CN101142234A - 结合红细胞生成素受体的新肽 - Google Patents

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CN101142234A CNA2005800462279A CN200580046227A CN101142234A CN 101142234 A CN101142234 A CN 101142234A CN A2005800462279 A CNA2005800462279 A CN A2005800462279A CN 200580046227 A CN200580046227 A CN 200580046227A CN 101142234 A CN101142234 A CN 101142234A
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Abstract

本发明涉及肽化合物，其为红细胞生成素受体(EPO－R)的激动剂。本发明还涉及使用此类肽化合物治疗与血红细胞产生不足或缺陷相关的疾病的治疗方法。本发明还提供了包含本发明的肽化合物的药物组合物。

Description

结合红细胞生成素受体的新肽
技术领域
本发明涉及肽化合物，其是红细胞生成素受体(EPO-R)的激动剂。本发明还涉及使用此类肽化合物治疗与血红细胞产生不足或缺陷相关的疾病的治疗方法。还提供了包含本发明的肽化合物的药物组合物。
背景技术
红细胞生成素(EPO)是具有165个氨基酸的糖蛋白激素，其分子量为约34千道尔顿(kD)，在24、38、83和126位氨基酸上优选具有糖基化位点。它最初以具有23个氨基酸的信号肽的前体蛋白质产生。EPO可以以三种形式产生：α、β和脱唾液酸。α和β形式在它们的糖组分中稍有不同，但是具有相同的效力、生物活性和分子量。脱唾液酸形式是除去末端糖(唾液酸)的α或β形式。已经报导了编码EPO的DNA序列[Lin的美国专利号4,703,008]。
EPO刺激有丝分裂和红细胞前体细胞的分化，从而确保产生红细胞。当低氧条件占优势时，EPO在肾中产生。在红细胞前体细胞的EPO诱导的分化期间，诱导珠蛋白合成；刺激血红素复合体合成；并且铁蛋白受体数增加。这些改变允许细胞利用更多铁并合成功能血红蛋白，其在成熟红细胞中结合氧。从而，红细胞及其血红蛋白在为身体供氧中起关键作用。这些改变由EPO与红细胞前体细胞表面的适宜受体的相互作用启动[参见，例如，Graber和Krantz(1978)Ann.Rev.Med.29.51-66]。
当身体处于健康状态时，EPO以极低深度存在于血浆中，其中组织从现有数目的红细胞接受足够的加氧作用。该正常的低EPO浓度足够刺激通过老化正常损失的血红细胞的更替。
在循环中血细胞运输的氧减少的低氧条件下，循环中EPO的量增加。例如，通过出血引起的大量失血、过量暴露于辐射导致血红细胞的破坏、由于高海拔或者长时间昏迷导致氧摄取减少，或者多种形式的贫血可以导致低氧。响应此类低氧应激，升高的EPO水平通过刺激祖红细胞增殖而增加血红细胞的产生。当循环中血红细胞数大于正常组织氧需求所需时，循环中的EPO水平降低。
因为EPO是血红细胞形成过程中必需的，所以该激素在诊断和治疗特征是低或者有缺陷的血红细胞生成的血液疾病中具有潜在有用的应用。最近的研究已经为多种疾病状态、障碍和血液不规则状态提供了设计EPO治疗功效的基础，所述疾病状态、障碍和血液不规则状态包括β-地中海贫血[参见，Vedovato等人(1984)Acta.Haematol.71：211-213]；囊性纤维化[参见，Vichinsky等人(1984)J.Pediatric 105：15-21]；妊娠和月经失调[参见，Cotes等人(193)Brit.J.Ostet.Gyneacol.90：304-311]；早产儿贫血[参见，Haga等人(1983)Acta Pediatr.Scand.72；827-831]；脊髓损伤[参见，Claus-Walker等人(1984)Arch.Phys.Med.Rehabil.65：370-374]；太空飞行[参见，Dunn等人(1984)Eur.J.Appl.Physiol.52：178-182]；急性失血[参见，Miller等人(1982)Brit.J.Haematol.52：545-590]；老化[参见，Udupa等人(1984)J.Lab.Clin.Med.103：574-580和581-588以及Lipschitz等人(1983)Blood 63：502-509]；伴随着异常红细胞发生的多种瘤性疾病状态[参见，Dainiak等人(1983)Cancer 5：1101-1106和Schwartz等人(1983)Otolaryngol.109：269-272]以及肾机能不全[参见，Eschbach.等人(1987)N.Eng.J.Med.316：73-78]。
已经表征了经纯化的均质性EPO[Hewick的美国专利号4,677,195]。纯化、克隆并表达了编码EPO的DNA序列以产生具有与天然EPO相同生物化学和免疫学性质的重组多肽。还产生了具有与天然EPO上的寡糖相同的寡糖的重组EPO分子[参见，Sasaki等人(1987)J.Biol.Chem.262：12059-12076]。
EPO的生物学效应似乎部分通过与细胞膜结合的受体的相互作用介导。使用从小鼠脾脏分离的类红细胞的初步研究表明，结合EPO的细胞的表面蛋白质包含两种多肽，它们分别具有约85,000道尔顿和100,000道尔顿的分子量[Sawyer等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.美国84：3690-3694]。计算出的EPO结合位点数平均为每个细胞表面800到1000个。在这些结合位点中，约300个以约90pM(皮摩尔)的Kd值结合EPO，而剩下的以约570pM的降低的亲和力结合EPO[Sawyer等人(1987)J.Biol.Chem.262：5554-5562]。独立的研究表明从注射弗罗德白血病病毒贫血性菌株(FVA)的小鼠制备的EPO-反应性脾成红血细胞具有总共约400个高和低亲和性EPO结合位点，它们的Kd值分别为约100pM和800pM[Landschulz等人(1989)Blood 73：1476-1486]。
随后的工作表明EPO受体(EPO-R)的两种形式由一种基因编码。该基因已被克隆[参见，例如，Jones等人(1990)Blood 76，31-35；Noguchi等人(1991)Blood 78：2548-2556；Maouche等人(1991)Blood 78：2557-2563]。例如，在D′Andrea等人的PCT公开号WO 90/08822中描述了小鼠和人EPO-R蛋白质的DNA序列和编码的肽序列。当前的模型表明EPO与EPO-R的结合导致两种EPO-R分子的二聚化和激活，其导致随后的信号转导步骤[参见，例如，Watowich等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.美国89：2140-2144]。
EPO-R的克隆基因的可得性促进了对该重要受体的激动剂和拮抗剂的研究。该重组受体蛋白质的可得性允许在多种随机和半随机肽多样性产生系统中研究受体-配体的相互作用。这些系统包括“载肽质粒(peptide onplasmid)”系统[美国专利号6,270,170中描述]；“载肽噬菌体(peptide onphage)”系统[美国专利号5,432,018和Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.美国87：6378-6382描述]；“编码的合成文库”(ESL)系统[1992年9月16日提交的美国专利申请序号946,239中描述]以及“极大规模固定化聚合物合成”系统[美国专利号5,143,854；PCT公开号90/15070；Fodor等人(1991)Science 251：767-773；Dower和Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.26：271-180；和美国专利号5,424,186中描述]。
至少一定程度与EPO-R相互作用的肽已经得到鉴定并且在例如，Wrighton等人(1996)Science 273：458-463、Johnson等人(1998)Biochemistry 37：3699-3710和Wrighton等人(1997)Nat.Biotechnol.15：1261-1265中描述，也参见美国专利号5,773,569、5,830,851、5,986,047和5,767,078、WO 96/40749、WO 96/40772、WO 01/38342和WO 01/91780。尤其，已经鉴定了一组含有肽基序的肽，该组肽的成员结合EPO-R并且刺激EPO-依赖性细胞增殖。然而，目前为止鉴定的含有所述基序的肽在体外以约20纳摩尔(nM)至约250nM的EC50值刺激EPO-依赖性细胞增殖。从而，需要约20nM到250nM的肽浓度刺激EPO刺激的最大细胞增殖的50％。
考虑到EPO-R激动剂对于研究该受体介导的重要的生物活性和治疗疾病的巨大潜力，仍然需要鉴定具有增强的效力和活性的肽EPO-R激动剂。本发明提供了此类化合物。
发明概述
本发明提供了具有显著增强的效力和活性的EPO-R激动剂单体肽，以及包含两个肽单体的二聚体肽激动剂。这些新肽激动剂的效力可通过一种或多种修饰进一步增强，所述修饰包括：乙酰化、形成分子内二硫键、共价连接一个或多个聚乙二醇(PEG)部分，以及图1A-1K和本申请全文中列出的那些。本发明还提供了具有保护基和/或疏水基的肽。与肽连接的保护基和/或疏水基可用于延长循环中该肽的半寿期，并利于细胞摄取以及穿过细胞膜转运。本发明还提供了含有此类肽激动剂的药物组合物，和使用此类肽激动剂治疗多种医学病症的方法。
发明详述
附图简述
图1A-1K是肽的表，包括本发明的肽序列。使用单字母氨基酸符号提供肽序列。修饰的及非天然产生的氨基酸使用本说明书中下文定义的缩写表示。为了方便起见，提及的每个单独的肽参考最左手一栏给出的其独立的序列识别号(SEQ ID NO)。各肽通过硫氢键(“SS键”)的二聚化在各个半胱氨酸残基上表示为粉红色，而通过肽的羧基或胺基(形成胺键)的二聚化在涉及的残基上分别表示为蓝色和黄色。各肽存在连接体部分时，在该栏中详细标记为“连接体”。标记为“连接体-R”的栏表示该连接体上如果存在化学部分，则为R基。
定义
肽中非常规氨基酸缩写如下：1-萘基丙氨酸为1-nal或者Np；2-萘基丙氨酸为2-nal；N-甲基甘氨酸(也称作肌氨酸)为MeG、Sc或Sar；高丝氨酸甲基醚为Hsm；乙酰化甘氨酸(N-乙酰甘氨酸)为AcG。其他缩写词由下表提供。
本文所用的术语“多肽”或者“蛋白质”指通过酰胺键连接在一起的α氨基酸的氨基酸单体的聚合物。因此，多肽长为至少两个氨基酸残基，通常更长。通常，术语“肽”指长仅为几个氨基酸残基的多肽。本发明的新EPO-R激动剂肽优选长度不超过约50个氨基酸残基。它们更优选长为约14至约45个氨基酸残基。与肽相比，多肽可以含有任意数目的氨基酸残基。所以，术语多肽包括肽以及氨基酸的更长序列。
本文所用的短语“可药用的”指“通常认为安全”的分子实体和组合物，即当其施用于人时为生理上可耐受的并且通常不产生过敏或者类似的不良反应，如胃不适、眩晕等等。优选地，本文所用的术语“可药用的”指得到联邦或者州政府管理机构的批准，或者为美国药典或者其他公知的药典中所列出可用于动物，更尤其用于人。术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或者运载物。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。水或者水性溶液盐水溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液优选用作载体，尤其用于可注射溶液。适宜的药物载体在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。
如本文所用的术语“激动剂”指生物活性配体，其结合其互补生物活性受体并激活该受体，从而导致该受体中的生物应答或者增强该受体的现有生物活性。
本文使用的缩写如下表和说明书全文中所定义。
缩写   定义
[]2或[]2   指肽是二聚体
A或Ala   丙氨酸
C或Cys   半胱氨酸
D或Asp   天冬氨酸
E或Glu   谷氨酸
F或Phe   苯丙氨酸
G或Gly   甘氨酸
H或His   组氨酸
I或Ile   异亮氨酸
K或Lys   赖氨酸
L或Leu   亮氨酸
M或Met   甲硫氨酸
N或Asn   天冬酰胺
P或Pro   脯氨酸
Q或Gln   谷氨酰胺
R或Arg   精氨酸
S或Ser   丝氨酸
T或Thr   苏氨酸
V或Val   缬氨酸
W或Trp   色氨酸
Y或Tyr   酪氨酸
1/2IDA   IDA接头的片段
2Py   2-吡啶丙氨酸
3Py   3-吡啶丙氨酸
Acm   乙酰氨基甲基
Ahx   5-氨基己酸(5-氨基己酸)
All或Alloc   烯丙氧基羰基
Bal   b-丙氨酸(β-丙氨酸)
LCBio or LCBiotin   长链生物素
BL-1   分枝连接体1
Boc   叔丁基氧基羰基
Bpa   联苯丙氨酸
BTD   模拟二肽
  C(Ace)   半胱氨酸(乙酸)
  C(Acm)   具有Acm侧链保护的光胱氨酸
  C(StBu)   具有StBu侧链保护的光胱氨酸
  C12 or C12   C12脂肪酸(月桂酸，酰胺连接的)
  C18 or C18   C18脂肪酸(硬脂酸，酰胺连接的)
  unsat C18，C18unsator C18u C18不饱和脂肪酸(油醇)
  Cit   瓜氨酸
  CSH   具有游离巯基侧链的光胱氨酸
  Cxx   表示Cys侧链上的单独基团
D-Xxx   D型氨基酸Xxx，其中Xxx是任意氨基酸
  Dap   2，3-二氨基丙酸
  DBY   3，5-二溴酪氨酸
  DCA   二己酸连接物体
  DCF   3，5-二氯苯基丙氨酸
  DL-1   天冬氨酸连接体
  Dpa   二苯基丙氨酸
  EL-1   谷氨酸连接体
  F1＊ or F1   荧光素
  Fmoc   9-芴甲氧羰基
  Fur   呋喃甲基丙氨酸
GBal   甘氨酸-B-丙氨酸(当连接到Lys侧链时，Gly的C末端与Lys的侧链酰胺连接，Bal的C末端与Gly的酰胺连接)
  GP-1   Goalpost连接体1
  GP-2   Goalpost连接体2
  GP-3   Goalpost连接体3
  h(xx)   氨基酸之前的h表示高-氨基酸
  hCys   高半胱氨酸
  Hsm   高丝氨酸甲基醚
  IDA   亚氨基二乙酸连接体
  IDA-BL   连接IDA连接体的分枝的连接体
  Kxx or K(x)   表示Lys侧链上的单个基团
K(C12) or K(C12)   通过羧基连接至Lys侧链胺的C12脂肪酸
  Linker-R   表示连接体C末端上的基团
  M(O)   甲硫氨酸亚砜
  M(O2) or M(O2)   甲硫氨酸砜
  MP7 or MP7   MiniPEG(7个亚乙基二醇重复)
  M(x)   表示修饰的Met氨基酸
  1Nal   1-萘基丙氨酸
  2Nal   2-萘基丙氨酸
  Nap   萘普生
  Nle   亚亮氨酸
  paF   对氨基苯丙氨酸
  Pen   青霉胺(b，b-二甲基半胱氨酸)
  Ph   苯基
  PFF   甲苯基丙氨酸(4-甲基苯基丙氨酸)
  pFF   对氟苯基丙氨酸
  pIF   对碘苯基丙氨酸
  pNF   对硝基苯基丙氨酸
R(Pbf)   精氨酸，2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
  Sar   肌氨酸
  S(Bn)   丝氨酸二苄醚
  S(Bz)   丝氨酸苄基
  SM-1   Stickman连接体1
  SS   二硫链连接的二聚体
TAP   10原子PEG(2，2’-(亚乙二氧基(二(乙胺)))
  TBA   叔丁基丙氨酸(甲基-亮氨酸)
  Trt   三苯甲基
  Y(Me)   酪氨酸甲酯
  Y(phos)   磷酸化酪氨酸的羟基
另外，下面是更多的缩写及其相关的化学结构。
Figure A20058004622700151
Figure A20058004622700161
Figure A20058004622700171
Figure A20058004622700181
Figure A20058004622700191
Figure A20058004622700192
新肽是EPO-R激动剂
本发明涉及肽，其是EPO-R激动剂，并具有显著增强的效力和活性。这些肽激动剂长度优选为约14至约45个氨基酸。
本发明的肽可以是单体、同型或异型二聚体，或其他同型或异型多聚体(multimer)。术语“同型”指包含相同的单体，因此，例如本发明的同型二聚体是含有二个相同单体的肽。术语“异型”指包含不同的单体，因此，例如本发明的异型二聚体是含有二个不相同单体的肽。本发明的肽多聚体可以是三聚体、四聚体、五聚体或其他高级结构。此外，此类二聚体和其他多聚体可以是异型二聚体或异型多聚体。本发明的肽单体可以是降解产物(例如，甲硫氨酸的氧化产物，或脱酰氨的谷氨酰胺、aganine，以及C末端酰胺)。可以使用此类降解产物，并由此认为是本发明的部分。在优选实施方案中，本发明的异型多聚体包含均是EPO-R激动剂肽的多肽。在更优选的实施方案中，本发明的多聚体是同型多聚体，即，它们包含多个具有相同氨基酸序列的EPO-R激动剂肽。
因此，本发明还涉及EPO-R的同型或异型肽激动剂，其表现出显著增强的效力和活性。在优选实施方案中，本发明的二聚体包含均是EPO-R激动剂肽的两个肽。这些优选的二聚体肽激动剂包含两个肽单体，其中每个肽单体长度为约14至约45个氨基酸。在特别优选的实施方案中，本发明的二聚体包含具有相同氨基酸序列的两个EPO-R激动剂肽。
20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸，如a，a-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本发明化合物的适宜组分。非常规氨基酸的实例包括，但不限于：β-丙氨酸、3-吡啶丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、正亮氨酸，和其他相似的氨基酸和亚氨基酸。
也可能是其他修饰，包括氨基末端修饰、羧基末端修饰、一个或多个天然产生的遗传编码的氨基酸用非常规氨基酸替换、一个或多个氨基酸残基的侧链的修饰、肽磷酸化等等。优选的氨基末端修饰是乙酰化(例如，用乙酸或卤素取代的乙酸)。优选实施方案中N末端甘氨酸乙酰化为N-乙酰甘氨酸(AcG)。优选实施方案中C末端甘氨酸是N-甲基甘氨酸(MeG，也称作肌氨酸)。
在优选实施方案中，本发明的肽单体含有核心序列的两个半胱氨酸残基之间的分子内二硫键。
本发明还提供这些肽单体的缀合物。因此，根据优选的实施方案，本发明的单体肽二聚化或寡聚化，由此增强EPO-R激动剂活性。
在一个实施方案中，本发明的肽单体可使用生物素/链霉抗生物素蛋白系统寡聚化。肽单体的生物素化类似物可通过标准技术合成。例如，肽单体可以是C末端生物素化的。然后这些生物素化的单体通过用链霉抗生物素蛋白温育[例如，室温下，在磷酸缓冲盐溶液(PBS)或HEPES缓冲的RPMI培养基(Invitrogen)中以4∶1的摩尔比温育1小时]来寡聚化。在该实施方案的变通方案中，生物素化的单体可以通过和许多市售抗生物素抗体[例如，来自Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.(Washington，DC)的山羊抗生物素IgG]中的任一种温育来寡聚化。
优选实施方案中，本发明的肽单体通过与至少一个连接体部分共价连接来二聚化。连接体(LK)部分优选(虽然不是必须)是C1-12连接部分，其任选以一个或两个-NH-键结束，并任选在一个或多个可用的碳原子上被低级烷基取代基取代。连接体LK优选包含-NH-R-NH-，其中R是低级(C1-6)亚烷基，其被能够与另一个分子的部分(例如，可存在于固体支持物的表面)连接的官能团，例如羧基或氨基取代。最优选的连接体是赖氨酸残基或赖氨酸酰胺(其中羧基已转化成酰胺基-CONH2的赖氨酸残基)。优选的实施方案中，连接体通过同时连接每个肽单体的C末端氨基酸桥连两个肽单体的C末端。
例如，当C末端连接体LK是赖氨酸酰胺时，该二聚体结构性图解于式I，总结于式II：
  式I                                    式II
Figure A20058004622700211
在式I和式II中，N2代表赖氨酸的∈-氨基的氮原子，N1代表赖氨酸的α-氨基的氮原子。该二聚结构可以写作[肽]2Lys-酰胺以表示肽结合赖氨酸的α和∈氨基，或者写作[Ac-肽]2Lys-酰胺以表示N末端乙酰化肽结合赖氨酸的α和∈氨基，或者写作[Ac-肽，-二硫键]2Lys-酰胺以表示N末端乙酰化肽结合到赖氨酸的α和∈氨基，每个肽含有分子内二硫键环，或者写作[Ac-肽，二硫键]2Lys-间隔臂-PEG以表示N末端乙酰化肽结合赖氨酸的α和∈氨基，每个肽含有分子内二硫键环，并且间隔臂分子在赖氨酸的C末端和PEG部分之间形成共价键，或者[Ac-肽-Lys＊-NH2]2-亚氨酸二乙酸-N-(Boc-βAla)以表示具有C末端赖氨酸酰胺残基的N末端乙酰化肽的同型二聚体，其中赖氨酸的∈酰胺结合到亚氨基二乙酸的两个羧基的每一个并且其中Boc-β-丙氨酸通过酰胺键共价结合到亚氨基二乙酸的氮原子。
在另一实施方案中，聚乙二醇(PEG)可以作为二聚化两个肽单体的连接体LK：例如，一个PEG部分可以同时连接肽二聚体的两条肽链的N末端。
在另一实施方案中，连接体(LK)部分优选是(但不是必须的)一个分子，其含有两个羧酸，并且在一个和多个可利用的原子上用能够结合一个和多个PEG分子的额外的官能团(如胺)任选取代。这种分子可以描绘为：
-CO-(CH2)n-X-(CH2)m-CO-
其中n为0到10的整数，m为1到10的整数，X选自O、S、N(CH2)pNR1、NCO(CH2)pNR1和CHNR1，R1选自H、Boc、Cbz等等，p为1到10的整数。
在优选实施方案中，每个肽的一个氨基与连接体LK形成酰胺键。在尤其优选的实施方案中，结合连接体LK的肽的氨基是赖氨酸残基的∈胺或者N末端残基的α胺，或者任选的间隔臂分子的氨基。在尤其优选的实施方案中，n和m均为1，X为NCO(CH2)pNR1，p为2，R1为Boc。含有此类优选连接体的二聚EPO肽可以在结构上以式III表示。
式III
Figure A20058004622700221
任选地，可以除去Boc基团以释放活性氨基，其能够与适当激活的水溶性聚合物种类形成共价键，所述聚合物种类为例如，PEG种类，如mPEG-对-硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)和N-羟基琥珀酰亚胺-PEG(NHS-PEG)(参见，例如，美国专利号5,672,662)。含有此类优选的连接体的二聚EPO肽可以在结构上如式IV表示。
式IV
通常，尽管不是必须，肽二聚体将还含有肽单体的半胱氨酸残基之间的一个或多个分子内二硫键。优选地，两个单体含有至少一个分子内二硫键。最优选地，肽二聚体的两个单体均含有分子内二硫键，从而每个单体含有环状基团。
肽单体或二聚体可以还包含一个或多个间隔臂部分。此类间隔臂部分可以连接至肽单体或者肽二聚体。优选地，此类间隔臂部分连接至连接体LK部分，该LK部分连接肽二聚体的单体。例如，此类间隔臂部分可以通过赖氨酸连接体的羰基碳或者通过亚氨基二乙酸连接体的氮原子连接至肽二聚体。例如，此类间隔臂可以将肽二聚体的连接体连接至所连接的水溶性聚合物部分或者保护基。在另一实例中，此类间隔臂可以将肽单体连接至所附的水溶性聚合物部分。
在一个实施方案中，间隔臂部分是任选以-NH-键或者羧基(-COOH)基团结束的C1-12连接部分，其任选在一个或多个可利用的碳原子上用低级烷基取代基取代。在一个实施方案中，间隔臂是R-COOH，其中R是低级(C1-6)亚烷基，其任选用能够结合另一分子部分的官能团如羧基或氨基取代。例如，间隔臂可以是甘氨酸(G)残基，或者氨基己酸。在优选实施方案中，氨基己酸是6-氨基己酸(Ahx)。例如，当间隔臂6-氨基己酸(Ahx)结合肽的N末端时，肽末端胺基可以通过标准酰胺偶联连接至Ahx的羧基。在另一实施方案中，当Ahx结合肽的C末端时，Ahx的胺可以通过标准酰胺偶联连接至连接体的羧基。此类肽的结构可以如式V描绘，并且在图VI中概述。
式V                                                           式VI
Figure A20058004622700241
在其他实施方案中，间隔臂是-NH-R-NH-，其中R是低级(C1-6)亚烷基，其任选用能够使得结合另一分子部分的官能团如羧基或氨基取代。例如，间隔臂可以是赖氨酸(K)残基或者赖氨酸酰胺(K-NH2，其中羧基已经转化成酰胺部分-CONH2的赖氨酸残基)。
在优选实施方案中，间隔臂部分具有下面的结构：
-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)∈-Y-
其中α、β、γ、δ和∈每个都是整数，它们的值独立地选择。在优选实施方案中，α、β和∈每个都是整数，它们的值独立地选自1至约6，δ为0或1，γ为选自0至约10的整数，只是当γ大于1时，β为2，Y选自NH或CO。在尤其优选的实施方案中，α、β和∈每个都等于2，γ和δ都等于1，Y为NH。例如，含有此类间隔臂的肽二聚体在式VII中图示，其中连接体是赖氨酸并且间隔臂将连接体连接至Boc保护基。
式VII
Figure A20058004622700242
在另一尤其优选的实施方案中，γ和δ为0，α和∈相加等于5，Y为CO。
在尤其优选的实施方案中，连接体加上间隔臂部分具有式VIII或式IX中所示的结构。
式VIII                                                式IX
Figure A20058004622700243
本发明的肽单体、二聚体、或者多聚体可以还包含一种或多种水溶性聚合物部分。优选地，这些聚合物共价连接本发明的肽化合物。优选地，对于终产物制备物的治疗用途，所述聚合物将是可药用的。本领域技术人员将能够基于如该聚合物-肽缀合物是否用于治疗，和如果用于治疗，那么所希望的剂量、循环时间、对蛋白酶解的抗性的这类考虑，以及其他考虑来选择所希望的聚合物。水溶性聚合物可以是例如，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(例如，均聚物或者无规共聚物)、聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物和聚氧乙烯化多元醇。优选的水溶性聚合物是PEG。
聚合物可以是任意分子量，并且可以是分支或非分支的。用于本发明的优选的PEG包含线性未分支的PEG，其分子量大于10千道尔顿(kD)，更优选分子量为约20到60kD。更优选地，所述线性未分支的PEG部分具有约20到40kD的分子量，尤其优选20kD PEG。应该理解在给定PEG制备物中，各分子之间分子量通常不同。某些分子比所述分子量大，某些分子比所述分子量小。此类变化通常通过使用“约”反映以描述PEG分子的分子量。
连接的聚合物分子数目可以改变；例如，1、2、3或更多水溶性聚合物可以连接至本发明的EPO-R激动剂肽。多个连接的聚合物可以是相同或者不同的化学部分(例如，不同分子量的PEG)。从而，在优选实施方案中，本发明期待连接两个或多个PEG部分的EPO-R激动剂肽。优选地，两个PEG部分都是线性未分支的PEG，每个PEG优选具有约10至约60kD的分子量。更优选地，每个线性未分支的PEG部分具有约20到40kD的分子量，尤其优选约20到30kD的分子量，进一步优选每个线性PEG部分的分子量约20kD。然而，在这些实施方案中还期待PEG的其他分子量。例如，本发明期待并且包括连接两个或多个线性未分支的PEG部分的EPO-R激动剂肽，至少一个或两个PEG具有约20到40kD或约20到30kD的分子量。在其他实施方案中，本发明期待并且包括连接两个或多个线性未分支的PEG部分的EPO-R激动剂肽，至少一个PEG具有约40到60kD的分子量。
在一个实施方案中，PEG可以作为二聚化两个肽单体的连接体。在一个实施方案中，PEG连接至肽单体或者二聚体的至少一个末端(N末端或C末端)。在另一实施方案中，PEG连接至肽单体或者二聚体的间隔臂部分。在优选实施方案中，PEG连接至肽二聚体的连接体部分。在高度优选的实施方案中，PEG连接至间隔臂部分，其中所述间隔臂部分连接至连接体LK部分，该LK部分连接肽二聚体的单体。在尤其优选的实施方案中，PEG连接至间隔臂部分，其中所述间隔臂部分通过赖氨酸连接体的羰基碳或者赖氨酸酰胺连接体的酰胺氮连接至肽二聚体。
本发明包含的肽和肽序列包括图1A-1K中所示的肽单体和二聚体。为了方便起见，那些图中图示的各个肽和肽序列在本文中参考图1A-1K最左手一栏给出的序列识别号(SEQ ID NO)描述。
本发明的肽序列可以单独存在或者结合肽链的N末端和/或C末端延伸(extension)存在。此类延伸可以是天然编码的肽序列，其任选具有或者基本上没有非天然产生的序列；该延伸可以包括任意加入、缺失、点突变或者本领域技术人员所希望的其他序列修饰或者组合。例如并且不限于，天然产生的序列可以是全长或者部分长度，并且可以包括氨基酸替换以提供糖类、PEG、其他聚合物等通过侧链缀合连接的位点。在变通方案中，氨基酸替换导致序列的人源化，以便其与人免疫系统相容。提供了所有类型的融合蛋白质，包括与有或者没有非免疫球蛋白间隔臂序列的本发明的EPO-R活化序列相邻或者接近的免疫球蛋白序列。一种实施方案是免疫球蛋白链，其具有代替重链和/或轻链的可变(V)区的EPO-R活化序列。
制备本发明的肽化合物：
肽合成
通过本领域已知的经典方法可以制备本发明的肽。这些标准方法包括完全固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成以及重组DNA技术[参见，例如，Merrifield J.Am.Chem.Soc.1963 85：2149]。
在一个实施方案中，分别合成肽二聚体的肽单体并在合成后二聚化。在优选实施方案中，二聚体的肽单体具有相同的氨基酸序列。
在尤其优选的实施方案中，二聚体的肽单体经由它们的C末端通过连接体LK部分连接，所述LK部分具有能够作为肽合成的起始位点的两个官能团和能够结合另一分子部分(例如，可以存在于固相支持物的表面上)的第三个官能团(例如，羧基或者氨基)。在该情况中，可以以固相合成技术的变通方案，直接在连接体LK部分的两个活性氮基团上合成两个肽单体。此类合成可以是顺次的或者同时的。
当进行将二聚体的肽链顺次合成到连接体上时，用两个不同的可以独立(orthogonally)除去的胺保护基保护连接体分子上的两个胺官能团。在优选实施方案中，受保护的二胺是受保护的赖氨酸。受保护的连接体通过该连接体的第三个官能团偶联到固相支持物上。除去第一个胺保护基，并在第一个去保护的胺部分上合成二聚体的第一个肽。然后除去第二个胺保护基，并在第二个去保护的胺部分上合成二聚体的第二个肽。例如，可以用Alloc保护连接体的第一个氨基部分，用Fmoc保护第二个氨基部分。在该情况下，可以用弱碱[例如，二甲基甲酰胺[DMF]中的20％哌啶]处理除去Fmoc基(但不是Alloc基)，并合成第一条肽链。之后，可以用适宜的试剂[例如，Pd(PPh3)/4-甲基吗啉和氯仿]除去Alloc基，并合成第二条肽链。该技术可以用于产生二聚体，其中两条肽链的序列相同或不同。注意到将对半胱氨酸使用不同的硫羟保护基以控制二硫键形成(如下文讨论)，甚至当二聚体的肽链的最后氨基酸序列相同时也必须使用该技术。
当将二聚体的肽链同时合成到连接体上时，可以用相同的可除去的胺保护基保护连接体分子的两个胺官能团。在优选实施方案中，受保护的二胺是受保护的赖氨酸。通过连接体的第三个官能团将受保护的连接体偶联到固相支持物上。在该情况中，连接体分子的两个受保护的官能团同时去保护，并在去保护的胺上同时合成两条肽链。注意到使用该技术，二聚体的肽链的序列将相同，并且半胱氨酸残基的硫羟保护基都是相同的。
肽合成的优选方法是固相合成。固相肽合成方法是本领域公知的[参见，例如，Stewart Solid Phase Peptide Syntheses(Freeman和同事：SanFrancisco)1969；Novabiochem Corp，San Diego，美国的2002/2003通用目录；Goodman Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(Houben-Weyl，Stuttgart)2002]。在固相合成中，通常使用α-氨基受保护的树脂从肽的C末端开始合成。例如，通过将所需的α-氨基酸连接至氯甲基化树脂、羟甲基树脂、聚苯乙烯树脂、二苯甲基胺树脂等等可以制备适宜的起始材料。一种此类氯甲基化树脂由Bio Rad Laboratories(Richmond，CA)以商标名BIO-BEADS SX-1出售。已经描述了羟甲基树脂的制备[Bodonszky等人(1966)Chem.Ind.London 38：1597]。已经描述了二苯甲基胺(BHA)树脂[Pietta和Marshall(1970)Chem.Commun.65]，并且可以从BeckmanInstruments，Inc.(Palo Alto，CA)通过商业途径获得所述树脂的氯化氢形式。例如，通过利用碳酸氢铯催化剂，根据Gisin(1973)Helv.Chim.Acta 56：1467描述的方法可以将α-氨基受保护的氨基酸偶联到氯甲基化树脂。
最初偶联后，例如，使用三氟乙酸(TFA)或者氢氯酸(HCl)在有机溶剂中的溶液在室温下除去α-氨基保护基。之后，将α-氨基受保护的氨基酸连续偶联到增长的支持物结合的肽链上。α-氨基保护基是肽的逐步合成领域中公知的那些，包括：酰基型保护基(例如，甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳香尿烷型保护基[例如，苄氧基羰基(Cbz)和取代的Cbz]、脂肪族尿烷保护基[例如，叔丁氧基羰基(Boc)、异丙氧基羰基、环己基氧基羰基]以及烷基型保护基(例如，苄基、三苯基甲基)、芴基甲氧基羰基(Fmoc)、烯丙氧基羰基(Alloc)和1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己(dioxocyclohex)-1-叉基)乙基(Dde)。
侧链保护基(通常醚、酯、三苯甲基、PMC(2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氢呋喃-6-磺酰基)等等)在偶联期间保持完整并且在氨基末端保护基的去保护期间或者偶联期间不裂解。该侧链保护基必须在最终肽的合成完成时和在将不改变靶肽的反应条件下是可以除去的。Tyr的侧链保护基包括四氢吡喃基、叔丁基、三苯甲基、苄基、Cbz、Z-Br-Cbz和2，5-二氯苄基。Asp的侧链保护基包括苄基、2，6-二氯苄基、甲基、乙基和环己基。Thr和Ser的侧链保护基包括乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基、四氢吡喃基、苄基、2，6-二氯苄基和Cbz。Arg的侧链保护基包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金刚烷氧基羰基酰磺酰基(Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)或者Boc。Lys的侧链保护基包括Cbz、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Cbz)、2-溴代苄氧基羰基(2-Br-Cbz)、Tos或者Boc。
除去α-氨基保护基后，以所希望的顺序逐步偶联剩余的受保护氨基酸。每种受保护的氨基酸通常以约3倍过量反应，使用适宜的羰基激活剂，如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3四甲基尿六氟磷酸盐(HBTU)或者二环己基碳二亚胺(DCC)的溶液，例如，在二氯甲烷(CH2Cl2)、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺(DMF)或者它们的混合物的溶液。
完成所希望的氨基酸序列后，通过用不仅从树脂切下肽而且切除所有剩余的侧链保护基的试剂，如三氟乙酸(TFA)或者氟化氢(HF)处理从树脂支持物解偶联所希望的肽。当使用氯甲基化树脂时，氟化氢处理导致形成游离肽酸。当使用二苯甲基胺树脂时，氟化氢处理直接形成游离肽酰胺。备选地，当使用氟甲基化树脂时，通过用氨处理肽树脂可以解偶联侧链受保护的肽，得到所希望的侧链受保护的酰胺，或者用烷基胺处理得到侧链受保护的烷基酰胺或者二烷基酰胺。然后以常用的方式通过用氟化氢处理除去侧链保护，得到游离酰胺、烷基酰胺或者二烷基酰胺。在本发明酯的制备中，使用用于制备肽酸的树脂，并用碱和适宜的醇(例如，甲醇)切割侧链受保护的肽。然后以常用的方式通过用氟化氢处理除去侧链保护基，得到所希望的酯。
这些方法也可以用于合成肽，其中任一本发明化合物的一个、两个或多个位置上用20种天然产生的遗传编码的氨基酸之外的氨基酸替换。可以替换至本发明肽的合成氨基酸包括，但不限于，N-甲基、L-羟丙基、L-3，4-二羟基苯丙氨酰基δ氨基酸，如L-δ-羟基赖氨酰和D-δ-甲基丙氨酰、L-α-甲基丙氨酰，β氨基酸和异喹啉基。D-氨基酸和非天然产生的合成氨基酸也可以掺入到本发明的肽中。
肽修饰
还可以修饰本发明肽化合物的氨基和/或羧基末端以产生本发明的其他化合物。氨基末端修饰包括甲基化(即，-NHCH3或者-N(CH3)2)、乙酰化(例如，用乙酸或者其卤化衍生物，如α-氯乙酸、α-溴乙酸、α-碘乙酸)、加入苄氧基羰基(Cbz)，或者用任意保护基团封闭氨基末端，所述保护基团含有RCOO-定义的羧化物官能度或者R-SO2-定义的磺酰官能度，其中R选自烷基、芳基、杂芳基、烷基芳基等等及类似基团。还可以在N末端掺入脱氨基酸(从而没有N末端氨基)以降低对蛋白酶的敏感性或者限制肽化合物的构象。在优选实施方案中，N末端被乙酰化。在最优选的实施方案中，乙酰化N末端甘氨酸以产生N-乙酰甘氨酸(AcG)。
羧基末端修饰包括用氨甲酰基取代游离酸或者在羧基末端形成环状内酰胺以导入结构限制。还可以环化本发明的肽，或者在肽的末端掺入脱氨基残基或者脱羧基残基，从而没有末端氨基或者末端羧基，从而降低对蛋白酶的敏感性或者限制肽的构象。本发明化合物的C末端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基，和羧基，和它们的低级酯衍生物，和其可药用的盐。
可以将20种遗传编码的氨基酸(或者立体异构的D型氨基酸)的天然产生的侧链用其他侧链取代，所述其他侧链为例如，烷基、低级烷基、4-、5-、6-到7-元环状烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基，和它们的低级酯衍生物，和4-、5-、6-到7-元杂环。具体地，可以使用脯氨酸类似物，其中脯氨酸残基的环大小从5元改变到4、6或7元。环状基团可以是饱和的或不饱和的，如果饱和，可以是芳族或者非芳族的。杂环基团优选含有一个或多个氮、氧和/或硫杂原子。此类基团的实例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异唑基、吗啉基(例如，吗啉代)、唑基、哌嗪基(例如，1-哌嗪基)、哌啶基(例如，1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如，硫代吗啉代)和三唑基。这些杂环基团可以是取代或未取代的。当基团被取代时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧，或者取代或未取代的苯基。
可以通过磷酸化和其他方法(例如，如Hruby等人(1990)BiochemJ.268：249-262中描述]修饰肽。
本发明的肽化合物还可以作为具有相似生物活性的非肽化合物的结构模型。本领域技术人员认识到可以用多种技术构建具有与前导肽化合物相同或相似的目的生物活性的化合物，但是它们在溶解性、稳定性和对水解和蛋白水解方面比前导肽化合物具有更有利的活性[参见，Morgan和Gainor(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24：243-252]。这些技术包括用由膦酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸组成的主链替换肽主链。
二硫键的形成
本发明的化合物可以含有一个或多个分子内二硫键。在一个实施方案中，肽单体或者二聚体包含至少一个分子内二硫键。在优选实施方案中，肽二聚体包含两个分子内二硫键。
可以通过氧化肽核心序列的半胱氨酸残基形成此类二硫键。在一个实施方案中，通过选择氧化剂的类型和浓度有效优化目的异构体的形成来进行半胱氨酸键形成的控制。例如，当氧化剂是DMSO时，优先实现肽二聚体的氧化以形成两个分子内二硫键(每条肽链上一个二硫键)(比分子间二硫键形成优先)。
在优选实施方案中，通过在肽合成期间选择性使用硫羟-保护基控制半胱氨酸键的形成。例如，当希望具有两个分子内二硫键的二聚体时，合成第一条单体肽，其中核心序列的两个半胱氨酸残基用第一种硫羟保护基[例如，三苯甲基(Trt)、烯丙氧基羰基(Alloc)，和1-(4，4-二甲基-2，6-二环己-1-叉基)乙基(Dde)等等]保护，然后合成第二条单体肽，其中核心序列的两个半胱氨酸残基用不同于第一种硫羟保护基的第二种硫羟保护基[乙酰氨基甲基(Acm)、叔丁基(tBu)等等]保护。之后，除去影响第一个单体的二硫键环化的第一种硫羟保护基，然后除去影响第二个单体的二硫键环化的第二种硫羟保护基。
本发明的其他实施方案提供了这些二硫键衍生物的类似物，其中一个硫已被CH2基或者硫的其他isotere替换。可以从本发明的化合物制备这些类似物，其中每个核心序列含有至少一个C或者高半胱氨酸残基和α-氨基-γ-丁酸代替第二个C残基，所述代替是使用本领域已知的方法[参见，例如，Barker等人(1992)J.Med.Chem.35：2040-2048和Or等人(1991)J.Org.Chem.56：3146-3149]的分子内或者分子间替换。本领域技术人员将易于理解使用α-氨基-γ-丁酸和高半胱氨酸的其他同系物也可以进行代替。
除了前面的环化策略，还可以使用其他非二硫化肽环化策略。此类备选环化策略包括例如，酰胺环化策略以及包括形成硫醚键的策略。从而，本发明的化合物可以以具有分子内酰胺键或者分子内硫醚键的环化形式存在。例如，可以合成这样的肽，其中用赖氨酸代替核心序列的一个半胱氨酸，用谷氨酸代替另一个半胱氨酸。之后，通过这两个残基的侧链间的酰胺键可以形成环状单体。备选地，可以合成这样的肽，其中用赖氨酸代替核心序列的一个半胱氨酸。然后可以通过赖氨酸残基的侧链和核心序列的第二个半胱氨酸残基之间的硫醚键形成环状单体。同样地，除了二硫键环化策略，可以容易地使用酰胺环化策略和硫醚环化策略以环化本发明的化合物。备选地，可以用α-取代的乙酸帽化肽的氨基末端，其中α取代基为离去基团，如α-卤乙酸，例如，α-氯乙酸、α-溴乙酸或者α-碘乙酸。
加入连接体
包括下面的描述，美国专利申请序号10/844,933和2004年5月12日提交的国际专利申请号PCT/US04/14887在此全部引入作为参考。
在其中通过连接体LK部分二聚化肽二聚体的实施方案中，可以在肽合成期间将所述连接体掺入到肽中。例如，当连接体LK部分含有两个能够作为肽合成起始位点的官能团和能够结合另一分子部分的第三个官能团(例如，羧基或者氨基)时，可以将连接体缀合至固相支持物。之后，在固相合成技术的变通方案中，可以将两个肽单体直接合成到连接体LK部分的两个活性氮基团上。
在备选实施方案中，当通过连接体LK部分二聚化肽二聚体时，肽合成后，所述连接体可以缀合至肽二聚体的两个肽单体。通过本领域成熟的方法可以实现此类缀合。在一个实施方案中，连接体含有适于连接至合成的肽单体的靶官能团的至少两个官能团。例如，具有两个游离胺基的连接体可以与两个肽单体的每一个的C末端羧基反应。在另一实例中，预活化或者在适宜偶联试剂存在下，含有两个羧基的连接体可以与两个肽单体的每一个的N末端或者侧链胺基或者C末端赖氨酸酰胺反应。
加入间隔臂
在其中肽化合物含有间隔臂部分的实施方案中，肽合成期间所述间隔臂可以掺入到肽中。例如，当间隔臂含有游离氨基和能够结合另一分子部分的第二个官能团(例如，羧基或氨基)时，可以将间隔臂缀合至固相支持物。之后，通过标准固相技术可以在间隔臂的游离氨基上直接合成肽。
在优选实施方案中，含有两个官能团的间隔臂首先通过第一个官能团偶联固相支持物。接着，具有能够作为肽合成起始位点的两个官能团和能够结合另一分子部分的第三个官能团(例如，羧基或氨基)的连接体LK部分通过间隔臂的第二个官能团和连接体的第三个官能团缀合至间隔臂。之后，以固相合成技术的变通方案，可以将两个肽单体直接合成到连接体LK部分的两个活性氮基团上。例如，具有游离胺基的固相支持物偶联的间隔臂可以通过连接体的游离羧基与赖氨酸连接体反应。
在备选实施方案中，当肽化合物含有间隔臂部分时，可以在肽合成后将所述间隔臂缀合至肽。可以用本领域成熟的方法实施所述缀合。在一个实施方案中，连接体含有适于连接所合成的肽的靶官能团的至少一个官能团。例如，具有游离胺基的间隔臂可以与肽的C末端羧基反应。在另一实施方案中，具有游离羧基的连接体可以与肽的N末端的或者赖氨酸残基的游离胺基反应。在另一实例中，通过氧化形成二硫键可以将含有游离巯基的间隔臂缀合至肽的半胱氨酸残基。
连接水溶性聚合物
近年来，水溶性聚合物，如聚乙二醇(PEG)，已经用于具有治疗和诊断重要性的肽的共价修饰。认为此类聚合物的连接增强生物活性、延长血液循环时间、降低免疫原性、增加水溶性并增强对蛋白酶消化的抵抗。例如，已经报导共价连接PEG至治疗性多肽如白介素[Knauf等人(1988)J.Biol.Chem.263；15064；Tsutsumi等人(1995)J.Controlled Release 33：447)、干扰素(Kita等人(1990)Drug Des.Delivery 6：157)、过氧化氢酶(Abuchowski等人(1977)J.Biol.Chem.252：582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp等人(1983)Anal.Biochem.131：25)和腺苷脱氨酶(Chen等人(1981)Biochim.Biophy.Acta 660：293)，以延长了它们的体内半寿期和/或降低了它们的免疫原性和抗原性。
本发明的肽化合物还可以包含一个或多个水溶性聚合物部分。优选地，这些聚合物共价连接至肽化合物。水溶性聚合物可以为例如，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(例如，均聚物或者无规共聚物)、聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物和聚氧乙烯化多元醇。优选的水溶性聚合物是PEG。
使用将水溶性聚合物连接至分子的受体结合部分(例如，肽+间隔臂)的多种化学方法的任意一种可以将本发明的肽、肽二聚体和其他基于肽的分子连接至水溶性聚合物(例如，PEG)。典型的实施方案利用一个连接接头将水溶性聚合物共价连接至受体结合部分，然而，在备选实施方案中，可以使用多个连接接头，该实施方案包括其他变通方案，其中不同种类的水溶性聚合物连接至不同连接接头处的受体结合部分，所述接头可以包括连接间隔臂和/或一个或多个肽链的共价连接接头。在一些实施方案中，二聚体或者更高级多聚体将包含不同种类的肽链(即，异型二聚体或者其他异型多聚体)。作为实例并且不限制，二聚体可以包含具有PEG连接接头的第一条肽链和缺少PEG连接接头或者利用不同于第一条肽链的连接相互作用的第二条肽链，在一些变通方案中，间隔臂可以包含或者缺乏PEG连接接头和所述间隔臂，如果被PEG化，可以利用不同于第一和/或第二条肽链的连接相互作用。备选实施方案利用连接至受体结合部分的间隔臂部分的PEG和缀合至所述分子的肽部分的氨基酸之一的侧链的不同水溶性聚合物(例如，糖类)。
多种聚乙二醇(PEG)种类可以用于PEG化受体结合部分(肽+间隔臂)。基本上可以使用任意适宜的反应性PEG试剂。在优选实施方案中，反应性PEG试剂将导致缀合至受体结合部分时形成氨基甲酸酯或者酰胺键。适宜的反应性PEG种类包括，但不限于，可以在NOF Corporation(Yebisu Garden Place Tower，20-3 Ebisu 4-chome，Shibuya-ku，Tokyo150-6019)的Drug Delivery Systems目录(2003)和Nektar Therapeutics(490Discovery Drive，Huntsville，Alabama 35806)的Molecular Engineering目录(2003)中出售的那些种类。例如并且不限于下面的PEG试剂通常是多种实施方案中优选的：mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、多-Arm PEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-Double Esters、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、杂官能PEGs(NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷脂(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITE系列的多臂PEGs，其包括本领域技术人员所选化学活化的基于甘油的PEG的GL序列，任意一种SUNBRITE活化的PEG(包括但不限于羧基-PEG、p-NP-PEG、Tresyl-PEG、醛PEG、缩醛-PEG、氨基-PEG、硫醇-PEG、马来酰亚胺-PEG、羟基-PEG-胺、氨基-PEG-COOH、羟基-PEG-醛、羧酸酐型-PEG、官能化PEG-磷脂，和本领域技术人员选择用于他们的特定应用和习惯的其他类似和/或适宜的反应性PEG。
所述聚合物可以是任意分子量，并且可以是分支或不分支的。用于本发明的优选的PEG包含分子量为约20千道尔顿(kD或kDa)至约40KD的线性不分支的PEG(术语“约”指在PEG的制备物中，某些分子将具有大于所述的分子量，有些分子具有小于所述的分子量)。最优选地，PEG具有约30KD至约40KD的分子量。可以使用其他大小，这取决于所希望的治疗态度(例如，所希望的持续释放时间；对生物活性的影响(如果存在)、处理的容易性、抗原性程度或者抗原性的缺乏；以及PEG对治疗肽的其他已知的影响)。
所连接的聚合物分子的数目可以改变，例如，1、2、3或更多水溶性聚合物可以连接至本发明的EPO-R激动剂肽。多个所连接的聚合物可以是相同或不同的化学部分(例如，不同分子量的PEG)。在一些情况中，聚合物连接的程度(连接至肽的聚合物部分的数目和/或聚合物连接的肽的总数)受到连接反应中聚合物分子与肽分子的比例的影响，以及受到反应混合物中每一种的总浓度的影响。通常，最佳聚合物对肽的比例(按照不提供过量未反应的肽和/或聚合物部分的反应效率)将由如下因素决定，这些因素为诸如所希望的聚合物的连接程度(例如，单、二-、三-等等)、所选聚合物的分子量、聚合物是分支的还是未分支的，和具体连接方法的反应条件。
在优选实施方案中，共价连接的水溶性聚合物是PEG。为了示例目的，下面描述共价连接PEG(PEG化)的方法的实例。这些示例性描述不意在限制。本领域技术人员将理解多种水溶性聚合物的多种共价连接方法是本领域成熟的。同样，本发明包括通过本领域已知的多种连接方法中的任一种连接的本领域已知的多种水溶性聚合物中的任一种的肽化合物。
在一个实施方案中，PEG可以作为二聚化肽两个单体的连接体。在一个实施方案中，PEG连接至肽单体或二聚体的至少一个末端(N末端或C末端)。在另一实施方案中，PEG连接至肽单体或者二聚体的间隔臂部分。在优选实施方案中，PEG连接至肽二聚体的连接体部分。在高度优选的实施方案中，PEG连接至间隔臂部分，其中所述间隔臂部分连接至连接体LK部分，该LK部分连接肽二聚体的单体。最优选地，PEG连接至间隔臂部分，其中所述间隔臂部分通过赖氨酸连接体的羰基碳或者赖氨酸酰胺连接体的酰胺氮连接至肽二聚体。
本领域技术人员可以利用多种PEG连接方法[参见，例如，Goodson等人(1990)Bio/Technology 8：343(PEGylation of interleukin-2 at itsglycosylation site after site-directed mutagenesis)；EP 0 401 384(couplingPEG to G-CSF)；Malik等人，(1992)Exp.Hematol.20：1028-1035(PEGylation of GM-CSF using tresyl chloride)；PCT公开号WO90/12874(PEGylation of erythropoietin containing a recombinantly introducedcysteine residue using a cysteine-specific mPEG derivative)；美国专利号5,757,078(PEGylation of EPO peptides)；及美国专利号6,077,939(PEGylation of an N-terminal α-carbon of a peptide)]。
例如，PEG可以通过反应基共价结合氨基酸残基。反应基为活化的PEG分子可以结合的基团(例如，游离氨基或羧基)。例如，N末端氨基酸残基和赖氨酸(K)残基具有游离氨基；C末端氨基酸具有游离羧基。巯基(例如，半胱氨酸残基中存在的)也可以用作连接PEG的反应基。此外，已经描述了用于特别在多肽的C末端特异引入活化基团(例如，酰肼、醛和芳香族氨基)的酶辅助方法[Schwarz等人(1990)Methods Enzymol.184：160；Rose等人(1991)Bioconjugate Chem.2：154；Gaertner等人(1994)J.Biol.Chem.269：7224]。
例如，使用具有不同反应部分的甲氧基化PEG(“mPEG”)可以将PEG分子连接至肽氨基。此类聚合物包括mPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯、mPEG-亚胺酯、mPEG4-硝基苯基碳酸酯和mPEG-氰尿酰氯。类似地，使用具有游离胺基的甲氧基化PEG(mPEG-NH2)可以将PEG分子连接至肽羧基。
当PEG的连接不是特异的并且希望包含特异PEG连接的肽时，可以从PEG化化合物的混合物中纯化目的PEG化化合物。例如，如果希望N末端PEG化的肽，那么可以从随机PEG化肽群体中纯化N末端PEG化的形式(即，从其他单PEG化部分分离该部分)。
在优选实施方案中，PEG位点特异地连接至肽。通过固相合成已经进行了在生长激素释放因子的有效类似物的N末端、侧链和C末端进行位点特异PEG化[Felix等人(1995)Int.J.Peptide Protein Res.46：253]。另一种位点特异方法包括通过N末端苏氨酸的高碘酸钠氧化产生的N末端的反应性醛基，以位点特异的方式将肽连接至脂质体表面嫁接的PEG链的末端[Zalipsky等人(1995)Bioconj.Chem.6：705]。然而，该方法局限于具有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的多肽。在Wei等人的美国专利号6,077,939中描述了通过腙、还原的腙、肟或者还原的肟键对肽的N末端PEG化的另一种位点特异性方法。
在一个方法中，通过还原性烷基化可以实现选择性N末端PEG化，还原性烷基化利用特定蛋白质中可用于衍生的伯氨基(赖氨酸对N末端)的不同类型的差别反应性。在适宜的反应条件下，含有羰基的PEG选择性连接至肽的N末端。例如，通过在一定pH下进行反应可以选择的是N末端PEG化的蛋白质，所述反应利用赖氨酸残基的∈-氨基和肽的N末端残基的α-氨基之间的pKa差异。通过这种选择性连接，主要在蛋白质的N末端发生PEG化，而不明显修饰其他反应基(例如，赖氨酸侧链氨基)。使用还原性烷基化，PEG应该具有用于偶联蛋白质的一种反应性醛(例如，可以使用PEG proprionaldehyde)。
位点特异性诱变是可用于制备用于位点特异性聚合物连接的肽的另一种方法。通过该方法，肽的氨基酸序列设计成在肽内的目的位置上掺入适宜的反应基。例如，WO 90/12874描述了蛋白质的位点定向PEG化，所述蛋白质通过插入半胱氨酸残基或者用半胱氨酸残基替换其他残基修饰。该公开还描述通过将半胱氨酸特异性mPEG衍生物与EPO上重组导入的半胱氨酸残基反应制备mPEG-红细胞生成素(“mPEG-EPO”)。
当PEG部分连接至间隔臂部分或者连接体部分时，可以使用类似的连接方法。在该情况中，连接体或者间隔臂含有反应基并且含有适宜的补充反应基的活化的PEG分子用于实现共价连接。在优选实施方案中，连接体或者间隔臂反应基含有末端氨基(即，位于连接体或者间隔臂的末端)，其与适宜活化的PEG分子反应产生稳定的共价键，如酰胺或者氨基甲酸酯。适宜的活化PEG种类包括，但不限于，mPEG-对-硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG-SC)和mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)。在其他优选的实施方案中，连接体或者间隔臂反应基含有羧基，其在适宜的反应条件下能够被活化而与含有胺的PEG分子形成共价键。适宜的PEG分子包括mPEG-NH2，适宜的反应条件包括碳二亚胺介导的酰胺形成等等。
EPO-R激动剂活性测定：
可用本领域已知的多种方法中的任一种测定本发明多种肽化合物(例如，EPO-R激动剂)的生物活性。参见，例如2004年5月12日提交的国际专利申请号PCT/US04/14886。本文还描述了若干优选的测试的非限定性实例。
体外功能性测定
体外竞争性结合测定法定量受试肽与EPO竞争性结合EPO-R的能力。例如(参见，例如，美国专利5,773,569中描述)，人EPO-R的细胞外结构域(EPO结合蛋白质，EBP)可以在大肠杆菌(E.coli)中重组产生，并将重组蛋白质偶联到固相支持物，如微量滴定皿或者合成珠[例如，Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)的Sulfolink珠]。然后将固定的EBP与标记的重组EPO或者标记的重组EPO和受试肽温育。受试肽的连续稀释液用于此类实验。没有加入受试肽的测定点定义了EPO对EBP的总的结合。对于含有受试肽的反应物，结合的EPO的量经定量并表达为对照(总的＝ 100％)结合的百分数。这些值对肽浓度作图。IC50值定义为使EPO对EBP的结合减小50％(即，EPO结合的50％抑制)的受试肽的浓度。
一种不同的体外竞争性结合测定法测量光信号作为两种珠子：缀合EPO的珠子和缀合EPO-R的珠子的接近性的函数产生。通过EPO与EPO-R的结合产生珠子接近性。与EPO竞争性结合EPO-R的受试肽将防止该结合，导致光发射的降低。导致光发射降低50％的受试肽的浓度定义为IC50值。
可以使用体外基于细胞的功能性测定法测量特异结合EPO受体的本发明的单体和二聚体肽EPO-R激动剂的生物活性和效力。
一种测定法基于鼠前-B-细胞系，其表达人EPO-R并且还用fos-启动子驱动的萤光素酶报道基因构建体转染。当暴露于EPO或者另一种EPO-R激动剂时，此类细胞通过合成萤光素酶应答。萤光素酶导致加入其底物萤光素时发光。从而，通过测量萤光素酶活性可以定量此类细胞中EPO-R活化的水平。通过向细胞加入受试肽的连续稀释液，然后孵育细胞4小时来测量受试肽的活性。孵育后，向细胞加入萤光素底物，并测量发光。导致半最大光发射的受试肽浓度记录为EC50。
可以使用FDC-P1/ER细胞[Dexter等人(1980)J.Exp.Med.152：1036-1047]进行另一种测定法，FDC-P1/ER细胞是良好表征的非转化的鼠骨髓来源的细胞系，其已经用EPO-R稳定转染。这些细胞表现出EPO-依赖性增殖。
在一种此类测定法中，在必需生长因子(参见，例如，美国专利5,773,569中描述)的存在下，细胞生长到半稳定密度。然后在PBS中洗涤细胞并在没有生长因子的完全培养基中饥饿16-24小时。测定细胞的生存力后(通过锥虫蓝染色)，制备贮存液(用没有生长因子的完全培养基)，得至约105个细胞/50μL。在96孔组织培养板中以每孔50μL的终体积测试肽EPO-R激动剂化合物的连续稀释液(通常游离的溶液相肽与结合噬菌体或者结合其他物质或固定化的肽相反)。向每孔加入细胞(50μL)并孵育细胞24-48小时，此时阴性对照将死亡或者休眠。然后通过本领域已知的技术(如测量指示细胞增殖的H3胸苷掺入的MTT测定法)测量细胞增殖[参见Mosmann(1983)J.Immunol.Methods 65：55-63]。对表达EPO-R的细胞系和不表达的亲代细胞系评估肽。产生最大细胞增殖一半所需的受试肽的浓度记录为EC50。
在另一测定中，在补充了EPO的培养基中使细胞生长到稳定期，收集细胞，然后在没有EPO的培养基中再培养18小时。将细胞分成相等细胞密度的三组：没有加入因子的一组(阴性对照)，具有EPO的一组(阳性对照)，具有受试肽的实验组。然后在多个时间点收集培养的细胞，将其固定、并用结合DNA的荧光染料(例如，碘化丙锭或者Hoechst染料，都可以从Sigma得到)染色。然后例如使用FACS Scan Flow细胞仪测量荧光。然后例如，使用CelIFIT软件(Becton Dickinson)的SOBR型可以测定细胞周期的每个期中的细胞百分数。相对于阴性对照组，用EPO或者活性肽处理的细胞显示出在S期中的更大比例的细胞(通过指示物的增加的荧光来测定，其指示增加的DNA含量)。
使用FDCP-1[参见，例如，Dexter等人(1980)J.Exp.Med.152：1036-1047]或TF-1[Kitamura等人(1989)Blood 73：375-380]细胞系进行类似测定。FDCP-1是生长因子依赖性鼠多能原始定向造血干细胞系，当补充了WEHI-3条件培养基(含有IL-3的培养基，ATCC号TIB-68)时，所述细胞系可以增殖，但是不分化。对于此类实验，用人或者鼠EPO-R转染FDCP-1细胞系以分别产生FDCP-1-hEPO-R或FDCP-1-mEPO-R细胞系，在EPO的存在下所述细胞系可以增殖但是不能分化。还可以使用一种依赖EPO的细胞系TF-1测量肽EPO-R激动剂对细胞增殖的影响。
在另一个测定法中，在Krystal(1983)Exp.Hematol 11：649-660中提出的基于H3-胸苷向脾细胞掺入的微测定法的方法可以用于确定本发明化合物作为EPO激动剂的能力。简言之，对B6C3F1小鼠每天用苯肼(60mg/kg)注射，为期两天。在第三天，除去脾细胞并使用MTT测定法确定所述细胞在24小时内增殖的能力。
在红细胞生成素应答细胞系中，EPO对EPO-R的结合诱导受体和多种细胞内蛋白质，包括Shc、vav和JAK2激酶的酪氨酸磷酸化。因此，另一种体外测定法测量本发明的肽诱导EPO-R和下游细胞内信号转导蛋白的酪氨酸磷酸化。如通过上述结合和增殖测定法鉴定的活性肽在红细胞生成素应答细胞中引起与EPO近乎相同的磷酸化模式。对于该测定法，FDC-P1/ER细胞[Dexter等人(1980)J Exp Med 152：1036-47]在补充了EPO的培养基中保持并生长到稳定期。然后在没有EPO的培养基中培养这些细胞24小时。然后将确定数目的这类细胞与受试肽在37℃孵育约10分钟。还用细胞的对照样品与EPO进行每种测定法。通过离心收集处理的细胞，将它们重悬浮在SDS裂解缓冲液中，并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将凝胶上的电泳蛋白质转移至硝化纤维素，并通过标准免疫学技术显现印迹上的含有磷酸酪氨酸的蛋白质。例如，可以用抗磷酸酪氨酸抗体(例如，Upstate Biotechnology，Inc.的小鼠抗磷酸酪氨酸IgG)探测印迹，洗涤，然后用二级抗体[例如，Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.(Washington，DC)的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG]探测。之后，可以通过标准技术显现含有磷酸酪氨酸的蛋白质，所述标准技术包括比色、化学发光或者荧光测定法。例如，用来自Amersham的ECL Western BlottingSystem可以进行化学发光测定。
可以用于评估本发明肽的活性的另一种基于细胞的体外测定法包含菌落测定法，使用鼠骨髓或者人外周血细胞。可以从小鼠的股骨得到鼠骨髓，可以从健康供体得到人外周血样品。对于外周血，首先从血液分离单核细胞，例如，通过离心由Ficoll-Hypaque梯度[Stem Cell Technologies，Inc.(Vancouver，加拿大)]进行分离。对于该测定，进行有核细胞计数以建立最初样品中有核细胞的数目和浓度。按照生产商[Stem Cell Technologies，Inc.(Vancouver，加拿大)]的使用说明将确定数目的细胞铺在甲基纤维素上。用受试肽处理实验组，用EPO处理阳性对照组，阴性对照组不处理。在确定的孵育期(通常10天到18天)后对每组生长的集落数打分。活性肽将促进集落形成。
可以用于阐明本发明化合物的活性的其他体外生物测定法公开于Greenberger等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.美国80：2931-2935(EPO-依赖性定向造血干细胞细胞系)；Quelle和Wojchowski(1991)J.Biol.Chem.266：609-614(B6SUt.EP细胞中的蛋白质酪氨酸磷酸化)；Dusanter-Fourt等人(1992)J.Biol.Chem.287：10670-10678(人EPO应答细胞中EPO受体的酪氨酸磷酸化)；Quelle等人(1992)J.Biol.Chem.267：17055-17060(FDC-ER细胞中细胞溶胶蛋白质pp100的酪氨酸磷酸化)；Worthington等人(1987)Exp.Hematol.15：85-92(血红蛋白的比色测定)；Kaiho和Miuno(1985)Anal.Biochem.149：117-120(用2，7-二氨基芴检测血红蛋白)；Patel等人(1992)J.Biol.Chem.267：21300-21302(c-myb的表达)；Witthuhn等人(1993)Cell 74：227-236(JAK2的结合和酪氨酸磷酸化)；Leonard等人(1993)Blood 82：1071-1079(GATA转录因子的表达)以及Ando等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.美国90：9571-9575(通过环D2和D3对G1转换的调节)。
已经报导Molecular Devices Corp.设计的称作microphysiometer的仪器成功地用于测量激动剂和拮抗剂对多种受体的影响。该仪器的基础是测量受体活化应答中细胞外基质的酸化速率。
体内功能性测定法
可以用于评估受试肽的效力的一种体内功能性测定法是polycythemicexhypoxic小鼠生物测定法。对于该测定法，将小鼠置于交替调节的循环数天。在该循环中，大鼠在低压条件和环境压力条件期间交替。之后，在施用受试样品前将小鼠在环境压力下保持2-3天。将受试肽样品，或者对于阳性对照小鼠，将EPO标准物皮下注射到受调节的小鼠中。2天后施用放射标记的铁(例如，Fe59)，施用放射标记的铁两天后采集血样。然后通过标准技术对每个血样测定血细胞比容和测量放射性。用活性受试肽注射的小鼠的血样将显示出比未接受受试肽或者EPO的小鼠的血样更大的放射性(由于红细胞血红蛋白对Fe59的结合)。
可以用于评估受试肽效力的另一种体内功能性测定法是网织红细胞测定法。对于该测定法，用EPO或者受试肽连续三日皮下注射正常的未处理小鼠。在第三天，还用葡聚糖铁腹膜内注射小鼠。在第5天，从小鼠收集血样。通过噻唑橙染色和流式细胞仪分析(retic-count程序)测定血液中网织红细胞的百分数(％)。此外，手工测定血细胞比容。用下面的公式确定校正的网织红细胞的百分数：
％RETIC校正的＝％RETIC观察值×(血细胞比容个体/血细胞比容正常)
相对于未接受受试肽或者EPO的小鼠，活性受试化合物将显示出增加的％RETIC校正的水平。
本发明的EPO-R激动剂肽的用途
本发明的肽化合物可以用作体外理解EPO的生物功能的工具，包括评估认为影响或者受到EPO的产生和EPO对EPO-R的结合的影响许多因素(例如，EPO/EPO-R信号转导/受体激活的机制)。本发明的肽还可以用于开发结合EPO-R的其他化合物，因为本发明化合物提供了重要的结构-活性关系信息，其有助于开发。
此外，基于它们结合EPO-R的能力，本发明的肽可以用作检测EPO-R对生物液体、组织匀浆物、纯化的天然生物材料等等中的活细胞、固定细胞上EPO-R的试剂。例如，通过标记此类肽，可以鉴定在表面上具有EPO-R的细胞。此外，基于它们结合EPO-R的能力，本发明的肽可以用于原位染色、FACS(荧光激活细胞分类术)分析、Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)等等。此外，基于它们结合EPO-R的能力，本发明的肽可以用于受体纯化，或者纯化在细胞表面上(或者在可渗透的细胞内)表达EPO-R的细胞。
本发明的肽还可以用作多种医学研究和诊断目的的商业试剂。此类用途可以包括但不限于：(1)用作定量多种功能性测定法中候选EPO-R激动剂活性的校准标准；(2)用作随机肽筛选的阻断试剂，即寻找EPO-R肽配体的新家族，所述肽可以用于阻断本发明的EPO肽的回收；(3)用于与EPO-R的共结晶，即，可以形成结合EPO-R的本发明肽的晶体，使得可以通过X-射线晶体学测定受体/肽的结构；(4)用于测量红细胞前体细胞诱导珠蛋白合成和血红素复合体合成的能力，和通过启动分化增加铁蛋白受体的数目；(5)用于保持EPO依赖性细胞系(如FDCP-1-mEPO-R和TF-1细胞系)的增殖和生长；和(6)其他研究和诊断应用，其中优选EPO-R是激活的或者对已知量的EPO-R激动剂方便地校准此类激活等。
在本发明的再一方面，提供了治疗方法和药物生产方法。可以将本发明的肽化合物施用于温血动物，包括人，以刺激EPO与EPO-R的体内结合。从而，本发明包括与EPO缺乏相关的疾病的治疗性治疗方法，所述方法包括以足够刺激EPO-R的量施用本发明的肽化合物，从而减轻与体内EPO缺乏相关的症状。例如，本发明的肽可以用于治疗肾机能不全和/或末期肾衰竭/透析；与艾滋病相关的贫血；与慢性炎性疾病(例如，类风湿性关节炎和慢性肠炎)相关的贫血和自身免疫病；和用于手术前增加患者的红细胞数。可以通过施用本发明的肽治疗的其他疾病状态、障碍和血液学不规则状态包括：β-地中海贫血；囊性纤维化；妊娠和绝经病症；早熟性早期贫血(early anemia of prematurity)；脊髓损伤；太空飞行、急性失血；衰老以及伴随着异常红细胞生成的多种肿瘤疾病状态。
在其他实施方案中，本发明的肽化合物可以用于治疗特征不是低或者缺乏血红细胞的障碍的治疗，例如，作为输液前的预处理。此外，施用本发明的化合物可以导致出血时间减少，从而将可以用于在手术前施用于患者或者其中预期发生出血的适应症。此外，本发明的化合物可以用于巨核细胞的激活。
因为已经表明EPO对血管内皮细胞具有促有丝分裂和趋化效果以及对中枢胆碱能神经元具有效果[参见，例如，Amagnostou等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.美国87：5978-5982和Konishi等人(1993)Brain Res.609：29-35]，所以本发明的化合物将可以用于治疗多种血管病症，如：促进伤口愈合；促进冠状侧枝血管(如心肌梗死后可能发生的那些血管)的生长；创伤治疗；和血管移植后的治疗。本发明的化合物还可以用于多种神经学病症的治疗，所述病症通常的特征是绝对低水平的乙酰胆碱，或者与其他神经活性物质，例如，神经递质相比，相对低水平的乙酰胆碱。
药物组合物
在本发明的再一方面，提供了上述EPO-R拮抗剂肽化合物的药物组合物。通过施用此类组合物减轻或者调节的疾病包括上文指出的那些疾病。此类药物组合物可以通过经口、肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或者皮下注射)、透皮(被动地或者使用离子电渗疗法或者电穿孔)、透粘膜(鼻、阴道、直肠或者舌下)途径施用或者使用生物可侵蚀的插入物施用，并且可以配制成适宜每种施用途径的剂型。通常，本发明包括包含有效量本发明的EPO-R激动剂肽、或者衍生产物以及可药用的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体的药物组合物。此类组合物包括多种缓冲成分(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂，如去污剂和增溶剂(例如，Tween 20，Tween 80，聚山梨酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如，Thimersol、苯甲醇)和膨胀性物质(例如，乳糖、甘露醇)；将所述物质掺入到聚合物化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂，或者掺入到脂质体中。还可以使用透明质酸。此类组合物可以影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)1435-1712页，将其引入本文作为参考。可以以液体形式，或者可以以干燥粉剂(例如，冻干)形式制备组合物。
经口递送
预计用于本文的是经口固体剂型，其在Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版1990(Mack Publishing Co.Easton PA 18042)第89章中概括性描述，将其引入本文作为参考。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、药片或者锭剂、扁囊剂、微型药片、粉剂或者颗粒剂。而且，脂质体或者类蛋白质胶囊化也可以用于配制本发明的组合物(例如，在美国专利号4,925,673中报导的类蛋白质微球体)。可以使用脂质体胶囊化并且可以用多种聚合物衍生脂质体(例如，美国专利号5,013,556)。用于治疗剂的可能的固体剂型的描述由Marshall，K.在G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑的Modern Pharmaceutics(1979年)的第10章中给出，将其引入本文作为参考。通常，该制剂将包括EPO-R激动剂肽(或者其化学修饰的形式)和插入物成分，其允许保护免于胃环境的破坏，并在肠中释放生物活性物质。
还预计用于本文的是经口施用的液体剂型，包括可药用的乳剂、溶液剂、混悬剂和糖浆剂，它们可以含有其他组分，包括惰性稀释剂；和佐剂，如湿润剂、乳化剂和混悬剂；和甜味剂、矫味剂和芳香剂。
肽可以经化学修饰从而衍生物的经口递送是有效的。通常，预计化学修饰将至少一个部分附着连接至组成分子自身，其中所述部分允许(a)抑制蛋白酶解；和(b)从胃或肠吸收到血流中。还希望一种或几种组分的总体稳定性的增加和增加在体内的循环时间。如上文讨论，PEG化是药物使用的优选的化学修饰。可以使用的其他部分包括：丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-tioxocane[参见，例如，Abuchowski和Davis(1981)″Soluble Polymer-Enzyme Adducts，″in Enzymes as Drugs.Hocenberg和Roberts编著(Wiley-Interscience：New York，NY)367-383页；和Newmark等人(1982)J.Appl.Biochem.4：185-189]。
对于经口制剂，释放部位可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)，或者大肠。本领域技术人员可以利用这样的制剂，其将不在胃中释放，而是将在十二指肠或者肠的别处释放物质。优选地，该释放将避免胃环境的有害影响，可以通过保护肽(或者衍生物)或者通过远离胃环境，如在肠中释放肽(或衍生物)来避免胃环境的有害影响。
为了确保完全的胃抗性，对至少pH5.0不可渗透的包衣是必需的。用作肠包衣的更常见的惰性成分的实例是乙酸-1，2，4-苯三酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、丙烯酸树脂L30D、Aquateric、醋酞纤维素(CAP)、丙烯酸树脂L、丙烯酸树脂S和Shellac。这些包衣可以用作混合膜。
包衣或者包衣混合物也可以用在片剂上，这些包衣或者包衣混合物不意在保护免于胃的影响。所述包衣或者包衣混合物可以包括糖包衣，或者使得片剂更易吞咽的包衣。胶囊剂可以由用于递送干燥治疗剂(例如即，粉剂)的硬壳(如明胶)组成，对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是厚淀粉或者其他可食用的纸。对于丸剂、锭剂、模制片或者片剂研制剂，可以使用湿法块化(moist massing)技术。
肽(或者衍生物)可以包括在制剂中作为颗粒大小为约1mm的粒剂或者微型药片形式的多微粒(multiparticulate)。用于胶囊施用的材料的制剂也可以是粉剂、略微压制的块(plug)，或者甚至片剂。这些治疗剂可以通过压缩制备。
还可以包括着色剂和/或矫味剂。例如，可以(如通过脂质体或者微球体胶囊化)制备肽(或衍生物)，然后将其包含在可食用产品，如含有着色剂和矫味剂的冷藏饮料中。
可以用惰性物质稀释或者增加肽(或衍生物)的体积。这些稀释剂可以包括糖类，尤其甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改良葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填充剂，它们包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些市售稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
固体剂型的治疗剂制剂中可以包含崩解剂。用作崩解剂的物质包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商用崩解剂Explotab。淀粉羟乙酸钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土都可以使用。崩解剂还可以是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶也可以用作崩解剂和粘合剂，并且可以包括诸如琼脂、Karaya或黄蓍胶的粉状树胶。海藻酸和其钠盐也可以用作崩解剂。
粘合剂可以用于将肽(或衍生物)物质保持在一起以形成硬片剂，包括来自天然产物的材料，如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其他包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以用于醇溶液以粒化肽(或衍生物)。
肽(或衍生物)的制剂中可以包括抗摩擦剂以防止配制过程期间的粘着。润滑剂可以用作肽(或衍生物)和模壁中间的层，这些润滑剂包括但不限于：硬脂酸，包括其镁和钙盐；聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可以使用可溶性润滑剂，如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、多种分子量的聚乙二醇、碳蜡4000和6000。
可以加入助流剂，其改善配制期间药物的流动性质并且帮助压制期间的重排。助流剂可以包括淀粉、滑石粉、致热性硅石和水合硅铝酸盐。
为了帮助肽(或衍生物)溶于水性环境，可以加入表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可以包括阴离子去污剂，如十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠。可以使用阳离子去污剂并且其可以包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可以包括在制剂中作为表面活性剂的可能的非离子去污剂的名单为聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或者以不同比例的混合物存在于所述蛋白质或者衍生物的制剂中。
可以大概增强肽(或衍生物)吸收的添加剂为例如脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。
控释经口制剂也是希望的。肽(或衍生物)可以掺入到允许通过扩散或者浸取机制释放的惰性基质，如树胶中。缓慢变性基质也可以掺入到制剂中。某些肠包衣也具有缓释效果。控释的另一种形式是通过基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即药物封装在半透性膜中，该膜允许水进入并且由于渗透作用将药物挤过一个小的开口。
其他包衣可以用于制剂。这些包衣包括可以在包衣锅中应用的多种糖。肽(或衍生物)还可以以膜包衣的片剂提供并且用于该情况的材料分成两组。第一组是非肠物质，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟基-乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇。第二组由通常为苯二甲酸酯的肠材料组成。
材料混合物可以用于提供最佳膜包衣。可以在锅涂布器或者在流化床中，或者通过压缩包衣进行膜包衣。
肠胃外递送
用于肠胃外施用的根据本发明的制剂包括无菌水性或非水性溶液剂、混悬剂或乳剂。非水性溶剂或者赋形剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油和玉米油、明胶和可注射的有机酯，如油酸乙酯。此类剂型还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。它们可以通过例如，通过保留细菌的滤器过滤、向组合物掺入消毒剂、通过放射处理组合物或者通过热处理组合物来消毒。它们还可以在使用前即刻用无菌水或者某些其他无菌可注射介质产生。
直肠或阴道递送
用于直肠或阴道施用的组合物优选为栓剂，其除了活性物质还含有包含赋形剂，如可可脂或者栓剂蜡。用于经鼻或舌下施用的组合物也可以用本领域熟知的标准赋形剂制备。
经肺递送
本文还期待经肺递送EPO-R激动剂肽(或者其衍生物)。肽(或衍生物)被吸入式递送到哺乳动物的肺中并穿过肺上皮层进入血流[参见，例如，Adjei等人(1990)Pharmaceutical Research 7：565-569；Adjei等人(1990)Int.J.Pharmaceutics 63：135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人(1989)J.Cardiovascular Pharmacology 13(sup5)：143-146(内皮素-1)；Hubbard等人(1989)Annals of Internal Medicine，卷III，206-212页(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等人(1989)J.Clin.Invest.84：1145-1146(α-1-蛋白酶)；Oswein等人(1990)″Aerosolization of Proteins″，Proceedings of Symposium onRespiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado(重组人生长激素)；Debs等人(1988)J.Immunol.140：3482-3488(γ干扰素和肿瘤坏死因子α)；和Platz等人的美国专利号5,284,656(粒细胞集落刺激因子)]。在Wong等人的美国专利号5,451,569中描述了经肺递送药物实现全身性效果的方法和组合物。
预计用于本发明实践中的是设计用于经肺递送治疗产品的多种机械装置，其包括但不限于喷雾器、定量吸入器和粉末吸入器，它们都是本领域技术人员熟悉的。适于本发明实践的市售装置的一些特例为Ultravent喷雾器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，MO)；Acorn II喷雾器(MarquestMedical Products，Englewood，CO)；Ventolin定量吸入器(GlaxoInc.，Research Triangle Park，NC)和Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.，Bedford，MA)。
所有此类装置需要使用适于肽(或衍生物)的调剂的制剂。通常，每种制剂对于所有装置的类型是特异的，可以包括使用除了用于治疗的常规稀释剂、佐剂和/或载体之外的适宜的推进剂物质。而且，预计使用脂质体、微囊剂或者微球体，包括复合物，或者其他类型载体。根据所用的化学修饰类型或者装置类型，在不同制剂中还可以制备化学修饰的肽。
适于用射流或超声喷雾器使用的制剂将通常含有溶于水中的肽(或衍生物)，其浓度为每毫升溶液约0.1到25mg生物活性蛋白质。该制剂还可以包括缓冲剂和简单糖(例如，用于蛋白质稳定和渗透压的调节)。喷雾器制剂还可以含有表面活性剂，其减小或者防止形成气溶胶的溶液雾化导致的肽(或衍生物)的表面聚集。
定量吸入器装置使用的制剂将通常包含细分的粉末，其含有通过表面活性剂悬浮在推进剂中的肽(或衍生物)。推进剂可以是用于该目的的任意常规物质，如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或者烃，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或者它们的组合。适宜的表面活性剂包括失水山梨醇三油酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性剂。
用于从粉末吸入器装置调剂的制剂将含有细分的干燥粉剂，其含有肽(或衍生物)并且还可以包括膨胀剂，如乳糖、山梨醇、蔗糖或者甘露醇，它们的量将促进粉剂从装置的分散，例如，为制剂的50-90wt％。为了最有效地递送到远端肺，肽(或衍生物)应该有利地以颗粒形式制备，其平均颗粒大小小于10mm(或者微米)，最优选0.5到5mm。
鼻递送
还预计EPO-R激动剂肽(或衍生物)的鼻递送。鼻递送允许向鼻子施用治疗产品后，肽直接进入血流，而不必使产物沉积在肺中。用于经鼻递送的制剂包括使用葡聚糖或者环葡聚糖(cyclodextran)的那些制剂。
还包括和本发明的肽一起使用的其他有助于鼻递送的渗透促进剂(例如2003年12月17日提交的国际专利公开号WO 2004056314中描述的，该专利申请在此全部引入作为参考)。
剂量
对于所有肽化合物，随着进一步研究的进行，将出现关于治疗多种患者中多种疾病的适宜的剂量水平的信息，普通技术人员考虑接受者的治疗背景、年龄和一般健康，将能够确定适宜剂量。所选剂量取决于所希望的治疗效果、施用途径和所希望的治疗持续时间。通常，每天将0.001到10mg/kg体重的剂量水平施用于哺乳动物。通常，对于静脉内注射或者输注，剂量可以较低。给药方案可以基于循环半寿期和所用制剂而变。
本发明的肽(或者它们的衍生物)可以与一种或多种其他的活性成分或者药物组合物结合施用。
实施例
接下来通过下面的实施例描述本发明。然而，本说明书中这些和其他实施例仅用于阐明，而不限于本发明或者任意例证形式的范围和意义。同样，本发明不限于本文描述的任何具体优选的实施方案。实际上，阅读本说明书时本发明的许多修改和变通方案对于本领域技术人员是显而易见的，并且可以做出所述修改和变通方案而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明仅仅由所附权利要求的术语以及权利要求等价的完整范围所限制。
列出的实施例描述了这样的实验，本领域的技术人员通过其可以确定本发明肽的生物活性。
实施例1：合成EPO-R激动剂肽
该实施例优先为描述性质，不限制可以合成本发明包括的肽的方法。但是，在先描述的合成EPO肽部分的其他方法(参见，例如2004年5月12日提交的PCT/US04/14886中的方法)也可用于制备本发明的化合物。
提供固相技术来合成本发明的肽单体或二聚体。还描述了连接连接体和本发明肽化合物的PEG部分的代表性技术，以及氧化肽化合物(例如形成分子内二硫键)的方法。最后，该实施例还提供了纯化根据这些方法合成的肽化合物的技术。
1.肽单体合成
如本文所述，使用Merrifield固相合成技术[参见Stewart和Young.Solid Phase Peptide Synthesis，第二版(Pierce Chemical，Rocl ford，IL)1984]，在Applied Biosystems 433A自动化仪器上合成本发明的多种肽单体。所用树脂为PAL(Milligen/Biosearch)，其是与5-(4’-Fmoc-氨基甲基-3，5’-二甲氧基苯氧基)戊酸交联的聚苯乙烯。使用PAL树脂导致当从树脂切割肽时得到羧基末端酰胺官能团。用Fmoc实现氨基酸上伯胺保护，侧链保护基对于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基为叔丁基；对于谷氨酰胺和天冬酰胺的酰胺为三苯甲基；对于半胱氨酸为Trt或者Acm；对于精氨酸的胍基为Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃磺酸)。每种偶联用BOP(苯并三唑基N-氧代三(二甲基氨基)六氟磷酸盐)和HOBt(1-羟基苯并三唑)进行1小时或2小时。
为了合成具有酰胺化羧基末端的肽，将完全装配的肽用90％三氟乙酸、5％乙二硫醇和5％水的混合物切割，最初在4℃，并在1.5小时内逐渐增加到室温。从树脂过滤去保护的产物并用二乙醚沉淀。充分干燥后，通过C18反相高效液相层析纯化产物，使用0.1％三氟乙酸中的乙腈/水梯度。
2.肽二聚体合成
以固相合成技术的变通方案将本发明的多种肽二聚体直接合成到赖氨酸连接体上。
为了同时合成两条肽链，将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶联至PAL树脂(Milligen/Biosearch)，从而提供最初的赖氨酸残基作为待合成的两条链之间的连接体。用弱碱(DMF中的20％哌啶)除去Fmoc保护基，并使用所得游离氨基作为起点合成肽链。使用上述固相合成技术进行肽链合成。用Trt保护所有半胱氨酸残基。二聚体去保护后，从树脂切割，并纯化，通过将去保护的二聚体在100％DMSO中5℃到25℃下孵育2-3天进行半胱氨酸残基的氧化。该氧化反应主要产生(＞75％)具有两个分子内二硫键的二聚体。
对于顺序合成两条肽链，将Fmoc-Lys(Alloc)-OH偶联至PAL树脂(Milligen/Biosearch)，从而提供最初的赖氨酸残基作为待合成的两条链间的连接体。用弱碱(DMF中的20％哌啶)除去Fmoc保护基。然后使用所得游离氨基作为起点合成第一条肽链。使用上述固相合成技术进行肽合成。用Trt保护第一条链的两个半胱氨酸残基。第一条肽链合成后，用Pd[P(C6H5)3]4、4-甲基吗啉和氯仿从支持物结合的赖氨酸连接体除去Alloc基。然后在该第二个游离氨基上合成第二条肽链。用Acm保护第二条链的两个半胱氨酸残基。通过用三氟乙酸除去Trt保护基，然后通过在20％DMSO中过夜搅拌氧化形成第一条链中的分子内二硫键。然后通过同时除去Acm保护基并用碘、甲醇和三氟乙酸铊(thalium)氧化去保护的半胱氨酸残基，在第二条肽链中形成分子内二硫键。
3.连接间隔臂
当间隔臂是氨基酸(例如，甘氨酸或赖氨酸)时，在固相肽合成期间将间隔臂掺入到肽中。在该情况中，将间隔臂氨基酸偶联至PAL树脂，其游离氨基作为连接另一间隔臂氨基酸或者赖氨酸连接体的基础。连接赖氨酸连接体后，如上述合成二聚体肽。
4.氧化肽以形成分子内二硫键
将肽二聚体溶解在20％DMSO/水(1mg干重肽/ml)并允许在室温静置36小时。通过将反应混合物上样到C18 HPLC柱(Waters Delta-PakC18，15微米颗粒大小，300埃孔径，40mm×200mm长度)，然后用在40分钟内从5到95％ACN的线性ACN/水/0.01％TFA梯度纯化肽。冻干含有目的肽的级分，得到疏松的白色固体。
5.肽的PEG化
使用几种不同的技术进行本发明肽的PEG化。
末端-NH2基的PEG化：将肽二聚体与无水DMF中的1.5当量(基于摩尔)活化的PEG种类(日本NOF Corp.的mPEG-NPC)混合，得到澄清溶液。5分钟后向上述溶液加入4当量DIEA。在室温下搅拌混合物14小时，然后用C18反相HPLC纯化。通过MALDI质谱证实PEG化肽的结构。还将纯化的肽通过如下面概述的阳离子交换层析进行纯化。
肽二聚体的N末端的二PEG化：将肽二聚体与无水DMF中的2.5当量(基于摩尔)活化的PEG种类(日本NOF Corp.的mPEG-NPC)混合，得到澄清溶液。5分钟后向上述溶液加入4当量DIEA。在室温下搅拌混合物14小时，然后用C18反相HPLC纯化。还将纯化的肽通过如下面概述的阳离子交换层析进行纯化。
通过N末端PEG化进行肽二聚化：将肽(2.5当量)和PEG-(SPA-NHS)2(1当量，来自Shearwater Corp，美国)以0.25M溶于无水DMF中得到澄清溶液。5分钟后向上述溶液加入10当量DIEA。在室温下搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC纯化。还将纯化的肽通过如下面概述的阳离子交换层析进行纯化。
通过C末端PEG化进行肽二聚化：将肽(2.5当量)和PEG-(SPA-NHS)2(1当量，来自Shearwater Corp，美国)以0.25M溶于无水DMF中得到澄清溶液。5分钟后向上述溶液加入10当量DIEA。在室温下搅拌混合物2小时，然后用C18反相HPLC纯化。还将纯化的肽通过如下面概述的阳离子交换层析进行纯化。
6.肽的离子交换纯化
对数种交换支持物检查它们保留起始二聚肽的能力，以及它们从未反应的(或者水解的)PEG中分离上述肽-PEG缀合物的能力。将离子交换树脂(2-3g)装入1cm柱中，然后转化成钠型(向柱子上样0.2N NaOH直到洗脱液的pH为14，约5个柱体积)，然后转化成氢型(用0.1N HCl或0.1M HOAc洗脱直到洗脱液和加样pH一致，约5个柱体积)，然后用25％ACN/水洗涤直到pH6。将缀合前的肽或者肽-PEG缀合物溶于25％ACN/水(10mg/mL)中并用TFA调节pH到＜3，然后上样柱子。用2-3个柱体积的25％ACN/水洗涤并收集5mL级分后，通过用25％ACN/水中的0.1M NH4OAc洗脱从柱子释放肽，再次收集5mL级分。通过HPLC分析揭示哪些级分含有目的肽。用蒸发光散射检测器(ELSD)分析表明当肽保留在柱子上并用NH4OAc溶液洗脱(通常在级分4到10之间)时，没有观察到作为污染物的非缀合的PEG。当用最初洗涤缓冲液洗脱肽(通常前2个级分)时，没有观察到目的PEG缀合物和过量PEG的分离。
下面的柱子可能成功地保留了所述肽和肽-PEG缀合物，并从未缀合的肽成功地纯化了肽-PEG缀合物：
表1：离子交换树脂
  支持物 来源
  Mono S HR 5/5强阳离子交换预装柱 Amersham Biosciences(Buckinghamshire，英格兰)
  SE53纤维素，微粒状强阳离子交换支持物 Whatman(Middlesex，英国)
  快速SP琼脂糖强阳离子交换支持物 Amersham Biosciences(Buckinghamshire，英格兰)
实施例2：体外活性测定
该实施例描述可用于评估本发明肽(如，EPO-R激动剂)的活性和效力的若干体外测定法。具体地，这些测定法的结果是本文描述的证明肽化合物是否结合EPO-R并激活EPO-R信号转导的那些。这些测定可用于与诸如已知的EPO模拟肽的化合物比较结合亲和力和生物活性。
这些测定法中测试的EPO-R激动剂肽单体和二聚体一般根据实施例1中描述的那些方法制备。然后使用一系列体外活性测定法评估这些肽单体和二聚体的效力，所述测定法包括：报道基因测定法、增殖测定法、竞争性结合测定法和C/BFU-e测定法。这四种测定法在下文详细描述。
1.报道基因测定法
该测定法基于鼠前-B细胞系来源的报道细胞Baf3/EpoR/GCSFRfos/lux。该报道细胞系表达嵌合受体，该受体包含人EPO受体的细胞外部分至人GCSF受体的细胞内部分。用fos启动子驱动的萤光素酶报道基因构建体进一步转化该细胞系。通过加入红细胞生成剂激活该嵌合受体导致萤光素酶报道基因的表达，因此加入萤光素酶底物萤光素时产生光。从而，通过测量萤光素酶活性可以定量此类细胞中EPO-R激活的水平。
将Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux细胞培养在补充了10％胎牛血清(FBS；Hyclone)，10％WEHI-3上清(来自WEHI-3细胞(ATCC#TIB-68)的培养物的上清)和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)中。测定前约18小时，通过将细胞转移至补充了10％FBS和0.1％WEHI-3上清的DMEM/F12培养基饥饿细胞。在测定当天，用补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基洗涤细胞一次，然后1×106个细胞/ml在已知浓度的受试肽存在下培养，或用EPO(R & D Systems Inc.，Minneapolis，MN)作为阳性对照，在补充了10％FBS(无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基中培养。同时在该测定中试验受试肽的连续稀释液。将测定板在37℃下5％CO2大气中培养4小时，之后向每孔加入萤光素(Steady-Glo；Promega，Madison，Wi)。孵育5分钟后，在Packard Topcount Luminometer(PackardInstrument Co.，Downers Grove，Ill.)上测量光发射。将光计数相对于受试肽浓度作图并用Graph Pad软件分析。导致光的半最大发射的受试肽浓度记录为EC50。
2.增殖测定法
该测定法基于鼠前-B细胞系Baf3，其经转染而表达人EPO-R。所得细胞系BaF3/Gal4/Elk/EPOR的增殖取决于EPO-R激活。使用MTT定量细胞增殖的程度，其中MTT测定中信号与活细胞数成比例。
将BaF3/Gal4/Elk/EPOR细胞培养在旋转瓶中补充了10％FBS(Hyclone)和2％WEHI-3上清(ATCC#TIB-68)的DMEM/F12培养基(Gibco)中。在旋转瓶中补充了10％FBS和0.1％WEHI-3上清的DMEM/F12培养基中，以1×106个细胞/ml的细胞密度过夜饥饿所培养的细胞。然后将饥饿的细胞用Dulbecco′s PBS(Gibco)洗涤两次，用补充了10％FBs(无WEHI-3上清)的DMEM/F12培养基重悬浮为1×106个细胞/ml的密度。然后将细胞悬浮物的50μL等分试样(～50,000个细胞)以一式三份铺在96孔测定板中。向96孔测定板加入受试EPO模拟肽或者50μL EPO(R & D Systems Inc.，Minneapolis，MN)或AranespTM(darbepoeitinα，可以从Amgen以商业途径得到的EPO-R激动剂)在补充了10％FBS(无WEHI-3上清I)的DMEM/F12培养基中的连续稀释液的50μL等分试样(最终孔体积100μL)。例如，当受试肽(或者对照EPO肽)的最终浓度为810pM到0.0045pM时，可以试验12种不同的稀释液。然后在37℃孵育平铺的细胞48小时。接着，向每个培养皿孔加入10μL MTT(Roche Diagnostics)，之后孵育4小时。通过加入10％SDS+0.01N HCl中止反应。然后在37℃过夜孵育板。通过分光光度法测量595nm波长下每孔的吸收。用吸收读数对受试肽浓度作图并使用GraphPad软件计算EC50。导致半最大吸收的受试肽浓度记录为EC50。
3.竞争性结合测定法
使用一种测定法进行竞争性结合计算，在该测定法中产生的光信号作为两种珠子的接近性的函数，所述珠子为：具有生物素化EPO-R结合肽示踪物的链霉抗生物素蛋白供体珠，和EPO-R结合的受体珠。通过非辐射能量转移产生光，在照明期间从第一种珠子释放单线态氧，与所释放的单线态氧的接触导致第二种珠子发光。这些珠子组可以通过商业途径得到(Packard)。通过EPO-R结合肽示踪物与EPO-R的结合产生珠子接近性。与EPO-R结合肽示踪物竞争性结合EPO-R的受试肽将防止该结合，导致光发射的降低。
该方法进一步详述如下：向384孔板的孔中加入受试EPO-R激动剂肽或者阳性或阴性对照的4μL连续稀释液。之后，加入2μL/孔受体/珠子混合物。受体珠子混合物由15μL的5mg/ml链霉抗生物素蛋白供体珠子(Packard)，15μL的5mg/ml单克隆抗体ab179(该抗体识别重组EPO-R中所含的人胎盘碱性磷酸酶蛋白质的部分)，蛋白质A包被的受体珠(蛋白质A将结合ab179抗体；Packard)，重组EPO-R(在中国仓鼠卵巢细胞中产生，作为人胎盘碱性磷酸酶蛋白质的部分的融合蛋白质，其含有ab179靶表位)的1∶6.6稀释液112.5μL和607.5μL Alphaquest缓冲液(40mMHEPES，pH7.4；1mM MgCl2；0.1％BSA，0.05％Tween 20)组成。轻拍混合。加入2μL/孔生物素化EPO-R结合肽示踪物。
离心1分钟混合。用Packard Top Seal密封板并用箔包裹。在室温下过夜孵育。18小时后用AlphaQuest读出器(Packard)读出光发射。将光发射对肽浓度作图并用Graph Pad或Excel分析。
相对于没有受试肽所观察到的光发射，导致光发射降低50％的受试肽的浓度记录为IC50。
4.C/BFU-e测定法
EPO-R信号转导刺激骨髓干细胞分化成增殖的血红细胞前体。该测定法测量受试肽刺激来自原代人骨髓多能干细胞的血红细胞前体增殖和分化的能力。
对于该测定，以补充了10％FBS(Hyclone)的IMDM培养基(Gibco)配制受试肽的连续稀释液。然后将这些连续稀释液或者阳性对照EPO肽加入甲基纤维素得到1.5mL的终体积。然后充分涡旋甲基纤维素和肽的混合物。将人骨髓来源的CD34+细胞(Poietics/Cambrex)的等分试样(100,000个细胞/mL)解冻。向50mL管中的0.1mL 1mg/ml DNA酶(Stem Cells)中温和加入解冻的细胞。接着，向细胞中温和加入40-50mL IMDM培养基：该培养基沿着50mL管边沿逐滴加入第一个10mL，然后沿着管的边沿缓慢加入剩余体积的培养基。以900转/分钟离心细胞20分钟，通过温和吸出除去培养基。将细胞重悬浮在1ml IMDM培养基中并在血细胞计数器载玻片上计数每mL细胞密度(载玻片上细胞悬浮液的10μL等分试样，细胞密度是平均计数×10,000个细胞/mL)。然后将细胞在IMDM培养基中稀释到15,000个细胞/mL的细胞密度。然后向每1.5mL甲基纤维素加肽样品中加入100μL稀释的细胞(测定培养基中最终细胞浓度为1000个细胞/mL)，并涡旋混合物。使混合物中气泡消失，然后用钝端针头吸出1mL。将来自每个样品的0.25mL吸出的混合物加入24孔板(Falcon商标)的4个孔的每孔中。在5％CO2的湿润培养箱中37℃下孵育平铺的混合物14天。使用相差显微镜(5×-10×目镜，最终放大率100×)对类红细胞集落的存在打分。相对于用EPO阳性对照所观察的，所形成的集落数为最大值的90％时的受试肽浓度记录为EC90。
5.放射性配体竞争性结合测定法
可以用备选的放射性配体竞争性结合测定法测量本发明肽的IC50值。该测定法测量125I-EPO与EPOr的结合。根据下面的示例性方案进行测定。
A.材料
重组人EPOR/Fc嵌合体 鉴定：重组人EPO R/Fc嵌合体供应商：R & D Systems(Minneapolis，MN，美国)目录号：963-ER批号：EOK033071保存：4℃
碘化的重组人红细胞生成素 鉴定：(3[125I]碘代酪氨酰)红细胞生成素，人重组的、高特异活性，370kBq，10μCi供应商：Amersham Biosciences(Piscataway，NJ，美国)目录号：IM219-10μCi批号：保存：4℃
蛋白质-G琼脂糖 鉴定：快速蛋白质-G琼脂糖4供应商：Amersham Biosciences(Piscataway，NJ，美国)目录号：17-0618-01批号：保存：4℃
测定缓冲液 磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH7.4，含有0.1％牛血清白蛋白和0.1％叠氮化钠保存：4℃
B.测定适宜的受体浓度
用1mL测定缓冲液重构一个50μg瓶中冻干的与人IgG1的Fc部分融合的重组EPOr细胞外结构域。为了确定用于测定的受体的正确量，将该受体制备物的100μL连续稀释液与约20,000cpm的200mL碘化重组人红细胞生成素(125I-EPO)在12×75mm聚丙烯试管中混合。盖上试管并在LabQuake旋转摇床上4℃温和混合过夜。
第二天，向每管加入50μL蛋白质G琼脂糖的50％浆液。将管在4℃孵育2小时，温和混合。然后以4000转/分钟(3297×G)将管离心15分钟以沉淀蛋白质-G sepharose。小心取出上清并丢去。用1ml的4℃测定缓冲液洗涤3次后，在Wallac Wizardγ计数器上计数沉淀。然后分析结果并计算达到最大结合值的50％所需的稀释度。
C.肽的IC50测定
为了测定本发明肽的IC50，将肽的100μL连续稀释液与100μL重组红细胞生成素受体(100pg/管)在12×75mm聚丙烯试管中混合。向每管加入100μL碘化重组人红细胞生成素(125I-EPO)，盖上试管并在4℃温和混合过夜。
第二天，如上述定量结合的125I-EPO。分析结果并使用GraphPadSoftware，Inc.(San Diego，CA)的Graphpad Prism版本4.0计算IC50值。对于通过该方法测量IC50值的每种肽优选重复该测定两次和多次，总共3次一式两份IC50测定。
实施例3：体内活性测定法
该实施例描述可以用于评估本发明肽(EPO-R激动剂肽)的活性和效力若干体内测定法。具体地，这些测定法的结果是本文描述的证明肽化合物是否结合EPO-R并激活EPO-R信号转导的那些。这些测定可用于与诸如已知的EPO模拟肽的化合物比较结合亲和力和生物活性。
该实施例描述了可用于评估本发明EPO-R激动剂肽的活性和效力的多种体内测定法。这些测定中测试的EPO-R激动剂肽单体和二聚体一般根据实施例1中描述的方法制备。然后使用一系列测定法评估这些肽单体和二聚体的体内活性，所述测定法包括：polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法和网织红细胞测定法。这两种测定法进一步详细描述如下。
1.polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法
以由Cotes和Bangham(1961)，Nature 191：1065-1067描述的方法修改的polycythemic exhypoxic小鼠生物测定法测定受试肽的体内活性。该测定法检查受试肽作为EPO模拟物，即，激活EPO-R和诱导新的血红细胞合成的能力。基于放射性标记的铁向合成的血红细胞的血红蛋白中的掺入定量血红细胞的合成。
让BDF1小鼠适应环境条件7-10天。测定所有动物的体重并且不使用低体重动物(＜15克)。将动物置于低压室中的连续调节循环共14天。每个24小时循环由0.40±0.02％大气压下18小时和环境气压下6小时组成。调节后将小鼠保持在环境气压下72小时后给药。
将受试肽或者重组人EPO标准物在PBS+0.1％BSA载体(PBS/BSA)中稀释。首先将肽单体贮存液在二甲亚砜(DMSO)中溶解。阴性对照组包括仅用PBS/BSA注射的一组小鼠，和用1％DMSO注射的一组。每个剂量组包含10只小鼠。用0.5mL适宜的样品皮下注射(颈背)小鼠。
样品注射后48小时，对小鼠腹膜内注射施用0.2ml Fe59(Dupont，NEN)，剂量为约0.75μ居里/小鼠。Fe59施用后24小时测定小鼠体重，并在Fe59施用后48小时处死小鼠。通过心脏穿刺从每只动物收集血液并测定血细胞比容(用肝素作为抗凝剂)。使用Packardγ计数器分析每个血样(0.2ml)的Fe59掺入。从适宜的数据集除去非应答小鼠(即，放射性掺入小于阴性对照组的那些小鼠)。还除去血细胞比容值小于阴性对照组53％的小鼠。
对于每个实验剂量，从10只动物的组得到结果。计算来自每组的血样中掺入的放射性的平均量[每分钟计数(CPM)]。
2.网织红细胞测定法
以EPO对照或者受试肽在连续三天对正常BDF1小鼠给药(0.5mL，皮下注射)。在第3天，还用右旋糖苷铁(100mg/ml)对小鼠给药(0.1mL，腹膜内注射)。在第5天，用CO2麻醉小鼠并通过心脏穿刺取血。通过噻唑黄染色和流式细胞仪分析(retic-count程序)测定每个血样的网织红细胞百分数(％)。手工测定血细胞比容。用下面的公式确定校正的网织红细胞的百分数：
％RETIC校正的＝％RETIC观察值×(血细胞比容个体/血细胞比容正常)
3.血液学测定法
通过每周四次静脉快速浓注EPO阳性对照、受试肽或者载体对正常CD1小鼠给药。通过改变制剂中活性化合物的浓度测试阳性对照和受试肽剂量范围，其表示为mg/kg。注射的体积为5ml/kg。载体对照组包含12只动物，剩余的剂量组每一组包括8只动物。每日记录生存力并且每周记录体重。
对给药的小鼠禁食，然后通过吸入异氟醚麻醉并通过在第1天(对于载体对照小鼠)和第15和29天(4只小鼠/组/天)心脏或者腹部主动脉穿刺收集终末血样。将血液转移至Vacutainer商标管。优选的抗凝剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
使用本领域公知的自动化临床分析仪(例如，Coulter，Inc.生产的)对血样评估终点测量红细胞合成和生理机能，诸如血细胞比容(Hct)、血红蛋白(Hgb)和总红细胞数(RBC)。
本发明不局限于本文描述的具体实施方案的范围。实际上，根据前面的描述和附图，除了本文描述的之外，对本发明的多种修改对于本领域技术人员是显而易见的。这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
还将理解所有值都是近似的，并且提供这些值用于描述。
本发明的说明书中引用和讨论了多篇参考文献，包括专利、专利申请和多种出版物。提供这些参考文献的引用和/或讨论仅仅是用于阐明本发明的内容并且不是承认任何此类参考文献是本发明的“现有技术”。该说明书中引用和讨论的所有参考文献在此完整引入本文作为参考，就像每个参考文献单独并入作为参考一样。

Claims (58)

1.肽，其包含选自根据图1A-1K的SEQ ID NO：1-668的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的肽，其中所述肽的N末端乙酰化。
3.根据权利要求1的肽，其中所述肽是单体。
4.根据权利要求1的肽，其中所述肽是二聚体。
5.根据权利要求4的肽，其中所述肽是同型二聚体。
6.根据权利要求1的肽，其进一步包含共价结合所述肽的一种或多种水溶性聚合物。
7.根据权利要求6的肽，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
8.根据权利要求7的肽，其中所述PEG包含具有约500至约60,000道尔顿分子量的线性不分支分子。
9.根据权利要求8的肽，其中所述PEG具有小于约20,000道尔顿的分子量。
10.根据权利要求8的肽，其中所述PEG具有约20,000至约60,000道尔顿的分子量。
11.根据权利要求8的肽，其中所述PEG具有约20,000至约40,000道尔顿的分子量。
12.根据权利要求8的肽，其中两个PEG部分共价结合所述肽，每个所述PEG包含线性不分支的分子。
13.根据权利要求12的肽，其中每个所述PEG具有约20,000至约30,000道尔顿的分子量。
14.根据权利要求1的肽，其中所述肽结合并活化红细胞生成素受体(EPO-R)。
15.肽二聚体，其包含：
(a)第一条肽链；
(b)第二条肽链；和
(c)连接所述第一和第二条肽链的连接部分，
其中所述第一条肽链和所述第二条肽链中的至少一条包含选自根据图1A-1K的SEQ ID NO：1-668的氨基酸序列，并且所述肽结合并活化红细胞生成素受体(EPO-R)。
16.根据权利要求15的肽二聚体，其中所述连接部分包含式：-NH-R3-NH-，其中R3为低级(C1-6)亚烷基。
17.根据权利要求16的肽二聚体，其中所述连接部分是赖氨酸残基。
18.根据权利要求15的肽二聚体，其中所述连接部分包含式：-CO-(CH2)n-X-(CH2)m-CO-，其中n为0到10的整数，m为1到10的整数，X选自O、S、N(CH2)pNR1、NCO(CH2)pNR1和CHNR1，R1选自H、Boc和Cbz，p为1到10的整数。
19.根据权利要求18的肽二聚体，其中n和m均为1，X为NCO(CH2)pNR1，p为2且R1为H。
20.根据权利要求15的肽二聚体，其进一步包含水溶性聚合物。
21.根据权利要求20的肽二聚体，其中所述水溶性聚合物共价结合连接体部分。
22.根据权利要求15的肽二聚体，其进一步包含间隔臂部分。
23.根据权利要求22的肽二聚体，其中所述间隔臂部分包含式：-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-，其中α、β和ε每个都是整数，它们的值独立地选自1到6，δ为0或1，γ为选自0到10的整数且Y选自NH或CO，条件是γ大于1时β为2。
24.根据权利要求23的肽二聚体，其中α、β和ε均为2，γ和δ均为1，并且Y为NH。
25.根据权利要求22的肽二聚体，其进一步包含一种或多种水溶性聚合物。
26.根据权利要求25的肽二聚体，其中所述水溶性聚合物共价结合间隔臂部分。
27.根据权利要求20或25的肽二聚体，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
28.根据权利要求27的肽二聚体，其中所述PEG是具有约500至约60,000道尔顿分子量的线性不分支PEG。
29.根据权利要求28的肽二聚体，其中所述PEG具有约500至小于约20,000道尔顿的分子量。
30.根据权利要求28的肽二聚体，其中所述PEG具有约20,000到60,000道尔顿的分子量。
31.根据权利要求30的肽二聚体，其中所述PEG具有约20,000至约40,000道尔顿的分子量。
32.根据权利要求27的肽，其中两个PEG部分共价结合所述肽，每个所述PEG包含线性不分支的分子。
33.根据权利要求32的肽，其中每个所述PEG具有约20,000至约30,000道尔顿的分子量。
34.治疗患者的方法，其包括对具有特征是红细胞生成素不足，或者血红细胞群体低或者有缺陷的疾病的患者施用治疗有效量的肽，所述肽包含选自根据图1A-1K的SEQ ID NO：1-668的氨基酸序列。
35.根据权利要求34的方法，其中所述疾病选自：末期肾衰竭或透析、与AIDS、自身免疫病或者恶性肿瘤相关的贫血、β-地中海贫血、囊性纤维化、早熟性早期贫血、与慢性炎症疾病相关的贫血、脊髓损伤、急性失血、衰老以及伴随异常红细胞生成的肿瘤疾病状态。
36.根据权利要求34的方法，其中所述肽是单体。
37.根据权利要求34的方法，其中所述肽是二聚体。
38.根据权利要求37的方法，其中所述肽是同型二聚体。
39.根据权利要求34的方法，其中一种或多种水溶性聚合物共价结合所述肽。
40.根据权利要求39的方法，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
41.根据权利要求40的方法，其中所述PEG是具有约500至约60,000道尔顿分子量的线性不分支PEG。
42.根据权利要求41的方法，其中所述PEG具有约500至小于约20,000道尔顿的分子量。
43.根据权利要求41的肽二聚体，其中所述PEG具有约20,000至约60,000道尔顿的分子量。
44.根据权利要求43的方法，其中所述PEG具有约20,000至约40,000道尔顿的分子量。
45.根据权利要求40的方法，其中两个PEG部分共价结合所述肽，每个所述PEG包含线性不分支的分子。
46.根据权利要求45的方法，其中每个所述PEG具有约20,000至约30,000道尔顿的分子量。
47.药物组合物，其包含：
(i)肽，其包含选自根据图1A-1K的SEQ ID NO：1-668的氨基酸序列；和
(ii)可药用的载体。
48.根据权利要求47的药物组合物，其中所述肽是单体。
49.根据权利要求47的药物组合物，其中所述肽是二聚体。
50.根据权利要求49的药物组合物，其中所述肽是同型二聚体。
51.根据权利要求50的药物组合物，其中一种或多种水溶性聚合物共价结合所述肽。
52.根据权利要求51的药物组合物，其中所述水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
53.根据权利要求52的药物组合物，其中所述PEG是具有约500至约60,000道尔顿分子量的线性不分支PEG。
54.根据权利要求53的药物组合物，其中所述PEG具有约500至小于约20,000道尔顿的分子量。
55.根据权利要求53的药物组合物，其中所述PEG具有约20,000至约60,000道尔顿的分子量。
56.根据权利要求55的药物组合物，其中所述PEG具有约20,000至约40,000道尔顿的分子量。
57.根据权利要求52的药物组合物，其中两个PEG部分共价结合所述肽，每个所述PEG包含线性不分支的分子。
58.根据权利要求57的药物组合物，其中每个所述PEG具有约20,000至30,000道尔顿的分子量。
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