PT964702E - Polipéptidos tendo um único polímero solúvel em água ligado ao n-terminal por covalência - Google Patents

Polipéptidos tendo um único polímero solúvel em água ligado ao n-terminal por covalência Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
"POLIPÉPTIDOS TENDO UM ÚNICO POLÍMERO SOLÚVEL EM ÁGUA LIGADO AO N-TERMINAL POR COVALÊNCIA"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se a polipéptidos, os quais têm ligado um polímero único, solúvel em água, nos seus terminais N. Estes polipéptidos têm propriedades que os tornam vantajosos para utilização como agentes farmacêuticos e de diagnóstico. A invenção refere-se, igualmente, a métodos de produção destes polipéptidos e composições farmacêuticas e kits relacionados.
Antecedentes da Invenção São citadas várias publicações ao longo deste pedido. A divulgação destas publicações é, deste modo, incorporada por referência neste pedido, para descrever mais completamente o estado da técnica à qual esta invenção pertence.
Nos últimos anos, têm sido utilizados polímeros solúveis em água, não-antigénicos, tal como polietilenoglicol ("PEG"), para a modificação covalente de polipéptidos com importância terapêutica e de diagnóstico. Por exemplo, tem sido referido que a ligação covalente do PEG a polipéptidos terapêuticos, tais como, interleucinas (Knauf, M. J. et al., J. Biol. Chem. 1988, 263, 15064; Tsutsumi, Y. et al., J. Controlled Release 1995, 33, 1 447), interferões (Kita, Y. et al., Drug Des. Delivery 1990, 6, 157), catalase (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 1977, 252, 3, 582), superóxido dismutase (Beauchamp, C. O. et al., Anal.
Biochem. 1983, 131, 25) e desaminase de adenosina (Chen, R. et al., Biochim. Biophy. Acta 1981, 660, 293), aumente a sua meia vida in vivo e/ou reduza a sua imunogenicidade e antigenicidade.
No entanto, esses métodos apresentam desvantagens significativas. Especificamente, na maioria dos casos, as moléculas do PEG são ligadas através dos grupos amina dos polipéptidos, utilizando PEG metoxilado ("mPEG") tendo partes reactivas diferentes. Esses polímeros incluem mPEG-succinato de succinimidilo, mPEG-carbonato de succinimidilo, mPEG-imidato e mPEG-cloreto cianúrico. A ligação utilizando estes polímeros foi, normalmente, não-específica, i. e., ocorrendo em vários grupos amina dos polipéptidos, de uma forma aleatória e não exclusivamente num grupo amina em particular. Essa ligação não-específica pode modificar os resíduos de aminoácido nos locais activos de tal forma que elimina a actividade biológica dos polipéptidos. Os conjugados resultantes podem, igualmente, conter uma mistura heterogénea do polipéptido modificado que é indesejável para utilização farmacêutica.
Para superar estes problemas, foi pretendido ligar um polímero a um polipéptido de um modo específico para um local. Em relação ao polipéptido, proceder deste modo, poderá conservar a actividade biológica, prolongar o tempo de circulação sanguínea, reduzir a imunogenicidade, aumentar a solubilidade aquosa e intensificar a resistência a digestão por proteases. A peguilação específica para um local no N-terminal, cadeia lateral e terminal C de um análogo potente do factor de libertação da hormona de crescimento, foi realizada através de 2 síntese em fase sólida (Felix, A. M. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1995, 46, 253). Uma vez que a peguilação específica foi realizada durante a montagem do péptido numa resina, o método não pode ser aplicado a um péptido existente.
Um método adicional utilizado envolveu a ligação de um péptido às extremidades de cadeias de PEG acopladas na superfície de lipossomas, de uma forma específica para um local, através de um grupo aldeído reactivo no N-terminal, produzido por oxidação da treonina N-terminal com periodato de sódio (Zalipsky, S. et al., Bioconj. Chem. 1995, 6, 705). No entanto, este método encontra-se limitado a polipéptidos com resíduos de serina ou de treonina N-terminais.
Foram, igualmente, descritos métodos baseados em enzimas para introduzir grupos activados, especificamente no terminal C de um polipéptido (Schwarz, A. et al., Methods Enzymol. 1990, 184, 160; Rose, K. et al., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 154; Gaertner, H. F. et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 7224). Tipicamente, estes grupos activos podem ser hidrazida, aldeído e grupos amina aromáticos, para ligação subsequente de sondas funcionais a polipéptidos. No entanto, uma vez que os métodos são baseados na especificidade de proteases, estes requerem uma precaução extrema e o âmbito da sua aplicação é limitado. A mutagénese específica para um local é uma outra abordagem que tem sido utilizada para preparar polipéptidos para a ligação específica para um local de polímeros. O documento WO 90/12874 descreve a peguilação dirigida para um local de proteínas modificadas pela inserção de resíduos de cisteína ou a substituição de outros resíduos por resíduos de cisteína. Esta publicação descreve, igualmente, a preparação de mPEG- 3 eritropoietina ("mPEG-EPO") fazendo reagir um derivado de mPEG especifico para a cisteina com um resíduo de cisteína introduzido recombinantemente na EPO. De um modo semelhante, a interleucina-2 foi peguilada no seu local de glicosilação após mutagénese dirigida para um local (Goodson, R. J. et al., Bio/Technology 1990, 8, 343).
As glicoproteínas proporcionam hidratos de carbono como locais alvo adicionais para a modificação. A enzima peroxidase foi modificada com PEG-diamina, através da sua parte hidrato de carbono (Urrutiogoity, M. et ai., Biocatalysis 1989, 2, 145). O documento WO 94/28024 descreve os métodos para preparar mPEG-EPO através de hidratos de carbono oxidados com periodato. A guímica associada consistiu na formação de hidrazona, por reacção de mPEG-hidrazida com grupos aldeído da parte hidrato de carbono na EPO. Este tipo de modificação produz grupos aldeído reactivos através de um passo de oxidação, o qual, potencialmente, pode oxidar vários tipos de resíduos de açúcares na parte hidrato de carbono e alguns resíduos de aminoácido no polipéptido, tal como a metionina. Outra desvantagem deste método provém da heterogeneidade das partes de hidrato de carbono da EPO. A EPO expressa a partir de células de ovário de hamster chinês tem quatro cadeias de hidratos de carbono, as quais incluem três cadeias ligadas a N nas asparaginas 24, 38 e 83 e uma cadeia ligada a O na serina 126. Foi identificado um total de 52 estruturas oligosacarídicas diferentes ligadas a N e, pelo menos, 6 ligadas a O, (Rush, R. S. et ai., Anal. Chem. 1995, 67, 1442; Linsley, K. B. et al., Anal. Blochem. 1994, 219, 207).
Consequentemente, é difícil controlar o número ou os locais de ligação das moléculas de polímero, quando estas modificam a EPO ou outra proteína através das suas cadeias de hidrato de carbono. 4
Em resumo, os métodos na técnica de ligação de um polímero solúvel em água a um polipéptido, apresentam desvantagens significativas. Estas desvantagens incluem o seguinte: (a) uma falta de precisão, tanto estequiometricamente, como no que respeita à localização da ligação; (b) a necessidade de realizar técnicas difíceis e de trabalho intensivo, tais como mutagénese específica para um local; (c) a necessidade de utilizar síntese peptídica em fase sólida simultaneamente com a ligação do polímero, em lugar de ligar um polímero a um polipéptido pré-existente; e (d) a exigência rigorosa de que a identidade do resíduo de aminoácido N-terminal seja treonina ou serina.
Durante algum tempo, verificou-se uma necessidade de um método geral de ligação de um polímero solúvel em água ao resíduo de aminoácido N-terminal de um polipéptido, especificamente para um local, em que o método não sofresse das desvantagens identificadas acima. No entanto, esse método não existe.
Sumário da Invenção
Esta invenção proporciona duas composições de matéria. A primeira composição de matéria consiste, essencialmente, num polipéptido e num polímero solúvel em água covalentemente ligado a este no átomo de carbono α N-terminal do polipéptido, através de uma ligação de hidrazona ou ligação de hidrazona reduzida, com a condição de que (a) o polímero tenha um peso molecular de 700 a 20000 daltons, (b) a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina α N-terminal e 5 (c) o resíduo de aminoácido N-terminal do polipéptido não seja serina ou treonina.
Esta invenção proporciona, igualmente, quatro métodos para ligar covalentemente um polímero solúvel em água ao átomo de carbono α N-terminal de um polipéptido. 0 primeiro método, o qual liga o polímero ao átomo de carbono através de uma ligação de hidrazona, compreende os passos de (a) fazer contactar o polipéptido com (i) ião glioxilato ou seu derivado numa concentração de desde 0,1 M a 2,0 M, (ii) um ião de um metal de transição numa concentração de desde 10 μΜ a 1 M e (iii) uma base de Lewis numa concentração de desde 10 mM a 10 M, a um pH de desde 5,0 a 7,0 e uma temperatura de desde 0 °C a 100 °C, para formar um polipéptido transaminado que tem um grupo carbonilo oí N-terminal; e (b) fazer contactar o polipéptido transaminado, a um pH de desde 3,0 a 5,0, com um polímero solúvel em água, tendo uma parte covalentemente ligada a este, o qual reage com o grupo carbonilo oí N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o polímero ao átomo de carbono oí N-terminal do polipéptido, através de uma ligação de hidrazona, com a condição de que o polímero tenha um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons e que a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina oí N-terminal. 6
Esta invenção proporciona, igualmente, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz da presente primeira composição e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Finalmente, esta invenção proporciona kits para utilização na preparação das presentes composições. 0 primeiro kit, para a preparação da primeira presente composição, compreende o seguinte: (a) um ião glioxilato ou seu derivado; (b) um ião de um metal de transição; (c) uma base de Lewis; e (d) um polímero solúvel em água tendo um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons e tendo uma parte covalentemente ligada a este, a qual reage com o grupo carbonilo α N-terminal de um polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o polímero ao átomo de carbono α N-terminal do polipéptido.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1 mostra um esquema para a preparação de uma EPO modificada no N-terminal. Esta é uma reacção em dois passos: transaminação e peguilação. Foram utilizados quatro derivados do mPEG5000 (í. e., mPEG tendo um p.m. de 5000 daltons) com carboxilato de hidrazina (HZC), hidrazida (HZ), 7 semicarbazida (SCZ) e grupos funcionais oxilamina.
Figura 2 mostra o cromatograma da filtração em gel de mPEG-EPO com uma ligação de hidrazona formada utilizando uma parte carboxilato de hidrazina (HZC), EPO nativa e mPEG5000 carboxilato de hidrazina numa coluna TSK G3000SWXL (7,5 x 30 mm). A fase móvel é o citrato de sódio 20 mM (pH 7,0) contendo NaCl 100 mM.
Figura 3 mostra espectros de massa de duração do trajecto por dessorção com laser auxiliada por uma matriz, de mPEG5000 carboxilato de hidrazina, EPO nativa e mPEG-EPO com uma ligação de hidrazona formada utilizando uma parte carboxilato de hidrazina (HZC).
Figura 4 mostra a caracterização de mPEG-EPO por métodos electroforéticos: (1) SDS-PAGE a 4-15%, coloração de Coomassie; (2) transferência de Western; (3) SDS-PAGE a 4-15%, coloração de iodo; e (4) Focagem isoeléctrica (IEF, pH 3-7). Faixa 1, marcadores de PM ou pi; Faixa 2, EPO nativa; Faixa 3, EPO Transaminada; e Faixas 4 e 5, mPEG-EPO com ligações de hidrazona formadas utilizando, respectivamente, partes carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ).
Figura 5 mostra um gráfico dos resultados de um ensaio ELISA de mPEG-EPO com ligações de hidrazona 8 formadas utilizando partes carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) .
Figura 6 mostra um gráfico dos resultados de um ensaio de proliferação celular de EPO nativa, EPO transaminada e mPEG-EPO com ligações de hidrazona formada utilizando partes carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ).
Figura 7 mostra um gráfico dos resultados de um bioensaio num murganho ex-hipóxico para mPEG-EPO com ligações de hidrazona formadas utilizando partes carboxilato de hidrazina (HZC), hidrazida (HZ) e semicarbazida (SCZ).
Descrição Detalhada da Invenção
Esta invenção proporciona duas composições de matéria. A primeira composição de matéria consiste, essencialmente, num polipéptido e num polímero solúvel em água, covalentemente ligado a este no átomo carbono α N-terminal do polipéptido, através de uma ligação de hidrazona ou ligação de hidrazona reduzida, com a condição de que (a) o polímero tenha um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons, (b) a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina a N-terminal e (c) o resíduo de aminoácido N-terminal do polipéptido não seja serina ou treonina.
Como aqui utilizado, "polipéptido" inclui tanto péptidos como proteínas. "Péptido" significa um polipéptido com menos de 10 resíduos de aminoácido de comprimento e "proteína" significa um polipéptido com 10 ou mais resíduos de aminoácido de comprimento. Nesta invenção, os polipéptidos podem ser de ocorrência natural ou recombinantes (í. e. produzidos através de tecnologia de ADN recombinante) e podem conter mutações (e. g. mutações pontuais, de inserção e de eliminação), assim como outras modificações covalentes (e. g. glicosilação e marcação [através de biotina, estreptavidina, fluoracina e isótopos radioactivos, tais como, I131) . Para além disso, cada presente composição pode conter mais do que um único polipéptido, í. e., cada um pode ser um monómero (um polipéptido ligado a um polímero) ou um multímero (dois ou mais polipéptidos ligados a um polímero ou entre si).
Os polipéptidos incluem, a título de exemplo, anticorpos monoclonais e policlonais, citocinas, tais como, M-CSF e GM-CSF, linfocinas, IL-2, IL-3, factores de crescimento, tais como PDGF e EGF, hormonas peptídicas, tais como hGH, EPO e seus derivados, factores de coagulação sanguínea, tais como Factor VIII, imunogénios, enzimas, inibidores de enzima e outros ligandos. Na forma de realização preferida das presentes composições, o polipéptido é EPO ou um seu derivado. A EPO pode ser de ocorrência natural ou recombinante. Os derivados da EPO incluem, mas não estão limitados aos polipéptidos GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG, VGNYMCHFGPITWVCRPGGG, GGVYACRMGPITWVC SPLGG, VGNYMAHMGPITWVCRPGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ, GGLYACHMGPMTWVCQPLRG, 10 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA, YSCHFGPLTWVCK e YCHFGPLTWVC, assim como os mutantes listados na Tabela 1 abaixo
Tabela 1
Mutação Actividade em relação a wt* Referência L5S +/- 9 L5S/W51S/M54S/V82S/W88S/ L112A/A124S/A125S +/- 9 S9A ++++ 3
Rl OA ++++ 3 E13A ++++ 3 R14L ++++ 3 R14A ++ 3 L17A ++++ 3 E18A ++++ 3 K20A ++++ 3 E21A ++++ 3 N24Q ++ 1 N24Q/N83Q + 1 N24Q/N38Q/N83Q +++ 1 C29Y/C33Y ++++ 3 A30S/L35S +++ 9 A30S/A124S/A125S ++ 9 C33P/R139C ++++ 7 L35S/A124S/A125S ++ 9 N38Q ++ 1 N38Q/N83Q ++++ 1 11
V41S
Κ45Α F48S Y49S A50S W51S W51S/V144S W51S/V82S/W88S + /- + + + 9 3 3 3 3 3 9 9 W51S/V82S/W88S/V144N W51S/V82S/W88S/L112A/I119A + + 9 A124S/A125S W51S/M54S/V82S/W88S/A124S + + + 9 A125S W51S/M54S/V82S/W88S/L112A/ + + 9 A124S/A125S + 9 W51S/M54S/V82S/W88S/L112A A124S/A125S/L130A + + + 9 W51S/M54S/V82S/W88S/I119A A124S/A125S W51S/M54S/V82S/W88S/L112A + 9 I119A/A124S/A125S W51S/M54S/V82S/W88S/A124S + + + 9 A125S/L130A W51S/V82S/W88S/A125S/A125S + + + 9 L130A + + + 9 K52S +++ + 3 M54L +++ + 10 M54S/V56S W57S/V82S/W88S/L112A/I119A +++ + 9 A124S/A125S + + + 9 Ε62Α +++ + 3 W64A +++ + 3 Q65A +++ + 3 G6 6 A +++ + 3 12
L69A L69N S 7 ΙΑ A73G R7 6A V82S V82S/W88S/V144N V82S/W88S/A124S/A125S N83Q Q92A L93A K97A S100A G101A L102A R103A S104A S104N L105A L105F T106A T107A L108A L109A L112A L112A/I119S/L130A/I133A P122Q A124P/A125T A125T A125N/A127S L130A D136A R139A Kl 4 OA
+ + + + + /-+ + + /-+++ + + + + + + + + + + /-
+++ + + /-
3 4 3 3 3 9 9 9 9 3 3 3 3 3 8 2 3 6 8 6 3 8 3 8 9 9 6 4 4 4 9 3 3 3 13 R143A +++ S146A +++ Ν147Α +++ R150A +++ Κ152Α + + L15 3A + + + K154A +++ L155A +++ Y156A ++ T157A +++ G158A +++ E159A +++ R162K/T163D/G164E/D165L ++ R162H/T163H/G164H/D165H/ r!66H/(167)H +++ LO 1 C\] + + 5113-17 +++ + 513 2-36 + + 5143-47 + + 5153-57 + + 5178-82 + 51111-119 + + + 51115-121 + + + 51120-122 +++ + 51123-125 +++ + 51126-129 + + + 51163-166 +++ + K116 (inserção de LISEEDL) +++ + Φ Em relação ao tipo selvagem é definido como se segue: ++++ = actividade do tipo selvagem ou melhor + + + = c . a . 75% da actividade do tipo selvagem + + = c . a . 50% da actividade do tipo selvagem + = c . a . 25% da actividade do tipo selvagem 14 + /- = EPO mutante descrita como sendo activa, no entanto, os dados não são suficientes para uma avaliação da actividade em relação ao tipo selvagem.
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Como aqui utilizado, "função natural" de um polipéptido significa a sua função antes da modificação covalente do seu grupo amina oí N-terminal. As funções naturais incluem, por exemplo, actividade enzimática, ligação a receptores (e. g. anticorpos), ligação a ligandos e imunogenicidade.
Os presentes métodos, abaixo descritos mais completamente, causam a perda do grupo amina oí N-terminal do polipéptido que é covalentemente modificado. Consequentemente, o polipéptido deve ter uma estrutura primária, de forma a que a sua função natural seja conservada após a modificação covalente e não possa ser eliminada. A função natural do polipéptido é "eliminada" pela remoção do seu grupo amina α N-terminal se essa remoção reduzir, em mais de 99%, a capacidade do polipéptido para realizar a sua função natural. Numa forma de realização, a remoção não reduz a capacidade do polipéptido para realizar a sua função natural em mais de 90%. Na forma de realização preferida, a remoção não reduz a capacidade do polipéptido realizar a sua função natural em mais de 50%.
Como aqui utilizado, uma "ligação de hidrazona" é uma ligação que compreende a estrutura covalente NH-N=C e uma "ligação de hidrazona reduzida" é uma ligação que compreende a estrutura covalente NH-NH-C. São aqui proporcionados compostos 16 contendo ligações de hidrazona reduzida, uma vez que estas ligações possuem uma maior estabilidade química.
Como discutido em cima, são conhecidos na técnica métodos de ligação de polímeros solúveis em água ao átomo de carbono a N-terminal de um polipéptido, através de uma ligação de hidrazona, contanto que o resíduo de aminoácido N-terminal seja serina ou treonina. Estes métodos conhecidos não irão funcionar em polipéptidos tendo qualquer outro resíduo N-terminal. Embora estes métodos conhecidos difiram, fundamentalmente, dos presentes métodos, estes resultam em polipéptidos com serina e treonina N-terminal, tendo um polímero ligado ao átomo de carbono α N-terminal, através de uma ligação de hidrazona. Por este motivo, a presente primeira composição não abrange um polipéptido ligado a um polímero através de uma ligação de hidrazona, em que o resíduo de aminoácido N-terminal do polipéptido seja serina ou treonina.
Os polímeros solúveis em água utilizados na presente invenção incluem, (d) polialquilenoglicol e seus derivados, incluindo PEG, mPEG, homopolímeros de PEG, homopolímeros de polipropilenoglicol, copolímeros de etilenoglicol com polipropilenoglicol, em que os referidos homopolímeros e copolímeros são não substituídos ou substituídos numa extremidade com um grupo alquilo. Estes polímeros podem ser lineares, ramificados ou em forma de estrela, com uma ampla variedade de pesos moleculares. Na forma de realização preferida, o polímero é mPEG.
Quando as presentes composições se destinam a ser utilizadas como fármacos, o polímero é não- -tóxico. Para além disso, quando é referido que um polímero tem um dado peso 17 molecular, esse peso molecular apenas pode ser aproximado, reflectindo o peso molecular médio de uma população de moléculas de polímero diferindo entre si, no que respeita ao número de subunidades presentes em cada molécula.
Na forma de realização preferida, o PEG ou seu derivado tem um peso molecular de, cerca de, 5000 daltons. Do mesmo modo, na forma de realização preferida das presentes composições, o polipéptido é EPO e o polímero é mPEG tendo um peso molecular de, cerca de, 5000 daltons.
Esta invenção proporciona, igualmente, quatro métodos para a ligação covalente de um polímero solúvel em água ao átomo de carbono α N-terminal de um polipéptido. O primeiro método, o qual liga o polímero ao átomo de carbono através de uma ligação de hidrazona, compreende os passos de (a) fazer contactar o polipéptido com (i) ião glioxilato ou seu derivado numa concentração de desde 0,1 M a 2,0 M, (ii) um ião de um metal de transição numa concentração de desde 10 μΜ a 1 M e (iii) uma base de Lewis numa concentração de desde 10 mM a 10 M, a um pH de desde 5.0 a 7,0 e a uma temperatura de desde 0 °C a 100 °C, para formar um polipéptido transaminado, que tem um grupo carbonilo α N-terminal; e (b) fazer contactar o polipéptido transaminado, a um pH de 3.0 a 5,0, com um polímero solúvel em água tendo uma parte covalentemente ligada a este, o qual reage com o grupo carbonilo α N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o polímero ao átomo 18 de carbono α N-terminal do polipéptido, através de uma ligação de hidrazona, com a condição de que o polímero tenha um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons e a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina α N-terminal. O terceiro método compreende os passos do primeiro método, assim como um passo adicional de redução da ligação de hidrazona formada no passo (b) . O passo de redução pode ser realizado utilizando, por exemplo, boro-hidreto de sódio (NaBH4) e cianoboro-hidreto de sódio (NaBH3CN) , de acordo com métodos conhecidos.
Os derivados do ião glioxilato incluem, mas não estão limitados a, glioxilamida e iões fenilglioxilo. Os iões de metais de transição incluem, mas não estão limitados a iões cúpricos, de níquel, de cobalto ou de zinco. As bases de Lewis incluem, mas não estão limitadas a, acetato e piridina.
As partes que reagem com o grupo carbonilo α N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona incluem, mas não estão limitadas a, carboxilato de hidrazina, hidrazina, semicarbazida, hidrazida, tiosemicarbazida, ácido carbónico di-hidrazida, carbazida, tiocarbazida e aril-hidrazida. Encontram-se comercialmente disponíveis polímeros solúveis em água com estas partes covalentemente ligadas a estes. Para além disso, as partes que reagem com o grupo carbonilo α N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de oxima incluem, mas não estão limitadas a, oxilamina. Encontram-se comercialmente disponíveis polímeros solúveis em água com oxilamina (assim como outras partes formadoras de oxima) covalentemente ligada a estes. 19
Na forma de realização preferida dos presentes métodos, a proteína é EPO ou um seu derivado.
Na forma de realização preferida, o PEG ou seu derivado tem um peso molecular de, cerca de, 5000 daltons.
Numa forma de realização do primeiro método, a parte ligada ao polímero, a qual é feita reagir com o polipéptido transaminado é carboxilato de hidrazina. Na forma de realização preferida, o polipéptido é EPO, o polímero é mPEG tendo um peso molecular de, cerca de, 5000 daltons e a parte covalentemente ligada ao polímero é carboxilato de hidrazina.
Em cada um dos presentes métodos, o tempo de contacto preferido para o passo (a) é de 20 minutos a 2 horas e para o passo (b) , o tempo de contacto preferido e a temperatura são, respectivamente, de 10 a 50 horas e de 4 °C até à temperatura ambiente.
Em determinados polipéptidos, o N-terminal de um polipéptido encontra-se "ocultado", í. e. não o expondo a solventes ou reagentes, quando o polipéptido se encontra na sua conformação nativa. Podem ser utilizados reagentes, tais como, tetrametilureia ou ureia para desnaturar um desses polipéptidos, de forma a permitir que o seu resíduo N-terminal sofra as reacções necessárias dos presentes métodos.
Esta invenção proporciona, igualmente, uma composição farmacêutica, a qual compreende uma quantidade eficaz da presente primeira ou segunda composição e um veículo farmaceuticamente aceitável. A título de exemplo, a presente 20 composição farmacêutica pode compreender uma quantidade da presente mPEG-EPO, eficaz para o tratamento de um sujeito que sofra de anemia.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos especialista na técnica e incluem, mas não estão limitados a, tampão de fosfato 0,01-0,1 M e, de um modo preferido, 0,05 M ou soro fisiológico a 0,8%. Adicionalmente, esses veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser soluções, suspensões e emulsões, aquosas ou não-aquosas. Propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como, azeite e ésteres orgânicos injectáveis, tais como, oleato de etilo, são exemplos de solventes não-aquosos. Os veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, solução de Ringer com dextrose, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer com lactato ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes, repositores de eletrólitos, tais como os baseados em solução de Ringer com dextrose e semelhantes. Podem, igualmente, encontrar-se presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes e semelhantes.
Finalmente, esta invenção proporciona kits para utilização na preparação das presentes composições. O primeiro kit, para preparação da primeira presente composição, compreende o seguinte: 21 (a) um ião glioxilato ou seu derivado; (b) um ião de metal de transição; (c) uma base de Lewis; e (d) um polímero solúvel em água tendo um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons e tendo uma parte covalentemente ligada a este, a qual reage com o grupo carbonilo α N-terminal de um polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o polímero ao átomo de carbono α N-terminal do polipéptido.
Os reagentes nestes kits podem ser embalados numa quantidade pré-determinada e podem ser contidos em compartimentos separados. Alternativamente, alguns reagentes podem ser contidos no mesmo compartimento, desde que as limitações dos presentes métodos o permitam. Finalmente, os kits podem compreender, adicionalmente, reagentes redutores para produzir ligações de hidrazona reduzida, de acordo com os presentes métodos, assim como tampões adequados e recipientes de reacção.
Esta invenção será melhor entendida por referência aos
Exemplos Experimentais que se seguem, mas os especialistas na técnica irão ter facilmente em consideração que as experiências específicas detalhadas são apenas ilustrativas da invenção, como descrito de uma forma mais completa nas reivindicações que se seguem. 22
Exemplos Experimentais 1. Preparação de EPO Transaminada
Foram permutados 5 mg de EPO, em citrato de sódio 20 mM (pH 6,9) e NaCl 100 mM, com tampão acetato de sódio 100 mM (pH 7,0) utilizando Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA) . As concentrações finais foram ajustadas para EPO 1 mg/mL, acetato de sódio 2 M, ácido acético 0,4 M, ácido glioxílico 0,1 M e sulfato cúprico 10 mM (pH 5,5) (Figura 1). A reacção foi deixada durante 2 horas à temperatura ambiente e foi inactivada pela adição de 100 mL de EDTA 0,5 Μ. A EPO transaminada foi purificada através de uma coluna Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , utilizando um tampão acetato de sódio 100 mM (pH 4,5). A extensão da transaminação foi estimada pela 2,4-dinitrofenil-hidrazina, como descrito na literatura (Fields, R. et al., Biochem. J.r 1971, 121, 587). A extinção a 370 nm foi medida após os primeiros minutos iniciais e após uma hora. A diferença na absorvência é proporcional à quantidade de grupos carbonilo presentes na molécula da EPO. A EPO transaminada foi, igualmente, submetida a análise de aminoácidos num sistema 420H ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando uma pré-coluna com química PITC. Os resultados indicam que os resíduos de lisina, i. e. os resíduos não-N-terminais, não se encontravam transaminados. 2. Preparação de mPEG-EPO com mPEG-Carboxilato de Hidrazina A EPO transaminada (1 mg) em acetato de sódio 100 mM (pH 4,5) foi ajustada para cloreto de sódio 0,5 M, num volume 23 final de 1 mL, à qual foram adicionados 10 mg de mPEG5000 carboxilato de hidrazina (Shearwater Polymers, Hunstville, AL) . A mistura de reacção foi agitada durante 40 horas à temperatura ambiente e foi purificada através de uma coluna Sephacryl S-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , utilizando tampão citrato de sódio 20 mM (7,0) contendo NaCl 100 mM. Adicionalmente, pode ser adicionado SDS a 0,1% à mistura de reacção, de forma a aumentar o rendimento da conjugação.
Na cromatografia de permeação em gel, o conjugado mPEG-EPO apresentou um peso molecular substancialmente aumentado em comparação com os da EPO e do mPEG5000 carboxilato de hidrazina (Figura 2).
Foi utilizada espectrometria de massa por dessorção com laser auxiliada por uma matriz (Finnigan-MAT LaserMAT 2000, duração do trajecto linear) para caracterizar a mPEG-EPO por determinação do peso molecular (Figura 3) . O mPEG5000 carboxilato de hidrazina apresenta um ião com m/z 5157,4. A EPO apresenta um monómero com duas cargas (m/z 14604), um monómero com uma carga (m/z 28569), um dimero (m/z 57208) e um trimero (m/z 85284). De um modo semelhante, mPEG-EPO apresenta um monómero com duas cargas (m/z 17092), um monómero com uma carga (m/z 34279), um dimero (m/z 69071) e um trimero (m/z 102955).
Um espectro de dicroismo circular (CD) (Jobin-YVON CD6, Dichrograph Spectrometer Instruments, SA, Edison, NJ) de mPEG-EPO mostrou que a proteína conservou a estrutura de feixes em hélice α presente na EPO nativa (dados não apresentados). Este resultado significa que uma molécula de PEG na extremidade N-terminal da EPO não interrompe a sua estrutura secundária. 24 3. Preparação de mPEG-EPO com mPEG-hidrazida. A EPO transaminada (1 mg) em acetato de sódio 100 mM (pH 4,5) foi ajustada para cloreto de sódio 0,5 M, SDS 0,1%, para um volume final de 1 mL e foram adicionados 10-20 mg de mPEG5000 hidrazida. A mistura de reacção foi agitada durante 40 horas, à temperatura ambiente e foi purificada através de uma coluna Sephacryl S-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , utilizando tampão citrato de sódio 20 mM (7,0), contendo NaCl 100 mM.
Os conjugados mPEG-EPO foram analisados por SDS-PAGE a 4-15% (Bio-Rad, Hercules, CA) com vários métodos: coloração de Coomassie (especifica para proteínas), transferência de Western (específica para EPO) e coloração de iodo (específica para PEG). A distância de migração em SDS-PAGE dos conjugados mPEG-EPO de peso molecular mais elevado é inferior à das EPO nativas. O padrão de focagem isoeléctrica indica que o ponto isoeléctrico (pi) da EPO não é significativamente alterado após a modificação. No entanto, a EPO transaminada é ligeiramente mais acídica do que a EPO e mPEG-EPO nativos.
Uma vez que as bandas da EPO e de mPEG-EPO são bem separadas através de SDS-PAGE, esta técnica pode ser utilizada para monitorizar a eficiência da reacção de conjugação. Foi observado que a reacção de conjugação foi >95% completada, quando utilizando mPEG5000-carboxilato de hidrazina, enquanto que a reacção foi completada em apenas cerca de 20%, quando utilizando mPEG5000-hidrazida, mPEG5000-semicarbazida ou mPEG5000-oxilamina. Deste modo, a parte carboxilato de hidrazina parece ser mais reactiva com grupos de carbonilo do que é a parte hidrazida, semicarbazida ou a oxilamina. 25
4. Reactividade de mPEG-EPO com Anticorpo Anti-EPO
Foi estudada a antigenicidade de mPEG-EPO, utilizando um kit de ELISA Quantikine™ IVD™ para EPO (R&D Systems, Minneapolis, MN). O ensaio consiste numa placa de microtitulação revestida com um anticorpo monoclonal contra a EPO. É permitida a interacção da EPO ou de mPEG-EPO com a placa revestida. Após a lavagem da placa, é adicionado um conjugado de anticorpo policlonal anti-EPO e peroxidase de rábano. Após a remoção do excesso de conjugado, é adicionado um cromógenio aos poços, o qual é oxidado pela reacção enzimática, para formar um complexo colorido azul. A absorvência deste complexo é medida a 450 nm.
Na Figura 5 são apresentados os resultados do ensaio ELISA de mPEG-EPO com uma ligação de hidrazona, formada a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ). Os dados indicam que, mesmo uma molécula de PEG ligada no N-terminal da EPO, reduz, significativamente, a afinidade da ligação do anticorpo monoclonal à EPO, possivelmente devido a impedimento estérico.
5. Actividade In vitro de mPEG-EPO A actividade biológica in vitro de mPEG-EPO foi avaliada através um ensaio de proliferação celular, utilizando células FDC-P1/HER, uma linha de células hematopoiéticas murinas. A linha celular expressa o receptor da EPO e é dependente da EPO para o crescimento. Após as células terem sido cultivadas na ausência de EPO durante 24 horas, foram adicionados EPO ou mPEG- 26 EPO as células. As células foram incubadas durante 42 horas e, seguidamente, foi adicionada timidina tritiada às células. Após 6 horas, o crescimento celular foi determinado pela incorporação de timidina.
Na Figura 6 são apresentados os resultados do ensaio de proliferação celular para a EPO transaminada e mPEG-EPO com ligações de hidrazona, formadas a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ) . A EPO transaminada apresenta actividade biológica máxima, comparável com a da EPO nativa, como determinado pela sua ED50. As amostras de mPEG-EPO com ligações de hidrazona, formadas a partir de carboxilato de hidrazina (HZC) e hidrazida (HZ), conservam apenas, respectivamente, 38,5% e 25% de actividade, como determinado pela sua ED50. Os dados indicam que uma molécula de PEG ligada ao N-terminal da EPO reduz, significativamente, a afinidade da EPO para o seu receptor, possivelmente, devido ao impedimento estérico.
6. Actividade In vivo de mPEG-EPO A actividade in vivo de mPEG-EPO foi avaliada através de um bioensaio com murganhos ex-hipóxicos (Coates, P.M. et al., Nature, 1961, 191, 1065). A formação de glóbulos vermelhos murinos endógenos é suprimida pela policitemia produzida através de exposições a pressão reduzida. A EPO ou o conjugado mPEG-EPO são injectados no nivel de 1 unidade/murganho. Foi administrado ferro-59, 48 horas após a injecção da EPO ou de mPEG-EPO. A incorporação de ferro-59, a qual indica a formação de novos glóbulos vermelhos sanguíneos, foi medida 48, 72 e 96 horas após a administração da EPO ou de mPEG-EPO. 27
Na Figura 7 são apresentados os resultados do bioensaio com murganhos ex-hipóxicos para mPEG-EPO com ligações de hidrazona, formadas com carboxilato de hidrazina (HZC), hidrazida (HZ) e semicarbazida (SCZ). As amostras de mPEG-EPO apresentam uma actividade in vivo mais elevada, assim como uma duração da actividade mais longa, em comparação com a EPO nativa. Os resultados in vivo, indicam que as amostras de mPEGEPO apresentam um tempo de circulação mais longo in vivo e a libertação contínua de EPO durante a circulação. 7. Preparação de mPEG-Dímero 17-29 de Fibrina 0 dímero 17-29 de fibrina tem a seguinte estrutura:
Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg-His-Gln-Ser-Ala-Cys-Lys
S
S
Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg-His-Gln-Ser-Ala-Cys-Lys
Foram dissolvidos 2 mg de dímero 17-29 de fibrina em 0,5 mL de acetato de sódio 2 M, ácido acético 0,4 M, ácido glioxílico 0,1 M e sulfato cúprico 10 mM (pH 5,5). Foi permitido o prosseguimento da reacção durante 2 horas à temperatura ambiente e esta foi inactivada adicionando 20 mL de EDTA 0,5 Μ. O dímero de fibrina transaminada foi purificado através de uma coluna Sephadex G-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , utilizando um tampão acetato de sódio 100 mM (pH 4,5). O dímero de fibrina transaminada apresentou uma significativa redução de Gly na análise de aminoácidos, indicando a transaminação da Gly N-terminal. 28
Foi adicionado 1 mg de dimero de fibrina transaminada em 0,5 mL de acetato de sódio 100 mM (pH 4,5), a 10 mg de mPEG5000 carboxilato de hidrazina. A mistura de reacção foi agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. O dimero mPEG-fibrina foi purificado por cromatografia de permuta aniónica com uma coluna HEMA IEC BIO CM (Alltech) . A fase móvel A foi acetato de sódio 20 mM (pH 5,5). A fase móvel B foi MOPS 0,2 M, fosfato de potássio monobásico 0,05 M e fosfato de potássio dibásico 0,25 M (pH 7,5) . O gradiente foi de 100% de A durante 5 minutos, seguidamente, de 0 a 100% de B durante 25 minutos. Foi recolhido para nova análise um novo pico aos 14,5 minutos, que apareceu antes do dimero de fibrina não modificado (18 minutos) . Um espectro de massa por dessorção com laser mostrou o ião com m/z 8070,9, o que comprovou que se encontrava ligada uma molécula de PEG ao dimero de fibrina (m/z 2986,8).
Lisboa, 14 de Novembro de 2006 29

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição de matéria consistindo, essencialmente, num péptido ou numa proteína e PEG ou um seu derivado, covalentemente ligado a esta no átomo de carbono oí N-terminal do polipéptido, com a condição de que (a) o PEG e o polipéptido se encontrem ligados entre si através de uma ligação de hidrazona ou uma ligação de hidrazona reduzida, (b) o PEG tem um peso molecular de desde 700 a 20000 daltons, (c) a função natural do polipéptido não é eliminada após a remoção do seu grupo amina α N-terminal e (d) o resíduo de aminoácido N-terminal da proteína não é serina ou treonina.
  2. 2. Composição da reivindicação 1, em que a proteína é EPO ou um seu derivado.
  3. 3. Composição da reivindicação 1, em que o PEG ou o seu derivado têm um peso molecular de cerca de 5000 dalton.
  4. 4. Composição da reivindicação 1, em que a proteína é EPO e o PEG é mPEG tendo um peso molecular de cerca de 5000 dalton.
  5. 5. Método para ligar covalentemente PEG ao átomo de carbono α N-terminal de um polipéptido; o qual compreende os passos de: (a) fazer contactar o polipéptido com (i) um ião glioxilato ou um seu derivado numa concentração de desde 0,1 M a 2,0 M, (i i) um ião de metal de transição numa concentração de desde 10 μΜ a 1 M e 1 (iii) uma base de Lewis numa concentração de desde 10 mM a 10 M, a um pH de 5,0 a 7,0 e a uma temperatura de 0 °C a 100 °C, para formar um polipéptido transaminado tendo um grupo carbonilo a N-terminal; e (b) fazer contactar o polipéptido transaminado, a um pH de desde 3,0 a 5,0, com o PEG ou um seu derivado, tendo uma parte covalentemente ligada a este, a qual reage com o grupo carbonilo α N-terminal do polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona ligando covalentemente, deste modo, o PEG ao átomo de carbono a N-terminal do polipéptido, com a condição de que o PEG tenha um peso molecular de desde 700 a 20000 dalton e a função natural do polipéptido não seja eliminada após a remoção do seu grupo amina a N-terminal.
  6. 6. Método da reivindicação 5, em que a proteína é EPO ou um seu derivado.
  7. 7. Método da reivindicação 5, em que o PEG ou o seu derivado têm um peso molecular de cerca de 5000 dalton.
  8. 8. Método da reivindicação 5, em que a parte covalentemente ligada ao PEG é carboxilato de hidrazina.
  9. 9. Método da reivindicação 5, em que a proteína é EPO, o PEG é mPEG tendo um peso molecular de cerca de 5000 dalton e a parte covalentemente ligada ao PEG é carboxilato de hidrazina. 2
  10. 10. Método da reivindicação 5, o qual compreende, adicionalmente, o passo de redução da ligação de hidrazona formada no passo (b) de modo a formar uma ligação de hidrazona reduzida.
  11. 11. Composição farmacêutica, a qual compreende uma quantidade eficaz da composição da reivindicação 1 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  12. 12. Kit para utilização na preparação da composição da reivindicação 1, o qual compreende o seguinte: (a) um ião glioxilato ou seu derivado; (b) um ião de metal de transição; (c) uma base de Lewis; e (d) PEG ou um seu derivado, tendo um peso molecular de desde 700 a 20000 dalton e tendo uma parte covalentemente ligada a este, a qual reage com o grupo carbonilo oí N-terminal de um polipéptido transaminado, para formar uma ligação de hidrazona, ligando covalentemente, deste modo, o PEG ao N-terminal ao átomo de carbono oí do polipéptido. Lisboa, 14 de Novembro de 2006 3
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