서(swap) 생성시켰다(표 3). 표 3은 FGF19 또는 FGF21로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 키메릭 구조를 보여준다. 간 종양 생성을 AAV 매개된 전이유전자 발현 후 24주에 평가하였다. FGF19의 2차 구조적 성분(β-시트(sheet) 및 β-시트들 사이의 루프(loop))이 조직적으로 대체된다. 구조를 AAV에 의해 개별적으로 db/db 마우스로 도입하여 연속 노출 후 24주에 구조의 종양생성 잠재성을 평가하였다. FGF19의 10 내지 20개의 N-터미널 아미노산이 종양생성에 중요한 것으로 확인되었다(표 3).
표 3
Figure 112016048463691-pct00004
이어서, 이 영역 내의 아미노산을 단지 바꿈으로써 추가 구조를 생성시켰다(표 4). 표 4는 N-터미널 영역에서의 FGF19 변이체의 구조 활성 관계 분석을 보여준다. 야생형 FGF19로부터의 아미노산 변화는 밑줄친 것이다. 간 종양생성을 전이유전자 발현 후 24주에 평가하였다.
표 4
Figure 112016048463691-pct00005
종합적으로, 30개 초과의 FGF19 변이체를 이들의 종양생성에 대해 개별적으로 평가하였다. 3개의 아미노산 치환(A30S, G31S, H33L) 및 5개의 아미노산 결손을 갖는, M70(서열 번호 1)으로 불리는 FGF19 변이체를 추가 연구를 위해 선택했다(도 7a).
FGF19와는 대조적으로, 24주 동안 M70에 고도 전신 노출된 db/db 마우스로부터의 간은 간 종양 결절이 전혀 없었다(FGF19 및 M70에 대해 각각 15.6±2.8 종양 결절/간 및 0.0±0.0 종양 결절/간, n= 5, p < 0.001; 도 7b). FGF19 발현 마우스는 간 중양이 현저히 증가하였고(2.91±0.19g 대 1.86±0.12g(대조군), n= 5, p < 0.001; 도 7c) 이는 이전 연구에서 보고된 바와 같이 간 종양 부하와 밀접히 연관된다. 대조적으로, M70 발현 마우스는 간 중량이 전혀 증가하지 않았다(1.56 + 0.09g 대 2.91±0.19g(FGF19 마우스), n= 5, p < 0.001; 도 7c). 유사한 결과가 체중에 대한 간의 비율을 계산하였을 때 수득되었다(도 7d 및 7e). 이들 마우스에서의 M70의 평균 혈청 농도는 2 내지 3㎍/ml로서, 사람에서의 순환 FGF19 수준보다 10,000배 높다(도 7f). 간 조직학적 분석은, M70 발현 마우스는 마우스에서의 FGF19 과발현과 연관된 어떠한 인식가능한 종양전 및 종양 병변도 발전시키지 않음을 드러냈다. 구체적으로, 변형된 간 부위, 간세포 형성이상, 간세포 샘종 또는 간세포 암종이 관찰되지 않았다(도 7g). FGF19 발현 마우스에서, 비종양생성 영역은 중심 정맥주변에 증가된 세포 밀도를 보였으나, 이러한 변화는 M70 발현 마우스에서는 관찰되지 않았다. M70의 과발현은 FGF19 과발현으로부터 야기되는 Ki-67 양성 세포의 수를 증가시키지 않았다(도 7g). 또한, FGF19 발현 세포에서의 간 종양 병변이 글루타민 합성효소에 대해 매우 양성이 되는 경우, 글루타민 합성효소의 증가된 발현이 M70 발현 마우스의 간에서 관찰되지 않았다(도 7g). 최종적으로, 간 효소의 혈청 수준으로 측정한 바와 같이, M70에 24주 동안 장기간 노출한 후 간 독성이 관찰되지 않았다(도 7h). 종합해 보면, 이들 결과는 M70이 db/db 마우스에서 간세포 종양생성을 촉진시키는 능력이 결여됐음을 나타낸다.
rasH2 형질전환 마우스 모델에서의 M70의 종양생성을 추가로 평가하였다. 사람 H-RAS 전이유전자에 대한 CB6F1-RasH2 미우스 반접합체가 설치류에서의 통상적인 2년 발암 평가를 위한 발군의 평가로서 널리 사용되었다((Storer et al., 2010, Toxicologic Pathol. 38, 51-61). 유전자독성 및 비유전자독성 종양유발물질둘 다에 민감한 rasH2 마우스는 야생형 마우스보다 일찍 자발적 신생물 및 유도된 신생물 둘 다를 발전시킨다. 이 계통은 또한, RAS 신호화 경로의 활성화가 사람 HCC에서 자주 관찰되기 때문에, 간암 발생을 연구하기 위한 관련된 유전적 배경을 제공한다(Calvisi et al., 2006, Gastroenterol. 130, 1117-1128).
52주 연구 기간 동안, FGF19 또는 M70을 발현하는 rasH2 마우스는 대조군 마우스에 비해 체중 증가가 현저히 감소하였다(도 8a). 그러나, FGF19 및 M70 발현 그룹으로부터의 간의 형태는 큰 차이를 보였다. 다수의 종양 결절의 총체적 형태 변화가 FGF19를 발현하는 미우스에서 관찰되었고, 이는 HCC의 생성과 일치한다(3.8 + 1.5 종양 결절/간; 도 8b). 대조적으로, M70을 발현하는 미우스로부터의 간은 정상적인 전체 형태를 나타냈고 종양 결절이 전혀 없었다(도 8b). 낮은 수준의 자발적 간 종양생성이 대조군 rasH2 마우스에서 관찰되었음을 주목해야 한다(도 8b). M70 발현 동물은 FGF19 마우스에 비해 간 종양이 현저한 감소하였다(0.76 + 0.05g 대 1.71 + 0.24g(FGF19 마우스), n= 9, p < 0.001; 도 8c). M70은 또한 rasH2 마우스에서의 간과 체중의 비율을 정상화시켰다(5.34 + 0.24% 대 8.66 + 1.36%(FGF19 마우스), n= 9, p < 0.01; 도 8d). 이들 마우스에서 FGF19 및 M70의 혈청 수준은 각각 155±28ng/ml 및 209±22ng/ml로서 비숫하다(도 8e).
이들 마우스로부터의 H & E 염색된 간 부분을 종양 및 종양전 병변의 존재에 대해 평가하였다(도 8f). 또한, FGF19 매개된 간 종양의 마커로서 항-글루타민 합성효소 염색을 수행하였다(도 8f). 글루타민 합성효소로 염색된 부분을 H & E로 염색된 쌍을 이루는 부분으로부터 취했고 사진은 동일한 간문맥(p) 및 중심(c) 정맥을 보였다. FGF19 발현 rasH2 마우스는 간세포 샘종 뿐만 아니라 간세포 암종을 나타냈다. 종양전 간세포 병변이 또한 FGF19 발현 rasH2 마우스에서 주목된다. 놀랍게도, M70을 발현하는 미우스로부터의 어떠한 간도 종양이나 종양전 병변의 조직학적 증거를 나타내지 않았다(도 8f). 조직학적 결과가 뒷받침하듯이, Ki-67 및 AFP(자주 HCC에서 유도된 배아 간 단백질)의 증가된 간 발현(Marrero and El-Serag, 2011, Hepatol. 53, 1060-1062)은 FGF19 발현 rasH2 마우스에서 관찰되었으나, M70 발현 마우스에서는 관찰되지 않았다(도 8g).
이들 결과는, FGF19와 달리 M70의 높은 순환 수준에의 장기간 노출(즉, db/db 마우스에서는 24주 또는 rasH2 마우스에서는 52주)이 간 종양생성을 촉진시키지 않음을 나타낸다.
실시예 9
M70은 시험관내 및 생체내에서 FGFR4에 결합하고 이를 활성화시킨다
간 종양을 유도하지 않는 M70의 능력을 강조하는 분자 메카니즘을 설명하기 위해, FGF19의 공지된 수용체 복합체에 대한 M70의 상호작용을 평가하였다. 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR)을 사용하여 M70 또는 FGF19의 FGFR4에 대한 직접 결합을 측정하였다. Biocore 분석에서, M70 또는 FGF19를 FGFR4의 세포외 도메인(ECD)의 Fc 융합 단백질로 코팅된 칩들 위로 유동시키는 데 사용하였다. M70은 FGF19와 비슷한 친화도로 FGFR4와 직접 상호작용하였다(해리 상수 KD는 각각 134±47nM 및 167±5nM, 도 9a 및 9b). M70은 또한 FGF19와 유사한 친화도로 KLB에 결합하였다(KD는 각각 24.1 + 11.0pM 및 28.5 + 0.8pM, 데이터는 표시하지 않음). M70은 경쟁 Biocore 분석으로 증명되는 바와 같이(데이터는 표시하지 않음) FGF19와 동일한 위치의 KLB에 결합한다. 고형상 분석에서, M70은 FGFR4-KLB 수용체 복합체와 상호작용하였다(도 9c). KLB의 존재는 리간드-수용체 친화도를 크게 증가시켰다. FGFR4-KLB 수용체 복합체에 대한 M70 결합의 해리 상수는 KD= 2.14nM(대 FGF19의 KD= 2.49nM)로서 고친화도 반응을 나타냈다
그의 수용체를 활성화시키기 위한 M70의 능력을 GAL-ElK1 루시퍼라제 리포터 유전자로 세포감염된 래트 L6 세포를 사용하여 세포 기초 분석으로 평가하였다(Wu et al., 2011, PloS one 6, e17868; Wu et al., 2010a, PNAS, 107, 14158-14163). 이 분석에서, 리간드의 FGFR로의 효과적인 결합은 내인성 ERK 키나제 경로의 활성화를 야기하여 ElK1 활성화 도메인 및 GAL4 DNA-결합 도메인을 포함하는 키메릭 전사 활성화제의 후속적인 활성화를 초래한다. L6 세포는 기능적 FGFR 또는 KLB가 결핍되고 동계 수용체가 공동 세포감염된 경우 FGF19에만 반응성이다(데이터는 표시하지 않음). M70은 FGF19 만큼 효과적으로 FGFR 및 KLB를 공동 발현하는 L6 세포에서 세포내 신호화 경로를 활성화시킨다(EC50은 M70 및 FGF19에 대해 각각 38pM 및 52pM; 도 9d). 대조적으로, FGFR4 단독으로 세포감염된 세포에서의 신호화는 둘 중 하나의 리간드에 대해 훨씬 덜 반응성인데, FGF19 또는 M70 중 하나의 첨가시 잠재성이 500배 넘게 저하된다(도 9d). 이러한 결과는 FGFR4-KLB 공동 수용체와 동계 리간드 간의 삼원 복합체의 생성이 세포간 신호화의 잠재적 활성화에 중요하다 것을 시사한다. 이어서 사람 HCC 세포주인 Hep3B에서의 FGFR4 경로 활성화를 분석하였다. Hep3B 세포는 FGFR의 이소폼 중에서 FGFR4와 KLB를 대부분 발현한다. M70은 야생형 FGF19와 유사한 잠재성 및 효능으로 ERK의 인산화 및 활성화를 유도했다(최대 유효 농도의 반 EC50은 M70 및 FGF19에 대해 각각 0.38nM 및 0.37nM; 도 9e).
FGF19/FGF15는 각각 사람 및 설치류에서의 간 담즙산 대사의 조절에 연루되어 있다(Holt et al., 2003, Genes Dev. 17, 1581-1591) (Inagaki et al., 2005, Cell Metabol. 2, 217-225). FGF19/FGF15는 FGFR4를 필요로 하는 과정에서 콜레스테롤-7α-하이드록실라제 1(Cyp7α1)의 간 발현을 강력하게 나타낸다(Inagaki et al., 2005, Cell Metabol. 2, 217-225; Wu et al., 2011, PloS one 6, e17868). 원발성 간세포에서 Cyp7α1을 조절하는 M70의 능력을 평가하였다. 배지에 첨가시, M70은 마우스, 래트 또는 사람 간으로부터 유도된 원발성 간세포에서의 Cyp7α1 발현을 효과적으로 억제하였다. M70의 활성은 야생형 FGF19의 활성과 비슷했다(원발성 마우스 간세포에서 최대 억제 농도의 반 IC50은 M70의 경우 0.64pM, FGF19의 경우 0.65pM; 원발성 래트 간세포에서 IC50은 M70의 경우 0.49pM, FGF19의 경우 3.96pM; 원발성 사람 간세포에서 IC50은 M70의 경우 6.80pM, FGF19의 경우 1.73pM; 도 9f). 원발성 사람 간세포에서, FGF19의 첨가는 Cyp7α1 mRNA를 97%까지 최대 억제하였다. 유사하게, M70은 Cyp7α1 발현을 98%까지 감소시킬 수 있었다(도 9f).
생체내 Cyp7α1의 간 발현에 대한 M70 투여의 급성 효과를 평가하기 위해, 마우스에 재조합 M70 또는 FGF19 단백질을 0.001 내지 10mg/kg의 용량으로 복막내(i.p.) 주사하였다(도 9g). M70의 단일 i.p. 주사는 1.29㎍/kg의 ED50으로 Cyp7α1 mRNA를 강력하게 억제하였다(도 9g). 이들 데이터는 M70의 전신 투여가 생체내에서 FGFR4 매개된 세포내를 강력하고 신속히 촉발시킬 수 있음을 입증한다.
요약하면, M70 및 야생형 FGF19는 비슷한 생물학적 활성 프로파일을 나타내서 ERK 신호화의 활성화 및 Cyp7α1 조절을 야기한다.
실시예 10
M70은 FGF19와 비교해 차등 신호화 경로 활성화를 나타낸다
M70은 FGFR4 수용체 복합체에 결합하고 Cyp7α1 억제를 야기하는 세포내 신호화 경로를 활성화하나, db/db 또는 rasH2 마우스 모델에서의 간 종양생성을 촉진시키지 않는다. 종양생성 가능성의 결핍에 대한 분자 기초를 설명하기 위해, ERK, PI3K/AKT, STAT 및 WNT/β-카테닌 경로를 포함한, 종양생성에 관련된 중요한 신호화 단백질의 활성화를 분석하였다.
M70 및 FGF19 단백질(1mg/kg)을 db/db 마우스에 복막내로 주사하였다. 간을 15분 후(데이터는 표시하지 않음), 2시간 후(도 10a) 및 4시간 후(데이터는 표시하지 않음)에 수집하고, 신호화 단백질의 인산화를 면역블로팅으로 측정하였다. 배양된 원발성 간세포에서 신호를 보내는 두 분자의 능력과 일치하게, FGF19 및 M70은 ERK 인산화를 생체내 간 조직에서와 유사한 정도로 자극하였다. 간 단백질 합성을조절하는 FGF19의 역할에 대한 이전 보고에 따라(Kir et al., 2011, Science 331, 1621-1624), 야생형 FGF19 및 M70 둘 다 간에서의 리보솜 S6 단백질의 강력한 인산화를 유도하였다. 이는 M70이 FGFR4-KLB 수용체 복합체에 대한 활성을 유지한다는 개념에 맞는 것이다. M70도 FGF19도 인산화 AKT의 간 수준에 대해 어떠한 영향도 미치지 않는다. GSK3β 및 β-카테닌의 활성화가 시험된 세 시점 모두에서 관찰되지 않았다.
놀랍게도, FGF19는 투여한지 2시간 후에 STAT3 인산화를 유도하였다(도 10a). 이 효과는 투여 후 4시간 동안 지속되었다(데이터는 표시하지 않음). 대조적으로, M70은 STAT3 인산화를 증가시키지 않았다(도 10a). 공지된 STAT3 활성화제인IL-6이 FGF19 처리된 간에서는 상향조절되지만 M70 처리된 간에서는 그렇지 않은 것으로 나타났다(도 10b). pSTAT3의 유도가 단백질 주입 후 15분에 또는 원발성 마우스 간세포 배지에서 관찰되지 않기 때문에(데이터는 표시하지 않음), FGF19에 의한 pSTAT3 활성화가 간에서의 비세포 자율 메카니즘으로 인해 있을 것이다. STAT3 인산화 및 활성화의 제공으로 서비빈, bcl-XL 및 사이클린 D1을 포함한 STAT3 표적 유전자의 증가된 발현이 M70이 아닌 FGF19를 발현하는 rasH2 간에서 관찰되었다(도 10c). STAT3이 HCC에서 자주 활성화된 발암 유전자이기 때문에(He and Karin,2011, Cell Res. 21, 159-168), FGF19에 의한 그의 활성화는 FGF19 유도된 간암 발생에 대한 타당한 메카니즘을 취한다. STAT3 경로의 활성화에 대한 M70의 불능은 그의 생체내 종양생성의 결핍때문이다.
따라서, M70만이 선택적 조절자의 특징인 그의 수용체의 신호화 경로 다운스트림의 서브셋을 활성화한다(Kenakin and Christopoulos, 2013, Nat. Rev. Drug Discov. 12, 205-21). M70의 확인 및 특징화로 FGF19-FGF4 경로에 의해 조절되는 2가지의 뚜렷한 생물학적 과정인 담즙산 항상성 및 종양생성을 정의하는 게 가능하다.
실시예 11
M70은 FGF19 매개된 종양 생성을 억제한다
우리의 관찰은 M70이 대사 신호화를 활성화시키고 FGFR4로부터의 종양생성 신호는 활성화시키지 않기 위해 선택적 조절자 또는 "바이어스 리간드(biased ligand)"로서 행동하는 것을 시사한다. 이어서, M70의 바이어스 아고니즘(biased agonism)이 오르토스테릭(orthosteric) 또는 알로스테릭(allosteric) 메카니즘을 통해 FGF19 연관된 종양생성을 억제하는데에 사용될 수 있을지를 측정하였다.
db/db 마우스에 AAV-FGF19의 3×1010 유전체 복제물을 단독으로 또는 10배 과몰의 AAV-M70(3×1011 유전체 복제물)과 함께 주사하였다. 마우스를 전이유전자 발현 후 24주에 해부하고 분석을 위해 간을 사용하였다. db/db 마우스에서의 FGF19의 이소성 발현은 간 표면 상의 종양 결절의 생성을 촉진시켰고(7.8 + 2.3 종양 결절/간), FGF19 및 M70을 둘 다 발현하는 마우스로부터의 간은 종양 결절이 전혀 없었다(도 11a). M70 발현 마우스로부터의 간 중량은 FGF19 발현 마우스에 비해 현저히 작았다(각각 1.59g±0.14g 및 2.42g±0.20g, n= 5, p < 0.01; 도 11b). FGF19 및 M70으로 공동 처리된 마우스에서의 체중에 대한 간의 비율은 대조군 마우스와 크게 다르지 않았다(도 11c). FGF19의 혈청 수준은 단독 투여시 94±12ng/ml였고, FGF19와 M70의 합친 혈청 수준은 453±169ng/ml였다(도 11d). 간의 조직학적 분석으로, FGF19 발현 마우스와 달리, FGF19 및 M70을 공동 발현하는 마우스는 간 종양의 어떠한 조직학적 증거도 나타내지 않음을 확인하였다(도 11e). 이들 데이터는 M70이 FGF19와 효과적으로 경쟁하여 FGF19 발현 마우스에서의 종양생성을 방지하는 것을 입증한다.
FGF19는 HCC 및 결장암에서 증폭되고/되거나 과발현되는 것으로 보고되어 있다(Desnoyers et al., 2008; Sawey et al., 2011, Oncogene 27, 85-97). 간, 결장, 유방 및 기타 사람 암 세포주의 패널을 선별하였고, FGF19가 생성되고 무엇보다도 추가 연구를 위해 선택된 Huh-7(HCC) 및 HCT-116(결장암) 세포주(도 11f)에 의해 FGF19가 분비되는 것을 관찰하였다. 배지 내의 FGF19의 수준은 ELISA 측정 결과 1 내지 2ng/ml에 달했고, 이는 사람에서의 생리학적 FGF19 농도보다 10배 높다.
HCC 세포주 Huh-7은 11q13.3 암플리콘(amplicon)을 숨기고 FGF19 및 CCND1을 둘 다 과발현한다. Huh-7 세포의 종양생성 능력에 대한 M70의 효과를 시험하였다. 무흉선 누드 마우스에 Huh-7 세포를 피하 주사하고, 종양이 ~ 100㎣의 크기에 달하도록 하였다. 이 시점에서, 마우스를 2개의 처리 그룹으로 나누는데, 한 그룹에는 AAV-M70을, 다른 그룹에는 대조군 바이러스를 정맥내 주사하였다. M70으로 처리된 마우스는 28%의 지연된 성장 경향을 나타냈다(종결 단계 종양 크기: 1856±348㎣(대조군) 대 1340±406㎣(M70 처리 후); n= 10; 도 11g). 체중에 대한 어떠한 유의한 효과도 나타나지 않았다(데이터는 표시하지 않음).
HCT-116 결장암 이종이식편 성장에 대한 M70의 효과를 조사하였다. 확립된 HCT-116 결장암 종양을 갖는 마우스에 AAV-M70 또는 대조군 바이러스를 투여하였다. 처리 개시 후 8일만큼 빨리, M70은 성장 성장을 37% 억제하였다(종양 크기: 459±83㎣(대조군) 대 287±87㎣(M70 그룹); n= 5; 도 11h). 처리 후 15일에, M70 처리된 마우스는 통계적으로 유의한 71%의 종양 성장 억제율을 나타냈다(종결 단계 종양 크기: 1634±524㎣(대조군) 대 479±155㎣(M70 처리 후); n= 5, p < 0.001; 도 11h 및 11i). 체중에 대한 어떠한 유의한 효과도 관찰되지 않았다(도 11j).
이들 결과는 M70이 종양생성 신호화에서 야생형 FGF19를 길항할 수 있는 바이어스 리간드로서 작용하는 것을 시사하고, FGF19 의존적 종양 성장을 억제하는 데 M70과 같은 선택적 조절자로 사용될 가능성을 나타낸다.
실시예 12
M70은 CT26 결장 종양 성장을 억제한다
이 연구는 면역 감응 마우스의 동계 모델에서 종양 진행에 대한 M70의 효과를 추가로 평가하기 위해 수행하였다. CT26은 마우스 결장암 세포주로, 동계 balb/c 마우스에 이식되고 성장된다. CT26은 종양 성장에 대한 화합물/작용제를 특징화하는 데, 특히 암 면역요법을 평가하는 데 널리 사용되었다.
양성 대조군으로서, 예정된 사멸-1(Programmed Death-1: PD-1)에 대한 저지 항체를 사용하였다. PD-1 및 이의 리간드 PD-L1/PD-L2는 면역 체크포인트 축을 나타낸다. PD-1 경로는 주변부에서의 T 세포 반응을 손상시키고 Foxp3+ Treg의 유도를 촉진시켜 종양 특이적 면역을 하향조절한다. 다른 면역 요법과 함께 PD-1 경로를 차단하는 것은 동계 모델에서의 종양 진행을 억제한다. 다수의 사람 항-PD-L1 단클론 항체(mAb) 및 사람 항-PD-L1 mAb를 임상 시험에 참여시켰고, 첫 번째 항-PD-1 항체가 최근 FDA에 의해 항암 요법으로서 승인되었다.
balb/c 마우스는 잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory)에서 구입하였다. 동물들은 병원균 부재 시설에서 유지되었다. 모든 동물 프로토콜은 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC), NGM Biopharmaceuticals)에 의해 승인되었다.
CT26 마우스 결장암 세포주는 ATCC에서 구입하였다. 세포는 10% FBS 및 페니시린/스트렙토마이신 칵테일을 함유하는 DMEM에서 배양되었다. 기하급수적으로 성장된 세포를 마우스에 이식하기 위해 수확하였다. 세포를 주사용 염수에 재현탁시켰다.
balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 1×106개의 CT26 세포를 이식하였다. 3일 후, M70 단백질을 CT26 이식물을 갖는 balb/c 마우스에 15일 동안 매일 피하 주사하였다. CT26 종양의 성장을 칼리퍼로 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 다음 식을 사용하여 게산하였다: 종양 부피= 너비2 * 길이/2.
도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이, M70은 비히클 단독에 비해 10mg/kg 용량(도 13a) 또는 3mg/kg 용량(도 13b)의 투여 후 CT26 결장암 동계 마우스 모델에서의 종양 성장을 지연시킨다. M70은 또한 10mg/kg 용량(도 14a) 또는 3mg/kg 용량(도 14b)의 투여 후 체중을 감소시키는 것으로 나타났다.
따라서, 이러한 연구는 M70을 사용한 치료가 면역 감응 balb/c 동계 마우스에서 CT26 결장 종양 성장을 지연시키고, 항종양 효능이 M70의 두 용량(3mg/kg 및 10mg/kg)에 대해 관찰됨을 나타낸다.
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서열 목록
본 명세서는 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형태(CRF) 사본으로 출원되었다. 2014년 10월 27일 생성되고 50,105바이트 크기인 13370-020-228_SEQLIST.txt로 명명된 CRF는 서열 목록의 종이 사본과 동일하고 그 전문이 본원에 참조로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> NGM Biopharmaceuticals, Inc. LING, Lei <120> Cancer Models and Associated Methods <130> 13370-020-228 <140> <141> <150> 61/896,473 <151> 2013-10-28 <150> 61/922,586 <151> 2013-12-31 <150> 62/067,273 <151> 2014-10-22 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M70 sequence <400> 1 Met Arg Asp Ser Ser Pro Leu Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile 1 5 10 15 Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys 20 25 30 Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln 35 40 45 Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val 50 55 60 Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp 65 70 75 80 Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe 85 90 95 Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys 100 105 110 His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr 115 120 125 Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro 130 135 140 Met Val Pro Glu Glu 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Glu Lys 180 185 190 <210> 27 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M145 (M6-R) sequence <400> 27 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Leu Arg His 1 5 10 15 Leu Tyr Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile 20 25 30 Arg Ala Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser 35 40 45 Leu Leu Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly 50 55 60 Val His Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln 65 70 75 80 Gly Leu Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile 85 90 95 Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro 100 105 110 Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly 115 120 125 Phe Leu Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu 130 135 140 Glu Pro Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser 145 150 155 160 Pro Leu Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu 165 170 175 Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys 180 185 <210> 28 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M146 (M50-R) sequence <400> 28 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Asp Gln Val 1 5 10 15 Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys 20 25 30 Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln 35 40 45 Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val 50 55 60 Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp 65 70 75 80 Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe 85 90 95 Glu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys 100 105 110 His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr 115 120 125 Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro 130 135 140 Met Val Pro Glu Glu Pro Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp 145 150 155 160 Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu 165 170 175 Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys 180 185 190 <210> 29 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M160 sequence <400> 29 Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro His Val His Tyr Gly Trp 1 5 10 15 Gly Asp Pro Ile Arg Gln Arg His Leu Tyr Thr Ser Gly Pro His Gly 20 25 30 Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly Val Val Asp Cys 35 40 45 Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala Val Ala 50 55 60 Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val Arg Tyr Leu Cys 65 70 75 80 Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln Tyr Ser Glu Glu 85 90 95 Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr 100 105 110 Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln 115 120 125 Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His Phe Leu 130 135 140 Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro Glu Asp Leu Arg Gly His 145 150 155 160 Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu Thr Asp Ser Met Asp 165 170 175 Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Phe 180 185 190 Glu Lys <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> residues 47-57 of HIV-1 TAT <400> 30 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 31 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 32 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 33 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30 Ala <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 35 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 37 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 40 ccgactagtc accatgcgga gcgggtgtgt gg 32 <210> 41 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 41 ataagaatgc ggccgcttac ttctcaaagc tgggactcct c 41 <210> 42 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 42 Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro His Val His Tyr Gly Trp 1 5 10 15 Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser Gly Pro His Gly 20 25 30 Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly Val Val Asp Cys 35 40 45 Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala Val Ala 50 55 60 Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val Arg Tyr Leu Cys 65 70 75 80 Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln Tyr Ser Glu Glu 85 90 95 Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr 100 105 110 Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln 115 120 125 Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His Phe Leu 130 135 140 Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro Glu Asp Leu Arg Gly His 145 150 155 160 Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu Thr Asp Ser Met Asp 165 170 175 Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Phe 180 185 190 Glu Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 195 200

Claims (72)

  1. 대상체에서 FGF19의 발암활성(oncogenic activity)을 길항하기 위한 약제학적 조성물로서, 서열 번호 1 및 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 FGF19 변이체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, 약제학적 조성물.
  6. 대상체에서 FGF19 의존적 암 또는 종양, 또는 이의 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 서열 번호 1 및 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 FGF19 변이체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, 약제학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  10. 제6항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, 약제학적 조성물.
  11. 대상체에서 FGF19 의존적 암 또는 종양, 또는 이의 증상을 예방하기 위한 약제학적 조성물로서, 서열 번호 1 및 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 FGF19 변이체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, 약제학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    FGF19 변이체가 서열 번호 5-29 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는, 약제학적 조성물.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    FGF19 의존적 암 또는 종양이 간세포암종, 결장암 또는 결장 종양, 전립선암 또는 전립선 종양, 또는 폐암 또는 폐종양인, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    FGF19 의존적 암 또는 종양이 간세포암종인, 약제학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    FGF19 의존적 암 또는 종양이 결장암 또는 결장 종양인, 약제학적 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    FGF19 의존적 암 또는 종양이 전립선암 또는 전립선 종양인, 약제학적 조성물.
  20. 제16항에 있어서,
    FGF19 의존적 암 또는 종양이 폐암 또는 폐종양인, 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 이를 필요로 하는 대상체인, 약제학적 조성물.
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