KR20060135648A - 섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개선된 제약학적 성질을 가지는 인간 섬유모세포 성장인자 21의 신규한 뮤테인에 관한 것이다. 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 종이 모두 개시된다. 본 발명은 또한 상기 핵산 서열의 전파 및 상기 뮤테인의 생산을 위한 벡터 및 숙주 세포를 포함한다. 또한 2형 당뇨, 비만, 대사 증후군의 치료방법, 및 중환자의 사망률 및 발병률을 저하시키는 방법도 개시된다.

섬유모세포 성장인자 21, FGF-21, 뮤테인, 2형 당뇨, 비만, 대사 증후군

Description

섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인{MUTEINS OF FIBROBLAST GROWTH FACTOR 21}

본 발명은 개선된 제약학적 성질을 가지는 섬유모세포 성장인자 21의 신규한 뮤테인의 동정에 관한 것이다.

섬유모세포 성장인자는 발생 조직 및 성인 조직에서 널리 발현되고(Baird et al., Cancer Cells, 3: 239-243, 1991), 혈관신생, 체세포분열, 패턴 형성, 세포 분화, 대사 조절 및 조직 상해의 회복을 포함하는 여러 생리적 기능에 중요한 역할을 하는 큰 폴리펩티드이다(McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59: 135-176, 1998). 공개된 문헌에 따르면, FGF 부류는 이제 FGF-1 내지 FGF-23까지 23개 이상의 구성원을 포함한다(Reuss et al., Cell Tissue Res. 313: 139-157 (2003))

섬유모세포 성장인자 21 (FGF-21)은 특히 간에서 발현된다고 보고되었으며(Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492: 203-206, (2000); WO01/36640; 및 WO01/18172), 허혈성 혈관 질환, 상처 회복, 및 폐, 기관지, 또는 폐포 세포 기능 상실 및 수많은 다른 장애와 연관된 질환에 대한 치료방법으로 설명되었다. 좀더 최근에, FGF-21은 인슐린의 존재 및 부재 하에 쥐 3T3-L1 지방세포에서 글루코스 흡수를 촉진하고, ob/ob 및 db/db 쥐 및 생후 8주된 ZDF 래트에서 투여량 의존적인 방식으로 식후 및 식전 혈중 글루코스, 트리글리세라이드, 및 글루카곤 수준을 감소시킨다는 것이 알려져, FGF-21을 당뇨 및 비만 치료에 사용하는 근거를 제공하였다(WO03/011213). 또한, FGF-21은 중환자의 사망률 및 발병률을 감소시키는데 효과적인 것으로 나타났다(WO03/059270).

단백질 약제, 예를 들어 FGF-21의 개발에 있어 중대한 난관은 그들의 물리적 및 화학적 불안정성을 극복하는 것이다. 단백질의 구조적 다양성과 특성이 폴딩, 구조적 안정성, 및 비-폴딩/변성과 같은 특정한 거동을 결정한다. 이러한 특성들은 단백질 수용액을 이용하는 제약 제제 조건을 개발할 때 단백질을 안정화시키기 위해 고려되어야 한다(Wang, W., Int. J. of Pharmaceutics, 18, (1999)).

특히 약제 단백질 개발에 있어서, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 레조르시놀, 및 벤질 알콜과 같은 항균 보존제들은 멸균된 다용도 제제일 것이 요구되는 비경구 제약 제제에 필수적이다. 불행하게도, 이러한 화합물들은 종종 단백질 생성물의 안정성에 악영향을 미쳐 특히 연합 및 응집을 유발한다(Maa et al., Int. J. of Pharmaceutics 140: 155-168 (1996); Lam et al., Pharm. Res. 14 (6): 725- 729(1997)).

FGF-21은 다용도, 멸균 제약 제제로 사용될 수 있을 것이다. 그러나, 보존제, 즉 m-크레졸은 이러한 조건 하에서 제제의 안정성에 악영향을 미치는 것이 밝혀졌다. 분명하게, 치료적 FGF-21 단백질을 위한 안정적인 수계 단백질 제제를 개발할 것이 요구된다. 본 발명은 제약 제제 조건 하에서 야생형 FGF-21보다 더 안정적인 FGF-21의 뮤테인을 발명하여 물리적 불안정성이라는 중대한 장애물을 극복 하였다. 따라서, 본 발명의 FGF-21의 뮤테인은 2형 당뇨, 비만, 대사 증후군의 치료, 및 중환자의 사망률 및 발병률의 감소에 유용한 안정적인 약제 단백질 제제를 제공한다.

<발명의 요약>

첫번째 일면에서, 본 발명은 글리신 42, 글루타민 54, 아르기닌 77, 알라닌 81, 류신 86, 페닐알라닌 88, 리신 122, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 프롤린 130, 아르기닌 131, 류신 139, 알라닌 145, 류신 146, 이소류신 152, 알라닌 154, 글루타민 156, 글리신 161, 세린 163, 글리신 170, 또는 세린 172 중 하나 이상에 대해 대전된 아미노산 및(또는) 극성이지만 대전되지 않은 아미노산으로 치환하는 것을 포함하고, 상기 아미노산의 번호 매김은 하기 서열 번호: 1에 기초한 것인, 인간 섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인, 또는 그의 생물학적으로 활성있는 펩티드를 제공한다.

본 발명의 두번째 일면은, 아르기닌 19, 티로신 20, 류신 21, 티로신 22, 트레오닌 23, 아스파르테이트 24, 아스파르테이트 25, 알라닌 26, 글루타민 27, 글루타민 28, 알라닌 31, 류신 33, 이소류신 35, 류신 37, 발린 41, 글리신 42, 글리신 43, 글루타메이트 50, 글루타민 54, 류신 58, 발린 62, 류신 66, 글리신 67, 리신 69, 아르기닌 72, 페닐알라닌 73, 글루타민 76, 아르기닌 77, 아스파르테이트 79, 글리신 80, 알라닌 81, 류신 82, 글리신 84, 세린 85, 프롤린 90, 알라닌 92, 세린 94, 페닐알라닌 95, 류신 100, 아스파르테이트 102, 티로신 104, 티로신 107, 세린 109, 글루타메이트 110, 프롤린 115, 히스티딘 117, 류신 118, 프롤린 119, 아스파 라긴 121, 리신 122, 세린 123, 프롤린 124, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 아스파르테이트 127, 알라닌 129, 프롤린 130, 글리신 132, 알라닌 134, 아르기닌 135, 류신 137, 프롤린 138, 또는 류신 139 중 두 개 이상에 대한 시스테인의 치환을 포함하고, 상기 아미노산의 번호 매김은 하기 서열 번호: 1에 기초한 것인, 인간 섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인, 또는 그의 생물학적으로 활성있는 펩티드를 제공한다.

본 발명의 세번째 일면은 본 발명의 두번째 실시태양에서 제시된 아미노산 위치 중 두 개 이상의 시스테인의 치환과 함께, 본 발명의 첫번째 실시태양에서 제시된 아미노산 위치의 어떤 것이 대전된 아미노산 및(또는) 극성이나 대전되지 않은 아미노산으로 치환되는 것을 포함하는 인간 FGF-21의 뮤테인, 또는 그의 생물학적으로 활성있는 펩티드를 제공한다.

다른 실시태양은 첫째, 둘째, 및 셋째 실시태양의 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 가지는 숙주 세포에 관한 것이다. 또 다른 실시태양은 폴리펩티드를 제조하고, 상기 폴리펩티드를 생산할 수 있는 세포를 제조하고, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제조하는 것에 관한 것이다.

또 다른 실시태양은, 첫번째, 두번째, 또는 세번째 실시태양의 인간 FGF-21 뮤테인 또는 그의 제약 조성물의 치료적 효과량을 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군 중 하나 이상을 나타내고 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 치료방법에 관한 것이다.

본원에 개시되고 청구된 바와 같이 본 발명의 목적을 위하여, 다음 용어들이 하기와 같이 정의되었다.

FGF-21은 27개의 아미노산 리더 서열을 가지는 아미노산 208개의 폴리펩티드이다. 인간 FGF-21은 쥐 FGF-21에 대해 79% 이하의 아미노산 동일성과 래트 FGF-21에 대해 80% 이하의 아미노산 동일성을 갖는다. 인간 FGF-21은 본 발명의 뮤테인에 대한 바람직한 폴리펩티드 주형이지만, 당업자가 대안적인 포유류 FGF-21 폴리펩티드 서열에 기반하여 뮤테인을 쉽게 제조할 수 있다는 것을 인식할 수 있다.

본 발명의 뮤테인의 아미노산 위치는 하기와 같이 아미노산 181개의 성숙 인간 FGF-21 폴리펩티드로부터 결정되었다(서열 번호: 1).

아미노산 181개의 성숙 인간 FGF-21 폴리펩티드를 코딩하기 위한 대응되는 DNA 서열은 하기와 같다(서열 번호: 2).

단백질 발현의 당업자는 메티오닌 또는 메티오닌-아르기닌 서열이 이. 콜라이에서의 발현을 위한 성숙 서열 (서열 번호: 1)의 N-말단에 도입될 수 있으며, 본 발명의 맥락에서 도출된다는 것을 인식할 것이다.

아미노산은 3 문자 코드를 사용하여 확인되거나, 또는 대안적으로 표준 1 문자 코드를 사용하여 명시될 수 있다. 돌연변이는 원래 아미노산에 대한 3 문자 코드 다음, 아미노산 번호 다음에 대체된 아미노산에 대한 3 문자 코드로 명시된다. 각 뮤테인의 번호 표기는 성숙 야생형 인간 FGF-21의 아미노산 181개 서열을 기초로 한다. 예를 들어, 139번 위치의 류신 (즉, Leu 139)에 대한 음성 대전된 아미노산인 글루타메이트 (Glu)로의 치환은 Leu139Glu 또는 L139E로 표기한다. 비슷한 방식으로, 152번 위치의 이소류신 및 163번 위치의 세린 (Ile152, Ser163)을 음성 대전된 아미노산인 글루타메이트 (Glu)로 이중 치환하는 것은 Ile152Glu/Ser163Glu, I152E/S163E 또는 I152E-S163E로 나타낸다.

인간 FGF-21 뮤테인은 야생형 성숙 단백질의 1개 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인간 FGF-21을 포함하는 것으로 정의된다. 일반적으로 말하자면, 뮤테인은 야생형 단백질의 변형된 구조적 또는 기능성 성질 몇몇을 가진다. 예를 들어, 뮤테인은 농축된 용액에서 바람직한 생활성 양상은 유지하면서도 증진되거나 또는 개선된 물리적 안정성 (예를 들어, 소수성 매개된 응집이 덜함)을 가질 수 있다. 뮤테인은 제약 보존제 (예를 들어, m-크레졸, 페놀, 벤질 알콜)에 대해 증가된 융화성을 가질 수 있으므로, 보관 도중 단백질의 생리화학적 성질 및 생물학적 활성을 유지하는 보존된 제약 제제의 제조를 가능하게 한다. 따라서, 야생형 FGF-21에 비해 증진된 제약 안정성을 가지는 뮤테인은 생리학적 조건 및 보존된 제약 제제 조건 하에 농축된 용액에서 생물학적 역가를 유지하면서도 개선된 물리적 안정성을 가진다. 본원에 사용될 때, 이들 용어는 제한하지 않으며, 상기 뮤테인이 야생형 단백질의 하나 이상의 변형된 성질을 가지는 것이 전적으로 가능하다.

"생물학적으로 활성있는 펩티드"는 뮤테인의 변형된 성질 및 생물학적 역가를 유지하는 본 발명의 뮤테인의 펩티드로 정의된다.

"치료적 효과량"은 환자에게 치료적 유익을 주기위해 필수적인 활성제의 최소량이다. 예를 들어, 2형 당뇨, 비만, 또는 대사 증후군을 보이거나, 앓거나, 앓기 쉽거나, 또는 앓는 것을 예방하기 위한 환자에 대한 "치료적 효과량"은 앞서 언급된 장애와 연관된 병리학적 증상, 질병 진행, 생리학적 상태 또는 앞서 언급된 장애의 저항성을 유도하고 개량하거나, 개선을 야기하는 양이다. 본 발명의 목적을 위해, "대상" 또는 "환자"는 바람직하게 인간이나, 동물, 특히 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이 등), 가축 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등), 및 실험 동물 (예를 들어, 래트, 쥐, 기니피그 등)일 수도 있다.

"2형 당뇨"는 인슐린이 분비됨에도 불구한 과량의 글루코스 생산으로 특징지워지며, 불충분한 글루코스 제거의 결과로써 순환하는 글루코스 수준이 과도하게 높게 유지된다.

"글루코스 과민증"은 글루코스에 대한 예외적인 과민증으로 정의될 수 있다.

"고혈당증"은 혈액 중 과량의 당 (글루코스)으로 정의된다.

저혈당으로도 불리우는 "저혈당증"은 혈액 중 글루코스 수준이 너무 낮아져 신체 활동을 위한 에너지를 충분히 공급할 수 없을 때 일어난다.

"고인슐린혈증"은 혈액 중에 정상보다 높은 수준의 인슐린으로 정의된다.

"인슐린 저항성"은 정상량의 인슐린이 비정상적인 생물학적 반응을 일으키는 상태로 정의된다.

인간 대상의 경우 "비만"은 주어진 인구에 대한 이상적인 체중보다 20% 이상 초과하는 체중으로 정의될 수 있다(R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916).

"대사 증후군"은 대부분의 남성에서 40 인치 이상의 허리로 나타나는 복부 지방; 식전 10 리터 당 110 mg (mg/dl) 이상의 고혈당; 혈류 중 150 mg/dl 이상의 높은 트리글리세라이드 농도; 40 mg/dl 미만의 낮은 HDL 농도; 및 130/85 이상의 혈압 중 3개 이상의 증상의 결합으로 정의될 수 있다.

본 발명에 포함되는 중환자는 일반적으로 불안정한 과대사 상태를 경험한다. 이러한 불안정한 대사상태는 몇몇 영양소의 상대적 결핍으로 이어질 수 있는 기질 대사에의 변화 때문이다. 일반적으로 지방 및 근육 모두의 산화가 증가한다.

또한, 중환자는 바람직하게 전신 염증 반응 증후군 또는 호흡 곤란을 겪는 환자들이다. 발병률의 감소는 중환자가 추가적인 질병, 상태, 또는 증상을 일으킬 확률이 감소하거나, 추가적인 질병, 상태, 또는 증상의 심한 정도가 감소하는 것을 의미한다. 예를 들어, 감소된 발병률은 세균혈증 또는 패혈증, 또는 다기관부전과 연관된 합병증의 발생이 감소하는 것을 의미할 수 있다.

본원에서 사용된 "전신 염증 반응 증후군 (SIRS)"은 (1) 38 ℃ 초과 또는 36 ℃ 미만의 체온; (2) 분 당 90회 초과하는 심박수; (3) 분 당 20회 초과하는 호흡 속도에 의해 드러나는 빈호흡, 또는 32 mg Hg 미만의 PaCO₂로 나타나는 과다호흡; 및 (4) 12,000/cu mm 초과, 4000/cu mm 미만의 혈구수, 또는 미성숙 중성구 10% 이상 존재와 같은 백혈구 수의 변화와 같은 임상증상 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 수의 임상 상태와 연관된 염증 반응을 설명한다. 이러한 생리학적 변화는 화학치료, 유도된 중성백혈구 감소증, 및 백혈구 감소증과 같은, 이러한 이상의 알려진 다른 원인이 없다는 전제로부터 급성 변화를 대표한다.

본원에서 사용된 "패혈증"은 감염으로부터 일어난 SIRS로 정의된다. SIRS의 비감염성 병원성 원인은 췌장염, 허혈, 복수의 외상 및 조직 손상, 즉 좌상 또는 심한 화상, 출혈 쇼크, 면역-매개된 장기 손상, 및 종양괴사인자 및 다른 시토카인과 같은 추정적인 염증 반응 매개자의 외부로부터의 투여를 포함할 수 있다.

패혈 쇼크 및 다기관 부전은 중환자실(ICU)의 발병률 및 사망률에 주요하게 기여한다. 패혈증은 시토카인 네트워크, 백혈구, 및 보체 연쇄반응을 포함하는 다수의 숙주 방어 기작, 및 내피를 포함하는 응고/섬유소용해 계의 활성화와 연관되고 이에 의해 매개된다. 다양한 기관의 미세혈관 내의 섬유소 축적과 연관된 파종성 혈관내 응고증 (DIC) 및 다른 정도의 소모성 응고병증이 패혈증/패혈 쇼크의 증상이다. 표적 기관에 대한 숙주 방어 반응의 파급 효과는 다기관 기능장애 증후군 (MODS)의 발전에 중요한 매개자이며, 패혈증, 심한 패혈증, 및 쇼크를 합병증으로 하는 패혈증 환자에 대한 오진에 기여한다.

본원에서 사용된 "호흡 곤란"은 어떤 종류의 폐 기능장애로 인해 호흡에 곤란을 겪는 환자의 상태를 말한다. 종종 이러한 환자들은 산소 보충 치료에 반응하거나 반응하지 않는 다양한 정도의 저산소혈증을 나타낸다.

호흡 곤란은 직접적인 폐 손상에 기인한 폐 기능 손상이 있는 환자에서 일어날 수 있거나, 또는 전신 반응의 과정에서와 같은 간접적 폐 손상 때문에 일어날 수 있다. 또한, 복수의 소인 장애의 존재는, 만성 알콜 남용, 만성 폐 질환, 및 낮은 혈청 pH와 같은 2차 요인의 존재와 마찬가지로 실질적으로 위험성을 높인다.

직접 폐 손상의 몇몇 원인은 폐렴, 위 내용물의 흡인, 폐 타박상, 지방 색전, 익수, 흡입 손상, 고소 및 폐 이식 또는 폐 색전제거 후의 재관류 폐 부종을 포함한다. 간접 폐 손상의 몇몇 원인은 패혈증, 쇼크 및 복수회의 수혈에 의한 심한 손상, 심폐 회로술, 약물 과용, 급성 췌장염, 및 혈액 제품의 수혈을 포함한다.

호흡 곤란을 일으키는 폐 장애의 한 부류는 폐심장증으로 알려진 증후군과 연관된다. 이러한 장애는 폐 고혈압으로 불리우는 폐 순환계 내의 상승된 압력을 초래하는 만성 저산소혈증과 연관된다. 이후의 폐 고혈압은 우심실의 작업량을 증가시켜 확대 또는 비대를 야기한다. 폐심장증은 일반적으로 우심실 압력이 꾸준히 증가하고, 우심실로의 정맥혈 회귀가 감소하는 임상적 증거로 정의되는 우심실 부전을 나타낸다.

폐기종 및 만성 기관지염을 포함하는 "만성 폐쇄 폐병" (COPD) 또한 호흡곤란을 일으키며, 공기 흐름의 폐쇄로 특징지워진다. COPD는 4번째 주요 사망 원인이고, 매년 100,000 명 이상이 이로 인해 사망한다.

"급성 호흡 곤란 증후군" (ARDS)는 일반적으로 진행성이고, 구별되는 기로 특징지워진다. 이 증후군은 일반적으로 이 상태에 대한 위험 요소가 있는 환자에게서 호흡 곤란 증세가 급박하게 시작되는 것으로 명백해진다. 산소 보충 치료에 반응하지 않는 동맥 저산소혈증이 특징적인 증상이다. 의존 폐 구역에 폐포 충전, 경화, 무기폐가 일어날 수 있으나, 비의존 구역도 실질적인 염증이 일어날 수 있다. 이 증후군은 지속적인 저산소혈증, 폐포사강의 증가, 폐탄성의 추가적인 감소를 동반한 섬유화 폐포염으로 발전할 수 있다. 폐 모세혈관 베드에 손상을 야기하는 폐동맥고혈압도 발병할 수 있다.

본 발명의 바람직한 첫번째 일면은 글리신 42, 글루타민 54, 아르기닌 77, 알라닌 81, 류신 86, 페닐알라닌 88, 리신 122, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 프롤린 130, 아르기닌 131, 류신 139, 알라닌 145, 류신 146, 이소류신 152, 알라닌 154, 글루타민 156, 글리신 161, 세린 163, 글리신 170, 또는 세린 172 중 1개 이상에 대해 대전된 아미노산 및(또는) 극성이나 대전되지 않은 아미노산으로 치환되는 것을 포함하고, 상기 아미노산의 번호매김은 서열 번호: 1을 기초로 하는 것인, 인간 FGF-21의 뮤테인을 포함한다. 대전된 아미노산은 양성 또는 음성 대전된 아미노산으로 정의된다. 양성 대전된 아미노산은 히스타딘, 리신, 아르기닌, 및 비자연적으로 발생하는 그의 유사체 (예를 들어, γ-아미노부티르산, 오르니틴 등)를 포함하는 것으로 정의된다. 음성 대전된 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 비자연적으로 발생하는 그의 유사체 (예를 들어, 아미노아디프산)을 포함하는 것으로 정의된다. 극성이나 대전되지 않은 아미노산은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 및 비자연적으로 발생하는 그의 유사체를 포함하는 것으로 정의된다. 첫번째 실시태양의 가장 바람직한 뮤테인은 Gln54Glu, Leu139Glu, Ala145Glu, Leu146Glu, Ile152Glu, Gln156Glu, Ser163Glu, 및 Ile152Glu-Ser163Glu이다.

본 발명의 두번째 일면은, 아르기닌 19, 티로신 20, 류신 21, 티로신 22, 트레오닌 23, 아스파르테이트 24, 아스파르테이트 25, 알라닌 26, 글루타민 27, 글루타민 28, 알라닌 31, 류신 33, 이소류신 35, 류신 37, 발린 41, 글리신 42, 글리신 43, 글루타메이트 50, 글루타민 54, 류신 58, 발린 62, 류신 66, 글리신 67, 리신 69, 아르기닌 72, 페닐알라닌 73, 글루타민 76, 아르기닌 77, 아스파르테이트 79, 글리신 80, 알라닌 81, 류신 82, 글리신 84, 세린 85, 프롤린 90, 알라닌 92, 세린 94, 페닐알라닌 95, 류신 100, 아스파르테이트 102, 티로신 104, 티로신 107, 세린 109, 글루타메이트 110, 프롤린 115, 히스티딘 117, 류신 118, 프롤린 119, 아스파라긴 121, 리신 122, 세린 123, 프롤린 124, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 아스파르테이트 127, 알라닌 129, 프롤린 130, 글리신 132, 알라닌 134, 아르기닌 135, 류신 137, 프롤린 138, 또는 류신 139 중 2개 이상에 대해 시스테인 치환을 포함하고, 상기 아미노산의 번호매김은 서열 번호: 1을 기초로 하는 것인, 인간 FGF-21의 뮤테인, 또는 그의 생물학적으로 활성있는 펩티드를 제공한다.

당업자는 천연 시스테인인 시스테인 75 및 시스테인 93도 개선된 성질을 줄 수 있는 신규한 디술파이드 결합을 도입할 장소로 이용될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 특히 생각할 수 있는 것은 각각 어떠한 다른 아미노산으로도 치환될 수 있는 시스테인 93 또는 시스테인 75와 동시적으로 변경될 수 있는 세린 85 또는 페닐알라닌 73의 시스테인 치환의 도입이다.

시스테인 잔기로부터 제공되는 것과 같은 자연적으로 발생하는 디술파이드 결합은 일반적으로 단백질의 열역학적 안정성을 증가시킨다. 융점의 증가로 측정될 수 있는 증가된 열역학적 안정성의 성공적인 예는 T4 리소자임 효소 (Matsumura, et al., PNAS 86: 6562-6566 (1989)) 및 바르나제 (Johnson et al., J Mol. Biol. 268: 198-208 (1997))의 복수의 디술파이드-결합된 돌연변이들이다. 본 발명의 일면은 디술파이드 결합에 의해 FGF-21의 118번-134번 아미노산 루프의 유연성을 억제하는 것이 가정적으로 단백질의 소수성 중심부에 보존제의 접근을 제한하도록 하는 보존제의 존재하에서 FGF-21의 물리적 안정성을 증진시킨다는 전제이다.

Cys75-Cys93 위치에 자연적으로 발생한 것 외에, 가공된 디술파이드 결합이 있는 FGF-21 뮤테인은 Gln76Cys-Ser1O9Cys, Cys75-Ser85Cys, Cys75-Ala92Cys, Phe73Cys-Cys93, Ser123Cys-His125Cys, Asp102Cys-Tyr104Cys, Asp127Cys-Gly132Cys, Ser94Cys-Glu110Cys, Pro115Cys-His117Cys, Asn121Cys-Asp127Cys, Leu1OOCys-Asp102Cys, Phe95Cys-Tyr107Cys, Arg19Cys-Pro138Cys, Tyr20Cys-Leu139Cys, Tyr22Cys-Leu137Cys, Arg77Cys-Asp79Cys, Pro90Cys-Ala92Cys, Glu50Cys-Lys69Cys, Thr23Cys-Asp25Cys, Ala31Cys-Gly43Cys, Gln28Cys-Gly43Cys, Thr23Cys-Gln28Cys, Val41Cys-Leu82Cys, Leu58Cys-Val62Cys, Gln54Cys-Leu66Cys, Ile35Cys-Gly67Cys, Gly67Cys-Arg72Cys, Ile35Cys-Gly84Cys, Arg72Cys-Gly84Cys, 또는 Arg77Cys-Ala81Cys이고, 여기서 아미노산의 번호매김은 서열 번호: 1을 기초로 한 것이다. 가공된 디술파이드 결합을 가지는 바람직한 뮤테인은 Tyr22Cys-Leu139Cys; Asp24Cys-Arg135Cys; Leu118Cys-Gly132Cys; His117Cys-Pro130Cys; His117Cys-Ala129Cys; Leu82Cys-Pro119Cys; Gly80Cys-Ala129Cys; Gly43Cys-Pro124Cys; Gly42Cys-Arg126Cys; Gly42Cys-Pro124Cys; Gln28Cys-Pro124Cys; Gln27Cys-Ser123Cys; Ala26Cys-Lys122Cys; 또는 Asp25Cys-Lys122Cys이다. 가공된 디술파이드 결합을 가지는 가장 바람직한 뮤테인은 Leu118Cys-Ala134Cys; Leu21Cys-Leu33Cys; Ala26Cys-Lys122Cys; Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys이다.

본 발명의 세번째 일면은 본 발명의 두번째 실시태양에서 제시된 아미노산 위치 중 두 개 이상에 대한 시스테인 치환과 함께, 본 발명의 첫번째 실시태양에서 제시된 아미노산 위치 중 어떤 것에 대한 대전된 아미노산 및(또는) 극성이나 대전되지 않은 아미노산의 치환을 포함하는, 인간 FGF-21의 뮤테인 또는 그의 생물학적으로 활성있는 펩티드를 제공한다.

단백질 약제의 개발에 있어 중대한 난관은 단백질의 물리적 및 화학적 불안정성을 처리하는 것이라는 사실이 당업계에 잘 알려져 있다. 이것은 단백질 제약 제제가 바람직한 생물활성 양상을 유지하면서도 안정적이고, 농축되고 보존된 용액일 것을 요구하는 다용도, 주사가능한 제제이어야 하는 경우 더욱 명백하다. 야생형 FGF-21의 세부적인 생물리적 특징 결정에 의해 고온 또는 낮은 pH와 같은 스트레스 조건에 노출되었을 때, 농축된 단백질 용액 (5 mg/ml 초과)이 가속된 연합 및 응집 (즉, 낮은 물리적 안정성 및 생물약학적 성질)으로 이어진다는 것을 알아내었다. FGF-21의 농축된 단백질 용액을 제약 보존제 (예를 들어, m-크레졸)에 노출시키는 것 역시 물리적 안정성에 부정적인 영향을 미쳤다.

따라서, 본 발명의 실시태양은 생리학적 조건 및 보존된 제제 조건 하에서, 화학적 안정성 및 생물학적 역가를 유지하면서도 농축된 용액의 물리적 안정성을 증진시키는 것이다. 주어진 단백질 농도에서 온도 및 이온력이 물리적 안정성에 상당한 영향을 미쳤기 때문에, 연합 및 응집은 소수성 상호작용에 기인한다고 생각되었다. 대부분의 경우, 비보존되고 가정적으로 표면에 노출된 아미노산 잔기를 표적으로 하였다. 이러한 잔기의 주변 환경을 분석하고, 구조적으로 중요하지 않다고 생각되는 것을 돌연변이화를 위해 선택하였다. 특이적 변화를 개시하는 한가지 방법은 글루탐산 잔기를 도입하여 단백질의 pI를 추가적으로 낮추는 것이다("글루탐산 스캔"). 대전된 치환기의 도입은 전하-전하 반발을 통해 소수성-매개된 응집을 억제할 것이고, 잠재적으로 보존제 융화성을 개선할 것이라고 가정하였다. 또한, 당업자는 충분한 정도의 돌연변이화를 이용하여, 동시적인 음성 전하의 감소의 존재 또는 부재 하의 양전하의 도입에 의해 pI를 염기성 pI 범위로 옮겨 전하-전하 반발작용을 가능하게 하는 것도 인식할 수 있을 것이다.

본 발명의 실시태양이 생리학적 조건 및 보존된 제약 제제 조건 하에서 물리적 및 화학적 안정성에 관한 것임에도, 야생형 FGF-21과 비교할 때 뮤테인의 생물학적 역가를 유지하는 것 또한 고려해야할 중요한 요소이다. 따라서, 본 발명의 뮤테인의 생물학적 역가는 시험관내 3T3-L1 세포 검정 (실시예 4)으로 측정되는 글루코스 흡수 및(또는) 생체내 ob/ob 쥐 검정 (실시예 5)로 측정되는 혈장 글루코스 및 혈장 트리글리세라이드 수준 저하에 영향을 미치는 뮤테인의 능력으로 정의된다.

본 발명에 따라 투여된 FGF-21 뮤테인은 당업계에 알려진 어떠한 수단으로 생성되고(되거나) 단리될 수 있다. 뮤테인을 제조하는 가장 바람직한 방법은 재조합 DNA 방법을 통한 것이고, 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 본원에 참고자료로 포함된 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.)]에 설명되어 있다.

또한, 바람직한 실시태양은 본원에 설명된 뮤테인로부터 얻어진 생물학적으로 활성있는 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 설명된 치환 중 하나 이상을 포함하며, 뮤테인은 생물학적 활성을 가질 것이다. 펩티드는 당업자에게 알려진 모든 수단, 예를 들어 효소적 절단, 화학적 합성 또는 재조합 DNA 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 수단으로 제조될 수 있을 것이다.

특정 섬유모세포 성장인자 펩티드의 단편이 생물학적으로 활성있다는 사실이 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌[Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85: 2324-2328 (1988), and J. Cell. Phys. Suppl. 5: 101-106 (1987)]을 참조하라. 따라서, 뮤테인의 단편 및 펩티드의 선택은 당업계에 알려진 기준을 기초로 한다. 예를 들어, 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)가 신경 펩티드, 내분비 펩티드, 및 시토카인의 불활성화에 참여하는 세린계 단백질 분해효소라는 것이 알려져 있다(Damme et al. Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)). FGF-21의 N-말단 (HisProIlePro)은 DPP-IV의 잠재적인 기질이 되어 N-말단에 아미노산 4개가 말단절단된 FGF-21 단편이 만들어질 수 있는 두 개의 디펩티드를 포함한다. 예측하지 못하였으나, 야생형 FGF-21의 이 단편은 생물학적 활성을 가지는 것으로 드러났고 (표 1), 따라서 N-말단에 아미노산 4개 이하가 말단절단된 본 발명의 뮤테인은 본 발명의 실시태양이다.

본 발명은 또한 RNA 형태이거나 또는 cDNA, 지놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있는 상기 설명된 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. DNA는 이중 가닥이거나 또는 단일 가닥일 수 있다. 본 발명의 뮤테인을 코딩하는 코딩 서열은 유전 코드의 중복 또는 퇴보의 결과로 다양할 수 있다.

본 발명의 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 뮤테인의 코딩 서열만, 뮤테인의 코딩 서열 및 기능성 폴리펩티드, 또는 리더 또는 분비 서열과 같은 추가적인 코딩 서열, 또는 전-단백질 서열; 뮤테인의 코딩 서열 및 인트론 또는 뮤테인 코딩 서열의 5' 및(또는) 3'의 비코딩 서열과 같은 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 따라서, "뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 뮤테인의 코딩서열뿐만 아니라, 추가적인 코딩 및(또는) 비코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또한 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 또한 제시된 치환을 포함하는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 설명된 폴리뉴클레오티드의 변이에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이는 인간 FGF-21 서열의 자연적으로 발생하는 대립형질 변이, 비자연적으로 발생하는 변이, 또는 상기 설명된 말단절단형 변이일 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 설명된 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이를 포함하고, 이 변이들은 개시된 뮤테인의 단편, 유도체 또는 유사체를 코딩한다. 이러한 뉴클레오티드 변이는 첫번째 또는 두번째 실시태양의 제시된 아미노산 치환 중 하나 이상이 존재하는 한 결실 변이, 치환 변이, 말단절단형 변이, 및 부가 또는 삽입 변이를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열이 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결된 (즉, 기능이 보장되도록 위치된) 후 숙주에서 발현될 것이다. 이들 발현 벡터는 전형적으로 에피솜 또는 숙주 염색체 DNA의 통합된 부분으로써 숙주 생물 내에서 복제가능하다. 보통, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 감지를 허용하도록 선택 표지, 예를 들어 테트라시클린, 네오마이신, 및 디히드로폴레이트 환원효소를 포함할 것이다. FGF-21 뮤테인은 적절한 프로모터의 조절 하에서 포유류 세포, 곤충, 효모, 박테리아 또는 다른 세포에서 발현될 수 있다. 세포를 포함하지 않는 번역 시스템 또한 본 발명의 DNA 구조물로부터 얻어지는 RNA를 이용한 이러한 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.

이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는데 특히 유용한 원핵세포 숙주이다. 사용하기에 적절한 다른 미생물 숙주는 다른 것들도 선택의 문제로써 사용될 수 있지만, 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 및 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토코커스(Streptococcus), 및 스타필로코커스(Staphylococcus)의 다양한 종을 포함한다. 이러한 원핵세포 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 양립가능한 발현 조절 서열 (예를 들어, 복제 기원)을 포함하는 발현 벡터 또한 제조할 수 있다. 또한, 락토스 프로모터 계, 트립토판(trp) 프로모터 계, β-락타마제 프로모터 계, 또는 λ 또는 T7 파지로부터의 프로모터 계와 같은 잘 알려진 프로모터 몇 개가 존재할 수 있다. 프로모터는 전형적으로, 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 조절할 것이며, 전사 및 번역의 개시 및 완료를 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 포함할 것이다.

단백질 발현의 당업자는 메티오닌 또는 메티오닌-아르기닌 서열이 이. 콜라이에서의 발현을 위해 성숙 서열 (서열 번호: 1)의 N-말단에 도입될 수 있고, 본 발명의 맥락에서 생각해낼 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 달리 언급되지 않으면, 이. 콜라이 내에서 발현되는 본 발명의 단백질은 N-말단에 도입된 메티오닌 서열을 가진다.

다른 미생물, 예를 들어 효모 또는 균류 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 필요에 따라 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 해당 효소를 포함한 프로모터, 복제 기원, 종결 서열 등과 같은 발현 조절 서열을 가지는 적절한 벡터를 갖는, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 피키아 앙쿠스타(Pichia angusta)가 바람직한 효모 숙주의 예이다. 다른 것들도 선택의 문제로써 사용될 수 있지만, 아스페르길러스 니제르(Aspergillus niger), 트리초데르마 리세이(Trichoderma reesei) 및 스키조필럼 콤무네(Schizophyllum commune)가 균류 숙주의 예이다.

포유류 조직 세포 배양 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 제조하기 위해 사용될 수 있다. 완전한 뮤테인을 분비할 수 있는 적절한 숙주 세포주 몇 개가 당업계에서 개발되었기 때문에 진핵 세포가 실질적으로 바람직하고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, NSO 세포, 시리아 햄스터 난소세포주, 헬라 세포, 또는 인간 배아 신장세포주 (즉, HEK293, HEK293EBNA)를 포함한다.

이러한 세포를 위한 발현 벡터는 복제 기원, 프로모터, 인핸서, 및 필수적인 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열과 같은 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 시토메갈로바이러스, 라우스 육종 바이러스 등으로부터 얻은 프로모터이다. 바람직한 폴리아데닐화 부위는 SV40 및 소 성장 호르몬으로부터 얻은 서열을 포함한다.

대상 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, FGF-21 뮤테인 서열 및 발현 조절 서열)을 포함하는 벡터는 세포 숙주의 종류에 따라 변하는 잘 알려진 방법으로 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 원핵세포에 대해 흔히 이용되고, 인산칼슘처리 또는 전기첨공법은 다른 세포 숙주에 대해 이용될 수 있다.

단백질 정제의 다양한 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법들은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) and Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)]에 설명되어 있다. 선택되는 정제 단계는 예를 들어 FGF-21 뮤테인에 대해 사용되는 제조 방법의 성질에 의존할 것이다.

FGF-21 뮤테인-함유 조성물은 환자의 임상적 상태, FGF-21 뮤테인 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 임상의들에게 알려진 다른 요소들을 고려하여, 양호한 의료 관례에 부합하는 방식으로 제제되고 투여되어야 한다. 따라서, 본원의 목적을 위한 FGF-21 뮤테인의 "치료적 효과량"은 이러한 것들을 고려하여 결정된다.

FGF-21 뮤테인의 약제 조성물 및 본 발명의 약제 조성물은 2형 당뇨, 비만, 대사 증후군, 또는 중환자를 치료하기 위한 일반적으로 의도되는 목적을 성취하기 위한 어떠한 수단으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "비경구적"이라는 용어는 정맥 내, 근육 내, 복막 내, 내간, 피하, 및 동맥 내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 가리킨다. 투여되는 양은 투여받는 사람의 나이, 건강상태, 및 체중, 현재 치료받고 있다면 치료의 종류, 빈도, 및 원하는 효과의 성격에 의존할 것이다. 본 발명의 권리범위 내의 조성물은 FGF-21 뮤테인이 2형 당뇨, 비만, 또는 대사 증후군의 치료를 위한 원하는 의학적 효과를 달성하기에 효과적인 양으로 존재하는 모든 조성물을 포함한다. 개인적인 요구조건은 환자에 따라 다를 수 있으나, 모든 성분의 효과량의 최적화된 범위의 결정은 통상의 기술을 가진 임상의의 능력 범위 내이다.

본 발명의 FGF-21 뮤테인은 제약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 것으로 알려진 방법에 따라 제제될 수 있다. 바람직한 제제는 선택적인 제약적으로 허용가능한 담체, 보존제, 부형제, 또는 안정화제와 함께, 고순도의 적절한 희석액 또는 수용액으로 재구성되는 안정적인 동결건조 제품이다[Remington's pharmaceutic Sciences 16th edition (1980)]. 본 발명의 뮤테인은 제약적으로 허용가능한 완충액, 및 허용가능한 안정성 및 투여를 위해 허용가능한 pH를 제공하도록 조정된 pH와 결합될 수 있다.

비경구적 투여를 위해, 한 실시태양에서, FGF-21 뮤테인은 일반적으로 상기 중 1종 이상을, 원하는 순도로, 주사가능한 형태의 단위 투여량 (용액, 현탁액, 또는 유화액)으로, 제약적으로 허용가능한 담체, 즉 사용되었을 때 환자에게 비독성인 투여량과 농도이고 제제의 다른 성분과 양립가능한 것과 함께 혼합함으로써 일반적으로 제제된다. 바람직하게, 1종 이상의 제약적으로 허용가능한 항미생물제가 첨가될 수 있다. 페놀, m-크레졸, 및 벤질 알콜은 바람직한 제약적으로 허용가능한 항미생물제이다.

선택적으로, 1종 이상의 제약적으로 허용가능한 염이 이온력이나 또는 긴장성을 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 1종 이상의 부형제가 제제의 등장성을 추가로 조정하기 위해 첨가될 수 있다. 글리세린, 염화 나트륨, 및 만니톨이 등장성 조정 부형제의 예이다.

당업자는 양호한 의료 관례 및 각 환자의 임상적 상태에 의해 결정되는 FGF-21 뮤테인을 포함하는 치료적 조성물에 대한 제약학적 효과량 및 투여 계획을 쉽게 최적화할 수 있다. 본 발명의 FGF-21 뮤테인의 전형적인 투여량 범위는 성인의 경우 하루 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg이다. 바람직하게 투여량은 하루 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg, 더욱 바람직하게 약 1.0 mg/일 내지 약 10 mg/일의 범위이다. 가장 바람직하게, 투여량은 약 1 내지 5 mg/일이다.

FGF-21 뮤테인의 적절한 투여량은 더 빠르고 더 효율적인 글루코스 이용에 의한 혈중 글루코스 농도 감소 및 에너지 소비 증가를 야기할 것이고, 따라서 2형 당뇨, 비만, 및 대사 증후군의 치료에 유용하다.

또한, 고혈당증 및 인슐린 저항성이 영양 공급을 받는 중환자에게서 흔하기 때문에, 몇몇 ICU는 중환자의 식후에 과다한 고혈당증을 치료하기 위해 인슐린을 투여한다. 사실, 최근의 연구들은 혈중 글루코스를 110 mg/dl 이하의 농도로 유지하기 위해 외래의 인슐린을 사용하는 것이, 당뇨 병력이 있는지 여부에 관계 없이 외과 중환자실의 중환자들 사이에서 발병률 및 사망률을 감소시켰음을 보고하였다(Van den Berghe, et al. N Engl J Med., 345 (19): 1359, (2001)). 따라서, 본 발명의 FGF-21 뮤테인은 특별히 대사적으로 불안정한 중환자에게서 대사적 안정성을 복구하는 것을 돕도록 맞춰졌다. FGF-21 뮤테인은 저혈당증을 유도하지 않으면서도 글루코스 흡수를 촉진하고 인슐린 민감성을 증진시킨다는 점에서 독특하다.

본 발명의 다른 일면에서, 2형 당뇨, 비만, 대사 증후군, 또는 중환자의 치료를 위한 치료제로써의 FGF-21 뮤테인의 용도를 생각해낼 수 있다.

여기까지 본 발명을 상세하게 설명했고, 본 발명을 예시할 뿐이고 제한하지 않을 목적으로 본원에 포함된 하기 실시예를 참조하여 더욱 명확하게 이해될 것이다.

본원에 참조된 모든 특허 및 문헌은 참고자료로 명확하게 포함되었다.

<실시예 1>

[이. 콜라이에서의 FGF-21 뮤테인의 발현 및 정제]

본 실시예에서 박테리아 내 발현을 위해 박테리아용 발현 벡터인 pET30a가 사용되었다 (노바젠 잉크.(Novagen Inc.), 매디슨, 위스콘신). pET30a는 카나마이신 항생제 저항 유전자를 코딩하며, 박테리아 복제기원("ori"), 강력한 T7 파지-IPTG 유도성 프로모터, 리보솜 결합 부위 ("RBS"), 및 서로 다른 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 몇 개를 가지는 적절한 MCS를 포함한다. 정제 목적을 위해 편리하게 벡터는 N-말단 펩티드 융합 및 C-말단 His-태그 융합을 위한 His- 및 S-태그를 코딩할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서는, FGF-21 변이를 코딩하는 cDNA를 NdeI 및 BamHI 절단 부위 사이에 각각 삽입하여, 결과 구조물이 설명된 태그 중 어떤 것도 이용하지 않는다.

리더 서열이 없으나 메티오닌 잔기로 치환된, FGF-21 뮤테인을 코딩하는 핵산 서열을 오픈 리딩 프레임의 5' 및 3' 말단에 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오티 드 프라이머를 이용하여 cDNA 클론으로부터 증폭시켰다. NdeI 및 BamHI 제한 효소의 인식 부위를 가지는 추가적인 뉴클레오티드를 각각 5' 및 3' 서열에 추가하였다.

클로닝을 위해, 당업계에 알려진 방법에 따라 5' 정방향 및 3' 역방향 PCR 프라이머는 FGF-21 뮤테인을 코딩하는 핵산의 코딩 서열의 일부에 대응되거나 또는 상보적인 뉴클레오티드를 가진다. 당업자는 프라이머가 시작할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열 상의 지점이 다양할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

증폭된 핵산 단편 및 pET30a 벡터는 NdeI 및 BamHI 제한 효소로 절단되고, 정제된 절단된 DNA 단편은 그후 함께 라이게이션시켰다. FGF-21 뮤테인을 코딩하는 DNA를 제한된 pET30a 벡터에 삽입하는 것은 IPTG-유도성 프로모터로부터 아래쪽에 있는 연관된 정지 코돈 및 프레임 안에 ATG 개시 코돈을 포함하는, FGF-21 뮤테인 폴리펩티드를 코딩하는 부위에서 일어난다. 연관된 정지 코돈인 TAG는 삽입 지점의 아래쪽의 6개의 히스티딘 코돈의 번역을 막는다.

라이게이션 혼합물을 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.)]에 설명된 것과 같은 표준 방법을 이용하여 이. 콜라이 적격세포 내로 형질전환시켰다.

형질전환 반응물을 LB/카나마이신 평판에 배양하고, 밤새 배양한 뒤 성장 형질전환체를 플라스미스 제조를 위해 선택하거나 또는 PCR 스크리닝을 위해 그대로 용해시켰다. 원하는 FGF-21 변이 삽입물을 포함하는 양성 재조합 플라스미드를 제한 분석으로 확인한 뒤, DNA 서열 분석하였다. 이들 플라스미드들은 그 후 발현 균주를 형질전환시키고 단백질 생산하는 데 사용되었다.

이. 콜라이 균주 BL21(DE3), BL21(DE3)STAR 또는 BL21(DE3)RP을 FGF-21 뮤테인의 발현에 사용하였다. 이들 중 몇몇만이 FGF-21 뮤테인 발현에 적절한 상기 균주들은 각각 노바젠, 잉크., 인비트로젠(Invitrogen) 및 스트래타젠(Stratagen)으로부터 상업적으로 이용가능하다. 형질전환체들은 카나마이신 존재 하에 LB 평판 상에서 성장하는 능력으로 확인하였다.

원하는 구조물을 포함하는 클론을 카나마이신 (30 μg/ml)로 보충된 LB 배지에 액체 배양액 중에서 밤새 (o/n) 성장시켰다. o/n 배양액은 대규모 배양액에 약 1:25 내지 1:250의 희석 비율로 접종하는데 사용되었다. 세포는 600 nm에서의 광학 밀도 ("OD600")가 0.6이 되도록 배양했다. 그 후 lacI 억제자를 불활성화시킴으로써 lac 억제자 민감성 프로모터로부터 전사를 유도하기 위하여 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드 ("IPTG")를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하였다. 그후 세포를 3 내지 12 시간 동안 추가로 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 원심분리로 수확하여, 펠렛을 pH 8.0인 50 mM 트리스 완충액으로 세척하고, 정제시까지 -20 ℃에 저장하였다. FGF-21 뮤테인은 이. 콜라이의 불용성 분획, 즉 봉입체 (또는 과립)으로 발현된다. 발현 수준이 변이에 따라 다양할 수 있으나, 야생형 (WT) FGF-21 단백질에 대해 전형적으로 관찰되는 수준은 50 mg/L이다. 그 후, 과립을 용해화시키는 것과 변이체의 리폴딩으로 정제 과정을 시작한 뒤, 4단계의 크로마토그래피가 이어졌다.

이. 콜라이로부터 FGF-21 뮤테인을 정제하기 위해, 과립을 50 mM 트리스, pH 9.0, 7 M 우레아 및 1 mM DTT 중에 pH 11.0까지 증가시키면서 실온에서 1시간 동안 교반하여 가용화했다. 단백질을 그후 상기와 동일한 버퍼를 이용하여 Q-세파로스 칼럼 상에 포획시키고, 직선 기울기의 0 내지 400 mM NaCl로 용리시켰다. 모든 디술파이드 결합을 환원시키기 위해 그 후 Q-세파로스 풀을 10 mM DTT로 두시간 동안 실온에서 처리하였다. 그 후 풀을 10배 희석하여 약 250 내지 500 μg/ml 농도의 단백질을 포함한 완충액 농도가 50 mM 트리스, pH 9.0, 7 M 우레아, 10 mM 시스테인, 1 mM DTT가 되도록 하였다. 실온, 환원 조건 하에서의 추가적인 두 시간 인큐베이션 후, 디술파이드가 없는 형태의 단백질을 얻기 위해, 그 후 풀을 20 mM 글리신, pH 9.0 내에서 약 48시간 투석하여, 정확한 디술파이드 결합이 형성될 수 있도록 하였다.

초기 정제 단계로써 역상 HPLC 크로마토그래피에서, 바이닥(Vydac) C18 칼럼 상에, 0.1% TFA/0 - 50% CH₃CN을 이동상으로 사용하였다. 이 칼럼은 FGF-21 또는 FGF-21 뮤테인을 농축하고, 오염성의 세포내 독소를 제거하는 데 사용되었다.

다음 정제 단계는 1X PBS 완충액, pH 7.4 중에서 실시된 수퍼덱스(Superdex) 35/600 칼럼 상의 크기 배제 크로마토그래피였다. 이 단계에서 FGF-21 뮤테인은 95% 순도이다. 보통 97%가 넘는 순도의 단백질을 생산하는 최종 단계는 50 mM 트리스, pH 8.0 중의 모노Q 크로마토그래피 및 직선 기울기의 0 내지 300 mM NaCl을 이용한 용리를 포함한다.

상기 설명된 4-칼럼 단계 정제 기구는 모든 FGF-21 뮤테인에 사용되었고, 안 정한 제제를 제조하였다.

<실시예 2>

[HEK293EBNA 세포에서의 FGF-21 뮤테인의 발현 및 정제]

대안적으로, FGF-21 뮤테인은 HEK293EBNA 세포 (엣쥐바이오시스템즈(EdgeBiosystems), 개더스버그, MD)와 같은 포유류 세포 발현 계에서 생산될 수 있다. FGF-21 뮤테인을 MCS 내의 NheI 및 XbaI 제한 부위 사이에, 상업적으로 이용가능한 pEAK10의 변형으로 대표되는 적절한 발현 벡터 내로 서브클로닝시켰다. 조직 배양액 중에서 원하는 생성물의 분비를 증진시키기 위해 성숙 FGF-21을 코딩하는 cDNA 서열을 Igκ 리더 서열을 가지는 프레임 안에 융합시켰다. 발현은 강력한 CMV 바이러스 프로모터에 의해 촉진되었다. 퓨진(Fugene, 로쉐 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 인디애나폴리스, IN)과 같은 표준 형질감염 시약 및 적절한 양의 재조합 플라스미드를 이용하여 단일 층 또는 현탁 배양으로써 적절한 세포 농도로 HEK293EBNA 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 혈청을 포함하지 않는 배지 중에서 37 ℃ 및 5% CO₂ 하에서 인큐베이션하였고, 5일 동안 매일 수집하였다. 전형적으로, HEK239EBNA 현탁 배양 중의 발현 수준은 30 mg/L 이하이다. 포유류 세포 중에서 인간 FGF-21 발현은 HPIP의 천연 N-말단 서열, 즉 N-말단에 메티오닌 잔기가 없는 서열을 생산한다. HEK239EBNA 세포로부터의 FGF-21을 DPP-IV (돼지 신장, 시그마(SIGMA), 세인트루이스)로 효소적으로 처리하는 것이 N-말단에 아미노산 4개의 말단절단을 야기한다는 것이 밝혀졌다. 쥐 3T3-L1 지방세포 검정 (실시예 4)에서 검정되는 경우, 이 FGF-21의 말단절단형 변이체는 야생형 FGF-21의 글루코스 흡수 수준 (표 1)에 상응하는 정도의 글루코스 흡수를 촉진한다.

<실시예 3>

[효모에서의 FGF-21 뮤테인의 발현 및 정제]

FGF-21 뮤테인의 제조를 위한 또 다른 발현 계는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모이다. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 생산을 위해, 상업적으로 이용가능한 계 (인비트로젠, 칼스배드, CA)는 재조합 단백질의 고수준의 발현을 촉진하기 위해 강력한 AOX1(알콜 산화효소) 프로모터를 가지는 벡터를 사용한다. 대안적으로, GAP (글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소) 유전자로부터의 프로모터를 사용하는 벡터가 고수준의 구성적 발현을 위해 이용가능하다. 복수 카피의 피키아 발현 벡터는 지놈에 통합된 대상 유전자를 복수 카피로 가지는 균주를 얻을 수 있도록 한다. 재조합 피키아 균주에서 대상 유전자의 카피 수가 증가하면 단백질 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 또 다른 효모 발현 계는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)이다. 발현 벡터는 GAL1 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서 서열을 포함한다. GAL1 프로모터는 갈락토스로 유도 시 강력한 전사 활성을 가지기 때문에 가장 널리 사용되는 효모 프로모터 중 하나이다.

분석적 특성 결정 (질량 스펙트럼 분석)은 피키아 파스토리스 내에서 발현된 FGF-21이 말단절단 (이후 des-HPIP로 표시될, N-말단에 아미노산 네 개 이하의 제 거[HisProIlePro])되었다는 것을 나타냈다. 쥐 3T3-L1 지방세포 검정 (실시예 4 참조)에서 검정되는 경우, 이 FGF-21의 말단절단된 변이체는 야생형 FGF-21과 동일한 수준의 글루코스 흡수를 촉진하였다 (표 1).

<실시예 4>

[쥐 3T3-L1 지방세포에서의 글루코스 흡수]

3T3-L1 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 록빌, MD)로부터 얻었다. 세포는 둘베코(Dulbecco) 변형 이글스 배지 중에 10% 철분 강화된 소 태아 혈청을 포함하는 성장 배지 (GM) 중에서 배양되었다. 표준 지방세포 분화를 위해, 세포가 배양 용기에 꽉 차도록 배양된 지 2일 후 (0일로 지칭), 세포는 10% 소 태아 혈청, 인슐린 10 μg/ml, 1μM 덱사메탄손, 및 0.5 μM 이소부틸메틸잔틴을 함유하는 분화 배지 (DM)에 48 시간 노출시켰다. 그 후 세포는 10% 소 태아 혈청, 및 인슐린 10 μg/ml을 함유하는 후분화 배지에서 유지되었다.

글루코스 운반 검정 - 0.1 mM 2-데옥시-D-[¹⁴C] 글루코스의 축적에 의해 검정된 헥소스 흡수는 12-웰 평판 중 3T3-L1 지방세포를 37 ℃로 가온되고 0.2% BSA를 함유하는 KRP 완충액 (136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 10 mM NaP0₄, 0.9 mM CaCl₂, 0.9 mM MgS0₄, pH 7.4)으로 두 번 세척하고, 0.2% BSA를 함유하는 래보비츠(Leibovitz) L-15 배지에서 37 ℃, 주위 대기 하에서 2시간 인큐베이션하고, 다시 0.2% BSA 함유 완충액 KRP 완충액으로 두 번 세척하고 37 ℃, 주위 대기 하에서 30분간 워트마닌의 부재 (Me₂SO 만 존재) 혹은 존재 하에서 0.2% BSA 함유 KRP 완충액 중에 인큐베이션하였다. 그 후 인슐린을 15분간 최종 농도 100 nM이 되도록 첨가한 다음, 최종 4분 간 2-데옥시-D-[¹⁴C] 글루코스의 흡수를 측정하였다. 10 μM 사이토칼라신 B의 존재하에서 측정된 비특이적 흡수를 모든 값에서 뺐다. 단백질 농도는 피어스(Pierce) 비신코닌산 검정으로 측정하였다. 흡수는 각 실험에 대해 3번 또는 4번 반복하여 측정하였다.

시험관 내 역가는 1.0으로 나타내었고 양성 대조군으로 사용된 야생형 FGF-21의 시험관 내 활성을 기준으로 하였다. 본 발명의 FGF-21 뮤테인의 시험관 내 역가를 표 1에서 야생형 FGF-21과 비교하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 본 발명의 뮤테인은 야생형 FGF-21과 비교하여 다양한 정도의 생물학적 역가를 유지하였다.

* N-말단에 아미노산 4개가 말단 절단됨, 즉, des-HPIP

** DPP-IV에 의해 N-말단에 아미노산 4개가 효소적으로 말단 절단됨, 즉, des-HPIP

<실시예 5>

[ob/ob 쥐 모델]

ob/ob 수컷 쥐를 이용한 비만 모델 연구는 비히클 및 인슐린 대조군과 비교하여 FGF-21로 처리한 뒤 혈장 글루코스 수준 및 트리글리세라이드 수준을 모니터하기 위해 행하였다. 시험군의 ob/ob 수컷 쥐 (생후 7주)에 7일간 비히클만 (0.9% NaCl), 또는 FGF-21 뮤테인 (0.125 mg/kg)을 피하주사 (0.1 mL, 하루 한번)하였다. 7일째에 꼬리 절단 출혈에 의해 혈액을 수집하였고, 화합물 최종 주사 1시간 후, 표준 방법을 사용하여 혈장 글루코스 수준을 측정하였다. 비히클 대조군에 비교하여 FGF-21 뮤테인의 혈장 글루코스 수준을 저하시키는 능력을 표 2에 나타냈다. 표 2의 데이터는 본 발명의 뮤테인이 비히클 대조군에 비해 혈장 글루코스 수준을 저하시켰음을 나타낸다. 비히클 대조군에 비해 FGF-21 뮤테인이 트리글리세라이드 수준을 저하시키는 능력을 표 3에 나타냈다.

<실시예 6>

[FGF-21 뮤테인의 제약학적 안정성]

본 발명의 FGF-21 뮤테인의 안정성을 생리학적 및 제약학적 제제 모의 조건 하에서 분석하였다. 생리학적 조건을 촉진하기 위해, 뮤테인은 표적 단백질 농도 10 mg/ml, pH 7.4, 실온, PBS 중에서 안정성에 대해 분석하였다. PBS 중에서의 뮤테인의 가용성/물리적 안정성은 크기 배제 크로마토그래피 및(또는) 역상 크로마토그래피로 측정되었을 때, 실온에서 제조 후 단백질의 회수가 90%를 초과하는 경우 충분한 것으로 취급하였다. 표 4 및 5에 제시한 본 발명의 뮤테인은 이 기준을 충족시킨다.

본 발명의 뮤테인의 제약 제제가 보존된 다용도 제제일 것이 예상가능하므로, 통상의 보존제와의 융화성을 분석하였다. 제제 융화성을 시험하기 위해, 보존제인 m-크레졸 (최종 농도 3 mg/ml, 보통, 중성 pH 조건 하에서 보존제 효과를 위한 유럽 의약품 기준 B를 충족시키기에 충분한 농도)을 pH 7.4의 PBS 중에 약 10 mg/ml의 농도로 뮤테인을 함유하는 용액에 실온에서 첨가하였다. 보존제 존재 하의 물리적 안정성은 실온에서 역상 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 후 주요 크로마토그래피 그래프의 피크에서의 단백질 회수를 결정하여 먼저 평가하였다. 또한, 37 ℃에서 DLS (동적 광산란법)으로 측정된 응집도는 야생형 FGF-21과 비교하여, m-크레졸 존재 하에서 2시간 후 입자의 평균 지름으로 나타내었다. 더 큰 평균 지름은 증가된 정도의 단백질 결합 및(또는) 응집에 대응한다. 야생형 FGF-21에 비교하여 본 발명의 첫번째 및 두번째 실시태양의 뮤테인의 보존제 융화성 (미립자의 평균 지름의 함수로써)은 표 4에 나타냈다. 모든 뮤테인은 이. 콜라이 내에서 발현되었다.

PBS 중에서 안정적이고 보존제와 융화가능한 본 발명의 뮤테인은 야생형 FGF-21에 비교하여 증진되거나 또는 개선된 제약학적 성질을 가지는 것으로 나타났다. 표 4에 나타난 바와 같이, 야생형 FGF-21에 비교하여 증진된 제약학적 성질을 가지는 본 발명의 바람직한 뮤테인은 L139E, A145E, L146E, I152E, Q156E, [I152E, S163E], S163E, Q54E, [L21C-L33C, L118C-A134C], L21C-L33C, A26C-K122C, 및 L118C-A134C이다.

* 평균 미립자 지름은 37 ℃에서 2시간 인큐베이션 후 단백질 용액이 표적 농도인 10 mg/ml, m-크레졸 3 mg/ml에서 측정된 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> Muteins of Fibroblast Growth Factor 21 <130> X-16280 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 181 <212> PRT <213> human <400> 1 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 2 <211> 543 <212> DNA <213> human <400> 2 caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 60 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 120 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 180 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 240 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 300 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 360 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 420 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 480 ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 540 tcc 543

Claims (41)

1. 글리신 42, 글루타민 54, 아르기닌 77, 알라닌 81, 류신 86, 페닐알라닌 88, 리신 122, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 프롤린 130, 아르기닌 131, 류신 139, 알라닌 145, 류신 146, 이소류신 152, 알라닌 154, 글루타민 156, 글리신 161, 세린 163, 글리신 170, 또는 세린 172 중 하나 이상에 대한 대전된 아미노산 및(또는) 극성이나 대전되지 않은 아미노산의 치환을 포함하고, 상기 아미노산의 번호매김은 서열 번호: 1을 기초로 하는 것인, 인간 섬유모세포 성장인자 21 (FGF-21)의 뮤테인, 또는 그의 생물학적으로 활성있는 펩티드.
2. 제1항에 있어서, 상기 음성 대전된 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 비자연적으로 발생된 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뮤테인.
3. 제1항에 있어서, 상기 극성이나 대전되지 않은 아미노산이 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 및 비자연적으로 발생된 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뮤테인.
4. 제1항에 있어서, 상기 뮤테인이 Leu139Glu, A1a145Glu, Leu146Glu, Ile152Glu, Gln156Glu, Ser163Glu, Ile152Glu, Ser163Glu, 및 Gln54Glu로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뮤테인.
5. 제4항에 있어서, 상기 뮤테인이 N-말단에 4개 이하의 아미노산이 말단절단된 것인 뮤테인.
6. 제1항의 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA인 폴리뉴클레오티드.
8. 제7항의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
9. 제8항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
10. 제9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 효모 세포인 숙주 세포.
11. (a) 제10항의 숙주 세포로부터 상기 폴리펩티드를 발현하는 단계, 및

    (b) 상기 폴리펩티드를 단리하는 단계

    를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
12. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 증상을 나타내는 환자를 치료하는데 유용하고, 제1항의 FGF-21 뮤테인의 치료적 효과량 및 허용가능한 제약학적 담체를 포함하는 제약 조성물.
13. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 증상을 나타내는 환자에게 제1항의 FGF-21 뮤테인의 치료적 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 환자가 2형 당뇨를 나타내는 환자인 방법.
15. 아르기닌 19, 티로신 20, 류신 21, 티로신 22, 트레오닌 23, 아스파르테이트 24, 아스파르테이트 25, 알라닌 26, 글루타민 27, 글루타민 28, 알라닌 31, 류신 33, 이소류신 35, 류신 37, 발린 41, 글리신 42, 글리신 43, 글루타메이트 50, 글루타민 54, 류신 58, 발린 62, 류신 66, 글리신 67, 리신 69, 아르기닌 72, 페닐알라닌 73, 글루타민 76, 아르기닌 77, 아스파르테이트 79, 글리신 80, 알라닌 81, 류신 82, 글리신 84, 세린 85, 프롤린 90, 알라닌 92, 세린 94, 페닐알라닌 95, 류신 100, 아스파르테이트 102, 티로신 104, 티로신 107, 세린 109, 글루타메이트 110, 프롤린 115, 히스티딘 117, 류신 118, 프롤린 119, 아스파라긴 121, 리신 122, 세린 123, 프롤린 124, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 아스파르테이트 127, 알 라닌 129, 프롤린 130, 글리신 132, 알라닌 134, 아르기닌 135, 류신 137, 프롤린 138, 또는 류신 139 중 2개 이상에 대한 시스테인 치환을 포함하고, 상기 아미노산의 번호매김은 서열 번호: 1을 기초로 하는 것인, 인간 FGF-21의 뮤테인, 또는 그의 생물학적으로 활성있는 펩티드.
16. 제15항에 있어서, 상기 뮤테인이 Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys, Leu21Cys/Leu33Cys, Leu118Cys/Ala134Cys, 또는 Ala26Cys/Lys122Cys로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뮤테인.
17. 제16항에 있어서, 상기 뮤테인이 N-말단에 4개 이하의 아미노산이 말단절단된 것인 뮤테인.
18. 제17항에 있어서, 상기 뮤테인이 des-HPIP-Leu118Cys/A1a134Cys인 뮤테인.
19. 제15항의 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
20. 제19항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA인 폴리뉴클레오티드.
21. 제20항의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
22. 제21항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
23. 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포인 숙주 세포.
24. (a) 제23항의 숙주 세포로부터 상기 폴리펩티드를 발현시키는 단계, 및

    (b) 상기 폴리펩티드를 단리하는 단계

    를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
25. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 증상을 나타내는 환자를 치료하는데 유용하고, 제15항의 FGF-21 뮤테인의 치료적 효과량 및 허용가능한 제약학적 담체를 포함하는 제약 조성물.
26. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 증상을 나타내는 환자에게 제15항의 FGF-21 뮤테인의 치료적 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 환자가 2형 당뇨를 나타내는 환자인 방법.
28. 아르기닌 19, 티로신 20, 류신 21, 티로신 22, 트레오닌 23, 아스파르테이트 24, 아스파르테이트 25, 알라닌 26, 글루타민 27, 글루타민 28, 알라닌 31, 류신 33, 이소류신 35, 류신 37, 발린 41, 글리신 42, 글리신 43, 글루타메이트 50, 글루타민 54, 류신 58, 발린 62, 류신 66, 글리신 67, 리신 69, 아르기닌 72, 페닐알라닌 73, 글루타민 76, 아르기닌 77, 아스파르테이트 79, 글리신 80, 알라닌 81, 류신 82, 글리신 84, 세린 85, 프롤린 90, 알라닌 92, 세린 94, 페닐알라닌 95, 류신 100, 아스파르테이트 102, 티로신 104, 티로신 107, 세린 109, 글루타메이트 110, 프롤린 115, 히스티딘 117, 류신 118, 프롤린 119, 아스파라긴 121, 리신 122, 세린 123, 프롤린 124, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 아스파르테이트 127, 알라닌 129, 프롤린 130, 글리신 132, 알라닌 134, 아르기닌 135, 류신 137, 프롤린 138, 또는 류신 139 위치의 2개 이상의 아미노산에 대한 시스테인 치환과 함께;

    글리신 42, 글루타민 54, 아르기닌 77, 알라닌 81, 류신 86, 페닐알라닌 88, 리신 122, 히스티딘 125, 아르기닌 126, 프롤린 130, 아르기닌 131, 류신 139, 알라닌 145, 류신 146, 이소류신 152; 알라닌 154; 글루타민 156, 글리신 161, 세린 163, 글리신 170, 또는 세린 172 중 하나 이상의 아미노산에 대한 대전된 아미노산 및(또는) 극성이나 대전되지 않은 아미노산의 치환을 포함하고;

    상기 아미노산의 번호매김은 서열 번호: 1을 기초로 하는 것인, 인간 FGF-21의 뮤테인, 또는 그의 생물학적으로 활성있는 펩티드.
29. 제28항의 뮤테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
30. 제29항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA인 폴리뉴클레오티드.
31. 제30항의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
32. 제31항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
33. 제32항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효모 세포인 숙주 세포.
34. (a) 제33항의 숙주 세포로부터 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및

    (b) 상기 폴리펩티드를 단리하는 단계

    를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
35. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 증상을 나타내는 환자를 치료하는데 유용하고, 제28항의 FGF-21 뮤테인의 치료적 효과량 및 허용가능한 제약학적 담체를 포함하는 제약 조성물.
36. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 증상을 나타내는 환자 에게 제28항의 FGF-21 뮤테인의 치료적 효과량을 투여하는 것을 포함하는 상기 환자의 치료방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 환자가 2형 당뇨를 나타내는 환자인 방법.
38. 제28항에 있어서, 상기 뮤테인은 N-말단에 아미노산 4개 이하가 말단절단된 것인 뮤테인.
39. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 증상의 치료용 약제의 제조를 위한 제1항의 FGF-21 뮤테인의 용도.
40. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 증상의 치료용 약제의 제조를 위한 제15항의 FGF-21 뮤테인의 용도.
41. 비만, 2형 당뇨, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 과민증, 고혈당증, 또는 대사 증후군으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 증상의 치료용 약제의 제조를 위한 제28항의 FGF-21 뮤테인의 용도.