PT964702E - Polipéptidos tendo um único polímero solúvel em água ligado ao n-terminal por covalência - Google Patents

Polipéptidos tendo um único polímero solúvel em água ligado ao n-terminal por covalência Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
"POLIPÉPTIDOS TENDO UM ÚNICO POLÍMERO SOLÚVEL EM ÁGUA LIGADO AO N-TERMINAL POR COVALÊNCIA"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a polipéptidos, os quais têm ligado um polímero único, solúvel em água, nos seus terminais N. Estes polipéptidos têm propriedades que os tornam vantajosos para utilização como agentes farmacêuticos e de diagnóstico. A invenção refere-se, igualmente, a métodos de produção destes polipéptidos e composições farmacêuticas e kits relacionados.
Antecedentes da Invenção São citadas várias publicações ao longo deste pedido. A divulgação destas publicações é, deste modo, incorporada por referência neste pedido, para descrever mais completamente o estado da técnica à qual esta invenção pertence.
Nos últimos anos, têm sido utilizados polímeros solúveis em água, não-antigénicos, tal como polietilenoglicol ("PEG"), para a modificação covalente de polipéptidos com importância terapêutica e de diagnóstico. Por exemplo, tem sido referido que a ligação covalente do PEG a polipéptidos terapêuticos, tais como, interleucinas (Knauf, M. J. et al., J. Biol. Chem. 1988, 263, 15064; Tsutsumi, Y. et al., J. Controlled Release 1995, 33, 1 447), interferões (Kita, Y. et al., Drug Des. Delivery 1990, 6, 157), catalase (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 1977, 252, 3, 582), superóxido dismutase (Beauchamp, C. O. et al., Anal.
Biochem. 1983, 131, 25) e desaminase de adenosina (Chen, R. et al., Biochim. Biophy. Acta 1981, 660, 293), aumente a sua meia vida in vivo e/ou reduza a sua imunogenicidade e antigenicidade.
No entanto, esses métodos apresentam desvantagens significativas. Especificamente, na maioria dos casos, as moléculas do PEG são ligadas através dos grupos amina dos polipéptidos, utilizando PEG metoxilado ("mPEG") tendo partes reactivas diferentes. Esses polímeros incluem mPEG-succinato de succinimidilo, mPEG-carbonato de succinimidilo, mPEG-imidato e mPEG-cloreto cianúrico. A ligação utilizando estes polímeros foi, normalmente, não-específica, i. e., ocorrendo em vários grupos amina dos polipéptidos, de uma forma aleatória e não exclusivamente num grupo amina em particular. Essa ligação não-específica pode modificar os resíduos de aminoácido nos locais activos de tal forma que elimina a actividade biológica dos polipéptidos. Os conjugados resultantes podem, igualmente, conter uma mistura heterogénea do polipéptido modificado que é indesejável para utilização farmacêutica.
Para superar estes problemas, foi pretendido ligar um polímero a um polipéptido de um modo específico para um local. Em relação ao polipéptido, proceder deste modo, poderá conservar a actividade biológica, prolongar o tempo de circulação sanguínea, reduzir a imunogenicidade, aumentar a solubilidade aquosa e intensificar a resistência a digestão por proteases. A peguilação específica para um local no N-terminal, cadeia lateral e terminal C de um análogo potente do factor de libertação da hormona de crescimento, foi realizada através de 2 síntese em fase sólida (Felix, A. M. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1995, 46, 253). Uma vez que a peguilação específica foi realizada durante a montagem do péptido numa resina, o método não pode ser aplicado a um péptido existente.
Um método adicional utilizado envolveu a ligação de um péptido às extremidades de cadeias de PEG acopladas na superfície de lipossomas, de uma forma específica para um local, através de um grupo aldeído reactivo no N-terminal, produzido por oxidação da treonina N-terminal com periodato de sódio (Zalipsky, S. et al., Bioconj. Chem. 1995, 6, 705). No entanto, este método encontra-se limitado a polipéptidos com resíduos de serina ou de treonina N-terminais.
Foram, igualmente, descritos métodos baseados em enzimas para introduzir grupos activados, especificamente no terminal C de um polipéptido (Schwarz, A. et al., Methods Enzymol. 1990, 184, 160; Rose, K. et al., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 154; Gaertner, H. F. et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 7224). Tipicamente, estes grupos activos podem ser hidrazida, aldeído e grupos amina aromáticos, para ligação subsequente de sondas funcionais a polipéptidos. No entanto, uma vez que os métodos são baseados na especificidade de proteases, estes requerem uma precaução extrema e o âmbito da sua aplicação é limitado. A mutagénese específica para um local é uma outra abordagem que tem sido utilizada para preparar polipéptidos para a ligação específica para um local de polímeros. O documento WO 90/12874 descreve a peguilação dirigida para um local de proteínas modificadas pela inserção de resíduos de cisteína ou a substituição de outros resíduos por resíduos de cisteína. Esta publicação descreve, igualmente, a preparação de mPEG- 3 eritropoietina ("mPEG-EPO") fazendo reagir um derivado de mPEG especifico para a cisteina com um resíduo de cisteína introduzido recombinantemente na EPO. De um modo semelhante, a interleucina-2 foi peguilada no seu local de glicosilação após mutagénese dirigida para um local (Goodson, R. J. et al., Bio/Technology 1990, 8, 343).
As glicoproteínas proporcionam hidratos de carbono como locais alvo adicionais para a modificação. A enzima peroxidase foi modificada com PEG-diamina, através da sua parte hidrato de carbono (Urrutiogoity, M. et ai., Biocatalysis 1989, 2, 145). O documento WO 94/28024 descreve os métodos para preparar mPEG-EPO através de hidratos de carbono oxidados com periodato. A guímica associada consistiu na formação de hidrazona, por reacção de mPEG-hidrazida com grupos aldeído da parte hidrato de carbono na EPO. Este tipo de modificação produz grupos aldeído reactivos através de um passo de oxidação, o qual, potencialmente, pode oxidar vários tipos de resíduos de açúcares na parte hidrato de carbono e alguns resíduos de aminoácido no polipéptido, tal como a metionina. Outra desvantagem deste método provém da heterogeneidade das partes de hidrato de carbono da EPO. A EPO expressa a partir de células de ovário de hamster chinês tem quatro cadeias de hidratos de carbono, as quais incluem três cadeias ligadas a N nas asparaginas 24, 38 e 83 e uma cadeia ligada a O na serina 126. Foi identificado um total de 52 estruturas oligosacarídicas diferentes ligadas a N e, pelo menos, 6 ligadas a O, (Rush, R. S. et ai., Anal. Chem. 1995, 67, 1442; Linsley, K. B. et al., Anal. Blochem. 1994, 219, 207).
Consequentemente, é difícil controlar o número ou os locais de ligação das moléculas de polímero, quando estas modificam a EPO ou outra proteína através das suas cadeias de hidrato de carbono. 4
Em resumo, os métodos na técnica de ligação de um polímero solúvel em água a um polipéptido, apresentam desvantagens significativas. Estas desvantagens incluem o seguinte: (a) uma falta de precisão, tanto estequiometricamente, como no que respeita à localização da ligação; (b) a necessidade de realizar técnicas difíceis e de trabalho intensivo, tais como mutagénese específica para um local; (c) a necessidade de utilizar síntese peptídica em fase sólida simultaneamente com a ligação do polímero, em lugar de ligar um polímero a um polipéptido pré-existente; e (d) a exigência rigorosa de que a identidade do resíduo de aminoácido N-terminal seja treonina ou serina.
Durante algum tempo, verificou-se uma necessidade de um método geral de ligação de um polímero solúvel em água ao resíduo de aminoácido N-terminal de um polipéptido, especificamente para um local, em que o método não sofresse das desvantagens identificadas acima. No entanto, esse método não existe.
Sumário da Invenção
Esta invenção proporciona duas composições de matéria. A primeira composição de matéria consiste, essencialmente, num polipéptido e num polímero solúvel em água covalentemente ligado a este no átomo de carbono α N-terminal do polipéptido, através de uma ligação de hidrazona ou ligação de hidrazona reduzida, com a condição de que (a) o polímero tenha um peso molecular de 700 a 20000 daltons, (b) a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina α N-terminal e 5 (c) o resíduo de aminoácido N-terminal do polipéptido não seja serina ou treonina.
Esta invenção proporciona, igualmente, quatro métodos para ligar covalentemente um polímero solúvel em água ao átomo de carbono α N-terminal de um polipéptido. 0 primeiro método, o qual liga o polímero ao átomo de carbono através de uma ligação de hidrazona, compreende os passos de (a) fazer contactar o polipéptido com (i) ião glioxilato ou seu derivado numa concentração de desde 0,1 M a 2,0 M, (ii) um ião de um metal de transição numa concentração de desde 10 μΜ a 1 M e (iii) uma base de Lewis numa concentração de desde 10 mM a 10 M, a um pH de desde 5,0 a 7,0 e uma temperatura de desde 0 °C a 100 °C, para formar um polipéptido transaminado que tem um grupo carbonilo oí N-terminal; e (b) fazer contactar o polipéptido transaminado, a um pH de desde 3,0 a 5,0, com um polímero solúvel em água, tendo uma parte covalentemente ligada a este, o qual reage com o grupo carbonilo oí N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o polímero ao átomo de carbono oí N-terminal do polipéptido, através de uma ligação de hidrazona, com a condição de que o polímero tenha um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons e que a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina oí N-terminal. 6
Esta invenção proporciona, igualmente, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz da presente primeira composição e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Finalmente, esta invenção proporciona kits para utilização na preparação das presentes composições. 0 primeiro kit, para a preparação da primeira presente composição, compreende o seguinte: (a) um ião glioxilato ou seu derivado; (b) um ião de um metal de transição; (c) uma base de Lewis; e (d) um polímero solúvel em água tendo um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons e tendo uma parte covalentemente ligada a este, a qual reage com o grupo carbonilo α N-terminal de um polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o polímero ao átomo de carbono α N-terminal do polipéptido.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1 mostra um esquema para a preparação de uma EPO modificada no N-terminal. Esta é uma reacção em dois passos: transaminação e peguilação. Foram utilizados quatro derivados do mPEG5000 (í. e., mPEG tendo um p.m. de 5000 daltons) com carboxilato de hidrazina (HZC), hidrazida (HZ), 7 semicarbazida (SCZ) e grupos funcionais oxilamina.
Figura 2 mostra o cromatograma da filtração em gel de mPEG-EPO com uma ligação de hidrazona formada utilizando uma parte carboxilato de hidrazina (HZC), EPO nativa e mPEG5000 carboxilato de hidrazina numa coluna TSK G3000SWXL (7,5 x 30 mm). A fase móvel é o citrato de sódio 20 mM (pH 7,0) contendo NaCl 100 mM.
Figura 3 mostra espectros de massa de duração do trajecto por dessorção com laser auxiliada por uma matriz, de mPEG5000 carboxilato de hidrazina, EPO nativa e mPEG-EPO com uma ligação de hidrazona formada utilizando uma parte carboxilato de hidrazina (HZC).
Figura 4 mostra a caracterização de mPEG-EPO por métodos electroforéticos: (1) SDS-PAGE a 4-15%, coloração de Coomassie; (2) transferência de Western; (3) SDS-PAGE a 4-15%, coloração de iodo; e (4) Focagem isoeléctrica (IEF, pH 3-7). Faixa 1, marcadores de PM ou pi; Faixa 2, EPO nativa; Faixa 3, EPO Transaminada; e Faixas 4 e 5, mPEG-EPO com ligações de hidrazona formadas utilizando, respectivamente, partes carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ).
Figura 5 mostra um gráfico dos resultados de um ensaio ELISA de mPEG-EPO com ligações de hidrazona 8 formadas utilizando partes carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) .
Figura 6 mostra um gráfico dos resultados de um ensaio de proliferação celular de EPO nativa, EPO transaminada e mPEG-EPO com ligações de hidrazona formada utilizando partes carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ).
Figura 7 mostra um gráfico dos resultados de um bioensaio num murganho ex-hipóxico para mPEG-EPO com ligações de hidrazona formadas utilizando partes carboxilato de hidrazina (HZC), hidrazida (HZ) e semicarbazida (SCZ).
Descrição Detalhada da Invenção
Esta invenção proporciona duas composições de matéria. A primeira composição de matéria consiste, essencialmente, num polipéptido e num polímero solúvel em água, covalentemente ligado a este no átomo carbono α N-terminal do polipéptido, através de uma ligação de hidrazona ou ligação de hidrazona reduzida, com a condição de que (a) o polímero tenha um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons, (b) a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina a N-terminal e (c) o resíduo de aminoácido N-terminal do polipéptido não seja serina ou treonina.
Como aqui utilizado, "polipéptido" inclui tanto péptidos como proteínas. "Péptido" significa um polipéptido com menos de 10 resíduos de aminoácido de comprimento e "proteína" significa um polipéptido com 10 ou mais resíduos de aminoácido de comprimento. Nesta invenção, os polipéptidos podem ser de ocorrência natural ou recombinantes (í. e. produzidos através de tecnologia de ADN recombinante) e podem conter mutações (e. g. mutações pontuais, de inserção e de eliminação), assim como outras modificações covalentes (e. g. glicosilação e marcação [através de biotina, estreptavidina, fluoracina e isótopos radioactivos, tais como, I131) . Para além disso, cada presente composição pode conter mais do que um único polipéptido, í. e., cada um pode ser um monómero (um polipéptido ligado a um polímero) ou um multímero (dois ou mais polipéptidos ligados a um polímero ou entre si).
Os polipéptidos incluem, a título de exemplo, anticorpos monoclonais e policlonais, citocinas, tais como, M-CSF e GM-CSF, linfocinas, IL-2, IL-3, factores de crescimento, tais como PDGF e EGF, hormonas peptídicas, tais como hGH, EPO e seus derivados, factores de coagulação sanguínea, tais como Factor VIII, imunogénios, enzimas, inibidores de enzima e outros ligandos. Na forma de realização preferida das presentes composições, o polipéptido é EPO ou um seu derivado. A EPO pode ser de ocorrência natural ou recombinante. Os derivados da EPO incluem, mas não estão limitados aos polipéptidos GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG, VGNYMCHFGPITWVCRPGGG, GGVYACRMGPITWVC SPLGG, VGNYMAHMGPITWVCRPGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ, GGLYACHMGPMTWVCQPLRG, 10 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA, YSCHFGPLTWVCK e YCHFGPLTWVC, assim como os mutantes listados na Tabela 1 abaixo
Tabela 1
Mutação Actividade em relação a wt* Referência L5S +/- 9 L5S/W51S/M54S/V82S/W88S/ L112A/A124S/A125S +/- 9 S9A ++++ 3
Rl OA ++++ 3 E13A ++++ 3 R14L ++++ 3 R14A ++ 3 L17A ++++ 3 E18A ++++ 3 K20A ++++ 3 E21A ++++ 3 N24Q ++ 1 N24Q/N83Q + 1 N24Q/N38Q/N83Q +++ 1 C29Y/C33Y ++++ 3 A30S/L35S +++ 9 A30S/A124S/A125S ++ 9 C33P/R139C ++++ 7 L35S/A124S/A125S ++ 9 N38Q ++ 1 N38Q/N83Q ++++ 1 11
V41S
Κ45Α F48S Y49S A50S W51S W51S/V144S W51S/V82S/W88S + /- + + + 9 3 3 3 3 3 9 9 W51S/V82S/W88S/V144N W51S/V82S/W88S/L112A/I119A + + 9 A124S/A125S W51S/M54S/V82S/W88S/A124S + + + 9 A125S W51S/M54S/V82S/W88S/L112A/ + + 9 A124S/A125S + 9 W51S/M54S/V82S/W88S/L112A A124S/A125S/L130A + + + 9 W51S/M54S/V82S/W88S/I119A A124S/A125S W51S/M54S/V82S/W88S/L112A + 9 I119A/A124S/A125S W51S/M54S/V82S/W88S/A124S + + + 9 A125S/L130A W51S/V82S/W88S/A125S/A125S + + + 9 L130A + + + 9 K52S +++ + 3 M54L +++ + 10 M54S/V56S W57S/V82S/W88S/L112A/I119A +++ + 9 A124S/A125S + + + 9 Ε62Α +++ + 3 W64A +++ + 3 Q65A +++ + 3 G6 6 A +++ + 3 12
L69A L69N S 7 ΙΑ A73G R7 6A V82S V82S/W88S/V144N V82S/W88S/A124S/A125S N83Q Q92A L93A K97A S100A G101A L102A R103A S104A S104N L105A L105F T106A T107A L108A L109A L112A L112A/I119S/L130A/I133A P122Q A124P/A125T A125T A125N/A127S L130A D136A R139A Kl 4 OA
+ + + + + /-+ + + /-+++ + + + + + + + + + + /-
+++ + + /-
3 4 3 3 3 9 9 9 9 3 3 3 3 3 8 2 3 6 8 6 3 8 3 8 9 9 6 4 4 4 9 3 3 3 13 R143A +++ S146A +++ Ν147Α +++ R150A +++ Κ152Α + + L15 3A + + + K154A +++ L155A +++ Y156A ++ T157A +++ G158A +++ E159A +++ R162K/T163D/G164E/D165L ++ R162H/T163H/G164H/D165H/ r!66H/(167)H +++ LO 1 C\] + + 5113-17 +++ + 513 2-36 + + 5143-47 + + 5153-57 + + 5178-82 + 51111-119 + + + 51115-121 + + + 51120-122 +++ + 51123-125 +++ + 51126-129 + + + 51163-166 +++ + K116 (inserção de LISEEDL) +++ + Φ Em relação ao tipo selvagem é definido como se segue: ++++ = actividade do tipo selvagem ou melhor + + + = c . a . 75% da actividade do tipo selvagem + + = c . a . 50% da actividade do tipo selvagem + = c . a . 25% da actividade do tipo selvagem 14 + /- = EPO mutante descrita como sendo activa, no entanto, os dados não são suficientes para uma avaliação da actividade em relação ao tipo selvagem.
Referências Citadas 1) Akai, K., Yamaguchi, K. e Ueda, M., Modified forms of human erythropoietin and DNA sequences encoding genes which can express them, documento EP 0427189 AI. (2) Bittorf, T., Jaster, R. e Brock, J. (1993) FEBS Letts. 336: 133-136. (3) Resultados de Bunn, H.F., et al. (4) Byrne, T.E. e Elliott, S.G., Erythropoietin isoforms, documento EP 0668351 Al. (5) Chern, Y., Chung, T., e Sytkowski, A.J. (1991) Eur. J. Biochem. 202: 225-229. (6) Funakoshi, A., Muta, H., Baba, T. e Shimizu, S. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 717-722. (7) Okasinski, G., Devries, P.J., Mellovitz, B.S., Meuth, J.L. e Schaefer, V.G., Erythropoietin analog compositions and methods, documento WO 94/25055. 15 (8) Grodberg, J., Davis, K.L. e Sytkowski, A.J. (1993) Eur. J. Biochem. 218: 597-601. (9) Resultados de Pulito, V. et al. (10) Shoemaker, C. B., Erythropoietin composition, documento U.S. 4835260.
Como aqui utilizado, "função natural" de um polipéptido significa a sua função antes da modificação covalente do seu grupo amina oí N-terminal. As funções naturais incluem, por exemplo, actividade enzimática, ligação a receptores (e. g. anticorpos), ligação a ligandos e imunogenicidade.
Os presentes métodos, abaixo descritos mais completamente, causam a perda do grupo amina oí N-terminal do polipéptido que é covalentemente modificado. Consequentemente, o polipéptido deve ter uma estrutura primária, de forma a que a sua função natural seja conservada após a modificação covalente e não possa ser eliminada. A função natural do polipéptido é "eliminada" pela remoção do seu grupo amina α N-terminal se essa remoção reduzir, em mais de 99%, a capacidade do polipéptido para realizar a sua função natural. Numa forma de realização, a remoção não reduz a capacidade do polipéptido para realizar a sua função natural em mais de 90%. Na forma de realização preferida, a remoção não reduz a capacidade do polipéptido realizar a sua função natural em mais de 50%.
Como aqui utilizado, uma "ligação de hidrazona" é uma ligação que compreende a estrutura covalente NH-N=C e uma "ligação de hidrazona reduzida" é uma ligação que compreende a estrutura covalente NH-NH-C. São aqui proporcionados compostos 16 contendo ligações de hidrazona reduzida, uma vez que estas ligações possuem uma maior estabilidade química.
Como discutido em cima, são conhecidos na técnica métodos de ligação de polímeros solúveis em água ao átomo de carbono a N-terminal de um polipéptido, através de uma ligação de hidrazona, contanto que o resíduo de aminoácido N-terminal seja serina ou treonina. Estes métodos conhecidos não irão funcionar em polipéptidos tendo qualquer outro resíduo N-terminal. Embora estes métodos conhecidos difiram, fundamentalmente, dos presentes métodos, estes resultam em polipéptidos com serina e treonina N-terminal, tendo um polímero ligado ao átomo de carbono α N-terminal, através de uma ligação de hidrazona. Por este motivo, a presente primeira composição não abrange um polipéptido ligado a um polímero através de uma ligação de hidrazona, em que o resíduo de aminoácido N-terminal do polipéptido seja serina ou treonina.
Os polímeros solúveis em água utilizados na presente invenção incluem, (d) polialquilenoglicol e seus derivados, incluindo PEG, mPEG, homopolímeros de PEG, homopolímeros de polipropilenoglicol, copolímeros de etilenoglicol com polipropilenoglicol, em que os referidos homopolímeros e copolímeros são não substituídos ou substituídos numa extremidade com um grupo alquilo. Estes polímeros podem ser lineares, ramificados ou em forma de estrela, com uma ampla variedade de pesos moleculares. Na forma de realização preferida, o polímero é mPEG.
Quando as presentes composições se destinam a ser utilizadas como fármacos, o polímero é não- -tóxico. Para além disso, quando é referido que um polímero tem um dado peso 17 molecular, esse peso molecular apenas pode ser aproximado, reflectindo o peso molecular médio de uma população de moléculas de polímero diferindo entre si, no que respeita ao número de subunidades presentes em cada molécula.
Na forma de realização preferida, o PEG ou seu derivado tem um peso molecular de, cerca de, 5000 daltons. Do mesmo modo, na forma de realização preferida das presentes composições, o polipéptido é EPO e o polímero é mPEG tendo um peso molecular de, cerca de, 5000 daltons.
Esta invenção proporciona, igualmente, quatro métodos para a ligação covalente de um polímero solúvel em água ao átomo de carbono α N-terminal de um polipéptido. O primeiro método, o qual liga o polímero ao átomo de carbono através de uma ligação de hidrazona, compreende os passos de (a) fazer contactar o polipéptido com (i) ião glioxilato ou seu derivado numa concentração de desde 0,1 M a 2,0 M, (ii) um ião de um metal de transição numa concentração de desde 10 μΜ a 1 M e (iii) uma base de Lewis numa concentração de desde 10 mM a 10 M, a um pH de desde 5.0 a 7,0 e a uma temperatura de desde 0 °C a 100 °C, para formar um polipéptido transaminado, que tem um grupo carbonilo α N-terminal; e (b) fazer contactar o polipéptido transaminado, a um pH de 3.0 a 5,0, com um polímero solúvel em água tendo uma parte covalentemente ligada a este, o qual reage com o grupo carbonilo α N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o polímero ao átomo 18 de carbono α N-terminal do polipéptido, através de uma ligação de hidrazona, com a condição de que o polímero tenha um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons e a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina α N-terminal. O terceiro método compreende os passos do primeiro método, assim como um passo adicional de redução da ligação de hidrazona formada no passo (b) . O passo de redução pode ser realizado utilizando, por exemplo, boro-hidreto de sódio (NaBH4) e cianoboro-hidreto de sódio (NaBH3CN) , de acordo com métodos conhecidos.
Os derivados do ião glioxilato incluem, mas não estão limitados a, glioxilamida e iões fenilglioxilo. Os iões de metais de transição incluem, mas não estão limitados a iões cúpricos, de níquel, de cobalto ou de zinco. As bases de Lewis incluem, mas não estão limitadas a, acetato e piridina.
As partes que reagem com o grupo carbonilo α N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona incluem, mas não estão limitadas a, carboxilato de hidrazina, hidrazina, semicarbazida, hidrazida, tiosemicarbazida, ácido carbónico di-hidrazida, carbazida, tiocarbazida e aril-hidrazida. Encontram-se comercialmente disponíveis polímeros solúveis em água com estas partes covalentemente ligadas a estes. Para além disso, as partes que reagem com o grupo carbonilo α N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de oxima incluem, mas não estão limitadas a, oxilamina. Encontram-se comercialmente disponíveis polímeros solúveis em água com oxilamina (assim como outras partes formadoras de oxima) covalentemente ligada a estes. 19
Na forma de realização preferida dos presentes métodos, a proteína é EPO ou um seu derivado.
Na forma de realização preferida, o PEG ou seu derivado tem um peso molecular de, cerca de, 5000 daltons.
Numa forma de realização do primeiro método, a parte ligada ao polímero, a qual é feita reagir com o polipéptido transaminado é carboxilato de hidrazina. Na forma de realização preferida, o polipéptido é EPO, o polímero é mPEG tendo um peso molecular de, cerca de, 5000 daltons e a parte covalentemente ligada ao polímero é carboxilato de hidrazina.
Em cada um dos presentes métodos, o tempo de contacto preferido para o passo (a) é de 20 minutos a 2 horas e para o passo (b) , o tempo de contacto preferido e a temperatura são, respectivamente, de 10 a 50 horas e de 4 °C até à temperatura ambiente.
Em determinados polipéptidos, o N-terminal de um polipéptido encontra-se "ocultado", í. e. não o expondo a solventes ou reagentes, quando o polipéptido se encontra na sua conformação nativa. Podem ser utilizados reagentes, tais como, tetrametilureia ou ureia para desnaturar um desses polipéptidos, de forma a permitir que o seu resíduo N-terminal sofra as reacções necessárias dos presentes métodos.
Esta invenção proporciona, igualmente, uma composição farmacêutica, a qual compreende uma quantidade eficaz da presente primeira ou segunda composição e um veículo farmaceuticamente aceitável. A título de exemplo, a presente 20 composição farmacêutica pode compreender uma quantidade da presente mPEG-EPO, eficaz para o tratamento de um sujeito que sofra de anemia.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos especialista na técnica e incluem, mas não estão limitados a, tampão de fosfato 0,01-0,1 M e, de um modo preferido, 0,05 M ou soro fisiológico a 0,8%. Adicionalmente, esses veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser soluções, suspensões e emulsões, aquosas ou não-aquosas. Propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como, azeite e ésteres orgânicos injectáveis, tais como, oleato de etilo, são exemplos de solventes não-aquosos. Os veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, solução de Ringer com dextrose, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer com lactato ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólitos, tais como os baseados em solução de Ringer com dextrose e semelhantes. Podem, igualmente, encontrar-se presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes e semelhantes.
Finalmente, esta invenção proporciona kits para utilização na preparação das presentes composições. O primeiro kit, para preparação da primeira presente composição, compreende o seguinte: 21 (a) um ião glioxilato ou seu derivado; (b) um ião de metal de transição; (c) uma base de Lewis; e (d) um polímero solúvel em água tendo um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons e tendo uma parte covalentemente ligada a este, a qual reage com o grupo carbonilo α N-terminal de um polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o polímero ao átomo de carbono α N-terminal do polipéptido.
Os reagentes nestes kits podem ser embalados numa quantidade pré-determinada e podem ser contidos em compartimentos separados. Alternativamente, alguns reagentes podem ser contidos no mesmo compartimento, desde que as limitações dos presentes métodos o permitam. Finalmente, os kits podem compreender, adicionalmente, reagentes redutores para produzir ligações de hidrazona reduzida, de acordo com os presentes métodos, assim como tampões adequados e recipientes de reacção.
Esta invenção será melhor entendida por referência aos
Exemplos Experimentais que se seguem, mas os especialistas na técnica irão ter facilmente em consideração que as experiências específicas detalhadas são apenas ilustrativas da invenção, como descrito de uma forma mais completa nas reivindicações que se seguem. 22
Exemplos Experimentais 1. Preparação de EPO Transaminada
Foram permutados 5 mg de EPO, em citrato de sódio 20 mM (pH 6,9) e NaCl 100 mM, com tampão acetato de sódio 100 mM (pH 7,0) utilizando Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA) . As concentrações finais foram ajustadas para EPO 1 mg/mL, acetato de sódio 2 M, ácido acético 0,4 M, ácido glioxílico 0,1 M e sulfato cúprico 10 mM (pH 5,5) (Figura 1). A reacção foi deixada durante 2 horas à temperatura ambiente e foi inactivada pela adição de 100 mL de EDTA 0,5 Μ. A EPO transaminada foi purificada através de uma coluna Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , utilizando um tampão acetato de sódio 100 mM (pH 4,5). A extensão da transaminação foi estimada pela 2,4-dinitrofenil-hidrazina, como descrito na literatura (Fields, R. et al., Biochem. J.r 1971, 121, 587). A extinção a 370 nm foi medida após os primeiros minutos iniciais e após uma hora. A diferença na absorvência é proporcional à quantidade de grupos carbonilo presentes na molécula da EPO. A EPO transaminada foi, igualmente, submetida a análise de aminoácidos num sistema 420H ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando uma pré-coluna com química PITC. Os resultados indicam que os resíduos de lisina, i. e. os resíduos não-N-terminais, não se encontravam transaminados. 2. Preparação de mPEG-EPO com mPEG-Carboxilato de Hidrazina A EPO transaminada (1 mg) em acetato de sódio 100 mM (pH 4,5) foi ajustada para cloreto de sódio 0,5 M, num volume 23 final de 1 mL, à qual foram adicionados 10 mg de mPEG5000 carboxilato de hidrazina (Shearwater Polymers, Hunstville, AL) . A mistura de reacção foi agitada durante 40 horas à temperatura ambiente e foi purificada através de uma coluna Sephacryl S-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , utilizando tampão citrato de sódio 20 mM (7,0) contendo NaCl 100 mM. Adicionalmente, pode ser adicionado SDS a 0,1% à mistura de reacção, de forma a aumentar o rendimento da conjugação.
Na cromatografia de permeação em gel, o conjugado mPEG-EPO apresentou um peso molecular substancialmente aumentado em comparação com os da EPO e do mPEG5000 carboxilato de hidrazina (Figura 2).
Foi utilizada espectrometria de massa por dessorção com laser auxiliada por uma matriz (Finnigan-MAT LaserMAT 2000, duração do trajecto linear) para caracterizar a mPEG-EPO por determinação do peso molecular (Figura 3) . O mPEG5000 carboxilato de hidrazina apresenta um ião com m/z 5157,4. A EPO apresenta um monómero com duas cargas (m/z 14604), um monómero com uma carga (m/z 28569), um dimero (m/z 57208) e um trimero (m/z 85284). De um modo semelhante, mPEG-EPO apresenta um monómero com duas cargas (m/z 17092), um monómero com uma carga (m/z 34279), um dimero (m/z 69071) e um trimero (m/z 102955).
Um espectro de dicroismo circular (CD) (Jobin-YVON CD6, Dichrograph Spectrometer Instruments, SA, Edison, NJ) de mPEG-EPO mostrou que a proteína conservou a estrutura de feixes em hélice α presente na EPO nativa (dados não apresentados). Este resultado significa que uma molécula de PEG na extremidade N-terminal da EPO não interrompe a sua estrutura secundária. 24 3. Preparação de mPEG-EPO com mPEG-hidrazida. A EPO transaminada (1 mg) em acetato de sódio 100 mM (pH 4,5) foi ajustada para cloreto de sódio 0,5 M, SDS 0,1%, para um volume final de 1 mL e foram adicionados 10-20 mg de mPEG5000 hidrazida. A mistura de reacção foi agitada durante 40 horas, à temperatura ambiente e foi purificada através de uma coluna Sephacryl S-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , utilizando tampão citrato de sódio 20 mM (7,0), contendo NaCl 100 mM.
Os conjugados mPEG-EPO foram analisados por SDS-PAGE a 4-15% (Bio-Rad, Hercules, CA) com vários métodos: coloração de Coomassie (especifica para proteínas), transferência de Western (específica para EPO) e coloração de iodo (específica para PEG). A distância de migração em SDS-PAGE dos conjugados mPEG-EPO de peso molecular mais elevado é inferior à das EPO nativas. O padrão de focagem isoeléctrica indica que o ponto isoeléctrico (pi) da EPO não é significativamente alterado após a modificação. No entanto, a EPO transaminada é ligeiramente mais acídica do que a EPO e mPEG-EPO nativos.
Uma vez que as bandas da EPO e de mPEG-EPO são bem separadas através de SDS-PAGE, esta técnica pode ser utilizada para monitorizar a eficiência da reacção de conjugação. Foi observado que a reacção de conjugação foi >95% completada, quando utilizando mPEG5000-carboxilato de hidrazina, enquanto que a reacção foi completada em apenas cerca de 20%, quando utilizando mPEG5000-hidrazida, mPEG5000-semicarbazida ou mPEG5000-oxilamina. Deste modo, a parte carboxilato de hidrazina parece ser mais reactiva com grupos de carbonilo do que é a parte hidrazida, semicarbazida ou a oxilamina. 25
4. Reactividade de mPEG-EPO com Anticorpo Anti-EPO
Foi estudada a antigenicidade de mPEG-EPO, utilizando um kit de ELISA Quantikine™ IVD™ para EPO (R&D Systems, Minneapolis, MN). O ensaio consiste numa placa de microtitulação revestida com um anticorpo monoclonal contra a EPO. É permitida a interacção da EPO ou de mPEG-EPO com a placa revestida. Após a lavagem da placa, é adicionado um conjugado de anticorpo policlonal anti-EPO e peroxidase de rábano. Após a remoção do excesso de conjugado, é adicionado um cromógenio aos poços, o qual é oxidado pela reacção enzimática, para formar um complexo colorido azul. A absorvência deste complexo é medida a 450 nm.
Na Figura 5 são apresentados os resultados do ensaio ELISA de mPEG-EPO com uma ligação de hidrazona, formada a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ). Os dados indicam que, mesmo uma molécula de PEG ligada no N-terminal da EPO, reduz, significativamente, a afinidade da ligação do anticorpo monoclonal à EPO, possivelmente devido a impedimento estérico.
5. Actividade In vitro de mPEG-EPO A actividade biológica in vitro de mPEG-EPO foi avaliada através um ensaio de proliferação celular, utilizando células FDC-P1/HER, uma linha de células hematopoiéticas murinas. A linha celular expressa o receptor da EPO e é dependente da EPO para o crescimento. Após as células terem sido cultivadas na ausência de EPO durante 24 horas, foram adicionados EPO ou mPEG- 26 EPO as células. As células foram incubadas durante 42 horas e, seguidamente, foi adicionada timidina tritiada às células. Após 6 horas, o crescimento celular foi determinado pela incorporação de timidina.
Na Figura 6 são apresentados os resultados do ensaio de proliferação celular para a EPO transaminada e mPEG-EPO com ligações de hidrazona, formadas a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) . A EPO transaminada apresenta actividade biológica máxima, comparável com a da EPO nativa, como determinado pela sua ED50. As amostras de mPEG-EPO com ligações de hidrazona, formadas a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ), conservam apenas, respectivamente, 38,5% e 25% de actividade, como determinado pela sua ED50. Os dados indicam que uma molécula de PEG ligada ao N-terminal da EPO reduz, significativamente, a afinidade da EPO para o seu receptor, possivelmente, devido ao impedimento estérico.
6. Actividade In vivo de mPEG-EPO A actividade in vivo de mPEG-EPO foi avaliada através de um bioensaio com murganhos ex-hipóxicos (Coates, P.M. et al., Nature, 1961, 191, 1065). A formação de glóbulos vermelhos murinos endógenos é suprimida pela policitemia produzida através de exposições a pressão reduzida. A EPO ou o conjugado mPEG-EPO são injectados no nivel de 1 unidade/murganho. Foi administrado ferro-59, 48 horas após a injecção da EPO ou de mPEG-EPO. A incorporação de ferro-59, a qual indica a formação de novos glóbulos vermelhos sanguíneos, foi medida 48, 72 e 96 horas após a administração da EPO ou de mPEG-EPO. 27
Na Figura 7 são apresentados os resultados do bioensaio com murganhos ex-hipóxicos para mPEG-EPO com ligações de hidrazona, formadas com carboxilato de hidrazina (HZC), hidrazida (HZ) e semicarbazida (SCZ). As amostras de mPEG-EPO apresentam uma actividade in vivo mais elevada, assim como uma duração da actividade mais longa, em comparação com a EPO nativa. Os resultados in vivo, indicam que as amostras de mPEGEPO apresentam um tempo de circulação mais longo in vivo e a libertação contínua de EPO durante a circulação. 7. Preparação de mPEG-Dímero 17-29 de Fibrina 0 dímero 17-29 de fibrina tem a seguinte estrutura:
Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg-His-Gln-Ser-Ala-Cys-Lys
S
S
Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg-His-Gln-Ser-Ala-Cys-Lys
Foram dissolvidos 2 mg de dímero 17-29 de fibrina em 0,5 mL de acetato de sódio 2 M, ácido acético 0,4 M, ácido glioxílico 0,1 M e sulfato cúprico 10 mM (pH 5,5). Foi permitido o prosseguimento da reacção durante 2 horas à temperatura ambiente e esta foi inactivada adicionando 20 mL de EDTA 0,5 Μ. O dímero de fibrina transaminada foi purificado através de uma coluna Sephadex G-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , utilizando um tampão acetato de sódio 100 mM (pH 4,5). O dímero de fibrina transaminada apresentou uma significativa redução de Gly na análise de aminoácidos, indicando a transaminação da Gly N-terminal. 28
Foi adicionado 1 mg de dimero de fibrina transaminada em 0,5 mL de acetato de sódio 100 mM (pH 4,5), a 10 mg de mPEG5000 carboxilato de hidrazina. A mistura de reacção foi agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. O dimero mPEG-fibrina foi purificado por cromatografia de permuta aniónica com uma coluna HEMA IEC BIO CM (Alltech) . A fase móvel A foi acetato de sódio 20 mM (pH 5,5). A fase móvel B foi MOPS 0,2 M, fosfato de potássio monobásico 0,05 M e fosfato de potássio dibásico 0,25 M (pH 7,5) . O gradiente foi de 100% de A durante 5 minutos, seguidamente, de 0 a 100% de B durante 25 minutos. Foi recolhido para nova análise um novo pico aos 14,5 minutos, que apareceu antes do dimero de fibrina não modificado (18 minutos) . Um espectro de massa por dessorção com laser mostrou o ião com m/z 8070,9, o que comprovou que se encontrava ligada uma molécula de PEG ao dimero de fibrina (m/z 2986,8).
Lisboa, 14 de Novembro de 2006 29

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição de matéria consistindo, essencialmente, num péptido ou numa proteína e PEG ou um seu derivado, covalentemente ligado a esta no átomo de carbono oí N-terminal do polipéptido, com a condição de que (a) o PEG e o polipéptido se encontrem ligados entre si através de uma ligação de hidrazona ou uma ligação de hidrazona reduzida, (b) o PEG tem um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons, (c) a função natural do polipéptido não é eliminada após a remoção do seu grupo amina α N-terminal e (d) o resíduo de aminoácido N-terminal da proteína não é serina ou treonina.
  2. 2. Composição da reivindicação 1, em que a proteína é EPO ou um seu derivado.
  3. 3. Composição da reivindicação 1, em que o PEG ou o seu derivado têm um peso molecular de cerca de 5000 dalton.
  4. 4. Composição da reivindicação 1, em que a proteína é EPO e o PEG é mPEG tendo um peso molecular de cerca de 5000 dalton.
  5. 5. Método para ligar covalentemente PEG ao átomo de carbono α N-terminal de um polipéptido; o qual compreende os passos de: (a) fazer contactar o polipéptido com (i) um ião glioxilato ou um seu derivado numa concentração de desde 0,1 M a 2,0 M, (i i) um ião de metal de transição numa concentração de desde 10 μΜ a 1 M e 1 (iii) uma base de Lewis numa concentração de desde 10 mM a 10 M, a um pH de 5,0 a 7,0 e a uma temperatura de 0 °C a 100 °C, para formar um polipéptido transaminado tendo um grupo carbonilo a N-terminal; e (b) fazer contactar o polipéptido transaminado, a um pH de desde 3,0 a 5,0, com o PEG ou um seu derivado, tendo uma parte covalentemente ligada a este, a qual reage com o grupo carbonilo α N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o PEG ao átomo de carbono a N-terminal do polipéptido, com a condição de que o PEG tenha um peso molecular de desde 700 a 20000 dalton e a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina a N-terminal.
  6. 6. Método da reivindicação 5, em que a proteína é EPO ou um seu derivado.
  7. 7. Método da reivindicação 5, em que o PEG ou o seu derivado têm um peso molecular de cerca de 5000 dalton.
  8. 8. Método da reivindicação 5, em que a parte covalentemente ligada ao PEG é carboxilato de hidrazina.
  9. 9. Método da reivindicação 5, em que a proteína é EPO, o PEG é mPEG tendo um peso molecular de cerca de 5000 dalton e a parte covalentemente ligada ao PEG é carboxilato de hidrazina. 2
  10. 10. Método da reivindicação 5, o qual compreende, adicionalmente, o passo de redução da ligação de hidrazona formada no passo (b) de modo a formar uma ligação de hidrazona reduzida.
  11. 11. Composição farmacêutica, a qual compreende uma quantidade eficaz da composição da reivindicação 1 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  12. 12. Kit para utilização na preparação da composição da reivindicação 1, o qual compreende o seguinte: (a) um ião glioxilato ou seu derivado; (b) um ião de metal de transição; (c) uma base de Lewis; e (d) PEG ou um seu derivado, tendo um peso molecular de desde 700 a 20000 dalton e tendo uma parte covalentemente ligada a este, a qual reage com o grupo carbonilo oí N-terminal de um polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona, ligando covalentemente, deste modo, o PEG ao N-terminal ao átomo de carbono oí do polipéptido. Lisboa, 14 de Novembro de 2006 3
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Families Citing this family (167)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100361933B1 (ko) * 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
US6458953B1 (en) * 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
US7666400B2 (en) * 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
ES2327606T3 (es) 2000-01-10 2009-11-02 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de g-csf.
DE60138364D1 (de) 2000-02-11 2009-05-28 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
WO2001087329A1 (en) 2000-05-15 2001-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivate
AU2001268228A1 (en) 2000-06-08 2001-12-17 La Jolla Pharmaceutical Company Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide
KR20030032977A (ko) * 2000-07-12 2003-04-26 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 키모카인 수용체 조절제, 제조 및 사용
RU2003109746A (ru) * 2000-09-08 2005-01-27 Грифон Терапьютикс, Инк. (Us) Синтетические белки, стимулирующие эритропоэз
US7118737B2 (en) 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
AU2001290312A1 (en) * 2000-10-16 2002-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-modified erythropoietin
CN100528235C (zh) 2000-12-20 2009-08-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 红细胞生成素共轭物
ES2284858T3 (es) 2001-02-02 2007-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Tratamiento de disfuncion neurologica que comprende sulfamatos de fructopiranosa y eritropoyetina.
YU48703A (sh) 2001-02-27 2006-05-25 Maxygen Aps Novi interferonu beta-slični molekuli
US20040077835A1 (en) * 2001-07-12 2004-04-22 Robin Offord Chemokine receptor modulators, production and use
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
CA2468499A1 (en) 2001-11-28 2003-06-05 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Erythropoietin dosing regimen for treating anemia
US7473680B2 (en) 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
AU2003218045A1 (en) 2002-03-11 2003-09-29 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc Methods for shp1 mediated neuroprotection
DK1517710T3 (da) 2002-06-21 2011-07-18 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylerede faktor VII-glycoformer
EP1534269B1 (en) * 2002-07-19 2013-10-30 The General Hospital Corporation Oxime conjugates and methods for their formation and use
US20040091961A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
PL219741B1 (pl) * 2002-12-26 2015-07-31 Mountain View Pharmaceuticals Sposób zwiększania antyproliferacyjnego potencjału nieglikozylowanego interferonu-beta-1b in vitro, koniugat wytworzony tym sposobem i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca koniugat i jej zastosowanie
WO2004061094A1 (en) 2002-12-30 2004-07-22 Gryphon Therapeutics, Inc. Water-soluble thioester and selenoester compounds and methods for making and using the same
KR20060003862A (ko) 2003-03-14 2006-01-11 네오스 테크놀로지스, 인크. 수용성분기폴리머 및 그 접합체
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7691603B2 (en) 2003-04-09 2010-04-06 Novo Nordisk A/S Intracellular formation of peptide conjugates
BRPI0411160A (pt) * 2003-05-12 2006-07-11 Affymax Inc novos compostos modificados com poli(glicol etilênico) e usos dos mesmos
MXPA05012313A (es) * 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Peptidos que se unen al receptor de eritropoyetina.
ATE428727T1 (de) * 2003-05-12 2009-05-15 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
EP1628686A2 (en) 2003-05-12 2006-03-01 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol)-modified peptides
US7074755B2 (en) * 2003-05-17 2006-07-11 Centocor, Inc. Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
KR20060032140A (ko) * 2003-05-30 2006-04-14 센토코 인코포레이티드 트랜스글루타미나아제를 이용한 신규 에리트로포이에틴접합체의 형성
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
CN102516386A (zh) 2003-10-10 2012-06-27 诺沃挪第克公司 Il-21衍生物
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
EP1694347B1 (en) 2003-11-24 2013-11-20 BioGeneriX AG Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US7368169B2 (en) * 2003-12-01 2008-05-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Hydrazide compounds with angiogenic activity
KR101439880B1 (ko) 2004-01-08 2014-09-12 라티오팜 게엠베하 펩티드의 오-결합형 글리코실화
EP1708755B1 (en) 2004-01-21 2012-03-21 Novo Nordisk Health Care AG Transglutaminase mediated conjugation of peptides
US20070105770A1 (en) * 2004-01-21 2007-05-10 Novo Nordisk A/S Transglutaminase mediated conjugation of peptides
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
US7476725B2 (en) * 2004-06-08 2009-01-13 Alza Corporation Preparation of macromolecular conjugates by four-component condensation reaction
CA2568952C (en) 2004-06-18 2019-05-21 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
ES2572779T3 (es) 2004-10-29 2016-06-02 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF)
JP2008519858A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
PL1824988T3 (pl) * 2004-11-12 2018-01-31 Bayer Healthcare Llc Ukierunkowana na miejsce modyfikacja czynnika VIII
JP4990792B2 (ja) 2004-12-22 2012-08-01 アンブレツクス・インコーポレイテツド アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの組成物およびこの使用
JP5425398B2 (ja) * 2004-12-22 2014-02-26 アンブレツクス・インコーポレイテツド 非天然アミノ酸及びポリペプチドを含む組成物、非天然アミノ酸及びポリペプチドに関連する方法並び非天然アミノ酸及びポリペプチドその使用
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
NZ555386A (en) 2004-12-22 2011-01-28 Ambrx Inc Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
WO2006089228A2 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an epo moiety and a polymer
WO2007010552A2 (en) * 2005-03-17 2007-01-25 Serum Institute Of India Limited N- terminal peg conjugate of erythropoietin
JP2008534640A (ja) 2005-04-05 2008-08-28 イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー タンパク質の機能部位またはエピトープの遮蔽方法
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
ATE529442T1 (de) 2005-06-03 2011-11-15 Ambrx Inc Verbesserte humane interferon-moleküle und ihre verwendungen
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
CA2611836A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-21 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Transmucosal delivery of peptide derivatives
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
JP2009506096A (ja) * 2005-08-30 2009-02-12 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー ペグ化成長ホルモンの液状調製物
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
US20070092486A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Avigenics, Inc. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
EP1951890A4 (en) 2005-11-16 2009-06-24 Ambrx Inc PROCESSES AND COMPOSITIONS WITH NON-NATURAL AMINO ACIDS
CN101062407A (zh) 2006-04-29 2007-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
EP2032600A2 (en) * 2006-05-19 2009-03-11 Glycofi, Inc. Erythropoietin compositions
EP2213733A3 (en) 2006-05-24 2010-12-29 Novo Nordisk Health Care AG Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
CN101495155A (zh) 2006-07-07 2009-07-29 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 新的蛋白结合物及其制备方法
US9187532B2 (en) 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
CA2659990C (en) * 2006-08-04 2016-03-22 Prolong Pharmaceuticals, Inc. Polyethylene glycol erythropoietin conjugates
DK2061878T3 (da) 2006-09-08 2014-04-07 Ambrx Inc Hybridsuppressor-trna for hvirveldyrceller
EP2615108B1 (en) 2006-09-08 2016-10-26 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and thier uses
MX2009002526A (es) 2006-09-08 2009-04-16 Ambrx Inc Transcripcion de tarn supresor en celulas de vertebrados.
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
EP2114427B1 (en) 2007-01-30 2014-06-25 New York University Peptides for treatment of conditions associated with nitric oxide
EP2118127A4 (en) * 2007-01-31 2010-12-01 Affymax Inc NICKET-BASED LINKER FOR BONDING MODIFYING GROUPS OF POLYPEPTIDES AND OTHER MACROMOLECULES
ATE554785T1 (de) 2007-03-30 2012-05-15 Ambrx Inc Modifizierte fgf-21 polypeptide und ihre verwendung
CA2682897C (en) 2007-04-03 2016-11-22 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
WO2008137471A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CN101778859B (zh) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 改良的用于生产核苷酸糖的方法
WO2009003188A2 (en) * 2007-06-27 2008-12-31 Cedars-Sinai Medical Center N-terminal specific chemical labeling for proteomics applications
EP2930182A1 (en) 2007-11-20 2015-10-14 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
CN101456911A (zh) * 2007-12-12 2009-06-17 江苏豪森药业股份有限公司 促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途
CA2707979A1 (en) * 2007-12-13 2009-06-18 Biovectra Inc. Polypeptides modified by protein trans-splicing technology
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
US20130189239A1 (en) 2008-02-27 2013-07-25 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII Molecules
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
EP2157432A1 (en) * 2008-08-15 2010-02-24 Qiagen GmbH Method for analysing a complex sample by mass spectrometry
MX2011003196A (es) 2008-09-26 2011-04-27 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.
CN102232085A (zh) 2008-09-26 2011-11-02 Ambrx公司 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途
WO2010129248A1 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Centocor Ortho Biotech Inc. Melanocortin receptor binding conjugates
RU2744370C2 (ru) * 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
US9815876B2 (en) 2010-03-05 2017-11-14 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
HUE045845T2 (hu) 2010-08-17 2021-12-28 Ambrx Inc Módosított relaxin polipeptidek és felhasználásuk
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
CN102652836A (zh) * 2011-03-03 2012-09-05 华中科技大学同济医学院附属协和医院 靶向释药的抗癌蛋白质或多肽聚合物前药及其制备方法
CA2840552A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
AU2012278944B2 (en) 2011-07-05 2015-09-17 Bioasis Technologies Inc. p97-antibody conjugates and methods of use
AU2013270684B2 (en) 2012-06-08 2018-04-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
DK2863955T3 (en) 2012-06-26 2017-01-23 Sutro Biopharma Inc MODIFIED FC PROTEINS, INCLUDING LOCATION-SPECIFIC NON-NATURAL AMINO ACID RESIDUES, CONJUGATES THEREOF, METHODS OF PRODUCING ITS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
JP6433424B2 (ja) 2012-07-31 2018-12-05 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド 脱リン酸化されたリソソーム蓄積症タンパク質およびその使用方法
ES2907763T3 (es) 2012-08-31 2022-04-26 Sutro Biopharma Inc Aminoácidos modificados que comprenden un grupo azido
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
JP2016505528A (ja) 2012-11-16 2016-02-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア タンパク質の化学修飾のためのピクテ−スペングラーライゲーション
CN102935236B (zh) * 2012-11-21 2015-08-26 武汉平华生物医药科技有限公司 一种具有p-糖蛋白抑制功能的抗肿瘤前药
WO2014160438A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Bioasis Technologies Inc. Fragments of p97 and uses thereof
ES2658039T3 (es) 2013-07-10 2018-03-08 Sutro Biopharma, Inc. Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso
US20150093399A1 (en) 2013-08-28 2015-04-02 Bioasis Technologies, Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
WO2015054658A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
US11103593B2 (en) 2013-10-15 2021-08-31 Seagen Inc. Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
WO2015081282A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-pyrrolo compounds and methods for producing a conjugate
EA036697B1 (ru) 2014-10-24 2020-12-09 Бристол-Майерс Сквибб Компани Модифицированные полипептиды fgf-21 и их применение
AU2016363013B2 (en) 2015-12-04 2022-03-10 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
AU2017237186A1 (en) 2016-03-25 2018-11-01 Seagen Inc. Process for the preparation of PEGylated drug-linkers and intermediates thereof
JP7244987B2 (ja) 2016-12-14 2023-03-23 シージェン インコーポレイテッド 多剤抗体薬物コンジュゲート
CA3052639A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
US11730822B2 (en) 2017-03-24 2023-08-22 Seagen Inc. Process for the preparation of glucuronide drug-linkers and intermediates thereof
CN111094462A (zh) 2017-12-26 2020-05-01 贝克顿·迪金森公司 深紫外线可激发的水溶剂化聚合物染料
JP2021519841A (ja) 2018-03-30 2021-08-12 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ペンダントクロモフォアを有する水溶性ポリマー色素
TW202015740A (zh) 2018-06-07 2020-05-01 美商西雅圖遺傳學公司 喜樹鹼結合物
EP3813867A1 (en) 2018-07-22 2021-05-05 Bioasis Technologies Inc. Treatment of lymmphatic metastases
FI3849614T3 (fi) 2018-09-11 2024-02-08 Ambrx Inc Interleukiini-2-polypeptidikonjugaatteja ja niiden käyttöjä
JP2022512746A (ja) 2018-10-19 2022-02-07 アンブルックス，インコーポレイテッド インターロイキン－１０ポリペプチド複合体、その二量体、およびそれらの使用
CN109400695B (zh) * 2018-10-31 2020-06-30 中南大学湘雅医院 一种多肽的修饰方法及应用
BR112021015832A2 (pt) 2019-02-12 2022-01-18 Ambrx Inc Composições que contêm conjugados de anticorpo-agonista de tlr, métodos e usos dos mesmos
CN114929284A (zh) 2019-10-04 2022-08-19 西根公司 喜树碱肽缀合物
AU2021233909A1 (en) 2020-03-11 2022-09-29 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and methods of use thereof
IL297167A (en) 2020-04-10 2022-12-01 Seagen Inc Charging variant connectors
US20210355468A1 (en) 2020-05-18 2021-11-18 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating lewy body dementia
US20210393787A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating frontotemporal dementia
AU2021327396A1 (en) 2020-08-20 2023-03-23 Ambrx, Inc. Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof
BR112023014128A2 (pt) 2021-01-15 2023-10-31 Seagen Inc Conjugados de anticorpo-fármaco imunomodulatórios
WO2022170002A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Seagen Inc. Immunostimulatory compounds and conjugates
WO2022212899A1 (en) 2021-04-03 2022-10-06 Ambrx, Inc. Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
CA3221398A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Seagen Inc. Anthracycline antibody conjugates
EP4155349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-29 Becton, Dickinson and Company Water-soluble yellow green absorbing dyes
WO2023083919A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Tubulis Gmbh Conjugates comprising a phosphorus (v) and a camptothecin moiety
WO2023083900A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Tubulis Gmbh Conjugates comprising a phosphorus (v) and a drug moiety
WO2023178289A2 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Seagen Inc. Camptothecin conjugates
WO2023215740A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Seagen Inc. Immunomodulatory antibody-drug conjugates
WO2024007016A2 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Beckman Coulter, Inc. Novel fluorescent dyes and polymers from dihydrophenanthrene derivatives
WO2024030577A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Seagen Inc. Immunostimulatory anti-pd-l1-drug conjugates
EP4321522A1 (en) 2022-08-12 2024-02-14 Seagen Inc. Cytotoxic compounds and conjugates thereof
WO2024044327A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Beckman Coulter, Inc. Dhnt monomers and polymer dyes with modified photophysical properties

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE69023314T2 (de) 1989-04-26 1996-03-28 Fanuc Ltd Verfahren zur rotationssteuerung einer hauptwelle.
JP2983629B2 (ja) 1989-10-13 1999-11-29 キリン―アムジエン・インコーポレイテツド エリスロポエチンイソフォーム
JPH03151399A (ja) * 1989-11-07 1991-06-27 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 変異ヒトエリスロポエチン
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
JPH08509614A (ja) * 1993-04-29 1996-10-15 アボツト・ラボラトリーズ エリスロポエチン類似体組成物および方法
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO1994029024A1 (en) 1993-06-03 1994-12-22 Beckman Instruments, Inc. Sample segment
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
IL128229A (en) 2007-07-04
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CA2262994A1 (en) 1998-02-12
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SI0964702T1 (sl) 2007-02-28
DE69736780T2 (de) 2007-09-06
BR9711009A (pt) 1999-08-17
WO1998005363A3 (en) 1998-05-07
NO990465D0 (no) 1999-02-01
EP1731174A3 (en) 2007-01-17
CN1226176A (zh) 1999-08-18
AU3908597A (en) 1998-02-25
JP4410852B2 (ja) 2010-02-03
CN100471521C (zh) 2009-03-25
EP0964702A2 (en) 1999-12-22
EP1731174A2 (en) 2006-12-13

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