JP2021008499A - 癌モデル及び関連方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】線維芽細胞増殖因子19（FGF19）依存性の疾患、障害、若しくは状態、又はこれらの症状などを予防又は治療するための医薬組成物の提供。【解決手段】FGFバリアントを含む医薬組成物。好ましくは、FGF19依存性の疾患が、肝細胞癌、結腸癌、結腸腫瘍、前立腺癌、前立腺腫瘍、肺癌又は肺腫瘍である、医薬組成物。【選択図】なし

Description

(関連出願の相互参照)
本願は、それぞれその内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2013年10月28
日に出願された米国特許仮出願第61/896,473号;2013年12月31日に出願された米国特許仮
出願第61/922,586号;及び2014年10月22日に出願された米国特許仮出願第62/067,273号の
利益を主張する。
(分野)
本発明は、特に、グルコース降下活性を有する線維芽細胞増殖因子のポリペプチドバリ
アントが、好都合な腫瘍学関連プロフィールも呈するかどうかを決定するのに有用なモデ
ル、及び、前述のものを含む方法及び使用に関する。提供されるのはまた、対象における
FGF19の発癌活性を弱める方法、及び、ある種の実施態様では、疾患、障害、又は状態、
例えば、FGF19依存性の疾患、障害、若しくは状態、又はこれらの症状などを予防又は治
療する方法である。
(背景)
糖尿病は、食後に放出するためのインスリンを製造及び貯蔵する膵β細胞、すなわち内
分泌細胞からの、インスリン産生の欠如(1型)、又はインスリン抵抗性若しくは不十分な
インスリン産生(2型)によって引き起こされる消耗性の代謝疾患である。高い血糖レベル
は、膵β細胞によるインスリンの分泌を刺激する。次に、インスリンは、グリコーゲン及
びトリグリセリドの貯蔵に、また、タンパク質の合成につながる、グルコースの筋肉及び
脂肪細胞への流入を刺激する。様々な細胞型上でのインスリン受容体の活性化は、グルコ
ース取り込み及び利用を増大させることによって、また、肝臓でのグルコース産生を低下
させることによって、循環グルコースレベルを低下させる。この調節ネットワーク内での
混乱は、糖尿病及び関連する病的状態をもたらす可能性がある。
グルコース代謝障害を患う個人は、多くの関連障害と共に、高血糖、高インスリン血症
、及び/又は耐糖能障害を患う可能性がある。例えば、インスリン抵抗性、すなわち、異
常なレベルのグルコース及び/又はインスリンをしばしば伴う障害は、正常な血中インス
リンレベルに応答する能力を喪失している肝臓、脂肪、及び筋肉細胞を特徴とする。こう
したグルコース代謝障害は、世界中の多くの、及びますます多くの人々に悪影響を与える
。
最も一般的には、限られたエネルギー消費及び/又は運動不足に伴う過剰な食物摂取に
よって引き起こされる肥満は、しばしば、様々なグルコース代謝障害を伴う。肥満は、個
人が、糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、痛風、リウマチ、及び関
節炎などの様々な疾患を発症する可能性を増大させる。さらに、死亡リスクは、肥満と直
接的に相関しており、例えば、40を超える肥満度指数は、平均余命の10年を超える低下を
もたらす。
ある種の薬理学的治療様式は、程度の差はあるが、グルコース恒常性活性と抗肥満活性
の両方を実証している。残念ながら、こうした様式は、頻繁に重大な、しばしば衰弱性の
有害作用を伴う。
糖尿病、肥満、及び関連する代謝性及び非代謝性障害の有病率及び重症度を考慮すると
、現在の治療選択肢の欠点と共に、代替の治療様式が必要とされる。
(概要)
糖尿病のための、非薬理学的な代替治療として、肥満外科手術が提案されている。手術
後の消化管ホルモン分泌の変化が、糖尿病状態の回復の原因であるであることが仮定され
ている。ヒトにおける線維芽細胞増殖因子19(FGF19)の血清レベルは、胃バイパス手術後
に上昇する。FGF19は、遠位小腸において、高度に発現され、FGF19のトランスジェニック
過剰発現は、グルコース恒常性を改善する(Tomlinson,E.の文献(2002年)Endocrinology 1
43(5):1741〜47)。FGF19の発現及び分泌の増強は、手術後に観察される糖尿病の寛解を、
少なくともある程度説明できるかもしれない。
FGF19に起因する望ましい代謝効果(例えば、血糖降下)にもかかわらず、(例えば、FGF1
9発現の増強又は外因性FGF19の投与を通じて)FGF19レベルを増大させる治療は、肝細胞癌
(HCC)の誘発を伴う。したがって、HCC様の癌性状態を誘発せずにFGF19の好都合な特性を
有する薬剤を特定するための、継続中の取り組みが存在する。本開示は、候補薬剤が、こ
うした特質を有するかどうか、また、対象が、こうした治療の実行可能な候補であるかど
うかの正確かつ効率的な決定を助けるための動物モデル及び関連方法に、ある程度基づい
ている。
さらなる実施態様では、対象の治療の使用又は方法は、グルコースレベルの低下、イン
スリン感受性の増大、インスリン抵抗性の低下、グルカゴンの減少、耐糖能又はグルコー
ス代謝若しくは恒常性の改善、膵臓機能の改善、又はトリグリセリド、コレステロール、
中間密度リポタンパク質(IDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、若しくは超低密度リポタン
パク質(VLDL)レベルの低下、又は血圧の低下、血管の内膜肥厚の低下、又は体重若しくは
体重増加の低下を目的とする又はもたらす。
一実施態様では、本開示は、代謝障害を患う試験対象が、FGF19バリアントでの治療の
候補であるかどうかを決定するための方法であって、a)FGF19又はFGF19代替物と、FGF19
バリアントとを、代謝障害を患う前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象に
投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を誘発するのに十分
である)ことと、b)前記試験対象において、癌性状態の徴候が観察されるかどうかを決定
する(ここでは、癌性状態の徴候の非存在が、前記試験対象が、FGF19バリアントでの治療
のための候補であることを示す)こととを含む前記方法を意図する。
本明細書で使用する場合、用語「FGF19代替物」には、FGF19と同じ又はそれに匹敵する
効果(ここでは、効果は一般に、癌関連(例えば、腫瘍形成又は癌性状態の他のいずれかの
徴候の誘発)である)を発揮する能力がある、あらゆる分子(例えばポリペプチド)が含まれ
るものとする。FGF19代替物は、しばしば、本明細書に記載したアミノ酸配列のうちの1つ
の、約150アミノ酸から約160アミノ酸、約160アミノ酸から約170アミノ酸、約170アミノ
酸から約180アミノ酸、約180アミノ酸から約190アミノ酸、又は約194アミノ酸又はそれ以
上のアミノ酸の連続的配列との、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%
、少なくとも約90%、少なくとも約93%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも
約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有する活性な断
片を含む、FGF19のバリアントである。
本開示では、語句「癌性状態の徴候」とは、概して、癌性の疾患、障害、又は状態が形
成されている、形成されつつある、又は形成される可能性があるあらゆる徴候をいう。大
抵の癌は、徴候又は症状の出現を理由に、又はスクリーニングを介して、初期に認識され
る。確定診断は、一般に、他の手段の中で、組織試料の病理検査、血液検査、X線、CTス
キャン、及び内視鏡検査の1以上を必要とする。癌性状態とは、癌腫、肉腫、リンパ腫及
び白血病、及び芽細胞腫を含めた、あらゆる型又は分類の癌をいう。
癌の症状は、通常、癌が形成されつつある体の部分に対する癌の影響(例えば、胸部の
異常なしこり、又は皮膚上のほくろの変化)によって引き起こされるが、癌性の疾患、障
害、及び/又は状態は、体重減少又は疲労などの、より全身的な症状を引き起こす可能性
がある。本明細書に記載する方法及びモデルでは、癌性の状態(又は障害又は疾患)の徴候
は、しばしば、腫瘍(例えば、結腸腫瘍又は肝腫瘍)である。腫瘍数、腫瘍サイズ、又は腫
瘍重量の低下の観察及び測定は、しばしば、治療様式が陽性の効果を有していることを示
す。
特定の実施態様では、癌性状態の徴候は、肝細胞癌(HCC、悪性肝細胞腫とも言われる)
、すなわち最も一般的なタイプの肝臓癌と関連している。HCCは、黄疸、腹水による腹部
膨満、血液凝固異常によるあざのできやすさ、食欲不振、体重減少、腹痛、悪心、嘔吐、
又は疲労を呈する可能性がある。HCCについては、この後、さらに論じる。
別の実施態様では、本開示は、代謝障害を患う試験対象が、FGF19バリアントでの治療
の候補であるかどうかを決定するための方法であって、(a)癌性状態の徴候を有する試験
対象であって、代謝障害を患う前記試験対象を提供することと、(b)FGF19又はFGF19代替
物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象に投与さ
れるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を誘発するのに十分である
)ことと、(c)前記試験対象において癌性状態の徴候が増強されるかどうかを決定する(こ
こでは、癌性状態の徴候の増強の非存在が、前記試験対象がFGF19バリアントでの治療の
候補であることを示す)こととを含む前記方法を意図する。
さらなる実施態様では、本開示は、代謝障害を患う試験対象が、FGF19バリアントでの
治療の候補であるかどうかを決定するための方法であって、a)癌性状態の徴候を有する試
験対象であって、代謝障害を患う前記試験対象を提供することと、b)FGF19又はFGF19代替
物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象に投与さ
れるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を誘発するのに十分である
)ことと、c)前記試験対象において癌性状態の徴候が低減されるかどうかを決定する(ここ
では、癌性状態の徴候の低減が、前記試験対象がFGF19バリアントでの治療の候補である
ことを示す)こととを含む前記方法を意図する。
本開示はまた、FGF19バリアントが、代謝障害を患う試験対象を治療するための候補で
あるかどうかを決定するための方法であって、FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアン
トとを、代謝障害を患う前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象に投与され
るFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を誘発するのに十分である)
ことと、前記試験対象において、癌性状態の徴候が観察されるかどうかを決定する(ここ
では、癌性状態の徴候の非存在が、FGF19バリアントが、前記試験対象の治療のための候
補であることを示す)こととを含む前記方法を意図する。
本明細書で意図される他の実施態様は、FGF19バリアントが、代謝障害を患う試験対象
を治療するための候補であるかどうかを決定するための方法であって、代謝障害を患う試
験対象であって、癌性状態の徴候を有する試験対象を提供することと、FGF19又はFGF19代
替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象に投与
されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を増悪させるのに十分で
ある)ことと、前記試験対象において、癌性状態の徴候が増強されるかどうかを決定する
こととを含む(ここでは、癌性状態の徴候の増悪の非存在が、FGF19バリアントが、前記試
験対象の治療のための候補であることを示す)前記方法に関心が持たれる。特定の実施態
様では、癌性状態の1以上の徴候は、試験対象において低減される。
一層さらなる実施態様では、本開示は、代謝障害を患う対象を治療する(又は、ある種
の状況では予防する)方法であって、代謝障害を患う対象を提供する(ここでは、該対象は
、FGF19誘発性癌性状態の徴候を呈する)ことと、候補FGF19バリアントポリペプチドのプ
ールから本明細書に記載した通りに特定された治療有効量のFGF19バリアントを、該対象
に投与することとを含む(ここでは、該対象における代謝障害の改善が存在する)前記方法
を意図する。
先に言及した通り、本開示はまた、種々のモデルを意図する。一実施態様は、FGF19バ
リアントが、代謝障害を患う対象における癌性の疾患、障害、又は状態を予防するための
候補であるかどうかを決定するためのモデルであって、(i)有効量のFGF19又はFGF19代替
物の投与の前に癌性状態の徴候を呈しない、かつ(ii)FGF19又はFGF19代替物の投与の後に
癌性状態の徴候を呈する対象を含み、ここでは、癌性状態の徴候は、配列番号:1に示した
アミノ酸配列を含む有効量のポリペプチドの投与時に改善する、前記モデルを対象とする
。ある種の実施態様では、該ポリペプチドは、配列番号:1に示したアミノ酸配列からなる
。
本開示はまた、FGF19バリアントが、代謝障害を患う対象における癌性の疾患、障害、
又は状態を治療するための候補であるかどうかを決定するためのモデルであって、FGF19
又はFGF19代替物の投与に由来する癌の少なくとも1つの徴候を有する対象を含み、ここで
は、癌の徴候は、配列番号:1に示したアミノ酸配列を含む有効量のポリペプチドの投与時
に改善する、前記モデルを意図する。ある種の実施態様では、該ポリペプチドは、配列番
号:1に示したアミノ酸配列からなる。
限定はされないが、ある種の実施態様では、FGF19バリアントは、本開示の方法及びモ
デルにおけるM70(配列番号:1)である。FGF19バリアントは、候補FGF19バリアントポリペ
プチドのプールから特定することができる。ここでは、特定されるFGF19バリアントは、
少なくとも1つの状態、例えば、高血糖状態(例えば糖尿病)、インスリン抵抗性、高イン
スリン血症、耐糖能障害、メタボリックシンドローム、肥満、又は望ましくない体重を改
善する。代謝性の障害、疾患、状態の追加の例は、以下に記載する。
本明細書に記載する方法及びモデルのある種の実施態様では、対象(例えば試験対象)は
、動物(例えば、げっ歯類又はサル)、例えばマウス(例えば、db/dbマウス)である。用語
が使用される文脈に応じて、対象は、ヒトでもあり得る。いくつかの実施態様では、対象
は、試料集団(ここでは、試料集団は、基準、参照などとして有用な、任意のグループの
メンバーであり得る)における成熟FGF19のレベルと比較して、成熟FGF19のレベルが増大
されている。いくつかの実施態様では、成熟FGF19のレベルの増大は、過剰発現が原因で
ある。
いくつかの実施態様では、FGF19、FGF19代替物、及び/又はFGF19バリアントは、例えば
検出、精製などを容易にするために、標識される。ある種の実施態様では、FGF19、FGF19
代替物、及び/又はFGF19バリアントは、共有結合を通して標識される。当業者は、様々な
種類の標識及びその使用について熟知している。標識は、ポリペプチドのN-終端及び/又
はC-終端で最も頻繁に行われるが、ポリペプチド内に存在することも可能である。本開示
は、インビボ、インビトロなどで実施することができる、任意の直接的及び間接的標識技
術の使用を意図する。
本開示の方法及びモデルでは、癌性の状態、障害、又は疾患の徴候を決定することと関
連するステップを、その癌性の状態、障害、又は疾患、それ自体の顕在化を可能にし、し
たがって検出できる、どの時点でも実施することができる。例として、前述の共投与ステ
ップの、3か月よりも後、20週よりも後、6か月よりも後、9か月よりも後、又は12か月よ
りも後に、決定を行うことができる。特定の実施態様では、FGF19は、FGF19バリアントと
共投与される。
本開示はまた、FGF19の発癌活性を弱める方法を意図する。ある種の実施態様では、本
明細書で提供されるのは、対象におけるFGF19の発癌活性を弱める方法であって、該対象
に治療有効量のFGF19バリアントを投与し、それによって、該対象におけるFGF19の発癌活
性を弱めることを含む前記方法である。ある種の実施態様では、対象は、代謝障害及び/
又は癌性状態の徴候を有する。
本開示は、対象におけるFGF19依存性の疾患、障害、若しくは状態、又はこれらの症状
を予防又は治療する方法であって、治療有効量のFGF19バリアントを該対象に投与するこ
とを含み、ここでは、該対象における該疾患、障害、又はその状態が、予防又は治療され
る、前記方法をさらに意図する。ある種の実施態様では、対象における疾患、障害、若し
くは状態、又はこれらの症状の改善が存在する。ある種の実施態様では、対象は、代謝障
害、及び/又は癌性状態の徴候を有する。具体的実施態様では、FGF19依存性の疾患、障害
、又は状態は、癌又は腫瘍である。いくつかの実施態様では、癌又は腫瘍は、肝臓癌又は
腫瘍である。ある種の実施態様では、癌又は腫瘍は、結腸癌又は腫瘍である。他の実施態
様では、癌又は腫瘍は、前立腺癌又は腫瘍である。さらに他の実施態様では、癌又は腫瘍
は、肺癌又は腫瘍である。ある種の実施態様では、対象は、その予防又は治療の必要があ
る対象である。具体的実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:1(M70)に示したアミ
ノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなるポリペプチドである。
(図面の簡単な説明)
図1は、成熟ヒトFGF19のアミノ酸配列を示す。flagエピトープに相当するアミノ酸残基には、下線を引いてある。
図2は、AAV介在性の遺伝子送達の5週後にdb/dbマウスにおいてELISAによって決定される血漿FGF19濃度を示す(対照としてのGFP;FGF19;及び/又はM70)。
図3は、AAV介在性の遺伝子送達の24週後のGFP;FGF19-flag;及び/又はM70への連続的曝露後の、db/dbマウスにおける肉眼での肝腫瘍結節形成を示す。
図4は、AAV介在性の遺伝子送達後のGFP;FGF19-flag;及び/又はM70への連続的曝露後のdb/dbマウスにおける、注射前と注射の3、5、及び23週後に測定される体重に対する効果を示す。
図5は、AAV介在性の遺伝子送達後のGFP;FGF19-flag;及び/又はM70への連続的曝露後のdb/dbマウスにおける、注射前と注射の3、5、及び23週後に測定されるグルコース濃度に対する効果を示す。
図6A〜6Eは、肝細胞腫瘍形成を研究するためのAAV介在性の導入遺伝子システムを示す。(A)実験プロトコルの図。マウスは、6〜12週齢の時に、尾静脈を介して、3×1011ゲノムコピーのAAV-FGF19の単回注射を受けた。24又は52週後、肝腫瘍分析のために、マウスを屠殺した。ITR、逆位末端配列;EF1a、伸長因子1αプロモーター。(B)AAV-FGF19の投与の24週後のdb/dbマウスの代表的な肝臓。FGF19を発現しているdb/dbマウスでは、肝臓表面から膨隆している複数の大きな盛り上がった腫瘍が観察された。この実験において対照ウイルス(AAV-GFP)を注射した動物では、肝腫瘍は観察されなかった。スケールバー、10mm。(C)db/dbマウス(n=5)において、AAV投与の1、4、12、及び24週後に、FGF19血清レベルをELISAによって測定した。すべての値は、平均±SEMを表す。(D)FGF19導入遺伝子を発現しているdb/dbマウスにおける、肝腫瘍の多重度、サイズ、及びスコアリング。肝臓ごとの腫瘍を数え、最大腫瘍サイズを測定した。各群における平均を、水平線によって示す(n=15/群、各点が個々の動物を表す)。すべての値は、平均±SEMを表す。***p＜0.001、*p＜0.05は、両側t検定による、対照群に対する有意差を表示する。(E)db/dbマウスにおけるFGF19誘発性肝腫瘍の組織学的及び免疫組織化学的特徴付け。各列は、上から下へ:肝臓切片のヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色;Ki-67、PCNA、グルタミン合成酵素、及びβ-カテニンの免疫組織化学的検出である。FGF19誘発性新生細胞は、強くグルタミン合成酵素陽性である。腫瘍(T)の輪郭を点線によって示す。スケールバー、100μm。
図7A〜7Hは、M70が、db/dbマウスにおける24週間の連続的曝露後に、腫瘍非存在FGF19バリアントであることを示す。(A)N-末端領域におけるM70及びFGF19のタンパク質配列のアラインメント。M70に導入された変異には下線を引いてある。(B)〜(F)24週間の、FGF19又はM70を発現しているdb/dbマウス(n=5/群)の、肝臓あたりの腫瘍の数(B)、肝臓重量(C)、肝臓の体重に対する比(D)。成長曲線(E)及び導入遺伝子発現の血清レベル(F)も決定した。(G)導入遺伝子発現の24週後のdb/dbマウスからの代表的な肝臓切片。肝臓パネルの列は、上から下へ:肝臓組織切片のヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色;Ki-67、及びグルタミン合成酵素の免疫組織化学的検出である。腫瘍(T)の輪郭を点線によって示す。スケールバー、100μm。(H)肝臓酵素の血清レベル(ALKP:アルカリホスファターゼ;ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ;AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ;n=5/群)を、研究の終了前に測定した。すべての値は、平均±SEMを表す。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、一元配置ANOVA、それに続くダネットの事後検定による、対照群に対する有意差を表示する。表3及び4も参照のこと。
図8A〜8Gは、M70で52週間処置されたrasH2マウスにおいて、肝腫瘍形成が無いことを示す。(A)〜(E)52週間の、FGF19又はM70導入遺伝子を発現しているrasH2マウス(n=9/群)の、成長曲線(A)、肝臓あたりの腫瘍の数(B)、肝臓重量(C)、肝臓-対-体重比(D)、及びM70又はFGF19の血清レベル(E)。(F)肝臓を、AAV投与の52週後に収集し、H&E又は抗グルタミン合成酵素、すなわちFGF19誘発性肝腫瘍のマーカーで染色した。グルタミン合成酵素で染色した切片は、H&Eで染色した対となる切片の近くの領域から採取し、同じ門脈(p)及び中心静脈(c)を示した。腫瘍(T)の輪郭を点線によって示す。スケールバー、100μm。(G)肝臓におけるKi-67及びAFP発現のqRT-PCR分析。mRNA存在量を、GAPDH発現に対して基準化する。すべての値は、平均±SEMを表す。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001は、一元配置ANOVA、それに続くダネットの事後検定による、対照群に対する有意差を表示する。
図9A〜9Gは、インビトロでのFGFR4の、M70結合及び活性化を示す。(A)フローセル上に固定されたFGF19とFGFR4-Fcキメラタンパク質の間の相互作用のBiacore SPR分析。左の列は、様々なFGF19濃度(2倍希釈で、15.62〜2000nM)に対して得られた結合曲線を示すのに対し、右の列は、KD値を得るための、データの定常状態適合を示す。(B)Biacoreによる、M70のFGFR4に対する結合。(A)と類似の手順が使用される。(C)FGFR4-KLB受容体複合体への、M70又はFGF19の固相結合。結合したリガンドは、ビオチン化FGF19特異的ポリクローナル抗体を使用して検出した。(D)KLBの存在下又は非存在下での、FGFR4を一過性形質移入させたL6細胞における、M70又はFGF19での刺激後の相対的ルシフェラーゼ活性。(E)M70は、Hep3B細胞におけるERKリン酸化を誘発する。(F)M70は、マウス、ラット、及びヒト由来の初代肝細胞において、Cyp7a1発現を抑制した。肝細胞におけるCyp7a1 mRNAの相対的発現を、qRT-PCRによって決定し、18S RNA(マウス及びラット)又はアクチン(ヒト)mRNAレベルに対して基準化した。(G)マウスにおける、M70による肝臓のCyp7a1発現の抑制。12週齢のdb/dbマウスに、組み換えM70又はFGF19タンパク質を腹腔内注射した。投与の4時間後、マウスを安楽死させ、qRT-PCRによって肝臓のCyp7a1発現を評価し、18S RNA発現に対して基準化した。マウスにおけるCyp7a1抑制の用量反応曲線を示した。すべての値は、平均±SEMを表す。
図10A〜10Cは、インビボでのM70及びFGF19による細胞シグナル伝達経路の活性化の差異を示す。(A)腹腔内に、生理食塩水、1mg/kg FGF19又は1mg/kg M70タンパク質を注射したdb/dbマウス(n=6/群)から、注射の2時間後に、肝臓を採取した。肝臓ライセートを、示されたタンパク質の発現及びリン酸化のために、ウエスタンブロットによって調べた。各レーンは、個々のマウスに対応する。Rab11は、ローディング対照として役立つ。肝臓のSTAT3は、FGF19によって活性化されるが、M70によって活性化されないことに留意されたい。(B)FGF19で処置されたマウスは、IL-6(STAT3誘導因子)の発現の上昇を呈した。肝臓を、db/dbマウスから、(A)と同様に採取した。肝臓におけるIL-6 mRNA量を、qRT-PCRによって測定し、GAPDH 発現に対して基準化した。結果を、生理食塩水処置された動物に対する発現(倍数)として表す。示したのは、1条件あたり5匹の別のマウスの結果である。同じ動物からの肝臓ライセートを免疫ブロットすることによって、STAT3リン酸化状態を、下のパネルに示す。(C)FGF19又はM70導入遺伝子を発現しているAAVベクターの投与の52週後のrasH2マウスにおける、STAT3標的遺伝子(サバイビン、Bcl-XL、及びサイクリンD1)に対するmRNAの発現を示すqPCR。すべての値は、平均±SEMを表す。**p＜0.01、***p＜0.001は、一元配置ANOVA、それに続くダネットの事後検定による、対照群に対する有意差を表示する。
図11A〜11Jは、M70が、db/dbマウスにおける、また、異種移植モデルにおけるFGF19誘発性腫瘍増殖を阻害することを示す。(A)〜(D)11週齢のdb/dbマウスに、M70(3×1011ゲノムコピー)の非存在又は存在下で、AAV-FGF19(3×1010ゲノムコピー)を注射した。24週後に、肝腫瘍スコア(A)、肝臓重量(B)、体重に対する肝臓の比(C)、及び導入遺伝子発現の血清レベル(D)を決定した。*p＜0.05は、一元配置ANOVA、それに続くダネットの事後検定による、対照群に対する有意差を表示する;＃＃p＜0.01は、両側t検定による有意差を表示する。(E)FGF19を発現している、又はM70で共処置された、マウスの肝臓の組織像。肝臓切片を、H&E又は抗グルタミン合成酵素、すなわちFGF19誘発性肝腫瘍のマーカーで染色した。腫瘍(T)の輪郭を点線によって示す。スケールバー、100μm。(F)FGF19を、ヒト癌細胞株によって産生及び分泌させる。培養上清中のFGF19レベルを、ELISAによって決定する。(G〜J)M70は、ヒト癌異種移植腫瘍増殖をインビボで阻害する。8週齢の無胸腺nu/nuマウスの皮下に、5×106 Huh-7(n=10)(G)又はHCT-116(n=5)(H〜J) 細胞を埋め込んだ。同等体積(〜100mm3)の確立された腫瘍を有するマウスを、無作為にグループ分けし、AAV介在性の遺伝子送達を介して、M70で処置した。この研究には、対照ウイルス(GFP)も含まれた。腫瘍増殖は、15日の処置期間にわたって測定する。画像は、15日の処置期間の終わりに切開されたHCT-116固形腫瘍を示す(I)。HCT-116腫瘍異種移植片を有するマウスの体重増加(J)も決定した。***p＜0.001は、二元配置ANOVA、それに続くボンフェローニの事後検定による、対照群に対する有意差を表示する。すべての値は、平均±SEMを表す。
図12A〜12Bは、FGF19依存性の腫瘍を治療するためのFGF19バリアントを開発するモデルを示す。(A)慢性の肝損傷(胆汁うっ滞、肝硬変など)は、肝臓におけるFGF19蓄積をもたらす。胆汁酸合成を調節するために重要であるが、FGF19は、STAT3、すなわち肝臓癌形成の促進において重要な転写因子を活性化することもできる。これは、腫瘍イニシエーション、プロモーション、及びHCCへの進行の一因となる。(B)M70は、FGF19の操作されたバリアントである。M70は、選択的モジュレーターとして、他のもの(すなわち腫瘍)を相対的に除外するほどに、ある種のFGFR4シグナル伝達経路(すなわちpERK及びCyp7a1)への偏りを呈する。さらに、M70は、FGF19に依存する腫瘍の増殖を阻害することができる。
図13A〜13Bは、M70が、CT26結腸癌同系(syngenic)マウスモデルにおける腫瘍増殖を遅延させることを示す。(A)M70は、10mg/kg用量の投与後にCT26腫瘍増殖を遅延させる。(B)M70は、3mg/kg用量の投与後にCT26腫瘍増殖を遅延させる。p値は、ビヒクル処置されたマウスに対して二元配置ANOVAによって決定した。***p＜0.001;**p＜0.01。
図14A〜14Bは、M70が、CT26結腸癌同系マウスモデルにおける体重を減少させることを示す。(A)M70は、10mg/kg用量の投与後に体重を減少させる。(B)M70は、3mg/kg用量の投与後に体重を減少させる。p値は、ビヒクル処置されたマウスに対して二元配置ANOVAによって決定した。***p＜0.001;**p＜0.01。
(詳細な説明)
本開示をさらに記載する前に、本開示が、本明細書に説明する特定の実施態様に限定さ
れないことを理解するべきであり、また、本明細書に使用される専門用語が、単に特定の
実施態様を説明する目的であるに過ぎず、限定の意図はないことも理解するべきである。
(概要)
本開示は、本明細書に記載するモデル及び方法を使用する、薬剤及びその組成物の特定
を意図する。これらのモデル及び関連方法は、癌性状態(例えば、肝細胞癌)を誘発しない
薬剤の特定のための、正確で効率的な方法論を提供する。ある種の実施態様では、本明細
書で提供されるモデル及び方法は、FGF19の発癌活性を弱める薬剤を特定するのに有用で
ある。ある種の実施態様では、こうした薬剤は、例えばグルコース代謝障害及び/又は体
重異常に関する、様々な疾患、障害、及び状態、及び/又はこれらの症状の治療及び/又は
予防における治療的有用性を有する。例として、限定はされないが、薬剤及びその組成物
は、2型糖尿病、インスリン抵抗性、並びに、インスリン抵抗性、インスリン産生の低下
、高血糖、メタボリックシンドローム、又は肥満を特徴とする疾患、障害、及び状態の治
療及び/又は予防のために使用することができる。こうした薬剤はまた、FGF19依存性の疾
患、障害、若しくは状態、又はこれらの症状の予防又は治療において有用である。
本明細書に記載するモデル及び関連方法は、FGF19(例えば、HCC)の癌関連の影響を誘発
せず悪化もさせない薬剤(例えば、ポリペプチド及び抗体)を特定するのに有用である。こ
の後詳細に記載する通り、特定の実施態様は、好都合な代謝特性を有するFGF19バリアン
トポリペプチドが、望ましい「癌関連の」プロフィールも有することとなるかどうかを決
定するためのモデル及び方法の使用を意図する。提供されるのはまた、対象におけるFGF1
9の発癌活性を弱める方法、及び、ある種の実施態様では、FGF19依存性の疾患、障害、若
しくは状態、又はこれらの症状を予防又は治療する方法である。ある種の実施態様では、
FGF19依存性の疾患、障害、又は状態は、肝臓、結腸、前立腺、又は肺の癌又は腫瘍など
の、癌又は腫瘍である。
(定義)
用語「患者」又は「対象」は、ヒト又は非ヒト動物(例えば、哺乳類)をいうために互換
的に使用される。
用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、対象を悩ませている疾患、障
害、又は状態の根本的原因の少なくとも1つ、又は対象を悩ませている疾患、障害、状態
に伴う症状の少なくとも1つを、一時的に又は永久的に消失、軽減、抑制、緩和、又は改
善するように、疾患、障害、若しくは状態、又はこれらの症状が診断された、観察された
、などの後に開始される、一連の行為(ポリペプチド又はポリペプチドを含む医薬組成物
を投与することなど)をいう。したがって、治療には、(例えば、血流内のインスリン及び
/又はグルコースのレベルを低下させて耐糖能を増大させるように、グルコースレベルの
変動を最小限にするように、及び/又はグルコース恒常性の混乱によって引き起こされる
疾患を防ぐように)、活動性疾患を阻害する(すなわち、疾患、障害、若しくは状態、又は
これらと関連する臨床症状の発生又はさらなる発生を抑える)ことが含まれる。
本明細書で使用される用語 「治療の必要がある」とは、医師又は他の医療専門家によ
ってなされる、対象が、治療を必要とする、又は治療から恩恵を受けるであろうという判
断をいう。
用語「予防する」、「予防すること」、「予防」などは、一般に、ある特定の疾患、障
害、又は状態にかかりやすい対象という状況において、対象が疾患、障害、状態などを発
症するリスクを、(例えば臨床症状の非存在によって決定される通りに)一時的に又は永久
的に予防、抑制、阻害、若しくは軽減する、又は、その発生を遅延させるように、ある方
式で(例えば、疾患、障害、状態、又はこれらの症状の発生の前に)開始される、一連の行
為(ポリペプチド又はポリペプチドを含む医薬組成物を投与することなど)をいう。ある種
の場合には、この用語はまた、疾患、障害、又は状態の進行を遅らせること、又は、有害
な又は他の望ましくない状態へのこれらの進行を阻害することをいう。
本明細書で使用される用語 「予防の必要がある」とは、医師又は他の医療専門家によ
ってなされる、対象が、予防的ケアを必要とする、又は予防的ケアから恩恵を受けるであ
ろうという判断をいう。
語句「治療有効量」とは、患者に投与された場合に疾患、障害、又は状態のあらゆる症
状、様相、又は特性に対するあらゆる検出可能な陽性の効果を有することが可能な量での
、単独での又は医薬組成物の一部としての、また、単一用量での若しくは一連の用量の一
部としての、対象への薬剤の投与をいう。治療有効量は、妥当な生理学的効果を測定する
ことによって確定することができる。高血糖状態の場合には、血糖の降下又は低下又は糖
負荷試験の改善を使用して、薬剤の量が、高血糖状態を治療するのに有効であるかどうか
を決定することができる。例えば、治療有効量は、あらゆるレベル(例えば、基準レベル)
の空腹時血漿グルコース(FPG)を低下又は減少させるのに十分な量である。ここでは、例
えば、治療有効量は、200mg/dlを超えるFPGレベルを200mg/dl未満に低下させるのに十分
である、治療有効量は、175 mg/dlから200mg/dlのFPGレベルを開始レベル未満に低下させ
るのに十分である、治療有効量は、150mg/dlから175mg/dlのFPGレベルを開始レベル未満
に低下させるのに十分である、治療有効量は、125mg/dlから150mg/dlのFPG レベルを開始
レベル未満に低下させるのに十分である、など(例えば、FPGレベルを、125mg/dl未満に、
120mg/dl未満に、115mg/dl未満に、110mg/dl未満に低下させる、など)である。さらに、H
bAIcレベルの場合には、該有効量は、レベルを、約10%から9%超、約9%から8%超、約8%か
ら7%超、約7%から6%超、約6%から5%超などだけ低下又は減少させるのに十分な量である。
より具体的には、HbAIcレベルの、約0.1%、0.25%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%
、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、33%、35%、40%、45%、50%、又はそれ以上
の低下又は減少が、本開示によって意図される。治療有効量は、投与レジメン及び対象の
状態の診断分析などと関連付けて調節することができる。
語句「変化をもたらすのに十分な量で」は、ある特定の治療法の施与の前(例えば、基
準レベル)と後とに測定される指標のレベルに、検出可能な差が存在することを意味する
。指標としては、あらゆる客観的パラメータ(例えば、グルコース若しくはインスリンの
レベル)、又は主観的パラメータ(例えば、対象の幸福の感情)が挙げられる。
語句「耐糖能」とは、本明細書で使用する場合、グルコース摂取量が変動した場合に血
漿グルコース及び/又は血漿インスリンのレベルを制御する、対象の能力をいう。例えば
、耐糖能は、約120分以内に、血漿グルコースのレベルを、グルコースの摂取の前に決定
されたレベルまで戻すように低下させる、対象の能力を包含する。
一般的に言えば、用語「糖尿病」及び「糖尿病の」とは、しばしば高血糖及び糖尿を特
徴とする、インスリンの不十分な産生又は利用を伴う炭水化物代謝の進行性の疾患をいう
。用語「糖尿病予備軍」及び「糖尿病予備軍の」とは、対象が、糖尿病において一般的に
観察される特性、症状などを有しないが、治療しないままであるならば糖尿病へと進行す
る可能性がある特性、症状などを有する状態をいう。これらの状態の存在は、例えば、空
腹時血漿グルコース(FPG)試験又は経口糖負荷試験(OGTT)のいずれかを使用して決定する
ことができる。どちらも、通常、試験を開始する前に少なくとも8時間、対象を絶食させ
る必要がある。FPG試験では、対象の血糖は、絶食の終了後に測定され;一般に、対象は一
晩絶食し、血糖は、朝、対象が食事をする前に測定される。健康な対象は一般に、約90か
ら約100mg/dlのFPG濃度を有するであろう。「糖尿病予備軍」の対象は一般に、約100から
125mg/dlのFPG濃度を有するであろう。「糖尿病」を患う対象は一般に、約126mg/dlを超
えるFPGレベルを有するであろう。OGTTでは、対象の血糖は、絶食後に、また、グルコー
ス豊富な飲料を飲んだ2時間後に再び測定される。グルコース豊富な飲料の摂取の2時間後
、健康な対象は一般に、約140mg/dl未満の血糖濃度を有し、糖尿病予備軍の対象は一般に
、約140から約199mg/dlの血糖濃度を有し、糖尿病の対象は一般に、約200mg/dl又はそれ
を超える血糖濃度を有する。前述の血糖値は、ヒト対象に関するので、正常血糖、中等度
の高血糖、及び明らかな高血糖を、マウス対象において別に見積もる。4時間の絶食後の
健康なマウス対象は一般に、約100から約150mg/dlのFPG濃度を有するであろう。「糖尿病
予備軍」のマウス対象は一般に、約175から約250mg/dlのFPG濃度を有するであろう。「糖
尿病」を患うマウス対象は一般に、約250 mg/dlを超えるFPG濃度を有するであろう。
本明細書で使用される用語「インスリン抵抗性」とは、正常な量のインスリンが、正常
な生理応答又は分子応答をもたらすことができない状態をいう。ある場合では、内因的に
産生される又は外因的に投与される生理学的量を超えるインスリンは、完全に又はある程
度、インスリン抵抗性に打ち勝ち、生物学的応答をもたらすことが可能である。
用語「メタボリックシンドローム」とは、限定はされないが、高インスリン血症、耐糖
能異常、肥満、脂肪の腹部又は上半身への再分布、高血圧、線維素溶解不全(dysfibrinol
ysis)、及び脂質異常症(高いトリグリセリド、低い高密度リポタンパク質(HDL)-コレステ
ロール、及び高い低比重低密度リポタンパク質(LDL)粒子を特徴とする)を含めた、形質の
関連するクラスターをいう。メタボリックシンドロームを患う対象は、2型糖尿病及び/又
は他の障害(例えば、アテローム性動脈硬化症)の発生のリスクがある。
語句「グルコース代謝障害」は、対象における、健康な個人に対するグルコースレベル
の上昇及び/又はインスリンレベルの上昇を伴う臨床症状又は臨床症状の組み合わせを特
徴とするあらゆる障害を包含する。グルコース及び/又はインスリンレベルの上昇は、次
の疾患、障害、及び状態において顕在化する可能性がある:高血糖、II型糖尿病、妊娠糖
尿病、I型糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高インスリン血症、グルコース代謝
異常、糖尿病予備軍、他の代謝障害(シンドロームXとも呼ばれているメタボリックシンド
ロームなど)、及び、特に肥満。本開示のポリペプチド及びその組成物を使用して、例え
ば、グルコース恒常性実現及び/又は維持する、例えば、血流内のグルコースレベルを低
下させる及び/又はインスリンレベルを健康な対象に見られる範囲まで低下させることが
できる。
本明細書で使用される用語「高血糖」とは、健康な個人と比べて高い量のグルコースが
、対象の血漿内を循環する状態をいう。高血糖は、本明細書に記載した通りの空腹時血糖
レベルの測定を含めた、当技術分野で公知の方法を使用して診断することができる。
本明細書で使用される用語 「高インスリン血症」とは、血糖レベルが高い又は正常で
ある時に、同時に、高いレベルの循環インスリンが存在する状態をいう。高インスリン血
症は、脂質異常症(高いトリグリセリド、高いコレステロール、高い低密度リポタンパク
質(LDL)、及び低い高密度リポタンパク質(HDL)など);高い尿酸レベル;多嚢胞性卵巣症候
群;II型糖尿病、及び肥満を伴うインスリン抵抗性によって引き起こされ得る。高インス
リン血症は、約2μU/mLよりも高い血漿インスリンレベルを有するものと診断することが
できる。
本明細書で使用する場合、語句「体重異常」とは、過剰な体重及び/又は食欲増進を伴
う状態をいう。対象が、基準の健康な個人と比較して過体重であるかどうかを決定するた
めに、対象の年齢、身長、性別、及び健康状態を含めた様々なパラメータが使用される。
例えば、対象は、対象の体重(キログラム)を対象の身長(メートルの2乗)で割ることによ
って算出された対象の肥満度指数(BMI)の評価によって、過体重又は肥満であるとみなす
ことができる。〜18.5から〜24.9kg/m2の範囲内のBMIを有する成人は、正常な体重を有す
るとみなされ;〜25から〜29.9 kg/m2のBMIを有する成人は、過体重(肥満予備軍(pre-obes
e))であるとみなすことができ;〜30kg/m2又はそれよりも高いBMIを有する成人は、肥満で
あるとみなすことができる。食欲増進は、しばしば、過剰な体重に寄与する。例えば、多
くの場合不眠症と関連する朝の食欲不振及び晩の過食を特徴とする夜食症候群を含めて、
食欲増進に関連する、いくつかの状態が存在するが、これらは、視床下部の損傷に関連し
ている可能性がある。
本明細書で互換的に使用される、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパ
ク質」とは、任意の長さの重合形状のアミノ酸をいい、これは、遺伝子によってコードさ
れた、及び遺伝子によってコードされていないアミノ酸、化学的に又は生化学的に改変又
は誘導体化されたアミノ酸、及び、改変されたポリペプチド骨格を有するポリペプチドを
含むことができる。この用語には、限定はされないが、N-終端メチオニン残基を伴う又は
伴わない、異種アミノ酸配列をもつ融合タンパク質、異種及び相同リーダー配列をもつ融
合タンパク質；免疫学的にタグ付けされたタンパク質;などを含めた、融合タンパク質が
含まれる。本開示全体を通して、1文字又は3文字コードによって、アミノ酸について言及
するということを理解されたい。
本明細書で使用する場合、用語「バリアント」は、天然に存在するバリアント(例えば
、相同体及び対立遺伝子バリアント)及び天然に存在しないバリアント(例えば、変異タン
パク質)を包含する。天然に存在するバリアントとしては、相同体、すなわち、それぞれ
ヌクレオチド又はアミノ酸配列が種によって異なる核酸及びポリペプチドが挙げられる。
天然に存在するバリアントとしては、対立遺伝子バリアント、すなわち、それぞれヌクレ
オチド又はアミノ酸配列が種内で、個体によって異なる核酸及びポリペプチドが挙げられ
る。天然に存在しないバリアントとしては、それぞれヌクレオチド又はアミノ酸配列の変
化を含む、核酸及びポリペプチドが挙げられる。ここでは、配列の変化は、人工的に導入
される、例えば、変化は、実験室又は他の施設内で、人間の介入(「人の手」)によっても
たらされる。
FGF19に関する用語「天然の」とは、生物学的に活性な天然に存在するFGF19バリアント
を含めて、生物学的に活性な天然に存在するFGF19をいう。この用語には、194アミノ酸ヒ
トFGF19成熟配列が含まれる。
用語「標識」、「標識すること」などは、本開示のポリペプチド又は核酸(又は、適切
な場合には抗体)の文脈で使用する場合、概して、例えば、ポリペプチド精製、同定、単
離、及び合成において有用な、任意の手段をいうものとする。標識は、一般に、対象ポリ
ペプチドと共有結合的に結合し、また、成熟ポリペプチドへの(一般にN-又はC-終端での)
付着、固相ペプチド合成中の組み込みを含めた、当技術分野で公知の任意の方式で、又は
組み換え手段を通じて導入することができる。例としては、限定はされないが、蛍光、ビ
オチン化、及び放射性同位体が挙げられる。ポリペプチド及び核酸分子は、インビトロ方
法とインビボ方法のどちらによっても標識することができる。標識試薬及びキットは、い
くつかの商業的供給源(例えば、Thermo Fischer Scientific社、Rockford,IL;及びMolecu
lar Probes/Life Technologies社;Grand Island,NY)から入手することができる。
本明細書で使用する場合、用語「FLAG-タグ」、「FLAGオクタペプチド」などとは、組
み換えDNA技術を使用してポリペプチドに付加することができる、8個のアミノ酸
Figure 2021008499
 ペプチドタグ(標識)をいう。ポリペプチドのFLAG成分に対する抗体は、例えば、アフィニ
ティクロマトグラフィー及び免疫蛍光による細胞局在研究、又はSDS PAGEタンパク質電気
泳動による検出のために使用することができる。FLAG-タグは、他のアフィニティタグ(例
えば、ポリヒスチジンタグ(His-タグ)又はmyc-タグ)と共に使用することができ、また、
ポリペプチドのC-終端又はN-終端に融合させることができる。
本明細書で使用される用語「変異タンパク質」は、概して、変異した組み換えタンパク
質、すなわち、アミノ酸配列の人工的に導入された変化、例えば、実験室又は他の施設内
で、人間の介入(「人の手」)によってもたらされたアミノ酸配列の変化を含むポリペプチ
ドをいう。これらのタンパク質は通常、単一の又は複数のアミノ酸置換を有し、しばしば
、部位特異的な又はランダムな突然変異誘発にさらされているクローン化された遺伝子か
ら、又は完全に合成の遺伝子から得られる。
天然のヒトFGF19又はFGF19変異タンパク質に関して本明細書で使用する場合、用語「改
変された」、「改変」などは、ヒトFGF19、天然に存在するFGF19バリアント、又はFGF19
変異タンパク質の、所望される特性を増強する1以上の変化をいう。ここでは、これらの
変化(1又は複数)は、FGF19の一次アミノ酸配列を変えない。こうした所望される特性とし
ては、例えば、溶解度を高めること、循環半減期を延長させること、安定性を増大させる
こと、クリアランスを低下させること、免疫原性又はアレルゲン性を変えること、製造可
能性(例えば、費用及び効率)の側面を改良すること、及び、検出アッセイに使用するため
の(例えば、特有のエピトープの導入によって)特定の抗体の産生を可能にすることが挙げ
られる。ヒトFGF19、天然に存在するFGF19バリアント、又はFGF19変異タンパク質に対す
る、施すことができる変化としては、限定はされないが、ペグ化(ポリエチレングリコー
ル(PEG)又はその誘導体の1以上の分子の共有結合的付着);糖鎖付加(例えば、N-糖鎖付加)
、ポリシアル酸付加、及びヘシル化(hesylation);アルブミン融合;アルブミン結合(例え
ば、共役脂肪酸鎖(アシル化)を介する);Fc-融合;及びPEG模倣体との融合が挙げられる。
いくつかの特定の実施態様は、ポリエチレングリコールを伴う改変を伴い、他の特定の実
施態様は、アルブミンを伴う改変を伴い、さらに他の特定の改変は、糖鎖付加を伴う改変
を伴う。
用語「DNA」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などは、本明細書で互
換的に使用され、任意の長さの重合形状のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若し
くはリボヌクレオチドのいずれか、又はこれらの類似体をいう。ポリヌクレオチドの非限
定的な例としては、線状及び環状の核酸、メッセンジャーRNA(mRNA)、相補的DNA(cDNA)、
組み換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどが挙げられる。
用語「プローブ」とは、対象の遺伝子又は配列に対応するDNA又はRNAの断片をいう。こ
こでは、該断片は、放射性によって(例えば、32P又は35Sを組み込むことによって)、又は
、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はフルオレセインなど、何らかの他の検出可能な分子を
用いて標識されている。相補的な配列をもつDNA又はRNAの配列は、ハイブリッド形成する
こととなるので、プローブは、例えば、ウイルスプラーク、細菌コロニー、又は、対象遺
伝子を含有するゲル上のバンドを標識するために使用することができる。プローブは、ク
ローン化されたDNAであり得る、又は、合成のDNAストランドであり得る;後者は、例えば
、タンパク質の一部を微小配列決定(microsequence)し、該タンパク質をコードする核酸
配列を推定し、その配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、該配列を放射性標識し、
これをプローブとして使用して、cDNAライブラリ又はゲノムライブラリをスクリーニング
することによって、単離されたタンパク質からcDNA又はゲノムクローンを得るために使用
することができる。
用語「異種」とは、異なる供給源に由来する構造によって定義される2種の成分をいう
。例えば、ポリペプチドの文脈では、「異種」ポリペプチドは、異なるポリペプチドに由
来する作動可能に連結されたアミノ酸配列を含むことができる。同様に、キメラポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドの文脈では、「異種」ポリヌクレオチドは、異なる遺
伝子に由来し得る作動可能に連結された核酸配列を含むことができる。「異種」核酸の例
としては、コード配列を含む核酸が、コード配列の遺伝的起原とは異なる遺伝的起原由来
の調節エレメント(例えば、プロモーター)と作動可能に連結された、(例えば、プロモー
ター、コード配列、又はこれらの両方とは異なる遺伝的起原であり得る、対象宿主細胞に
おける発現を提供するための)発現構築物が挙げられる。組み換え細胞の文脈では、「異
種」とは、それが存在する宿主細胞とは異なる遺伝的起原のものである核酸(又は、ポリ
ペプチドなどの遺伝子産物の存在をいうことができる。
用語「作動可能に連結された」とは、所望の機能を提供する、分子間の結合をいう。例
えば、「作動可能に連結された」は、核酸の文脈では、核酸配列間の機能性の結合をいう
。例として、核酸発現制御配列(プロモーター、シグナル配列、又は一連の転写因子結合
部位など)は、第2のポリヌクレオチドと作動可能に連結することができる。ここでは、該
発現制御配列は、第2のポリヌクレオチドの転写及び/又は翻訳に影響を与える。ポリペプ
チドの文脈では、「作動可能に連結された」とは、ポリペプチドの記載された活性を提供
するための、アミノ酸配列(例えば、異なるドメイン)間の機能性の結合をいう。
本明細書で使用する場合、ポリペプチドの構造の文脈では、「N-終端」(又は「アミノ
終端」)及び「C-終端」(又は「カルボキシル終端」)とは、それぞれ、ポリペプチドの最
も遠いアミノ及びカルボキシル端をいい、一方で、用語「N-末端」及び「C-末端」とは、
それぞれ、N-終端及びC-終端に対するポリペプチドのアミノ酸配列における相対的位置を
いい、それぞれ、N-終端及びC-終端の残基を含むことができる。「N-末端直近」又は「C-
末端直近」とは、第2のアミノ酸残基に対する第1のアミノ酸残基の位置をいう。ここでは
、第1と第2のアミノ酸残基は、共有結合的に結合されて、連続的アミノ酸配列を提供して
いる。
「から得られる」は、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列の文脈(例えば、FGF19ポ
リペプチド「から得られる」アミノ酸配列)では、ポリペプチド又は核酸が、参照ポリペ
プチド又は核酸(例えば、天然に存在するFGF19ポリペプチド又はFGF19をコードしている
核酸)の配列に基づく配列を有することを示すことが意図されるが、タンパク質又は核酸
が作製される供給源又は方法に関して制限することは意図されない。例として、用語 「
から得られる」は、参照アミノ酸又はDNA配列の同族体又はバリアントを含む。
ポリペプチドの文脈では、用語「単離された」とは、天然に存在する場合に、それが天
然に存在し得る環境とは異なる環境にある対象のポリペプチドをいう。「単離された」は
、対象のポリペプチドについて実質的に濃縮された、及び/又は対象のポリペプチドが、
部分的に又は実質的に精製された試料内であるポリペプチドを含むことが意図される。ポ
リペプチドが天然に存在しない場合、「単離された」は、ポリペプチドが、合成手段又は
組み換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されていることを示す。
「濃縮された」は、対象のポリペプチドが、a)生体試料(例えば、ポリペプチドが天然
に存在する、又は投与後に存在する試料)などの出発試料中のポリペプチドの濃度よりも
高い(例えば、少なくとも3倍高い、少なくとも4倍高い、少なくとも8倍高い、少なくとも
64倍高い、又はそれ以上の)濃度、又はb)ポリペプチドが作製される環境(例えば、細菌細
胞中など)よりも高い濃度で存在するように、試料が(例えば、科学者又は臨床医によって
)天然にではなく操作されたことを意味する。
「実質的に純粋な」は、成分(例えば、ポリペプチド)が、組成物の全量の約50%超、一
般的に、ポリペプチド全量の約60%超を構成することを示す。より一般的には、「実質的
に純粋な」とは、全組成物の少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、又はそれ
以上が、対象の成分である組成物をいう。ある場合では、ポリペプチドは、組成物の全量
の約90%超、又は約95%超を構成することとなる。
用語「分析すること」及び「測定すること」及びこれらの文法的変化形は、本明細書で
は互換的に使用され、定性的若しくは定量的決定のいずれか、又は定性的と定量的決定の
両方をいう。これらの用語が、検出に関して使用される場合、本明細書に説明した及び当
技術分野で公知である様々な方法を含めて、相対量を評価するあらゆる手段が意図される
。例えば、遺伝子発現は、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫沈降分析によっ
て、又は発現されたタンパク質の活性、機能、又は量を測定することによって、分析又は
測定することができる。
用語「抗体」(Ab)及び「免疫グロブリン」(Ig)とは、同じ構造特性を有する糖タンパク
質をいう。抗体が、特定の抗原に対する結合特異性を呈するのに対して、免疫グロブリン
には、抗体と、抗原特異性を欠く他の抗体様分子との両方が含まれる。
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう
。すなわち、個々の抗体を含む集団は、微量で存在する可能性がある天然に存在する変異
の可能性を除けば同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原
部位に向かう。異なる決定基(エピトープ)に向かう異なる抗体を含む可能性があるポリク
ローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向
かう。
抗体の文脈では、用語「単離された」とは、その天然の環境の混入成分から分離及び/
又は回収されている抗体をいう;こうした混入成分としては、抗体の診断的又は治療的使
用を妨げる可能性がある材料が挙げられ、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非
タンパク質性溶質が含まれ得る。
本明細書で使用する場合、用語「FGF19依存性の」及び類似の用語は、疾患、障害、又
は状態の文脈で使用される場合、原因のすべて又は一部がFGF19の発現である、疾患、障
害、又は他の状態をいう。ある種の実施態様では、FGF19の発現は、対照と比較すると増
幅される。いくつかの実施態様では、FGF19の発現は、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35
%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくはそれ以上
、又はこれらの任意の数値範囲だけ増幅される。いくつかの実施態様では、FGF19の増幅
された発現は、疾患、障害、若しくは状態、又はこれらの症状を、直接的にもたらす。他
の実施態様では、FGF19の増幅された発現は、疾患、障害、若しくは状態、又はこれらの
症状を、間接的にもたらす。
(線維芽細胞増殖因子19(FGF19))
線維芽細胞増殖因子(FGF)は、細胞の増殖及び分化において重要な役割を担う増殖因子
のファミリーである。ヒトでは、FGFファミリーの22のメンバーが同定されており、これ
らはすべて、構造的に関連するシグナル伝達分子である。FGFのFGF19サブファミリーは、
ヒトFGF21、FGF23、及びFGF19、並びにマウスFGF15からなる。
FGFファミリーメンバーの生理学的効果は、FGF受容体チロシンキナーゼ(FGFR)ファミリ
ー(それぞれがチロシンキナーゼドメインを有する4つのメンバー(FGFR1、FGFR2、FGFR3、
及びFGFR4)が含まれる)の1以上のメンバーへのヘパリン依存性の結合の結果である。さら
に、FGFR1、FGFR2、及びFGFR3はそれぞれ、「b」及び「c」バリアントと呼ばれる2つのス
プライスバリアント(すなわち、FGFR1b、FGFR2b、FGFR3b、FGFR1c、FGFR2c、及びFGFR3c)
も有する。
FGF19は、脂肪細胞と肝細胞の両方を標的にし、これらに対して影響を与える。組み換
えヒトFGF19で治療されたマウスは、高脂肪の食事であるにもかかわらず、代謝率の増大
、脂質酸化の増大、より低い呼吸商、及び体重減少を示す。FGF19の代謝的効果は、FGFR1
c、FGFR2c、及びFGFR3c受容体への結合を介して生じ、その中で、FGFR1c及びFGFR2cへの
結合が最も重要である。これらの受容体へのFGF19結合は、共受容体Klotho-β(KLB)を必
要とする。
FGF19はまた、肝臓による胆汁産生を調節することが示されている。したがって、FGF19
様の薬剤は、胆汁酸恒常性における重要な役割を果たすことができる。結果は、FGF19に
よって調節される肝臓胆汁酸代謝が、そのグルコース降下効果とは無関係である可能性が
あることを示唆している。
本明細書の他の場所に言及した通り、糖尿病の治療のための胃バイパス手術の使用は、
大抵の患者におけるII型糖尿病を完全にかつ持続的に治療することが示されている。この
「肥満学的効果」は、手術のほんの数日後、かつ有意な体重減少が達成されるずっと前に
は明白である。FGF19レベルは、肥満外科手術後に増大し、これは、肥満学的効果の原因
である可能性がある。
FGF19は、22残基のシグナルペプチドを含む、216アミノ酸のポリペプチドとして発現さ
れる(GenBank:AAQ88669.1)。成熟ヒトFGF19(野生型)は、次のアミノ酸配列を含む194アミ
ノ酸のポリペプチドである:
Figure 2021008499
(FGF19及び肝細胞癌)
本明細書に記載した通り、FGF19は、癌、特にHCC、すなわち最も一般的なタイプの肝臓
癌の誘発と関連がある。ある種の態様によれば、所望の代謝活性(例えば、グルコース降
下活性)を有するが、実質的なHCC活性をを欠く又は有しない、本明細書に示した通りのポ
リペプチド、若しくは部分配列、バリアント、又はこれらの改変形態を特定する方法及び
モデルが提供される。様々な代謝障害及び関連する方法(例えば、グルコースレベルを測
定する方法)は、癌を検出する方法と共に、本明細書の他の場所に記載されている、また
、当技術分野で公知である。
HCCのスクリーニング及び診断において、様々な方法論を使用することができ、これら
は、当業者に周知である。HCCの指標としては、限定はされないが、上昇するα-フェトプ
ロテイン(AFP)又はデス-γ-カルボキシプロトロンビン(DCP)レベルなどの腫瘍マーカーの
検出が挙げられる。超音波、CTスキャン、及びMRIを含めた、いくつかの様々なスキャニ
ング及び画像化技術も利用可能である。本明細書で提供される方法及びモデルの、ある種
の実施態様に関しては、ポリペプチド(例えば、候補ポリペプチド)が、HCCを誘発する証
拠を呈するかどうかの評価は、例えば、ポリペプチドを投与された動物モデル(例えば、d
b/dbマウスモデル)におけるHCC結節形成を、野生型 FGF19によって誘発されるHCC結節形
成と比較して定量化することによって、インビボで決定される。肉眼的には、HCCは、結
節状であり得るのに対し、腫瘍結節(これは、しばしば、円形から楕円形、灰色又は緑色
、十分に境界があるが封入されてはいない)は、1つの大きな塊又は複数の小さな塊のいず
れかとして見える。或いは、HCCは、拡散し、境界がはっきりしておらず、しばしば門脈
に浸潤する、浸潤性の腫瘍として存在する可能性がある。HCCの危険因子としては、2型糖
尿病(多くの場合、肥満によって悪化する)が挙げられる。2型糖尿病におけるHCCのリスク
は、糖尿病の期間及び治療プロトコルに応じて(非糖尿病のリスクの〜2.5から〜7倍)高く
なる。
1以上の前述の方法論によって、HCCの存在の可能性が高いことが示された結果の後、肝
組織試料の病理学的評価が、一般に実施される。したがって、本明細書で提供される方法
のある種の実施態様は、ポリペプチド配列が、HCCを誘発する証拠を呈するかどうかを決
定するために、HCC研究に有用なインビボ動物モデルからの肝組織試料を評価することを
さらに含む。ある種の実施態様では、インビボ動物モデルは、db/dbマウスモデルである
。顕微鏡評価によって、病理学者は、4つの一般的な構造的及び細胞学的タイプ(パターン
)のHCC(すなわち、線維層板型、偽腺性(腺様)、多形性(巨細胞)、及び明細胞)のうちの1
つが存在するかどうかを決定することができる。
(所望の特性を有するFGF19バリアントポリペプチドを特定するための方法及びモデル)
FGF19バリアントポリペプチド、及び少なくともいくつかの点でFGF19の活性を模倣する
他の薬剤は、科学文献と特許文献の両方に記載されている。例えば、Wuらの文献、PLos O
ne,6:e17868(2001年3月11日);米国特許第8,324,160号;及び米国特許出願公開第2011/0195
895号;第2011/0207912号、及び第2011/0104152号を参照のこと。限定の意図はまったく無
いが、候補FGF19バリアント配列としては、FGF19(配列番号:3)のアミノ酸16〜20のWGDPI
配列に相当するWGDPI(配列番号:4)配列モチーフを有するポリペプチドが挙げられる。本
明細書で意図される特定のポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2021008499
 を有する。
他の実施態様では、FGF19バリアントは、以下に示した通りのアミノ酸配列:
Figure 2021008499
Figure 2021008499
Figure 2021008499
Figure 2021008499
又は、前述のペプチド配列のいずれかの、その部分配列若しくは断片を含む、又はこれら
からなる。前述のペプチド配列のいずれかのある種の実施態様では、N-末端のR残基が欠
失している。
先に記載した通り、本開示の一態様は、代謝障害を患う試験対象が、FGF19バリアント
での治療の候補であるかどうかを決定するための方法であって、(a)癌性状態の徴候を有
する試験対象であって、代謝障害を患う前記試験対象を提供することと、(b)FGF19又はFG
F19代替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象
に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を誘発するのに十
分である)ことと、(c)前記試験対象において癌性状態の徴候が増強されるかどうかを決定
することとを含む(ここでは、癌性状態の徴候の増強の非存在が、前記試験対象がFGF19バ
リアントでの治療の候補であることを示す)前記方法を意図する。
本開示の別の態様は、代謝障害を患う試験対象が、FGF19バリアントでの治療の候補で
あるかどうかを決定するための方法であって、(a)癌性状態の徴候を有する試験対象であ
って、代謝障害を患う前記試験対象を提供することと、(b)FGF19又はFGF19代替物と、FGF
19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象に投与されるFGF19
又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を誘発するのに十分である)ことと、
(c)前記試験対象において、癌性状態の徴候が低減されるかどうかを決定することとを含
む(ここでは、癌性状態の徴候の低減が、前記試験対象がFGF19バリアントでの治療の候補
であることを示す)前記方法を意図する。
本開示はまた、FGF19バリアントが、代謝障害を患う試験対象を治療するための候補で
あるかどうかを決定するための方法であって、(a)FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリア
ントとを、代謝障害を患う前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象に投与さ
れるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を誘発するのに十分である
)ことと、(b)前記試験対象において、癌性状態の徴候が観察されるかどうかを決定するこ
ととを含む(ここでは、癌性状態の徴候の非存在が、FGF19バリアントが、前記試験対象の
治療のための候補であることを示す)前記方法を意図する。
本明細書で意図されるさらなる実施態様は、FGF19バリアントが、代謝障害を患う試験
対象を治療するための候補であるかどうかを決定するための方法であって、(a)代謝障害
を患う試験対象であって、癌性状態の徴候を有する試験対象を提供することと、(b)FGF19
又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここでは、前記試
験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を増悪させ
るのに十分である)ことと、(c)前記試験対象において、癌性状態の徴候が増強されるかど
うかを決定することとを含む(ここでは、癌性状態の徴候の増悪の非存在が、FGF19バリア
ントが、前記試験対象の治療のための候補であることを示す)前記方法に関心が持たれる
。特定の実施態様では、癌性状態の1以上の徴候は、試験対象において低減される。
本明細書で提供される方法のある種の実施態様では、FGF19バリアントは、M5、M6、M7
、M14、M15、M32、M36、M43、M52、M53、M67、M68、M69、M70、M75、M76、M77、M83、M84
、M140、M144、M145、M146、及びM160からなる群から選択される。一実施態様では、FGF1
9バリアントは、M5である。別の実施態様では、FGF19バリアントは、M6である。いくつか
の実施態様では、FGF19バリアントは、M7である。
一実施態様では、FGF19バリアントは、M14である。別の実施態様では、FGF19バリアン
トは、M15である。他の実施態様では、FGF19バリアントは、M32である。一実施態様では
、FGF19バリアントは、M36である。別の実施態様では、FGF19バリアントは、M43である。
他の実施態様では、FGF19バリアントは、M52である。さらに他の実施態様では、FGF19バ
リアントは、M53である。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、M67である。
一実施態様では、FGF19バリアントは、M68である。別の実施態様では、FGF19バリアン
トは、M69である。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、M70である。一実施態
様では、FGF19バリアントは、M75である。別の実施態様では、FGF19バリアントは、M76で
ある。他の実施態様では、FGF19バリアントは、M77である。さらに他の実施態様では、FG
F19バリアントは、M83である。一実施態様では、FGF19バリアントは、M84である。
別の実施態様では、FGF19バリアントは、M140である。他の実施態様では、FGF19バリア
ントは、M144である。さらに他の実施態様では、FGF19バリアントは、M145である。一実
施態様では、FGF19バリアントは、M146である。いくつかの実施態様では、FGF19バリアン
トは、M160である。他の実施態様では、2つ以上の前述のFGF19バリアントの任意の組み合
わせも意図される。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:
5〜29のいずれか1つ;又はその部分配列若しくは断片に示したアミノ酸配列を含む。ある
種の実施態様では、N-末端のR残基は、欠失している。いくつかの実施態様では、FGF19バ
リアントは、配列番号:5を含む。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:6を
含む。一実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:7を含む。他の実施態様では、FGF
19バリアントは、配列番号:8を含む。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:
9を含む。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:10を含む。他の実施
態様では、FGF19バリアントは、配列番号:11を含む。別の実施態様では、FGF19バリアン
トは、配列番号:12を含む。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:13
を含む。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:14を含む。一実施態様では、
FGF19バリアントは、配列番号:15を含む。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配列
番号:16を含む。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:17を含む。他
の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:18を含む。さらに他の実施態様では、FG
F19バリアントは、配列番号:19を含む。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、
配列番号:20を含む。一実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:21を含む。いくつ
かの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:22を含む。他の実施態様では、FGF19
バリアントは、配列番号:23を含む。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:2
4を含む。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:25を含む。他の実施
態様では、FGF19バリアントは、配列番号:26を含む。さらに他の実施態様では、FGF19バ
リアントは、配列番号:27を含む。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番
号:28を含む。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:29を含む。ある種の実
施態様では、FGF19バリアントは、前述の配列のいずれか1つを含み、ここでは、N-末端の
R残基は、欠失している。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、前述の配列のい
ずれかの部分配列を含む。他の実施態様では、2つ以上の前述のFGF19バリアントの任意の
組み合わせも意図される。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:
5〜29のいずれか1つ;又はその部分配列若しくは断片に示したアミノ酸配列アミノ酸配列
からなる。ある種の実施態様では、N-末端のR残基は、欠失している。いくつかの実施態
様では、FGF19バリアントは、配列番号:5からなる。他の実施態様では、FGF19バリアント
は、配列番号:6からなる。一実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:7からなる。
他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:8からなる。別の実施態様では、FGF19
バリアントは、配列番号:9からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配
列番号:10からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:11からなる。別
の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:12からなる。いくつかの実施態様では、
FGF19バリアントは、配列番号:13からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配
列番号:14からなる。一実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:15からなる。別の
実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:16からなる。いくつかの実施態様では、FG
F19バリアントは、配列番号:17からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列
番号:18からなる。さらに他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:19からなる
。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:20からなる。一実施態様では
、FGF19バリアントは、配列番号:21からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリアン
トは、配列番号:22からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:23から
なる。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:24からなる。いくつかの実施態
様では、FGF19バリアントは、配列番号:25からなる。他の実施態様では、FGF19バリアン
トは、配列番号:26からなる。さらに他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:2
7からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:28からなる。他の
実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:29からなる。ある種の実施態様では、FGF1
9バリアントは、前述の配列のいずれか1つからなり、ここでは、N-末端のR残基は、欠失
している。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、前述の配列のいずれか1つの部
分配列からなる。他の実施態様では、2つ以上の前述のFGF19バリアントの任意の組み合わ
せも意図される。
先に言及した通り、本開示はまた、様々なモデルも意図する。信頼できる、再現可能な
結果を提供する、いかなるモデルも使用することができる。当業者は、本開示の対象物と
共に使用することができるモデルについて熟知している。いくつかの実施態様では、げっ
歯類モデル、特にマウスモデルが使用される。本開示の態様を実施する際には、実験セク
ションの実施例において使用されるob/obマウスモデルに加えて、db/db、db/ob、及びDIO
モデルも用途を見いだすことができる。
1つのこうした実施態様は、FGF19バリアントが、代謝障害を患う対象における癌性の疾
患、障害、又は状態を予防するための候補であるかどうかを決定するためのモデルであっ
て、(i)有効量のFGF19又はFGF19代替物の投与の前に癌性状態の徴候を呈しない、かつ(ii
)FGF19又はFGF19代替物の投与の後に癌性状態の徴候を呈する対象を含み、ここでは、癌
性状態の徴候は、配列番号:1に示したアミノ酸配列を含む有効量のポリペプチドの投与時
に改善する、前記モデルを対象とする。ある種の実施態様では、該ポリペプチドは、配列
番号:1に示したアミノ酸配列からなる。
本開示はまた、FGF19バリアントが、代謝障害を患う対象における癌性の疾患、障害、
又は状態を治療するための候補であるかどうかを決定するためのモデルであって、FGF19
又はFGF19代替物の投与に由来する癌の少なくとも1つの徴候を有する対象を含み、ここで
は、癌の徴候は、配列番号:1に示したアミノ酸配列を含む有効量のポリペプチドの投与時
に改善する、前記モデルを意図する。ある種の実施態様では、該ポリペプチドは、配列番
号:1に示したアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施態様では、本明細書で提供されるのは、FGF19バリアントが、代謝障害
を患う対象における癌性の疾患、障害、又は状態を予防するための候補であるかどうかを
決定するためのモデルであって、i)有効量のFGF19又はFGF19代替物の投与の前に癌性状態
の徴候を呈しない、かつii)FGF19又はFGF19代替物の投与の後に癌性状態の徴候を呈する
対象を含み、ここでは、癌性状態の徴候は、有効量のFGF19バリアントの投与時に改善す
る、前記モデルである。
他の実施態様では、本明細書で提供されるのは、FGF19バリアントが、代謝障害を患う
対象における癌性の疾患、障害、又は状態を治療するための候補であるかどうかを決定す
るためのモデルであって、FGF19又はFGF19代替物の投与に由来する癌の少なくとも1つの
徴候を有する対象を含み、ここでは、癌の徴候は、有効量のFGF19バリアントの投与時に
改善する、前記モデルである。
本明細書で提供されるモデルのある種の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:
5〜29のいずれか1つ;又はその部分配列若しくは断片に示したアミノ酸配列を含む。本明
細書で提供されるモデルの他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:5〜29のい
ずれか1つ;又はその部分配列若しくは断片に示したアミノ酸配列からなる。ある種の実施
態様では、N-末端のR残基は、欠失している。いくつかの実施態様では、FGF19バリアント
は、配列番号:5を含む又は配列番号:5からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは
、配列番号:6を含む又は配列番号:6からなる。一実施態様では、FGF19バリアントは、配
列番号:7を含む又は配列番号:7からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列
番号:8を含む又は配列番号:8からなる。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番
号:9を含む又は配列番号:9からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配
列番号:10を含む又は配列番号:10からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配
列番号:11を含む又は配列番号:11からなる。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配
列番号:12を含む又は配列番号:12からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリアント
は、配列番号:13を含む又は配列番号:13からなる。他の実施態様では、FGF19バリアント
は、配列番号:14を含む又は配列番号:14からなる。一実施態様では、FGF19バリアントは
、配列番号:15を含む又は配列番号:15からなる。別の実施態様では、FGF19バリアントは
、配列番号:16を含む又は配列番号:16からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリア
ントは、配列番号:17を含む又は配列番号:17からなる。他の実施態様では、FGF19バリア
ントは、配列番号:18を含む又は配列番号:18からなる。さらに他の実施態様では、FGF19
バリアントは、配列番号:19を含む又は配列番号:19からなる。いくつかの実施態様では、
FGF19バリアントは、配列番号:20を含む又は配列番号:20からなる。一実施態様では、FGF
19バリアントは、配列番号:21を含む又は配列番号:21からなる。いくつかの実施態様では
、FGF19バリアントは、配列番号:22を含む又は配列番号:22からなる。他の実施態様では
、FGF19バリアントは、配列番号:23を含む又は配列番号:23からなる。別の実施態様では
、FGF19バリアントは、配列番号:24を含む又は配列番号:24からなる。いくつかの実施態
様では、FGF19バリアントは、配列番号:25を含む又は配列番号:25からなる。他の実施態
様では、FGF19バリアントは、配列番号:26を含む又は配列番号:26からなる。さらに他の
実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:27を含む又は配列番号:27からなる。いく
つかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:28を含む又は配列番号:28からなる
。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:29を含む又は配列番号:29からなる
。ある種の実施態様では、FGF19バリアントは、前述の配列のいずれか1つを含む又は前述
の配列のいずれか1つからなり、ここでは、N-末端のR残基は、欠失している。いくつかの
実施態様では、FGF19バリアントは、前述の配列のいずれか1つの部分配列を含む又は前述
の配列のいずれかの部分配列からなる。他の実施態様では、2つ以上の前述のFGF19バリア
ントの任意の組み合わせも意図される。
(FGF19バリアントと共投与されるFGF19の効果の評価)
実験セクションに説明する実施例では、単独で投与された又はFGF19バリアントM70と共
投与されたFGF19の、db/dbマウスに対する影響を評価した。ビヒクルとしてアデノ随伴ウ
イルス(AAV)を使用して、マウスにおいて対象の外因性遺伝子を送達及び発現させ、導入
遺伝子によってコードされたタンパク質への継続的、持続的、かつ全身的な曝露を可能に
した。
図2は、GFP(対照);FGF19(2つの別々の用量);及びFGF19とFGF19バリアントM70(それぞれ
2つの別々の用量)のAAV介在性の遺伝子送達の5週後のdb/dbマウスにおける、ELISAによっ
て決定された血漿FGF19濃度を示す。FGF19とM70導入遺伝子の共投与の後に観察された高
いFGF19濃度は、FGF19バリアントM70とFGF19の両方の発現からの寄与を反映している。こ
の実施例では、実験結果の定量化を容易にするために、FGF19-flagを使用した;実験セク
ションに説明した通り、c-Flag成分は、FGF19の腫瘍形成効果に影響を与えなかったが、
これは、FGF19の抗糖尿病効果に対する影響を有することができる。
FGF19単独の投与と比較した、HCCに対するFGF19とFGF19バリアントM70の共投与の影響
の可能性を評価した。図3に示す通り、db/dbマウスモデルにおけるFGF19の異所性発現が
、肝臓表面から膨隆している複数の大きな盛り上がった腫瘍結節の形成を促進したのに対
し、FGF19とM70の両方を発現しているマウスから単離された肝臓には、(用いられる条件
下で)肝臓結節はまったくなかった。さらに、FGF19介在性の腫瘍形成は、肝臓病変の出現
によって裏付けられた通り、FGF19とM70導入遺伝子が共発現された場合には、完全に抑制
される。これらのデータは、操作されたFGF19バリアントM70が、野生型タンパク質を伴う
マウスにおける腫瘍形成能を欠くだけでなく、野生型タンパク質の増殖促進効果を効率的
に妨げることができることを示唆しているという点で驚くべきことである。本発明を実施
するために、この事象に関連する根本的な作用機序の正確な理解は必要とされないが、こ
れは、少なくともある程度、FGF19結合部位での、M70の野生型FGF19に対する競合に起因
し得る。
実施例4は、注射前に最初に測定され、その後、示された導入遺伝子の注射の3-、5-、
及び23-週後に決定された、マウス体重に対する効果を示す。図4に示す通り、FGF19バリ
アントM70とFGF19を共発現しているトランスジェニックdb/dbマウスは、対照を投与され
た動物と比較して、体重の有意な減少を示したのに対して、FGF19導入遺伝子のみを発現
しているマウスでは、体重に対するそれほど劇的ではない効果が観察された。FGF19とM70
導入遺伝子を共発現しているマウスにおいて観察された体重の変化はまた、対照群内の動
物から採取した肝臓の重量と比較した、肝臓重量の低下にも反映された。
体重の決定と類似の方式で、導入遺伝子発現の血糖に対する効果も、導入遺伝子注射の
前と、注射の3-、5-、及び23-週後に評価した。図5に示した結果は、FGF19バリアントM70
とFGF19を共発現しているトランスジェニックdb/dbマウスが、対照動物と比較して、血糖
濃度の有意な低下を示すことを示唆する。
先述の研究及び日付の発展として、また、実験セクションの実施例6〜11に提供される
通り、インビボ腫瘍形成能モデルをマウスにおいて確立して、例えば、胆汁酸恒常性にお
けるその本質的役割を損なわずに腫瘍形成におけるFGF19を標的にする目的で、FGF19誘発
性肝発癌性を評価した。実施例7は、インビボでの肝細胞腫瘍形成の評価のためのAAV介在
性の導入遺伝子システムを示す。FGF19導入遺伝子発現は、AAV介在性の遺伝子送達手法を
使用して導入した(Zhangらの文献、2009年、Hum.Gene Ther.20、922〜929)。実施例8に示
す通り、あるパネルのFGF19バリアントを、インビボで評価し、M70を含めた腫瘍非存在バ
リアントを特定した。注目すべきことには、実施例8及び9で提供される通り、M70は、胆
汁酸恒常性を調節する有益な活性を保持することが示され;M70はまた、FGFR4(これは、FG
F19に伴われる腫瘍形成能を仲介すると想定されている)と結合し、活性化させることが示
された(Frenchらの文献、2012年、PloS one 7,e36713;Wuらの文献、2010年、J.Biol.Chem
.285、5165〜5170)。実施例10で提供される通り、FGF19は、STAT3経路、M70において消失
される活性を活性化することによって、腫瘍進行を刺激することが機構的に示された。さ
らに、実施例11で提供される通り、M70は、複数の腫瘍モデルにおいて、FGF19依存性の腫
瘍増殖を阻害することが示された。さらに、実施例12に提供する通り、M70は、同系マウ
スモデルにおいて、結腸腫瘍増殖を阻害することが示された。
したがって、本明細書で提供される実施例では、天然のホルモンが、有益な機能(すな
わち、胆汁酸代謝)を完全なままにしつつ、有害な活性(すなわち、腫瘍形成能)の可能性
を選択的に消失するように操作される。広範な構造活性分析を通じて、M70を、FGFR4受容
体複合体と結合し、選択的に活性化させて、胆汁酸恒常性を維持する、腫瘍非存在FGF19
バリアントと特定した。生理学的レベル超のM70に長期間(db/dbマウスでは24週、rasH2マ
ウスでは52週)曝露したマウスには、肝腫瘍が存在しなかった(実施例8;図7及び8)。M70は
また、マウスにおける、及びヒト癌異種移植片における、FGF19に伴われる腫瘍形成能を
妨害することが実証された(実施例11、図11)。腫瘍非存在FGF19バリアントは、以前に特
定されたが(Wuらの文献、2011年、PloS one 6,e17868;Wuらの文献、2010a、PNAS,107、14
158〜14163)、これらのバリアントは、FGFR4結合を排除するように特別に設計され、また
、その延長により、胆汁酸代謝の調節が損なわれた。対照的に、M70は、FGFR4と結合し、
FGFR4の下流のCyp7a1及びpERK経路を調節する際に、類似の強度及び効力を呈し(実施例9
及び10;図9及び10)、これらの結果は、インビボで、FGFR4/KLB受容体複合体(これは、肝
細胞腫瘍形成を引き起こさない)の選択的活性化の証拠を提供する。
M70とFGF19との間の主な違いは、タンパク質のN-終端にある。各FGFファミリータンパ
ク質は、構造的に保存される中心の球状ドメインと、構造的に柔軟かつ一次配列が多岐で
ある隣接するN-末端及びC-末端セグメントからなる(Beenken 及びMohammadiの文献、2009
年、Nat.Rev.Drug Discov.8、235〜253)。複数のFGF/FGFR複合体のX線結晶構造において
は、FGF分子のN-末端セグメントは、FGFRと特異的に接触し、FGF-FGFR相互作用の特異性
を決定する重要な役割を担うと考えられている(Beenken及びMohammadiの文献、2009年、N
at.Rev.Drug.Discov.8、235〜253)。体系的なインビボスクリーニングの本発明者らの試
みを通じて、5-aa欠失と結合させたN-終端での3アミノ酸の変化が、胆汁酸調節などのFGF
R4依存性のプロセスを活性化するその能力を損なわずに腫瘍形成能を失わせることが示さ
れた。
理論に拘泥されることを望まないが、いくつかの系統の根拠によって、M70が、「偏っ
た(biased)リガンド」又は選択的モジュレーターの薬理学的特性を呈することが示される
。例えば、実施例9及び図9で提供される通り、M70は、野生型FGF19と類似の強度及び効力
をもつFGFR4の細胞外ドメインと結合する。M70は、FGFR4-KLB若しくはFGFR4を形質移入さ
せた細胞、又はFGFR4-KLBを内因的に発現している細胞におけるERKリン酸化を活性化する
。FGF19と同様に、M70は、初代肝細胞において、また、マウスにおいて、Cyp7a1を強力に
抑制する。FGF19とは異なり、M70は、肝腫瘍形成を促進しない。再び、理論に拘泥される
ことを望まないが、M70による腫瘍形成能の喪失は、pSTAT3、すなわち肝細胞性発癌経路
における重要なシグナル伝達分子の活性化の喪失によって説明される可能性がある。
実施例10及び図10で提供される通り、FGF19は、肝臓におけるSTAT3を活性化するが、M7
0は肝臓におけるSTAT3を活性化しないことが示された。STAT3は、肝細胞性発癌における
主役である(He及びKarinの文献、2011年、Cell Res.21、159〜168)。リン酸化された(す
なわち活性化された)STAT3は、ヒトにおけるHCCの約60%に見られる(Heらの文献、2010年
、Cancer Cell 17、286〜297)。STAT3活性化はまた、HCC患者における予後不良と相関す
る(Calvisiらの文献、2006年、Gastroenterol.130、1117〜1128)。恒常的活性型のSTAT3
は、細胞の形質転換における癌遺伝子として作用する(Brombergらの文献、1999年、Cell
98、295〜303。STAT3の肝細胞特異的な消失は、マウスにおけるHCC発生を妨げた(Heらの
文献、2010年、Cancer Cell 17、286〜297)。STAT3活性化の阻害剤は、ヒト癌細胞の増殖
を妨害し、HCCを含めた様々な癌を治療するために、臨床試験中である(Chenらの文献、20
10年、Clin.Cancer Res,16、5189〜5199;Karrasらの文献、2000年、Cellular immunol.20
2、124〜135;Linらの文献、2009年、Oncogene 28、961〜972)。他の炎症性サイトカイン
の中で、IL-6は、肝臓における主なSTAT3活性化因子であることが想定されている(Heらの
文献、2010年、Cancer Cell 17、286〜297)。IL-6シグナル伝達は、肝臓癌前駆体の悪性
の進行を刺激することが示されている(Heらの文献、2013年、Cell 155、384〜396)。IL-6
産生の増大は、原発性胆汁性肝硬変、すなわちHCCリスクの増大を伴う胆汁うっ滞性の状
態を有する患者において観察された(Kakumuらの文献、1993年、Gastroenterologia Japon
ica 28、18〜24)。FGF19はまた、実施例10及び図10において、インビボでSTAT3シグナル
伝達を活性化することが示される。この効果は、FGFR4受容体複合体によって直接的に、
又はサイトカイン又は増殖因子の誘発を通じて間接的に仲介される可能性がある。実際、
IL-6の発現は、本発明者らの研究において、FGF19で治療された動物の肝臓において上昇
する(実施例10;図10)。
M70は、FGF19結合を置き換える、又はFGF19結合を妨げることが可能であるので、FGFR4
上のオルソステリック部位と結合し、FGF19に伴われる腫瘍形成能を阻害することができ
る。さらに、M70は、すべての経路を、無差別に同じ程度まで遮断するわけではない。M70
は、ある種のアロステリックモジュレーター(図12)について観察される通り、他のもの(
すなわち腫瘍)を相対的に除外するほどに、ある種のFGFR4シグナル伝達経路(すなわちCyp
7a1、pERK)へと付勢する。
治療的視点から見ると、本発明者らの研究はまた、慢性肝臓疾患及び癌におけるM70の
使用のための実験的根拠を提供する。M70は、FGF19依存性の腫瘍の治療のための抗癌剤と
して有用であり得る(例えば、実施例8及び11;図7、8、及び11を参照のこと)。これは、FG
F19が、〜15%ヒトHCCにおいて増幅され、かつ、しばしば腫瘍発生に至る肝硬変及び胆汁
うっ滞性の状態において上方調節されることを考えると、特に当てはまる。以前の報告で
は、異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示す抗FGF19モノクローナル抗体を中和するこ
との発生が示されたが(Desnoyersらの文献、2008年、Oncogene 27、85〜97)、こうした戦
略は、重大な有害作用を引き起こした。この抗体のカニクイザルへの投与は、内在性FGF1
9の狙い通りの阻害(肝内胆汁酸合成の増加、血清胆汁酸の上昇、腸肝循環の撹乱、及び下
痢及び肝毒性の発生をもたらす)により、重い下痢を伴う、用量と関連する肝臓毒性をも
たらした(Paiらの文献、2012年、Toxicological sciences,126、446〜456)。
実験セクションで提供される通り、また、抗体を中和することとは対照的に、本発明者
らの研究は、M70が、腫瘍形成能を消失しながら、胆汁酸調節に対するFGF19の活性を保持
することを示す(例えば、実施例8、9、及び11;図8、9、及び11を参照のこと)。これは、
抗癌剤として使用された場合の、胆汁酸恒常性の維持を確実にする。重要なことに、本明
細書で提供される実験データは、M70が、腫瘍形成能を欠くだけでなく、野生型FGF19に伴
う腫瘍形成効果を効率的に妨げることができることを示す。さらに、M70は、FGF19介在性
のHCCに加えて、結腸癌異種移植腫瘍の増殖を阻害する。M70はまた、同系マウスモデルに
おける結腸癌の増殖も阻害する(例えば、実施例12及び図13を参照のこと)。これらの結果
は、選択的FGFR4モジュレーターとして、M70が、FGF19の発癌活性を弱めることを裏付け
る。
実験セクションで提供される通り、AAV介在性の遺伝子送達を使用して、成体マウスに
おいて肝細胞腫瘍形成における複数のタンパク質を評価するために、頑強なハイスループ
ットシステムも確立された。同所性部位(肝臓)でのFGF19の過剰発現は、複数の系統のマ
ウスにおける肝臓異形成、及びHCCの発生に至ることが示された。これは、胚形成におけ
る交絡因子、及び従来のトランスジェニックマウス手法における発生を排除する。腫瘍イ
ニシエーション又はプロモーションのために、ジエチルニトロソアミン(DEN)又はフェノ
バルビタールなどの化学的腫瘍プロモーターは必要ではない。他の癌遺伝子、シグナル伝
達タンパク質、並びに天然のタンパク質のバリアントを評価するために、同じ手法を適合
させることができる。
FGF19は、一連の生物学的効果を示す。FGF19の治療的可能性としては、慢性肝疾患、並
びに肥満及び糖尿病の治療が挙げられるが、肝細胞増殖及び発癌可能性のその促進が、習
慣的な使用のためのFGF19の開発に立ちはだかる。しかし、M70を、その強力な代謝特性を
保持しつつ腫瘍形成能を欠く、操作されたFGF19バリアントと特定することで、望まれな
い副作用なしで治療効果が得られる可能性がある。本発明者らの結果は、FGFR4-KLB受容
体複合体の選択的活性化が肝腫瘍形成を誘発しないことを裏付けるだけでなく、癌、胆汁
酸調節解除を伴う疾患、2型糖尿病、及び他の代謝障害を治療するためにこの経路を利用
するための新規手段をさらに提供する。
(ポリペプチド及び核酸分子)
本開示はまた、本明細書に記載したポリペプチド配列から得られる連続的アミノ酸残基
を含有するポリペプチドの活性な断片(例えば部分配列)を意図する。ペプチド又はポリペ
プチド部分配列の連続的アミノ酸残基の長さは、その部分配列が得られる特定の天然に存
在するアミノ酸配列に応じて変動する。ある種の実施態様では、ペプチド及びポリペプチ
ドは、約5アミノ酸から約10 アミノ酸、約10アミノ酸から約15アミノ酸、約15アミノ酸か
ら約20アミノ酸、約20アミノ酸から約25アミノ酸、約25アミノ酸から約30 アミノ酸、約3
0アミノ酸から約40アミノ酸、約40アミノ酸から約50アミノ酸、約50アミノ酸から約75ア
ミノ酸、約75アミノ酸から約100アミノ酸、又は約100アミノ酸から最大で完全長までのポ
リペプチドである。
本明細書で提供されるFGF19バリアントポリペプチドのある種の実施態様では、アミノ
酸残基(又はその模倣体)の総数は、約250未満である。他の実施態様では、アミノ酸残基
の数は、約190から約230、約200から約225、又は約210から約220残基の範囲である。一層
さらなる実施態様では、アミノ酸残基の数は、180残基超、185残基超、190残基超、195残
基超、200残基超、205残基超、210残基超、215残基超、220残基超、又は225残基超である
。
さらに、ある種の実施態様では、該ポリペプチドは、参照配列と比較して、定義された
長さの連続的アミノ酸(例えば「比較域(comparison window)」)にわたって、定義された
配列同一性を有する。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知で
ある。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith及びWatermanの文献、A
dv.Appl.Math.2:482(1981年)の局所的相同性アルゴリズムによって、又はNeedleman及びW
unschの文献、J.Mol.Biol.48:443(1970年)の相同性アラインメントアルゴリズムによって
、又はPearson及びLipmanの文献、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988年)の類似性検
索法(search for similarity method)によって、又はこれらのアルゴリズム(GAP、BESTFI
T、FASTA、及びTFASTA(Wisconsin Genetics Software Package、Madison,Wis.))のコンピ
ュータ処理される実行によって、又は手動アラインメント及び目視検査(例えば、「分子
生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」(Ausubelら編、19
95年、別冊)を参照のこと)によって実施することができる。
一例として、いくつかの実施態様では、適切なポリペプチドは、本明細書に記載したア
ミノ酸配列の1つの、約5アミノ酸から約10アミノ酸、約10アミノ酸から約12アミノ酸、約
12アミノ酸から約15アミノ酸、約15アミノ酸から約20アミノ酸、約20アミノ酸から約25ア
ミノ酸、約25アミノ酸から約30アミノ酸、約30アミノ酸から約35アミノ酸、約35アミノ酸
から約40アミノ酸、約40アミノ酸から約45アミノ酸、約45アミノ酸から約50アミノ酸、約
50アミノ酸から約60アミノ酸、約60アミノ酸から約70アミノ酸、約70アミノ酸から約80ア
ミノ酸、約80アミノ酸から約90アミノ酸、約90アミノ酸から約100アミノ酸、約100アミノ
酸から約110アミノ酸、約110アミノ酸から約120アミノ酸、約120アミノ酸から約130アミ
ノ酸、約130アミノ酸から約140アミノ酸、約140アミノ酸から約150アミノ酸、約150アミ
ノ酸から約160アミノ酸、約160アミノ酸から約170アミノ酸、約170アミノ酸から約180ア
ミノ酸、約180アミノ酸から約190アミノ酸、又は約194アミノ酸の連続的配列に対して、
少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約
95%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配
列を含む。
ある種の実施態様では、該ポリペプチドは、天然供給源(例えば、その天然に存在する
環境ではない環境)から単離され、また、(例えば、細菌;酵母;ピキア(Pichia);昆虫細胞
などの遺伝子改変された宿主細胞において)組み換えによって作ることもできる(ここでは
、遺伝子改変された宿主細胞は、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核
酸を用いて改変される)。該ポリペプチドは、合成によって(例えば、無細胞化学合成によ
って)生成することもできる。生成の方法は、以下に、より詳細に記載する。
いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、当技術分野で公知の様々なFGF19関連の核
酸を操作して該ポリペプチドをコードすることが可能な構築物を提供するための、組み換
え技術を使用して産生される。ある特定のアミノ酸配列が提供される場合、当業者は、例
えば分子生物学における、自身の経歴と経験から見て、こうしたアミノ酸配列をコードす
る様々な異なる核酸分子を認識するであろうということを理解されたい。
いくつかの実施態様では、本開示はまた、アミノ酸残基内に(例えば、バリアント又は
種を通して保存されない位置に)、参照配列(例えば、対応する野生型配列)と比較して1以
上の変更を有するポリペプチドも提供する。こうしたポリペプチドは、しばしば、種間で
保存されるドメインを保持し、天然に存在するポリペプチドと同じ生物活性を有する。こ
うしたポリペプチドはまた、しばしば、1以上の保存的アミノ酸置換を有する。語句「保
存的アミノ酸置換」とは、一般に、次のグループ内のアミノ酸残基の置換をいう:1)L、I
、M、V、F;2)R、K;3)F、Y、H、W、R;4)G、A、T、S;5)Q、N;及び6)D、E。保存的アミノ酸
置換は、タンパク質内のアミノ酸(1又は複数)を、類似の酸性度、塩基性度、電荷、極性
の側鎖、又は側鎖の大きさをもつアミノ酸と置き換えることによって、タンパク質の活性
を維持する。置換、挿入、又は欠失のための手引きは、異なるバリアントタンパク質又は
異なる種からのタンパク質の、アミノ酸配列のアラインメントに基づく可能性がある。
特定の実施態様では、FGF19のLoop-8領域に対する改変が意図される。本明細書では、F
GF19残基127〜129(配列番号:3)は、Loop-8領域を構成するものと定義されるが、文献中で
は、Loop-8領域は、時として、他の残基(例えば、残基125〜129)を含む又は他の残基から
なるものと定義される。FGF19骨格に対するR127L置換とP128E置換のある種の組み合わせ
は、HCC形成に対して予想外に陽性の影響を与える。R127L置換とP128E置換と、FGF19コア
領域におけるLeu(L)からGln(Q)への置換の組み合わせはまた、HCC形成の防止に対して有
意な影響を与える。
したがって、FGF19 Loop-8領域のバリアントは、実質的な、又は測定可能な、又は検出
可能なHCC形成を低減又は消失することができるので、包含される。さらに、HCC形成を低
減する効果は、Loop-8領域の外側のアミノ酸残基に対する改変(例えば、配列番号:3のア
ミノ酸21〜29に相当する領域などのコア領域内のアミノ酸残基の置換によって増強するこ
とができる。
いくつかの実施態様では、Loop-8改変バリアントは、FGF19 Loop-8領域内の置換(下線)
を含む、M70:
Figure 2021008499
 である。ある種の実施態様では、Loop-8改変M70バリアントは、(i)R127L置換、(ii)P128E
置換、又は(iii)R127L置換及びP128E置換に相当するFGF19 Loop-8領域内の置換(下線)を
含む。ある種の実施態様では、Loop-8改変 M70バリアントは、FGF19コア領域内の置換を
さらに含む、又はさらに含む。いくつかの実施態様では、Loop-8改変M70バリアントは、L
18Q置換を含む。
他の実施態様では、Loop-8改変バリアントは、M5(配列番号:5)、M6(配列番号:6)、M7(
配列番号7)、M14(配列番号:8)、M15(配列番号:9)、M32(配列番号:10)、M36(配列番号:11)
、M43(配列番号:12)、M50(配列番号:13)、M52(配列番号14)、M53(配列番号:15)、M67(配
列番号:16)、M68(配列番号:17)、M69(配列番号:18)、M70(配列番号:1 or 19)、M75(配列
番号:20)、M76(配列番号:21)、M77(配列番号22)、M83(配列番号:23)、M84(配列番号:24)
、M140(配列番号:25)、M5-R(配列番号:26)、M6-R(配列番号:27)、M50-R(配列番号:28)、
又はM160(配列番号:29)である。いくつかの実施態様では、Loop-8改変バリアントは、配
列番号:3のアミノ酸127〜129に相当するFGF19 Loop-8領域内の置換を含む。ある種の実施
態様では、Loop-8改変バリアントは、(i)R127L置換、(ii)P128E置換、又は(iii)R127L置
換及びP128E置換に相当するFGF19 Loop-8領域内の置換を含む。いくつかの実施態様では
、FGF19バリアントは、配列番号:3のアミノ酸21〜29に相当するコア領域内の置換を含む
、又はさらに含む。ある種の実施態様では、FGF19バリアントは、L22Q置換に相当するコ
ア領域内の置換を含む、又はさらに含む。
本明細書に記載するポリペプチドをコードする核酸分子(その天然に存在する及び天然
に存在しないアイソフォーム、対立遺伝子バリアント、及びスプライスバリアントを含め
て)が、本開示によって意図される。本開示はまた、天然に存在するDNA配列と1以上の塩
基が異なるが、遺伝暗号の縮重のおかげで、それでもポリペプチドに相当するアミノ酸配
列に翻訳される、核酸配列も包含する。
(アミド結合置換)
ある場合では、ポリペプチドは、ペプチド結合以外の1以上の結合を含む。例えば、少
なくとも2つの隣接するアミノ酸が、アミド結合以外の結合を介して連結される。例えば
、望ましくないタンパク質分解又は他の手段の分解を低減又は消失させる、及び/又は血
清安定性を増大させる、及び/又は立体構造柔軟性を制限又は増大させるために、ポリペ
プチドの骨格内の1以上のアミド結合を置換することができる。
別の実施例では、ポリペプチド中の1以上のアミド結合(-CO-NH-)は、-CH2NH-、CH2S-、
-CH2CH2-、-CH=CH-(シス及びトランス)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、又は-CH2SO-などの、ア
ミド結合のアイソスターである結合と置き換えることができる。ポリペプチド中の1以上
のアミド結合はまた、例えば、還元型のアイソスター偽ペプチド結合によって置き換える
ことができる。Couderらの文献(1993年) Int.J.Peptide Protein Res.41:181〜184を参照
のこと。こうした置き換え、及びどのように実行するかは、当業者に公知である。
(アミノ酸置換)
ある種の実施態様では、ポリペプチド中で1以上のアミノ酸置換が行われる。次のもの
は、非限定的な例である:
a)分枝、環状、及び直鎖のアルキル、アルケニル、又はアルキニル置換を含めたC1〜C10
炭素からの、脂肪族側鎖によって置換されたアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン
、ノルロイシン、(S)-2-アミノ酪酸、(S)-シクロヘキシルアラニン、又は他の単純なα-
アミノ酸を含めたアルキル置換疎水性アミノ酸の置換;
b)フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン
、1-ナフチルアラニン、2-ナフチルアラニン、2-ベンゾチエニルアラニン、3-ベンゾチエ
ニルアラニン、ヒスチジンを含めた芳香族置換疎水性アミノ酸の置換(先に列挙した芳香
族アミノ酸(その実例は、2-、3-、又は4-アミノフェニルアラニン、2-、3-、又は4-クロ
ロフェニルアラニン、2-、3-、又は4-メチルフェニルアラニン、2-、3-、又は4-メトキシ
フェニルアラニン、5-アミノ-、5-クロロ-、5-メチル-、又は5-メトキシトリプトファン
、2'-、3'-、又は4'-アミノ-、2'-、3'-、又は4'-クロロ-、2、3、又は4-ビフェニルアラ
ニン、2'-、3'-、又は4'-メチル-、2-、3-、又は4-ビフェニルアラニン、及び2-又は3-ピ
リジルアラニンである)の、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲ
ン化(フルオロ、クロロ、ブロモ、若しくはヨード)、又はアルコキシ(C1〜C4から)置換形
を含めて)。
c)アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、2,3-ジアミノプロピオン酸、ホモアル
ギニンを含めた塩基性側鎖を含有するアミノ酸の置換(置換基が、α窒素又は遠位の窒素(
1又は複数)などのヘテロ原子上か、α炭素上(例えば、pro-R位置の)かにかかわらず、先
のアミノ酸のアルキル、アルケニル、又はアリール置換(C1〜C10分枝、線状、又は環状)
誘導体を含めて)。実例として役立つ化合物としては、N-ε-イソプロピル-リジン、3-(4-
テトラヒドロピリジル)-グリシン、3-(4-テトラヒドロピリジル)-アラニン、N,N-γ,γ'-
ジエチル-ホモアルギニンが挙げられる。アルキル基がα-炭素のpro-R位置を占める、α-
メチル-アルギニン、α-メチル-2,3-ジアミノプロピオン酸、α-メチル-ヒスチジン、α-
メチル-オルニチンなどの化合物も含まれる。アルキル芳香族、ヘテロ芳香族カルボン酸(
ここでは、ヘテロ芳香族基は、1以上の窒素、酸素、又は硫黄原子を、単独で又は組み合
わせて有する)、又は酸塩化物、活性なエステル、活性なアゾライド(azolide)、及び関連
する誘導体などの多くの周知の活性化された誘導体のいずれか、及びリジン、オルニチン
、又は2,3-ジアミノプロピオン酸から形成されるアミドも含まれる;
d)アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、アルキル、アリール、
アリールアルキル、及び2,4-ジアミノプロピオン酸のヘテロアリールスルホンアミド、オ
ルニチン、又はリジン、及びテトラゾール置換アルキルアミノ酸を含めた酸性アミノ酸の
置換;
e)アスパラギン、グルタミン、及びアスパラギン又はグルタミンのアルキル又は芳香族置
換誘導体を含めた側鎖アミド残基の置換;及び/又は
f)セリン、トレオニン、ホモセリン、2,3-ジアミノプロピオン酸、及びセリン又はトレオ
ニンのアルキル又は芳香族置換誘導体を含めたヒドロキシル含有アミノ酸の置換。
いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、1以上の天然に存在する、遺伝子によって
コードされないL-アミノ酸、合成のL-アミノ酸、又はアミノ酸のD-鏡像異性体を含む。例
えば、ポリペプチドは、D-アミノ酸のみを含むことができる。例えば、ある種の実施態様
では、ポリペプチドは、次の残基の1つ以上を含む:ヒドロキシプロリン、β-アラニン、o
-アミノ安息香酸、m-アミノ安息香酸、p-アミノ安息香酸、m-アミノメチル安息香酸、2,3
-ジアミノプロピオン酸、α-アミノイソ酪酸、N-メチルグリシン(サルコシン)、オルニチ
ン、シトルリン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、フェニ
ルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラ
ニン、3-ベンゾチエニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラ
ニン、3-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、1,2,
3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、β-2-チエニルアラニン、メチオニンスル
ホキシド、ホモアルギニン、N-アセチルリジン、2,4-ジアミノ酪酸、rho-アミノフェニル
アラニン、N-メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε-アミノヘキサン酸、ω-ア
ミノヘキサン酸、ω-アミノヘプタン酸、ω-アミノオクタン酸、ω-アミノデカン酸、ω-
アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノ
プロピオン酸、δ-アミノ吉草酸、及び2,3-ジアミノ酪酸。
(追加の改変)
いくつかの実施態様では、ポリペプチドに、システイン残基又はシステイン類似体が導
入されて、ジスルフィド結合を介する別のペプチドへの結合が提供される、又は、該ポリ
ペプチドの環化が提供される。システイン又はシステイン類似体を導入する方法は、当技
術分野で公知である;例えば、米国特許第8,067,532号を参照のこと。
他の実施態様では、ポリペプチドは、環化される。例えば、1以上のシステイン又はシ
ステイン類似体を、ポリペプチドに導入することができる。ここでは、導入されたシステ
イン又はシステイン類似体は、導入された第2のシステイン又はシステイン類似体と共に
、ジスルフィド結合を形成することができる。他の環化の手段としては、オキシムリンカ
ー又はランチオニンリンカーの導入が挙げられる;例えば、米国特許第8,044,175号を参照
のこと。閉環結合を形成することができるアミノ酸(又は非アミノ酸部分)のいかなる組み
合わせも、使用及び/又は導入することができる。閉環結合は、架橋の導入を可能にする
官能基をもつアミノ酸の任意の組み合わせを用いて(又はアミノ酸と-(CH2)n-CO-又は-(CH
2)n-C6H4-CO-を用いて)もたらすことができる。いくつかの例は、ジスルフィド、ジスル
フィド模倣体、例えば-(CH2)n-カルバ(carba)架橋など、チオアセタール、チオエーテル
架橋(シスタチオニン又はランチオニン)、及びエステル及びエーテルを含有する架橋であ
る。これらの例においては、nは、任意の整数であり得るが、しばしば10未満である。
他の改変の例としては、例えば、N-アルキル(若しくはアリール)置換(ψ[CONR])、又は
、ラクタム及び他の環状構造を構築するための骨格架橋が挙げられる。本開示のモジュレ
ーター化合物の他の誘導体としては、C-末端ヒドロキシメチル誘導体、O-修飾誘導体(例
えば、C-末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル)、N-末端修飾された誘導体(アルキルア
ミドなどの置換されたアミド、及びヒドラジドを含めて)が挙げられる。
ある場合では、ポリペプチド中の1以上のL-アミノ酸が、D-アミノ酸で置き換えられる
。
ある場合では、ポリペプチドは、レトロ-インベルソ類似体である(Sela及びZismanの文
献(1997年) FASEB J.11:449)。レトロ-インベルソペプチド類似体は、アミノ酸配列の方
向を逆転させ(レトロ)、かつ、例えばL-アミノ酸ではなくD-アミノ酸を使用して、その中
で1以上のアミノ酸のキラリティー、D-、又はL-を反転させた(インベルソ)、線状ポリペ
プチドの異性体である。例えば、Jamesonらの文献(1994年)Nature 368:744;及びBradyら
の文献(1994年) Nature 368:692を参照のこと。
ポリペプチドは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、又は小胞膜を横断する
ことを容易にする、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機
化合物を指す、「タンパク質形質導入ドメイン」(PTD)を含むことができる。別の分子に
接着したPTDは、その分子が膜を横断する、例えば、細胞外空間から細胞内空間、又は細
胞質ゾルから細胞小器官内に進むのを容易にする。いくつかの実施態様では、PTDは、ポ
リペプチドのアミノ終端と共有結合的に結合されるのに対し、他の実施態様では、PTDは
、ポリペプチドのカルボキシル終端と共有結合的に結合される。タンパク質形質導入ドメ
インの例としては、限定はされないが、最小のウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメ
イン(
Figure 2021008499
 を含むHIV-1 TATの残基47〜57に相当する);細胞に直接的に流入するのに十分ないくつか
のアルギニン(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、又は10〜50のアルギニン)を含むポリ
アルギニン配列;VP22ドメイン(Zenderらの文献(2002年)Cancer Gene Ther.9(6):489〜96)
;ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン(Noguchiらの文献(2003
年)Diabetes 52(7):1732〜1737);切断型ヒトカルシトニンペプチド(Trehinらの文献(2004
年) Pharm.Research 21:1248〜1256);ポリリジン(Wenderらの文献(2000年)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 97:13003〜13008);
Figure 2021008499
 トランスポータン
Figure 2021008499
 が挙げられる。PTDの例としては、限定はされないが、
Figure 2021008499
 3アルギニン残基から50アルギニン残基までのアルギニンホモポリマーが挙げられる。PTD
ドメインアミノ酸配列の例としては、限定はされないが、次のいずれかが挙げられる:
Figure 2021008499
 。
ポリペプチドのC-末端のアミノ酸のカルボキシル基COR3は、遊離の形態(R3=OH)で、又
は、例えば、ナトリウム、カリウム、又はカルシウム塩などの生理的に許容されるアルカ
リ又はアルカリ土類の塩の形態で存在することができる。カルボキシル基はまた、例えば
、メタノール、分枝又は非分枝C1〜C6-アルキルアルコール(例えば、エチルアルコール又
はtert-ブタノール)などの、第一級、第二級、又は第三級アルコールを用いて、エステル
化することもできる。カルボキシル基はまた、アンモニア、分枝又は非分枝C1〜C6-アル
キルアミン、又はC1〜C6ジ-アルキルアミン(例えば、メチルアミン又はジメチルアミン)
などの、第一級又は第二級アミンを用いてアミド化することもできる。
ポリペプチドのN-終端のアミノ酸NR1R2のアミノ基は、遊離の形態(R1=H及びR2=H)で、
又は、例えば塩化物又は酢酸塩などの生理的に 許容される塩の形態で存在することがで
きる。アミノ基はまた、R1=H、かつR2=アセチル、トリフルオロアセチル、又はアダマン
チルであるように、酸を用いてアセチル化することもできる。アミノ基は、例えば、Fmoc
、ベンジルオキシ-カルボニル(Z)、Boc、又はAllocなどの、ペプチド化学において通常使
用されるアミノ保護基によって保護された形態で存在することができる。アミノ基(ここ
ではR1及び/又はR2=C1-C6アルキル又はC2-C8アルケニル又はC7-C9アラルキルである)を、
N-アルキル化することができる。アルキル残基は、直鎖、分枝、又は環状(例えば、それ
ぞれ、エチル、イソプロピル、及びシクロヘキシル)であり得る。
(ポリペプチドの生成の方法)
本開示のポリペプチドは、組み換え及び非組み換え方法(例えば化学合成)を含めた、任
意の適切な方法によって生成することができる。
(A.化学合成)
ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は、液相又は固相を介して進めることが
できる。固相ペプチド合成(SPPS)は、非天然のアミノ酸及び/又はペプチド/タンパク質骨
格修飾の組み込みを可能にする。本開示のポリペプチドを合成するために、Fmoc及びBoc
などの、様々な形態のSPPSが利用可能である。化学合成の詳細は、当技術分野で公知であ
る(例えば、Ganesan A.の文献、2006年 Mini Rev.Med.Chem.6:3〜10;及びCamarero J.A.
らの文献、2005年 Protein Pept Lett.12:723〜8)。
固相ペプチド合成は、この後記載する通りに実施することができる。α官能基(Nα)及
びあらゆる反応性の側鎖は、酸不安定基又は塩基不安定基で保護される。保護基は、アミ
ド結合をつなぐための条件下で安定であるが、形成されているペプチド鎖を損なわずに、
容易に切断することができる。α-アミノ官能基のための適切な保護基としては、限定は
されないが、次のものが挙げられる:t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシカ
ルボニル(Z)、o-クロル(chlor)ベンジルオキシカルボニル、ビ-フェニルイソプロピルオ
キシカルボニル、tert-アミルオキシカルボニル(Amoc)、α、α-ジメチル-3,5-ジメトキ
シ-ベンジルオキシカルボニル、o-ニトロスルフェニル、2-シアノ-t-ブトキシ-カルボニ
ル、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソサイロ(d
ioxocylo)ヘキサ-1-イリデン)エチル(Dde) など。
適切な側鎖保護基としては、限定はされないが:アセチル、アリル(All)、アリルオキシ
カルボニル(Alloc)、ベンジル(Bzl)、ベンジルオキシカルボニル(Z)、t-ブチルオキシカ
ルボニル(Boc)、ベンジルオキシメチル(Bom)、o-ブロモベンジルオキシカルボニル、t-ブ
チル(tBu)、t-ブチルジメチルシリル、2-クロロベンジル、2-クロロベンジルオキシカル
ボニル(2-CIZ)、2,6-ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、1-(4,4-ジメ
チル-2,6-ジオキソシクロヘキサ-1-イリデン)エチル(Dde)、イソプロピル、4-メトキシ-2
,3-6-トリメチルベンジルスルホニル(Mtr)、2,3,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホ
ニル(Pmc)、ピバリル(pivalyl)、テトラヒドロピラン-2-イル、トシル(Tos)、2,4,6-トリ
メトキシベンジル、トリメチルシリル、及びトリチル(Trt)が挙げられる。
固相合成では、C-末端アミノ酸は、適切な支持材料にカップリングされる。適切な支持
材料は、合成プロセスの段階的縮合及び切断反応のための試薬及び反応条件に対して不活
性であり、かつ、使用されている反応媒体に溶解しないものである。市販品として入手で
きる支持材料の例としては、反応基及び/又はポリエチレングリコールで修飾されている
スチレン/ジビニルベンゼンコポリマー;クロロメチル化スチレン/ジビニルベンゼンコポ
リマー;ヒドロキシメチル化又はアミノメチル化スチレン/ジビニルベンゼンコポリマーな
どが挙げられる。ペプチド性の酸を調製することが意図される場合、4-ベンジルオキシベ
ンジル-アルコール(Wang-アンカー)又は塩化2-クロロトリチルを用いて誘導体化された、
ポリスチレン(1%)-ジビニルベンゼン又はTentaGel(登録商標)を使用することができる。
ペプチドアミドの場合、5-(4'-アミノメチル)-3',5'-ジメトキシフェノキシ)吉草酸(PAL-
アンカー)又はp-(2,4-ジメトキシフェニル-アミノメチル)-フェノキシ基(Rinkアミドアン
カー)を用いて誘導体化された、ポリスチレン(1%)ジビニルベンゼン又はTentaGel(登録商
標)を使用することができる。
高分子支持体への結合は、エタノール、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド(D
MF)、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、N-メチルピロリドン、又は類似の溶媒中で
、活性化試薬を添加して、室温又は高温(例えば、40℃から60℃)で、例えば2から72時間
の反応時間で、C-末端Fmoc保護アミノ酸を支持材料と反応させることによって実現するこ
とができる。
Nα保護アミノ酸(例えば、Fmocアミノ酸)と、PAL、Wang、又はRinkアンカーとのカップ
リングは、例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール又は1-ヒドロキシ-7-アザベンゾト
リアゾールの存在下又は非存在下で、カップリング試薬、例えば、N,N'-ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド(DCC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、若しくは他のカル
ボジイミド、テトラフルオロホウ酸2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラ
メチルウロニウム(TBTU)若しくは他のウロニウム塩、o-アシル-尿素、ヘキサフルオロリ
ン酸ベンゾトリアゾール-1-イル-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム(PyBOP)若しくは他の
ホスホニウム塩、N-ヒドロキシスクシン酸イミド、他のN-ヒドロキシイミド、又はオキシ
ムの助けを借りて、例えば、例えばジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、トリエチルアミ
ン、又はN-メチルモルホリン(例えばジイソプロピルエチルアミン)などの塩基を添加して
又は添加せずに、HOBtを添加したTBTUの助けを借りて、2から72時間の反応時間で(例えば
、ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドン、又はジクロロメタン、例えばジメチルホ
ルムアミドなどの溶媒中で、1.5から3倍過剰のアミノ酸及びカップリング試薬中で、例え
ば、2倍過剰で、約10℃から50℃の温度、例えば25℃で、3時間)実施することができる。
カップリング試薬の代わりに、先に記載した条件下で、活性なエステル(例えば、ペン
タフルオロフェニル、p-ニトロフェニル、など)、Nα-Fmoc-アミノ酸の対称無水物、その
酸塩化物、又は酸フッ化物を使用することも可能である。
Nα保護アミノ酸(例えば、Fmocアミノ酸)は、DIEAを添加したジクロロメタン中で(この
溶媒及びこの塩基の使用に限定されないが)、10から120分、例えば20分の反応時間を用い
て、2-クロロトリチル樹脂とカップリングさせることができる。
保護されたアミノ酸の連続的カップリングは、一般的に自動ペプチド合成装置において
、ペプチド合成における従来の方法に従って実施することができる。例えば、ピペリジン
のジメチルホルムアミド溶液(10%から50%)での5から20分間の(例えば、50%ピペリジンのD
MF溶液での2×2分、及び20%ピペリジンのDMF溶液での1×15分の)処理による、固相上にカ
ップリングさせたアミノ酸のNα-Fmoc保護基の切断後、次に保護されるアミノ酸(3から10
倍過剰、例えば、10倍過剰)を、ジクロロメタン、DMF、又は2つの混合物などの不活性な
非水性の極性溶媒中で、約10℃から50℃の温度で、例えば25℃で、先のアミノ酸とカップ
リングさせる。第1のNα-Fmocアミノ酸をPAL、Wang、又はRinkアンカーとカップリングさ
せるための先に言及した試薬が、カップリング試薬として適している。保護されたアミノ
酸の活性なエステル、又はその塩化物若しくはフッ化物若しくは対称無水物も、代替とし
て使用することができる。
固相合成の最後に、支持材料からペプチドを切断し、同時に、側鎖保護基を切断する。
切断は、5%〜20% V/Vのスカベンジャー、例えばジメチルスルフィド、エチルメチルスル
フィド、チオアニソール、チオクレゾール、m-クレゾール、アニソール、エタンジチオー
ル、フェノール、又は水、例えば、15% v/vジメチルスルフィド/エタンジチオール/m-ク
レゾール1:1:1を添加した、トリフルオロ酢酸又は他の強酸性媒体を用いて、0.5から3時
間、例えば2時間以内に実施することができる。完全に保護された側鎖をもつペプチドは
、氷酢酸/トリフルオロエタノール/ジクロロメタン2:2:6を用いて2-クロロトリチルアン
カーを切断することによって得られる。保護されたペプチドは、シリカゲル上でのクロマ
トグラフィーによって精製することができる。ペプチドが、Wang アンカーを介して固相
に結合される場合、また、C-末端アルキルアミド化を伴うペプチドを得ることが意図され
る場合、切断は、アルキルアミン又はフルオロアルキルアミンを用いるアミノリシスによ
って実施することができる。アミノリシスは、約-10℃から50℃(例えば、約25℃)の温度
、かつ約12から24時間(例えば、約18時間)の反応時間で実施される。さらに、ペプチドは
、例えばメタノールでの再エステル化によって、支持体から切断することができる。
得られた酸性の溶液を、3から20倍量の冷エーテル又はn-ヘキサン、例えば、10倍過剰
のジエチルエーテルと混合して、ペプチドを沈殿させ、したがって、エーテル中に残存す
るスカベンジャーと切断された保護基とを分離することができる。ペプチドを、氷酢酸か
ら数回、再沈殿させることによって、さらなる精製を実施することができる。得られた沈
殿を、水又はtert-ブタノール又はこれらの2種の溶媒の混合物、例えば、tert-ブタノー
ル/水の1:1混合物に溶解し、凍結乾燥することができる。
得られたペプチドを、アセテート形態の弱塩基性樹脂に対するイオン交換;非誘導体化
ポリスチレン/ジビニルベンゼンコポリマー(例えば、Amberlite(登録商標)XAD)上での疎
水性吸着クロマトグラフィー;シリカゲル上での吸着クロマトグラフィー;例えばカルボキ
シメチルセルロース上での、イオン交換クロマトグラフィー;例えばSephadex(登録商標)G
-25上での、分配クロマトグラフィー;向流分配クロマトグラフィー;又は、高圧液体クロ
マトグラフィー(HPLC)、例えば、オクチル又はオクタデシルシリルシリカ(ODS)相上での
逆相HPLCを含めた、様々なクロマトグラフィー方法によって精製することができる。
(B.組み換え産生)
組み換え技術を使用してポリペプチドを産生する場合、ポリペプチドは、任意の適切な
構築物及び任意の適切な宿主細胞(原核又は真核細胞、例えば、それぞれ細菌(例えばE.co
li)又は酵母宿主細胞であり得る)を使用して、細胞内タンパク質として又は分泌タンパク
質として産生することができる。宿主細胞として使用することができる真核細胞の他の例
としては、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び/又は植物細胞が挙げられる。哺乳類宿主細胞が
使用される場合、該宿主細胞としては、ヒト細胞(例えば、HeLa、293、H9、及びJurkat細
胞);マウス細胞(例えば、NIH3T3、L細胞、及びC127細胞);霊長類細胞(例えば、Cos 1、Co
s 7、及びCV1)、及びハムスター細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(Chinese ham
ster ovary)(CHO)細胞)が含まれ得る。
ポリペプチドの発現に適した様々な宿主-ベクターシステムを、当技術分野で公知の標
準の手順に従って用いることができる。例えば、例えば、Sambrookらの文献、1989年、「
分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、Cold Sprin
g Harbor Press社、New York;及びAusubelらの文献、1995年、「分子生物学の最新プロト
コル(Current Protocols in Molecular Biology)」(Wiley and Sons社編)を参照のこと。
宿主細胞への遺伝子材料の導入のための方法としては、例えば、形質転換、電気穿孔、接
合、リン酸カルシウム方法などが挙げられる。導入のための方法は、導入されたポリペプ
チドをコードしている核酸の安定な発現を提供するように選択することができる。ポリペ
プチドをコードしている核酸は、遺伝性のエピソーム要素(例えば、プラスミド)として提
供することもできるし、ゲノムに組み込むこともできる。対象のポリペプチドの生成に使
用するための様々な適切なベクターは、市販品として入手できる。
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供することもできるし、宿主細胞ゲノ
ムへの組み込みを提供することもできる。発現ベクターは、転写及び翻訳調節配列を提供
する、また、誘導性の又は構成的な発現を提供することができる。ここでは、コード領域
は、転写開始領域及び転写及び翻訳停止領域の転写制御下で、作動可能に連結されている
。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、限定はされないが、プロモーター配列、リボ
ソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、及びエンハンサー又は
アクチベーター配列が含まれ得る。プロモーターは、構成的又は誘導性のいずれかであり
得、また、強力な構成的プロモーター(例えば、T7)であり得る。
発現構築物は一般に、対象のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するための
、プロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を有する。ベクターを含有する細
胞の選択を容易にするために、発現宿主において作動する選択可能マーカーが存在するこ
とができる。さらに、発現構築物は、追加のエレメントを含むことができる。例えば、発
現ベクターは、1つ又は2つの複製システムを有することができ、したがって、発現のため
の生物において、例えば哺乳類又は昆虫細胞において、また、クローニング及び増幅のた
めの原核生物宿主において維持されることが可能になる。さらに、発現構築物は、形質転
換された宿主細胞の選択を可能にするための、選択可能マーカー遺伝子を含有することが
できる。選択可能遺伝子は、当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異な
ることとなる。
タンパク質の単離及び精製は、当技術分野で公知の方法に従って実現することができる
。例えば、タンパク質は、タンパク質を構成的に及び/又は誘発時に発現するように遺伝
子改変された細胞のライセートから、又は合成の反応混合物から、免疫アフィニティ精製
によって単離することができる。これは一般に、試料を抗タンパク質抗体と接触させるこ
とと、洗浄して非特異的に結合した材料を除去することと、特異的に結合したタンパク質
を溶出することを含む。単離されたタンパク質は、透析及びタンパク質精製方法において
通常用いられる他の方法によって、さらに精製することができる。一実施態様では、タン
パク質は、金属キレートクロマトグラフィー方法を使用して単離することができる。タン
パク質は、単離を容易にするための改変を含有することができる。
ポリペプチドは、実質的に純粋な又は単離された(例えば、他のポリペプチドを含まな
い)形態で調製することができる。ポリペプチドは、存在し得る他の成分(例えば、他のポ
リペプチド又は他の宿主細胞成分)に対して、該ポリペプチドについて濃縮された組成物
中に存在することができる。例えば、精製されたポリペプチドは、該ポリペプチドが、他
の発現されたタンパク質を実質的に含まない組成物中に存在する、例えば、組成物の90%
未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、又は1%未満が
他の発現されたタンパク質で構成されるように提供することができる。
(治療的及び予防的使用)
本明細書で提供されるのはまた、薬剤又はその組成物の投与によって、高血糖、高イン
スリン血症、耐糖能障害、グルコース代謝障害、肥満及び他の体重異常、並びに他の代謝
性の及び代謝関連の疾患、障害、及び状態を治療又は予防するための方法である。さらに
、本明細書に記載した通り、本開示は、他の疾患、障害、及び状態の宿主を治療又は予防
するための方法を提供する。こうした方法はまた、例えば、症状の重さ又は頻度を低下さ
せることによって、疾患、障害、又は状態と関連する1以上の症状に対する有利な効果を
有することができる。ある種の実施態様では、該方法は、疾患又は障害を治療するための
方法である。他の実施態様では、該方法は、疾患又は障害を予防するための方法である。
ある種の実施態様では、本開示は、代謝障害を患う対象を治療する(又は、ある種の状
況では予防する)方法であって、代謝障害を患う対象を提供する(ここでは、該対象は、FG
F19誘発性癌性状態の徴候を呈する)ことと、候補FGF19バリアントポリペプチドのプール
から本明細書に記載した通りに特定された治療有効量のFGF19バリアントを該対象に投与
することとを含み、ここでは、該対象における代謝障害の改善が存在する、前記方法を意
図する。
疾患、障害、及び状態の非限定的な例としては、以下が挙げられる:1)糖尿病(I型及び2
型)、妊娠性糖尿病、高血糖、インスリン抵抗性、異常なグルコース代謝、「糖尿病予備
軍」(空腹時血糖異常(IFG)又は耐糖能異常(IGT)) を含めた、グルコース利用障害及びそ
れに関連する後遺症、並びに、例えば膵β細胞破壊などの組織病理学的変化を含めた、高
血糖状態に関連する若しくは高血糖状態起因する他の生理的障害。さらなる高血糖関連の
障害としては、腎損傷(例えば、尿細管損傷又は腎症)、肝変性、眼損傷(例えば、糖尿病
性網膜症又は白内障)、及び糖尿病性足病変;2)脂質異常症及びその後遺症、例えばアテロ
ーム性動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管障害など;3)肥満及び体重の上昇などの、メタボ
リックシンドロームと関連し得る他の状態(限定はされないが非アルコール性脂肪肝疾患(
NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、及び多嚢胞卵巣症候群(PCOS)などの、その合
併性の状態を含めて)が挙げられ、また、血栓症、凝固能亢進状態及び血栓形成促進状態(
動脈性及び静脈性)、高血圧、心血管疾患、脳卒中、及び心不全;4)アテローム性動脈硬化
症、慢性炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、喘息、紅斑性狼瘡、関節
炎、又は他の炎症性リウマチ障害を含めた、炎症反応が関与する障害又は状態;5)例えば
脂肪肉腫、固形腫瘍、及び新生物を含めた、脂肪細胞腫瘍、脂肪腫様癌腫などの、細胞周
期又は細胞分化過程の障害;6)アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、進行
性多巣性白質脳症、及びギランバレー症候群を含めた、中枢神経及び末梢神経の神経変性
疾患及び/又は脱髄障害、及び/又は神経炎症過程に関与する神経系疾患、及び/又は他の
末梢神経障害;7)紅斑性-扁平性皮膚症を含めた、皮膚及び皮膚科的障害、及び/又は創傷
治癒過程の障害；並びに、8)他の障害、例えばシンドロームX、変形性関節症、及び急性
呼吸促迫症候群も挙げられる。
本明細書で提供される方法によって、対象が、高血糖、高インスリン血症、耐糖能障害
、及び/又はグルコース異常の治療又は予防のための候補であり得るかどうかを決定する
ために、当技術分野で公知の様々な診断方法(例えば、空腹時血漿グルコース(FPG)評価及
び経口糖負荷試験(oGTT))を利用することができる。
本明細書で提供される方法によって、対象が、体重異常(例えば、肥満)の治療又は予防
のための候補であり得るかどうかを決定するために、限定はされないが、病因及び対象の
状態の程度(例えば、対象が、基準の健康な個人と比較してどの程度体重超過しているか)
などのパラメータが評価されるべきである。例えば、〜25から〜29.9kg/m2のBMIを有する
成人は、過体重(肥満予備軍)であるとみなすことができるのに対し、〜30kg/m2以上のBMI
を有する成人は、肥満であるとみなすことができる。過体重である及び/又は質の悪い食
事(例えば、脂肪又はカロリーが高い食事)を摂取している対象については、本開示の1以
上のポリペプチドを含む一連の治療法を開始する前に、改変された食事習慣及び/又は運
動療法を最初に実践及び効果を評価することが一般的である。
本明細書で提供されるのはまた、代謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態を
患う対象(例えば、ヒトなどの動物)を治療する方法であって、(i)代謝障害を患う試験対
象が、FGF19バリアントでの治療の候補であるかどうかを決定することを含む前記方法で
あって、(a)癌性状態の徴候を有する試験対象であって、代謝障害を患う前記試験対象を
提供することと、(b)FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投
与する(ここでは、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団に
おいて癌性状態を誘発するのに十分である)ことと、(c)前記試験対象において癌性状態の
徴候が増強されるかどうかを決定する(ここでは、癌性状態の徴候の増強の非存在が、前
記試験対象がFGF19バリアントでの治療の候補であることを示す)こととを含み、前記試験
対象における癌性状態の徴候の増強が存在しないならば、(ii)前記対象(例えば、ヒトな
どの動物)にFGF19バリアントを続いて投与することをさらに含む、前記方法である。ある
種の実施態様では、FGF19バリアントのその後の投与は、対象(例えば、ヒトなどの動物)
において代謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態の治療をもたらす治療有効量
である。
本明細書で提供されるのはまた、代謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態を
患う対象(例えば、ヒトなどの動物)を治療する方法であって、(i)代謝障害を患う試験対
象が、FGF19バリアントでの治療の候補であるかどうかを決定することを含む前記方法で
あって、(a)癌性状態の徴候を有する試験対象であって、代謝障害を患う前記試験対象を
提供することと、(b)FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投
与する(ここでは、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団に
おいて癌性状態を誘発するのに十分である)ことと、(c)前記試験対象において癌性状態の
徴候が低減されるかどうかを決定する(ここでは、癌性状態の徴候の低減が、前記試験対
象がFGF19バリアントでの治療の候補であることを示す)こととを含み、前記試験対象にお
ける癌性状態の徴候の低減が存在するならば、(ii)前記対象(例えば、ヒトなどの動物)に
FGF19バリアントを続いて投与することをさらに含む、前記方法である。ある種の実施態
様では、FGF19バリアントのその後の投与は、対象(例えば、ヒトなどの動物)において代
謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態の治療をもたらす治療有効量である。
本明細書で提供されるのはまた、代謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態を
患う対象(例えば、ヒトなどの動物)を治療する方法であって、(i)FGF19バリアントが、代
謝障害を患う試験対象を治療するための候補であるかどうかを決定することを含む前記方
法であって、(a)FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを、代謝障害を患う前記試
験対象に共投与する(ここでは、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は
、参照集団において癌性状態を誘発するのに十分である)ことと、(b)前記試験対象におい
て、癌性状態の徴候が観察されるかどうかを決定する(ここでは、癌性状態の徴候の非存
在が、FGF19バリアントが、前記試験対象の治療のための候補であることを示す)ことを含
み、癌性状態の徴候が存在しないならば、(ii)前記対象(例えば、ヒトなどの動物)にFGF1
9バリアントを続いて投与することをさらに含む、前記方法である。ある種の実施態様で
は、FGF19バリアントのその後の投与は、対象(例えば、ヒトなどの動物)における代謝性
の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態の治療をもたらす治療有効量である。
本明細書で提供されるのはまた、代謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態を
患う対象(例えば、ヒトなどの動物)を治療する方法であって、(i)FGF19バリアントが、代
謝障害を患う試験対象を治療するための候補であるかどうかを決定することを含む前記方
法であって、(a)代謝障害を患う試験対象であって、癌性状態の徴候を有する試験対象を
提供することと、(b)FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投
与する(ここでは、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団に
おいて癌性状態を増悪させるのに十分である)ことと、(c)前記試験対象において、癌性状
態の徴候が増強されるかどうかを決定する(ここでは、癌性状態の徴候の増悪の非存在が
、FGF19バリアントが、前記試験対象の治療のための候補であることを示す)ことを含み、
前記試験対象における癌性状態の徴候の増強が存在しないならば、(ii)前記対象(例えば
、ヒトなどの動物)にFGF19バリアントを続いて投与することをさらに含む、前記方法であ
る。ある種の実施態様では、FGF19バリアントのその後の投与は、対象(例えば、ヒトなど
の動物)における代謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態の治療をもたらす治
療有効量である。いくつかの実施態様では、癌性状態の1以上の徴候は、試験対象におい
て低減される。
本明細書で提供されるのはまた、代謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態を
患う対象を治療する方法であって、(a)代謝障害を患う対象(ここでは、該対象は、FGF19
誘発性癌性状態の徴候を呈する)を提供することと、(b)本明細書で提供される方法又はモ
デルのいずれか1つにおいて特定される治療有効量のFGF19バリアントを該対象に投与する
こととを含む(ここでは、該対象における代謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は
状態の改善が存在する)前記方法である。
本明細書で提供される方法の、ある種の実施態様では、対象は、動物である。他の実施
態様では、対象は、ヒトである。いくつかの実施態様では、癌性状態は、腫瘍である。あ
る種の実施態様では、腫瘍は、結腸腫瘍又は肝腫瘍である。いくつかの実施態様では、代
謝性の若しくは代謝関連の疾患、障害、又は状態は、代謝障害である。いくつかの実施態
様では、代謝障害は、高血糖状態、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、
肥満、及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される。一実施態様では、高血
糖状態は、糖尿病である。別の実施態様では、治療は、代謝障害の改善をもたらす。ある
種の実施態様では、代謝障害の改善は、血糖の低下である。他の実施態様では、対象にお
ける代謝障害の改善は、体重の減少である。ある種の実施態様では、対象における代謝障
害の改善は、インスリンの低下である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、例えば本明細書で提供されるFGF19バリア
ントを使用して、FGF19の発癌活性を弱める方法である。いくつかの実施態様では、FGF19
を発現している細胞が、本明細書で提供されるFGF19バリアントと接触される。いくつか
の実施態様では、FGF19バリアントは、M70である。ある種の実施態様では、本明細書で提
供されるのは、対象におけるFGF19の発癌活性を弱める方法であって、該対象に治療有効
量のFGF19バリアントを投与し、それによって、該対象におけるFGF19の発癌活性を弱める
ことを含む前記方法である。いくつかの実施態様では、提供されるのは、対象において、
FGF19依存性の疾患、障害、若しくは状態、又はこれらの症状を予防する方法であって、
治療有効量のFGF19バリアントを該対象に投与することを含み、ここでは、該疾患、障害
、状態、又はその症状が、該対象において予防される、前記方法である。他の実施態様で
は、提供されるのは、対象において、FGF19依存性の疾患、障害、若しくは状態、又はこ
れらの症状を治療する方法であって、治療有効量のFGF19バリアントを該対象に投与する
ことを含み、ここでは、該疾患、障害、状態、又はその症状が、該対象において治療され
る、前記方法である。
ある種の実施態様では、対象は、代謝障害、及び/又は癌性状態の徴候を有する。ある
種の実施態様では、FGF19依存性の疾患、障害、又は状態は、癌又は腫瘍である。いくつ
かの実施態様では、癌又は腫瘍は、肝臓、結腸、前立腺、又は肺の癌又は腫瘍である。い
くつかの実施態様では、癌又は腫瘍は、良性である。他の実施態様では、癌又は腫瘍は、
悪性である。
ある種の実施態様では、対象は、FGF19依存性の疾患、障害、又は状態を発症するリス
クを有する又はリスクがある。いくつかの実施態様では、FGF19依存性の疾患、障害、又
は状態は、肝硬変又は胆汁うっ滞などの、肝臓(肝細胞性)疾患、障害、又は状態である。
いくつかの実施態様では、肝臓疾患又は障害は、慢性の肝臓疾患又は障害である。いくつ
かの実施態様では、FGF19依存性の疾患、障害、又は状態は、HCCなどの癌又は腫瘍である
。他の実施態様では、FGF19依存性の疾患、障害、又は状態は、肝硬変又は胆汁うっ滞な
どの肝臓疾患、障害、又は状態ではない。いくつかの実施態様では、FGF19依存性の疾患
、障害、又は状態は、HCCなどの癌又は腫瘍ではない。いくつかの実施態様では、FGF19依
存性の疾患、障害、又は状態は、結腸癌又は腫瘍である。ある種の実施態様では、結腸癌
又は腫瘍は、結腸腺癌である。いくつかの実施態様では、FGF19依存性の疾患、障害、又
は状態は、前立腺癌又は腫瘍である。さらに他の実施態様では、FGF19依存性の疾患、障
害、又は状態は、肺癌又は腫瘍である。ある種の実施態様では、肺癌又は腫瘍は、肺扁平
上皮癌である。いくつかの実施態様では、FGF19は、原発性又は転移性の癌又は腫瘍細胞
において発現される。ある種の実施態様では、FGF19依存性の疾患、障害、又は状態は、
前癌性である。例えば、肝硬変及び胆汁うっ滞は、時として、HCCなどの肝臓癌につなが
ることがあり、こうした肝臓疾患及び障害を治療又は予防する方法が意図される。ある種
の実施態様では、対象は、こうした肝臓疾患及び障害の予防又は治療の必要がある対象で
ある。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントの投与は、対象における胆汁酸恒常性
を維持する。
本明細書で提供されるのはまた、対象における、FGF19依存性の癌又は腫瘍などの癌又
は腫瘍、又はこれらの症状を治療する方法であって、治療有効量のFGF19バリアントを該
対象に投与することを含む前記方法である。ある種の実施態様では、投与は、対象におけ
る癌、腫瘍、又はこれらの症状の改善をもたらす。いくつかの実施態様では、該方法は、
腫瘍数、腫瘍サイズ、又は腫瘍重量の低下をもたらす。本明細書で提供されるのはまた、
対象におけるFGF19依存性の癌又は腫瘍などの癌又は腫瘍、又はこれらの症状を予防する
方法であって、治療有効量のFGF19バリアントを該対象に投与することを含む前記方法で
ある。いくつかの実施態様では、投与は、対象における癌、腫瘍、又はこれらの症状の予
防をもたらす。いくつかの実施態様では、該方法は、腫瘍数、腫瘍サイズ、又は腫瘍重量
の低下をもたらす。具体的実施態様では、癌又は腫瘍は、FGF19依存性の癌又は腫瘍であ
る。ある種の実施態様では、癌又は腫瘍は、肝細胞癌である。いくつかの実施態様では、
癌又は腫瘍は、肝細胞癌ではない。一実施態様では、癌又は腫瘍は、結腸癌又は腫瘍であ
る。いくつかの実施態様では、癌又は腫瘍は、前立腺癌又は腫瘍である。ある種の実施態
様では、癌又は腫瘍は、肺癌又は腫瘍である。ある種の実施態様では、FGF19バリアント
は、配列番号:1に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドである。いくつかの実施態様で
は、FGF19バリアントは、配列番号:1に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドである
。ある種の実施態様では、対象は、その必要がある対象である。
本明細書で提供される治療的及び予防的方法のいずれかを、本明細書で提供されるモデ
ル又は他の方法のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。
本明細書で提供される方法のある種の実施態様では、FGF19バリアントは、M5、M6、M7
、M14、M15、M32、M36、M43、M52、M53、M67、M68、M69、M70、M75、M76、M77、M83、M84
、M140、M144、M145、M146、及びM160からなる群から選択される。一実施態様では、FGF1
9バリアントは、M5である。別の実施態様では、FGF19バリアントは、M6である。いくつか
の実施態様では、FGF19バリアントは、M7である。一実施態様では、FGF19バリアントは、
M14である。別の実施態様では、FGF19バリアントは、M15である。他の実施態様では、FGF
19バリアントは、M32である。一実施態様では、FGF19バリアントは、M36である。別の実
施態様では、FGF19バリアントは、M43である。他の実施態様では、FGF19バリアントは、M
52である。さらに他の実施態様では、FGF19バリアントは、M53である。いくつかの実施態
様では、FGF19バリアントは、M67である。一実施態様では、FGF19バリアントは、M68であ
る。別の実施態様では、FGF19バリアントは、M69である。いくつかの実施態様では、FGF1
9バリアントは、M70である。一実施態様では、FGF19バリアントは、M75である。別の実施
態様では、FGF19バリアントは、M76である。他の実施態様では、FGF19バリアントは、M77
である。さらに他の実施態様では、FGF19バリアントは、M83である。一実施態様では、FG
F19バリアントは、M84である。別の実施態様では、FGF19バリアントは、M140である。他
の実施態様では、FGF19バリアントは、M144である。さらに他の実施態様では、FGF19バリ
アントは、M145である。一実施態様では、FGF19バリアントは、M146である。いくつかの
実施態様では、FGF19バリアントは、M160である。他の実施態様では、2つ以上の前述のFG
F19バリアントの任意の組み合わせも意図される。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:
5〜29のいずれか1つ;又はその部分配列若しくは断片に示したアミノ酸配列を含む。本明
細書で提供される方法の他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:5〜29のいず
れか1つ;又はその部分配列若しくは断片に示したアミノ酸配列からなる。ある種の実施態
様では、N-末端のR残基は、欠失している。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは
、配列番号:5を含む又は配列番号:5からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、
配列番号:6を含む又は配列番号:6からなる。一実施態様では、FGF19バリアントは、配列
番号:7を含む又は配列番号:7からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番
号:8を含む又は配列番号:8からなる。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:
9を含む又は配列番号:9からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、配列番
号:10を含む又は配列番号:10からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番
号:11を含む又は配列番号:11からなる。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配列番
号:12を含む又は配列番号:12からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリアントは、
配列番号:13を含む又は配列番号:13からなる。他の実施態様では、FGF19バリアントは、
配列番号:14を含む又は配列番号:14からなる。一実施態様では、FGF19バリアントは、配
列番号:15を含む又は配列番号:15からなる。別の実施態様では、FGF19バリアントは、配
列番号:16を含む又は配列番号:16からなる。いくつかの実施態様では、FGF19バリアント
は、配列番号:17を含む又は配列番号:17からなる。他の実施態様では、FGF19バリアント
は、配列番号:18を含む又は配列番号:18からなる。さらに他の実施態様では、FGF19バリ
アントは、配列番号:19を含む又は配列番号:19からなる。いくつかの実施態様では、FGF1
9バリアントは、配列番号:20を含む又は配列番号:20からなる。一実施態様では、FGF19バ
リアントは、配列番号:21を含む又は配列番号:21からなる。いくつかの実施態様では、FG
F19バリアントは、配列番号:22を含む又は配列番号:22からなる。他の実施態様では、FGF
19バリアントは、配列番号:23を含む又は配列番号:23からなる。別の実施態様では、FGF1
9バリアントは、配列番号:24を含む又は配列番号:24からなる。いくつかの実施態様では
、FGF19バリアントは、配列番号:25を含む又は配列番号:25からなる。他の実施態様では
、FGF19バリアントは、配列番号:26を含む又は配列番号:26からなる。さらに他の実施態
様では、FGF19バリアントは、配列番号:27を含む又は配列番号:27からなる。いくつかの
実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:28を含む又は配列番号:28からなる。他の
実施態様では、FGF19バリアントは、配列番号:29を含む又は配列番号:29からなる。ある
種の実施態様では、FGF19バリアントは、前述の配列のいずれか1つを含む又は前述の配列
のいずれか1つからなり、ここでは、N-末端のR残基は、欠失している。いくつかの実施態
様では、FGF19バリアントは、前述の配列のいずれかの部分配列を含む又は前述の配列の
いずれかの部分配列からなる。他の実施態様では、2つ以上の前述のFGF19バリアントの任
意の組み合わせも意図される。
(医薬組成物)
本開示のポリペプチドは、対象への投与に適した組成物の形態であり得る。一般に、こ
うした組成物は、1以上のポリペプチドと、1以上の医薬として許容し得る又は生理的に許
容し得る希釈剤、担体、又は賦形剤を含む「医薬組成物」である。ある種の実施態様では
、該ポリペプチドは、治療的に許容し得る量で存在する。該医薬組成物は、本開示の方法
において使用することができる;したがって、例えば、該医薬組成物は、本明細書に記載
された治療的及び予防的方法並びに使用を実施するために、対象にエクスビボ又はインビ
ボで投与することができる。
本開示の医薬組成物は、意図される投与方法又は投与経路と適合するように製剤化する
ことができ;投与経路の例は、本明細書に説明している。さらに、本医薬組成物は、本開
示によって意図される通りの疾患、障害、及び状態を治療又は予防するために、本明細書
に記載した通りの他の治療的に活性な薬剤又は化合物(例えばグルコース降下剤)と組み合
わせて使用することができる。
医薬組成物は、一般的に、本開示によって意図される治療有効量のポリペプチドの少な
くとも1種と、医薬としてかつ生理的に許容し得る1種以上の製剤物質とを含む。医薬とし
て許容し得る又は生理的に許容し得る適切な希釈剤、担体、又は賦形剤としては、限定は
されないが、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸及び硫酸水素ナトリウム)、保存剤(例え
ば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチル又はn-プロピル、p-ヒドロキシ安息香
酸エステル)、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、界面活性剤、緩衝液
、ビヒクル、希釈剤、及び/又は補助剤が挙げられる。例えば、適切なビヒクルは、非経
口的投与のための医薬組成物に一般的な他の材料がおそらく添加された、生理食塩水溶液
又はクエン酸緩衝生理食塩水であり得る。中性の緩衝生理食塩水又は血清アルブミンと混
合した生理食塩水は、さらなるビヒクル例である。当業者は、医薬組成物及び剤形におい
て使用することができる様々な緩衝液を容易に認識するであろう。典型的な緩衝液として
は、限定はされないが、医薬として許容し得る弱酸、弱塩基、又はそれらの混合物が挙げ
られる。例としては、緩衝成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、
アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びこれらの塩などの、水溶性材料で
あり得る。許容し得る緩衝薬としては、例えば、トリス緩衝液、N-(2-ヒドロキシエチル)
ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)
、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンス
ルホン酸(MOPS)、及びN-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(
TAPS)が挙げられる。
医薬組成物は、製剤化した後、液剤、懸濁剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、又は脱水若しく
は凍結乾燥された散剤として、滅菌バイアル中で保管することができる。こうした製剤は
、すぐに使える形態、使用前に再構成を必要とする凍結乾燥形態、使用前に希釈を必要と
する液体形態、又は他の許容し得る形態のいずれかで保管することができる。いくつかの
実施態様では、医薬組成物は、単回使用容器(例えば、単回使用のバイアル、アンプル、
注射器、又は自己注射器(例えばEpiPen(登録商標)に類似したもの))中で提供されるのに
対し、他の実施態様では、反復使用容器(例えば、反復使用バイアル)が提供される。埋め
込み体(例えば埋め込み型ポンプ)及びカテーテルシステム(これらはどちらも当業者に周
知である)を含めた、任意の薬物送達器具を使用して、ポリペプチドを送達することがで
きる。一般に皮下又は筋肉内に投与されるデポ注射剤も、本明細書に開示するポリペプチ
ドを規定された期間にわたって放出するために利用することができる。デポ注射剤は通常
、固体-基剤又は油-基剤のいずれかであり、一般に、本明細書に説明した製剤成分の少な
くとも1つを含む。当業者は、デポ注射剤の可能な製剤及び使用について熟知している。
ある種の実施態様では、Nano Precision Medical社のデポ送達技術(Nano Precision Medi
cal社;Emeryville,CA)の使用が意図される。この技術は、0次放出速度の巨大分子(タンパ
ク質及びペプチド治療剤など)を生成するチタニアナノチューブ膜を利用する。この生体
適合性の膜は、治療用巨大分子の長期の(例えば最大1年の)一定速度の送達を提供する、
小さい皮下埋め込み体内に収められる。この技術は、例えば、II型糖尿病の治療のための
GLP-1アゴニストの送達について、現在評価中である。
医薬組成物は、無菌の水性又は油性の注射用懸濁剤の形態であり得る。この懸濁剤は、
本明細書に言及した適切な分散若しくは湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、公知の技術に従
って製剤化することができる。無菌の注射用調製物はまた、無毒の非経口的に許容し得る
希釈剤又は溶媒中の、例えば1,3-ブタンジオールの溶液としての、無菌の注射用液剤又は
懸濁剤であり得る。用いることができる許容し得る希釈剤、溶媒、及び分散媒としては、
水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、クレモフォールEL(商標)(BASF社,Parsippany
,NJ)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、
プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール)、並びにこれらの適切な混合
物が挙げられる。さらに、溶媒又は懸濁媒として、従来、無菌の不揮発性油が用いられて
いる。この目的のために、合成のモノ-又はジグリセリドを含めた、いかなる無刺激性の
不揮発性油も用いることができる。さらに、注射剤の調製においては、オレイン酸などの
脂肪酸の使用が認められる。特定の注射用製剤の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物
質(例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチン)を含めることによって実現する
ことができる。
活性成分を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、トローチ、舐剤、水性若
しくは油性懸濁剤、分散可能な散剤若しくは顆粒剤、乳剤、硬若しくは軟カプセル、又は
シロップ、液剤、マイクロビーズ、又はエリキシルとしての、経口使用に適した形態であ
り得る。経口使用が意図される医薬組成物は、医薬組成物の製造に関して当技術分野で公
知の任意の方法に従って調製することができ、こうした組成物は、医薬として洗練され且
つ口当たりの良い調製物を提供するために、例えば甘味剤、着香料、着色剤、及び保存剤
などの1種以上の作用物質を含有することができる。錠剤、カプセルなどは、錠剤の製造
に適した無毒の医薬として許容し得る賦形剤と混合した活性成分を含有する。これらの賦
形剤は、希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、又
はリン酸ナトリウムなど;造粒剤及び崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、又はアルギ
ン酸など;結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、又はアカシアゴムなど;並びに滑沢剤、例
えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクなどであり得る。
経口投与に適した錠剤、カプセルなどは、コーティングされなくてもよいし、消化管内
での崩壊及び吸収を遅延させ、それによって持続作用を提供するために、公知の技術によ
ってコーティングすることもできる。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステア
リン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。これらはまた、制御放出の
ための浸透圧性治療用錠剤を形成するために、当技術分野で公知の技術によってコーティ
ングすることができる。追加の薬剤は、投与される組成物の送達を制御するために、生分
解性又は生体適合性の粒子又は高分子物質、例えばポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロ
ゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、エチレン-酢酸ビニル、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、又はラクチド/グリ
コリドコポリマー、ポリラクチド/グリコリドコポリマー、又はエチレン酢酸ビニルコポ
リマーなどを含む。例えば、経口用薬剤は、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-
マイクロカプセル又はポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルそれぞれの使用によ
り、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製したマイクロカプセル中
に、或いはコロイド薬物送達システム中に、封入することができる。コロイド分散システ
ムには、巨大分子複合体、ナノ-カプセル、ミクロスフェア、マイクロビーズ、並びに水
中油型エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、及びリポソームを含めた脂質-ベースのシ
ステムが含まれる。リポソームを調製する方法は、例えば、米国特許第4,235,871号、第4
,501,728号、及び第4,837,028号に記載されている。先に言及した製剤の調製のための方
法は、当業者に明らかであろう。
経口使用のための製剤はまた、活性成分が例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、
カオリン又は微結晶セルロースなどの不活性な固形希釈剤と混合されている硬ゼラチンカ
プセルとして、或いは活性成分が水又は油性媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン
、若しくはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルとして、提供することができ
る。
水性懸濁剤は、その製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含有する。こうした
賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロー
ス、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリ
ドン、トラガカントゴム、及びアカシアゴム;分散剤又は湿潤剤、例えば、天然に存在す
るホスファチド(例えばレシチン)、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物(例
えばステアリン酸ポリオキシ-エチレン)、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコール
との縮合生成物(例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール)、又はエチレンオキシドと
脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物(例えばモノオレイン酸ポリ
オキシエチレンソルビトール)、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物
由来の部分エステルとの縮合生成物(例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタン)であ
り得る。この水性懸濁剤は、1種以上の保存剤を含有することもできる。
油性懸濁剤は、活性成分を、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、若しく
はココナツ油、又は流動パラフィンなどの鉱油に懸濁することによって、製剤化すること
ができる。油性懸濁剤は、増粘剤、例えば蜜ろう、固形パラフィン、又はセチルアルコー
ルを含有することができる。先に示したものなどの甘味剤、及び着香料を添加して、口当
たりの良い経口調製品を提供することができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散可能な散剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿
潤剤、懸濁化剤、及び1種以上の保存剤との混合物中の、活性成分を提供する。適切な分
散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、本明細書に例示されている。
本開示の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であり得る。油相は、植物油
、例えばオリーブ油若しくは落花生油、又は鉱油、例えば流動パラフィン、又はこれらの
混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するゴム、例えばアカシアゴム又はトラ
ガカントゴム;天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン、及び脂肪酸由
来のエステル若しくは部分エステル;ヘキシトール無水物、例えば、モノオレイン酸ソル
ビタン;並びに、部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、モノオレイ
ン酸ポリオキシエチレンソルビタンであり得る。
製剤はまた、インプラント、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ、及びマイクロカ
プセル化送達システムを含めた制御放出製剤などの、迅速な分解又は体からの排出に対し
て組成物を保護するための担体も含むことができる。例えば、単独の、又はワックスと組
み合わせたモノステアリン酸グリセリル若しくはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延
材料を用いることができる。
本開示は、薬物の直腸内投与のための座剤の形態のポリペプチドの投与を意図する。座
剤は、薬物を、常温では固体であるが、直腸温度では液体であり、従って直腸内で融解し
て薬物を放出することとなる、適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製する
ことができる。こうした材料としては、限定はされないが、カカオ脂及びポリエチレング
リコールが挙げられる。
本開示によって意図されるポリペプチドは、現在知られている又は将来開発される、任
意の他の適切な医薬組成物(例えば、経鼻又は吸入使用のためのスプレー剤)の形態であり
得る。
製剤中のポリペプチド又はその断片の濃度は、(例えば、重量で、約0.1%未満から、通
常約2%若しくは少なくとも約2%で、20%から50%と同程度若しくはそれ以上まで)広く変動
する可能性があり、通常、主として流体体積、粘度、及び対象に基づく要因(例えば、選
択された投与の特定の様式に従うもの)に基づいて選択されることとなる。
(投与経路)
本開示は、任意の適切な方式での、開示されたポリペプチド、及びその組成物の投与を
意図する。適切な投与経路としては、非経口(例えば、筋肉内、静脈内、皮下(例えば、注
射又は埋め込み))、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内(実質内)、及び脳室内)、経
口、経鼻、膣内、舌下、眼内、直腸内、局所(例えば、経皮)、舌下、及び吸入が挙げられ
る。
本明細書で開示されたポリペプチドを、規定の期間にわたって放出するために、一般に
皮下又は筋肉内に投与されるデポー注射も利用することができる。デポー注射は、通常、
固体又はオイル基剤であり、一般に、本明細書に説明した製剤成分の少なくとも1種を含
む。当業者は、可能な製剤及びデポー注射の使用について熟知している。
抗体に関しては、例示的な実施態様において、本開示の抗体又は抗体断片を、注射用の
無菌の等張性の生理食塩水溶液中で10mg/mlで4℃で保管し、対象への投与の前に、注射用
の100ml又は200ml 0.9%塩化ナトリウムに希釈する。該抗体は、静脈内注入によって、0.2
から10mg/kgの用量で、1時間かけて投与される。他の実施態様では、抗体は、静脈内注入
によって、15分から2時間かけて投与される。さらに他の実施態様では、投与手順は、皮
下の急速静注を介する。
(組み合わせ療法)
本開示は、1以上の活性な治療薬又は他の予防若しくは治療様式と組み合わせた、本明
細書で特定されたFGF19バリアントポリペプチドの使用を意図する。こうした組み合わせ
療法では、しばしば、種々の活性な薬剤が、異なる作用機構を有する。こうした組み合わ
せ療法は、1以上の薬剤の用量低下を可能にし、それによって、1以上の薬剤に伴う有害作
用を低減又は消失させることによって、特に好都合であり得る;さらに、こうした組み合
わせ療法は、根底にある疾患、障害、又は状態に対する相乗的な治療的及び予防的効果を
有することができる。
本明細書で使用する場合、「組み合わせ」は、別々に投与することができる、例えば、
別々の投与のために別々に製剤化される(例えば、1つのキット内に提供することができる
)治療法、及び、単一の製剤中で共に投与することができる治療法(すなわち「共製剤(co-
formulation)」)を含むことが意図される。本明細書に記載した方法及びモデルを使用し
て特定されたポリペプチドと、1以上の活性な治療薬又は他の予防若しくは治療様式との
組み合わせを、連続的に(例えば、ある薬剤が、1種以上の他の薬剤の前に投与される)又
は同時に(例えば、2種以上の薬剤が同時に又はほぼ同時に投与される)、投与又は適用す
ることができる。2種以上の薬剤が連続的に投与されるか同時に投与されるかにかかわら
ず、これらの薬剤は、本開示の目的では、組み合わせで投与されるとみなされる。
したがって、本明細書に記載した方法及びモデルの使用を通じてして特定されたポリペ
プチドの方法及び使用は、別の治療の前に、又は実質的に同時に、又は後に、実施するこ
とができ、他の形態の治療法を補うことができる。補足的治療法としては、他のグルコー
ス降下及び/又は体重減少治療、例えばインスリン、インスリン感受性エンハンサー、及
び他の薬物治療、食事の変化(低糖、低脂肪など)、体重減少手術-(胃バイパス、胃切除に
よって胃容積を減少させること)、胃緊縛術、胃バルーン、胃スリーブ(gastric sleeve)
などが挙げられる。
本開示は、1)インスリン、インスリン模倣体、及び、インスリン分泌の刺激を引き起こ
す薬剤(スルホニル尿素(例えば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、ト
ルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド)、及びメグリチニド(例えば、レパ
グリニド(PRANDIN)及びナテグリニド(STARLIX))を含めて);2)ビグアナイド(例えば、メト
ホルミン(GLUCOPHAGE))、並びに、グルコース利用を促進すること、肝臓グルコース産生
を低下させること、及び/又は腸管グルコース排出を減少させることによって作用する他
の薬剤;3)α-グルコシダーゼ阻害剤(例えば、アカルボース及びミグリトール)、並びに、
炭水化物消化、したがって消化管からの吸収を遅らせ、食後の高血糖を低下させる他の薬
剤;4)チアゾリジンジオン(例えば、ロシグリタゾン(AVANDIA)、トログリタゾン(REZULIN)
、ピオグリタゾン(ACTOS)、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタ
ゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン(adaglitazone)
、ダルグリタゾン(これらは、(例えば、インスリン増感によって)インスリン作用を増強
し、それによって、末梢組織におけるグルコース利用を促進する);5)DPP-IV阻害剤(例え
ば、ビルダグリプチン(GALVUS)及びシタグリプチン(JANUVIA))並びにグルカゴン様ペプチ
ド-1(GLP-1)及びGLP-1アゴニスト及び類似体を含めた、グルカゴン様ペプチド(例えば、
エキセナチド(BYETTA及びITCA 650(12か月の期間をかけてエキセナチド類似体を送達する
、皮下に挿入される浸透圧ポンプ;Intarcia社、Boston,MA));並びに6)DPP-IV抵抗性類似
体(インクレチン模倣体)、PPARγアゴニスト、二重作用性(dual-acting)PPARアゴニスト
、パン作用性(pan-acting)PPARアゴニスト、PTP1B阻害剤、SGLT阻害剤、インスリン分泌
促進物質、RXRアゴニスト、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3阻害剤、免疫モジュレータ
ー、β-3アドレナリン受容体アゴニスト、11β-HSD1阻害剤、及びアミリン類似体、を含
めた多数の薬剤(及びこれらのクラス)との組み合わせ療法を意図する。
さらに、本開示は、薬剤と、体重減少を促進するための方法(体重減少を促進するため
の、代謝を刺激する又は食欲を低下させる薬剤、及び改変された食事、及び/又は運動療
法など)との組み合わせ療法を意図する。食欲抑制薬物は、周知であり、本明細書で提供
される方法と組み合わせて使用することができる。
本開示のFGF19バリアントポリペプチドは、その状況に適した任意の方式で、1以上の他
の薬剤と組み合わせて使用することができる。一実施態様では、少なくとも1種の活性な
薬剤と本開示の少なくとも1種のポリペプチドでの治療は、一定期間にわたって維持され
る。別の実施態様では、少なくとも1種の活性な薬剤での治療が、(例えば、対象が安定で
ある場合に)縮小又は中断されるのに対し、本開示のポリペプチドでの治療は、一定の投
与レジメンで維持される。さらなる実施態様では、少なくとも1種の活性な薬剤での治療
が、(例えば、対象が安定である場合に)縮小又は中断されるのに対し、本開示のポリペプ
チドでの治療も、縮小される(例えば、より低い用量、より少ない頻度の投与、又はより
短期の治療レジメン)。さらに別の実施態様では、少なくとも1種の活性な薬剤での治療が
、(例えば、対象が安定である場合に)縮小又は中断されるのに対し、本開示のポリペプチ
ドでの治療は、増大される(例えば、より高い用量、より高い頻度の投与、又はより長期
の治療レジメン)。さらに別の実施態様では、少なくとも1種の活性な薬剤での治療が維持
され、本開示のポリペプチドでの治療が縮小又は中断される(例えば、より低い用量、よ
り少ない頻度の投与、又はより短期の治療レジメン)。さらに別の実施態様では、少なく
とも1種の活性な薬剤での治療と、本開示のポリペプチドでの治療が、縮小又は中断され
る(例えば、より低い用量、より少ない頻度の投与、又はより短期の治療レジメン)。
(投与)
本開示のポリペプチドは、例えば、投与の目標(例えば、所望される回復の程度);治療
される対象の年齢、体重、性別、並びに健康及び身体状態;ポリペプチド、及び/又は投与
されている製剤の性質;投与経路;並びに疾患、障害、状態、又はこれらの症状の性質(例
えば、グルコース/インスリンの調節不全の重さ、及び障害の段階)に依存する量で、対象
に投与することができる。投与レジメンはまた、投与されている薬剤(1種又は複数)に伴
う何らかの有害作用の存在、性質、及び程度を考慮に入れることができる。有効な投薬量
及び投薬レジメンは、例えば、安全性及び用量漸増試験、インビボ研究(例えば、動物モ
デル)、及び当業者に公知の他の方法から、容易に決定することができる。
一般に、投与パラメータは、投薬量が、対象にとって不可逆的に有毒である可能性があ
る量(すなわち、最大耐量、「MTD」)よりも少ない、かつ、対象に対する測定可能な効果
をもたらすのに必要とされる量以上であることを要求する。こうした量は、例えば、投与
経路及び他の要因を考慮に入れて、吸収、分布、代謝、及び排泄(「ADME」)と関連する薬
物動態及び薬力学的パラメータによって決定される。
有効な用量(ED)は、それを摂取する対象のうちのある割合において治療応答又は所望さ
れる効果をもたらす、薬剤の用量又は量である。薬剤の「半有効量」又はED50は、それが
投与される集団の50%において治療応答又は所望される効果をもたらす、薬剤の用量又は
量である。ED50は通常、薬剤の効果の合理的な予測の尺度として使用されるが、臨床医が
、すべての関連する要因を考慮に入れて、適切であると考える可能性があるのは、必ずし
も用量とは限らない。したがって、ある場合には、有効量は、算出されたED50よりも多く
、ある場合には、有効量は、算出されたED50よりも少なく、さらに他の場合には、有効量
は、算出されたED50と同じである。
さらに、本開示のポリペプチドの有効な用量は、1以上の用量で対象に投与される場合
に、健康な対象に対する所望の結果をもたらす量であり得る。例えば、有効な用量は、高
い血漿グルコース及び/又は血漿インスリンを有する 対象に投与される場合に、健康な対
象に対して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、
少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約
80%、又は80%超の、所望の低下を実現する用量であり得る。
適切な投薬量レベルは、一般に、1日あたり患者の体重1kgあたり約0.001から100mgとな
り、これを、単一又は複数回用量で投与することができる。いくつかの実施態様では、投
薬量レベルは、1日あたり約0.01から約25mg/kg、他の実施態様では1日あたり約0.05から
約10mg/kgとなる。適切な投薬量レベルは、約0.01から25mg/kg/日、約0.05から10mg/kg/
日、又は約0.1から5mg/kg/日であり得る。この範囲内では、投薬量は、0.005から0.05、0
.05から0.5、又は 0.5から5.0mg/kg/日であり得る。
経口用薬剤の投与については、組成物は、1.0から1000ミリグラムの活性成分、具体的
には、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、25
0.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0、及び1000.0ミリグラムの活性
成分を含有する、錠剤、カプセルなどの形態で提供することができる。ポリペプチドは、
例えば、1日1から4回、また、多くの場合、1日1回又は2回のレジメンで投与することがで
きる。
本開示のポリペプチドの投薬は、ポリペプチドの薬物動態(例えば半減期)、及び薬力学
的応答(例えばポリペプチドの治療効果の持続期間)に応じて、1日に1回から3か月に1回の
範囲内であり得る適切な頻度で繰り返すことができる。ポリペプチドが、抗体若しくはそ
の断片、又はあるポリペプチド又はそのバリアントであるいくつかの実施態様では、投与
は、1週に1回から3か月に1回まで、しばしば繰り返される。他の実施態様では、こうした
ポリペプチドは、1か月におよそ1回投与される。
ある種の実施態様では、開示されたポリペプチドの投薬量は、「単位剤形」に含有され
る。語句「単位剤形」とは、各単位が、所望の効果をもたらすのに十分な、あらかじめ決
定された量の本開示のポリペプチドを、単独で、又は1種以上の追加の薬剤と組み合わせ
て含有する、物理的に不連続の単位をいう。単位剤形のパラメータは、個々の薬剤及び達
成されることとなる効果に依存することとなるということを理解されたい。単位用量の例
は、約25〜250;250〜500;500〜1,000;1,000〜2,500;2,500〜5,000;5,000〜25,000;若しく
は25,000〜50,000ng;又は約25〜250;250〜500;500〜1,000;1,000〜2,500;2,500〜5,000;5
,000〜25,000;25,000〜50,000μg;又は約25〜250;250〜500;500〜1,000;1000〜2,500;2,5
00〜5,000;5,000〜25,000;若しくは25,000〜50,000mgの範囲であり得る。
単一又は複数回用量を、例えば、1日に複数回、連日、1日おき、毎週、又は断続的に(
例えば、週に2回、1、2、3、4、5、6、7、若しくは8週に1回、又は2、3、4、5、若しくは
6か月に1回)、投与することができる。
(キット)
本開示はまた、開示されたポリペプチド及びその医薬組成物を含むキットを意図する。
キットは一般に、下に記載する通りの様々な成分を収める物理学的構造の形状であり、例
えば、先に記載した方法(例えば、グルコース恒常性を回復させる必要がある対象へのポ
リペプチドの投与)を実施する際に利用することができる。
キットは、対象への投与に適した医薬組成物の形態であり得る、本明細書に開示された
1種以上のポリペプチドを含む(例えば、滅菌容器中に提供する)ことができる。ポリペプ
チドは、すぐに使える形態で、又は、例えば投与前に再構成若しくは希釈を必要とする形
態で提供することができる。ポリペプチドが、使用者によって再構成する必要がある形態
である場合、キットはまた、ポリペプチドと共に又はポリペプチドとは別に包装された、
緩衝液、医薬として許容し得る賦形剤なども含むことができる。組み合わせ療法が意図さ
れる場合、キットが、いくつかの薬剤を別々に含有することもできるし、キット内でいく
つかの薬剤が既に合わせられている可能性もある。キットの各成分は、個々の容器内に封
入することができ、種々の容器はすべて、単一の包装内に存在することができる。本開示
のキットは、その中に収められる成分を適切に維持するのに不可欠な条件(例えば、冷凍
又は凍結)のために設計することができる。
キットは、その中の成分についての識別情報を含むラベル又は添付文書、及びその使用
のための説明書(例えば、投与パラメータ、活性成分(1種又は複数)の臨床薬理学(作用機
序、薬物動態、及び薬力学的を含めて)、有害作用、禁忌など)を含有することができる。
ラベル又は添付文書は、ロット番号及び有効期限などの製造業者情報を含むことができる
。ラベル又は添付文書は、例えば、物理的構造内に別々に含有される成分を収める物理的
構造に組み込む、又はキットの構成成分(例えば、アンプル、チューブ、又はバイアル)に
添付することができる。説明書の例としては、該説明書中の開示されたポリペプチド及び
医薬組成物を用いる、血糖を低下又は降下させること、高血糖の治療、糖尿病などの治療
のためのものが挙げられる。
ラベル又は添付文書は、コンピュータ可読媒体、例えばディスク(例えば、ハードディ
スク、カード、メモリーディスク)、光ディスク、例えばCD-若しくはDVD-ROM/RAM、DVD、
MP3、磁気テープ、又は電気記憶媒体、例えばRAM及びROM、又はこれらのものの複合体、
例えば磁気/光学記憶媒体、FLASHメディア、又はメモリー型カードをさらに含む、又はこ
れらに組み込むことができる。いくつかの実施態様では、実在の説明書は、キット内には
存在しないが、例えばインターネットを介して離れた供給源から説明書を得るための手段
が提供される。
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明
が属する技術分野の業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記
載した方法及び材料に類似する又は同等の方法及び材料を、本発明の実践又は試験におい
て使用することができるが、適切な方法及び材料を、本明細書に記載する。
矛盾する場合、定義を含めて、本明細書が支配するであろう。本明細書で及び添付の特
許請求の範囲において使用する場合、単数形「ある(a、an、the)」には、文脈によってそ
うではないと明確に指示されない限り、複数の指示物が含まれる。したがって、例えば、
「あるペプチド配列」又は「ある治療」に対する言及には、複数の、こうした配列、治療
、及びその他が含まれる。特許請求の範囲を、何らかの任意要素を除外するために起草で
きることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の記述又は「消極
的」限定の使用に関連して、こうした排他的な用語法、例えば「唯一」、「〜のみ」など
の使用のための先行詞としての役割を果たすものとする。
値の範囲が提供される場合、その範囲の、及びその規定された範囲内の任意の他の規定
された又は間にある値の、上限と下限の間の、文脈によってそうではないと明確に指示さ
れない限り下限の単位の10分の1までの、間にあるそれぞれの値は、本発明に包含される
ことが理解されよう。これらの、より小さい範囲の上限と下限は、独立に、より小さい範
囲内に含めることができ、また、本発明の範囲内に包含され、規定された範囲内のいかな
る具体的に除外される制限も受ける。規定された範囲が、制限のうちの片方又は両方を含
む場合、これらの含まれる制限のうちの一方又は両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
本明細書で使用する場合、数値は、本文書全体を通して、範囲形式で提示されることが
多い。範囲形式の使用は、単に便利さ及び簡潔さのためであり、文脈によってそうではな
いと明確に示されない限り、本発明の範囲の不変の限界と解釈されるべきではない。した
がって、文脈によってそうではないと明確に示されない限り、範囲の使用は明確に、可能
性のあるすべての部分範囲、その範囲内のすべての個々の数値、並びにこうした範囲内の
整数及び範囲内の値の分数又は整数を含めたすべての数値又は数値範囲を含む。この解釈
は、範囲の幅にかかわらず、本特許文書全体を通したすべての文脈において適用される。
したがって、例えば、90〜100％の範囲に対する言及には、91〜99％、92〜98％、93〜95
％、91〜98％、91〜97％、91〜96％、91〜95％、91〜94％、91〜93％、及びその他が含ま
れる。90〜100％の範囲に対する言及には、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％
など、並びに91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％など、92.1％、92.2％、92.3％、
92.4％、92.5％など、及びその他も含まれる。さらに、1〜3、3〜5、5〜10、10〜20、20
〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜12
0、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜20
0、200〜225、225〜250の範囲に対する言及には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20などが含まれる。さらなる例では、25〜250、250〜
500、500〜1000、1000〜2500、2500〜5000、5000〜25,000、又は5000〜50,000の範囲に対
する言及には、こうした数値内の若しくはこうした数値を包含する任意の数値又は範囲、
例えば、25、26、27、28、29…250、251、252、253、254…500、501、502、503、504…な
どが含まれる。連続する範囲の使用には、別の範囲を提供するための、範囲の上側と範囲
の下側の組合せが含まれる。この解釈は、範囲の幅にかかわらず、本特許文書全体を通し
たすべての文脈において適用される。したがって、例えば5〜10、10〜20、20〜30、30〜4
0、40〜50、50〜75、75〜100、100〜150などの連続する範囲に対する言及には、5〜20、5
〜30、5〜40、5〜50、5〜75、5〜100、5〜150、及び10〜30、10〜40、10〜50、10〜75、1
0〜100、10〜150、及び20〜40、20〜50、20〜75、20〜100、20〜150、及びその他などの
範囲が含まれる。
簡潔さのために、本明細書では、ある種の略語を使用する。一例は、アミノ酸残基を表
すための1文字の略語である。アミノ酸とその対応する3文字及び1文字の略語は、次の通
りである:
Figure 2021008499
本発明は概して、多数の実施態様を説明するために肯定的な言葉を使用して、本明細書
に開示される。本発明には、具体的には、物質又は材料、方法の工程及び条件、プロトコ
ル、手順、アッセイ、又は分析などの特定の対象物が、完全に又は部分的に除外されてい
る実施態様も含まれる。したがって、たとえ、本発明が概して、本発明が含まないものに
関して本明細書に表現しないとしても、本発明に表現上は含まれない態様が、本明細書に
開示される。
本発明のいくつかの実施態様を記載してきた。しかし、本発明の趣旨及び範囲を逸脱せ
ずに、様々な改変を行うことができることが理解されよう。したがって、実験セクション
における説明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を説明するが、制限はしない
ことを意図する
(実験)
完全な開示、及び本発明の実施及び使用の方法の説明を当業者に提供するために、次の
実施例を提示するが、これらの実施例は、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を制
限するものではなく、下の実験が、実施される実験のすべて又は唯一の実施される実験で
あることを示すものでもない。使用される数(例えば、量、温度など)に関する正確性を確
実にするために努力が注がれているが、いくらかの実験誤差及び偏差について考慮される
べきである。
そうではないと示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、
温度はセルシウス度(℃)であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。次のものを含めて
、一般的な略語が使用される:bp=塩基対(1又は複数);kb=キロベース(1又は複数);pl=ピコ
リットル(1又は複数);s又はsec=秒(1又は複数);min=分(1又は複数);h又はhr=時間(1又は
複数);aa=アミノ酸(1又は複数);kb=キロベース(1又は複数);nt=ヌクレオチド(1又は複数)
;ng=ナノグラム;μg=マイクログラム;mg=ミリグラム;g=グラム;kg=キログラム;dl又はdL=
デシリットル;μl又はμL=マイクロリットル;ml又はmL=ミリリットル;l又はL=リットル;
μM=マイクロモル;mM=ミリモル;M=モル;kDa=キロダルトン;i.m.=筋肉内(に);i.p.=腹腔内
(に);s.c.=皮下(に);bid=1日2回;HPLC=高速液体クロマトグラフィー;BW=体重;U=ユニット
;ns=統計的に有意ではない;PG=空腹時血漿グルコース;FPI=空腹時血漿インスリン;ITT=イ
ンスリン負荷試験;PTT=ピルビン酸負荷試験;oGTT=経口ブドウ糖負荷試験;GSIS=グルコー
ス刺激性インスリン分泌;AAV=アデノ随伴ウイルス;PBS=リン酸緩衝生理食塩水;PCR=ポリ
メラーゼ連鎖反応;NHS=N-ヒドロキシスクシンイミド;DMEM=ダルベッコ改変イーグル培地;
GC=ゲノムコピー;EDTA=エチレンジアミン四酢酸;FGF19CF=C終端にFLAG-タグを有するFGF1
9;GFP=緑色蛍光タンパク質;ELISA=酵素結合免疫吸着検定法;ANOVA=分散分析;SEM=平均値
の標準誤差。
(実施例1)
(実施例2〜5のための材料及び方法)
下の実施例2〜5では、次の方法及び材料を使用した。
(動物)
約15週齢の、治療の開始時に体重が約36〜48gのdb/dbマウス(The Jackson Laboratory
社;Bar Harbor,ME)を、制御された光(12時間の明期及び12時間の暗期周期、暗期6:30 p.m
.〜6:30 a.m.)、温度(22±4℃)、及び湿度(50%±20%)条件下で、福祉ガイドラインに従っ
て飼育した。マウスは、オートクレーブ滅菌蒸留水に自由に接近でき、18 kcal%脂質、24
kcal%タンパク質、及び58 kcal%炭水化物を含有する、市販の食餌(Harlan Laboratories
社、Indianapolis,IN、Irradiated 2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet)を自
由に与えた。すべての動物研究は、NGM動物実験委員会(Institutional Animal Care and
Use Committee)によって認可された。
(核酸及びアミノ酸配列)
FGF19 ORF(hFGF19(GenBank Accession No.NM_005117.2)をコードするORFのcDNA及びそ
れによってコードされるタンパク質配列(GenBank Accession No.NP_005108.1))を、ヒト
小腸組織から調製された組み換えDNA(cDNA)を使用するPCRを介して増幅した。Phusion(登
録商標)ハイフィディリティDNAポリメラーゼ(F-530L;New England BioLabs社;Ipswich,MA
)を含むPCR試薬キットを、次のプライマー:フォワードPCRプライマー:
Figure 2021008499
 、及びリバースPCRプライマー:
Figure 2021008499
 と共に使用した。
増幅したDNA断片を、Spe I及びNot I(制限部位は、それぞれ5'又は3'PCR プライマー内
に含まれている)で消化し、次いで、同じ制限酵素で消化されているAAV導入遺伝子ベクタ
ーを用いて連結した。発現のために使用されるベクターは、選択可能マーカーと発現カセ
ット(クローン化コード配列の挿入のための部位の強力な真核生物プロモーター5'、それ
に続く3'非翻訳領域、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化テールからなる)を含有して
いた。発現構築物はまた、5'及び3'端の内部末端反復に隣接されていた。
(FGF19及びFGF19バリアントをコードするAAVの産生及び精製)
AAV293細胞(Agilent Technologies社、Santa Clara,CA)を、10%ウシ胎児血清及び1×抗
生物質-抗真菌剤溶液(Mediatech社)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Media
tech社、Herndon,VA) 中で培養した。この細胞を、第1日に150-mm細胞培養プレート中に5
0%密度で蒔き、第2日に、次の3種のプラスミド(20μg/各プレート):i)AAV導入遺伝子プラ
スミド、ii)pHelperプラスミド(Agilent Technologies社)、及びiii)AAV2/9プラスミドを
用いるリン酸カルシウム沈降法を使用して形質移入した(Rabinowitzらの文献、2002年)。
形質移入の48時間後、細胞をプレートからこすり落とし、3000×gでの遠心分離によって
ペレット化し、20mM Tris pH8.5、100mM NaCl、及び1mM MgCl2を含有する緩衝液に再懸濁
した。この懸濁液をアルコール・ドライアイス浴中で凍結し、次いで、37℃の水浴中で解
凍し;この凍結-解凍サイクルを3回繰り返した。Benzonase(登録商標)(Sigma-Aldrich社;S
t.Louis,MO)を添加して50unit/mLにし、デオキシコール酸を添加して0.25%の最終濃度と
した。37℃での30分間のインキュベーション後、5000×gでの20分間の遠心分離によって
細胞破壊片をペレット化した。上清中のウイルス粒子を、以前に記載された通りに、製造
中止となっているイオジキサナール(iodixanal)(Sigma-Aldrich社)グラジエントを使用し
て精製した(Zolotukhinらの文献(2002年)Endocrinology 143(5):1741〜47)。このウイル
スストックを、Vivaspin(登録商標)20(分子量(MW)カットオフ100,000Da、Sartorius Sted
im Biotech社;Aubagne,France)を使用して濃縮し、10%グリセロールを含むリン酸塩緩衝
生理食塩水(PBS)に再懸濁し、-80℃で保管した。
ウイルスのゲノムコピー(GC)数を決定するために、2μLのウイルスストックを、50unit
/mL Benzonase、50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、及び10mM CaCl2を含有する6μLの溶
液中で、37℃で30分間インキュベートした。その後、2mg/mLのプロテイナーゼK、0.5% SD
S、及び25mM EDTAを含有する15μLの溶液を添加し、この混合物を、55℃でさらに20分間
インキュベートして、ウイルスDNAを放出させた。mini DNeasy(登録商標)Kit(Qiagen社;V
alencia,CA)を用いてウイルスDNAをきれいにし、40μLの水で溶出した。定量PCRを使用し
て、ウイルスGCを決定した。ウイルスストックを、生理食塩水で所望のGC/mLに希釈し、
この作業溶液(200μL)をマウスの尾静脈に注射した。
(血糖分析)
それぞれの絶食していない動物から、尾切開によって血液試料を収集し、製造業者の説
明書に従ってグルコメータ(Accu-Chek(登録商標)装置;Roche Diagnostics社、Indianapol
is,IN)を使用して、血漿グルコースレベルを測定した。
(血清FGF19及びFGF19バリアント曝露レベル分析)
マウス尾切開からの全血(〜50μl/マウス)を、プレーン(plain)毛細管(BD Clay Adams
SurePrep(商標)、Becton Dickenson社;Sparks,MD)に収集した。Autocrit(商標)Ultra 3遠
心機(Becton Dickinson)中での10,000rpm、4℃での10分間の遠心分離によって、血清と血
液細胞を分離し、直ちに-80℃で凍結した。血清中のFGF19及びFGF19バリアントのレベル
を、製造業者の説明書に従って市販品として入手できるELISA(Biovendor社;Asheville,NC
)を使用して測定した。標準としてヒトFGF19を使用して、M70の相対濃度を決定した。し
たがって、他のFGF19バリアントの相対濃度も決定することができる。
(体脂肪量及び除脂肪量測定)
麻酔をかけていない動物を、それぞれ、プラスチックホルダーに入れ、NMR-MRI(全身組
成分析装置、EchoMRI(商標)、Houston,TX)を使用して身体組成を決定した。体脂肪量、除
脂肪量、及び水分量(データは示さない)を記録した。手順全体は、各動物について、2分
を超えなかった。
(肉眼での肝臓結節評価)
AAV注射の24週後、動物を安楽死させ、それぞれの肝臓を、肉眼での結節形成について
調べた。視認可能な肝臓結節(直径＞2mm)の数を、数えて記録した。
(統計的分析)
結果はすべて、平均値±平均値の標準誤差として表した。一元配置ANOVA、それに続い
てダネットの事後検定を使用して、複数の群からのデータを比較した(GraphPad Prism(登
録商標);San Diego,CA)。必要な場合、独立スチューデントt検定を使用して、2つの治療
を比較した。二元配置ANOVA、それに続いてボンフェローニの事後検定を使用して、経時
変化研究のために、複数の群を比較した。0.05又はそれよりも小さいp値は、統計的に有
意であるとみなされた。
(実施例2)
(遺伝子送達後のdb/dbマウスにおける血漿FGF19レベル)
FGF19バリアントM70が、db/dbマウスにおけるFGF19誘発性腫瘍形成能を妨害することが
可能であるかどうかを評価するために、24週研究を実施した。送達の従来の方法に代わる
ものとして、この実施例(及び以下に続く実施例2〜4)では、ビヒクルとしてAAVを使用し
て、マウスにおいて対象となる外因性遺伝子を送達及び発現させ、これらの導入遺伝子に
よってコードされたタンパク質への継続的、持続的、かつ全身的な曝露を可能にした。
遺伝子送達の前に、マウスを表1に説明する通りに6群(5匹の雄マウス/群)に分け、各マ
ウスについて、血糖及び体重測定を記録した。
Figure 2021008499
第0週に、マウスに、0.2mL生理食塩水、又は0.2mLの第2〜6群のAAV構築物の1つを注射
した。第3週及び5週に、血糖及び体重測定値を、第1〜6群の各マウスについて、再び記録
した。
遺伝子送達の5週後、生理食塩水(第1群)又はAAV構築物(第2〜6群)を注射したマウスか
ら単離された血清中のFGF19濃度を測定した。薬物濃度を測定するために使用されるELISA
は、FGF19とM70とを正確に区別することができないので、第5及び6群について決定された
血漿濃度は、両方のタンパク質の合計血漿濃度を表す。
結果を図2に示す。低い(3e9;第3群)及び高い(3e10;第4群)用量の組み換えFGF19-flagウ
イルスを与えられたマウスにおいて検出されたFGF19レベルは、AAV用量(それぞれ1.4±0.
5ng/mLと93.6±12.6ng/mL)と比例していた。FGF19-flagとM70導入遺伝子の両方を注射し
たマウスでは、M70ウイルス(3e11)が、FGF19-flag構築物単独と比較して100又は10倍過剰
で存在していた。2種の導入遺伝子を共注射する結果として、低用量と高用量両方のFGF19
-flag(それぞれ734.0±61.1ng/mL(第5群)と453.4±169.4ng/mL(第6群))での、FGF19の高
い血清レベルが検出され、これは、M70とFGF19-flagの両方の発現からの寄与を表した。
対照的に、生理食塩水又はAAV-GFPの一方を注射したdb/dbマウスから単離された試料では
、FGF19は検出できなかった。
第23週に、血糖及び体重測定値を、各マウスについて、再び記録した。遺伝子送達の24
週後、すべての動物を安楽死させ、剖検にかけた。
(実施例3)
(FGF19バリアントM70の非存在下又は存在下での、db/dbマウスにおける肉眼での肝臓結節
のFGF19介在性の形成)
実施例2からの安楽死させた動物を使用して、それぞれのマウスからの肝臓を調べ、視
認可能な肝臓結節の数を決定した。結果を図3に示す。群番号については、表1を参照のこ
と。
図3に示す通り、db/dbマウスモデルにおけるFGF19-flagの異所性発現は、低い(3e9;第3
群)ウイルス用量と高い(3e10;第4群)ウイルス用量の両方で、肝臓表面から膨隆している
複数の大きな盛り上がった結節の形成を促進した(それぞれ、肝臓あたり2.4±1.4病変、
及び肝臓あたり7.8病変)。比較すると、FGF19-flagとM70との両方を発現しているマウス
から単離された肝臓には、肝臓結節はまったくなかった(第5群及び第6群)。結果を、同じ
研究群内のすべての動物に対する平均及びSEMとして表す。c-flag成分は、FGF19の腫瘍形
成効果に影響を与えなかったが、FGF19の抗糖尿病効果には影響を与える可能性があるこ
とに留意するべきである。
FGF19-flagの異所性発現は、たった1ng/mLの血清濃度で、db/dbマウスにおける肝臓結
節の形成を促進する。しかし、FGF19介在性の腫瘍形成は、肝臓病変の出現によって裏付
けられた通り、FGF19-flagとM70導入遺伝子がこのモデルにおいて共発現された場合には
、完全に抑制される。これらのデータは、操作されたFGF19バリアントM70が、野生型タン
パク質を伴うマウスにおける腫瘍形成能を欠くだけでなく、野生型タンパク質の増殖効果
を効率的に妨げることができることを示唆する。
(実施例4)
(db/dbマウスにおける体重及び組成物に対する導入遺伝子発現の効果)
実施例2に言及した通り、15週齢の雄db/dbマウス(n=5)に、表1に示した通りに、0.2mL
生理食塩水又は組み換えAAV導入遺伝子を注射した。注射前(第1週)、及び注射の3、5、及
び23週後に、各マウスについて体重を測定した。図4に示される結果は、すべての動物か
らのそれぞれの測定値の平均、及びSEMとして表される。
M70とFGF19-flagを共発現しているトランスジェニックdb/dbマウス(第5及び6群)は、生
理食塩水を投与した動物(第1群)と比較すると、体重の有意な減少を示した。FGF19-flag
導入遺伝子を発現しているマウスでは、体重に対するそれほど劇的ではない効果が観察さ
れたが、その減少は、用量依存的であるように見え、より高い用量を注射した動物(第3及
び4群)では、第3及び5週で有意であった。
両方の対照群における(生理食塩水(第1群)又はAAV-GFP(第2群)のいずれかを投与された
)マウスが、研究の最後までに、遺伝子送達後の第3及び5週における、その最大体重と比
較して、質量の有意な減少を示す傾向にあることに留意されたい。これらの動物における
体重減少は、通常、db/dbマウス、及び24週の研究の過程にわたる、2型糖尿病の進行にお
いて観察される重度の高血糖と関連している。
FGF19-flagとM70導入遺伝子を共発現しているマウスにおいて観察された体重の変化は
、生理食塩水群における動物から採取したもの(データは示さない)と比較した場合の肝臓
重量の低下に反映され;特に、臓器サイズの低下は、これらのマウスにおける体重の減少
に正比例していた。対照的に、相対的肝臓重量は、FGF19-flagを発現しているマウスにお
いて増大したが、これらの変化は、体重に対して基準化した場合に、同様に有意ではなか
った(データは示さない)。
さらに、身体組成に対する治療の効果を、注射の23週後、NMR-MRIを使用して決定した
。観察された体重の減少と一致して、M70とFGF19-flag導入遺伝子の異所性共発現は、生
理食塩水で処置されたマウスと比較した場合の、db/dbマウスにおける体脂肪量と除脂肪
量の両方の減少をもたらした(データは示さない)。FGF19-flagの発現は、低用量又は高用
量の導入遺伝子を与えられたdb/dbマウスにおいて、身体組成に対する効果をほとんど有
しなかった(データは示さない)。
(実施例5)
(db/dbマウスにおける絶食していない血糖に対する導入遺伝子発現の効果)
実施例2に言及した通り、15週齢の雄db/dbマウス(n=5)に、表1に示した通りに、0.2mL
生理食塩水又は組み換えAAV導入遺伝子を注射した。注射前(第1週)、及び注射の3、5、及
び23週後に、各マウスについて血糖を測定した。図5に示される結果は、すべての動物か
らのそれぞれの測定値の平均、及びSEMとして表される。
M70とFGF19-flagを共発現しているトランスジェニックdb/dbマウス(第5及び6群)は、対
照動物(第1及び2群)と比較すると、血糖濃度の有意な低下を示した。FGF19-flagとM70導
入遺伝子を共発現しているマウスでは、グルコースレベルは急激に低下し、遺伝子送達の
約3週後までにプラトーレベル(高用量(第6群)及び低用量(第5群)のFGF19-flag導入遺伝子
で、それぞれ160及び141mg/dL)に到達した。FGF19-flagを発現しているマウス(第3及び4
群)における血糖レベルは、対照群よりも有意に低く、24週の研究の過程にわたって、最
初の基準レベル(約400〜450mg/dL)に維持されていた。以前に示された通り、c-Flag成分
は、FGF19の腫瘍形成効果に影響を与えなかったが、これは、FGF19の抗糖尿病効果に影響
を与える可能性がある。これらのマウスにおいて検出される低い全身的レベルのFGF19-fl
agは、生理食塩水又はAAV-GFPで処置されたマウスにおいて観察される悪化している糖血
症からのいくらかの保護を提供するように見えるが、グルコースレベルを基準値未満に下
げることはできない。
予想された通り、生理食塩水(第1群)又は対照ウイルス、AAV-GFP(第2群)での注射後の
研究の過程にわたって、グルコース降下は観察されなかった。注目すべきことには、対照
群においてグルコメータによって決定される血液グルコース濃度(〜600mg/dL)は、装置に
よる検出の上限を表し、これらの試料における実際のグルコース濃度よりも低く示される
可能性がある。
(実施例6)
(実施例7〜11のための材料及び方法)
下の実施例7〜16では、次の方法及び材料を使用した。
(DNA構築物)
ヒトFGF19(NM_005117)、ヒトFGFR4(NM_022963)、マウスFGFR4(NM_008011)、ヒトKLB(NM
_175737)、及びマウスKLB(NM_031180)cDNAを、Genecopoeia社から購入した。QuickChange
(商標)Site-Directed Mutagenesisキット(Stratagene社)を使用して、FGF19構築物に、変
異を導入した。
(FGF19及びFGF19バリアントをコードするAAVの産生及び精製)
AAV293細胞(Agilent Technologies社、Santa Clara,CA)を、10%ウシ胎児血清及び1×抗
生物質-抗真菌剤溶液(Mediatech社)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Media
tech社、Herndon,VA)中で培養した。この細胞を、第1日に150-mm細胞培養プレート中に50
%密度で蒔き、第2日に、次の3種のプラスミド(20μg/各プレート):i)AAV導入遺伝子プラ
スミド、ii)pHelperプラスミド(Agilent Technologies社)、及びiii)AAV2/9プラスミドを
用いるリン酸カルシウム沈降法を使用して形質移入した(Rabinowitzらの文献、2002年)。
形質移入の48時間後、細胞をプレートからこすり落とし、3000×gでの遠心分離によって
ペレット化し、20mM Tris pH8.5、100mM NaCl、及び1mM MgCl2を含有する緩衝液に再懸濁
した。この懸濁液をアルコール・ドライアイス浴中で凍結し、次いで、37℃の水浴中で解
凍し;この凍結-解凍サイクルを3回繰り返した。Benzonase(登録商標)(Sigma-Aldrich社;S
t.Louis,MO)を添加して50unit/mLにし、デオキシコール酸を添加して0.25%の最終濃度と
した。37℃での30分間のインキュベーション後、5000×gでの20分間の遠心分離によって
細胞破壊片をペレット化した。上清中のウイルス粒子を、以前に記載された通りに、製造
中止となっているイオジキサナール(iodixanal)(Sigma-Aldrich社)グラジエントを使用し
て精製した(Zolotukhinらの文献(2002年)Endocrinology 143(5):1741〜47)。このウイル
スストックを、Vivaspin(登録商標)20(分子量(MW)カットオフ100,000Da、Sartorius Sted
im Biotech社;Aubagne,France)を使用して濃縮し、10%グリセロールを含むリン酸塩緩衝
生理食塩水(PBS)に再懸濁し、-80℃で保管した。
ウイルスのゲノムコピー(GC)数を決定するために、2μLのウイルスストックを、50unit
/mL Benzonase、50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、及び10mM CaCl2を含有する6μLの溶
液中で、37℃で30分間インキュベートした。その後、2mg/mLのプロテイナーゼK、0.5% SD
S、及び25mM EDTAを含有する15μLの溶液を添加し、この混合物を、55℃でさらに20分間
インキュベートして、ウイルスDNAを放出させた。mini DNeasy(登録商標)Kit(Qiagen社;V
alencia,CA)を用いてウイルスDNAをきれいにし、40μLの水で溶出した。定量PCRを使用し
て、ウイルスGCを決定した。ウイルスストックを、生理食塩水で所望のGC/mLに希釈し、
この作業溶液(200μL)をマウスの尾静脈に注射した。
(動物実験)
すべての動物研究は、NGMの動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Comm
ittee)によって認可された。マウスは、病原体を含まない動物施設内で、制御された12時
間の明期/12時間の暗期周期で、22℃で飼育した。すべてのマウスは、標準の固形飼料(Ha
rlan Laboratories社、Teklad 2918)及びオートクレーブ滅菌水(自由に)を継続した。別
段の指定がない限り、雄のマウスを使用した。C57BL/6J、FVB/NJ、BDF、ob/ob、及びdb/d
bマウスは、Jackson Laboratory社から購入した。ヘテロ接合体のrasH2トランスジェニッ
クマウスは、Taconic社から入手した。第7日に、10〜12週齢のob/ob or db/dbマウス、又
は6〜8週齢のC57BL/6J、FVB/NJ、BDF、若しくはrasH2マウスのコホートを、体重に基づい
て、無作為に処置群に分けた。すべての動物は、第1日に、尾静脈を介して、3×1011ゲノ
ムコピーのAAVの、単回の200μL静脈内注射を受けた。体重を記録し、血清FGF19レベルの
測定のために、尾切開を介して血液を収集した。動物を安楽死させ、AAVの投与の24又は5
2週後に肝臓を収集した。
(肉眼的、組織学的、及び免疫組織化学的分析)
AAV-FGF19を注射したマウスにおける肝臓の変化の開始を決定するために、1年の期間を
通して、指定された間隔で、肉眼的な組織学的評価を実施した。体重、肝臓重量、及び肝
腫瘍結節数を、剖検時に記録した。FGF19バリアントの腫瘍スコア算出については、腫瘍
スコア=バリアントを発現している肝臓の表面全体上の腫瘍結節の数/野生型FGF19を発現
している肝臓の表面全体上の腫瘍結節の数。したがって、FGF19を発現しているマウスは
、1という任意の値を伴う腫瘍スコアを与えられた。ホルマリン固定されたパラフィン包
埋組織切片を、肝細胞の過形成、肥大、又は新形成の組織学的評価のために、ヘマトキシ
リン及びエオシン(H&E)で染色した。必要な場合、肝臓切片を、クエン酸緩衝液(Vector L
aboratories社)を使用して、抗原回復のために処理し、次いで、10μg/mL抗PCNA(Dako社)
、抗Ki67(Dako社)、抗グルタミン合成酵素(Thermofisher社)、又は抗β-カテニン抗体(Ce
ll Signaling社)と共にインキュベートした。検出のために、ビオチン化二次抗体、ABC-H
RP試薬、及びDAB比色ペルオキシダーゼ基質(Vector Laboratories社)を使用した。LacZ染
色のために、肝臓をOCTに包埋し、クライオスタット上で切片作成した。組織切片を、4%
パラホルムアルデヒド及び2%グルタルアルデヒドを含有するPBS中で、10分間固定し、1mg
/mL X-gal(Promega社)(5mMフェロシアン化カリウム及び5mMフェリシアン化カリウム中)と
共に、37℃で2時間インキュベートした。
(ルシフェラーゼ分析)
Rat L6筋芽細胞を、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手し、10%ウシ胎児血
清(FBS)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で、5% CO2下で37℃で培養した
。96ウェルプレートに入れた細胞を、FuGENE(登録商標)6形質移入試薬(Roche Applied Sc
ience社)を使用して、マウスKLB、マウスFGFR4、GAL4-Elk-1転写活性化因子(pFA2-Elk1、
Stratagene社)、ホタルルシフェラーゼレポーター駆動(driven)GAL4結合部位(pFR-luc、S
tratagene社)、及びウミシイタケルシフェラーゼ(pRL-SV40、Promega社)をコードする発
現ベクターで一過性形質移入した。形質移入の翌日、細胞を、20μg/mLヘパリン(Sigma社
)を含有する無血清培地中のリガンドで6時間刺激した。細胞を、溶解緩衝液(Promega社)
を用いて溶解し、Dual-Glo(登録商標)ルシフェラーゼ分析システム(Promega社)及びEnSpi
re(登録商標)プレートリーダー(Perkin Elmer社)を使用して、ルシフェラーゼ活性を決定
した。ホタルルシフェラーゼ活性を、共発現されたウミシイタケルシフェラーゼ活性に対
して基準化し、3連の平均±SEMとして示した。
(初代肝細胞におけるCyp7a1発現)
マウス、ラット、又はヒト肝臓からの初代肝細胞(Life Technologies社)を、コラーゲ
ンIコーティング96ウェルプレート(Becton Dickinson社)上に蒔き、100nMデキサメタゾン
及び0.25 mg/mLマトリゲルを添加したWiliamsのE培地中で一晩インキュベートした。細胞
を、組み換えFGF19又はM70タンパク質で、24時間(マウス又はラット肝細胞)又は6時間(ヒ
ト肝細胞)処理した。細胞ライセートにおけるCyp7a1発現を、QuantiTectマルチプレック
スqRT-PCRマスターミックス(Qiagen社)、並びにあらかじめ作られたプライマー及びプロ
ーブ(Life Technologies社;マウスCyp7a1:Mm00484150_m1;ラットCyp7a1:Rn00564065_m1;
ヒトCyp7a1:Hs00167982_m1)を使用して、qRT-PCR分析によって決定した。反応は、Applie
d Biosystems 7900HT配列検出システム上で3連で実施した。相対mRNAレベルは、内部標準
として18S RNA(マウス及びラット)又はアクチン(ヒト)を使用して、閾値サイクル比較の
方法によって算出した。
(インビボシグナル伝達分析)
db/dbマウス(9〜11週齢)(Jackson Laboratories社)は、FGF19又はM70組み換えタンパク
質の腹腔内(i.p.)注射(1mg/kg)を受けた。注射の15分、2時間、又は4時間後に、肝臓を収
集し、液体窒素中で急速凍結した。凍結された肝臓試料を、プロテアーゼ阻害剤(Roche社
)及びホスファターゼ阻害剤(Sigma社)を含有するRIPA溶解緩衝液(50mM Tris pH7.5、150m
M NaCl、1% NP40及び0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1mMジチオトレイトール、1mM PM
SF、2mMフッ化ナトリウム、及び2mMオルトバナジン酸ナトリウム)中で均質化した。BCA分
析(Thermo Fisher社)によって決定された通りの等量のタンパク質(15μg)を、4〜20%ポリ
アクリルアミドゲル(Bio-Rad社)上で分離し、ニトロセルロース膜(Bio-Rad社)に転写した
。膜を、5%脱脂粉乳(PBS/0.05% Tween 20中)中でブロッキングし、pSTAT3(Cell Signalin
g社)、STAT3(Cell Signaling社)に対する抗体、又は抗体カクテルI(Cell Signaling社)と
共にインキュベートした。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次
試薬で検出し、Odyssey(登録商標)スキャナ(Li-Cor Biotechnology)を使用して視覚化し
た。
(異種移植実験)
6〜8週齢の無胸腺nu/nu雌マウス(Charles River Laboratories社)に、5×106細胞(200
μL/マウス)を、側腹部に皮下注射した。類似の体積(〜100mm3)の腫瘍を有するマウスを
、無作為にグループ分けし、3×1011 AAV-M70又は対照ウイルス(AAV-GFP)の1回の尾静脈
注射を介して処置した。腫瘍を電子ノギスで測定し、式:(W2×L)/2(式中、W及びLは、そ
れぞれ、より小さい及び大きい径である)を使用して平均腫瘍体積を算出した。
(統計的分析)
すべての結果を、平均±平均値の標準誤差(SEM)として表す。一元配置ANOVA、それに続
くダネットの事後検定を使用して、複数の群(GraphPad Prism(登録商標))からのデータを
比較した。必要な場合、独立スチューデントt検定を使用して、2つの治療群を比較した。
二元配置ANOVA、それに続いてボンフェローニの事後検定を使用して、経時変化研究のた
めに、複数の群を比較した。0.05又はそれよりも小さいp値は、統計的に有意であるとみ
なされた。
(実施例7)
(インビボでの肝細胞腫瘍形成の評価のためのAAV介在性の導入遺伝子システム)
AAV介在性の遺伝子送達は、一般に他のウイルスベクターに関連する炎症反応を起こさ
ずに 連続的導入遺伝子発現を実現するための手段を提供する(Zaissらの文献、2002年、J
.Virol.76、4580〜4590)。AAV遺伝子送達方法を用いて、成体マウスに導入した場合、1年
までの発現の持続が観察されている(Riveraらの文献、1999年、PNAS 96、8657〜8662)。
第1のAAVベクターは、最近、ヒトにおける遺伝性障害のための治療として認可された(Wir
thらの文献、2013年、Gene 525、162〜169)。
これまでに報告されたFGF19トランスジェニックモデルでは、FGF19は、骨格筋、すなわ
ちFGF19発現の非生理学的部位において異所的に発現された(Inagakiらの文献、2005年、C
ell Metabol.2、217〜225;Nicholesらの文献、2002年、Amer.J.Pathol.160、2295〜2307)
。肝硬変又は胆汁うっ滞などの病的状況下では、肝臓においてFGF19発現が誘発される(De
snoyersらの文献、2008年、Oncogene 27、85〜97;Hasegawa Yの文献、2013年、Hepatol.5
8,802A;Schaapらの文献、2009年、Hepatol.49、1228〜1235)。トランスジェニックマウス
を産生する従来の方法に代わるものとして、6〜12週齢のマウスにおいて、FGF19を、AAV
を介して導入した(図6A)。この手法を使用する、導入遺伝子発現の第1の組織は、肝臓で
あり、心臓及び筋肉では、発現はほんのわずかである(データは示さない)。AAVの単回投
与後に、毒性を持たない肝細胞の90〜100%形質導入及び長期遺伝子発現を、以前に報告さ
れた通りに観察した(Zincarelliらの文献、2008年、Mol.Ther.16、1073〜1080)(データは
示さない)。
複数のマウス系統を、FGF19介在性の肝腫瘍形成の潜伏期及び頑健性について評価した(
表2)。対照AAVウイルス(AAV-GFP、緑色蛍光タンパク質)は、肝腫瘍をまったく生じなかっ
た(表2)。
表2に示す通り、FGF19は、複数のマウスモデルにおいて、肝臓癌形成を促進する。様々
な系統のマウス(6〜12週齢)に、FGF19又は対照遺伝子(GFP、緑色蛍光タンパク質)をコー
ドする3×1011ゲノムコピーのAAVベクターを注射した。腫瘍発生率は、AAV投与の24又は5
2週後に決定した。n.d.、未決定。
Figure 2021008499
一般に、AAV-GFPを注射したマウスは、生理食塩水注射動物と類似の表現型を呈した(デ
ータは示さない)。簡略化のために、AAV-GFP注射動物からの結果のみを、次の研究におけ
る対照として示した。
興味深いことに、腫瘍潜伏期は、マウスの遺伝的背景に応じて異なっていた。レプチン
受容体の変異は、硬変した肝臓においてしばしば見られ、ヒトにおけるHCCと関連してい
る(Ikedaらの文献、2014年、Gastroenterol.,146:222〜232;Wangらの文献、2010年;World
J.Gastroenterol.16、5801〜5809)。db/dbマウスは、レプチン受容体における遺伝子欠
陥を有し(Tartagliaらの文献、1995年、Cell 83、1263〜1271)、候補HCCを促進する遺伝
子候補を評価するための、臨床的に関連する遺伝学的状況を提供する。実際、試験された
いくつかのマウス系統の中で、db/dbマウスは、AAV-FGF19送達の24週後に、肝臓表面から
膨隆している複数の大きな盛り上がった腫瘍結節の出現を伴い、最も短い潜伏期と高い腫
瘍浸透性を呈した(図6B)。
血清FGF19 レベルは、db/dbマウスにおける3×1011ゲノムコピーのAAV-FGF19の単回の
尾静脈注射の1週後に、〜 1μg/mlに到達した(図6C)。対照ウイルスを注射したマウスに
おいては、FGF19は検出されなかった。FGF19の高い循環レベルは、24週の研究期間全体を
通して持続した(図6C)。肝臓の表面全体の視認可能な腫瘍結節を数えた(図6D)。肝腫瘍結
節の最大径を記録した(図6D)。対照ウイルス又は生理食塩水を注射したdb/dbマウスにお
いて、いくつかの肝腫瘍結節が観察されることもあり、これは、おそらく、この遺伝的モ
デルにおける腫瘍形成におけるバックグラウンドの増大を反映している(図6D、及び、デ
ータは示さない)。腫瘍スコアシステムは、材料及び方法(実施例6)に記載した通り、肝腫
瘍結節の多重度に基づいて確立した(図6D)。
顕微鏡検査によって、AAV-FGF19誘発性インサイチュー肝腫瘍を、固形HCCと分類した。
これは、FGF19-トランスジェニック動物において報告されるものと似ていた(図6E)。Ki-6
7及びPCNAに対する免疫組織化学的染色によって調べられる細胞増殖状態は、この腫瘍が
高度に増殖性であることを示した。FGF19-トランスジェニックマウスにおいて観察された
ものと同様に、AAV-FGF19マウスにおける肝腫瘍は、グルタミン合成酵素陽性であり、中
心周囲起原を示唆していた(Nicholesらの文献、2002年、Amer.J.Pathol.160、2295〜2307
)(図6E)。AAV-FGF19マウスからの肝腫瘍はまた、β-カテニンに対する核染色の増大を示
した(図6E)。このように、AAV介在性の導入遺伝子発現は、FGF19誘発性肝臓癌形成をイン
ビボで評価するための頑強なシステムを提供する。
(実施例8)
(M70は、操作された腫瘍非存在FGF19バリアントである)
FGF19とFGF21は、同じFGFサブファミリーに属し、34%のアミノ酸同一性を有する。興味
深いことに、FGF19とは異なり、FGF21は、本発明者らのAAV介在性の導入遺伝子モデルに
おいて、肝腫瘍形成を誘発しない(データは示さない)。FGF19によって誘発される腫瘍形
成能にとって重要な構造要素を特定するために、α-ストランド及びβ-ヘリックスを含め
た予測される二次構造要素を規則に従って交換することによって、FGF19とFGF21との間の
、いくつかのキメラ構築物を産生した(表3)。表3は、FGF19又はFGF21に由来するアミノ酸
配列をもつキメラ構築物を示す。肝腫瘍形成を、AAV介在性の導入遺伝子発現の24週後に
評価した。FGF19の二次構成成分(β-シート、及びβ-シート間のループ)は、規則に従っ
て置き換えられる。構築物を、AAVによって、db/dbマウスに個々に導入し、連続的曝露の
24週後に、その腫瘍形成能を評価した。FGF19のN-末端10〜20アミノ酸が、腫瘍形成能に
とって重要であると特定された(表3)。
Figure 2021008499
その後、この領域内のアミノ酸を変更することのみによって、追加の構築物を産生した
(表4)。表4は、N-末端領域におけるFGF19バリアントの構造・活性関連分析を示す。野生
型FGF19からのアミノ酸変化には、下線を引いてある。肝腫瘍形成を、導入遺伝子発現の2
4週後に評価した。
Figure 2021008499
全体で、30を超えるFGF19バリアントを、その腫瘍形成能について、個々に評価した。3
アミノ酸置換(A30S、G31S、H33L)と5-アミノ酸欠失を有するFGF19バリアント(M70と呼ば
れる)(配列番号:1)を、さらなる研究のために選択した(図7A)。
FGF19とは対照的に、24週間のM70への高い全身的曝露を伴うするdb/dbマウスからの肝
臓には、肝腫瘍結節はまったくなかった(FGF19及びM70について、それぞれ、肝臓あたり1
5.6±2.8腫瘍結節、及び肝臓あたり0.0±0.0腫瘍結節 n=5、p＜0.001;図7B)。FGF19を発
現しているマウスは、肝臓重量の有意な増大を呈し(対照マウスにおける1.86±0.12gに対
して2.91±0.19g、n=5、p＜0.001;図7C)、これは、先の研究で報告された通り、肝腫瘍量
と密接に相関する。対照的に、M70を発現しているマウスは、肝臓重量の増大をまったく
示さなかった(FGF19マウスにおける2.91±0.19gに対して1.56±0.09g、n=5、p＜0.001;図
7C)。肝臓-対-体重比を算出すると、類似の結果が得られた(図7D及び図7E)。これらのマ
ウスにおいては、M70の平均血清濃度は、2〜3μg/mlであり、ヒトにおける循環FGF19レベ
ルよりも約10,000倍高かった(図7F)。肝臓組織学的分析では、M70を発現しているマウス
が、マウスにおけるFGF19過剰発現に伴ういかなる識別可能な前腫瘍性及び腫瘍性病変も
発生しなかったことが明らかになった。具体的には、肝臓病巣変化も、肝細胞異形成も、
肝細胞腺腫も、肝細胞癌も、観察されなかった(図7G)。FGF19を発現しているマウスでは
、非腫瘍形成領域は、中心静脈の周囲の細胞密度の増大を示したが、こうした変化は、M7
0を発現しているマウスでは観察されなかった。M70の過剰発現は、FGF19-過剰発現に起因
するKi-67陽性細胞の数の増加を引き起こさなかった(図7G)。さらに、FGF19発現細胞にお
ける肝腫瘍病変が、グルタミン合成酵素について高度に陽性になる一方で、M70発現マウ
スの肝臓では、グルタミン合成酵素の発現の増大は観察されなかった(図7G)。最後に、肝
臓酵素の血清レベルによって決定される通り、M70への長期間の曝露の24週後に、肝臓毒
性は観察されなかった(図7H)。まとめると、これらの結果は、M70が、db/dbマウスにおい
て、肝細胞腫瘍形成を促進する能力を欠いていることを実証している。
rasH2トランスジェニックマウスモデルにおけるM70の腫瘍形成能を、さらに評価した。
ヒトH-RAS導入遺伝子に対して半接合性であるCB6F1-RasH2マウスは、げっ歯類における従
来の 2年の発癌性評価のための加速的評価として、広範に使用されている(Storerらの文
献、2010年、Toxicologic Pathol.38、51〜61)。遺伝毒性発癌物質と非遺伝毒性発癌物質
との両方に対して感受性があるrasH2マウスは、野生型マウスよりも早く、自然発生的新
生物も、誘発される新生物も発生する。この系統はまた、ヒトHCCにおいてRASシグナル伝
達経路の活性化が頻繁に認められるので、肝発癌性を研究するための妥当な遺伝的背景を
提供する(Calvisiらの文献、2006年、Gastroenterol.130、1117〜1128)。
52週の研究の過程にわたって、FGF19及びM70を発現しているrasH2マウスは、対照マウ
スと比較して、体重増加が有意に減少していた(図8A)。しかし、FGF19及びM70を発現して
いる群からの肝臓の形態は、劇的な違いを示した。FGF19を発現しているマウスの肝臓で
は、複数の腫瘍結節を伴う肉眼的形態変化が観察され、これは、HCCの形成と整合性があ
った(肝臓あたり3.8+1.5腫瘍結節;図8B)。対照的に、M70を発現しているマウスからの肝
臓は、正常な肉眼的形態を有し、腫瘍結節はまったくなかった(図8B)。対照rasH2マウス
において、低いレベルの自然発生的肝腫瘍形成が観察されたことに注意するべきである(
図8B)。M70を発現している動物は、FGF19マウスと比較して、肝臓重量の劇的な低下を示
した(FGF19マウスにおける1.71+0.24 gに対して0.76+0.05g、n=9、p＜0.001;図8C)。M70
はまた、rasH2マウス(FGF19マウスにおける8.66+1.36 %に対して5.34+0.24% 、n=9、p＜0
.01;図8D)における肝臓と体重との比を基準化した。これらのマウスにおけるFGF19 及びM
70の血清レベルは、比較可能であり、それぞれ、155±28ng/ml及び209±22ng/mlである(
図8E)。
これらのマウスからのH&E染色された肝臓切片を、腫瘍及び前腫瘍性病変の存在につい
て評価した(図8F)。さらに、FGF19誘発性肝腫瘍のマーカーとしての抗グルタミン合成酵
素染色を実施した(図8F)。グルタミン合成酵素で染色した切片を、H&Eで染色された対と
なる切片から採取し、写真は、同じ門脈(p)及び中心静脈(c)を示した。FGF19を発現して
いるrasH2マウスは、肝細胞腺腫並びに肝細胞癌を示した。FGF19を発現しているrasH2マ
ウスでは、前腫瘍性肝細胞病変も注目された。注目すべきことには、M70を発現している
マウスからの肝臓はいずれも、腫瘍、又は前腫瘍性病変の組織学的証拠を呈しなかった(
図8F)。裏付けとなる組織学的結果、Ki-67及びAFP(HCCにおいてしばしば誘発される胚性
の肝臓タンパク質(Marrero及びEl-Seragの文献、2011年、Hepatol.53、1060〜1062))の肝
臓発現の増大は、FGF19を発現している rasH2マウスでは観察されるが、M70を発現してい
るマウスでは観察されない(図8G)。
これらの結果は、高循環レベルのM70への長期間の曝露(すなわち、db/dbマウスにおけ
る24週又はrasH2マウスにおける52週)は、FGF19とは異なり、肝腫瘍形成を促進しないこ
とを実証している。
(実施例9)
(M70は、インビトロ及びインビボで、FGFR4と結合し活性化させる)
M70が肝腫瘍を誘発できないことを強調する分子機構を解明するために、M70の、FGF19
の公知の受容体複合体に対する相互作用を評価した。表面プラズモン共鳴(SPR)分析を使
用して、M70又はFGF19の、FGFR4に対する直接的結合を測定した。Biacore分析では、M70
又はFGF19を使用して、FGFR4の細胞外ドメイン(ECD)のFc融合タンパク質でコーティング
したチップ上に流した。M70は、FGF19に匹敵する親和性をもってFGFR4と直接的に相互作
用した(それぞれ、解離定数KD=134±47nM及び167±5nM、図9A及び図9B)。M70はまた、KLB
に対して、FGF19と類似の親和性で結合した(それぞれ、KD=24.1+11.0pM及び28.5+0.8pM;
データは示さない)。M70は、FGF19と同じKLBの部位に結合し、これは、競合Biacore分析
によって実証される(データは示さない)。固相分析では、M70は、FGFR4-KLB受容体複合体
と相互作用した(図9C)。KLBの存在は、リガンド-受容体親和性を劇的に増大させた。FGFR
4-KLB受容体複合体に結合しているM70の解離定数は、(FGF19についての2.49 nMのにKD対
して)2.14nMのKDを伴う高親和性相互作用を示した。
M70がその受容体を活性化する能力を、FGF応答性GAL-Elk1ルシフェラーゼレポーター遺
伝子を形質移入させたrat L6細胞を使用する細胞ベースの分析において評価した(Wuらの
文献、2011年、PloS one 6、e17868;Wuらの文献、2010a、PNAS、107、14158〜14163)。こ
の分析では、リガンドのFGFRに対する有効な結合は、内在性のERKキナーゼ経路の活性化
をもたらし、Elk-1活性化ドメイン及びGAL4 DNA-結合ドメインを含むキメラ転写活性化因
子のその後の活性化につながる。L6細胞は、機能性のFGFR又はKLBを欠いており、同族の
受容体で共形質移入された場合に、FGF19に対して応答性であるに過ぎない(データは示さ
ない)。M70は、FGFR4とKLBを共発現しているL6細胞における細胞内シグナル伝達経路を、
FGF19と同じぐらい効率的に活性化した(M70及びFGF19について、それぞれ、EC50=38pM及
び52pM;図9D)。対照的に、FGFR4単独を形質移入させた細胞におけるシグナル伝達は、ど
ちらかのリガンドに対して、かなり低い応答性であり、FGF19又はM70のいずれかの添加時
の強度の＞500倍の低下を示した(図9D)。これらの結果は、FGFR4-KLB共受容体と同族のリ
ガンドとの間の三元複合体の形成が、細胞内シグナル伝達の強力な活性化にとって重要で
あることを示唆する。次いで、Hep3B、すなわちヒトHCC細胞株におけるFGFR4経路活性化
を分析した。Hep3B細胞は、FGFRのアイソフォーム、及びKLBの中で、FGFR4を優勢に発現
する。組み換えM70タンパク質は、野生型FGF19と類似の強度及び効力で、ERKのリン酸化
及び活性化を誘発した(M70及びFGF19について、それぞれ、最大半量有効濃度EC50=0.38nM
及び0.37nM;図9E)。
FGF19/FGF15は、ヒト及びげっ歯類それぞれにおける肝臓の胆汁酸代謝の調節と関連付
けられている(Holtらの文献、2003年、Genes Dev.17、1581〜1591)(Inagakiらの文献、20
05年、Cell Metabol.2、217〜225)。FGF19/FGF15は、FGFR4を必要とする過程で、コレス
テロール-7a-ヒドロキシラーゼ1(Cyp7a1)の肝臓発現を強力に抑制する(Inagakiらの文献
、2005年、Cell Metabol.2、217〜225;Wuらの文献、2011年、PloS one 6,e17868)。M70が
初代肝細胞においてCyp7a1を調節する能力を、評価した。培地への添加時、M70は、マウ
ス、ラット、又はヒト肝臓から得られた初代肝細胞におけるCyp7a1発現を効率的に抑制し
た(図9F)。M70の活性は、野生型FGF19の活性に匹敵していた(初代マウス肝細胞では、FGF
19の0.65pMに対して、M70の最大半量阻害濃度IC50 0.64 pM;初代ラット肝細胞では、FGF1
9の3.96 pMに対して、M70のIC50 0.49 pM;初代ヒト肝細胞では、FGF19の1.73 pMに対して
、M70のIC50 6.80 pM;図9F)。初代ヒト肝細胞では、FGF19の添加は、Cyp7a1 mRNAの97％
の最大抑制をもたらした。同様に、M70は、Cyp7a1発現を98%低下させることが可能であっ
た(図9F)。
インビボでのCyp7a1の肝臓発現に対するM70 投与の急性効果を評価するために、マウス
に、0.001から10mg/kgまでの範囲の用量の、組み換えM70又は FGF19 タンパク質を腹腔内
(i.p.)注射した(図9G)。M70の単回i.p.注射は、1.29μg/kgのED50で、Cyp7a1 mRNAを強力
に抑制した(図9G)。これらのデータは、M70の全身投与が、インビボで、FGFR4介在性の細
胞内を強力にかつ迅速に誘発できることを実証している。
要約すると、M70及び野生型FGF19は、同等の生物活性のプロフィールを呈し、ERKシグ
ナル伝達の活性化及びCyp7a1調節をもたらす。
(実施例10)
(M70は、FGF19と比較した場合にシグナル伝達経路活性化の差異を呈する)
M70は、FGFR4受容体複合体と結合し、細胞内シグナル伝達経路を活性化して、Cyp7a1抑
制をもたらすが、db/db又はrasH2マウスモデルのいずれかにおいては、肝腫瘍形成を促進
しない。腫瘍形成能を欠くことについての分子的機序を解明するために、ERK、PI3K/AKT
、STAT、及びWNT/β-カテニン経路を含めた、腫瘍形成に関与する重要なシグナル伝達タ
ンパク質の活性化を分析した。
M70及びFGF19タンパク質(1mg/kg)を、db/dbマウスの腹腔内に注射した。15分(データは
示さない)、2時間(図10A)、及び4時間(データは示さない)後に肝臓を収集し、免疫ブロッ
ティングによって、シグナル伝達タンパク質のリン酸化を測定した。FGF19とM70は、培養
された初代肝細胞における両方の分子がシグナル伝達する能力と一致して、インビボで肝
臓組織において、類似の程度までERKリン酸化を刺激した。肝臓タンパク質合成を調節す
る際のFGF19の役割に関する以前の報告(Kirらの文献、2011年、Science 331、1621〜1624
)と一致して、野生型FGF19とM70はどちらも、肝臓におけるリボソームS6タンパク質の頑
強なリン酸化を誘発した(図10、及びデータは示さない)。これは、M70が、FGFR4-KLB 受
容体複合体に対する活性を保持するという考えと一致する。M70とFGF19のどちらも、リン
酸化されたAKTの肝臓レベルに対するいかなる効果も有しなかった。試験された3つのすべ
ての時点で、GSK3β及びβ-カテニンの活性化は観察されなかった。
注目すべきことには、FGF19は、投与の2時間後にSTAT3リン酸化を誘発した(図10A)。こ
の効果は、投与の4時間後まで持続した(データは示さない)。対照的に、M70は、STAT3リ
ン酸化を増大させなかった(図10A)。IL-6、すなわち公知のSTAT3活性化因子は、FGF19処
置された肝臓において上方調節されるが、M70-処置された肝臓では上方調節されないこと
が示された(図10B)。pSTAT3の誘発は、タンパク質注射の15分後にも、初代マウス肝細胞
培養株においても観察されなかった(データは示さない)ので、FGF19によるpSTAT3活性化
は、肝臓上での非細胞自律機構が原因のようである。STAT3リン酸化及び活性化を用いた
裏付けによって、FGF19を発現しているがM70を発現していないrasH2肝臓におけるサバイ
ビン、bcl-XL、及びサイクリンD1を含めたSTAT3標的遺伝子の発現の増大が観察された(図
10C)。STAT3は、HCCにおいてしばしば活性化される癌遺伝子である(He及びKarinの文献、
2011年、Cell Res.21、159〜168)ので、FGF19によるその活性化は、FGF19誘発性肝発癌性
に対する説得力のある機構を提示する。M70がSTAT3経路を活性化できないことが、インビ
ボでのその腫瘍形成能の喪失に寄与する可能性がある。
このように、M70は唯一、その受容体の下流の、あるサブセットのシグナル伝達経路、
すなわち選択的モジュレーターの特徴を活性化する(Kenakin及びChristopoulosの文献、2
013年、Nat.Rev.Drug Discov.12、205〜21)。M70の特定及び特徴付けによって、本発明者
らが、FGF19-FGFR4経路、すなわち胆汁酸恒常性及び腫瘍形成によって調節される2つの異
なる生物学的プロセスを定義することが可能になる。
(実施例11)
(M70は、FGF19介在性の腫瘍形成を阻害する)
本発明者らの観察は、M70が、選択的モジュレーター又は「偏ったリガンド」として振
る舞い、代謝性のシグナル伝達を活性化するが、FGFR4からの腫瘍形成シグナルは活性化
しないことを示唆する。次に、オルソステリック又はアロステリック機構を介するFGF19
に伴われる腫瘍形成を阻害するために、M70の偏ったアゴニズムを利用することができる
かどうかを決定した。
db/dbマウスに、10倍モル過剰のAAV-M70(3×1011ゲノムコピー)と共に又は伴わずに、3
×1010ゲノムコピーのAAV-FGF19を注射した。マウスは、導入遺伝子発現の24週後に剖検
し、肝臓を、分析のために用いた。db/dbマウスにおけるFGF19の異所性発現が、肝臓表面
上の腫瘍結節の形成を促進した(肝臓あたり7.8+2.3腫瘍結節)のに対して、FGF19とM70と
の両方を発現しているマウスからの肝臓には、腫瘍結節はまったくなかった(図11A)。M70
共発現マウスからの肝臓重量は、FGF19発現マウスに対して有意に低かった(それぞれ1.59
g±0.14g及び2.42g±0.20g、n=5、p＜0.01;図11B)。M70及びFGF19共処置マウスにおける
、体重に対する肝臓の比は、対照マウスのものと有意差がなかった(図11C)。FGF19の血清
レベルは、単独で投与された場合、94±12ng/mlであり、FGF19とM70との合わせた血清レ
ベルは、453±169ng/mlであった(図11D)。肝臓の組織学的分析によって、M70とFGF19とを
共発現しているマウスは、FGF19発現マウスとは異なり、肝腫瘍のいかなる組織学的証拠
も呈しなかったことが確認された(図11E)。これらのデータは、M70が、FGF19と効率的に
競合して、FGF19発現マウスにおける腫瘍形成を予防することを実証している。
FGF19は、HCC及び結腸癌において増幅及び/又は過剰発現されると報告されている(Desn
oyersらの文献、2008年;Saweyらの文献、2011年、Oncogene 27、85〜97)。あるパネルの
肝臓、結腸、乳房、及び他のヒト癌細胞株をスクリーニングし、FGF19が、特に、Huh-7(H
CC)及びHCT-116(結腸癌)細胞株によって産生及び分泌されることを認め(図11F)、これら
をさらなる研究のために選択した。培地中のFGF19のレベルは、1〜2ng/ml(ELISA測定によ
る)、すなわち、ヒトにおける生理的FGF19濃度の約10倍に到達した。
HCC細胞株Huh-7は、11q13.3アンプリコンを有し、FGF19とCCND1の両方を過剰発現する
。Huh-細胞の腫瘍形成能力に対するM70の効果を試験した。無胸腺ヌードマウスに、Huh-7
細胞を皮下注射し、腫瘍を〜100mm3のサイズに到達させた。この時点で、マウスを2つの
処置群:AAV-M70を静脈内に注射する群と、対照ウイルスを含む別の群とに分けた。M70処
置されたマウスは、28%の増殖の遅延の傾向を呈した(最終段階の腫瘍サイズ:対照におけ
る1856±348mm3、対、M70処置後の1340±406mm3;n=10;図11G)。体重に対する有意な影響
は認められなかった(データは示さない)。
HCT-116結腸癌異種移植増殖に対するM70の効果も試験物(examiner)であった。確立され
たHCT116結腸癌腫瘍を有するマウスに、AAV-M70 又は対照ウイルスを投与した。早ければ
処置開始の8日後に、M70は、腫瘍増殖を37%抑制した(腫瘍サイズ:対照群における459±83
mm3、対、M70群における287±87mm3;n=5;図11H)。処置後15日目に、M70処置されたマウス
は、腫瘍増殖の統計的に有意な71%阻害を呈した(最終段階の腫瘍サイズ:対照における163
4±524mm3、対、M70処置後の479±155mm3、n=5、p＜0.001;図11H及び11I)。体重に対する
有意な影響は認められなかった(図11J)。
これらの結果は、M70が、腫瘍形成シグナル伝達において、野生型FGF19を弱めることが
可能な偏ったリガンドとして作用することを示唆しており、また、FGF19依存性の腫瘍増
殖を抑制するためにM70などの選択的モジュレーターを使用する可能性を実証している。
(実施例12)
(M70は、CT26結腸腫瘍増殖を阻害する)
この研究は、免疫応答能のあるマウスにおける同系モデルにおける腫瘍進行に対するM7
0の効果をさらに評価するために実施した。CT26は、同系Balb/cマウスにおいて良好に移
植及び増殖する、マウス結腸癌細胞株である。CT26は、腫瘍増殖に対する化合物/薬剤を
特徴付けるために、特に、癌免疫療法を評価するために、広く使用した。
陽性対照として、プログラム死-1(Programmed Death-1)(PD-1)に対するブロッキング抗
体を使用した。PD-1とそのリガンドPD-L1/PD-L2は、免疫チェックポイントの軸に相当す
る。PD-1経路は、T-細胞応答を損ない、かつ末梢におけるFoxp3+Tregの誘発を促進するこ
とによって、腫瘍特異的な免疫を下方調節する。他の免疫療法と共にPD-1経路を遮断する
ことは、同系モデルにおける腫瘍進行を阻害する。複数のヒト抗PD-1モノクローナル抗体
(mAb)、並びにヒト抗PD-L1 mAbを、臨床試験に参加させ、第1の抗PD-1抗体が、最近、抗
癌療法として、FDAによって認可された。
Balb/cマウスを、Jackson Laboratory社から購入した。動物は、病原体を含まない動物
施設内に維持した。すべての動物プロトコルは、生物製剤のNGM動物実験委員会(Institut
ional Animal Care and Use Committee)によって認可された。
CT26マウス結腸癌細胞株は、ATCCから購入した。細胞を、10% FBSとペニシリン/ストレ
プトマイシンカクテルを含むDMEM中で培養した。指数関数的に増殖した細胞を、マウスに
おける埋め込みのために収集した。細胞を、注射のために、生理食塩水に再懸濁した。
Balb/cマウスの右側腹部に、1x106 CT26細胞を埋め込んだ。3日後、M70タンパク質を、
15日間、1日1回、CT26埋め込み細胞を有するBalb/cマウスの皮下に注射した。CT26腫瘍の
増殖を、ノギスを用いて週2回測定した。式:腫瘍体積=短径(width)2 *長径(length)/2を
使用して、腫瘍体積を算出した。
図13に示す通り、M70は、10mg/kg用量(図13A)又は3mg/kg用量(図13B)の投与後に、CT26
結腸癌同系マウスモデルにおける腫瘍増殖を、ビヒクル単独に比べて遅延させる。M70は
また、10mg/kg用量(図14A)又は3mg/kg用量(図14B)の投与後に、体重を減少させることも
示された。
このように、これらの研究は、M70処置が、免疫応答能のあるBalb/c同系マウスにおけ
るCT26結腸腫瘍増殖を遅延させることを示し、抗腫瘍効力は、M70のどちらの用量(3mg/kg
及び10mg/kg)についても観察される。
本発明の特定の実施態様を、本発明の実施のための、本発明者らが知る最良の形態を含
めて、本明細書に記載する。開示された実施態様の変形形態は、前述の説明を読んだ際に
、当業者に明らかとなり得、また、当業者がこうした変形形態を適宜用いることができる
ことが予想される。したがって、本発明は、本明細書に具体的に記載されているのとは別
の方法でも実施され、また、本発明は、適用法によって許可される通りの、本明細書に添
付された特許請求の範囲に列挙した対象物の、すべての改変物及び等価物を含むことが意
図される。さらに、すべての可能な変形形態の、先に記載した要素の任意の組み合わせも
、本明細書内でそうではないと示される又は文脈によってそうではないと明確に否定され
るのではない限り、本発明によって包含される。
本明細書に引用した、すべての刊行物、特許出願、受託番号、及び他の参考文献を、ま
るで、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が、具体的かつ個々に参照によって組み込まれ
ることが示されるかのように、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む。本明細
書に取り上げた刊行物は、もっぱら、本出願の出願日より前のその開示のために提供され
る。本明細書では何も、先行発明という理由で、本発明がこうした刊行物に先行する権利
を与えられない了解と解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実
際の公開日とは異なる可能性があり、これは、独自に確認する必要がある可能性がある。
(配列表)
本明細書は、配列表のコンピュータ読み取り可能形式(CRF)複写と共に出願することと
なる。2014年10月27日に作成された、サイズが50,105バイトである、13370-020-228_SEQL
IST.txtというタイトルのCRFは、その配列表の紙複写と同一であり、その内容全体を参照
によって本明細書に組み込む。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
代謝障害を患う試験対象が、FGF19バリアントでの治療の候補であるかどうかを決定す
るための方法であって、
(a)FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを、代謝障害を患う前記試験対象に共投
与する(ここでは、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団に
おいて癌性状態を誘発するのに十分である)ことと、
(b)前記試験対象において、癌性状態の徴候が観察されるかどうかを決定することとを含
み、
ここでは、癌性状態の徴候の非存在が、前記試験対象が、FGF19バリアントでの治療のた
めの候補であることを示す、
前記方法。
（構成２）
代謝障害を患う試験対象が、FGF19バリアントでの治療の候補であるかどうかを決定す
るための方法であって、
(a)癌性状態の徴候を有する試験対象であって、代謝障害を患う前記試験対象を提供する
ことと、FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここ
では、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状
態を誘発するのに十分である)ことと、
(b)前記試験対象において癌性状態の徴候が増強されるかどうかを決定することとを含み
、
ここでは、癌性状態の徴候の増強の非存在が、前記試験対象がFGF19バリアントでの治療
の候補であることを示す、
前記方法。
（構成３）
代謝障害を患う試験対象が、FGF19バリアントでの治療の候補であるかどうかを決定す
るための方法であって、
(a)癌性状態の徴候を有する試験対象であって、代謝障害を患う前記試験対象を提供する
ことと、FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここ
では、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状
態を誘発するのに十分である)ことと、
(b)前記試験対象において癌性状態の徴候が低減されるかどうかを決定することとを含み
、
ここでは、癌性状態の徴候の低減が、前記試験対象がFGF19バリアントでの治療の候補で
あることを示す、
前記方法。
（構成４）
癌性状態の徴候が、腫瘍である、構成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成５）
前記腫瘍が、結腸腫瘍又は肝腫瘍である、構成4記載の方法。
（構成６）
前記癌性状態の徴候の低減が、腫瘍数、腫瘍サイズ、又は腫瘍重量の低下によって決定
される、構成3記載の方法。
（構成７）
前記FGF19バリアントが、配列番号:1に示したアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列
からなる、構成1から6のいずれか1項記載の方法。
（構成８）
前記FGF19バリアントが、配列番号:5から29のうちのいずれか1つに示したアミノ酸配列
;又はこれらの部分配列又は断片を含む又はこれらからなる、構成1から6のいずれか1項記
載の方法。
（構成９）
前記対象が、動物である、構成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成１０）
前記対象が、マウスである、構成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成１１）
前記マウスが、db/dbマウスである、構成10記載の方法。
（構成１２）
前記候補FGF19バリアントポリペプチドが、高血糖状態、インスリン抵抗性、高インス
リン血症、耐糖能障害、及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なく
とも1つの状態を改善する、構成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成１３）
前記高血糖状態が、糖尿病を含む、構成12記載の方法。
（構成１４）
前記候補FGF19バリアントポリペプチドが、肥満又は望ましくない体重を改善する、構
成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成１５）
前記試験対象が、試料集団における成熟FGF19のレベルと比較して、上昇したレベルの
成熟FGF19を有する、構成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成１６）
前記試験対象が、FGF19を過剰発現する、構成15記載の方法。
（構成１７）
前記FGF19又はFGF19代替物及びFGF19バリアントのうちの少なくとも1つが標識される、
構成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成１８）
前記標識が、FLAG-タグを含む、構成17記載の方法。
（構成１９）
前記決定ステップが、共投与ステップの20週後よりも後に実施される、構成1から3のい
ずれか1項記載の方法。
（構成２０）
FGF19が、前記FGF19バリアントと共投与される、構成1から3のいずれか1項記載の方法
。
（構成２１）
FGF19バリアントが、代謝障害を患う試験対象を治療するための候補であるかどうかを
決定するための方法であって、
(a)FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを、代謝障害を患う前記試験対象に共投
与する(ここでは、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団に
おいて癌性状態を誘発するのに十分である)ことと、
(b)前記試験対象において、癌性状態の徴候が観察されるかどうかを決定することとを含
み、
ここでは、癌性状態の徴候の非存在が、FGF19バリアントが、前記試験対象の治療のため
の候補であることを示す、
前記方法。
（構成２２）
FGF19バリアントが、代謝障害を患う試験対象を治療するための候補であるかどうかを
決定するための方法であって、
(a)代謝障害を患う試験対象であって、癌性状態の徴候を有する試験対象を提供すること
と、FGF19又はFGF19代替物と、FGF19バリアントとを前記試験対象に共投与する(ここでは
、前記試験対象に投与されるFGF19又はFGF19代替物の量は、参照集団において癌性状態を
増悪させるのに十分である)ことと、
(b)前記試験対象において、癌性状態の徴候が増強されるかどうかを決定することとを含
み、
ここでは、癌性状態の徴候の増悪の非存在が、FGF19バリアントが、前記試験対象の治療
のための候補であることを示す、
前記方法。
（構成２３）
癌性状態の徴候が、前記試験対象において低減される、構成22記載の方法。
（構成２４）
癌性状態の徴候が、腫瘍である、構成21から23のいずれか1項記載の方法。
（構成２５）
前記腫瘍が、結腸腫瘍又は肝腫瘍である、構成24記載の方法。
（構成２６）
癌性状態の徴候の前記低減が、腫瘍数、腫瘍サイズ、又は腫瘍重量の低下によって決定
される、構成23記載の方法。
（構成２７）
前記対象が、動物である、構成21から23のいずれか1項記載の方法。
（構成２８）
前記対象が、マウスである、構成21から23のいずれか1項記載の方法。
（構成２９）
前記マウスが、db/dbマウスである、構成28記載の方法。
（構成３０）
前記候補FGF19バリアントポリペプチドが、高血糖状態、インスリン抵抗性、高インス
リン血症、耐糖能障害、及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される少なく
とも1つの状態を改善する、構成21から23のいずれか1項記載の方法。
（構成３１）
前記高血糖状態が、糖尿病を含む、構成30記載の方法。
（構成３２）
前記候補FGF19バリアントポリペプチドが、肥満又は望ましくない体重を改善する、構
成21から23のいずれか1項記載の方法。
（構成３３）
前記試験対象が、試料集団における成熟FGF19のレベルと比較して、上昇したレベルの
成熟FGF19を有する、構成21から23のいずれか1項記載の方法。
（構成３４）
前記試験対象が、FGF19を過剰発現する、構成33記載の方法。
（構成３５）
前記FGF19又はFGF19代替物及びFGF19バリアントのうちの少なくとも1つが標識される、
構成1から3のいずれか1項記載の方法。
（構成３６）
前記標識が、FLAG-タグを含む、構成35記載の方法。
（構成３７）
FGF19が、前記FGF19バリアントと共投与される、構成21又は22記載の方法。
（構成３８）
前記決定ステップが、共投与ステップの20週後よりも後に実施される、構成21又は22記
載の方法。
（構成３９）
前記決定ステップが、共投与ステップの9か月後よりも後に実施される、構成21又は22
記載の方法。
（構成４０）
前記決定ステップが、共投与ステップの12か月後よりも後に実施される、構成21又は22
記載の方法。
（構成４１）
代謝障害を患う対象を治療する方法であって、
(a)代謝障害を患う対象(ここでは、該対象は、FGF19誘発性癌性状態の徴候を呈する)を提
供することと、
(b)構成21から23のいずれか1項において特定される治療有効量のFGF19バリアントを該対
象に投与することとを含み、
ここでは、該対象における代謝障害の改善が存在する、
前記方法。
（構成４２）
前記対象が、動物である、構成41記載の方法。
（構成４３）
前記対象が、ヒトである、構成42記載の方法。
（構成４４）
前記癌性状態が、腫瘍である、構成41記載の方法。
（構成４５）
前記腫瘍が、結腸腫瘍又は肝腫瘍である、構成44記載の方法。
（構成４６）
前記代謝障害が、高血糖状態、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、肥
満、及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される、構成41記載の方法。
（構成４７）
前記高血糖状態が、糖尿病である、構成46記載の方法。
（構成４８）
前記対象における代謝障害の改善が、血糖の低下である、構成41記載の方法。
（構成４９）
前記対象における代謝障害の改善が、体重の減少である、構成41記載の方法。
（構成５０）
前記対象における代謝障害の改善が、インスリンの低下である、構成41記載の方法。
（構成５１）
FGF19バリアントが、代謝障害を患う対象における癌性の疾患、障害、又は状態を予防
するための候補であるかどうかを決定するためのモデルであって、(i)有効量のFGF19又は
FGF19代替物の投与の前に癌性状態の徴候を呈しない、かつ(ii)FGF19又はFGF19代替物の
投与の後に癌性状態の徴候(ここでは、癌性状態の徴候は、配列番号:1に示したアミノ酸
配列を含む、又は該アミノ酸配列からなる有効量のポリペプチドの投与時に改善する)を
呈する対象を含む、前記モデル。
（構成５２）
FGF19バリアントが、代謝障害を患う対象における癌性の疾患、障害、又は状態を治療
するための候補であるかどうかを決定するためのモデルであって、FGF19又はFGF19代替物
の投与に由来する癌の少なくとも1つの徴候を有する(ここでは、癌の徴候は、配列番号:1
に示したアミノ酸配列を含む、又は該アミノ酸配列からなる有効量のポリペプチドの投与
時に改善する)対象を含む、前記モデル。
（構成５３）
前記癌の徴候が、腫瘍である、構成51又は52記載のモデル。
（構成５４）
前記腫瘍が、結腸腫瘍又は肝腫瘍である、構成53記載のモデル。
（構成５５）
前記癌の徴候の改善が、腫瘍数、腫瘍サイズ、又は腫瘍重量の低下である、構成51から
54のいずれか1項記載のモデル。
（構成５６）
前記対象が、マウスである、構成51から55のいずれか1項記載のモデル。
（構成５７）
前記マウスが、db/dbマウスである、構成56記載のモデル。
（構成５８）
前記FGF19又はFGF19代替物及びFGF19バリアントのうちの少なくとも1つが標識される、
構成51から57のいずれか1項記載のモデル。
（構成５９）
前記標識が、FLAG-タグを含む、構成58記載のモデル。
（構成６０）
前記代謝障害が、高血糖状態、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、肥
満、及びメタボリックシンドロームからなる群から選択される、構成51又は52記載のモデ
ル。
（構成６１）
前記高血糖状態が、糖尿病である、構成60記載のモデル。
（構成６２）
ステップi)が、有効量のFGF19の投与を含む、構成51から61のいずれか1項記載のモデル
。
（構成６３）
対象におけるFGF19の発癌活性を弱める方法であって、該対象に治療有効量のFGF19バリ
アントを投与し、それによって、該対象におけるFGF19の発癌活性を弱めることを含む前
記方法。
（構成６４）
対象におけるFGF19依存性の癌若しくは腫瘍、又はこれらの症状を治療する方法であっ
て、治療有効量のFGF19バリアントを該対象に投与することを含み、ここでは、対象にお
ける癌、腫瘍、又はこれらの症状の改善が存在する、前記方法である。
（構成６５）
対象におけるFGF19依存性の癌若しくは腫瘍、又はこれらの症状を予防する方法であっ
て、治療有効量のFGF19バリアントを該対象に投与することを含み、ここでは、該対象に
おける癌、腫瘍、又はこれらの症状が予防され、それによって、該対象におけるFGF19依
存性の癌又は腫瘍が予防される、前記方法。
（構成６６）
前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、肝細胞癌である、構成64又は65記載の方法。
（構成６７）
前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、肝細胞癌ではない、構成64又は65記載の方法。
（構成６８）
前記癌又は腫瘍が、結腸癌又は腫瘍である、構成64又は65記載の方法。
（構成６９）
前記癌又は腫瘍が、前立腺癌又は腫瘍である、構成64又は65記載の方法。
（構成７０）
前記癌又は腫瘍が、肺癌又は腫瘍である、構成64又は65記載の方法。
（構成７１）
前記FGF19バリアントが、配列番号:1に示したアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列
からなるポリペプチドである、構成63から70のいずれか1項記載の方法。
（構成７２）
前記対象が、その必要がある対象である、構成63から71のいずれか1項記載の方法。

Claims (30)

  1. FGF19バリアントを含む、対象におけるFGF19依存性の癌若しくは腫瘍、又はその症状を
    治療するための医薬組成物であって、該FGF19バリアントが、配列番号:1及び5〜29のいず
    れか1つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記医薬組成物。
  2. 前記FGF19バリアントが、配列番号:1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであ
    る、請求項1記載の医薬組成物。
  3. 前記FGF19バリアントが、配列番号:1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドで
    ある、請求項1記載の医薬組成物。
  4. 前記FGF19バリアントが、配列番号:5〜29のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む
    、請求項1記載の医薬組成物。
  5. 前記FGF19バリアントが、配列番号:5〜29のいずれか1つに示されるアミノ酸配列からな
    る、請求項1記載の医薬組成物。
  6. 前記対象が、その必要がある対象である、請求項1〜5のいずれか1項記載の医薬組成物
    。
  7. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、肝細胞癌である、請求項1〜6のいずれか1項記載の医
    薬組成物。
  8. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、結腸癌又は結腸腫瘍である、請求項1〜6のいずれか1
    項記載の医薬組成物。
  9. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、前立腺癌又は前立腺腫瘍である、請求項1〜6のいず
    れか1項記載の医薬組成物。
  10. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、肺癌又は肺腫瘍である、請求項1〜6のいずれか1項記
    載の医薬組成物。
  11. FGF19バリアントを含む、対象におけるFGF19依存性の癌若しくは腫瘍、又はその症状を
    予防するための医薬組成物であって、該FGF19バリアントが、配列番号:1及び5〜29のいず
    れか1つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記医薬組成物。
  12. 前記FGF19バリアントが、配列番号:1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであ
    る、請求項11記載の医薬組成物。
  13. 前記FGF19バリアントが、配列番号:1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドで
    ある、請求項11記載の医薬組成物。
  14. 前記FGF19バリアントが、配列番号:5〜29のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む
    、請求項11記載の医薬組成物。
  15. 前記FGF19バリアントが、配列番号:5〜29のいずれか1つに示されるアミノ酸配列からな
    る、請求項11記載の医薬組成物。
  16. 前記対象が、その必要がある対象である、請求項11〜15のいずれか1項記載の医薬組成
    物。
  17. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、肝細胞癌である、請求項11〜16のいずれか1項記載の
    医薬組成物。
  18. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、結腸癌又は結腸腫瘍である、請求項11〜16のいずれ
    か1項記載の医薬組成物。
  19. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、前立腺癌又は前立腺腫瘍である、請求項11〜16のい
    ずれか1項記載の医薬組成物。
  20. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、肺癌又は肺腫瘍である、請求項11〜16のいずれか1項
    記載の医薬組成物。
  21. FGF19バリアントを含む、対象におけるFGF19の発癌活性を弱めるための医薬組成物であ
    って、該FGF19バリアントが、配列番号:1及び5〜29のいずれか1つに示されるアミノ酸配
    列を含むポリペプチドである、前記医薬組成物。
  22. 前記FGF19バリアントが、配列番号:1に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであ
    る、請求項21記載の医薬組成物。
  23. 前記FGF19バリアントが、配列番号:1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドで
    ある、請求項21記載の医薬組成物。
  24. 前記FGF19バリアントが、配列番号:5〜29のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む
    、請求項21記載の医薬組成物。
  25. 前記FGF19バリアントが、配列番号:5〜29のいずれか1つに示されるアミノ酸配列からな
    る、請求項21記載の医薬組成物。
  26. 前記対象が、その必要がある対象である、請求項21〜25のいずれか1項記載の医薬組成
    物。
  27. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、肝細胞癌である、請求項21〜26のいずれか1項記載の
    医薬組成物。
  28. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、結腸癌又は結腸腫瘍である、請求項21〜26のいずれ
    か1項記載の医薬組成物。
  29. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、前立腺癌又は前立腺腫瘍である、請求項21〜26のい
    ずれか1項記載の医薬組成物。
  30. 前記FGF19依存性の癌又は腫瘍が、肺癌又は肺腫瘍である、請求項21〜26のいずれか1項
    記載の医薬組成物。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2558115B1 (en) 2010-04-16 2019-07-31 The Salk Institute for Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using fgf
AU2012279237B2 (en) 2011-07-01 2016-09-29 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
ES2828505T3 (es) 2012-11-28 2021-05-26 Ngm Biopharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos y enfermedades metabólicos
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
RU2675514C2 (ru) 2012-12-27 2018-12-19 ЭнДжиЭм БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. Способы модуляции гомеостаза желчных кислот и лечение расстройств и заболеваний, ассоциированных с желчными кислотами
CA2928135A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (fgf) 1 and methods of use
WO2015061331A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use
EP3062881B1 (en) 2013-10-28 2019-10-02 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Cancer models and associated methods
DK3097122T3 (da) 2014-01-24 2020-08-10 Ngm Biopharmaceuticals Inc Antistoffer, der binder beta-klotho-domæne 2, og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
AU2015277438B2 (en) 2014-06-16 2020-02-27 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
CA2964782A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising peptide variants and methods of use thereof
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
WO2017019957A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
AU2016344134A1 (en) 2015-10-30 2018-05-31 Salk Institute For Biological Studies Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (FGF) 1 analogs
EP3377090B1 (en) 2015-11-09 2021-04-07 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
WO2018026713A1 (en) * 2016-08-01 2018-02-08 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor (fgf) 1 proteins with glucose lowering ability and reduced mitogenicity
EP3503882A4 (en) 2016-08-26 2020-07-29 NGM Biopharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-19-MEDIATED CARCINOMAS AND TUMORS
CN109722480B (zh) * 2018-05-17 2022-04-26 上海交通大学 一种非小细胞肺癌检测试剂盒及其应用
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
CN113735960B (zh) * 2021-03-12 2023-04-28 江南大学 一种fgf重组蛋白治疗nash的应用
CN114731985B (zh) * 2022-03-29 2023-09-26 华南理工大学 一种代谢相关脂肪性肝病非人灵长类动物模型的构建方法

Family Cites Families (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US20020042367A1 (en) 1997-11-25 2002-04-11 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity and related disorders
US20020012961A1 (en) 1999-04-15 2002-01-31 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor- 19
US20060246540A1 (en) 1997-08-26 2006-11-02 Ashkenazi Avi J Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030113718A1 (en) 1997-09-17 2003-06-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
NZ503343A (en) 1997-09-17 2002-09-27 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and use to induce apoptosis of tumour cells
US20030108983A1 (en) 1997-09-17 2003-06-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6806352B2 (en) 1997-09-17 2004-10-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020155543A1 (en) 1997-11-25 2002-10-24 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity and related disorders
US20050026832A1 (en) * 1997-11-25 2005-02-03 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity and related disorders
US20040126852A1 (en) 1997-11-25 2004-07-01 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity
WO2000060085A1 (en) 1999-04-02 2000-10-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor-20
US7390879B2 (en) 1999-06-15 2008-06-24 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7129072B1 (en) 1999-08-30 2006-10-31 New York University Crystal of fibroblast growth factor receptor 1 in complex with fibroblast growth factor
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
AU7368100A (en) 1999-09-10 2001-04-10 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
US6797695B1 (en) 1999-10-22 2004-09-28 Kyoto University Human FGF-20 gene and gene expression products
ATE446365T1 (de) 1999-11-18 2009-11-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Menschliches fgf-21 gen und genexpressionsprodukte
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
EP1246843A1 (en) 2000-01-05 2002-10-09 ZymoGenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf12
US20010044525A1 (en) 2000-01-05 2001-11-22 Conklin Darrell C. Novel FGF Homolog zFGF12
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
AU2631001A (en) 2000-01-05 2001-07-16 Zymogenetics Inc. Novel fgf homolog zfgf11
US20060160181A1 (en) 2000-02-15 2006-07-20 Amgen Inc. Fibroblast Growth Factor-23 molecules and uses thereof
JP2005508131A (ja) 2000-02-15 2005-03-31 アムジェン インコーポレイテッド 線維芽細胞成長因子−２３分子およびその使用
US20030180312A1 (en) 2000-02-22 2003-09-25 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2001249125A1 (en) 2000-03-08 2001-09-17 Chiron Corporation Human fgf-23 gene and gene expression products
WO2001066596A2 (en) 2000-03-08 2001-09-13 Chiron Corporation Human fgf-23 gene and gene expression products
AU5056501A (en) 2000-03-31 2001-10-08 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
US20030065140A1 (en) 2000-04-03 2003-04-03 Vernet Corine A.M. Novel proteins and nucleic acids encoding same
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
KR20090036151A (ko) 2000-07-19 2009-04-13 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코포레이션 신규 섬유아세포 성장 인자 (ｆｇｆ23) 및 그의 이용 방법
CA2416538A1 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
US6812339B1 (en) 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
US20070037165A1 (en) 2000-09-08 2007-02-15 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
US7265210B2 (en) 2000-09-15 2007-09-04 Genentech, Inc. Anti-PRO9821 antibodies
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
AU2002230531A1 (en) 2000-11-22 2002-06-03 Bayer Corporation Use of fgf-19 for inhibiting angiogenesis
US20020151496A1 (en) 2000-12-08 2002-10-17 Bringmann Peter W. Novel fibroblast growth factors
DE10100588A1 (de) 2001-01-09 2002-07-18 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens
DE10100587C1 (de) 2001-01-09 2002-11-21 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens
US7164007B2 (en) 2001-06-20 2007-01-16 Genentech, Inc. Anti-PR020044 antibodies
AU2003225903A1 (en) 2002-03-21 2003-10-08 Curagen Corporation Methods of using farnesoid x receptor (fxr) agonists
US6987121B2 (en) 2002-04-25 2006-01-17 Smithkline Beecham Corporation Compositions and methods for hepatoprotection and treatment of cholestasis
EP1553912A4 (en) 2002-06-07 2007-08-08 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TUMOR DIAGNOSIS AND TREATMENT
WO2004026228A2 (en) 2002-09-18 2004-04-01 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
US20050181375A1 (en) 2003-01-10 2005-08-18 Natasha Aziz Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer
PT2949658T (pt) 2003-03-03 2018-10-18 Bracco Suisse Sa Péptidos que ligam especificamente o recetor de hgf (cmet) e utilizações dos mesmos
DK1641483T3 (da) 2003-06-12 2008-06-02 Lilly Co Eli Fusionsproteiner
KR20060135648A (ko) 2003-12-10 2006-12-29 일라이 릴리 앤드 캄파니 섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인
EP2194064A1 (en) 2004-05-13 2010-06-09 Eli Lilly & Company FGF-21 fusion proteins
JP2006016323A (ja) 2004-06-30 2006-01-19 Hiroshima Industrial Promotion Organization 生理活性バイオマテリアル
EP1789442B1 (en) 2004-09-02 2009-09-30 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
EP1789443A1 (en) 2004-09-02 2007-05-30 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
EP1817335A2 (en) 2004-10-29 2007-08-15 Genentech, Inc. Disruptions of genes encoding secreted proteins, compositions and methods relating thereto
CA2586201A1 (en) 2004-11-03 2006-05-11 Almac Diagnostics Limited Transcriptome microarray technology and methods of using the same
US7655627B2 (en) 2004-12-14 2010-02-02 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
US20060275794A1 (en) 2005-03-07 2006-12-07 Invitrogen Corporation Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents
CA2614039C (en) 2005-07-22 2015-10-13 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins
US20090081658A1 (en) 2005-08-24 2009-03-26 Abdelmajid Belouchi Genemap of the human genes associated with crohn's disease
US20090312265A1 (en) 2006-02-10 2009-12-17 Dermagen Ab Novel antimicrobial peptides and use thereof
WO2008021196A2 (en) 2006-08-09 2008-02-21 The Mclean Hospital Corporation Methods and compositions for the treatment of medical disorders
AU2007293465A1 (en) 2006-09-01 2008-03-13 American Type Culture Collection Compositions and methods for diagnosis and treatment of Type 2 Diabetes
WO2008052796A1 (en) 2006-11-03 2008-05-08 U3 Pharma Gmbh Fgfr4 antibodies
CA2711267C (en) 2007-01-03 2018-07-10 California Stem Cell, Inc. Stem cell growth media and methods of making and using same
US8067532B2 (en) 2007-01-19 2011-11-29 Kai Pharmaceuticals, Inc. Modifications of peptide compositions to increase stability and delivery efficiency
US8012931B2 (en) 2007-03-30 2011-09-06 Ambrx, Inc. Modified FGF-21 polypeptides and their uses
ES2665996T3 (es) 2007-04-02 2018-04-30 Genentech, Inc. Anticuerpo agonista de klotho-beta para utilizar en el tratamiento de diabetes mellitus o resistencia a la insulina
EP2036539A1 (en) 2007-09-11 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Stable formulations of amylin and its analogues
US20120142546A1 (en) 2007-12-10 2012-06-07 The Johns Hopkins University Hypomethylated genes in cancer
EP2080812A1 (en) 2008-01-18 2009-07-22 Transmedi SA Compositions and methods of detecting post-stop peptides
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
US8420088B2 (en) 2008-01-28 2013-04-16 Novartis Ag Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides
US20090226459A1 (en) * 2008-01-29 2009-09-10 Cold Spring Harbor Laboratory Role of fgf-19 in cancer diagnosis and treatment
NZ579566A (en) 2008-03-19 2013-01-25 Ambrx Inc Modified fgf-21 polypeptides and their uses
WO2009117622A2 (en) 2008-03-19 2009-09-24 Ambrx, Inc. Modified fgf-23 polypeptides and their uses
WO2009116861A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Podiceps B.V. Diagnostic of pre-symptomatic metabolic syndrome
CN101591653B (zh) 2008-05-27 2013-07-31 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 低表达cyp7a1的肝细胞及其构建方法
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
US8363365B2 (en) 2008-06-17 2013-01-29 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Semiconductor device
FR2933702A1 (fr) 2008-07-08 2010-01-15 Sanofi Aventis Antagonistes specifiques du recepteur fgf-r4
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
US8338569B2 (en) 2008-08-04 2012-12-25 Five Prime Therapeutics, Inc. FGFR extracellular domain acidic region muteins
SG195542A1 (en) 2008-10-10 2013-12-30 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010065439A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
US20120035105A1 (en) 2009-01-09 2012-02-09 Sdg, Inc. Insulin Therapies for the Treatment of Diabetes, Diabetes Related Ailments, and/or Diseases or Conditions Other Than Diabetes or Diabetes Related Ailments
WO2010080730A2 (en) 2009-01-09 2010-07-15 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for delivering bile acids
US20100274362A1 (en) 2009-01-15 2010-10-28 Avner Yayon Cartilage particle tissue mixtures optionally combined with a cancellous construct
LT2393828T (lt) 2009-02-03 2017-01-25 Amunix Operating Inc. Prailginti rekombinantiniai polipeptidai ir juos apimančios kompozicijos
CA2760674A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
AR076541A1 (es) 2009-05-05 2011-06-22 Amgen Inc Mutantes de fgf21 y usos del mismo
US8461111B2 (en) 2009-05-20 2013-06-11 Florida State University Research Foundation Fibroblast growth factor mutants having improved functional half-life and methods of their use
US10241093B2 (en) 2009-05-28 2019-03-26 The Cleveland Clinic Foundation Trimethylamine-containing compounds for diagnosis and prediction of disease
WO2010139741A1 (en) 2009-06-04 2010-12-09 Novartis Ag Fgf-21 for treating cancers
US20120172298A1 (en) 2009-06-11 2012-07-05 Novo Nordisk A/S Glp-1 and fgf21 combinations for treatment of diabetes type 2
JP2012530493A (ja) 2009-06-17 2012-12-06 アムジエン・インコーポレーテツド キメラポリペプチドおよびその使用
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
CN102656266B (zh) 2009-10-15 2016-08-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改变的受体特异性的嵌合成纤维细胞生长因子
US8889621B2 (en) 2009-10-30 2014-11-18 New York University Inhibiting binding of FGF23 to the binary FGFR-Klotho complex for the treatment of hypophosphatemia
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
WO2011084808A2 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Amunix Operating Inc. Bifunctional polypeptide compositions and methods for treatment of metabolic and cardiovascular diseases
EP2460527A1 (en) 2010-01-21 2012-06-06 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
US20110195077A1 (en) 2010-01-29 2011-08-11 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion ppolypeptides
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
EP2558115B1 (en) 2010-04-16 2019-07-31 The Salk Institute for Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using fgf
JP2013533227A (ja) 2010-06-08 2013-08-22 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｆｇｆ２１類似体および誘導体
CN103415300B (zh) 2010-07-20 2018-02-23 诺沃—诺迪斯克有限公司 N‑末端修饰的fgf21化合物
CN103221039A (zh) 2010-09-09 2013-07-24 三叶草私人有限公司 血管生成抑制剂的气道给药
US8993727B2 (en) 2010-09-22 2015-03-31 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
CN102464712A (zh) 2010-11-11 2012-05-23 重庆富进生物医药有限公司 缺失型人成纤维细胞生长因子21变异体及其偶联物
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
JP5613547B2 (ja) 2010-12-14 2014-10-22 株式会社スクウェア・エニックス タスクベースの並列プログラミング言語
BR112013015861A2 (pt) 2010-12-22 2018-06-05 Marcadia Biotech Inc métodos para reduzir ganho de peso ou induzir perda de peso, e para tratar hiperglicemia, reduzir níveis de glicose no sangue, ou normalizar níveis de glicose no sangue.
WO2012086809A1 (ja) 2010-12-24 2012-06-28 独立行政法人産業技術総合研究所 ヒトfgf19活性の正確で高感度な測定方法ならびにヒトfgf19活性の制御剤
WO2012125812A1 (en) 2011-03-17 2012-09-20 Novartis Ag Fgfr and ligands thereof as biomarkers for breast cancer in hr positive subjects
JP5977814B2 (ja) 2011-04-08 2016-08-24 アムジエン・インコーポレーテツド 増殖分化因子１５（ｇｄｆ−１５）を使用して代謝障害を治療または改善する方法
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
US20140189893A1 (en) 2011-05-10 2014-07-03 Amgen Inc. Method of identifying compounds that specifically modulate the interaction of fgfr1 and beta klotho
PE20140995A1 (es) 2011-05-16 2014-08-23 Genentech Inc Agonistas de fgfr1 y sus metodos de uso
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
KR20140039278A (ko) 2011-06-08 2014-04-01 드노보 바이오파마 (항주) 리미티드 코포레이션 레티노이드 x 수용체 모듈레이터 활성 예측 방법 및 조성물
US20140294820A1 (en) 2011-06-24 2014-10-02 University Of Miami Fibroblast growth factor receptor inhibition for the treatment of disease
AU2012279237B2 (en) 2011-07-01 2016-09-29 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
WO2013027191A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion polypeptides
WO2013033452A2 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating type 1 diabetes using fgf21
UY34347A (es) 2011-09-26 2013-04-30 Novartis Ag Proteínas de función dual para tratar trastornos metabólicos
TWI593708B (zh) 2011-09-26 2017-08-01 諾華公司 治療代謝病症之融合蛋白質
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
CN103127503B (zh) 2011-11-23 2017-11-10 上海医学生命科学研究中心有限公司 拮抗和/或阻断IL‑6/IL‑6R/gp130信号通路在抗肝癌治疗中的用途
WO2013109856A2 (en) * 2012-01-18 2013-07-25 Genentech, Inc. Methods of using fgf19 modulators
US9475856B2 (en) 2012-03-02 2016-10-25 New York University Chimeric FGF21 proteins with enhanced binding affinity for β-klotho for the treatment of type II diabetes, obesity, and related metabolic disorders
JP2013194049A (ja) 2012-03-23 2013-09-30 Kazuo Todokoro ヒト造血幹細胞を増幅させるための組成物及び方法
EP2833892A4 (en) 2012-04-02 2016-07-20 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS AND PEPTIDES ASSOCIATED WITH ONCOLOGY
WO2013156920A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Klotho variant polypeptides and uses thereof in therapy
CA2869320A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Eli Lilly And Company Therapeutic uses of fibroblast growth factor 21 variant proteins to increase bone formation or depositions
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
TWI513705B (zh) 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
US9422353B2 (en) 2012-06-11 2016-08-23 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variant, composition , and uses thereof
CN109627239B (zh) 2012-07-11 2021-10-12 缆图药品公司 成纤维细胞生长因子受体的抑制剂
TW201420606A (zh) 2012-08-22 2014-06-01 Lilly Co Eli 同源二聚體蛋白
MX2015002985A (es) 2012-09-07 2015-06-22 Sanofi Sa Proteinas de fusion para el tratamiento de un sindrome metabolico.
ES2828505T3 (es) 2012-11-28 2021-05-26 Ngm Biopharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos y enfermedades metabólicos
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
RU2675514C2 (ru) 2012-12-27 2018-12-19 ЭнДжиЭм БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. Способы модуляции гомеостаза желчных кислот и лечение расстройств и заболеваний, ассоциированных с желчными кислотами
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2014130659A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2014152090A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Georgetown University Compositions and treatments of metabolic disorders using fgf binding protein 3 and fgf 19
WO2014152089A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Georgetown University Compositions and treatments of metabolic disorders using fgf binding protein 3
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
CA2928135A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (fgf) 1 and methods of use
EP3062881B1 (en) 2013-10-28 2019-10-02 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Cancer models and associated methods
DK3097122T3 (da) 2014-01-24 2020-08-10 Ngm Biopharmaceuticals Inc Antistoffer, der binder beta-klotho-domæne 2, og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
AU2015277438B2 (en) 2014-06-16 2020-02-27 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2016048995A2 (en) 2014-09-23 2016-03-31 Salk Institute For Biological Studies Fgf19 truncations and mutants and uses thereof
CA2964782A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising peptide variants and methods of use thereof
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
EP3377090B1 (en) 2015-11-09 2021-04-07 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
EP3503882A4 (en) 2016-08-26 2020-07-29 NGM Biopharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-19-MEDIATED CARCINOMAS AND TUMORS
WO2018044778A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 NGM Biopharmaceuticals, Inc Methods for treatment of bile acid-related disorders

Also Published As

Publication number Publication date
AU2014342630B2 (en) 2020-11-05
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