CN102625811B - Fgf21突变体及其用途 - Google Patents
Fgf21突变体及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102625811B CN102625811B CN200980150308.1A CN200980150308A CN102625811B CN 102625811 B CN102625811 B CN 102625811B CN 200980150308 A CN200980150308 A CN 200980150308A CN 102625811 B CN102625811 B CN 102625811B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- fgf21
- polymer
- peg
- molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
本发明提供编码FGF21突变多肽的核酸分子，FGF21突变多肽，包含FGF21突变多肽的药物组合物，以及使用所述核酸、多肽或者药物组合物治疗代谢紊乱的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本发明要求2008年10月10日递交的申请号为61/195,761的美国临时申请的优先权。
技术领域
本发明涉及编码FGF21突变多肽的核酸分子，FGF21突变体多肽，包含FGF21突变多肽的药物组合物，以及使用所述核酸、多肽或者药物组合物治疗代谢紊乱的方法。
背景技术
FGF21属于成纤维细胞生长因子(FGF)亚族的分泌多肽，所述成纤维细胞生长因子(FGF)亚族包括FGF19、FGF21和FGF23(Itoh等，2004，Trend Genet.20：563-69)。FGF21是一种非典型的FGF，其是独立于肝素，并在葡萄糖、脂类调控和能量代谢中作为激素发挥功能。
FGF21作为肝脏分泌因子分离自肝脏cDNA文库。其在肝脏和胰脏中高度表达，也是FGF家族主要在肝脏表达的唯一成员。过表达FGF21的转基因小鼠显示出了低生长率、低血糖和甘油三酯水平以及的代谢表型，并且没有出现与年龄相关的2型糖尿病、胰岛增生与肥胖。对糖尿病鼠模型药物施用重组FGF21蛋白导致血糖水平正常，甘油三酯和胆固醇水平降低，并改善糖耐受和胰岛素敏感性。此外，FGF21通过增加能量消耗、身体活性和代谢率减低体重和身体脂肪。实验研究提供了FGF21用于治疗人类2型糖尿病、肥胖、血脂异常及其他代谢紊乱的药物学给药的支持。
人类FGF21在体内半衰期很短。在小鼠和食蟹猴中，人类FGF21的有效半衰期是1至2小时。在开发用作治疗2型糖尿病的治疗剂的FGF21蛋白中，需要增加其半衰期。具有增加的半衰期的FGF21蛋白将允许给药该蛋白的患者的给药频率减少。
发明概述
在一实施方案，本发明提供了分离的核酸分子，其包括编码SEQ ID NO：4多肽的核苷酸序列，所述多肽具有至少一个氨基酸置换：(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合。
在另一实施方案，本发明提供了一分离的核酸分子，其包括编码SEQ ID NO：4多肽的核苷酸序列，所述多肽具有至少一个氨基酸置换：(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合，其包含使所述多肽与SEQ ID NO：4至少85％一致的增加、缺失或进一步置换，前提条件是权利要求1(a)-(e)所述的至少一种氨基酸置换不进行进一步修饰。
本发明还提供包含本发明核酸分子的载体和宿主细胞。
在进一步实施方案，本发明提供分离的多肽，其具有下列至少一个氨基酸置换的SEQ ID NO：4的氨基酸序列：(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合。
在进一步实施方案，本发明提供编码多肽的分离的核酸，所述多肽包含具有下列至少一种氨基酸置换的SEQ ID NO：4的氨基酸序列：(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合，以及其包含使所述多肽与SEQ ID NO：4至少85％一致的增加、缺失或进一步置换，前提条件是权利要求1(a)-(e)所述的至少一种氨基酸置换不进行进一步修饰。
在又一实施方案，本发明提供分离的多肽，包含具有下列至少一种氨基酸置换的SEQ ID NO：4的氨基酸序列：(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合，以及其包含使所述多肽与SEQ ID NO：4至少85％一致的增加、缺失或进一步置换，前提条件是权利要求1(a)-(e)所述的至少一种氨基酸置换不进行进一步修饰。
另外，本发明提供组合物，包含：通过接头结合第二多肽的第一多肽，所述第一多肽含有任选地具有下列至少一种氨基酸置换的SEQ ID NO：4的氨基酸序列：(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合，所述第二多肽包括任选地具有下列至少一种氨基酸置换的SEQ IDNO：4的氨基酸序列的多肽：(a)在36，72，77，126和175位中的一个或多个的赖氨酸残基；(b)在37，38，46，91，69，77，79，87，91，112，113，120，121，125，126，175，170和179位中的一个或多个的半胱氨酸残基；(c)在56，59，69和122位中的一个或多个的精氨酸残基；(d)在170位的甘氨酸残基；(e)在171位的甘氨酸残基；以及(a)-(e)的组合。
本发明还提供本发明多肽的化学修饰形式。化学修饰形式的多肽包含附接N-端和/或天然或非天然存在的聚合物附接位点的聚合物。本发明还提供药物组合物和治疗代谢紊乱的方法，例如肥胖症和糖尿病，包括向需要的患者施用本发明的药物组合物。
本发明的特定实施方案从某些实施方案的下列详细描述和所附权利要求书中是明显可见的。
附图简述
图1是具有附接其序列的两种聚合物(例如PEG分子)的FGF21分子的草图。
图2包含四种SDS-PAGE凝胶，其示出9种FGF21突变体的PEG化程度，所述FGF21突变体具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点用PEG化学修饰，即E37C，R77C和H125C(左上)，D38C，D46C和D79C(右上)，H87C，E91C，G113C(左下)和G120C，R126C，N121C(右下)。
图3包含SDS-PAGE凝胶，其示出3种FGF21突变体的PEG化程度，所述FGF21突变体具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子化学修饰，即K69C，R175C和Y179C。
图4包括两个图，其示出对FGF21突变多肽进行ELK-荧光素酶测定的结果，所述FGF21突变多肽具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点通过附接20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子而化学修饰，即E37C，R77C，E91C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21(上图)和G113C，N121C，D46C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21(下图)。
图5包括两个图，其示出对FGF21突变多肽进行ELK-荧光素酶测定的结果，所述FGF21突变多肽具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点通过附接20kDa甲氧基-PEG马来酰亚胺而化学修饰，即H125C，G120C，R126C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21(上图)和D79C，D38C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21(下图)。
图6包括两个图，其示出对野生型FGF21和FGF21突变多肽进行ELK-荧光素酶测定的结果，它们具有单一工程化聚合物附接位点，所述附接位点通过附接20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子而化学修饰，即K69C，D79C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21(上图)和R175C，Y179C，野生型FGF21和N-端PEG化FGF21(下图)。
图7是本发明的系链分子的草图。
图8示出在小鼠中在单次注射赋形剂(PBS)，野生型FGF21或N-端PEG化野生型FGF21后从时间0开始血糖水平的改变百分率的图。
图9示出在小鼠中在单次注射赋形剂(PBS)或者用20，30或40kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子N-端PEG化的野生型FGF21后从时间0开始血糖水平的改变百分率的图。
图10包括两个图，其示出在小鼠中在单次注射PBS或N-端PEG化FGF21突变多肽后从时间0开始在9天中血糖水平的改变百分率的图，N-端PEG化FGF21突变多肽包含突变体R77C或R126K，其在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子进一步PEG化，融合蛋白包含Fc分子和G170E FGF21突变多肽(上图)；或N-端PEG化FGF21突变多肽，包含突变体R77C，其在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子和P171G(下图)进一步PEG化。
图11是示出在单次注射赋形剂(10mM磷酸钾，5％山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间0开始血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E91C/H125C，E91C/R175C，E37C/G120C，E37C/H125C和E37C/R175C；还研究包含Fc分子和P171G FGF21突变多肽的融合蛋白。
图12是示出在单次注射赋形剂(10mM磷酸钾，5％山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间0开始血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E91C/H121C，G120C/H125C或E37C/R77C；还研究包含Fc分子和G170E FGF21突变多肽的融合蛋白。
图13是示出在小鼠中在单次注射赋形剂(10mM磷酸钾，5％山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间0开始血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C，E91C/R175C，E37C/H125C，E37C/R77C/P171G，E91C/R77C/P171G和E37C/R125C/P171G。
图14是示出在小鼠中在单次注射赋形剂(10mM磷酸钾，5％山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间0开始血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G和E91C/R125C/P171G，或包含两个相同FGF21突变多肽的系链分子，FGF21突变多肽具有相同的引入突变体，即R77C/P171G(2x)和R78C/P172G(2x)，其通过20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子结合在一起。
图15是在小鼠中在单次注射赋形剂(10mM Tris HCl，150mM NaCl，pH 8.5)或FGF21突变多肽后从时间0开始作为剂量函数的血糖水平的改变百分率的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G，并且以剂量0.01mg/kg，0.03mg/kg，0.1mg/kg，0.3mg/kg或1mg/kg来施用。
图16是示出在小鼠中在单次注射赋形剂(10mM磷酸钾，5％山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间0开始的体重改变的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C，E91C/R175C，E37/H125C，E37C/R77C/P171G，E91C/R77C/P171G和E37C/R125C/P171G。
图17是示出在小鼠中在单次注射赋形剂(10mM磷酸钾，5％山梨糖醇，pH 8)或FGF21突变多肽后从时间0开始的体重改变的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G和E91C/R125C/P171G，或包含两个FGF21突变多肽的系链分子，FGF21突变多肽具有相同的引入突变体，即R37C/P171G(2x)和R77C/P171G(2x)，其通过20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子结合在一起。
图18是在小鼠中在单次注射赋形剂(10mM Tris HCl，150mM NaCl，pH 8.5)或FGF21突变多肽后从时间0开始作为剂量函数的体重改变的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G，并且施加5种不同的剂量。
图19A-19F是一系列6个图，其示出在8个星期肾脏液泡研究中小鼠体重改变的图，其使用一周给药赋形剂(方块)，5mg/kg(三角形)和25mg/kg(空心圆)PEG化FGF21分子。使用双半胱氨酸靶向的PEG-FGF21给药的小鼠显示出保持体重减轻，而给药系链分子的那些显示出主要瞬间体重减轻。
图20包括两个棒图，其示出在注射赋形剂或FGF21突变多肽的小鼠中8个星期肾脏液泡研究结果的图，FGF21突变多肽在这些引入的聚合物附接位点使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子双PEG化，即E37C/R77C/P171G；E37/H125C/P171G；E91C/H125C/P171G；E37C/P171G；R77C/P171G；和R77C/P171G；测试两种不同剂量。
发明详述
人FGF21蛋白，如增加半衰期具有增强特性可以准备使用的方法和标准披露外分子生物学方法。据了解，由一个或多个具有约束力的水溶性聚合物，如聚乙二醇分子，在蛋白的蛋白质半衰期可以延长。因此，在不同的实施例，天然FGF21半衰期可以延长引入蛋白质氨基酸置换的形式在哪个聚合物可附着在FGF21蛋白点。这种修饰的蛋白质，在此统称为FGF21突变体和本发明的形式体现。也可引入聚合物结合的非天然聚合物附接位点引入的N-端的FGF21分子。
本文中使用的重组核酸方法包括在实施例中，通常为Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，GreenPublishers Inc.and Wiley and Sons 1994)中阐述的那些，为了任何目的其通过引用方式全部并入本文。
1.通用定义
如本文中使用的，除非另有说明，术语“一种”表示一种或多种。
术语“分离的核酸分子“是指该发明的核酸分子(1)已脱离至少约50个蛋白质，脂肪，碳水化合物，或其他材料自然地发现它是从源细胞总核酸分离的，(2)不与全部或部分聚核苷酸对其中的“分离的核酸分子”是联系在一起的性质，(3)可操作地链接到它的聚核苷酸在没有联系的性质，或(4)不发生在自然界作为一个更大的聚核苷酸序列的一部分。优选，分离的核酸分子的本发明实质上从任何其他污染核酸分子或其他污染物，为它的天然环境，在多肽干预其生产或它的治疗，诊断，预防或研究发现使用自由使用。
术语“分离的多肽“是指本发明的多肽，(1)已至少从聚核苷酸约50，脂肪，碳水化合物，百分之分居或其他材料自然地发现它是从源细胞总核酸分离的(2)不链接(共价键或共价相互作用)的全部或一部分的多肽其中“分离的多肽“在本质上是联系在一起，(3)可操作地链接(共价键或共价交互)到与它没有联系的性质，或(4)不发生在自然界多肽。优选，分离的多肽实质上从任何其他污染多肽或其他污染物，为它的天然环境，干扰其治疗，诊断，预防或研究发现自由使用。
术语“载体”是指任何分子(例如核酸，质粒或病毒)，用于传输编码信息到宿主细胞。
术语“表达载体“，是指载体，它可以通过一个合适的宿主细胞转化，并包含核酸序列，直接和/或控制插入的外源核酸序列的表达。表达包括但不限于加工，如转录，翻译和RNA的剪接，如内含子存在。
术语“宿主细胞“，是用来指已经改变，或者是能够被转化与核酸序列和表达了当时人们感兴趣的某些基因的细胞。术语包括了母细胞后代，不论是在形态的后代在遗传相同或化妆到原来的父母，只要选定的基因存在。
术语“自然形成“使用时，如核酸分子，多肽，宿主细胞的生物材料连接，等等，这是指在自然界中发现，并非由人操纵的材料。同样，“非天然“是指这里所用的一个不存在于自然界，或已被修改或人为结构合成材料。使用时与核苷酸的联系，术语“自然发生“是指基地腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的。使用时，与氨基酸连接，术语“自然发生“是指20种氨基酸丙氨酸(A)，半胱氨酸(C)和天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)和苯丙氨酸(F)的甘氨酸(G)，组氨酸(H)，异亮氨酸(I)，赖氨酸(K)时，亮氨酸(L)和蛋氨酸(M)，天冬酰胺(N)，脯氨酸(P)，谷氨酰胺(Q)，精氨酸(R)，丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，缬氨酸(V)，色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
术语“FGF21多肽“是指任何天然野生型多肽在人类表达。就本申请而言术语，“FGF21多肽“可以互换使用来指全长FGF21多肽，它由209个氨基酸残基的(SEQ ID：2)，是由核苷酸编码序列如SEQ ID：1；以及多肽成熟的形式，它由181个氨基酸残基的(SEQ ID：4)组成，是由如SEQ ID NO的核苷酸序列编码：3，其中28个氨基酸残基或继续其全长的FGF21多肽(即构成的信号肽)已被删除氨基-端。FGF21多肽可表示有或没有的N-端蛋氨酸残基，正如文中提到的，N-端甲硫氨酸残基可以添加设计或作为细菌表达系统的功能。
术语“生物活性”，适用于FGF21多肽，包括FGF21突变多肽所述，指的是野生型FGF21多肽，如降低血糖，胰岛素，甘油三酯，或胆固醇的能力，自然发生的活性；减少体重，改善糖耐量，能量消耗，或胰岛素的敏感性。适用于FGF21突变多肽，术语是不是在类型或已纳入FGF21突变多肽引进一些修改而定。例如，一些FGF21突变多肽拥有了FGF21活性有所下降水平相对于野生型FGF21多肽，但仍然被认为是具有生物活性的FGF21突变多肽。在一个特定的FGF21突变多肽活性之间的差异可以看出在体内和体外实验，任何此类的差异与使用的特殊检测。这样的观察，但并不影响术语，意思是“生物活性”和FGF21突变多肽露出了野生型FGF21多肽，如降低血糖，胰岛素，甘油三酯，或胆固醇的能力，自然发生的活性；降低体重，改善糖耐量，能量消耗，在任何或胰岛素的敏感性，在体内或体外试验是“生物活性。”
术语“有效量“和”治疗有效量“互换使用，并参考了FGF21突变多肽的使用量，以支持一个或多个生物活性的野生型FGF21多肽，如能够降低，可观察的水平血糖，胰岛素，甘油三酯，或胆固醇水平，降低体重，或改善糖耐量，能量消耗，或胰岛素的敏感性。
术语“药学上可接受的载体“或”生理学上可接受的载体“作为此处使用的是指一个或多个配方材料完成或提高FGF21突变多肽交付使用。这种材料的例子中可以在Remington上文找到，通过引入并入本文。
术语“系链分子“是指由两个或两个以上建设FGF21分子的一个接头分子拴在一起。一个系链分子至少包括两个FGF21多肽，其中至少一种是FGF21突变多肽所述外，但可以由三，四个或更多的FGF21或FGF21突变多肽接头一起加入，因此，术语系链分子不局限于一个分子组成的只有一个或两个FGF21或FGF21突变多肽组合。
术语“高分子附接位点“是指一个多肽主要氨基酸序列(例如一FGF21多肽)，它适应于有化学聚合物(例如聚乙二醇分子的所有分子量，聚甘露糖，聚糖共价键合区域等)。聚合物附接位点可能意味着一个单一的氨基酸(例如半胱氨酸，赖氨酸，精氨酸或适当的非天然氨基酸)或术语可以指两个或多个相邻氨基酸无论是在相互顺序或空间。
术语“化学修饰，“在使用时就一个FGF21野生型或FGF21突变所披露者外多肽，是指一个FGF21多肽已经从它的天然状态的修改由一个或多个外源分子共价附接第外源分子的例子包括聚乙二醇(PEG)的，单甲氧基-聚乙二醇，右旋糖酐，纤维素，聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇，羟基升乙基淀粉(HES)和聚乙烯醇。多肽的化学修饰FGF21的例子包括聚乙二醇化野生型FGF21和FGF21突变多肽。
2.FGF21突变多肽
在各方面，本发明公开了一种为定点聚乙二醇化的FGF21和FGF21突变多肽，可提高对FGF21分子药代动力学性质，同时尽量减少对体外培养方法的系列活性的影响。增强这些聚乙二醇化FGF21分子药动学特征具有在体内的分子疗效上通过增加接触到的治疗剂的影响。此外，本文所述的策略与聚乙二醇化创建多个站点，这可能都进一步提高对分子药代动力学特性，降低其液泡形成潜在的不兼容。采用两种主要战略是实现这个目标，如本文所述。
一方面，本发明涉及FGF21在其中一个或更多的修改已经实施序列。因此，术语“FGF21突变多肽”和“FGF21突变体”，它可以互换使用，是指一FGF21多肽在其中野生型FGF21氨基酸序列(例如如SEQ ID 2或4)已被修改。这些修改包括但不限于一个或多个氨基酸置换，包括与非天然氨基酸类似物，截断插入和置换。因此，FGF21多肽突变包括但不限于定点FGF21突变体，如引入非天然聚合物附接位点的人，或传授程度的抵抗蛋白质，如本文所述。为了确定具体的氨基酸突变体的FGF21在本发明中，氨基酸残基截断或突变编号置换的目的对应于成熟的181个残基的FGF21多肽(即该的N-端序列开始HPIPD，这些残基都分别指定为残基第1，2，3，4和5)。N-端蛋氨酸残基可以但并不需要存在，这N-端甲硫氨酸残基是不是在蛋白质的编码方案包括在内。
如上所述，FGF21突变包括截断形式的FGF21包括一个或多个置换或插入，其中包括非天然氨基酸构成本发明实施例体。这样可以插入或置换传授包括聚合物附接地点采取行动的各种属性。在这种情况下，非天然氨基酸可以被纳入除了各种突变体此处描述成一个FGF21序列。因此，一FGF21突变可以由一个或更多的突变体所述，可以进一步包括一个或多个非天然氨基酸。一个非限制性的非天然存在的，可以插入到FGF21序列或在FGF21序列野生型的氨基酸残基取代的例子清单包括-氨基酸，均氨基酸，环状氨基酸和氨基酸衍生物侧链。例子包括(L-形或D-形；缩写)：对-乙酰基-苯丙氨酸，对-叠氮基-苯丙氨酸，对-溴-苯丙氨酸，对-碘-苯丙氨酸和对-乙炔基-苯丙氨酸，瓜氨酸(Cit)，高瓜氨酸(hCit)，Nα-甲基瓜氨酸(NMeCit)，Nα-甲基高瓜氨酸(Nα-MeHoCit)，鸟氨酸(Orn)，Nα-甲基鸟氨酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)，肌氨酸(Sar)，高赖氨酸(hLys或hK)，高精氨酸(hArg或hR)，高谷胱甘肽(hQ)，Nα-甲基精氨酸(NMeR)，Nα-甲基亮氨酸(Nα-MeL或NMeL)，N-甲基高赖氨酸(NMeHoK)，Nα-甲基谷氨酰胺(NMeQ)，异亮氨酸(Nle)，正缬氨酸，(Nva)，1，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)，八氢吲哚-2-羧酸(Oic)，3-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)，3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)，1，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)，2-茚满基甘氨酸(IgI)，对-碘苯丙氨酸(pI-Phe)，对-氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe)，4-胍基苯丙氨酸(Guf)，甘氨酰赖氨酸(缩写″K(Nε-甘氨酰)″或″K(甘氨酰)″或″K(gly)″)，硝基苯丙氨酸(nitrophe)，氨基苯丙氨酸(氨基苯或氨基-Phe)，苄基苯丙氨酸(苄基phe)，γ-羧基谷氨酸(γ-羧基glu)，羟基脯氨酸(羟基pro)，p-羧基l-苯丙氨酸(Cpa)，α-氨基己二酸(Aad)，Nα-甲基缬氨酸(NMeVal)，N-α-甲基亮氨酸(NMeLeu)，Nα-甲基异亮氨酸(NMeNle)，环戊基甘氨酸(Cpg)，环己基甘氨酸(Chg)，乙酰基精氨酸(乙酰基arg)，α，β-二氨基丙酸(Dpr)，α，γ-二氨基丁酸(Dab)，二氨基丙酸(Dap)，环己基丙氨酸(Cha)，4-甲基-苯丙氨酸(Me Phe)，β，β-二苯基-丙氨酸(BiPhA)，氨基丁酸(Abu)，4-苯基-苯丙氨酸(或二苯丙氨酸4Bip)，α-氨基-异丁酸(Aib)，β-丙氨酸，β-氨基丙酸，哌啶酸，氨基己酸，氨基庚酸，氨基庚二酸，desmosine，二氨基庚二酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，羟基赖氨酸，异-羟基赖氨酸，isodesmosine，别-异亮氨酸，N-甲基甘氨酸，N-甲基异亮氨酸，N-甲基缬氨酸，4-羟基脯氨酸(Hyp)，γ-羧基谷氨酸盐，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰蛋氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，ω-甲基精氨酸，4-氨基-O-邻苯二甲酸(4APA)，和其他类似氨基酸以及那些特定列出的任一种的衍生形式。
在本发明实施例等，FGF21突变多肽包括一个氨基酸序列即至少百分之85至野生型相同FGF21氨基酸序列(例如如SEQ ID：2或4)，但其中的具体残基介绍非天然聚合物附接位点中的FGF21突变多肽本有没有得到进一步的修改。换句话说，随着残基的FGF21异常突变序列已被修改，以便引入非天然聚合物附接位点或一抗突变，提高蛋白质，约15百分之的所有其他氨基酸残基在FGF21突变序列可能会被修改。例如，在FGF21突变多肽G170C，多达15％的所有氨基酸残基的其他比甘氨酸残基的位置170可以修改。还有一些实施方案中，FGF21多肽的氨基酸序列突变包括至少是百分之九十左右，约有95，96，97，或98或百分之99到野生型相同FGF21氨基酸序列(例如的SEQ ID：2，4，6或8)，但其中的具体残基已被修改，那是引入非天然聚合物附接位点或提高蛋白质阻力没有得到进一步的修改。这种FGF21突变多肽具有至少对野生型FGF21多肽一种活性。
FGF21突变多肽可产生氨基酸置换引入，无论是保守或不保守的性质和利用自然或不自然产生的氨基酸的FGF21多肽在特定的位置。这种置换可以在设计或置换除了提出一个理想的观察传授属性到FGF21多肽。通过举例的方式，一种FGF21突变多肽能包括设计来实现，如引入非天然聚合物附接位点或增强抗水解一个理想的属性，置换，并能进一步包括一个或更多的保守或不保守的置换可能，但不需要维护野生型FGF21多肽的生物活性。
FGF21突变体，可以保守或不保守。一个″保守氨基酸置换″会涉及到与外来的残基取代原生氨基酸残基(即残基中的野生型FGF21多肽序列中指定的位置找到)(即残基是不发现一对野生型FGF21多肽序列中指定位置)等，很少有或没有对氨基酸残基在该位置极性或电荷效应。保守的氨基酸置换也是包括非天然氨基酸残基那通常是由化学合成肽，而不是在生物系统的合成中。这些措施包括肽和氨基酸倒基逆转或其他形式。
天然存在的残基可基于通常侧链性质来分类：
(1)疏水性：异亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：Asn，Gln，His，Lys，Arg；
(5)影响侧链取向的残基：Gly，Pro；以及
(6)芳族：Trp，Tyr，Phe。
保守的置换可涉及这些类中的一个成员，在同一类的其他成员交换。非保守置换可能涉及的一个成员对这些类的一个成员从另一个类的交换。
所需的氨基酸置换的(无论保守或不保守)可以被那些在当时这种置换由本领域技术人员确定的。一种氨基酸置换的例子(但不限于)列表列于表1。
表1
氨基酸置换
| 原始残基 | 示例性置换 |
| Ala | Val，Leu，Ile |
| Arg | Lys，Gln，Asn |
| Asn | Gln |
| Asp | Glu |
| Cys | Ser，Ala |
| Gln | Asn |
| Glu | Asp |
| Gly | Pro，Ala |
| His | Asn，Gln，Lys，Arg |
| Ile | Leu，Val，Met，Ala，Phe |
| Leu | Ile，Val，Met，Ala，Phe |
| Lys | Arg，Gln，Asn |
| Met | Leu，Phe，Ile |
| Phe | Leu，Val，Ile，Ala，Tyr |
| Pro | Ala |
| Ser | Thr，Ala，Cys |
| Thr | Ser |
| Trp | Tyr，Phe |
| Tyr | Trp，Phe，Thr，Ser |
| Val | Ile，Met，Leu，Phe，Ala |
2.A.包含耐蛋白水解突变的FGF21突变多肽
已确定，FGF21成熟的形式(即181个残基的形式)在体内降解，最终被确定为来自蛋白质的攻击经历。成熟FGF21在体内降解已被发现导致较短有效半衰期，它可以产生不利影响分子的治疗潜力。因此，进行有针对性的研究，以确定FGF21突变体的表现出的抗蛋白水解。由于这一调查结果，在成熟的FGF21被确定为特别易受蛋白水解多肽的位点包括在位置4-5，20-21，151-152和171-172之间的氨基酸残基肽键。
消除这方面的一个模范作用的蛋白替代非限制性清单观察成熟FGF21同时不影响蛋白质的生物活性，不能接受的程度，可以在本发明是在表2展示。表2是唯一的示范性和其他蛋白水解置换可以识别并在本发明使用。除了置换，这些耐蛋白水解置换可引入一个或多个非天然存在的高分子附接位点，从而产生FGF21突变多肽各展示突变类型传授的优良特性。
表2
提供抗蛋白水解的代表性置换
优选，但不一定，FGF21突变多肽组成耐蛋白水解突变具有生物活性基本相同，或比对野生型FGF21活性更大。因此，本发明的另一种实施方案，是向FGF21突变多肽组成一个或多个非天然存在的高分子附接位点和有抗药性的蛋白水解，但仍保留生物活性，它是一样的，或比野生型FGF21更大。虽然一些不太理想，FGF21突变体的情况包括一个或多个非天然存在的高分子附接位点和有抗药性的蛋白水解，但本发明的另一实施方案表现出生物活性有所下降。在某些情况下，它可以保持理想的蛋白水解程度，因此，FGF21突变体包括一或多个非天然存在的高分子附接位点和它有抗药性的蛋白水解，但仍然允许某种程度的蛋白水解发生也构成本发明的另一种实施方案。
正如本发明的所有FGF21突变多肽，耐蛋白水解FGF21突变多肽组成的一或多个非天然存在的高分子附接位点可由所述本领域普通技能的人利用，例如那些与标准分子生物学技术的知识，能运用这些知识，再加上即时披露，制作和使用的耐蛋白水解FGF21突变体，包括一或多个非天然存在的聚合物附接位点的本发明。标准的技术可用于重组DNA，寡核苷酸合成，组织培养，和转换(例如电穿孔，脂质体)。例如参见Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，通过引入并入本文。酶反应和纯化技术可以执行根据制造商的规格，常用于本领域，或如本文所述。除非有具体的定义规定，在连接使用的术语，和实验室程序及，分析化学，有机合成化学，化学和医药技术，本文介绍的是那些众所周知的，而且通常在本领域中。标准技术可用于化工合成，化学分析，药物制剂，配方，交付，以及患者的治疗。
耐蛋白水解FGF21突变体，包括一或多个非天然存在的高分子附接位点是抗蛋白水解可以使用最先进的化学修饰和已知的方法中所述。化学修饰(例如PEG化)的耐蛋白水解FGF21突变多肽组成的一个或多个非天然存在的高分子附接位点能产生分子那是既表现出理想的蛋白水解性和药代动力学和药效学性质。
2.B.包含非天然存在的聚合物附接位点的FGF21突变多肽
在本发明的各个方面，FGF21突变多肽披露。在另一个方面，本发明的FGF21突变多肽包括FGF21多肽到其中一个非天然存在的聚合物(例如聚乙二醇化)附接位点已被引入。在另一个方面，本发明FGF21突变多肽到其中一个非天然存在的聚合物(例如聚乙二醇)附接位点已被引入截断形式披露。FGF21包括非天然存在的高分子附接位点和一个或更多的保守或不保守的置换，这可能但不一定维持野生型FGF21的生物活性，形成本发明的另一个方面突变多肽。本发明的各FGF21多肽本突变可以被视为所述和准备在此提供参考。
在一个实施方案，本发明的FGF21多肽突变被修改通过引入非天然存在的高分子附接位点。事实上，在一个方面，这是本发明的FGF21突变体，即一个或多个非天然存在的高分子附接位点，使得半延长生命的聚合物可以连接到FGF21多肽引进目标突变体在理想的位置。选取典型的聚合物，但不一定，水溶性蛋白质，这样，它是连接不沉淀在水环境中，例如生理环境。聚合物在适当的范围也包括了聚合物的混合物。优选，为最终产品制备治疗应用，聚合物是药学上可接受的如合适的分子量聚乙二醇。非水溶性聚合物，如聚乙二醇脂肪酸嵌段共聚物，也可以结合到本发明的FGF21多肽并构成本发明的突变体。
在本发明的FGF21突变多肽活性可检测在多种方式，例如，在体外用例10中所描述的ELK-荧光素酶测定。
在本发明的FGF21突变多肽活性也进行评估，在体内实验中，如与OB/OB的，如例12所示小鼠。一般来说，评估一个或这些多肽更体内活性的多肽可以施用到实验动物腹腔。经过一个或多个所需的时间段，一个血液样本可以得出，并可以测量血糖水平。
正如本发明的所有FGF21突变多肽，这些多肽可以选择包括一个氨基-端蛋氨酸残基，可通过引入定点突变或细菌表达了一个过程的结果。
本发明的FGF21突变多肽可以编写如例7所示。熟悉分子生物学技术与标准的普通的技术人员，这些可以采用在知识，加上即时披露，制造和使用本发明的FGF21突变多肽。标准的技术可用于重组DNA，寡核苷酸合成，组织培养，和转换(例如电穿孔，脂质体)。例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，通过引入并入本文。酶反应和纯化技术可以执行根据制造商的规格，常用于本领域，或如本文所述。除非有具体的定义规定，在连接使用的术语，和实验室程序及，分析化学，有机合成化学，化学和医药技术，本文介绍的是那些众所周知的，而且通常在本领域中。标准技术可用于化工合成，化学分析，药物制剂，配方，交付，以及患者的治疗。
然后FGF21突变多肽制备，多肽可通过例9所述的化学修饰的聚合物附接。
3.包含非天然存在的聚合物附接位点的截断的FGF21突变多肽
本发明的一个实施方案是向截断的一种突变FGF21多肽形式包括一名或更多的非天然存在的高分子附接位点第这种截断突变多肽可以，但不一定是化学修饰。
本文所用术语″截断的FGF21突变多肽″是指一FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽，其中一个或更多的氨基酸残基本有被删除的氨基-端(或N-端年底)在FGF21多肽，一个或更多的氨基酸残基本有被删除从羧基-端(或C-端)的FGF21突变结束多肽或化学修饰FGF21多肽，或一个或多个氨基酸残基本有被从双方的N-端和C-端除去两端的FGF21突变多肽或化学修饰FGF21多肽。
N-端截断的突变FGF21活性和C-端截断的突变及突变FGF21分子FGF21截断的同时在N端和C-端两端的分子，以及化学修饰，这些突变体的形式，可以在各种不同的方式检测，比如，利用体外ELK-荧光素酶测定作为本文所述的例10。
该截断的突变FGF21多肽和化学修饰截断的本发明的突变FGF21多肽的活性，也可在体内评估法，如肥胖/转播，如例12所示。一般来说，评估一个或这些多肽更体内活性的多肽可以施用到实验动物腹腔。经过一个或多个所需的时间段，一个血液样本可以得出，并可以测量血糖水平。
如同所有的本发明的FGF21突变体，截断的突变FGF21和化学修饰截断的突变FGF21多肽可以选择性地包括一个氨基-端蛋氨酸残基，可通过引入定点突变或细菌表达的一个结果过程。
该本发明的截断的FGF21突变多肽可以编写如例7所示。熟悉分子生物学技术与标准的普通的技术人员，这些可以采用在知识，加上即时披露，制造和使用本发明的FGF21突变多肽。标准的技术可用于重组DNA，寡核苷酸合成，组织培养，和转换(例如电穿孔，脂质体)。例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，通过引入并入本文。酶反应和纯化技术可以执行根据制造商的规格，常用于本领域，或如本文所述。除非有具体的定义规定，在连接使用的术语，和实验室程序及，分析化学，有机合成化学，化学和医药技术，本文介绍的是那些众所周知的，而且通常在本领域中。标准技术可用于化工合成，化学分析，药物制剂，配方，交付，以及患者的治疗。
然后截断的突变FGF21多肽制备，多肽可通过例9所述的化学修饰的聚合物附接。
4.封端的和C-端FGF21突变多肽
在另一实施例中，本发明是针对突变FGF21多肽包括一名或更多的非天然存在的高分子附接位点已封由一个又一个或另外更残基到的C-端的端的在多肽，延长超出了野生型蛋白氨基酸序列。还有另一种实施方案，本发明是针对FGF21突变多肽组成一个或多个非天然存在的高分子附接的位点，包括一个或多个进一步的C-端突变体。这种封端的和C-端突变FGF21突变多肽可以，但不一定是化学修饰。
本文所用术语″封端的FGF21突变多肽″是指一FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变，其中一个或更多的氨基酸残基本有被添加到了FGF21突变多肽或C端的化学修饰FGF21多肽突变多肽。任何天然或非天然存在的氨基乙酸可用于第一个FGF21突变多肽，其中包括一个或更多的脯氨酸残基和一个或更多的甘氨酸残基尽管野生型FGF21序列只有181残基的长，一封端的FGF21突变多肽扩展了多肽一残每个基长度增加上限残基，与本公开的编号方案相一致，残基开始编号是182。因此，单一的脯氨酸残基盖表示为P182。更长的上限是可能的，因此被编号(例如X182，Y183，Z184，其中X，Y和Z是任何天然或非天然存在的氨基酸)。旋盖残基可以被添加到一个突变FGF21多肽使用任何方便的方法，如化学，其中一个氨基酸共价键连接被化学反应的C-端的多肽。另外，一个密码子编码一个覆盖残基可以被添加到FGF21编码序列突变多肽分子生物学技术的使用标准。多肽的突变FGF21所述之任何可封端的一个或多个残基，如果需要。
C-端突变体形成本发明的另一个方面。本文所用术语的″C-端突变″是指一个或更多的变化中的残基区有了91-181(或更长的时间，如果是封端的多肽)的一种突变FGF21多肽。C-端突变成FGF21突变多肽序列将推出除了一个或更多的突变体，介绍一个非天然存在的高分子附接位点。虽然C-端突变体，可在任何时候引入了对FGF21突变多肽序列91-181地区，用于C-端突变体的模范岗位的职位包括171，172，173，174，175，176，177，178，179，180和181。C-端突变体，可以使用标准的引入分子生物学技术，如在此所描述的。多肽的突变FGF21所述任何可以包含一个C-端的突变。
封端的和/或C-端突变体的位置和鉴定的例子列于表3：
表3
封端位置和/或C-端突变体的例子
E37C，R77C，P171G，P182
P171G，S181P，P182
P171G，S181P
P171G，S181T
P171G，S181G
P171G，S181A
P171G，S181L
P171G，A180P
P171G，A180G
P171G，A180S
P171G，Y179P
P171G，Y179G
P171G，Y179S
P171G，Y179A
P171G，L182
P171G，G182
P171G，P182
P171G，G182，G183
P171G，G182，G183，G184，G185，G186
封端的和/或C-端活性突变FGF21突变多肽的活性，以及化学修饰，这些突变体的形式，可以检测在多种方式，例如，使用体外ELK-荧光素酶测定描述例10。
封端的和/或C-端活性突变FGF21突变多肽的活性和化学修饰封端的和/或C-端突变FGF21突变多肽，本发明的体内实验，如肥胖，也可在评估/ob小鼠例12所示。一般来说，评估一个或这些多肽更体内活性的多肽可以施用到实验动物腹腔。经过一个或多个所需的时间段，一个血液样本可以得出，并可以测量血糖水平。
如同所有的本发明的FGF21突变体，封端的和/或C-端突变FGF21突变多肽和化学修饰封端的和/或C端突变FGF21突变多肽，可以选择性地包括一个氨基-端蛋氨酸残基，可引入定点突变或作为一个细菌表达的结果。
本发明的封端的和/或C-端突变FGF21突变多肽可以编写如例7所示。熟悉分子生物学技术与标准的普通的技术人员，这些可以采用在知识，加上即时披露，制造和使用本发明的FGF21突变多肽。标准的技术可用于重组DNA，寡核苷酸合成，组织培养，和转换(例如电穿孔，脂质体)。例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，通过引入并入本文。酶反应和纯化技术可以执行根据制造商的规格，常用于本领域，或如本文所述。除非有具体的定义规定，在连接使用的术语，和实验室程序及，分析化学，有机合成化学，化学和医药技术，本文介绍的是那些众所周知的，而且通常在本领域中。标准技术可用于化工合成，化学分析，药物制剂，配方，交付，以及患者的治疗。
然后封端的和/或C-端突变FGF21突变多肽肽制备，多肽可通过例9所述的化学修饰的聚合物附接。
5.不含天然存在的半胱氨酸残基的FGF21突变多肽
在本发明的另一个方面，FGF21突变多肽可以准备在其中两个半胱氨酸残基在野生型FGF21多肽序列与残基那是不形成二硫键，不作为聚合物取代附接位点，诸如，丙氨酸或丝氨酸。随后，替换，可在FGF21突变多肽序列，介绍了巯基含残基的(形式的非天然存在的高分子附接位点，例如半胱氨酸残基或非天然存在的氨基有巯基氨基酸)或自由氨基群体(例如赖氨酸或精氨酸残基或非天然存在的氨基酸具有自由氨基组)。自由氨基聚合物，用于附接，如聚乙二醇硫醇或依靠群体，然后可以有针对性地半胱氨酸，赖氨酸或精氨酸残基那已纳入FGF21突变多肽序列在已知位置介绍。这种策略可以更有效地促进和控制聚合物的位置。
在其中的一个方法，两个天然存在的半胱氨酸残基于该野生型FGF21多肽，这是在位置位于75和93，可以用非含巯基残基取代第随后，一个半胱氨酸残基可引入在一个已知位置。该FGF21突变多肽还可以包括其他突变体，它可以引入更聚合物附接位点(例如半胱氨酸残基)或可以被用来实现一些其他所需的性能。这种FGF21突变多肽的例子包括C75A/E91C/C93A/H125C/P171G和C75S/E91C/C93S/H125C/P171G。在这些例子中，天然存在的半胱氨酸在位置75和93本有被突变为丙氨酸或丝氨酸残基，聚合物附接位点引入本有91和125位上(在这个案例如聚乙二醇硫醇反应聚合物)和一个额外的突变位点已经取得了171，即171替代脯氨酸与甘氨酸残基。
像所有的FGF21突变多肽披露外，含有的半胱氨酸FGF21突变多肽的活性既不发现，在野生型FGF21多肽序列，而是采用聚合物组成一个附接位点和一个或多个额外的选择突变体，以及化学修饰，这些突变体的形式，可以在各种不同的方式检测，例如，使用体外ELK-荧光素酶测定中所描述的例10本。这些多肽体内活性，可在体内评估法，如与OB/OB的，如例12所示小鼠所述。
如同所有FGF21突变体，FGF21突变多肽含有既不是半胱氨酸活性的发现，在野生型FGF21多肽序列，而是采用聚合物组成一个附接位点和一个或更多的选择额外的突变体和化学修饰这些FGF21突变多肽形式可以选择包括一个氨基-端蛋氨酸残基，可通过引入定点突变或细菌表达了一个过程的结果。
FGF21含有既不是半胱氨酸突变多肽发现，在野生型FGF21多肽序列，而是采用聚合物组成一个附接位点，还可以多一个额外的突变体，可制备此处所述例如，在例或7。熟悉分子生物学技术与标准的普通的技术人员，这些可以采用在知识，加上即时披露，制造和使用这些FGF21突变多肽。标准的技术可用于重组DNA，寡核苷酸合成，组织培养，和转换(例如电穿孔，脂质体)。例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，通过引入并入本文。酶反应和纯化技术可以执行根据制造商的规格，常用于本领域，或如本文所述。除非有具体的定义规定，在连接使用的术语，和实验室程序及，分析化学，有机合成化学，化学和医药技术，本文介绍的是那些众所周知的，而且通常在本领域中。标准技术可用于化工合成，化学分析，药物制剂，配方，交付，以及患者的治疗。
然后FGF21突变多肽含有既不是半胱氨酸筹备工作的发现，在野生型FGF21多肽序列，而是采用聚合物组成一个附接位点和一个或多个额外的选择性突变体，可在多肽化学修饰由聚合物附接，如例9所述。
6.″系链分子″
在本发明的另一方面，可制备如本文所述″系链分子″。″系链分子″是一个由两个FGF21分子多肽拴在一起的接头分子。通过加入两个FGF21多肽一起来，有效半衰期和一系链分子的效力可以延长至半衰期和单一FGF21多肽效力。
本发明的一个系链分子包括一个接头和两个FGF21多肽，这可以有两种天然存在的FGF21多肽到这是任何突变体已经出台，二FGF21突变多肽有一个接头附接位点引入到FGF21多肽或有一天然存在的FGF21多肽和一个FGF21突变多肽结合。系链分子，包括至少一种FGF21多肽具有非天然存在的接头附接位点和一个或多个额外的突变体也在考虑，形成本发明的另一个方面。这种系链分子可以构成一个突变，从而构成了一个接头分子附接以及另一突变传递给另一个可取的性能系链分子的位点。
本文所用术语″接头附接位点″是指自然或非天然存在的氨基官能团酸具有与其中接头可以关联。举例，接头附接位点是残基含有巯基，它可以与PEG分子有关。
6.A.系链分子中的FGF21多肽
当一个系链分子由两个FGF21突变多肽中，FGF21突变多肽可以包括一个或更多的突变体进入序列出台，但突变体不一定要在同一氨基在FGF21突变多肽每个酸的地位。作为例子，如果一个系链分子由两个FGF21突变多肽，一FGF21突变多肽可能包含H125C突变，这可能形成一个接头分子附接一点。相反，其他FGF21突变多肽可以包含在一个位置比H125可作为一对圈养的两个FGF21突变多肽一起接头附接其他点突变。即使一个或两个FGF21突变多肽被录用，该接头可以在N端的FGF21突变多肽后附；介绍附接分不一定使用。
当一个系链分子包括一个或两个自然存在的FGF21多肽的接头可以在一个连接点在FGF21多肽是适合进行附接的化学反应。例如，天然存在的二硫键可以减少和半胱氨酸残基可以服务于诸如聚乙二醇接头，如附接分。在另一项实施方案，一个接头可以连接到一个赖氨酸侧链上的N-端或FGF21多肽。
对一个或一个系链分子的FGF21突变多肽都可以构成一个截断的FGF21突变多肽。正如本文所述，一截断的FGF21突变多肽可消除任何准备的残基数目在任的N-端的C-端或两者的N-和C-端。
系链分子还可以包括一个或两个FGF21多肽其中包括在多肽序列，可能不会优先考虑作为接头附接位点，而会传授一些其他可取的性能的系链分子突变。因此，系链分子组成的一个或多个FGF21突变多肽传授到其中一个基因突变的一个理想的性能系链分子形成了本发明的另一个方面。
该系链分子的活性可以在各种不同的方式检测，比如，利用体外ELK-荧光素酶测定作为本文所述的例10。
该系链本发明分子活性也进行评估，在体内实验中，如与OB/OB的，如例12所示小鼠。一般来说，评估一个或这些多肽更体内活性的多肽可以施用到实验动物腹腔。经过一个或多个所需的时间段，一个血液样本可以得出，并可以测量血糖水平。
如同所有的本发明的FGF21突变体，FGF21多肽那一个系链分子组成，它可以FGF21突变多肽，野生型FGF21多肽或两者的结合，可以选择性地包括一个氨基-端蛋氨酸残基，可引入定点突变或作为一个细菌表达的结果。
熟悉分子生物学技术与标准的普通的技术人员，这些可以采用在加上即时披露的知识，制作和使用的本发明的系链分子。标准的技术可用于重组DNA，寡核苷酸合成，组织培养，和转换(例如电穿孔，脂质体)。例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，通过引入并入本文。酶反应和纯化技术可以执行根据制造商的规格，常用于本领域，或如本文所述。为赞同FGF21多肽接头的进程将取决于对接头的性质，但已知的在本领域的。化学的接头附接所述的例子。指导如何本发明的系链可以形成分子提供在本例9。
除非有具体的定义规定，在连接使用的术语，和实验室程序及，分析化学，有机合成化学，化学和医药技术，本文介绍的是那些众所周知的，而且通常在本领域中。标准技术可用于化工合成，化学分析，药物制剂，配方，交付，以及患者的治疗。
6.B.系链分子中的接头
任何接头可用在系链分子中以将两个FGF21突变多肽系在一起。接头分子可分支或未分支，并且可使用多种已知的化学技术附接FGF21突变多肽，例如本文中所述的那些。接头的化学结构并不关键，因为其主要起到间隔的作用。接头可独立地和其他接头相同或不同，或接头可存在于系链分子(例如包含3个或更多FGF21突变或野生型多肽的系链分子)。在一个实施方案中，接头可由通过肽链连接在一起的氨基酸组成。这些氨基酸中的一些可糖基化，这是本领域容易理解的。例如构成唾液酸化位点的有用接头序列是X1X2NX4X5G(SEQ ID NO：5)，其中X1，X2，X4和X5各自独立地是任何氨基酸残基。在其他实施方案中，接头分子可以是任何尺寸的PEG分子，例如20kDa，30kDa或40kDa。
在其中存在肽基接头(即，由通过肽键连接在一起的氨基酸组成)的实施方案中，其长度优选为1至约40氨基酸残基，更优选1至约20氨基酸残基，最优选1至约10氨基酸残基组成。在一个实施方案中，接头中的氨基酸残基选自20种标准氨基酸中的任一者。在另外的实施方案中，接头中的氨基酸残基选自半胱氨酸，甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺和/或丝氨酸。在又一实施方案中，肽基接头由大部分氨基酸构成，其是空间位阻的，例如通过肽键连接的甘氨酸，丝氨酸和丙氨酸。如果存在，通常期望，选择肽基接头以避免体内循环中的快速蛋白水解转换。因此优选肽基接头包括聚甘氨酸，特别是(Gly)4(SEQ IDNO：6)；(Gly)5(SEQ ID NO：7)；聚(Gly-Ala)；和聚丙氨酸。其他优选肽基接头包括GGGGS(SEQ ID NO：8)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：9)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：10)和本文提供的实施例中使用的任何接头。然而，本文中所述的接头是示例性的，本发明范围内的接头可以更长，并且可包括其他残基。
在系链分子包含肽接头部分的实施方案中，酸性残基例如谷氨酸或天冬氨酸残基置于接头部分的氨基酸序列中。例子包括下列肽接头序列。
GGEGGG(SEQ ID NO：11)；
GGEEEGGG(SEQ ID NO：12)；
GEEEG(SEQ ID NO：13)；
GEEE(SEQ ID NO：14)；
GGDGGG(SEQ ID NO：15)；
GGDDDGG(SEQ ID NO：16)；
GDDDG(SEQ ID NO：17)；
GDDD(SEQ ID NO：18)；
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(SEQ ID NO：19)；
WEWEW(SEQ ID NO：20)；
FEFEF(SEQ ID NO：21)；
EEEWWW(SEQ ID NO：22)；
EEEFFF(SEQ ID NO：23)；
WWEEEWW(SEQ ID NO：24)；或
FFEEEFF(SEQ ID NO：25)。
在其他实施方案中，肽基接头构成磷酸化位点，例如X1X2YX3X4G(SEQ ID NO：26)，其中X1，X2，X3和X4各自独立地是任何氨基酸残基；X1X2SX3X4G(SEQ ID NO：27)，其中X1，X2，X3和X4各自独立地是任何氨基酸残基；或X1X2TX3X4G(SEQ ID NO：28)，其中X1，X2，X3和X4各自独立地是任何氨基酸残基。
非肽接头也可用在系链分子中。例如，可以使用烷基接头例如-NH-(CH2)s-C(O)-。其中s＝2至20。这些烷基接头可进一步被任何空间位阻基团所取代，例如低级烷基(例如C1-C6)低级酰基、卤素(例如Cl，Br)，CN，NH2、苯基等。
任何合适的接头可用在本发明中以形成系链分子。在一个例子中，用于制备本文中所述的系链分子的接头是同型双官能双-马来酰亚胺PEG分子，其具有下列通式：
X-(CH2CH2O)nCH2CH2-X
其中X是马来酰亚胺基团。在其他实施方案中，X可以是邻吡啶基-二硫化物、碘乙酰胺、乙烯基砜或本领域中已知的对于巯基具有特异性的任何其他反应性部分。在又一实施方案中，X可以是氨基-特异性反应部分，其用于将两个突变多肽通过N-端或工程化赖氨酰基而系在一起。(例如参见Pasut and Veronese，2006，“PEGylation of ProteinsasTailored Chemistry for Optimized Bioconjugates，”Adv.Polym.Sci.192：95-134)。
在又一实施方案中，接头可具有下列通式结构：
X-(CH2CH2O)nCH2CH2-Y
其中X和Y是选自上面的不同的反应部分。这种接头将允许不同突变多肽缀合以产生系链的杂二聚物或杂低聚物。
在进一步实施方案中，接头可以是聚乙二醇分子，它可以有1分子量为100kDa的，优选是10至50kDa的(例如10，20，30或40kDa)和20kDa的更优选。肽接头可以进行修改，以形成上述相同的方式衍生物。
有用接头的其他例子包括氨基乙氧基乙氧基-乙酰基接头，其公开在国际公开No.WO 2006/042151中，通过引入全部并入本文。
当形成本发明的系链分子，可以采用标准的化学关联一个接头与野生型或突变FGF21分子。该协会精确的方法将取决于附接位点(例如氨基酸侧链)和接头的性质。当一个接头是一种聚乙二醇分子，附接可以通过采用标准化学和游离巯基或胺基，例如那些在半胱氨酸残基的(可到FGF21多肽序列的突变或介绍可以发现是天然存在的)的赖氨酸或(可到的突变或FGF21多肽序列的介绍可以天然存在的)或的N-端氨基。
7.FGF21突变体的化学修饰
在本发明的一方面，FGF21突变多肽的化学修饰。术语“化学修饰”是指多肽(例如FGF21突变多肽)已经由一个或一个以上的多肽聚合物的位点除了修改。对化学修饰的FGF21突变多肽形式的例子包括聚乙二醇化和FGF21突变多肽糖基化形式。
本发明的化学修饰FGF21突变多肽可以包含任何类型包括水溶性高分子聚合物，例如聚乙二醇。每个示范聚合物可以是任何分子量和可分支或不分枝。每个典型的聚合物之间有一个约2kDa至约100kDa的平均相对分子质量(术语“关于”，表示在一个水溶性聚合物的准备，有些分子的意志重量比说一些分子量越来越少)。平均每聚合物分子量优选是与约5kDa及约50kDa的，更优选之间约10kDa及约40kDa的，最间约10kDa及约20kDa的优选。
合适的水溶性聚合物或混合物包括但不限于，碳水化合物，聚乙二醇(PEG)的(含PEG的形式，已被用于衍生蛋白，包括单(C1至C10的)，烷氧基-，或芳氧基-聚乙二醇)，单甲氧基-聚乙二醇，右旋糖酐(例如低，分子量右旋糖酐例如，约6kD)，纤维素，糖或其他基础聚合物，聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。本发明还包含有双功能交联分子那是可以被用来编写共价连接FGF21多肽突变多聚体。另外，本发明所涵盖的FGF21突变体共价连接到聚唾液酸。
在本发明的一些实施方案，FGF21突变多肽共价，修改为包括一个或更多的水溶性聚合物，包括但不限于，聚乙二醇(聚乙二醇)，聚氧乙烯乙二醇，或聚丙二醇。见，例如美国专利号4640835，4496689，4301144，4670417，4791192和4179337。在本发明的一些实施方案，FGF21突变体包括一个或更多的聚合物，包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇，右旋糖酐，纤维素，另一碳水化合物为基础的聚合物，聚-(N-乙烯吡咯烷酮-聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，或这些聚合物的混合物。
7.A.PEG化FGF21突变多肽
在本发明的一些实施方案中，FGF21突变多肽共价与聚乙二醇亚基修改。在一些实施例中，一个或更多的水溶性聚合物是在一个保税仓或更具体的(例如，在N-端)的FGF21突变。在一些实施例中，一个或更多的水溶性聚合物都附着在一个FGF21的突变体或更多的侧链，这些侧链可以天然存在的或可形成工程聚合物附接位点的组成部分。在一些实施例中，PEG是用来提高一个FGF21突变多肽治疗的能力。某些这样的方法进行了讨论，例如，在美国专利号6133426，这是由现为任何目的纳入参考。
在本发明的实施方案中，其中的聚合物是聚乙二醇，聚乙二醇组可以是任何方便的分子量，并可以是线性或分枝。平均相对分子质量的聚乙二醇集团将优选分子量范围从约2至约100kDa的，更约5kDa，优选是约50kDa的，例如10，20，30，40，或50kDa。聚乙二醇组一般会附着在FGF21突变通过酰化或还原烷基化反应，通过一组聚乙二醇部分(例如醛，NHS，或马来酰亚胺，乙烯基砜，烷基卤化物)到反应组的FGF21突变(例如氨基或巯基)。
当聚合物连接到FGF21突变多肽是聚乙二醇，对本发明的FGF21突变多肽聚乙二醇化，可以专门进行使用的聚乙二醇化反应中的任何本领域已知的。这种反应是描述在以下引用，例如：Zalipsky，1995年，功能化聚乙二醇(PEG)为生物相关结合物，Zalipsky，1995，Functionalized Poly(ethylene glycol)for Preparation of Biologically RelevantConjugates，Bioconjugate Chemistry 6：150-165；Francis et al.，1992，Focus onGrowth Factors 3：4-10，欧洲专利号：0 154 316 0 401 384和美国专利号4179337。例如，当目标残基是赖氨酸残基(即有活性胺基残基)，聚乙二醇化，可通过酰化反应进行了或一个带有氨基反应聚乙二醇分子烷基化反应(或类似的反应水溶性聚合物)作为所述。对于酰化反应，选定的聚合物中可以反应酯基反应。对于还原烷基化，选定的聚合物中可以有一个醛基反应。反应性醛是例如聚乙二醇丙醛，这是水稳定的或单C1-C10的烷氧基或芳氧基衍生物(见美国专利号5252714)。各种不同的氨基聚乙二醇反应的特定基团的聚合物将激活也知道，在普通技术的采用，也可根据情况决定。
在另一个例子中，当目标残基是一个半胱氨酸残基(即一个具有活性巯基残基)，聚乙二醇化可以通过标准进行马来酰亚胺化学了。这种反应，所选聚合物可以包含一个或更多的反应马来酰亚胺团体或其他活性成分例如乙烯基砜硫醇，邻吡啶基-二硫化碳或碘乙酰胺。见，例如Pasut & Veronese，2006，“PEGylation of Proteins as TailoredChemistry for Optimized Bioconjugates，”Adv.Polym.Sci.192：95-134；Zalipsky，1995，“Functionalized Poly(ethylene glycol)for Preparation of BiologicallyRelevant Conjugates，”Bioconjugate Chemistry 6：150-165，and Hermanson，Bioconjugate Techniques，2nd Ed.，Academic Press，2008，这是通过引入并入本文。
在本发明的一些实施方案中，为集团的聚乙二醇附接至FGF21突变有用的战略需要经过共轭在溶液中形成联动相结合，FGF21突变体和PEG部分，每个基团的特殊功能是相互对等反应。FGF21突变为“预激活”的一组适当的功能在特定的位点。前体的纯化和充分的特点，与之前的PEG部分反应。该突变体与聚乙二醇FGF21结扎通常发生在水相的地方，可以很容易地用SDS-PAGE或反相高效液相色谱法分析监测。详细分析可以做到的LC-MS的肽图谱。详细分析可以做到的LC-MS的肽图谱。
7.B.多糖FGF21突变多肽
多糖聚合物是另一种类型的水溶性聚合物，可用于蛋白质修饰使用。因此，本发明的FGF21突变多肽可以附加到一个多糖聚合物，使之成为本发明实施例。于是，一个精心设计的非天然存在的高分子附接位在FGF21突变多肽点可以构成一个残基决定将一个多糖附后。右旋糖酐是多糖的阿尔法1-6主要由葡萄糖个体之间的联系与亚基组成的聚合物。该右旋糖酐本身是许多分子量范围内工作，并随时可从约1kD的分子重量，以约70kD的。右旋糖酐是一个合适的水溶性赋形剂作为一个单独或结合使用聚合物其他赋形剂(例如Fc)。见，例如国际公开No.WO 96/11953。共轭对治疗或诊断免疫球蛋白右旋糖酐使用的报告。见，例如欧洲专利申请公布号0 315 456，这是此纳入参考。本发明还包含了对约1kDa的右旋糖酐使用约20kDa。
7.C.FGF21突变多肽的化学修饰的方法
一般来说，化学改性(例如聚乙二醇化或糖基化)，可用于下一个激活的反应，聚合物分子的蛋白质任何合适的条件下进行。编制化学修饰FGF21突变多肽的方法将一般包括以下步骤：(一)反应与聚合物分子多肽激活的条件下，使FGF21(例如一种反应酯，马来酰亚胺或醛的聚合物分子的衍生物)突变多肽成为连接到一个或更多的聚合物分子和(b)获得的反应产物。最佳反应条件将根据已知参数和预期的效果。例如，较大的聚合物分子效率中的蛋白质，附着在聚合物分子较大的比例。在一本发明实施例，化学修饰FGF21突变多肽可以在一个单一的聚合物分子氨基-端，而在其他的化身FGF21突变多肽可以与主序列相关的两个或更多的聚合物，例如一种聚合物在的N-端的多肽，以及在另一多肽残基第二位。或者，FGF21能有相关的突变体的主要序列在两个不同的残基，但不上的N-端两个或更多的聚合物。
一般来说，可以减轻或由目前的化学修饰条件下施用FGF21突变多肽包括那些描述了本文FGF21多肽。然而，化学修饰FGF21突变披露者外可以有额外的活性多肽，例如增加半衰期，比野生型FGF21和FGF21突变体。
8.FGF21突变体的治疗性组合物及其施用
治疗性组合物，包括FGF21突变多肽在本发明的范围，并特别考虑在对系链分子标志灯，FGF21突变多肽和化学修饰FGF21突变多肽的展览强化属性。这种系链分子，FGF21突变多肽和化学修饰FGF21突变多肽治疗性组合物，可以包括在一个系链分子治疗有效量，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽，可化学修饰，与药学或生理学上可接受的制定剂混合选择与行政模式的适用性。
可接受的制剂材料优选在使用的最大剂量和浓度时对于接受者是非毒性的。
药物组合物可以包含修改配方的材料，维护，或保留，例如，pH值，渗透压，粘度，清晰度，色彩，等张，气味，不育，稳定性，溶出度或释放率，吸附，渗透的成分或。制定合适的材料包括但不限于，氨基酸(例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸)，抗生素，抗氧化剂(例如抗坏血酸，亚硫酸钠，或氢钠，亚硫酸)，缓冲区(例如硼砂，碳酸氢盐，Tris-HCl，柠檬酸，磷酸盐，或其他有机酸)，膨化剂(例如甘露醇或甘氨酸)，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))，配位剂(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，-环糊精，或羟基丙基--环糊精)，填料，单糖，双糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖，或糊精)，蛋白质(例如牛血清白蛋白，白蛋白，或免疫球蛋白)，色素，调味和稀释剂，乳化剂，亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，盐形成抗衡(例如钠)，防腐剂(例如苯扎氯铵，苯甲酸，水杨酸，硫柳汞，苯乙醇，甲基苯甲酸酯，尼泊金丙酯，洗必泰，山梨酸，或过氧化氢)，溶剂(例如甘油，丙二醇，或聚乙二醇)，糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)，悬浮，表面活性剂或润湿剂(例如pluronics；聚乙二醇，山梨醇酯；聚山梨酯例如吐温20或吐温80；仓鼠；氨丁三醇，卵磷脂，胆固醇或tyloxapal)，稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)，强壮促进剂(例如碱金属卤化物-优选钠或氯化钾-甘露醇或山梨糖醇)，赋形剂，稀释剂，辅料和/或药物佐剂(见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(18th Ed.，A.R.Gennaro，ed.，Mack PublishingCompany 1990)，以及后续版本同样，通过引入并入本文为任何目的)。
最佳药物组合物将由取决于熟练的技术人员，例如，预定的路线格式和所需的剂量(见，例如Remington′s Pharmaceutical Science)。这些成分可以影响体内的系链分子关，身体状况，稳定性，在体内释放，系链分子，FGF21突变多肽(可以被截断，封端的或的C-端突变)或化学修饰FGF21突变多肽。
主要赋形剂或载体在药物组合物可以是水或非水溶液的性质。例如，一个合适的赋形剂或载体注射可以是水，生理盐水，或人工脑脊液，可能与施用在肠外补充的其他材料共同组成。中性缓冲盐水或盐水混合血清白蛋白进一步模范赋形剂其他模范药物组合物包括pH值约7.0-8.5的TRIS，或pH值约4.0-5.5，可以进一步包括山梨糖醇或合适的替代醋酸缓冲缓冲区。在本发明，系链分子，体现FGF21突变多肽和化学修饰FGF21突变多肽组成可用于存储编写的混合选定的组成具有纯洁的希望与可选的制剂(Remington′sPharmaceutical Sciences，上文)学位一个蛋糕冻干形式或水溶液。此外，系链分子，FGF21突变多肽和化学修饰FGF21突变多肽产品可以归结为一个使用适当的辅料例如蔗糖冻干物。
药物组合物可肠外交付选定了本发明。另外，可以选择成分吸入或交付通过消化道，例如口服。这种药学上可接受的范围内组成的准备是最先进的技术。
制定组件是向施用位点可以接受的浓度。例如，缓冲区是用来维持在生理pH或组成稍微较低的pH值，通常在从约5至约8pH值范围内。
当正考虑肠外施用，在治疗性组合在使用这项发明物可以在一个无热原，肠外可以接受的，水组成一个所需的系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽溶液的形式药学上可接受的赋形剂。静脉注射一种特别适合赋形剂是无菌的蒸馏水中，一个系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽是无菌的，等渗溶液妥善保存，制定。还有一种制剂能涉及到与药剂制订所需的分子，例如注射微球，生物侵蚀的颗粒，聚合物化合物(例如聚乳酸或聚羟基酸)，珠，或脂质体，这对控制或提供持续释放产品交付然后可以通过注射剂。玻尿酸也可以使用，这可以有促进血液循环的效果持续时间。对于所需的分子引入其他适当的方式包括埋植式给药装置。
在一个实施方案中，药物组合物可吸入制定。例如，系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽可归结为吸入干粉。这种吸入解决方案还可以制定一个对气溶胶给药推进剂。在又一实施方案中，解决方案可雾化。肺施用中进一步说明国际公开No.WO94/20069，它描述了化学修饰的蛋白质肺部给药。
这也是考虑某些配方可以口服。在本发明，系链分子体现FGF21突变多肽(可以被截断，封端的或的C-端突变)或化学修饰FGF21突变多肽就是以这种方式施用可与或制定没有这些载体惯用的在固体剂型例如片剂和胶囊复合。例如，可以设计一个胶囊释放在胃肠道内的活性部分的制定在点时生物利用度最大化和预系统退化减至最低。其他药剂可以包含以方便系链分子，FGF21突变多肽(可以被截断，封端的或的C-端突变)的吸收或化学修饰FGF21突变多肽。稀释液，调味料，低熔点蜡，植物油，润滑油，悬浮剂，片剂崩解剂，粘合剂，也可使用。
另一种药物组合物可以包括一个系链分子治疗有效量在混合物，具有无毒赋形剂是合适的FGF21突变多肽(可以被截断，封端的或的C-端突变)或化学修饰FGF21突变多肽为片剂生产。在无菌水溶解的药片，或其他适当的赋形剂，解决方案，可制备单位剂量形式。合适的辅料包括但不限于惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠或碳酸氢钠，乳糖，或磷酸钙；或结合剂，例如淀粉，凝胶，或阿拉伯胶；或润滑剂例如硬脂酸镁，硬脂酸酸，或滑石粉。
附加系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽药物组合物的意愿是显而易见的那些在本领域技术人员，其中包括涉及系链分子配方，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽在缓释或受控交货配方。技术负责制定其他缓释或控制，运载工具例如脂质体载体，品种，生物侵蚀或多孔微球珠厂打针，那些在本领域已知的(见，例如国际公开No.WO 93/15722，它描述了多孔聚合物微球为药物组合物的交付控制释放)。
缓释制剂的其他例子包括在状物品，例如电影，或半透聚合物微胶囊形成矩阵。缓释矩阵可以包括聚酯，水凝胶，聚乳酸(美国专利号3773919，欧洲专利号0 058 481)，对L-谷氨酸和乙基-L的共聚物-谷氨酸(idman et al.，1983，Biopolymers 22：547-56)，poly(2-羟基ethyl-methacrylate)(Langer et al.，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277and Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)，ethylene vinyl acetate(Langer et al.，上文)，乙烯醋酸乙烯酯(兰格等人，上文)或聚维(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利号为0 133 988)。缓释成分还可以包括脂质体，可以通过在已知的几种方法中的任何本领域准备。见，例如Epstein et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-92；和欧洲专利号0 036676，0 088 046和0 143 949。
系链分子FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽药物组合物用于在体内的施用通常必须是无菌的。这可以通过过滤，通过无菌膜过滤。组成冻干，灭菌使用这种方法可以进行或之前，或以下，冷冻干燥和重建。施用组成的肠外可以存储在一个解决方案的形式或冻干。此外，静脉成分一般都放置在有无菌接入端口，例如，输液袋或有塞小瓶由皮下注射针头可刺穿容器。
一旦药物组合物已研制完，它可以存储在无菌瓶作为解决方案，暂停，凝胶，乳液，固体，冻干粉或脱水。这种提法可以存储在表准备好使用的形式或要求重组之前，施用(例如冻干)。
在一个具体实施方案，本发明是针对试剂盒生产单剂量施用单位。该套件可以分别同时包含集装箱有干蛋白和第二个集装箱有水配方。也包括在本发明的范围包含单和多腔预填充注射器(例如液体的注射器和冻干)。
一个系链分子治疗有效量，FGF21突变多肽(可以被截断，封端的或的C-端突变)或化学修饰FGF21突变多肽药物组合物被聘用治疗作用，将取决于，例如在治疗方面，和目标。本领域技术人员都明白，适当的治疗剂量水平将因此有所不同取决于后交付分子部分，指示为其系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽正在使用，路线施用和大小(体重，体表，或器官大小)和条件的病人(年龄和一般健康)。因此，临床医生可以滴度剂量及给药途径修改，以获取最佳的治疗效果。一个典型的剂量范围可以从约0.1克/公斤多达约100毫克/公斤或更多，基于上述因素而定。在其他实施方案中，剂量范围从0.01毫克/公斤高达约10毫克/公斤，例如0.05毫克/公斤，0.1毫克/公斤，0.2毫克/公斤，0.3毫克/公斤，0.4毫克/公斤，0.5毫克/公斤，0.6毫克/公斤，0.7毫克/公斤，0.8毫克/公斤，0.9毫克/公斤，1.0毫克/公斤，2毫克/公斤，3毫克/公斤，4毫克/公斤，5毫克/公斤，6毫克/公斤，7毫克/公斤，8毫克/公斤，9毫克/公斤或10毫克/公斤。
用药频率将取决于该系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变在制定多肽所使用的药代动力学参数。通常，医生会施用的组成，直到达成的剂量是达到了预期的效果。因此，可以组成以单一剂量，剂量为两个或更多(可能或可能不包含所需的分子相同金额)随着时间的推移持续输注或作为，或通过导管植入装置。适当剂量的进一步完善并例行通过在普通技术的人士，在他们日常的任务是执行的范围。确定适当的剂量可以通过适当的剂量反应数据。
该药物组合物的给药途径是与已知的方法例如口头协议，通过静脉注射，腹腔内，脑(实质内)，脑室，肌肉注射，人工，动脉，门静脉，或病灶内航线；通过缓释系统；或通过植入装置。如果需要，组合物可通过施用不断注射输液或注射植入装置。
可选择地或另外地，该成分可通过本文施用的一种膜，海绵植入术，或其他适当材料上所需要的分子被吸收或封装。凡植入设备被使用，该设备可以被植入任何合适的组织或器官，并提供所需的分子可以通过扩散，定时释放丸，或连续给药。
10.FGF21多肽突变体的治疗用途
系链分子，FGF21突变多肽(可以被截断，封端的或的C-端突变)和化学修饰本发明的FGF21突变多肽可用于治疗，诊断，改善，或防止疾病，疾病的人数，或条件，包括但不限于代谢紊乱在一个实施方案中的代谢紊乱是糖尿病来对待。在另外的实施方案中，是肥胖症的代谢紊乱。其他条件或实施例包括代谢紊乱例如脂质代谢障碍；高血压；肝脂肪变，例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，心血管疾病，例如动脉粥样硬化和老化。
在应用上，障碍或条件例如糖尿病或肥胖症治疗可以施用系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽如本文所述的病人需要在一个治疗有效剂量款额。施用可以进行描述，例如通过静脉注射，腹腔注射，肌肉注射或在平板或液体形成口头形式，责任。在大多数情况下，所需的剂量可以由如本文所述医生，可以代表了系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽有效治疗剂量。这将是显而易见的现有技术，系链分子治疗有效剂量，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽将取决于特别吁请施用当局的时间表，单位剂量的抗原施用，是否核酸分子或多肽施用是与其他治疗药物，免疫状态和收件人的健康组合。术语“有效治疗剂量，”在该条款，意味着系链分子数量，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21能够引起突变多肽的生物或医药在一个组织系统的反应，动物或人类的研究人员所追求的，医生，或其他临床医生，其中包括一种疾病或疾病的症状减轻正在接受治疗。
11.抗体
抗体和抗体片段特异性结合的系链分子，FGF21突变多肽和化学修饰本发明的FGF21突变多肽，但没有具体结合到野生型FGF21多肽是考虑并在本发明的范围。该抗体可多克隆，包括单特异性多克隆，单克隆(单抗)，重组；嵌合，人性化，例如互补性，决定区(CDR)的嫁接，人，单链和/或双功能；以及碎片；变异；或其化学修饰分子。抗体片段包括抗体的那部分特异性结合上FGF21突变多肽表位。这些碎片的例子包括晶圆和F(ab′)片段通过全长抗体酶裂解产生。其他具有约束力的片段包括重组DNA技术产生的，例如含有核酸序列的编码抗体可变区基因重组质粒的表达。
走向系链分子定向多克隆抗体，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变一般都产自动物的皮下或多重的FGF21突变多肽与佐剂腹腔注射方式(例如家兔或小鼠)多肽。它可以是有益的共轭FGF21突变多肽为载体蛋白，免疫原性，在接受免疫接种的种类，例如钥匙孔血蓝蛋白，血清，白蛋白，牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂。此外，聚合剂例如明矾用于增强免疫反应。免疫后的动物血清，是流血，反系测定链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽抗体滴度。
对系链分子的单克隆抗体导向，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽能利用任何方法，对于生产的抗体分子在文化的不断提供了细胞株。合适的方法制备单克隆抗体的例子包括Kohler et al.，1975，Nature 256：495-97 and the human B-cell hybridomamethod(Kozbor，1984，J.Immunol.133：3001；Brodeur et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications 51-63(Marcel Dekker，Inc.，1987)。此外本发明提供的杂交瘤细胞株单克隆抗体的产生与系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽反应。
本发明的反FGF21突变抗体可施用于任何已知的含量测定方法，例如竞争结合实验，直接和间接夹心检测和免疫检测(见，例如Sola，Monoclonal Antibodies：A Manual ofTechniques 147-158(CRC Press，Inc.，1987)，通过引入全部并入本文的检测和定量的FGF21突变多肽)。这些抗体会结合FGF21突变与亲和力这是为了检测方法被采用适当的多肽。
为了诊断应用，在某些实施方案中，抗-系链分子、FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽抗体可标记可检测的部分。所述可检测的部分可是能够产生(直接或间接)可检测的信号的任何一种。例如，可检测的部分可以是放射性同位素，例如3H，14C，32P，35S，125I，99Tc，111In，或67Ga；荧光素或化学发光化合物例如异硫氰酸荧光素，若丹明，或萤虫素；或酶例如碱性磷酸酯酶、-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶(Bayer et al.，1990，Meth.Enz.184：138-63)。
竞争结合实验依赖于标签标准的能力(例如FGF21突变多肽，或免疫反应的一个部分除外)的竞争与测试样品的分析物(例如一个系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽)的与反系有限链分子结合，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽抗体，这取决于分析物。该系链分子数量，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变试验样品中的多肽是成反比的标准成为必然的抗体数量。为了便于确定标准量成为束缚，通常是不溶性的抗体之前或之后的比赛，这样的标准和分析物绑定到抗体可以方便地从标准和分析物仍然未分离。
夹心检测通常涉及两种抗体，每一个不同的免疫结合部分，或表面抗原的蛋白质，能够用来检测和/或定量分析。在夹心法，测试样品中分析通常是受第一抗体，是固定在一个坚实的支持物，并在此后的第二抗体结合的分析物，从而形成不溶性的三部分组成复杂。见，例如美国专利号4376110。第二抗体本身也可以是一个标有检出成分(直接夹心分析)可以测量或使用抗免疫球蛋白抗体，是一种可检测的基团(间接夹心分析)标签。例如，一类是夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)，在这种情况下，检出成分是一种酶。
反系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰本发明的FGF21突变多肽的抗体，也有用在体内成像。检测成分与标签管理的抗体可以对动物，优选到血液里，以及是否存在和在主机的位置标记抗体检测。该抗体可与任何成分的标记在动物检测是否核磁共振，放射科，或其他检测手段是本领域已知的。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含系链分子，FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽抗体和用于检测系链分子的其他试剂，生物样品中FGF21突变多肽或化学修饰FGF21突变多肽水平。这些试剂可包括可检测的标记，阻断血清，阳性和阴性对照样品和检测试剂。
实施例
下述的实施例说明本发明的具体实施方案及其各种用途。它们仅是为了说明的目的给出的，不应该被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
制备FGF21多肽表达构建体
使用具有对应于成熟FGF21序列的5′和3′端的核苷酸序列的引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到编码成熟FGF21多肽的核酸序列。表4列出用于扩增成熟FGF21序列的引物。
表4
用于制备FGF21构建体的PCR引物
用于制备FGF21表达构建体的引物并入了限制性核酸内切酶位点，用于将所述序列定向克隆到合适的表达载体(例如，pET30(Novagen/EMD Biosciences；San Diego，CA)或pAMG33(Amgen；Thousand Oaks，CA))当中。表达载体pAMG33含有低拷贝数R-100复制源、修饰的lac启动子和卡那霉素抗性基因。表达载体pET30含有源自pBR322的复制源、可诱导的T7启动子和卡那霉素抗性基因。虽然发现来自pAMG33的表达较高，但发现pET30是更可靠的克隆载体。因此，首先在pET30中生成本申请中所述的大多数构建体，然后进行疗效筛选。然后将选定的序列转移至pAMG33供进一步扩增。
在反应混合物中扩增FGF21序列，所述反应混合物含40.65ìLdH2O、5ìL PfuUltraII反应缓冲液(10x)、1.25ìL dNTP混合物(40mM-4x 10mM)、0.1ìL模板(100ng/mL)、1ìL引物1(10ìM)、1ìL引物2(10ìM)和1ìL PfuUltra II融合HS DNA聚合酶(Stratagene；La Jolla，CA)。扩增反应进行的方式是，对于每千碱基所需产物，在95℃下加热两分钟；然后是95℃下20秒的十个循环，60℃下20秒(每个循环中另减去1℃)，以及72℃下15秒；接着是，对于每千碱基所需产物，在94℃下20秒的20个循环，55℃下20秒，以及72℃下15秒；接着是72℃下三分钟。扩增产物用限制性核酸内切酶NdeI和EcoRI消化；连接到合适的载体当中；然后转化到感受态细胞当中。
作为所使用的细菌表达系统的结果，所表达的成熟FGF21多肽包括N-端蛋氨酸残基或变体蛋氨酸残基，如fMet或葡萄糖基化Met。
实施例2
从细菌中纯化野生型FGF21多肽
在下述的实施例中，在细菌表达系统中表达野生型FGF21多肽。在如下所述的表达之后，除另指出外，如本实施例中所述纯化野生型FGF21多肽。
为了从细菌内含体中纯化野生型FGF21多肽，将加倍冲洗的内含体(DWIB)溶解在增溶缓冲液中，所述增溶缓冲液在pH值8.5的Tris缓冲液中含有盐酸胍和DTT，然后在室温下混合一个小时，把增溶混合物加到复性缓冲液中，所述复性缓冲液含有尿素、精氨酸、半胱氨酸和胱胺盐酸盐，pH值为9.5，然后在5℃混合24小时(参见例如，Clarke，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9：157-63；Mannall等人，2007，Biotechnol.Bioeng.97：1523-34；Rudolph等人，1997，″Folding proteins，″in Protein Function：A Practical Approach(Creighton，ed.，New York，IRL Press)，pp 57-99；和Ishibashi等人，2005，ProteinExpr.Purif.42：1-6)。
增溶及复性化之后，通过0.45微米过滤器来过滤混合物。然后用10kD分子量截止Pall Omega盒，在20psi的跨膜压力(TMP)下将复性池浓缩大约10倍，在20psi的TMP下，用3柱体积的20mM Tris(pH值8.0)渗滤。
然后使澄清的样本经阴离子交换(AEX)色谱法，使用Q琼脂糖HP树脂。20mM Tris中的0至250mM NaCl线性盐梯度液在pH值8.0和5℃下试验。通过SDS-PAGE分析峰值级分并汇集。
然后使AEX洗脱池经疏水相互作用色谱法(HIC)，使用苯基琼脂糖HP树脂。使用pH值8.0的0.7M至0M的硫酸铵递减线性梯度液，在环境温度下洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE分析峰值级分(Laemmli，1970，Nature 227：680-85)并汇集。
用10kD分子量截止Pall Omega0.2m2盒，在20psi的MP下将HIC池浓缩到7mg/mL。在20psi的TMP下，用5体积的10mMKPO4、5％山梨醇(pH值8.0)对浓缩物进行渗滤，将回收的浓缩物稀释至5mg/mL。最后，通过Pall mini-Kleenpac 0.2μM Posidyne膜过滤溶液。
实施例3
FGF21突变体识别
野生型FGF21具有相对较短的半衰期，在某些情况下，这对于将野生型FGF21用作治疗剂来说是不理想的。另外，延长半衰期的传统方法(如多肽的聚乙二醇化)受限于FGF21序列中合适的聚乙二醇化位点的数目及位置。在野生型FGF21多肽序列中有七个天然的聚乙二醇化位点(即á氨基)、四个赖氨酸残基和两个半胱氨酸残基。这些位点对于聚乙二醇化来说是不理想的，因为PEG分子能不利地影响FGF21取得其自然结构的能力，或者它可能会不利地影响FGF21与其受体或-klotho之间的相互作用。此外，除了á氨基是例外，这些反应性残基不容许在单靶向位置处的位点特异性聚乙二醇化。因此进行了有针对性的重点研究，用以识别在野生型FGF21多肽内能突变为适合化学修饰的残基的残基。在研究中考虑的包括有残基在FGF21序列中的位置以及其在蛋白质表面上的位置。
为了识别野生型FGF21多肽中适合突变为适用于本文中所述的化学修饰的个别残基，采用两种不同的策略。
实施例3.A
使用同源模型识别的突变候选物
在第一种策略中，在系统化合理的蛋白质工程方法中使用同源模型来识别表面暴露侧链的可能性很大的残基，其有可能容许聚乙二醇化而不干扰FGF21活性。由于没有公布FGF21的X射线或NMR结构可以用来识别这种残基，使用得自蛋白质数据库(PDB)的高分辨率的FGF19(1PWA)X射线晶体结构，利用MOE(Molecular Operating Environment；Chemical Computing Group；Montreal，Quebec，Canada)建模软件来创建FGF21的3D同源模型。选择FGF19为模板，因为在沉积于PDB的蛋白质当中，就氨基酸序列同源性而言，FGF19是与FGF21最密切相关的蛋白质。
然后将FGF21同源模型扩展到代表结合于FGF受体的FGF-21。此模型用于识别这样的残基，其有可能暴露在FGF21的表面上，并且可供与活化的聚合物(例如PEG)部分反应，同时避免可能会干扰FGF21与其受体相互作用的残基。还考虑了物种间残基的序列保守性以及天然侧链的生化特性。根据此位点在对活性的破坏作用最小的情况下成功进行聚乙二醇化的估计可能性对通过此筛选识别为良好候选物的残基进行评级。A组残基代表最佳候选物，D组残基代表可行但不怎么优选的候选物。A组包括N121、H125、H112、R77、H87、E37和K69。B组包括R126、G113、D79、E91、D38、D46和G120。C组包括S71、D89、L86、T70、G39、T40、R36、P49、S48、S123、K122、A81、A111、E110和R96。最后，D组包括Q18、R19、A26、Q28、E34、A44、A45、E50、L52、Q54、L55、K59、G61、L66、V68、R72、P78、G80、Y83、S85、F88、P90、A92、S94、L98、E101、D102、Q108、L114、H117、P119、P124、D127、P128、A129、P130、R131和P140。
此外，基于序列比对和侧链的生化特性识别分子的端氨基和羧基片段内潜在的聚乙二醇化位点，因为分子的这些部分没有可用的三维结构数据。识别被认为最适合突变的残基，随后根据残基与选择标准匹配的良好程度进行分组。对于FGF21多肽序列的N-端，评价了残基1-13，D5被确认为突变的最佳候选物，残基H1、P2、I3、P4和S6经确认也是可行的。对于FGF21多肽序列的C-端，评价了残基141-181，残基Y179和R175被确认为突变的最佳候选物，残基P143、P171、S172、Q173、G174、S176、P177、S178、A180和S181形成另一组候选物，残基P144、A145、P147、E148、P149、P150、I152A154、Q156和G170形成第三组突变候选物。
实施例3.B
通过移除不需要的天然聚合物附着位点产生的FGF21突变体
第二种策略使用氨基特异性共轭化学试剂将PEG偶联至FGF21。潜在的血管源性共轭物的位点选择性双重聚乙二醇化可显著降低其血管源性潜力(参见例如美国专利No.6,420,339)。因此，在本发明的一个方面，通过使蛋白质变异，只留下两个伯氨基供聚乙二醇化，由此完成FGF21的位点选择性双重聚乙二醇化。
FGF21蛋白质含有四个赖氨酸和十个精氨酸残基，在野生型FGF21序列(SEQ IDNO：4)中以黑体(R和K残基)和下划线(K残基)突出显示。两种天然半胱氨酸残基以黑体和斜体突出显示：
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS SEQ ID NO：4
首先使四个天然赖氨酸突变为精氨酸，产生只含有一个伯氨基的母体分子，该伯氨基为N-端的α-氨基。对此测试离体活性，发现其具有充分的活性。接下来逐步用赖氨酸取代选定的精氨酸以产生多达十个类似物，所述类似物在FGF21分子上的不同位置处含有用于聚乙二醇化的第二个伯氨基。检查FGF21(与其受体结合)的同源模型可以对所建议的共轭物位点进行评级，这种评级由它们与假定的受体界面的接近程度决定。没有论述似乎埋藏的位点。
对各种位置进行评级，特征如下：(a)溶剂暴露的且在受体界面远端的位点：R36、R77、K122和R126；(b)溶剂暴露的且在受体界面近端的位点：K56、K59、K69、R72和R175；以及(c)埋藏的位点：R17、R19、R131和R135。
最终的构建体各含有单个α-氨基和ε-氨基，对其进行纯化，测试与PEG共轭之前和之后的活性，如实施例9(共轭)和实施例10(离体活性测定)中所述。
实施例4
包含单个突变的FGF21突变体的识别
表3提供了对包含单个突变的FGF21突变体的汇总，该FGF21突变体通过上文实施例3.A和3.B中所述的合理的蛋白质工程方法产生。这些单一突变体提供并且掺入非天然存在的聚合物附着位点，特别是半胱氨酸或赖氨酸残基。这些残基的侧链特别适于通过附着聚合物如PEG分子的化学修饰。认识到，除了引入的非天然存在聚合物附着位点之外，聚合物可根据需要任选地附着于蛋白质的N-端。
由于引入的残基被设计成保持FGF21生物活性的野生型水平，所以预期这些FGF21突变体多肽保持FGF21生物活性并且仍提供一个或多个非天然存在聚合物附着位点。化学修饰(例如聚乙二醇化)后，预期这些突变体的体内半衰期比野生型FGF21长，同时保持显著的生物活性的体内野生型水平。
靶向诱变的位置数目在表5中给出，并且对应于包括181个氨基酸残基的成熟FGF21蛋白质中的残基位置。使用下述的技术制备编码列于下表5中的FGF21突变体多肽的核酸序列。
表5
包含单个突变的FGF21突变体多肽
| 残基数目 | WT | 突变 | |
| 36 | R | K | R36K |
| 37 | E | C | E37C |
| 38 | D | C | D38C |
| 46 | D | C | D46C |
| 56 | K | R | K56R |
| 60 | K | R | K60R |
| 91 | E | C | E91C |
| 69 | K | C | K69C |
| 69 | K | R | K69R |
| 72 | R | K | R72K |
| 77 | R | C | R77C |
| 77 | R | K | R77K |
| 79 | D | C | D79C |
| 86 | H | C | H86C |
| 91 | E | C | E91C |
| 112 | H | C | H112C |
| 113 | G | C | G113C |
| 120 | G | C | G120C |
| 121 | N | C | N121C |
| 122 | K | R | K122R |
| 125 | H | C | H125C |
| 126 | R | C | R126C |
| 126 | R | K | R126K |
| 171 | P | G | P171G |
| 175 | R | C | R175C |
| 175 | R | K | R175K |
| 170 | G | C | G170C |
| 179 | Y | C | Y179C |
实施例5
包含两个突变的FGF21突变体的识别
进行对同源性模型和获自单个半胱氨酸突变体的数据进一步分析，以便识别提供两个非天然存在聚合物附着位点的突变体的组合。化学修饰后，这些FGF21突变体具有两个在所需位置附着于多肽的聚合物(例如，PEG分子)。与本发明的所有FGF21突变体多肽一样，聚合物也可附着于多肽的N-端，取决于聚合物自身的性质。描述双重聚乙二醇化FGF21突变体的图以图解方式示于图1中。
表6提供了对包含两个突变的FGF21突变体的汇总，该FGF21突变体通过这种合理的蛋白质工程方法产生。这些双重突变体掺入非天然存在的聚合物附着位点，特别是半胱氨酸。这些残基的侧链特别适于通过附着聚合物如PEG分子的化学修饰。认识到，除了引入的非天然存在聚合物附着位点之外，聚合物可根据需要任选地附着于蛋白质的N-端。
由于引入的残基被设计成保持FGF21生物活性，所以预期这些FGF21突变体多肽保持FGF21生物活性并且仍提供一个或多个非天然存在聚合物附着位点。化学修饰(例如聚乙二醇化)后，预期这些突变体的体内半衰期比野生型FGF21长，同时保持显著的体内潜能。
靶向诱变的位置数目在表6中给出，并且对应于包括181个氨基酸残基的成熟FGF21蛋白质中的残基位置。使用下述的技术制备编码列于下表6中的FGF21突变体多肽的核酸序列。
表6
包含两个突变的FGF21突变体多肽
| 残基1 | WT | 突变 | 残基2 | WT | 突变 | |
| 37 | E | C | 77 | R | C | E37C，R77C |
| 120 | G | C | 125 | H | C | G120C，H125C |
| 77 | R | C | 91 | E | C | R77C，E91C |
| 77 | R | C | 125 | H | C | R77C，H125C |
| 91 | E | C | 125 | H | C | E91C，H125C |
| 77 | R | C | 120 | G | C | R77C，G120C |
| 37 | E | C | 91 | E | C | E37C，E91C |
| 91 | E | C | 175 | R | C | E91C，R175C |
| 37 | E | C | 175 | R | C | E37C，R175C |
| 91 | E | C | 120 | G | C | E91C，G120C |
| 37 | E | C | 120 | G | C | E37C，G120C |
| 77 | R | C | 175 | R | C | R77C，R175C |
| 37 | E | C | 125 | H | C | E37C，H125C |
| 37 | E | C | 69 | K | C | E37C，K69C |
| 69 | K | C | 91 | E | C | K69C，E91C |
| 120 | G | C | 175 | R | C | G120C，R175C |
| 69 | K | C | 120 | G | C | K69C，G120C |
| 69 | K | C | 125 | H | C | K69C，H125C |
| 69 | K | C | 77 | R | C | K69C，R77C |
| 125 | H | C | 175 | R | C | H125C，R175C |
| 69 | K | C | 175 | R | C | K69C，R175C |
| 37 | E | C | 170 | G | C | E37C，G170C |
实施例6
包含三个突变的FGF21突变体的识别
如上所述，非天然存在聚合物附着位点可被引入到野生型FGF21多肽序列。这提供了在多肽的所需位置处进行位点选择性化学修饰的机会。此外，之前已确定野生型FGF21序列中的残基P171对蛋白分解性降解有易感性。因此，通过引入上述修饰的组合，加上在P171位置的突变，可以产生具有增强的蛋白分解性稳定性和位点特异性聚合物附着位点的FGF21分子。
进行对同源性模型进一步分析，以便识别提供两个非天然存在聚合物附着位点的突变体的组合。化学修饰后，这些FGF21突变体具有两个在所需位置附着于多肽的聚合物(例如，PEG分子)。与本发明的所有FGF21突变体多肽一样，聚合物也可附着于多肽的N-端，取决于聚合物自身的性质。描述双重聚乙二醇化FGF21突变体的图以图解方式示于图1中。分析包括评价除了两个引入的聚合物附着位点之外在P171位置的突变，该突变被设计成增加FGF21突变体多肽的蛋白分解性稳定性，并且提供选择的聚合物附着位点和增加的蛋白分解性稳定性，同时在相同时间保持或增加野生型FGF21的体内生物活性。
在平行研究中，为了使用之前所述的位点选择性混合化学方法(参见美国专利No.6,420,339，其通过引用并入本文)将在α-氨基N-端和引入的半胱氨酸突变的位点选择性聚乙二醇化，示于实施例4中的、来自表5的单个突变的选择亚组与增加P171突变的稳定性组合。这些双重突变体被命名为R77C/P171G和H125C/P171G，并且是可使用实施例4的表5中所公开的突变来考虑的任何其它组合的模范，
表7提供了对除了在P171位置的突变、还包含两个突变的FGF21突变体的汇总，该FGF21突变体通过这种合理的蛋白质工程方法产生。这些突变体掺入两个非天然存在的聚合物附着位点，特别是半胱氨酸。这些残基的侧链特别适于通过附着聚合物如PEG分子的化学修饰。认识到，除了引入的非天然存在聚合物附着位点之外，聚合物可根据需要任选地附着于蛋白质的N-端。所述的三重FGF21突变体不但包括上述引入的聚合物附着位点，而且包括诱导在位置171的突变的蛋白分解性稳定性。FGF21三重突变的化学修饰后，这种突变组合起如下作用：通过两个聚合物(例如PEG分子)与多肽序列的缔合来增加FGF21半衰期的作用以及通过消除蛋白分解性切割位点来增加半衰期。
由于引入的残基被设计成保持FGF21生物活性的体内野生型水平，所以预期这些FGF21突变体多肽保持FGF21生物活性并且仍提供唯一的非天然存在聚合物附着位点。化学修饰(例如聚乙二醇化)后，预期这些突变体的体内半衰期比野生型FGF21长，同时保持显著的生物活性的体内野生型水平。
靶向诱变的位置数目在表7中给出，并且对应于包括181个氨基酸残基的成熟FGF21蛋白质中的残基位置。使用下述的技术制备编码列于下表7中的FGF21突变体多肽的核酸序列。
表7
包含3个突变的FGF21突变体多肽
实施例7
FGF21突变体多肽的制备和表达
编码表3(单个突变)、表4(双重突变)和表5(三重突变，即双重突变+P171G)中列出的FGF21突变体(在这个实施例中共同地称为“FGF21突变体”)的构建体were prepared byof the通过如下所述的野生型FGF21表达载体的PCR扩增(实施例1中描述了野生型FGF21表达载体的构建)。这些实验的目的是产生包含一个或多个非天然存在聚合物附着位点的FGF21突变体，并且在某些情况下对蛋白分解有抗性。预期这些FGF21突变体的化学修饰的形式表现出更长的半衰期，并且在某些情况下也抵抗蛋白分解。
使用具有与待突变的密码子的区域上游和下游同源的序列的引物来制备FGF21突变体构建体。用于这类扩增反应的引物还提供重叠序列的约15个核苷酸以允许扩增产物(即具有所需突变体的整个载体)的重新环化。
使用表8所示的引物制备示例性FGF21突变体构建体，其编码具有在位置170替代天然甘氨酸残基的谷氨酸残基的FGF21突变体(即G170E FGF21突变体多肽)。
表8
用于制备示例性FGF21突变体的PCR引物
表6中所示的引物允许用下面所示的谷氨酸残基取代甘氨酸残基，其中最上面序列是有义引物(SEQ ID NO：29)，第二和第三序列(SEQ ID NO：30和31)是FGF21表达构建体的部分，而第四序列是反义引物(SEQ ID NO：32)：
5′-ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGCCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCA
GAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGT
AGCCTGGGAGACTCGTACCACCTTGGAAGG-5′
使用基本上使用实施例1中所述的PCR条件制备FGF21突变体构建体。用限制性内切酶DpnI消化扩增产物，然后将其转化成感受态细胞。对所得克隆测序以确认聚合酶产生的错误不存在。
通过用编码特定突变体的构建体转化感受态BL21(DE3)或BL21 Star(Invitrogen；Carlsbad，CA)细胞来表达FGF21突变体。在有限通气下、使转化体在补充有40ìg/mL卡那霉素的TB培养基中生长过夜，第二天早上对其通气，在短暂恢复期后，将转化体在0.4mM IPTG中诱导。诱导后，通过离心18-20小时收获FGF21突变体多肽。
作为使用细菌表达系统的结果，用N-端甲硫氨酸残基表达FGF21突变体多肽。
实施例8
纯化来自细菌的FGF21和FGF21突变体多肽
在接下来的实施例中，在细胞表达系统中表达FGF21突变体多肽。在如实施例7中所述的表达后，除非另有说明，否则如该实施例中所述地纯化FGF21突变体多肽。
为了纯化来自细菌包涵体的FGF21突变体多肽，将经两次洗涤的包涵体(DWIB)溶解于溶解缓冲液(在pH 8.5的Tris缓冲液中含有盐酸胍和DTT)中，然后在室温下混合1小时，将溶解混合物加入至含有脲、精氨酸、半胱氨酸和盐酸胱胺的重折叠缓冲液(pH 9.5)中，然后在5℃混合24小时(参见例如，Clarke，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9：157-63；Mannall等人，2007，Biotechnol.Bioeng.97：1523-34；Rudolph等人，1997，《ProteinFunction：A Practical Approach》的“Folding Proteins”(Creighton编辑，New York，IRLPress)，第57-99页；和Ishibashi等人，2005，Protein Expr.Purif.42：1-6)。
溶解并重折叠后，将混合物滤过0.45微米滤器。然后在20psi的跨膜压(TMP)下用5kD分子量截留Pall Omega盒将重折叠池浓缩约10倍，在20psi的TMP下用3柱体积20mMTris(pH 8.0)渗滤。
然后使用Q Sepharose HP树脂将澄清的样品进行阴离子交换(AEX)层析法。在5℃、于pH 8.0运行0-250mM在20mM Tris中的NaCl的线性盐梯度。通过SDS-PAGE分析峰级分并将其混合。
然后使用Phenyl Sepharose HP树脂对AEX洗出液混合物进行疏水作用层析(HIC)。在环境温度下、使用含有20mM TRIS(pH 8.0)的0.6M～0M硫酸铵的递减线性梯度洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE分析峰级分(Laemmli，1970，Nature 227：680-85)并将其混合。
在20psi的TMP下用5kD分子量截留Pall Omega 0.2m2盒将HIC混合物浓缩至7mg/mL。在20psi的TMP下用5柱体积20mM Tris(pH 8.0)渗滤浓缩物，然后将回收的浓缩物稀释至约5mg/mL。最终，将溶液滤过0.22μm醋酸纤维素滤器。
实施例9
FGF21突变体的化学修饰
如实施例7中所述地制备具有在表3-5中显示的所选位置取代的半胱氨酸的FGF21的变体，然后用20kDa甲氧基-PEG-马来酰亚胺对分子进行聚乙二醇化反应。除非另有说明，否则本文所公开的所有聚乙二醇化FGF21野生型和突变体多肽包含一个或多个20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺聚合物。
然后在25℃、使用5摩尔当量的TCEP将部分纯化的FGF21分子还原30分钟。然后使用GE Healthcare Sephadex G25M柱将经还原的FGF21缓冲液更换为10mM咪唑(pH 7.5)。在25℃、将经缓冲液更换的FGF21与5摩尔当量的20kDa甲氧基-PEG-马来酰亚胺反应30分钟。然后将所得的反应混合物进行离子交换层析法，从而将单-聚乙二醇化物种与多-聚乙二醇化分子和未-聚乙二醇化分子分离。大多数FGF21突变体多肽与甲氧基-PEG-马来酰亚胺充分反应，主要制备高收率的单-聚乙二醇化产物(图2和3)。
为了制备束缚分子，在25℃、使用5摩尔当量的TCEP将部分纯化的FGF21分子还原30分钟。然后使用GE Healthcare Sephadex G25M柱将经还原的FGF21缓冲液更换为10mM咪唑(pH 7.5)。在4℃、将经缓冲液更换的FGF21与0.45摩尔当量的20kDa PEG双-马来酰亚胺反应60分钟。然后将所得的反应混合物进行离子交换层析法，从而将束缚分子与其它不需要的反应产物分离。时常需要另外的离子交换纯化步骤，这通过将第一离子交换混合物在约4体积的水中稀释并再施加至离子交换柱来进行。
可选地，如前所述通过使用甲氧基-PEG-丙醛的还原烷基化来实现胺与N-端的特异性偶联(参见美国专利No.5,824,784)。简言之，在4℃、将约2mg/ml的突变体FGF21与5倍摩尔过量的20kD mPEG-丙醛在乙酸盐缓冲液(pH 5.5)和10mM氰基硼氢化钠中反应过夜。可使用这种策略实现本文所述的任何FGF21野生型和突变体分子的N-端聚乙二醇化。
当在N-端和突变体赖氨酸需要胺特异性双重聚乙二醇化时，使用甲氧基PEG-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺酯)。简言之，在4℃、将约2mg/ml突变体FGF21与5倍摩尔过量(PEG∶氨基)的20kD mPEG-NHS在n，n-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 7.5)中反应约2小时。
当应用混合化学方法以在N-端和突变体Cys位置双重聚乙二醇化FGF21突变体时，如前所述相继使用甲氧基-PEG-丙醛和甲氧基-PEG-马来酰亚胺(参见美国专利No.6,420,339)。简言之，在4℃、将约2mg/ml突变体FGF21与1.5倍摩尔过量的20kD mPEG-NHS在磷酸缓冲液(pH 6.5)中反应约2小时，然后将pH调节至约pH 5，加入5倍过量的20kD mPEG-丙醛和10mM氰基硼氢化钠。允许最终反应在4℃继续过夜。
如前所述，通过阴离子交换层析法在Tris缓冲液(pH 8)中纯化所有不同的反应混合物。
实施例10
FGF21突变体多肽和化学修饰的FGF21突变体多肽的体外活性
然后将聚乙二醇化FGF21突变体多肽进行体外测定，以评价它们的活性，并与FGF21突变体多肽的未聚乙二醇化形式和N-端聚乙二醇化FGF21相比较。
这些实验的一个目标是识别在ELK荧光素酶体外测定中保持FGF21活性的FGF21突变体多肽和化学修饰的FGF21突变体多肽。使用重组人293T肾细胞系统进行ELK荧光素酶测定，其中293T细胞过度表达-klotho和荧光素酶报道基因构建体。-klotho是FGF21激活其FGF受体所需的共受体。用于该测定的FGF受体是在293T肾细胞中表达的FGF受体的内源性水平。荧光素酶报道基因构建体包含编码GAL4-ELK1的序列和由含有5个串联拷贝的Gal4结合位点(5xUAS-Luc)的启动子驱使的荧光素酶报道基因。荧光素酶活性通过磷酸化Erk/ELK1的水平来调节，并且用于间接监控并定量FGF21活性。
通过在不同浓度的野生型FGF21或FGF21突变体多肽存在下培养293T细胞6小时，来进行ELK荧光素酶测定，然后测定细胞溶解产物的荧光素酶活性。图4-6和表3-5汇总了对于数个示例性FGF21突变体多肽(包括具有1个、2个或3个突变的那些)所获得的体外结果。
实施例10.A
聚乙二醇化的包含1个突变的FGF21突变体多肽的EC50值
下面表9汇总了包含两个突变的各种FGF21突变体多肽的EC50值，该突变体多肽在特定且已知的位置引入一个非天然存在聚合物附着位点。
产生各种FGF21突变体多肽，然后在本文所述的ELK荧光素酶测定中确定其活性。表9汇总了所得数据：
表9
聚乙二醇化的包含1个突变的FGF21突变体多肽的EC50的汇总
表9汇总了聚乙二醇化对本发明的各种FGF21突变体多肽中的某些突变体多肽的体外活性的影响。
图4、5和6图解描述了数种聚乙二醇化包含单个点突变的FGF21突变体的结果和EC50值。图4和5包含关于数种FGF21突变体(其数据示于表9中)的数据。更具体地，图4的上图显示针对聚乙二醇化E37C、R77C、E91C突变体和N-端聚乙二醇化野生型FGF21以及未聚乙二醇化FGF21进行的ELK荧光素酶测定的结果。在图4的下图中，呈示关于聚乙二醇化G113C、N121C、D46C突变体和N-端聚乙二醇化野生型FGF21以及未聚乙二醇化野生型FGF21的数据。
转向图5，在上图中，呈示H125C、G120C、R126C突变体和N-端聚乙二醇化野生型FGF21以及未聚乙二醇化野生型FGF21的数据。在下图中，呈示D79C、D38C突变体和N-端聚乙二醇化野生型FGF21以及未聚乙二醇化野生型FGF21的数据。
继续图6的上图，呈示聚乙二醇化K69C和D79C突变体以及N-端聚乙二醇化野生型FGF21、未聚乙二醇化野生型FGF21的图解数据。在图6的下图中，呈示聚乙二醇化R175C和Y179C突变体和N-端聚乙二醇化野生型FGF21以及未聚乙二醇化野生型FGF21的数据。令人惊讶地是，很多这些分子具有与未聚乙二醇化分子接近的体外活性。
实施例10.B
选择的Arg/Lys FGF21突变体的EC50值
如实施例3中所述，通过诱变去除天然存在聚合物附着位点(例如聚乙二醇化位点)来产生一系列FGF21突变体多肽。在这些FGF21突变体中，将反应性Lys基团首先突变为精氨酸，只留下N-端α-氨基酸可用于聚乙二醇化。接着选择精氨酸残基，不管是天然型还是突变型均一个接一个转化为赖氨酸，因此在FGF21表面上的确定位置引入第二聚乙二醇化位点。这种策略的一个目标是产生FGF21突变体多肽，其中在一个或多个特异性且已知的位置共轭聚合物(例如PEG分子)。
产生各种精氨酸/赖氨酸FGF21突变体多肽，然后在本文所述的ELK荧光素酶测定中确定其活性。表10汇总了所得数据：
表10
聚乙二醇化的包含赖氨酸/精氨酸突变的FGF21突变体多肽的EC50的汇总
实施例10.C
选择的聚乙二醇化的包含两个突变的FGF21突变体多肽的EC50值
在本文所述的ERK荧光素酶检查很多包含两个突变的FGF21突变体多肽的活性。将这些突变体工程化以引入两个非天然存在聚合物附着位点(以半胱氨酸残基的形式)和突变，提供增强的蛋白分解性稳定性(P171G)到野生型FGF21序列中。
产生各种FGF21突变体多肽，然后在本文所述的体外ELK荧光素酶测定中确定其活性。下面表11示出了那些实验的EC50值。
表11
选择的化学修饰的包含两个突变的FGF21突变体多肽的EC50值
在平行实验中，使用源自实施例10A的单个半胱氨酸突变体制备双重聚乙二醇化FGF21突变体，而且携带增强P171G突变的稳定性。如前所述，使用混合的聚乙二醇化化学法将这些突变体在N-端和工程化半胱氨酸均进行位点选择性聚乙二醇化(参见美国专利No.6,420,339)。因为混合的聚乙二醇化化学法允许分辨N-端和半胱氨酸共轭位点，所以将不同聚合物位点选择性偶联至不同位点也是可能的。在这种情况下，制备一系列共轭物，其中将5kDa、10kDa和20kDa聚合物的组合偶联至N-端，将20kDa聚合物一致地偶联至半胱氨酸突变体。这允许评价N-端聚乙二醇化合物对FGF21体外活性的影响。在本文所述的体外ELK荧光素酶测定中对这些共轭物均进行测试。结果示于表12中。
表12
选择的化学修饰的包含半胱氨酸突变和P171G突变的FGF21突变体多肽的EC50值
实施例10.D
选择的化学修饰的包含三个突变的FGF21突变体多肽的EC50值
也在本文所述的体外ELK荧光素酶测定中检查多种包含三个突变的FGF21突变体多肽的活性。将这些突变体工程化以引入两个非天然存在聚合物附着位点(以半胱氨酸残基的形式)和突变，提供增强的蛋白分解性稳定性(P171G)到野生型FGF21序列中。
产生各种FGF21突变体多肽，然后在本文所述的体外ELK荧光素酶测定中确定其活性。下面表13汇总了所得的数据：
表13
选择的化学修饰的包含三个突变的FGF21突变体多肽的EC50值
令人惊讶地，数据表明这些双重聚乙二醇化FGF21突变体多肽的大部分具有优于N-端单-聚乙二醇化分子的活性。
实施例11
选择的FGF21束缚分子的EC50值
本发明的束缚分子包括由连接体分子束缚在一起的2个FGF21多肽序列。图7图示了束缚分子的一个实例。如本文所述，据预测这些束缚分子将提供较长的半衰期，同时仍保持期望水平的生物活性。
本文描述了各种束缚分子的产生并且在体外ELK荧光素酶测定中确定活性。产生的束缚分子包括FGF21突变体，其中突变引入连接体连接位点。几个FGF21突变体是双突变体并包括P171G突变来增加蛋白水解的稳定性。该体外研究的条件和程序与实施例10中的那些相同。表14汇总了所获得的数据：
表14
选择的FGF21束缚分子的EC50值
从表14的数据可看到：束缚分子具有惊人的高体外活性，其等于或大于未聚乙二醇化分子的活性，该活性值，仅作参考，确定为0.63。
实施例12
化学修饰的FGF21突变体多肽的体内活性
FGF21具有多种生物活性，包括降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减轻体重；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性。根据实施例10所述的初始体外评估，聚乙二醇化FGF21突变体多肽进一步分析其体外FGF21活性。聚乙二醇化FGF21多肽被引入耐胰岛素ob/ob小鼠，并测量特定聚乙二醇化FGF21多肽降低血糖的能力。体外操作的程序如下。
将待测试的聚乙二醇化FGF21多肽腹腔内注射到8周龄大的ob/ob小鼠中(JacksonLaboratory)，在单次注射后的以下各时间点获得血样：如注射后0、6、24、72、120和168小时。用OneTouch Glucometer(LifeScan，Inc.Milpitas，CA)测定血糖水平，将结果表达为相对于血糖基线水平(如在0小时)的血糖百分比变化。
FGF21突变体如本文所述产生，并通过添加两个20kDa含甲氧基的PEG马来酰亚胺分子来修饰，一个在各个引入的聚合物连接位点，其通常为半胱氨酸残基。对突变进行选择从而来为两个PEG分子提供离散的、已知的连接点。使用本文所述的方法来实现FGF21突变体的聚乙二醇化。
实施例12.A
N-端聚乙二醇化野生型FGF21的体内活性
对由聚乙二醇化在多肽的N-端化学修饰的野生型FGF21在ob/ob小鼠模型中进行研究。对未聚乙二醇化野生型FGF21也在同一实验中进行研究，并用PBS作为对照。采用单个20kDa含甲氧基的PEG马来酰亚胺分子来N-端聚乙二醇化野生型FGF21。图8示出了该实验的结果。
在单次注射后，天然的和N-端聚乙二醇化的野生型FGF21将血糖水平降低了30-40％。然而，天然的野生型FGF21的血糖水平在注射24小时后返回到基线水平。相反，N-端聚乙二醇化野生型FGF21在至少72小时内具有稳定的血糖降低的活性。该项研究的结果表明聚乙二醇化野生型FGF21延长了天然分子的药效。
转回到图9，使用野生型FGF21在ob/ob小鼠模型中进行剂量响应研究，其用20、30或40kDa PEG分子来进行聚乙二醇化。图9示出，与20kDa PEG分子相比，30和40kDa PEG分子具有较高和较长的葡萄糖降低功效，表明PEG的大小和体内药效正相关。
实施例12.A.1
在N-端和引入的聚合物连接位点共轭的选择的化学修饰的FGF21突变体多肽的体内活性
几种FGF21化学修饰的突变体在N-端和第二工程位点进行位点选择性地聚乙二醇化，在ob/ob小鼠模型中对其进行研究。这些双重聚乙二醇化FGF21构建体均在N-端和第二位点进行聚乙二醇化，该第二位点包括如实施例4所述的工程赖氨酸或实施例6所述的工程半胱氨酸。
使用不同组的聚乙二醇化FGF21突变体多肽进行类似实验。图10包括两条图线，显示注射有载体(PBS)的小鼠的血糖水平的百分比变化，或聚乙二醇化形式的FGF21突变体包括聚合物连接突变，即也是N-端聚乙二醇化FGF21 R77C，和N-端聚乙二醇化FGF21 R126K(上图)，以及N-端聚乙二醇化F77/P171G(下图)，其在引入的聚合物连接位点也是聚乙二醇化的。采用20kDa含甲氧基的PEG马来酰亚胺分子。该实验的结果再次证实，相对于在至少120小时内具有稳定的葡萄糖下降的野生型FGF21蛋白而言，双重聚乙二醇化FGF21突变体显示出增强的药效。
实施例12B
选定的包括两个或三个突变位点的化学改性的FGF21突变体多肽的体内活性
在小鼠ob/ob模型中对大量化学改性的FGF21突变体多肽进行研究。通过添加两个20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子来对这些突变体进行化学改性，其中一个位于引入的半胱氨酸残基中的任一者中，并且就包括单个突变位点的FGF21突变体多肽而言，其位于多肽的N-端。这些突变位点的选择使得可为一个或多个PEG分子提供离散的已知连接点。一些FGF21突变体还包括P171G突变，以增强蛋白酶解抗性。将聚乙二醇化FGF21突变体多肽注入小鼠体内，这些小鼠在9天的研究过程中间断性出血。
实施例12B.1
对血糖水平的影响
使用另一组聚乙二醇化FGF21突变体多肽进行实验。图11为示出小鼠血糖水平百分比变化的曲线图，其中这些小鼠注射有载体(PBS)，或FGF21突变体的双重聚乙二醇化形式，其包括多个突变位点，即E91/H125C、E91C/R175C、E37C/G120C、E37C/H125C、E37C/R175C；还对未聚乙二醇化Fc-G170E FGF21进行了研究。使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子。此实验的结果再次证实双重聚乙二醇化FGF21突变体相对于野生型FGF21蛋白而言表现出增强的药物动力学作用。
使用另一组聚乙二醇化FGF21突变体多肽进行类似实验。图12为示出小鼠血糖水平百分比变化的曲线图，其中这些小鼠注射有载体(PBS)，或包括多个突变位点的FGF21突变体的双重聚乙二醇化形式，即N-端聚乙二醇化R77C，其在引入的聚合位点处也被聚乙二醇化；N-端聚乙二醇化R126K，其在引入的聚合位点处也被聚乙二醇化；E91/G120C；G120C/H125C和E37C/R77C；还对未聚乙二醇化Fc-G170E FGF21进行了研究。使用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子。此实验的结果再次证实双重聚乙二醇化FGF21突变体相对于野生型FGF21蛋白而言表现出增强的药物动力学作用。
在另一个实验中，图13示出聚乙二醇化FGF21突变体在9天的研究过程中对小鼠血糖水平的影响。该数据表明聚乙二醇化分子相对于天然分子而言具有提高的体内效能。在图13中，结果由聚乙二醇化E37C/R77C、E91C/R175C、E37C/H125C、E37C/R77C/P171G、E91C/R175C/P171G和E37C/H125C/P171G FGF21突变体产生，这些突变体均在引入的聚合物连接位点处双重聚乙二醇化。在此研究中，用两个20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子对FGF21突变体进行改性，并且所用载体为10mM磷酸钾、5％山梨糖醇(pH 8)。
如图13所示，三种双重突变型双重聚乙二醇化分子E37C/R77C；E91C/R175C；E37C/H125C降低了血糖水平，并且作用在单次注射后保持了72小时。有趣的是，引入P171G突变还延长了体内作用，并且使最大将血糖活性维持了另外2天，总的作用时间为120小时。
另外，对包括三个突变位点的若干FGF21多肽以及若干束缚分子的降血糖能力一同进行了研究。所用三重突变体为E37C/R77C/P171G和E91C/H125C/P171G；束缚分子包括两个相同的FGF21突变体多肽，其包括两个突变点，即E37C/P171G和R77C/P171G。20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子用于FGF21的双重聚乙二醇化形式，以及束缚分子中的连接分子。该实验的结果在图14中示出。相比束缚的FGF21突变体，双重聚乙二醇化突变体具有进一步增强的药物动力学作用。相比束缚的FGF21突变体的120小时而言，双重聚乙二醇化突变体的降血糖活性持续了至少168小时。
图15为示出在九天中ob/ob小鼠血糖百分比随剂量变化的曲线图，这些小鼠中注射有载体(10mM TRIS、150mM NaCl，pH 8.5)或不同剂量的双重聚乙二醇化E37C/R77C/P171G FGF21突变体多肽。该实验的结果表明双重聚乙二醇化三重突变体E37C/R77C/P171G以剂量依赖方式降低了ob/ob小鼠的血糖水平。0.3mg/kg的剂量水平几乎达到了最大降血糖活性，并且作用保持了至少5天。当剂量水平增加至1mg/kg时，观察到进一步提高的体内效能和作用持续时间。
实施例12B.2
对体重的影响
2型糖尿病往往伴随脂肪和体重的增加。因此，治疗性分子优选地具有理想的减体重作用和理想的降血糖水平作用。因此，对本文所描述的许多聚乙二醇化FGF21突变体在减轻小鼠体重方面的作用进行了评价。
为了研究各种FGF21突变体多肽对体重的影响，将聚乙二醇化野生型和FGF21突变体多肽经由腹腔注射到8周大的ob/ob小鼠体内(Jackson Laboratory)，并在单次注射后在多个时间点对体重进行监测，例如注射后0、24、72、120和168小时。
图16示出在研究期间聚乙二醇化FGF21突变体对小鼠体重的影响。采用双重聚乙二醇化E37C/R77C、E91C/R175C、E37C/H125C、E37C/R77C/P171G、E91C/R175C/P171G和E37C/H125C/P171G FGF21突变体多肽产生这些结果。在该研究中用20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子对FGF21突变体进行改性。还相对于血糖水平的变化对这些FGF21突变体进行了研究，并将结果在图13中示出。合在一起，该数据表明相对于对照载体而言，接受聚乙二醇化FGF21突变体的小鼠重量得以减轻，并且包括抗蛋白酶解的突变P171G的FGF21突变体多肽相比其P171野生型对应物更加有效。
图17为小鼠体重变化的曲线图，这些小鼠注射有载体，或FGF21突变体的双重聚乙二醇化形式，其包括多个突变位点，即E37C/R77C/P171G；E91C/H125C/P171G；R77C/P171G；和束缚分子，其在一种情况中包括两个E37C/P171G FGF21突变体多肽，而在另一种情况中包括两个R77C/P171G FGF21突变体多肽。20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子用于FGF21的聚乙二醇化形式，而20kDa PEG双马来酰亚胺用于束缚分子。还相对于血糖水平的变化对这些FGF21突变体进行了研究，并将结果在图14中示出。合在一起，该数据表明相对于对照载体而言，接受聚乙二醇化FGF21突变体的小鼠重量得以减轻。还观察到双重聚乙二醇化FGF21突变体多肽相比所研究的束缚分子在减轻体重方面更加有效。
还以多剂量研究检验了双重聚乙二醇化FGF21突变体多肽对体重的影响。图18为示出在九天中ob/ob小鼠的体重随剂量变化的曲线图，这些小鼠中注射有载体或不同剂量的双重聚乙二醇化E37C/R77C/P171G。还相对于血糖水平的变化对此FGF21突变体进行了研究，并将结果在图15中示出。合在一起，这些数据表明0.3mg/kg的剂量水平在单次注射后足以减小ob/ob小鼠的体重增量。
实施例13
鼠肾空泡研究
采用PEG和其它聚合物延长治疗性蛋白半衰期的一个考虑因素是聚乙二醇化分子形成肾空泡的可能性。PEG的该性质在文献中具有充分的说明(参见例如Bendele等，1998，“Short Communication：Renal Tubular Vacuolation in Animals Treated withPolyethylene-glycol-conjugated Proteins”Toxicological Sciences、42：152-157；和Conover等，1996，“Transitional Vacuole Formation Following a Bolus Infusion ofPEG-hemoglobin in the Rat”，Art.Cells，Blood Subs.，and Immob.Biotech.24：599-611)，并且不可预知。诱导肾空泡形成的聚乙二醇化分子通常(但不一定)会使分子不宜作为治疗性蛋白。在某些情况下，对肾空泡的形成关注较少并且可能被容许。因此，用小鼠进行长期的肾空泡研究。
FGF21突变体多肽按照本文所述产生。一种研究按照下文进行设计和实施。将多重聚乙二醇化FGF21分子连续7日，每日一次，每次10mg/kg的剂量经皮下注射施用给雌性C57BL/6小鼠(3/组)；将对照载体(10mM KHPO4、150mM NaCl，pH 8)和2种阳性对照物以相同的方式施用。在每次剂量施用前和1、3和6天给药后的1-2小时，对所有动物进行详细的临床观察；在所有其它给药日后的1-2小时，收集笼侧观察结果。在每次剂量施用前和尸体剖检时收集体重。收集所有动物的肾和肝，以用于组织学评价。表15汇总了该研究的结果。
表15
肾空泡研究汇总
表15示出使用载体(10mM Tris、150mM NaCl，pH 8.5)、FGF21的N-端聚乙二醇化形式以及FGF21突变体的聚乙二醇化形式(包括突变位点H125C、R77C、K69C、G120C、E37C、R175、E91C、N121C、R126C、G113C、D79C、D46C和H112C)的7天鼠空泡研究的结果。如表中所示，使用一个或两个20kDa甲氧基PEG马来酰亚胺分子。空泡指数的范围在0(相对于对照物未观察到空泡变化)和4(严重的空泡形成)之间。从表15可看出，所有单-聚乙二醇化FGF21突变体均诱导肾空泡的形成。然而，双-聚乙二醇化FGF21突变体均未诱导空泡形成。还注意到到，小鼠肝脏中未观察到空泡形成。
在一周的研究后，进行8周的慢性研究。在该研究中，将多种聚乙二醇化FGF21分子以每周一次、每次5或25mg/kg的剂量经由皮下注射施用给8周的雌性C57BL/6小鼠(5/group)；将对照载体(10mM Tris、150mM NaCl，pH 8.5)以相同的方式施用。在给药前、给药日给药后1-2小时对所有动物的临床征象进行观察；非给药日每天一次进行观察。从第一天开始每次剂量施用前，然后在每次给药后第三天以及尸体剖检时收集体重。收集所有(垂死或安乐死)动物的肾、肝和脾，以用于组织学评价。
图19A-19F为示出在八周的肾空泡研究期间所观察到的重量变化的一系列曲线图，该研究采用载体(方形)和两种剂量的双重聚乙二醇化、FGF21突变体，即5mg/kg(三角形)和25mg/kg(开口圆)。所研究的FGF21突变体包括R77C、P171G(图19A)；E37C、R77C、P171G(图19B)；E37C、H125C、P171G(图19C)；E91C、H125C、P171G(图19D)；E37C、P171G(图19E)和R77C、P171G(图19F)。在图19A中，采用混合化学途径，导致FGF21突变体的N-端聚乙二醇化以及引入的聚合物连接位点、非天然存在的半胱氨酸77处发生聚乙二醇化。在图19B-19D中，采用单一化学途径，导致引入的聚合物连接位点、非天然存在的半胱氨酸残基(图19B中位置37和77、图19C中位置37和125以及图19D中位置91和125处的半胱氨酸)处发生聚乙二醇化。最后，在图19D和19E中，单个双马来酰亚胺PEG用于在非天然存在的半胱氨酸残基(图21E中的位置37和图19F中的位置77处的半胱氨酸)处将两个FGF21突变体连接在一起。
图20包括两个柱状图，其示出八周肾空泡研究过程中，针对两种剂量5和25mg/kg、六个单独或双重聚乙二醇化FGF21突变体所观察到的肾空泡的平均得分。0分表示未观察到多于照动物中所发现的空泡，而4分表示相对于对照动物而言具有严重的空泡形成。FGF21突变体与图19A-19E中的描述相同。因此，对于一种构建体，采用混合化学途径，导致FGF21突变体的N-端聚乙二醇化以及引入的聚合物连接位点、非天然存在的半胱氨酸77处发生聚乙二醇化。对于三种其它构建体，采用单一化学途径，导致引入的聚合物连接位点、非天然存在的半胱氨酸残基(一种构建体中的位置37和77、第二种构建体中的位置37和125或第三种构建体中的位置91和125处的半胱氨酸)处发生聚乙二醇化。最后，单个双马来酰亚胺PEG用于在非天然存在的半胱氨酸残基(位置37或位置77处的半胱氨酸)处将两个FGF21突变体连接在一起。将P171G突变引入六个构建体的每一者中。
虽然已通过多种实施方案对本发明进行了描述，但应当理解对于本领域的技术人员而言仍存在变型和修改。因此，希望所附权利要求书涵盖在所主张的本发明范围内的所有此类等效变型。此外，本文所用的分节标题仅出于组织性目的，而不应理解为对所述主题的限制。
本公开中应用的所有参考文献均明确以引用的方式并入本文中。
Claims (53)
1.一种分离的核酸分子，其编码SEQ ID NO: 4的多肽，所述多肽具有在36位的赖氨酸残基置换和下列至少一种氨基酸置换：在56, 59, 69或122位的精氨酸残基置换。
2.一种载体，包含权利要求1所述的核酸分子。
3.一种宿主细胞，包含权利要求2所述的载体。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其是真核细胞。
5.根据权利要求3所述的宿主细胞，其是原核细胞。
6.一种制备由权利要求2所述的载体编码的多肽的方法，包括：在合适的条件下培养包含权利要求2所述的载体的宿主细胞，以表达所述多肽，并且任选地分离所述多肽。
7.一种由权利要求6所述的方法制备的多肽。
8.根据权利要求7所述的多肽，还包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸残基。
9.一种分离的多肽，与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列相比，所述分离的多肽具有在36位的赖氨酸残基置换和下列至少一种氨基酸置换：在56, 59, 69或122位的精氨酸残基置换；
以及其中所述分离的多肽还包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸残基。
10.一种分离的多肽，与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列相比，所述分离的多肽有在36位的赖氨酸残基置换和下列至少一种氨基酸置换：在56, 59, 69或122位的精氨酸残基置换；
以及其中所述多肽共价连接一种或多种聚合物。
11.根据权利要求10所述的分离的多肽，其中所述多肽共价连接一种聚合物。
12.根据权利要求11所述的分离的多肽，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
13.根据权利要求12所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇 (PEG),单甲氧基-聚乙二醇, 右旋糖酐, 纤维素, 聚-(N-乙烯吡咯烷酮) 聚乙二醇, 丙二醇均聚物, 聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物, 聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。
14.根据权利要求13所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
15.根据权利要求10所述的分离的多肽，其中所述聚合物是分支聚合物。
16.一种分离的多肽，与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列相比，所述分离的多肽具有在36位的赖氨酸残基置换和下列至少一种氨基酸置换：在56, 59, 69或122位的精氨酸残基置换；
以及其中所述多肽具有共价连接其氨基-端的PEG部分。
17.一种分离的多肽，与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列相比，所述分离的多肽具有在36位的赖氨酸残基置换和下列至少一种氨基酸置换：在56, 59, 69或122位的精氨酸残基置换；
以及其中所述多肽共价连接两种聚合物。
18.根据权利要求17所述的分离的多肽，其中所述两种聚合物中的一种是水溶性聚合物。
19.根据权利要求18所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇 (PEG),单甲氧基-聚乙二醇, 右旋糖酐, 纤维素, 聚-(N-乙烯吡咯烷酮) 聚乙二醇, 丙二醇均聚物, 聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物, 聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。
20.根据权利要求19所述的分离的多肽，其中所述水溶性聚合物是PEG。
21.根据权利要求17所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的一种是分支的。
22.根据权利要求17所述的分离的多肽，其中所述聚合物中的两种都是分支的。
23.一种药物组合物，包含分离的多肽和药学上可接受的配制剂，其中所述分离的多肽与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列相比具有在36位的赖氨酸残基置换和下列至少一种氨基酸置换：在56, 59, 69或122位的精氨酸残基置换。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的配制剂是载体、佐剂、增溶剂、稳定剂或抗氧化剂。
25.权利要求24所述的药物组合物在制备用于治疗代谢紊乱的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述代谢紊乱是糖尿病。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述代谢紊乱是肥胖症。
28.一种组合物，包含：第一多肽，所述第一多肽与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列相比具有在36位的赖氨酸残基置换并且具有下列至少一种氨基酸置换：在56, 59, 69或122位的精氨酸残基置换；
并且其中所述第一多肽通过接头结合第二多肽，所述第二多肽与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列相比具有在36位的赖氨酸残基置换并且具有下列至少一种氨基酸置换：在56, 59,69或122位的精氨酸残基置换。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述第一、第二或两种多肽还包含引入所述多肽的C-端的脯氨酸或甘氨酸残基。
30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述接头是肽。
31.根据权利要求28所述的组合物，其中所述接头是水溶性聚合物。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇 (PEG), 单甲氧基-聚乙二醇, 右旋糖酐, 纤维素, 聚-(N-乙烯吡咯烷酮) 聚乙二醇, 丙二醇均聚物,聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物, 聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
34.根据权利要求28所述的组合物，其中所述第一、第二或两种多肽除了所述接头还共价连接一种聚合物。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇 (PEG), 单甲氧基-聚乙二醇, 右旋糖酐, 纤维素, 聚-(N-乙烯吡咯烷酮) 聚乙二醇, 丙二醇均聚物,聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物, 聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
38.根据权利要求31所述的组合物，其中所述聚合物是分支的。
39.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组合物具有共价连接其氨基-端的单一PEG部分。
40.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组合物共价连接两种聚合物。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述两种聚合物中的一种是水溶性聚合物。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇 (PEG), 单甲氧基-聚乙二醇, 右旋糖酐, 纤维素, 聚-(N-乙烯吡咯烷酮) 聚乙二醇, 丙二醇均聚物,聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物, 聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
44.根据权利要求40所述的组合物，其中所述聚合物中的两种都是水溶性聚合物。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述水溶性聚合物独立地是聚乙二醇 (PEG),单甲氧基-聚乙二醇, 右旋糖酐, 纤维素, 聚-(N-乙烯吡咯烷酮) 聚乙二醇, 丙二醇均聚物, 聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物, 聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇、以及它们的组合。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中两种所述水溶性聚合物都是PEG。
47.根据权利要求40所述的组合物，其中所述聚合物中的一种是分支的。
48.根据权利要求40所述的组合物，其中所述聚合物中的两种是分支的。
49.一种药物组合物，包含权利要求28所述的组合物和药学上可接受的配制剂。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的配制剂是载体、佐剂、增溶剂、稳定剂或抗氧化剂。
51.权利要求49所述的药物组合物在制备用于治疗代谢紊乱的药物中的用途。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述代谢紊乱是糖尿病。
53.根据权利要求51所述的用途，其中所述代谢紊乱是肥胖症。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19576108P | 2008-10-10 | 2008-10-10 | |
| US61/195,761 | 2008-10-10 | ||
| US61/195761 | 2008-10-10 | ||
| PCT/US2009/060045 WO2010042747A2 (en) | 2008-10-10 | 2009-10-08 | Fgf21 mutants and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102625811A CN102625811A (zh) | 2012-08-01 |
| CN102625811B true CN102625811B (zh) | 2016-09-21 |
Family
ID=41571715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200980150308.1A Active CN102625811B (zh) | 2008-10-10 | 2009-10-08 | Fgf21突变体及其用途 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9279013B2 (zh) |
| EP (1) | EP2358749B1 (zh) |
| JP (2) | JP5878757B2 (zh) |
| KR (1) | KR101651703B1 (zh) |
| CN (1) | CN102625811B (zh) |
| AU (1) | AU2009302318A1 (zh) |
| CA (1) | CA2739615C (zh) |
| CL (1) | CL2011000792A1 (zh) |
| CO (1) | CO6362020A2 (zh) |
| CR (1) | CR20110245A (zh) |
| EA (2) | EA032727B1 (zh) |
| IL (1) | IL212061A0 (zh) |
| MA (1) | MA32771B1 (zh) |
| MX (1) | MX341149B (zh) |
| NZ (1) | NZ592009A (zh) |
| PE (1) | PE20120021A1 (zh) |
| SG (1) | SG195542A1 (zh) |
| TN (1) | TN2011000161A1 (zh) |
| UA (1) | UA105016C2 (zh) |
| WO (1) | WO2010042747A2 (zh) |
| ZA (1) | ZA201103356B (zh) |
Families Citing this family (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8981061B2 (en) | 2001-03-20 | 2015-03-17 | Novo Nordisk A/S | Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof |
| GB0426146D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Bioxell Spa | Therapeutic peptides and method |
| KR101476472B1 (ko) | 2007-03-30 | 2015-01-05 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도 |
| US8420088B2 (en) | 2008-01-28 | 2013-04-16 | Novartis Ag | Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides |
| TW200936156A (en) | 2008-01-28 | 2009-09-01 | Novartis Ag | Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides |
| JOP20190083A1 (ar) | 2008-06-04 | 2017-06-16 | Amgen Inc | بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها |
| MX341149B (es) * | 2008-10-10 | 2016-08-09 | Amgen Inc | Mutantes fgf21 y uso de los mismos. |
| US9480753B2 (en) | 2009-01-23 | 2016-11-01 | Novo Nordisk A/S | FGF21 derivatives with albumin binder A-B-C-D-E- and their use |
| WO2011154349A2 (en) * | 2010-06-08 | 2011-12-15 | Novo Nordisk A/S | Fgf21 analogues and derivatives |
| US20110195077A1 (en) * | 2010-01-29 | 2011-08-11 | Novartis Ag | Methods and compositions using fgf23 fusion ppolypeptides |
| CN103124562A (zh) * | 2010-06-08 | 2013-05-29 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | Fgf21的类似物和衍生物 |
| CN103415300B (zh) | 2010-07-20 | 2018-02-23 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | N‑末端修饰的fgf21化合物 |
| WO2012027261A1 (en) | 2010-08-23 | 2012-03-01 | Amgen Inc. | Sulfonylpiperazine derivatives that interact with glucokinase regulatory protein for the treatment of diabetes |
| US9023791B2 (en) * | 2010-11-19 | 2015-05-05 | Novartis Ag | Fibroblast growth factor 21 mutations |
| CN103717586A (zh) | 2011-04-05 | 2014-04-09 | 安姆根有限公司 | 用于治疗糖尿病的与葡糖激酶调节蛋白相互作用的苯并二氧杂*和苯并二氧杂环己烯化合物 |
| RS56090B1 (sr) | 2011-05-16 | 2017-10-31 | Hoffmann La Roche | Fgfr1 agonisti i načini primene |
| EP3597666A3 (en) | 2011-07-01 | 2020-04-22 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases |
| AU2012301769B2 (en) * | 2011-08-31 | 2016-05-19 | Amgen Inc. | FGF21 for use in treating type 1 diabetes |
| UY34347A (es) | 2011-09-26 | 2013-04-30 | Novartis Ag | Proteínas de función dual para tratar trastornos metabólicos |
| EP3196214B1 (en) | 2012-02-15 | 2019-07-31 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (trem-1) |
| US9550830B2 (en) | 2012-02-15 | 2017-01-24 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) |
| SI2814842T1 (sl) | 2012-02-15 | 2018-10-30 | Novo Nordisk A/S | Protitelesa, ki vežejo peptidoglikal prepoznan protein 1 |
| WO2013123444A1 (en) | 2012-02-17 | 2013-08-22 | Amgen Inc. | Sulfonyl compounds that interact with glucokinase regulatory protein |
| WO2013173382A1 (en) | 2012-05-15 | 2013-11-21 | Amgen Inc. | Benzothiophene sulfonamides and other compounds that interact with glucokinase regulatory protein |
| CN104364261B (zh) | 2012-06-11 | 2017-04-05 | 伊莱利利公司 | 成纤维细胞生长因子21变体 |
| TWI513705B (zh) | 2012-06-11 | 2015-12-21 | Lilly Co Eli | 纖維母細胞生長因子２１蛋白質 |
| US9290557B2 (en) | 2012-11-28 | 2016-03-22 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides |
| NZ630484A (en) | 2012-11-28 | 2017-04-28 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases |
| US9273107B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-03-01 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
| US9925242B2 (en) | 2012-12-27 | 2018-03-27 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods of using compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides for treatment of nonalcoholic steatohepatitis |
| WO2014149699A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Eli Lilly And Company | Bifunctional protein |
| RU2707531C2 (ru) | 2013-10-28 | 2019-11-27 | ЭнДжиЭм БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. | Модели рака и соответствующие способы |
| TWI728373B (zh) | 2013-12-23 | 2021-05-21 | 美商建南德克公司 | 抗體及使用方法 |
| WO2015103782A1 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Wenzhou Medical College Biological Pharmaceuticals And Nature Products Ltd., Co | Fgf21 mutant and conjugate thereof |
| EP3738981A1 (en) | 2014-01-24 | 2020-11-18 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Antibodies binding beta klotho domain 2 and methods of use thereof |
| EP3125921B1 (en) | 2014-03-11 | 2020-07-08 | Novartis AG | Fgf21 variants for use in treating hiv-haart induced partial lipodystrophy |
| US10398758B2 (en) | 2014-05-28 | 2019-09-03 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions |
| AU2015277438B2 (en) | 2014-06-16 | 2020-02-27 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
| JP6738316B2 (ja) | 2014-07-17 | 2020-08-12 | ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 粘度を低下させるためのｔｒｅｍ−１抗体の部位特異的変異誘発 |
| CN114129709A (zh) | 2014-10-23 | 2022-03-04 | 恩格姆生物制药公司 | 包含肽变异体的药物组合物及其使用方法 |
| KR20240024362A (ko) | 2014-10-24 | 2024-02-23 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도 |
| WO2016073855A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders |
| US10654909B2 (en) | 2014-12-04 | 2020-05-19 | Novartis Ag | Soluble alpha klotho and serum albumin fusion protein |
| TWI681966B (zh) * | 2014-12-23 | 2020-01-11 | 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 | Ｆｇｆ２１衍生物及其用途 |
| KR20160088656A (ko) | 2015-01-16 | 2016-07-26 | 주식회사유한양행 | 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
| WO2016179140A1 (en) * | 2015-05-05 | 2016-11-10 | The Regents Of The University Of California | Fibroblast growth factor polymers, methods for making the same and applications thereof |
| US11638745B2 (en) | 2015-05-20 | 2023-05-02 | University of Pittsburgh—Of the Commonwealth Cvctom of Hierher Education | Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients |
| WO2017019957A2 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Binding proteins and methods of use thereof |
| KR20170049319A (ko) * | 2015-10-28 | 2017-05-10 | 주식회사유한양행 | 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
| EP3888672A1 (en) | 2015-11-09 | 2021-10-06 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders |
| TW201731867A (zh) * | 2015-12-02 | 2017-09-16 | 賽諾菲公司 | Ｆｇｆ２１變異體 |
| WO2017220706A1 (en) | 2016-06-22 | 2017-12-28 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical compositions of fgf21 derivatives and uses thereof |
| CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN107759697B (zh) | 2016-08-19 | 2023-03-24 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 制备融合蛋白的方法 |
| EP3502143A4 (en) | 2016-08-19 | 2020-07-15 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN |
| CA3034399A1 (en) | 2016-08-26 | 2018-03-01 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors |
| AU2017382038A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-08-08 | Sanofi | FGF21 compound / GLP-1R agonist combinations with optimized activity ratio |
| EP3612637A4 (en) | 2017-04-21 | 2021-01-27 | Yuhan Corporation | DOUBLE-FUNCTION PROTEIN PRODUCTION PROCESS AND ITS DERIVATIVES |
| CN107056925B (zh) * | 2017-04-28 | 2022-01-14 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 人fgf21突变体、其制备方法及用途 |
| CA3072903A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Modified fibroblast growth factor 21 (fgf-21) for use in methods for treating nonalcoholic steatohepatitis (nash) |
| WO2019154189A1 (en) * | 2018-02-08 | 2019-08-15 | Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. | Fgf21 variant, fusion protein and application thereof |
| US11155618B2 (en) | 2018-04-02 | 2021-10-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Anti-TREM-1 antibodies and uses thereof |
| SG11202013240RA (en) | 2018-07-03 | 2021-01-28 | Bristol Myers Squibb Co | Fgf21 formulations |
| US20230346957A1 (en) | 2020-01-08 | 2023-11-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Fgf-21 conjugate formulations |
| US11028132B1 (en) | 2020-04-07 | 2021-06-08 | Yitzhak Rosen | Half-life optimized linker composition |
| EP4192495A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-06-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Fgf21 combined with ccr2/5 antagonists for the treatment of fibrosis |
| US20240123031A1 (en) | 2020-11-25 | 2024-04-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating liver diseases |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005091944A2 (en) * | 2004-03-17 | 2005-10-06 | Eli Lilly And Company | Glycol linked fgf-21 compounds |
| WO2006065582A2 (en) * | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Eli Lilly And Company | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
| CN1890371A (zh) * | 2003-12-10 | 2007-01-03 | 伊莱利利公司 | 成纤维细胞生长因子的21突变蛋白 |
| CN101010338A (zh) * | 2004-09-02 | 2007-08-01 | 伊莱利利公司 | 成纤维细胞生长因子21的突变蛋白 |
| WO2008121563A2 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Ambrx, Inc. | Modified fgf-21 polypeptides and their uses |
Family Cites Families (146)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
| US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4263428A (en) | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
| JPS6023084B2 (ja) | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
| US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
| US4640835A (en) | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
| EP0088046B1 (de) | 1982-02-17 | 1987-12-09 | Ciba-Geigy Ag | Lipide in wässriger Phase |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| HUT35524A (en) | 1983-08-02 | 1985-07-29 | Hoechst Ag | Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance |
| EP0143949B1 (en) | 1983-11-01 | 1988-10-12 | TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION | Pharmaceutical composition containing urokinase |
| US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
| DE3572982D1 (en) | 1984-03-06 | 1989-10-19 | Takeda Chemical Industries Ltd | Chemically modified lymphokine and production thereof |
| US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
| DE3675588D1 (de) | 1985-06-19 | 1990-12-20 | Ajinomoto Kk | Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist. |
| CA1310924C (en) | 1986-04-24 | 1992-12-01 | Francis P. Mccormick | Infective drug delivery system |
| US4791192A (en) | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
| US4970154A (en) | 1987-10-09 | 1990-11-13 | Baylor College Of Medicine | Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency |
| DE3889853D1 (de) | 1987-11-05 | 1994-07-07 | Hybritech Inc | Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik. |
| US5158881A (en) | 1987-11-17 | 1992-10-27 | Brown University Research Foundation | Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments |
| US4892538A (en) | 1987-11-17 | 1990-01-09 | Brown University Research Foundation | In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells |
| US5106627A (en) | 1987-11-17 | 1992-04-21 | Brown University Research Foundation | Neurological therapy devices |
| US5011472A (en) | 1988-09-06 | 1991-04-30 | Brown University Research Foundation | Implantable delivery system for biological factors |
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| JP2989002B2 (ja) | 1988-12-22 | 1999-12-13 | キリン―アムジエン・インコーポレーテツド | 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子 |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| US5288855A (en) | 1989-01-23 | 1994-02-22 | Farmitalia Carlo Erba | Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor |
| EP0481000B1 (en) | 1989-07-06 | 1999-05-12 | The Regents Of The University Of California | Receptors for fibroblast growth factors |
| US5676954A (en) | 1989-11-03 | 1997-10-14 | Vanderbilt University | Method of in vivo delivery of functioning foreign genes |
| EP1375666A3 (en) | 1989-12-22 | 2007-09-26 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Eukaryotic host cell line in which an endogenous gene has been activated, and uses thereof |
| US5272071A (en) | 1989-12-22 | 1993-12-21 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line |
| WO1991010470A1 (en) | 1990-01-08 | 1991-07-25 | Brown University Research Foundation | Devices and methods for enhanced delivery of active factors |
| DE69133566T2 (de) | 1990-01-12 | 2007-12-06 | Amgen Fremont Inc. | Bildung von xenogenen Antikörpern |
| US5672510A (en) | 1990-01-19 | 1997-09-30 | Genetic Therapy, Inc. | Retroviral vectors |
| ES2204886T3 (es) | 1990-07-06 | 2004-05-01 | Gencell S.A. | Receptores de factor de crecimiento fibroblastico. |
| DK0814159T3 (da) | 1990-08-29 | 2005-10-24 | Genpharm Int | Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer |
| US5217889A (en) | 1990-10-19 | 1993-06-08 | Roninson Igor B | Methods and applications for efficient genetic suppressor elements |
| US5252714A (en) | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
| US5229501A (en) | 1991-01-11 | 1993-07-20 | Chiron Corporation | Expression and use of human fibroblast growth factor receptor |
| US6565841B1 (en) | 1991-03-15 | 2003-05-20 | Amgen, Inc. | Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor |
| IL100219A0 (en) | 1991-12-02 | 1992-09-06 | Yeda Res & Dev | Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity |
| WO1993015722A1 (en) | 1992-02-07 | 1993-08-19 | Syntex (Usa) Inc. | Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles |
| US5234784A (en) | 1992-04-01 | 1993-08-10 | Eastman Kodak Company | Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image |
| US5364791A (en) | 1992-05-14 | 1994-11-15 | Elisabetta Vegeto | Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations |
| CA2136439A1 (en) | 1992-06-18 | 1994-01-06 | Michael Philip Nova | Process for detection of neoplastic disease |
| ES2301158T3 (es) | 1992-07-24 | 2008-06-16 | Amgen Fremont Inc. | Produccion de anticuerpos xenogenicos. |
| US5474914A (en) | 1992-07-29 | 1995-12-12 | Chiron Corporation | Method of producing secreted CMV glycoprotein H |
| US5489743A (en) | 1993-01-19 | 1996-02-06 | Amgen Inc. | Transgenic animal models for thrombocytopenia |
| US5581476A (en) | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
| JPH11501201A (ja) | 1993-05-07 | 1999-02-02 | スターリング ウィンスロップ インコーポレイティド | ラクトース加水分解牛乳及び味を改善し甘味を抑えた乳製品 |
| US6664107B1 (en) | 1993-05-26 | 2003-12-16 | Ontario Cancer Institute, University Health Network | CD45 disrupted nucleic acid |
| CA2165162C (en) | 1993-06-14 | 2000-05-23 | Hermann Bujard | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
| US5589362A (en) | 1993-06-14 | 1996-12-31 | Basf Aktiengesellschaft | Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities |
| US5654168A (en) | 1994-07-01 | 1997-08-05 | Basf Aktiengesellschaft | Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units |
| ATE218893T1 (de) | 1993-08-12 | 2002-06-15 | Neurotech Sa | Biokompatible immunoisolatorische kapseln, die genetisch veränderte zellen enthalten |
| US5658785A (en) | 1994-06-06 | 1997-08-19 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
| US5484720A (en) | 1994-09-08 | 1996-01-16 | Genentech, Inc. | Methods for calcium phosphate transfection |
| US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US6096871A (en) | 1995-04-14 | 2000-08-01 | Genentech, Inc. | Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life |
| EP0822830B1 (en) | 1995-04-27 | 2008-04-02 | Amgen Fremont Inc. | Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice |
| PL323587A1 (en) | 1995-05-26 | 1998-04-14 | Zeneca Ltd | Gene changing-over system including edisone receptor |
| AU705035B2 (en) | 1995-06-07 | 1999-05-13 | Baylor College Of Medicine | Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell |
| WO1996041865A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-27 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Rapamcycin-based regulation of biological events |
| EP0888303B1 (en) | 1996-02-28 | 2010-04-21 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc | Synthetic derivatives of rapamycin as multimerizing agents for chimeric proteins with immunophilin-derived domains |
| US5679559A (en) | 1996-07-03 | 1997-10-21 | University Of Utah Research Foundation | Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery |
| US6214795B1 (en) | 1996-11-12 | 2001-04-10 | Praecis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity |
| CA2276108C (en) | 1996-12-26 | 2009-03-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel peptide, novel dna, and novel antibody |
| US6133426A (en) | 1997-02-21 | 2000-10-17 | Genentech, Inc. | Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies |
| US6342220B1 (en) | 1997-08-25 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
| CA2309783C (en) | 1997-11-25 | 2011-06-28 | Genentech, Inc. | Fibroblast growth factor-19 |
| US6150098A (en) | 1998-02-20 | 2000-11-21 | Amgen Inc. | Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides |
| ZA200007412B (en) | 1998-05-15 | 2002-03-12 | Imclone Systems Inc | Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases. |
| US6548634B1 (en) | 1998-09-30 | 2003-04-15 | Chiron Corporation | Synthetic peptides having FGF receptor affinity |
| US6369109B1 (en) | 1998-10-28 | 2002-04-09 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts | Betulinic acid and derivatives thereof useful for the treatment of neuroectodermal tumor |
| WO2000027885A1 (fr) | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau popypeptide chimerique |
| AU3224700A (en) | 1999-02-08 | 2000-08-25 | Chiron Corporation | Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion |
| AU3755900A (en) | 1999-03-15 | 2000-10-04 | Chiron Corporation | Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye |
| CA2311201A1 (en) | 1999-08-05 | 2001-02-05 | Genset S.A. | Ests and encoded human proteins |
| US7408047B1 (en) | 1999-09-07 | 2008-08-05 | Amgen Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
| US7459540B1 (en) | 1999-09-07 | 2008-12-02 | Amgen Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
| WO2001018209A1 (en) | 1999-09-10 | 2001-03-15 | Curagen Corporation | Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same |
| WO2001032678A1 (en) | 1999-11-05 | 2001-05-10 | Smithkline Beecham Corporation | sbgFGF-19a |
| US6716626B1 (en) | 1999-11-18 | 2004-04-06 | Chiron Corporation | Human FGF-21 nucleic acids |
| ATE446365T1 (de) | 1999-11-18 | 2009-11-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Menschliches fgf-21 gen und genexpressionsprodukte |
| AU1628101A (en) | 1999-11-22 | 2001-06-04 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor |
| US7108984B2 (en) | 2000-01-12 | 2006-09-19 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods of identifying modulators of the FGF receptor |
| US20020081663A1 (en) | 2000-01-05 | 2002-06-27 | Conklin Darrell C. | Novel FGF homolog ZFGF11 |
| AU2631001A (en) | 2000-01-05 | 2001-07-16 | Zymogenetics Inc. | Novel fgf homolog zfgf11 |
| AU5056501A (en) | 2000-03-31 | 2001-10-08 | Nobuyuki Itoh | Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof |
| JP2002112772A (ja) | 2000-07-10 | 2002-04-16 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ |
| IL139380A0 (en) | 2000-10-31 | 2001-11-25 | Prochon Biotech Ltd | Active variants of fibroblast growth factor |
| US20060223114A1 (en) | 2001-04-26 | 2006-10-05 | Avidia Research Institute | Protein scaffolds and uses thereof |
| US20030157561A1 (en) | 2001-11-19 | 2003-08-21 | Kolkman Joost A. | Combinatorial libraries of monomer domains |
| US20040018499A1 (en) | 2001-06-06 | 2004-01-29 | Lal Preeti G | Extracellular messengers |
| WO2002102973A2 (en) | 2001-06-20 | 2002-12-27 | Prochon Biotech Ltd. | Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof |
| ATE468862T1 (de) | 2001-07-11 | 2010-06-15 | Maxygen Inc | G-csf konjugate |
| WO2003011213A2 (en) | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Eli Lilly And Company | Method for treating diabetes and obesity |
| WO2003038054A2 (en) | 2001-10-31 | 2003-05-08 | New York University | Structure-based design and synthesis of fgf inhibitors and fgf modulator compounds |
| EP1469880A4 (en) | 2002-01-15 | 2006-04-26 | Lilly Co Eli | METHOD FOR REDUCING MORBIDITY AND MORTALITY IN CRITELY SICK PATIENTS |
| US7531304B2 (en) | 2002-01-31 | 2009-05-12 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. | Method for screening FGFR-4 agonists |
| EP1332761A1 (en) | 2002-01-31 | 2003-08-06 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR) |
| IL149562A0 (en) | 2002-05-09 | 2002-11-10 | Prochon Ltd | Fgf variants and methods for use thereof |
| JP2003334088A (ja) | 2002-05-22 | 2003-11-25 | Pharma Design Inc | ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子 |
| AU2003265057A1 (en) | 2002-09-04 | 2004-03-29 | Abtech | Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy |
| AU2003284357A1 (en) | 2002-11-01 | 2004-06-07 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
| JP2007524566A (ja) | 2002-12-20 | 2007-08-30 | エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ | レセプターとリガンドの間の相互作用の調節の方法 |
| WO2004083381A2 (en) | 2003-03-13 | 2004-09-30 | Indiana University Advanced Research & Technology Institute | Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants |
| JP2006240990A (ja) | 2003-05-15 | 2006-09-14 | Kirin Brewery Co Ltd | ｋｌｏｔｈｏタンパク質および抗ｋｌｏｔｈｏタンパク質抗体ならびにそれらの用途 |
| AU2004251145C1 (en) | 2003-06-12 | 2011-04-14 | Eli Lilly And Company | GLP-1 analog fusion proteins |
| WO2004110472A2 (en) | 2003-06-12 | 2004-12-23 | Eli Lilly And Company | Fusion proteins |
| WO2005019258A2 (en) | 2003-08-11 | 2005-03-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
| WO2005037235A2 (en) | 2003-10-16 | 2005-04-28 | Imclone Systems Incorporated | Fibroblast growth factor receptor-1 inhibitors and methods of treatment thereof |
| AU2004312376A1 (en) | 2003-12-19 | 2005-07-21 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention |
| EP1727559A1 (en) | 2004-01-26 | 2006-12-06 | Eli Lilly And Company | Use of fgf-21 and a thiazolidinedione for treating type 2 diabetes |
| JP4505631B2 (ja) | 2004-03-31 | 2010-07-21 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物 |
| WO2005113606A2 (en) * | 2004-05-13 | 2005-12-01 | Eli Lilly And Company | Fgf-21 fusion proteins |
| WO2006028714A1 (en) | 2004-09-02 | 2006-03-16 | Eli Lilly And Company | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
| US20080176790A1 (en) * | 2004-10-29 | 2008-07-24 | Defrees Shawn | Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf) |
| JP2008528487A (ja) | 2005-01-21 | 2008-07-31 | イーライ リリー アンド カンパニー | 心臓血管疾患を治療する方法 |
| JP2006246823A (ja) | 2005-03-11 | 2006-09-21 | Kyoto Univ | 造血因子としてのＦｇｆ２１の使用 |
| WO2006130527A2 (en) | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Novartis Ag | Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1 |
| ES2336832T3 (es) | 2005-07-22 | 2010-04-16 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Composiciones y procedimientos para tratar enfermedades con proteinas de fusion de fgfr. |
| JP2009504183A (ja) | 2005-08-15 | 2009-02-05 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 遺伝子破壊、それに関連する組成物および方法 |
| US8043833B2 (en) | 2005-10-31 | 2011-10-25 | Novo Nordisk A/S | Expression of soluble therapeutic proteins |
| CA2644046A1 (en) | 2006-02-28 | 2007-09-07 | Trustees Of Boston University | Metabolic regulators and uses thereof |
| US8101721B2 (en) | 2006-06-15 | 2012-01-24 | Fibron Ltd. | Antibodies blocking fibroblast growth factor receptor activation and methods of use thereof |
| CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
| US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
| US20110008347A1 (en) | 2006-12-01 | 2011-01-13 | Agency For Science ,Technology And Research | Cancer-related protein kinases |
| PL2550972T3 (pl) | 2007-04-02 | 2018-08-31 | Genentech, Inc. | Przeciwciało agonistyczne Klotho-beta do stosowania w leczeniu cukrzycy lub insulinooporności |
| JP5187837B2 (ja) | 2007-04-06 | 2013-04-24 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法 |
| US7537903B2 (en) | 2007-04-23 | 2009-05-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner |
| US20100330062A1 (en) | 2007-05-08 | 2010-12-30 | Koeffler H Phillip | Klotho protein and related compounds for the treatment and diagnosis of cancer |
| JP2010529954A (ja) | 2007-05-22 | 2010-09-02 | ノバルティス アーゲー | Ｆｇｆ２１関連障害を処置、診断および検出する方法 |
| US8481497B2 (en) | 2007-05-29 | 2013-07-09 | Sapporo Medical University | Therapeutic agent for cancer, and method for treatment of cancer |
| JP2010531135A (ja) | 2007-06-04 | 2010-09-24 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用したｏ結合型グリコシル化 |
| EP3260129A1 (en) | 2007-08-03 | 2017-12-27 | Eli Lilly and Company | An fgf-21 compound and a glp-1 compound for use in the treatment of obesity |
| US8426396B2 (en) | 2008-01-08 | 2013-04-23 | Shriners Hospitals For Children | Treatment for achondroplasia |
| TW200936156A (en) | 2008-01-28 | 2009-09-01 | Novartis Ag | Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides |
| WO2009117622A2 (en) | 2008-03-19 | 2009-09-24 | Ambrx, Inc. | Modified fgf-23 polypeptides and their uses |
| JOP20190083A1 (ar) | 2008-06-04 | 2017-06-16 | Amgen Inc | بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها |
| WO2010006214A1 (en) | 2008-07-09 | 2010-01-14 | Ambrx, Inc. | Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses |
| WO2010017198A2 (en) | 2008-08-04 | 2010-02-11 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Fgfr extracellular domain acidic region muteins |
| MX341149B (es) * | 2008-10-10 | 2016-08-09 | Amgen Inc | Mutantes fgf21 y uso de los mismos. |
| AU2010246038A1 (en) | 2009-05-05 | 2011-12-01 | Amgen Inc. | FGF21 mutants and uses thereof |
| SI3248610T1 (sl) | 2009-05-05 | 2024-03-29 | Amgen Inc., | Mutanti fgf21 in njihove uporabe |
-
2009
- 2009-10-08 MX MX2011003788A patent/MX341149B/es active IP Right Grant
- 2009-10-08 PE PE2011000856A patent/PE20120021A1/es not_active Application Discontinuation
- 2009-10-08 US US13/123,205 patent/US9279013B2/en active Active
- 2009-10-08 WO PCT/US2009/060045 patent/WO2010042747A2/en active Application Filing
- 2009-10-08 EP EP09748878.7A patent/EP2358749B1/en active Active
- 2009-10-08 EA EA201100516A patent/EA032727B1/ru unknown
- 2009-10-08 EA EA201990619A patent/EA201990619A1/ru unknown
- 2009-10-08 UA UAA201105749A patent/UA105016C2/uk unknown
- 2009-10-08 JP JP2011531178A patent/JP5878757B2/ja active Active
- 2009-10-08 CN CN200980150308.1A patent/CN102625811B/zh active Active
- 2009-10-08 NZ NZ592009A patent/NZ592009A/xx unknown
- 2009-10-08 KR KR1020117010559A patent/KR101651703B1/ko active IP Right Grant
- 2009-10-08 AU AU2009302318A patent/AU2009302318A1/en not_active Abandoned
- 2009-10-08 SG SG2013075916A patent/SG195542A1/en unknown
- 2009-10-08 CA CA2739615A patent/CA2739615C/en active Active
-
2011
- 2011-03-31 IL IL212061A patent/IL212061A0/en unknown
- 2011-04-06 TN TN2011000161A patent/TN2011000161A1/fr unknown
- 2011-04-07 CO CO11043102A patent/CO6362020A2/es not_active Application Discontinuation
- 2011-04-08 CL CL2011000792A patent/CL2011000792A1/es unknown
- 2011-05-05 MA MA33815A patent/MA32771B1/fr unknown
- 2011-05-09 ZA ZA2011/03356A patent/ZA201103356B/en unknown
- 2011-05-10 CR CR20110245A patent/CR20110245A/es unknown
-
2015
- 2015-04-02 JP JP2015075667A patent/JP2015165801A/ja active Pending
-
2016
- 2016-01-27 US US15/007,438 patent/US20160244497A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1890371A (zh) * | 2003-12-10 | 2007-01-03 | 伊莱利利公司 | 成纤维细胞生长因子的21突变蛋白 |
| WO2005091944A2 (en) * | 2004-03-17 | 2005-10-06 | Eli Lilly And Company | Glycol linked fgf-21 compounds |
| CN101010338A (zh) * | 2004-09-02 | 2007-08-01 | 伊莱利利公司 | 成纤维细胞生长因子21的突变蛋白 |
| WO2006065582A2 (en) * | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Eli Lilly And Company | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
| WO2008121563A2 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Ambrx, Inc. | Modified fgf-21 polypeptides and their uses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2739615A1 (en) | 2010-04-15 |
| EA032727B1 (ru) | 2019-07-31 |
| MA32771B1 (fr) | 2011-11-01 |
| EP2358749A2 (en) | 2011-08-24 |
| EP2358749B1 (en) | 2018-07-18 |
| PE20120021A1 (es) | 2012-02-10 |
| TN2011000161A1 (en) | 2012-12-17 |
| WO2010042747A2 (en) | 2010-04-15 |
| MX2011003788A (es) | 2011-08-03 |
| NZ592009A (en) | 2012-11-30 |
| US9279013B2 (en) | 2016-03-08 |
| EA201100516A1 (ru) | 2011-10-31 |
| US20110195895A1 (en) | 2011-08-11 |
| EA201990619A1 (ru) | 2019-07-31 |
| KR20110093790A (ko) | 2011-08-18 |
| CN102625811A (zh) | 2012-08-01 |
| CL2011000792A1 (es) | 2011-08-26 |
| SG195542A1 (en) | 2013-12-30 |
| AU2009302318A1 (en) | 2010-04-15 |
| JP2015165801A (ja) | 2015-09-24 |
| MX341149B (es) | 2016-08-09 |
| KR101651703B1 (ko) | 2016-08-26 |
| JP5878757B2 (ja) | 2016-03-08 |
| CA2739615C (en) | 2017-12-05 |
| IL212061A0 (en) | 2011-06-30 |
| UA105016C2 (uk) | 2014-04-10 |
| ZA201103356B (en) | 2012-02-29 |
| CO6362020A2 (es) | 2012-01-20 |
| JP2012504965A (ja) | 2012-03-01 |
| CR20110245A (es) | 2011-08-29 |
| US20160244497A1 (en) | 2016-08-25 |
| WO2010042747A3 (en) | 2010-06-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102625811B (zh) | Fgf21突变体及其用途 | |
| CN104684576B (zh) | 聚乙二醇化的oxm变体 | |
| CN102143758B (zh) | Fgf21突变体及其用途 | |
| EA021425B1 (ru) | Мутанты fgf21 и их применение | |
| CN102481330A (zh) | C型利钠肽变体 | |
| JP2001524505A (ja) | ポリエチレングリコール−ｇｒｆ結合体の部位特異的調製方法 | |
| CN102470156A (zh) | 选择性作用于αvβ3整合素并缀合人血清白蛋白(HSA)变体的多肽及其药学用途 | |
| US10316087B2 (en) | Soluble and stable heterodimeric TCR | |
| CN101142234A (zh) | 结合红细胞生成素受体的新肽 | |
| EP3216801B1 (en) | Soluble heterodimeric t cell receptor, and preparation method and use thereof | |
| AU2013211503B2 (en) | FGF21 mutants and uses thereof | |
| KR100695587B1 (ko) | 부갑상성 호르몬과 생체적합성 고분자의 1:1 접합체,이의 제조방법과 이를 함유하는 약학 조성물 | |
| EA041758B1 (ru) | Fgf21 мутанты и их применение | |
| AU2016203765A1 (en) | FGF21 mutants and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |