MX2007007591A - Metodos para expresion y purificacion de hormona de crecimiento humano recombinante. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere en general a la produccion, purificacion y aislamiento de hormona de crecimiento humano (Hgh = human growth hormone). Mas particularmente, la invencion se refiere a la produccion, purificacion y aislamiento hGH sustancialmente purificada a partir de celulas anfitrionas recombinantes o medio de cultivo incluyendo por ejemplo celulas anfitrionas de levadura, de insectos, de mamiferos y bacterianas. El proceso de la presente invencion tambien es util para purificacion de hGH enlazado a polimeros u otras moleculas.

Description

MÉTODOS PARA EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANO RECOMBINANTE REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. número de serie 60/638,616 presentada en diciembre 22, 2004, solicitud de patente provisional de los E.U.A. número de serie 60/655,744 presentada en febrero 23, 2005, solicitud de patente provisional de los E.U.A. número de serie 60/680,977 presentada en mayo 13, 2005, y solicitud de patente provisional de los E.U.A. número de serie 60/727,968 presentada en octubre 17, 2005, las especificaciones de las cuales aquí se incorporan en su totalidad. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a la producción, purificación y aislamiento de hormona de crecimiento humano (hGH= human growth hormone) . Más particularmente, la invención se refiere a la producción, purificación y aislamiento de hGH sustancialmente purificada de un anfitrión recombinante. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia súper-genes de hormona de crecimiento (GH=growth hormone) (Bazan, F. Immunology Today 11: 350-354 (1990); Mott, H. R. and Campbell, I. D.

Current Opinión in Structural Biology 5: 114- 121 (1995); Silvennoinen, 0. and Ihle, J. N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS) representa un conjunto de proteínas con características estructurales similares. Cada miembro de esta familia de proteínas comprende un haz de cuatro hélices. Mientras que todavía hay más miembros de la familia por identificar, algunos miembros de la familia incluyen los siguientes: hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placentario, eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TPO) , interleucina (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-I 1, IL-12 (sub-unidad p35) , IL-13, IL- 15, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar, factor inhibidor de leucemia, alfa interferona, beta interferona, gama interferona, omega interferona, tau interferona, epsilon interferona, factor de estímulo de colonia-granulositos (G-CSF= granulocyte-colony stimulating factor) , factor de estímulo de colonia de macrófago-granulosito (GM- CSF= granulocyte-macrophage colony stimulating factor) , factor de estímulo de colonia de macrófagos (M-CSF= macrophage colony stimulating factor) y cardiotropina-1 (CT-I) ("la familia de súper-genes GH"). Miembros de la familia de súper-genes GH tienen estructuras secundarias y terciarias similares, a pesar del hecho de que en general tienen identidad de secuencia de ADN (DNA) o aminoácidos limitada. Las características estructurales compartidas permiten nuevos miembros de la familia de genes sean fácilmente identificados. La hormona de crecimiento humana participa en gran parte de la regulación del crecimiento y desarrollo humano normal . Esta hormona pituitaria de una sola cadena de origen natural consiste de 191 residuos aminoácido y tiene peso molecular aproximado de 22 kDa. hGH exhibe una multitud de efectos biológicos, incluyendo crecimiento lineal (somatogénesis) lactación, activación de macrófagos y efectos tipo insulina y diabetogénicos, entre otros (Chawla, R. , et al, Ann . Rev. Med . 34:519-547 (1983); Isaksson, O., et al, Ann . Rev. Physiol , 47:483- 499 (1985); Hughes, J. and Friesen, H. , Ann . Rev. Physiol , 47:469-482 (1985)). La estructura de hGH es bien conocida (Goeddel, D., et al, Nature 281:544-548 (1979)), y la estructura tridimensional de hGH se ha resuelto por cristalografía de rayos x (de Vos, A., et al, Science 255:306-312 (1992)). La proteína tiene una estructura globular compacta, que comprende cuatro ases alfa elicoidales anfipáticos, denominados A-D empezando desde el extremo N, que se unen por bucles. hGH también contiene cuatro residuos cisteína que participan en dos enlaces disulfuro intramoleculares: C53 se aparea con C165 y C182 se aparea con C189. La hormona no está glicosilada y se ha expresado en una forma secretada en E. coli (Chang, C, et al, Gene 55:189-196 (1987)). Una cantidad de mutantes de origen natural de hGH se han identificado. Estos incluyen hGH-V (Seeburg, DNA 1: 239 (1982); patentes de los E.U.A. números 4,446,235, 4,670,393, y 4,665,180, que aquí se incorporan por referencia (y un hGH de 20 -kDa que contienen una eliminación de residuos 32-46 de hGH (Kostyo et al, Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987); Lewis, U. , et al, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978)). Además, numerosas variantes de hGH, que surgen de procesamiento post-transcripción, post-traducción, secretorio, metabólico y otros procesos fisiológicos se han reportado (Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)). Los efectos biológicos de hGH derivan de su interacción con receptores celulares específicos. La hormona es un miembro de una familia de proteínas homologas que incluyen lactógenos placentarios y prolactinas. hGH es inusual entre los miembros de familia, sin embargo ya que exhibe especificidad de especies amplia y liga ya sea al receptor somatogénico clonado (Leung, D., et al, Nature 330:537-543 (1987)) o prolactina (Boutin, J. , et al, Cell 53:69-77 (1988)). Con base en estudios estructurales y bioquímicos, mapas funcionales para los dominios de enlace lactogénicos y somatogénicos se han propuesto (Cunningham, B. and Wells, J., Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 3407 (1991)) . El receptor hGH es un miembro de la familia receptor de factor de crecimiento/citosina/ hematopoyético, que incluye varios otros receptores de factor de crecimiento, tales como los receptores interleucina (IL)-3, -4 y -6, el receptor de factor de estímulo de colonia de macrófago granulosito (GM-CSF) , el receptor de eritropoyetina (EPO) así como el receptor G-CSF. Ver Bazan, Proc. Nati. Acad. Sd USA 87: 6934- 6938 (1990) . Miembros de la familia de receptor de citosina contienen cuatro residuos cisteína conservados y un motivo triptofano-serina-X-triptofano-serina justo fuera de la región de transmembrana. Las secuencias conservadas se consideran involucradas en interacciones proteína-proteína. Ver e.g., Chiba et al, Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992). La interacción entre hGH y dominio extracelular de su receptor (hGHbp) está entre las interacciones de hormona-receptor más bien comprendidas. Datos cristalográficos de rayos x de alta resolución (Cunningham, B., et al., Science, 254:821-825 (1991)) han mostrado que hGH tiene dos sitios de enlace de receptor y liga dos moléculas receptoras secuencialmente utilizando distintos sitios en la molécula. Los dos sitios de enlace de receptor se refieren como sitio I y sitio II. El sitio I incluye el extremo terminal carboxy de la hélice D y parte de la hélice A y el bucle A-B, mientras que el sitio II abarca la región amino-terminal de la hélice A y una porción de la hélice C. El enlace de GH a su receptor ocurre secuencialmente, con el sitio de enlace I primero. El sitio II después acopla un segundo receptor GH resultando en dimerización y activación de receptor de las rutas de señalización intracelular que llevan a respuestas celulares a la hormona. Una hGH muteína en donde una sustitución G120R se ha introducido en el sitio II, es capaz de ligar un solo receptor hGH, pero es incapaz de dimerizar dos receptores. La muteína actúa como un antagonista hGH in vi tro, supuestamente al ocupar sitios de receptor sin activar rutas de señalización intracelular (Fuh, G., et al, Science 256:1677-1680 (1992) ) . hGH recombinante se utiliza como un terapéutico y se ha aprobado para el tratamiento de una cantidad de indicaciones. Deficiencia hGH lleva a enanismo, por ejemplo que ha sido tratado exitosamente por mas de una década por administración exógena de la hormona. Formas de deficiencia hGH (GHD) incluyen GHD pediátrica, GHD de adulto o de inicio en infancia, y GHD de adulto de inicio en adulto. Además de deficiencia hGH, hGH también se ha probado para el tratamiento de falla renal (en niños) , síndrome de Turner y caquexia en pacientes de SIDA (AIDS) . Recientemente, la administración de alimentos y drogas (FDA= Food and Drug Administration) ha aprobado hGH para el tratamiento de estatura corta no dependiente de GH. hGH también actualmente está bajo investigación para el tratamiento de envejecimiento, fragilidad en los mayores, síndrome de intestino corto, y falla cardiaca congestiva. Poblaciones objetivo para el tratamiento hGH incluyen niños con estatura corta idiopática (ISS= idiopathic short stature) y adultos con síntomas tipo GHD. hGH recombinante actualmente se vende como un producto inyectable diariamente con cinco productos principales actualmente en el mercado: HumatropeMR (Eli Lilly & Co.), NutropinMR (Genentech), NorditropinR (Novo-Nordisk) , GenotropinMR (Pfizer) y Saizen/SerostimMR (Serono) . Un reto significante a utilizar la hormona de crecimiento como un agente terapéutico sin embargo es que la proteína tiene corta vida media in vivo y por lo tanto debe de administrarse por inyección sub-cutánea diaria para máxima efectividad (MacGillivray, et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 1806-1809 (1996)). Se enfoca esfuerzo considerable en medios para mejorar la administración de agonistas y antagonistas de hGH, al reducir el costo de producción, haciendo la administración más fácil para el paciente, mejorar la eficacia y el perfil de seguridad y crear otras propiedades que proporcionen una ventaja competitiva. Por ejemplo, Genentech y Alkermes previamente comercializaron Nutropin DepotMR, una formulación de depósito de hGH, para deficiencia de hormona de crecimiento pediátrico. Mientras que el depósito permite administración menos frecuente (una vez cada dos a tres semanas en vez de una vez diariamente) , también esta asociado con efectos secundarios indeseables, tal como disminuida biodisponibilidad y dolor en el sitio de inyección y se retiró del mercado en 2004. Otro producto, PegvisomantMR (Pfizer) recientemente también se ha probado por la FDA. PegvisomantMR es un análogo de ingeniería genética de hGH que funciona como un antagonista de receptor de hormona de crecimiento altamente selectivo indicado para el tratamiento de acromegalia (van der Lely, et ah, The Lancet 358: 1754- 1759 (2001). Aunque varios de los residuos de cadena lateral aminoácido en PegvisomantMR se derivan con polímeros de polietilen glicol (PEG) , el producto todavía se administra una vez al día, indicando que las propiedades f rmacéuticas no son óptimas. Además de modificación con PEG (polietilen glicol) y formulaciones de depósito, otras rutas de administración incluyendo formas de dosis inhalada y oral de hGH están bajo desarrollo de preclínico y clínico de etapa temprana y ninguno aún ha recibido aprobación de la FDA. De acuerdo con esto, hay necesidad para un polipéptido que exhibe actividad de hormona de crecimiento pero que también ha proporcionado una más prolongada vida media en suero y por lo tanto niveles terapéuticos más óptimos de hGH y una vida media terapéutica incrementada. Recientemente, una tecnología totalmente nueva en las ciencias de proteínas se ha reportado que promete superar muchas de las limitaciones asociadas con modificaciones específicas de sitio de proteínas tales como hGH. Específicamente, nuevos componentes se han agregado a la maquinaria biosintética de proteína de la procariota Escherichia coli (E. coli) (e.g., L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) y la eucariota Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (e.g., J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), que ha permitido la incorporación de aminoácidos no genéticamente codificados a proteínas in vivo . Construcciones proporcionadas a las células anfitrionas contienen un polinucleótido que codifica el polipéptido hGH comprenden un codón selector y una ARNt (tRNA) sintetasa ortogonal y/o un tRNA ortogonal para sustituir un aminoácido no naturalmente codificado en el polipéptido hGH. Una cantidad de nuevos aminoácidos con propiedades químicas físicas o biológicas novedosas incluyendo etiquetas de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, aminoácidos de fotoreticulación (ver por ejemplo Chin, J. W., et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024; y, Chin, J. W., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027), ceto aminoácidos, aminoácidos que contienen átomos pesados y aminoácidos glicosilados se han incorporado eficientemente y con alta fidelidad en proteínas en E. Coli y en levadura en respuesta al codón ámbar, TAG utilizando esta metodología. Ver J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schuitz, (2002), ChemBioChem 3 (11) : 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; y, L. Wang, & P. G. Schuitz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Todas las referencias se incorporan por referencia aquí en su totalidad. Estos estudios han demostrado que es posible introducir en forma selectiva y rutinaria grupos funcionales químicos que son químicamente inertes a todos los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos genéticamente codificados comunes y que pueden emplearse para reaccionar en forma eficiente y selectiva para formar enlaces covalentes estables . La capacidad por incorporar aminoácidos no genéticamente codificados en proteínas permite la introducción de grupos funcionales químicos que pueden proporcionar alternativas valiosas a los grupos funcionales de origen natural, tales como epsilon-NH2 de lisina, el sulfhidrilo-SH de cisteína el grupo imino de histidina, etc. Ciertos grupos químicos funcionales se conocen que son inertes a los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos genéticamente codificados comunes pero reaccionan en forma limpia y eficiente para formar enlaces estables. Conexión covalente del polímero hidrofílico poli (etilen glicol) PEG es un método para incrementar la solubilidad en agua, biodisponibilidad, aumentar la vida media en suero, aumentar vida media terapéutica, modular la inmunogenicidad, modular la actividad biológica o extender el tiempo de circulación de muchas moléculas biológicamente activas, incluyendo proteínas, péptidos y particularmente moléculas hidrofóbicas. PEG se ha emplead extensamente en productos farmacéuticos, en implantes artificiales y en otras aplicaciones en donde la biocompatibilidad, falta de toxicidad y falta de inmunogenicidad, son importantes. A fin de llevar al máximo, las propiedades deseadas de PEG, el peso molecular total y estado de hidratación del polímero o polímeros PEG conectados a la molécula biológicamente activa debe ser suficientemente alto para impartir las características ventajosas típicamente asociadas con la conexión de polímero PEG tal como incrementada solubilidad en agua y vida media en circulación, mientras que no impactan adversamente la bioactividad de la molécula precursora. Cualquier masa molecular para un PEG puede emplearse según se desee prácticamente incluyendo pero no limitado a de aproximadamente 100 Daltons (Da) a 100,000 Da o más según se desee (incluyendo pero no limitado a, en ocasiones 0.1-50 kDa o 10-40 kDa). PEGs de cadena ramificada, incluyendo pero no limitados a moléculas de PEG con cada cadena que tiene peso molecular (MW) en el rango de 1-100 kDa (incluyendo pero no limitado a 1-50 kDa or 5-20 kDa) también puede emplearse. Derivados PEG frecuentemente se enlazan con moléculas biológicamente activas a través de funcionalidades químicas reactivas, tales como residuos lisina, cisteína e histidina, las porciones de extremo N y carbohidrato. Proteínas y otras moléculas a menudo tienen un número limitado de sitios reactivos disponibles para conexión de polímero. A menudo, los sitios mas adecuados para modificación mediante conexión de polímero juegan un papel significante en enlace de receptor, y son necesarios para retención de la actividad biológica de la molécula. Como resultado, la conexión indiscriminada de cadenas de polímeros a estos sitios reactivos en una molécula biológicamente activa a menudo lleva a una reacción significante o incluso perdida total de actividad biológica de la molécula modificada con polímero. R. Clark et al., (1996), L Biol. Chem., 271 : 21969-21977. Para formar conjugados que tienen peso molecular de polímero suficiente para impartir las ventajas deseadas a una molécula objetivo, enfoques de la técnica previa típicamente han involucrado conexión aleatoria de numerosos brazos de polímero a la molécula, de esta manera aumentando el riesgo de una reducción o incluso pérdida total en bioactividad de la molécula precursora. Sitios reactivos que forman los sitios para conectar los derivados PEG a proteínas están dictados por la estructura de la proteína. Proteínas, incluyendo enzimas, están compuestas de diversas secuencias de alfa aminoácidos que tienen la estructura general H2N-CHR-COOH. La porción alfa amino (H2N-) de un aminoácido se reúne a la porción carboxilo (—COOH) de un aminoácido adyacente para formar enlaces amida que pueden representarse como - (NH-CHR-CO) n — en donde el subíndice "n" puede ser igual a cientos o miles. El fragmento representado por R puede contener sitios reactivos para actividad biológica de proteína y para conectar derivados PEG. Por ejemplo, en el caso del aminoácido lisina, existe una porción -NH2 en la posición épsilon así como en la posición alfa. El -NH2 épsilon está libre para reacción bajo condiciones de pH básico. Gran parte en la técnica del campo de derivatización de proteínas con PEG se ha dirigido a desarrollar derivados PEG para conexión a la porción épsilon -NH2 de los residuos lisina presentes en proteínas. "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" , Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp . 1-17. Estos derivados PEG todos tienen una limitación común, sin embargo, que no pueden instalarse selectivamente entre los residuos lisina a menudo numerosos presentes en las superficies de las proteínas. Esto puede ser una limitación significante en casos en donde un residuo lisina es importante para actividad de proteína, existiendo en un sitio activo de enzima por ejemplo, o en casos en donde un residuo lisina juega un papel para mediar la interacción de la proteína con otras moléculas biológicas, como en el caso de sitios de enlace de receptor. Una complicación segunda e igualmente importante de métodos existentes para modificación con PEG de proteínas es que los derivados PEG pueden someterse a reacciones secundarias indeseadas con residuos diferentes a aquellos descritos. Histidina contiene una porción imino reactiva, representada estructuralmente como -- N(H)--, pero muchas especies químicamente reactivas que reaccionan con épsilon -NH2 también pueden reaccionar con -- N(H)--. Similarmente, la cadena lateral del aminoácido cisteína contiene un grupo sulfhidrilo libre, representado estructuralmente como -SH. En algunos casos, los derivados PEG dirigidos al grupo épsilon —NH2 de lisina también reaccionan con residuos cisteía, histidina u otros. Esto puede crear mezclas complejas, heterogéneas de moléculas bioactivas derivadas de PEG y arriesga el destruir la actividad de la molécula bioactiva que es objetivo. Sería conveniente el desarrollar derivados PEG que permiten un grupo funcional químico ser introducido en un solo sitio dentro de la proteína que entonces permitirá el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros PEG a la molécula bioactiva en sitios específicos en la superficie de la proteína que están tanto bien definidos como son pronosticables . Además de residuos lisina, se ha dirigido esfuerzo considerable en la técnica hacia el desarrollo de reactivos PEG activados que hacen blanco a otras cadenas laterales aminoácido, incluyendo cisteína, histidina y el extremo N. Ver, por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 6,610,281 que se incorpora aquí por referencia, y "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp . 1-17. Un residuo cisteína puede introducirse selectivamente en sitio en la estructura de proteínas utilizando mutagénesis dirigida de sitio y otras técnicas conocidas en la especialidad, y la porción sulfhidrilo libre resultante puede reaccionarse con derivados PEG que contienen grupos funcionales tiol-reactivos. Este enfoque es complicado, sin embargo, ya que la introducción de un grupo sulfhidrilo libre puede complicar la expresión, plegado y estabilidad de la proteína resultante. De esta manera, sería conveniente el tener un medio para introducir un grupo funcional químico en moléculas bioactivas que permiten el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros PEG a la proteína mientras que simultáneamente son compatibles con (es decir, no acoplan en reacciones secundarias indeseables con) sulfhidrilos y otros grupos funcionales químicos que se encuentran típicamente en proteínas. Como puede verse de un muestreado de la técnica, muchos de estos derivados que se han desarrollado para la conexión a las cadenas laterales de proteínas, en particular, la porción --NH2 en la cadena lateral de aminoácido lisina y la porción -SH en la cadena lateral cisteína, han demostrado ser problemáticos en su síntesis y uso. Algunos forman enlaces inestables con la proteína que están sujetos a hidrólisis y por lo tanto se descomponen, degradan y de otra forma son inestables en ambientes acuosos, tales como en la corriente sanguínea. Algunos forman enlaces más estables, pero están sujetos a hidrólisis antes de formar el enlace, lo que significa que el grupo reactivo en el derivado PEG puede estar inactivado antes que pueda conectarse a la proteína. Algunos son algo tóxicos y por lo tanto menos adecuados para uso in vivo . Algunos son muy lentos en reaccionar para ser prácticamente útiles. Algunos resultan en una pérdida de actividad de proteína al conectar a sitios responsables por la actividad de proteína. Algunos no son específicos en los sitios a los cuales se conectarán, lo que también puede resultar en una pérdida de actividad deseable y en una falta de reproducción de resultados. A fin de superar los retos asociados con modificar proteínas con porciones poli (etilen glicol), derivados PEG se han desarrollado que son más estables (por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 6,602,498, que se incorpora aquí por referencia) o que reaccionan selectivamente con porciones tiol en moléculas y superficies (por ejemplo, la patente de los E.U.A. No. 6,610,281, que se incorpora aquí por referencia) . Claramente hay necesidad en la técnica por derivados PEG que son químicamente inertes en ambientes fisiológicos hasta que se requieran reaccionar selectivamente para formar enlaces químicos estables. Por lo tanto, existe actualmente una necesidad no satisfecha por proporcionar polipéptido hGH en una forma substancialmente pura adecuada para utilizar en aplicaciones terapéuticas humanas. Además, métodos para la producción de polipéptido hGH de grado farmacéutico se requieren que sean susceptibles de producción a gran escala, que sean de alta eficiencia y productivos en costo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a la producción y purificación de polipéptido hGH de células anfitrionas recombinantes o medio de cultivo. Más particularmente, la invención se refiere a la producción y purificación de polipéptido hGH substancialmente purificado de un anfitrión recombinante, incluyendo pero no limitado a, un anfitrión procariótico, un anfitrión bacteriano o un anfitrión de E. coli . En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para aislar polipéptido hGH substancialmente purificado que comprende las etapas de: (a) cromatografía de intercambio de aniones; y (b) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC hydrophobic interaction chromatography) . Purificación de polipéptido hGH modificado con PEG incluye las siguientes etapas adicionales: (c) reaccionar polipéptidos hGH con PEG para formar conjugados hGH-PEG; y (d) aislar los conjugados hGH-PEG por cromatografía de intercambio de aniones. Todavía en otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para aislar polipéptido hGH substancialmente purificado, que comprende las etapas de: (a) cromatografía de intercambio de aniones; (b) cromatografía de hidroxiapatita; y (c) cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) . Purificación de polipéptido hGH modificados con PEG incluye las siguientes etapas adicionales: (d) reaccionar el polipéptido hGH con PEG para formar conjugados hGH-PEG; y (e) aislar los conjugados hGH-PEG por cromatografía de intercambio de aniones . En una modalidad, el anfitrión recombinante se elige del grupo que consiste de una célula procariótica y una célula eucariótica. En una modalidad, el anfitrión recombinante puede comprender cualquier célula anfitriona que produce un componente sub-celular insoluble, tal como cuerpos de inclusión, que comprende polipéptido de hGH incluyendo por ejemplo, células de levadura, células de mamíferos, células de insectos y células bacterianas, incluyendo por ejemplo, E. coli .

Los materiales de cromatografía de interacción hidrofóbica adecuados para utilizar en los métodos de la presente invención pueden incluir, pero no están limitados a matrices alquil- o aril-substituidas, tales como matrices substituidas con butil-, hexil-, octil- o fenil-substituidas incluyendo matrices de agarosa, agarosa reticulada, sefarosa, celulosa, sílice, dextrano, poliestireno, poli (metacrilato) , y resinas de modo mixto, incluyendo pero no limitadas a, una resina polietilenamina o una matriz poli (metacrilato) butil- o fenil-substituida . En una modalidad específica, el material de cromatografía de interacción hidrofóbico puede comprender resinas fenil sefarosa. En una modalidad, el polipéptido hGH substancialmente purificado aislado por los métodos aquí descritos puede incluir, pero no está limitado a, hGH maduro, variantes hGH maduro, polipéptidos hGH, variantes de polipéptido hGH, y hGH conjugado con poli (etilen glicol) . Todavía en otra modalidad, el polipéptido hGH substancialmente purificado aislado por los métodos de la presente invención puede exhibir cuando menos una actividad biológica de hGH maduro. Todavía en otra modalidad, el polipéptido hGH substancialmente purificado aislado por los métodos de la presente invención puede ser de mamífero. En una modalidad específica, el polipéptido hGH substancialmente purificado aislado por los métodos de la presente invención puede ser humano. En otra modalidad de la presente invención, el polipéptido hGH obtenido de la etapa HIC se enlaza covalentemente con un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua es poli (etilen glicol). En otras modalidades, el polipéptido hGH comprende uno o más aminoácidos no-naturalmente codificados. Expresión de polipéptidos de hGH que comprenden un aminoácido no-naturalmente codificado y purificación de sus formas modificadas con PEG proporciona moléculas hGH alteradas en una forma específica de sitio para uso terapéutico. La modificación con PEG de polipéptidos hGH en aminoácidos naturalmente codificados, puede resultar en la modificación con PEG de polipéptido hGH en sitios indeseables y/o modificación con PEG de polipéptidos indeseables que pueden ser contaminantes. Métodos que utilizan aminoácidos no-naturalmente codificados para modificación con PEG específica de sitio de polipéptidos hGH, hace innecesarias estas etapas de purificación. En otra modalidad, conjugación del polipéptido hGH que comprende uno o más aminoácidos que no son de origen natural en otra molécula, incluyendo pero no limitada a PEG, proporcionan polipéptido hGH substancialmente purificado debido a la reacción química única empleada para conjugar al aminoácido no-natural. Conjugación de polipéptido hGH que comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados a otra molécula, tal como PEG, puede realizarse con otras técnicas de purificación, realizadas antes de o siguiendo la etapa de conjugación para proporcionar polipéptido hGH substancialmente puro. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra gastos de flujo de alimentación para una fermentación de 8 litros. La Figura 2 muestra un proceso de fermentación a una escala de 5 litros. La Figura 3, Paneles A y B muestra análisis SDS-PAGE de polipéptido hGH preparado por liberación periplásmica y homogenización. La Figura 4 muestra un flujo de proceso para una fermentación de 5 litros. La Figura 5 muestra una estructura química de un PEG de 30 kDa lineal. DEFINICIONES Habrá de entenderse que está invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, construcciones y reactivos particulares aquí descritos y como tales pueden variar. También habrá de entenderse que la terminología aquí empleada es con el propósito de describir solo modalidades particulares, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado solo por las reivindicaciones anexas. Como se emplea aquí, y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referencias en plural a menos de que el contexto claramente lo indique de otra forma. De esta manera, por ejemplo, referencia a "hGH" es una referencia a una o más de estas proteínas e incluye sus equivalentes conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, y así en adelante. A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado como se entiende comúnmente para una persona con destreza ordinaria en la especialidad a la cual pertenece esta invención. Aunque cualesquiera métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos pueden emplearse en la práctica o prueba de la invención, los métodos, dispositivos y materiales preferidos ahora se describen. Todas las publicaciones y patentes aquí mencionadas se incorporan por referencia con el propósito de describir e ilustrar por ejemplo, las construcciones y metodologías que se describen en las publicaciones, que pueden emplearse en conexión con la invención actualmente descrita. Las publicaciones aquí discutidas se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada aquí habrá de considerarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a anteponer fecha a dicha descripción en virtud de invención previa o por ninguna otra razón. La solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 11/046,432 incorporada aquí por referencia en su totalidad. La solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 11/046,432 describe las secuencias de aminoácidos de origen natural de hGH, selección de sitio para incorporar aminoácido no-naturalmente codificados, y métodos, composiciones, técnicas y estrategias para producir, purificar, caracterizar y utilizar aminoácidos no-naturalmente codificados, polipéptidos hGH de aminoácidos no-naturalmente codificados, y polipéptidos hGH de aminoácidos no naturalmente codificados modificados . El término "proteína" como se emplea aquí, incluye un polímero o complejo de diversos polímeros de aminoácidos y no connota una longitud específica de un polímero de aminoácidos. De esta manera, por ejemplo, el término péptido, oligopéptido y polipéptido se incluyen dentro de la definición de proteína, ya sea que se produzca utilizando técnicas recombinantes, síntesis química o enzimática o de origen natural. El término también incluye péptides, oligopéptidos y polipéptidos que se han modificado o derivatizado, tales como por glicosilación, acetilación, fosforilación, y semejantes. El término "proteína" específicamente incluye variantes, como se define aquí. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se emplean aquí en forma intercambiable para referirse a un polímero de residuos aminoácido. Esto es, una descripción dirigida a un polipéptido apliqué igualmente a una descripción de un péptido y una descripción de una proteína, y vice versa. Los términos aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural así como polímeros de aminoácido en donde uno o más residuos aminoácido es un aminoácido no naturalmente codificado. Como se emplea aquí, los términos abarcan cadenas aminoácido de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud íntegra, en donde los residuos aminoácido se unen por enlaces péptidos covalentes. Como se emplea aquí, "hormona de crecimiento" o "GH" habrá de incluir aquellos polipéptidos y proteínas que tienen cuando menos una actividad biológica de una hormona de crecimiento humano, así como análogos GH, isoformas GH, mimétidos de GH, fragmentos de GH, proteínas GH híbridas, proteínas de fusión, oligómeros y multímeros, homólogos, variantes de patrón de glicosilación, variantes, variantes de combinación y moteínas de los mismos, independientemente de la actividad biológica de los mismos, y además independientemente de los métodos de síntesis o su fabricación incluyendo pero no limitados a, métodos recombinantes (ya sea producidos a partir de cDNA, DNA genómico, DNA sintético u otra forma de ácido nucleico) , in vi tro o in vivo, por microinyección de moléculas de ácido nucleico, sintéticos, transgénicos y activados por genes. El término "polipéptido hGH" o "hGH" abarca polipéptidos hGH que comprenden uno o más substituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Substituciones ejemplares en una amplia variedad de posiciones de aminoácidos en hGH de origen natural incluyendo substituciones que aumentan la actividad agonista, incrementan la resistencia de proteasa, convierten el polipéptido en un antagonista, modulan inmunogeneicidad, modulan enlace receptor, etc., están abarcados por el término "polipéptido hGH" . Para la secuencia de aminoácidos GH de origen natural de longitud íntegra completa así como la secuencia aminoácido GH de origen natural madura y mutante de origen natural, ver SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente aquí. En algunas modalidades, polipéptidos hGH de la invención son substancialmente idénticos a SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 o cualquier otra secuencia de un polipéptido de hormona de crecimiento. Una cantidad de mutantes de origen natural de hGH se han identificado. Estos incluyen hGH-V (Seeburg, DNA 1: 239 (1982); patentes de los E.U.A. Nos. 4,446,235, 4,670,393, y 4,665,180, que se incorporan aquí por referencia) y un hGH de 20-kDa que contiene una eliminación de residuos 32-46 de hGH (Kostyo et al, Biochem . Biophys . Acta 925: 314 (1987); Lewis, U. , et al, J. Biol . Chem. , 253:2679-2687 (1978) ) . Hormona de crecimiento placentario se describe por Igout, A., et al , Nucleic Acids Res . 17(10) -.3998 (1989)). Además, numerosas variantes hGH, que surgen de procesamiento metabólico posttranscripción, post-traducción, secretorio, y otros procesos fisiológicos, se han reportado incluyendo variantes de 2 cadenas o escindidas proteolíticamente (Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)).

Moléculas de ácido nucleico que codifica mutantes hGH y polipéptidos hGH mutantes son bien conocidos e incluyen pero no están limitados a aquellos descritos en las patentes de los E.U.A. Nos.: 5,534,617; 5,580,723; 5,688,666; 5,750,373; 5,834,250; 5,834,598; 5,849,535; 5,854,026; 5,962,411; 5,955,346; 6,013,478; 6,022,711; 6,136,563; 6,143,523; 6,428,954; 6,451,561; 6,780,613 y la publicación de la solicitud de patente de los E.U.A. 2003/0153003; que aquí se incorporan por referencia. El término "hGH" también puede emplearse para referirse a hormona de crecimiento humano recombinante con substitución dirigida por sitio de un aminoácido no-naturalmente codificado. Todas las referencias a posiciones de aminoácidos en hGH aquí descritas se basan en la posición en SEQ ID NO: 2, a menos que se especifique de otra forma (es decir, cuando se establece que la comparación se basa en SEQ ID NO: 1, 3, u otra secuencia hGH) . Aquellos con destreza en la técnica apreciarán que posiciones de aminoácido correspondientes a posiciones en SEQ ID NO: 1, 2, 3, o cualquier otra secuencia GH puede identificarse fácilmente en cualquier otra molécula hGH tal como fusiones hGH, variantes, fragmentos, etc. Por ejemplo, programas de alineamiento de secuencia tales como BLAST pueden emplearse para alinear e identificar una posición particular en una proteína que corresponde con una posición en SEQ ID NO: 1, 2, 3, u otra secuencia GH. Substituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos aquí descritas en referencia a SEQ ID NO: 1, 2, 3, u otra secuencia GH, se pretende que también se refieran a substituciones, eliminaciones o adiciones y posiciones correspondientes en fusiones hGH, variantes, fragmentos, etc., aquí descritos o conocidos en la técnica y están abarcados expresamente por la presente invención. Preparaciones comerciales de hGH se venden bajo los nombres: HumatropeMR (Eli Lilly & Co . ) , NutropinMR (Genentech) , NorditropinMR (Novo-Nordisk) , GenotropinMR (Pfizer) y Saizen/SerostimMR (Serono) . El término "polipéptido hGH" también incluye las sales y prodrogas farmacéuticamente aceptables, y prodrogas de las sales, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biológicamente-activos, variantes biológicamente activas y estereoisómeros de la hGH de origen natural así como variantes agonistas, miméticas y antagonistas de la hGH de origen natural y fusiones de polipéptido de los mismos. Fusiones que comprenden aminoácidos adicionales como el extremo amino, extremo carboxilo, o ambos, están abarcadas por el término "polipéptido hGH". Fusiones ejemplares incluyen, pero no están limitadas por ejemplo a hormona de crecimiento metionilo, en donde una metionina se enlaza al extremo N de hGH resultando de la expresión recombinante, fusiones para el propósito de purificación (incluyendo pero no limitadas a, poli-histidina o epítopes de afinidad) , fusiones con péptidos de enlace de albúmina de suero y fusiones con proteínas de suero tales como albúmina de suero. La patente de los E.U.A. No. 5,750,373, que aquí se incorpora por referencia, describe un método para seleccionar proteínas novedosas tales como hormona de crecimiento y variantes de fragmento de anticuerpo que tienen propiedades de enlace alteradas para sus moléculas de receptor respectivas. El método comprende fusión de un gen que codifica una proteína de interés al dominio terminal carboxilo de la proteína de revestimiento de gen III del fago filamentoso M13. Diversas referencias describen modificación de polipéptidos por conjugación o glicosilación de polímero. El término "polipéptido hGH" incluye polipéptidos conjugados a un polímero tal como PEG y puede comprender uno o más derivatizaciones adicionales de cisteína, lisina u otros residuos. Además, el polipéptido hGH puede comprender un enlazador o polímero, en donde el aminoácido al cual se conjuga el enlazador polímero, puede ser un aminoácido no natural de acuerdo con la presente invención, o puede estar conjugado con un aminoácido naturalmente codificado utilizando técnicas conocidas en la especialidad tales como acoplamiento a lisina o cisteína.

La presente invención proporciona conjugados de polipéptido hGH que tienen una amplia variedad de grupos funcionales, substituyentes o porciones, con otras substancias incluyendo pero no limitadas a una etiqueta; un colorante; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; un fotoreticulador o enlazador; un radionúclido; un compuesto citotóxico; una droga; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN (DNA) ; un ARN (RNA) ; un polinucleótido antisentido; un sacárido; un dendrímero soluble en agua; una ciclodextrina; un ácido ribonucleico inhibitorio; un biomaterial; una nanopartícula; una etiqueta espín; un fluoróforo, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa en forma covalente o no covalente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo de escisión química; un grupo de fotoescisión; una cadena lateral alargada un azúcar enlazado a carbono; un agente redox-activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción isotópicamente etiquetada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminescente; un grupo denso en electrones; un grupo magnético; un grupo intercalado; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrones o cualquier combinación de los anteriores, o cualquier otro compuesto o substancia conveniente) . Conjugación de polímero de polipéptidos hGH se ha reportado. Ver, por ejemplo las patentes de los E.U.A. Nos. 5,849,535, 6,136,563 y 6,608,183, que se incorporan aquí por referencia. La patente de los E.U.A. No. 4,904,584 describe polipéptidos agotados en lisina modificado con PEG, en donde al menos un residuo lisina se ha eliminado o reemplazado con cualquier otro residuo aminoácido. WO 99/67291 describe un proceso para conjugar una proteína con PEG, en donde al menos un residuo aminoácido en la proteína se elimina y la proteína se conjuga con PEG bajo condiciones suficientes para lograr conjugación a la proteína. WO 99/03887 describe variantes modificadas con PEG de polipéptidos que pertenecen a la superfamilia de hormona de crecimiento, en donde un residuo de cisteina se ha substituido con un residuo aminoácido no esencial ubicado en una región especificada del polipéptido. WO 00/26354 describe un método para producir una variante de polipéptido glicosilado con reducida alergenicidad, que en comparación con un polipéptido precursor correspondiente, comprende al menos un sitio de glicosilación adicional. La patente de los E.U.A. No. 5,218,092 describe modificación de factor de estímulo de colonia de granulocito (G-CSF) y otros polipéptidos para introducir cuando menos una cadena carbohidrato adicional en comparación con el polipéptido nativo. El término "polipéptido hGH" abarca polipéptidos hGH que comprenden una o más substituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácido. Polipéptidos hGH de la presente invención pueden comprender modificaciones con uno o más aminoácidos naturales en conjunto con una o más modificaciones de aminoácido no naturales. Substituciones ejemplares en una amplia variedad de posiciones de aminoácido en polipéptidos hGH de origen natural se han descrito, incluyendo pero no limitadas a substituciones que modulan una o más de actividades biológicas del polipéptido hGH, tales como pero no limitadas a, incrementada actividad agonista, incrementada solubilidad del polipéptido, convertir el polipéptido en un antagonista, disminuir la susceptibilidad de proteasa, etc., y están abarcadas por el término "polipéptido hGH". En algunas modalidades, los polipéptidos hGH además comprenden una adición, substitución o eliminación que modula actividad biológica del polipéptido hGH. Por ejemplo, las adiciones, substituciones o eliminaciones pueden modular afinidad por el receptor polipéptido hGH, modular (incluyendo pero no limitadas a, incrementos o disminuciones) , dimerización de receptor, estabilizar dímeros de receptor, modular vida media en circulación, modular vida media terapéutica, modular estabilidad del polipéptido, modular escisión por proteasas, modular dosis, modular liberación o bio-disponibilidad, facilitar purificación, o mejorar o alterar una ruta de administración particular. Similarmente, polipéptidos hGH pueden comprender secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace de anticuerpo (incluyendo pero no limitados a, FLAG o poly-His) u otra secuencia de basadas en afinidad (incluyendo pero no limitadas a, FLAG, poly-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo pero no limitadas a biotina) que mejoran la detección (incluyendo pero no limitadas a GFP) , purificación u otros rasgos del polipéptido.

Polipéptidos hGH pueden comprender secuencias de señal de secreción. Ejemplos de secuencias de señal de secreción incluyen pero no están limitadas a, una secuencia de señal de secreción procariótica, una secuencia de señal de secreción eucariótica, una secuencia de señal de secreción eucariótica 5 ' -optimizada para expresión bacteriana, una secuencia de señal de secreción novedosa, secuencia de señal de secreción pectato liasa, secuencia de señal de secreción Omp A, y una secuencia de señal de secreción fago. Ejemplos de secuencias de señal de secreción, incluyen pero no están limitadas a, STII (procariótica) , Fd Gilí y M13 (fago) , Bgl2 (levadura) , y la secuencia de señal bla derivada de un transposón. El término "polipéptido hGH" también abarca homodímeros, heterodímeros, homomultímeros y heteromultímeros que se enlazan, pero no están limitados a aquellos enlazados directamente mediante cadenas laterales aminoácido no naturalmente codificadas, ya sea las mismas o diferentes cadenas laterales aminoácido no naturalmente codificadas, a cadenas laterales aminoácido naturalmente codificadas, o indirectamente mediante un enlazador. Dímeros hGH enlazados directamente mediante un enlace disulfuro Cys-Cys se describen en Lewis, U. J. , et al , J. Biol . Chem . 252:3697-3702 (1977); Brostedt, P. and Roos, P., Prep . Biochem. 19:217-229 (1989)).

Enlazadores ejemplares incluyen pero no están limitados a, polímeros solubles en agua tales como poli (etilen glicol) o polidextrano o polipéptidos de diversas longitudes . El término "polipéptido hGH" también incluye hGH glicosilado, tal como pero no limitado a, polipéptidos glicosilados en cualquier posición aminoácido, formas N-enlazadas u O-enlazadas glicosiladas del polipéptido. Variantes que contienen cadenas nucleótido sencillas también se consideran como variantes biológicamente activas de polipéptido hGH. Además, variantes de combinación también se incluyen. El término "polipéptido hGH" también incluyen heterodímeros de polipéptido hGH, homodímeros, heteromultímeros u homomultímeros de cualquiera uno o más de los polipéptidos hGH o cualquier otro polipéptido, proteína, carbohidrato, polímero, molécula pequeña, enlazador, ligando, u otra molécula biológicamente activa de cualquier tipo, enlazado por medios químicos o expresado como proteína de fusión, así como análogos polipéptido que contienen por ejemplo, eliminaciones específicas u otras modificaciones sin embargo mantienen actividad biológica . Aquellos con destreza en la técnica apreciarán que posiciones aminoácido correspondientes a posiciones en una secuencia hGH particular pueden identificarse fácilmente en cualquier otra molécula hGH tales como fusiones hGH, variantes, fragmentos, etc. Por ejemplo, programas de alineamiento de secuencia tales como BLAST pueden utilizarse para alinear e identificar una posición particular en una proteína que corresponde con una posición en una secuencia GH particular. "hGH nativo" como se emplea aquí, se define como hGH, incluyendo hGH de origen natural, análogos y sus variantes, que está adecuadamente plegado y contiene solo enlaces disulfuro correctos. hGH también contiene cuatro residuos cisteína, que participan en dos enlaces disulfuro intramolecular: C53 está apareado con C 165 y C 182 está apareado con C 189 o los homólogos de esos residuos aminoácido en análogos y variantes de hGH. hGH nativo es biológicamente activo. "hGH insoluble" se refiere a hGH precipitado o agregado que se produce por células anfitrionas recombinantes, o de otra forma es una célula anfitrona recombinante asociada, y puede adquirir una conformación biológicamente inactiva con posibles enlaces disulfuro incorrectos o no formados. hGH insoluble puede estar contenido en cuerpos de inclusión o cuerpos refráctiles, es decir puede o no ser visible bajo un microscopio de contraste de fase. hGH insoluble puede producirse al hacer insoluble al hGH insoluble por cualquier método conocido por una persona con destreza en la especialidad. "hGH inadecuadamente plegado" se refiere a hGH que está en una conformación biológicamente menos activa con enlaces disulfuro incorrectos o no formados. hGH inadecuadamente plegado puede ser pero no requiere ser insoluble . El término "variante hGH" como se emplea aquí, incluye variantes de hGH maduro y polipéptidos hGH. Una "variante hGH" puede crearse por e incluye por ejemplo, la eliminación o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína madura, eliminación o adición de uno o más aminoácido al extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína madura, y/o substitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína madura. Por ejemplo, una variante hGH puede crearse al agregar o eliminar cuando menos 10 aminoácidos, al menos 5 aminoácidos, al menos 3 aminoácidos, o al menos 1 aminoácido. Variantes hGH también pueden incluir modificaciones post-traducción incluyendo, pero no limitadas a, glicosilación, acetilación, fosforilación, y semejantes. El término "variante hGH" específicamente incluye, pero no está limitado a, mutantes, variantes alélicas, homólogos y fusiones de secuencias hGH maduras.

Una variante hGH también incluye pero no está limitada a, péptido mímicos o "peptoides". Ver WO 91/04282. El término "substancialmente purificado" se refiere a polipéptido hGH que puede estar substancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína como se encuentra en su ambiente de origen natural, es decir una célula nativa, o célula anfitriona en el caso de polipéptido hGH producido en forma recombinante. hGH que puede estar substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tiene menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, o menos que aproximadamente 1% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando el polipéptido hGH o su variante se produce en forma recombinante por las células anfitrionas, la proteína puede estar presente a aproximadamente 30%, aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, aproximadamente 2%, o aproximadamente 1% o menos del peso seco de las células. Cuando el polipéptido hGH o su variante se produce en forma recombinante por las células anfitrionas, la proteína puede estar presente en el medio de cultivo a aproximadamente 5 g/L, aproximadamente 4 g/L, aproximadamente 3 g/L, aproximadamente 2 g/L, aproximadamente 1 g/L, aproximadamente 750 mg/L, aproximadamente 500 mg/L, aproximadamente 250 mg/L, aproximadamente 100 mg/L, aproximadamente 50 mg/L, aproximadamente 10 mg/L, o aproximadamente 1 mg/L o menos del peso seco de las células. De esta manera, polipéptido hGH "substancialmente purificado" como se produce por los métodos de la presente invención, puede tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, y más específicamente un nivel de pureza de al menos aproximadamente 90%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 95%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 99% o mayor, como se determina por métodos apropiados incluyendo pero no limitados a análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, y electroforesis capilar.

Una "célula anfitriona recombinante" o "célula anfitriona" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, independientemente del método empleado para inserción, por ejemplo absorción directa, transducción, apareamiento-f, u otros métodos conocidos en la técnica para crear células anfitrionas recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o en forma alterna, puede integrarse en el genoma anfitrión. Como se emplea aquí, el término "medio" o "medio" incluye cualquier medio de cultivo, solución, sólido, semi-sólido, o soporte rígido que pueda soportar o contener cualquier célula anfitriona, incluyendo células anfitrionas bacterianas, células anfitrionas eucarióticas, células anfitrionas de mamíferos, células anfitrionas de levadura, células anfitrionas de insectos, células anfitrionas de plantas, células CHO, células anfitrionas procarióticas, células anfitrionas E. coli , o Pseudomonas, y contenidos celulares. De esta manera, el término puede abarcar medio en donde la célula anfitriona se ha desarrollado, por ejemplo medio en el cual se ha secretado el polipéptido hGH, incluyendo medio ya sea antes o después de una etapa de proliferación. El término también puede abarcar amortiguadores o reactivos que contienen lisados de células anfitrionas, tales como en el caso en donde polipéptidos hGH se producen intracelularmente y las células anfitrionas se lisan o rompen para liberar el polipéptido hGH. "Agente reductor" como se emplea aquí, con respecto a plegado de proteína, se define como cualquier compuesto o material que mantiene grupos sulfhidrilo en el estado reducido y reduce enlaces disulfuro intra- o intermoleculares. Agentes reductores convenientes incluyen pero no están limitados a, ditiotreitol (DTT) , 2 -mercaptoetanol , ditioeritritol , cisteína, cisteamina (2-aminoetantiol) , y glutationa reducida. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza en la técnica que una amplia variedad de agentes reductores son adecuados para utilizar en los métodos de la presente invención. "Agente oxidante" como se emplea aquí, con respecto a plegado de proteína, se define como cualquier compuesto o material que sea capaz de retirar un electrón de un compuesto que se oxida. Agentes oxidantes convenientes incluyen, pero no están limitados a, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado y oxígeno. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad que son adecuados una amplia variedad de agentes oxidantes para utilizar en los métodos de la presente invención. "Agentes desnaturalizante" o "desnaturalizante", como se emplea aquí, se define como cualquier compuesto o material que provocará un desdoblado reversible de una proteína. La fuerza de un agente desnaturalizante o desnaturalizante se determinará tanto por las propiedades como la concentración del desnaturalizante o agente desnaturalizante particular. Desnaturalizantes o agentes desnaturalizantes convenientes pueden ser caótropos, detergentes, solventes orgánicos, solventes miscibles en agua, fosfolípidos o una combinación de dos o más de estos agentes. Caótropos convenientes incluyen pero no están limitados a, urea, guanidina y tiocianato de sodio. Detergentes útiles pueden incluir, pero no están limitados a, detergentes fuertes tales como dodecil sulfato de sodio o polioxietilen éteres (por ejemplo, detergentes Tween o Tritón), Sarkosyl, detergentes no iónicos suaves (por ejemplo digitonina), detergentes catiónicos suaves (tales como N->2 , 3- (Dioleioxi) -propil-N,N,N-trimetilamonio, detergentes iónicos suaves (por ejemplo colato de sodio o deoxicolato de sodio) o detergentes zwitterionic incluyendo pero no limitados a sulfobetaínas (Zwittergent), 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-1- propan sulfato (CHAPS), y 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-2 -hidroxi-1 -propan sulfonato (CHAPSO) . Solventes miscibles en agua orgánicos tales como acetonitrilo, alcanoles inferiores (en especial C2-C4-alcanoles tales como etanol o isopropanol) , o alcandioles inferiores (en especial C2-C4 alcandioles tales como etilen-glicol) pueden emplearse como desnaturalizantes. Fosfolípidos útiles en la presente invención pueden ser fosfolípidos de origen natural tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidilinositol o derivados fosfolípidos sintéticos o variantes tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina . "Plegado" como se emplea aquí, describe cualquier proceso, reacción o método que transforma polipéptido que contienen enlace disulfuro de un estado inadecuadamente plegada o nativa con respecto a enlaces disulfuro . "Co-plegado" como se emplea aquí, se refiere específicamente a procesos, reacciones o métodos de plegado que emplean cuando menos dos polipéptido que interactúan entre sí y resultan en la transformación de polipéptidos no plegados o inadecuadamente plegados a polipéptidos nativos, adecuadamente plegados.

Un "aminoácido no-naturalmente codificado" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina o selenocisteína . Otros términos que pueden emplearse en forma de sinónimo con el término "aminoácido no-naturalmente codificado" son "aminoácido no-natural", "aminoácido inatural", "aminoácido que no es de origen natural", y diversas versiones con guiones y sin guiones de los mismos. El término "aminoácido no-naturalmente codificado" también incluye pero no está limitado a, aminoácidos que ocurren por modificación (por ejemplo modificaciones postraducción) de un aminoácido naturalmente codificado (incluyendo pero no limitado a los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína) pero ellos mismos no están incorporados naturalmente en una cadena polipéptido creciente por el complejo de traducción. Ejemplos de estos aminoácidos que no son de origen natural, incluyen pero no están limitados a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N- acetilglucosaminil-L-treonina, y O-fosfotirosina . Como se emplea aquí, el término "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero que es soluble en solventes acuosos. El enlace de polímero solubles en agua con polipéptidos hGH puede resultar en cambios incluyendo pero no limitados a, vida media en suero incrementada o modulada, o vida media terapéutica incrementada o modulada respecto a la forma no modificada, inmunogenicidad modulada, características de asociación física modulada tales como agregación y formación de multímero, enlace receptor alterado, y dimerización o multimerización de receptor alterada. El polímero soluble en agua puede o no tener su propia actividad biológica, y puede utilizarse como un enlazador para conectar hGH a otras substancias, incluyendo pero no limitadas a uno o más polipéptidos hGH, o una o más moléculas biológicamente activas. Polímeros convenientes incluyen pero no están limitados a, polietilen glicol, polietilen glicol propionaldehido, mono C1-C10 alcoxi o ariloxi derivados de los mismos (descritos en la patente de los E.U.A. No. 5,252,714 que aquí se incorpora por referencia), monometoxi-polietilen glicol, polivinyl pirrolidona, polivinil alcohol, poliaminoácidos, anhídrido maleico diviniléter, N- (2 -Hidroxipropil ) -metacrilamida, dextran, derivados dextran incluyendo dextran sulfato, polipropilen glicol, copolímero de polipropilen óxido/etilen óxido, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glicanos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo pero no limitados a metilcelulosa y carboximetil celulosa, almidón y derivados de almidón, polipéptido, polialquilen glicol y sus derivados, copolímeros de polialquilen glicoles y sus derivados, polivinil etil éteres, y alfa-beta-poli [ (2-hidroxietil) -DL-aspartamida, y semejantes, o sus mezclas. Ejemplos de estos polímeros solubles en agua incluyen, pero no están limitados a, polietilen glicol y albúmina de suero. Un "grupo de modificación de extremo amino" se refiere a cualquier molécula que puede conectarse al extremo amino de un polipéptido. Similarmente, un "grupo de modificación de extremo carboxi" se refiere a cualquier molécula que puede conectarse al extremo carboxi de un polipéptido. Grupos de modificación de extremo, incluyen pero no están limitados a diversos polímeros solubles en agua, péptidos o proteínas tales como albúmina de suero u otras porciones que incrementan la vida media en suero de péptidos. Como se emplea aquí, el término "polialquilen glicol" o "poli (alquen glicol)" se refiere a polietilen glicol (poli (etilen glicol)), polipropilen glicol, polibutilen glicol y sus derivados. El término "polialquilen glicol" abarca tanto polímeros lineales como ramificados y pesos moleculares promedio entre 0.1 kDa y 100 kDa. Otras modalidades ejemplares se citan por ejemplo en catálogos de proveedores comerciales tales como el catálogo de Shearwater Corporation "Polyethylen Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001) . Los términos "grupo funcional", "porción activa", "grupo de activación", "grupo saliente", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "porción químicamente reactiva" se emplean en la técnica y aquí para referirse a porciones unidades distintas definibles de una molécula. Los términos son algo sinónimos en las técnicas químicas y se emplean aquí para indicar las porciones de moléculas que realizan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas. El término "enlace" o "enlazador" se emplea aquí para referirse a grupos o enlaces que normalmente se forman como resultado de una reacción química y típicamente son enlaces covalentes. Enlaces hidrolíticamente estables significan que los enlaces son substancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo pero no limitados a, bajo condiciones fisiológicas por un periodo prolongado de tiempo, probablemente incluso en forma indefinida. Enlaces hidrolíticamente inestables o degradables significan que los enlaces se degradan en agua o en soluciones acuosas, incluyendo por ejemplo sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables significan que el enlace puede degradarse por una o más enzimas. Como se entiende en la técnica, PEG y polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en la estructura principal de polímero o en el grupo enlazador entre la estructura principal de polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula de polímero. Por ejemplo, enlaces éster formados por la reacción de ácidos carboxílicos PEG o ácidos carboxílicos PEG activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo, generalmente hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen pero no están limitados a, enlaces carbonato; enlaces imina que resultan de la reacción de una amina y un aldehido; enlaces fosfato éster formados al reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona que son productos de reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces acetal que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol; enlaces ortoéster que son el producto de reacción de un formiato y un alcohol; enlaces péptido formados por un grupo amina, incluyendo pero no limitados a, en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleótidos formados por un grupo fosforamidita, incluyendo pero no limitados a, al final de un polímero, y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido.

El término "molécula biológicamente activa" , "porción biológicamente activa" o "agente biológicamente activo" cuando se emplean aquí, significan cualquier substancia que puede afectar cualesquiera propiedades físicas o bioquímicas de un sistema biológico, ruta, molécula o interacción referente a un organismo, incluyendo pero no limitados a, virus, bacteria, bacteriófago, transposon, prion, insectos, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se emplea aquí, moléculas biológicamente activas, incluyen pero no están limitadas a, cualquier substancia pretendida para diagnóstico, cura, mitigado, tratamiento o prevención de enfermedad en humanos u otros animales, o para mejorar de otra forma el bienestar físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no están limitadas a péptidos, proteínas, enzimas, drogas de molécula pequeña, drogas fuertes, drogas ligeras, carbohidratos, átomos o moléculas inorgánicos, colorantes, lípidos, nucleósidos, radionúclidos, oligonucleótidos, toxinas, células, virus, liposomas, micropartículas y micelios. Clases de agentes biológicamente activos que son adecuados para utilizar con la invención incluyen, pero no están limitadas a drogas, prodrogas, radionúclidos, agentes de formación de imagen, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes anti-virales, agentes antiinflamatorios, agentes anti-tumor, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroidales, toxinas microbialmente derivadas y semejantes. Un "polímero bifuncional" se refiere a un polímero que comprende dos grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otras porciones (incluyendo pero no limitados a grupos laterales aminoácido) para formar enlaces covalentes o no-covalentes . Un enlazador bifuncional que tiene un grupo functional reactivo con un grupo en un componente biológicamente activo particular, y otro grupo reactivo con un grupo en un segundo componente biológico, puede utilizarse para formar un conjugado que incluye el primer componente biológicamente activo, el enlazador bifuncional y el segundo componente biológicamente activo. Muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para conectar diversos compuestos a péptidos se conocen. Ver por ejemplo la solicitud de patente europea No. 188,256; las patentes de los E.U.A. Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; y 4,569,789 que aquí se incorporan por referencia. Un "polímero multi-funcional" se refiere a un polímero que comprende dos o más grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otras porciones (incluyendo pero no limitados a grupos secundarios aminoácido) para formar enlaces covalentes o no-covalentes. Un polímero bi-funcional o polímero multi -funcional puede ser cualquier longitud o peso molecular deseado, y puede seleccionarse para proporcionar un espaciamiento o conformación deseados particulares entre una o más moléculas enlazadas a hGH. Cuando se especifican grupos substituyentes por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, igualmente abarcan los substituyentes químicamente idénticos que resultarán de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo la estructura -CH20- es equivalente a la estructura -OCH2- . Como se emplea aquí, el término "vida media en suero modulada" significa el cambio positivo o negativo en vida media en circulación de un hGH modificado respecto a su forma no modificada. Vida media en suero se mide al tomar muestras de sangre en diversos puntos en tiempo después de administración de hGH, y determinar la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración en suero con el tiempo permite cálculo de la vida media en suero. Vida media en suero incrementada convenientemente tiene aproximadamente dos veces, pero un aumento más pequeño puede ser útil, por ejemplo cuando permite un régimen de dosificación satisfactorio o evita un efecto tóxico. En algunas modalidades, el aumento es de cuando menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces, o al menos aproximadamente diez veces. El término "vida media terapéutica modulada" como se emplea aquí, significa el cambio positivo o negativo de la vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de polipéptido hGH, respecto a su forma no modificada. La vida media terapéutica se mide al medir las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámica de la molécula en diversos puntos en tiempo después de administración. Vida media terapéutica incrementada convenientemente permite un régimen de dosis benéfico particular, una dosis total benéfica particular, o evita un efecto indeseado. En algunas modalidades, la vida media terapéutica incrementada resulta de una potencia incrementada, enlace incrementado o disminuido de la molécula modificada con su diana u objetivo, descomposición incrementada o disminuida de la molécula por enzimas tales como proteasas, o un aumento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada.

El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, denota que el ácido nucleico o proteína esté libre de al menos algunos de los otros componentes celulares con los cuales se asocia en el estado natural, o que el ácido nucleico o proteína se ha concentrado a un nivel mayor que la concentración de su producción in vivo o in vi tro . Puede estar en un estado homogéneo. Substancias aisladas ya pueden estar en un estado seco o semi-seco, o en solución, incluyendo pero no limitadas a solución acuosa. Puede ser un componente de una composición farmacéutica que comprende portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. La pureza y homogeneidad se determina típicamente utilizando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquido de alto desempeño. Una proteína que es de especie predominante presente en una preparación se purifica substancialmente. En particular, un gen aislado se separa de marcos de lectura abiertos que flanquean al gen y codifican una proteína diferente al gen de interés. El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína da lugar a una banda substancial en un gel electroforético. Particularmente, puede significar que el ácido nucleico o proteína es cuando menos 85% puro, cuando menos 90% puro, cuando menos 95% puro, cuando menos 99% o mayor de pureza. El término "ácido nucleico" se refiere a deoxiribonucleótidos , deoxiribonucleósidos , ribonucleósidos, o ribonucleótidos y polímeros de los mismos ya sea en forma de una hebra sencilla o doble. Al menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares como el ácido nucleico de referencia y se metabolizan en una forma similar a nucleótidos de origen natural. A menos que se limite específicamente de otra forma, el término también se refiere a análogos oligonucleótido incluyendo ácido péptidonucleico (PNA = peptidonucleic acid) , análogos de DNA empleados en tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos, y semejantes) . A menos que se indique de otra forma, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente sus variantes modificadas en forma conservadora (incluyendo pero no limitadas a substituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, substituciones de codón degeneradas pueden lograrse al generar secuencias en donde la tercer posición de uno o más codones selectos (o todos) se substituye con residuos de deoxiinosina y/o de base mixta (Batzer et ah, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et ah, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et ah, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994) ) . El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y que no son de origen natural, así como análogos aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan en una forma similar a los aminoácidos de origen natural . Aminoácidos de origen natural son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina) y pirrolisina y selenocisteina . Análogos aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura básica que un aminoácido de origen natural, es decir un carbón a que se liga a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, tal como homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Estos análogos tienen grupos R modificados (tales como norleucina) o estructuras principales péptido modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que el aminoácido de origen natural.

Aminoácidos pueden referirse aquí ya sea por su nombre común de símbolo de tres letras o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Nucleótidos, igualmente pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados . "Variantes modificados en forma conservadora" aplican tanto secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, "variantes modificadas en forma conservadora" se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica a una secuencia de aminoácido, con secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. De esta manera, en toda posición en donde se especifica una alanina por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas en forma conservadora. Toda secuencia de ácido nucleico aquí, que codifica un polipéptido también describe toda variación silenciosa posible del ácido nucleico. Una persona con destreza ordinaria en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que ordinariamente es el único codón por metionina, y TGG, que ordinariamente es el único codón para triptofano) puede modificarse para dar por resultado una molécula funcionalmente idéntica. De acuerdo con esto, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita. En cuanto a secuencias de aminoácidos, una persona con destreza ordinaria en la especialidad reconocerá que individuales substituciones, eliminaciones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteínas que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada en forma conservadora" en donde la alteración resulta en la eliminación de un aminoácido, adición de aminoácido, o substitución de aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Tablas de substituciones conservadoras proporcionan aminoácidos de funcionalidad similar se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Estas variantes, modificadas en forma conservadora son además de y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecies, y alelos de la invención. Tablas de substitución conservadoras proporcionan aminoácidos de funcionalidad similar se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Los siguientes ocho grupos cada uno contienen aminoácidos que son substituciones conservadoras por otras : 1) Alanina (A) , Glicina (G) ; 2) Ácido Aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteína (C) , Metionina (M) (ver, e.g., Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co . ; 2da edición (diciembre 1993) Los términos "idénticos" o por ciento "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas.

Secuencias son "substancialmente idénticas" si tiene un porcentaje de residuos aminoácido o nucleótidos que son los mismos (es decir, aproximadamente 60% de identidad, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, o aproximadamente 95% de identidad sobre una región especificada) , cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes (u otros algoritmos disponibles a personas con destreza ordinaria en la especialidad) o por alineamiento manual e inspección visual . Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. La identidad puede existir sobre una región que es al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o sobre una región que es de 75 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o cuando no se especifica, a través de todas la secuencia de un polinucleótido o polipéptido. Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, secuencias de prueba y referencia se alimentan en una computadora, se designan subsecuentes coordenadas y de ser necesario, se designan parámetros de programa para algoritmo de secuencia. Parámetros de programa predefinidos pueden emplearse, o pueden designarse parámetros alternos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces el por ciento de identidad de secuencia para las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa . Una "ventana de comparación" , como se emplea aquí, incluye referencia a un segmento de cualquiera de la cantidad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en donde una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean en forma óptima. Métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede conducirse, incluyendo pero no limitado a, por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por el método de búsquedad de similaridad de Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) , o por alineamiento manual e inspección visual (ver, e.g., Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) ) . Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar por ciento de identidad de secuencia y similaridad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Soporte lógico o programa para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias nucleótido) utiliza como valores predefinidos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=S, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácido, el programa BLASTP utiliza como valores predefinidos una longitud de palabra 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST típicamente se realiza con el filtro de "baja complejidad" apagado. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias (ver por ejemplo, Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de similaridad que se proporciona por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una correspondencia entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido ocurrirá al azar. Por ejemplo, un ácido nucleico puede considerarse similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia es menos que aproximadamente 0.2, menos que aproximadamente 0.01, o menos que aproximadamente 0.001. La frase "selectiva (o específicamente) hibridiza a" se refiere al enlace, duplejado o hibridización de una molécula solo a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones de hibridización severas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (incluyendo pero no limitado a, DNA o RNA de biblioteca o celular total) . La frase "condiciones de hibridización severas" se refieren a hibridización de secuencias de DNA, RNA, P?A, u otros mímicos de ácido nucleico, o sus combinaciones bajo condiciones de baja fuerza iónica y alta temperatura como se conoce en la técnica. Típicamente, bajo condiciones severas, una sonda hibridizará a su subsecuencia diana en una mezcla compleja de ácido nucleico (incluyendo pero no limitada a, D?A o RNA celular total o de biblioteca) pero no hibridiza a otras secuencias en la mezcla compleja. Condiciones severas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas hibridizan específicamente a superiores temperaturas. Una guía extensa a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with ?ucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). En general, se eligen condiciones severas para ser aproximadamente 5-10 grados C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para una secuencia específica a un pH de concentración iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo la fuerza iónica definida, pH, y concentración nucleica) en la cual 50% de las sondas complementarias al objetivo o diana hibridizan a la secuencia diana en equilibrio (como las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Condiciones severas pueden ser aquellas en donde la concentración de sale es menos que aproximadamente ion sodio 1.0 M, típicamente concentración de ion sodio aproximada de 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es cuando menos aproximadamente 30 grados C para sondas cortas (incluyendo pero no limitadas a, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 grados C para sondas largas (incluyendo pero no limitadas a, mayores a 50 nucleótidos) . Condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes destabilizantes tales como formamida. Para hibridización selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos dos veces el fondo, opcionalmente 10 veces la hibridización de fondo. Condiciones de hibridización severas ejemplares pueden ser como sigue: 50% formamida, 5X SSC, y 1% SDS, incubando a 42 grados C, o 5X SSC, 1% SDS, incubando a 65 grados C, con lavado en 0.2X SSC, y 0.1% SDS a 65 grados C. Estos lavados pueden realizarse por 5, 15, 30, 60, 120 o más minutos.

Como se emplea aquí, el término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucaria tales como animales (incluyendo pero no limitados a, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas (incluyendo pero no limitados a, monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.), hongos, levaduras, flagelados, microsporidia, protistas, etc. Como se emplea aquí el término "no-eucariota" se refiere a organismos no-eucarioticos . Por ejemplo, un organismo no-eucariotico puede pertenecer al dominio filo genético Eubacteria (incluyendo pero no limitado a Escherichia coli , Thermus thermophilics , Bacillus stearothermophilus , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), o el dominio filo genético Archaea (incluyendo pero no limitado a Methanococcus jannaschii , Methano bacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Halof erax volcanii y Halobacterium species NRC-1 , Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii , Aeuropyrum pernix, etc.) . El término "sujeto" Como se emplea aquí, se refiere un animal, en algunas modalidades un mamífero y en otras modalidades un humano, quien es el objeto de tratamiento observación o experimento.

El término "cantidad efectiva" como se emplea aquí, se refiere a aquella cantidad del polipéptidos aminoácido no natural que se administra que aliviará en cierta medida una o más de los síntomas de la enfermedad condición o desorden a tratar. Composiciones que contienen el aminoácido polipéptido no natural aquí descrito pueden administrarse para tratamientos profilácticos, de mejora y/o terapéuticos. Los términos "mejora" o "mejoría" significa el incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración, un efecto deseado. De esta manera, respecto a mejorar el efecto de agentes terapéuticos, el término "mejora" se refiere a la capacidad de incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema. Una "cantidad de mejora efectiva" como se emplea aquí, se refiere a una cantidad adecuada para mejorar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Cuando se utiliza en un paciente, cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad y curso de la enfermedad desorden o condición, terapia previa, el estado de salud del paciente y respuesta a las drogas, y el juicio del médico a cargo del tratamiento. El término "modificado" como se emplea aquí, se refiera cualesquiera cambios realizados a un polipéptido dado tales como cambios a la longitud del polipéptidos, la secuencia de aminoácidos, estructura química, modificación co-traducción, o modificación posttraducción de un péptido. La forma término "(modificado)" significa que los polipéptidos que se discuten están opcionalmente modificados, esto es los polipéptidos bajo discusión pueden ser modificados o no modificados. El término "modificado post-traducción" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural que ocurre en este aminoácido después de que se ha incorporado en una cadena polipéptido. El término abarca, a manera de ejemplo solamente modificaciones co-traducción in vivo, modificaciones, co-traducción in vi tro (tales como sistema de traducción libre de células) modificaciones post-traducción in vivo y modificaciones post-traducción iri vi tro . En aplicaciones profilácticas, composiciones que contienen el polipéptidos aminoácidos no natural se administran a un paciente susceptible a o de otra forma en riesgo en enfermedad desorden o condición particular. Esta cantidad se define como una "cantidad profilácticamente efectiva" . En este uso, las cantidades precisas también dependen del estado de salud del paciente, el peso y semejantes. Se considera bien dentro de la destreza en la técnica para una persona el que determine estas cantidades profilácticamente efectivas mediante experimentación rutinaria (por ejemplo una prueba clínica de escala de dosis) . El término "protegido" se refiere a la presencia de una porción o "grupo protector" que evita reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo del grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de ter-butiloxicarbonil (t-Boc) y 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) . Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro . Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxilico, tal como ácido butanóico o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser un grupo benzilo o alquilo tal como metilo, etilo o ter-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la técnica también pueden emplearse en o con los métodos y composiciones aquí descritos, incluyendo grupos fotolabiles tales como Nvoc y MeN voc . Otros grupos protectores conocidos en la técnica también pueden emplearse en o con los métodos y composiciones aquí descritos.

A manera de ejemplo solamente, grupos bloqueadores/protectores pueden seleccionarse de: alil Bn Cbz aloc Me {CHjfcC- Boc pMBn tritil acetil Fmoc Otros grupos protectores se describen en Greene and Wuts, Protective Groups en Organic Synthesis, 3rd Ed. , John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, que aquí se incorporan por referencia en su totalidad. En aplicaciones terapéuticas, composiciones que contienen el aminoácido polipéptido no natural (modificado) se administran a un paciente que ya sufre de una enfermedad, condición o desorden, en una cantidad suficiente para curar o al menos frenar parcialmente los síntomas de la enfermedad desorden o condición. Esta cantidad se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva", y dependerá de la severidad y curso del enfermedad desorden o condición, terapia previa, el estado de salud del paciente y respuesta a las drogas, y el juicio del médico a cargo. Se considera bien dentro de la destreza en la técnica que alguien determine estas cantidades terapéuticamente efectivas por experimentación rutinaria (por ejemplo una pruebas clínica de escala de dosis) . El término "tratamiento" se emplea para referirse ya sea a tratamientos profilácticas y/o terapéuticos . Polipéptidos aminoácidos no naturalmente codificados presentados aquí pueden incluir compuestos isotópicamente etiquetados con uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o un número de masa diferente de la masa atómica o número de masa usualmente encontrados en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los presentes compuestos incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor y cloro tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 35S, 18F, 36C1 respectivamente. Ciertos compuestos isotópicamente etiquetados aquí descritos por ejemplo aquellos en los cuales isótopos reactivos tales como 3H y 14C se incorporan, pueden ser útiles en ensayos de distribución del tejido de sustrato y/o droga. Además, la sustitución con isótopos tales como deuterio, es decir 2H pueden producir ciertas ventajas terapéuticas que resultan de mayor estabilidad metabólica, por ejemplo incrementada vida media in vivo o requerimientos de dosis reducida. Todos los hizo menos incluyendo pero no limitados a diasterómeros, enantiómeros, y mezclas de los mismos, se consideran como parte de las composiciones aquí descritas. En modalidades adicionales, los aminoácidos polipéptidos no naturalmente codificados se metabólizan ante administración a un organismo que requiere producir un metabolito éstos se utilizan para producir un efecto deseado, incluyendo un efecto terapéutico deseado. Además, en modalidades adicionales, son metabolitos activos de aminoácidos polipéptidos no naturalmente codificados. En algunas situaciones, aminoácidos polipéptidos no naturalmente codificados pueden existir como tautoméros . Además, los aminoácidos polipéptidos no naturalmente codificados aquí descritos pueden existir en formas no solvatada así como solvatada con solventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol y semejantes. Las formas solvatadas también se consideran aquí descritas. Aquellos con destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que algunos de los compuestos aquí pueden existir en varias formas tautoméricas. Todas estas formas tautoméricas se consideran como parte de las composiciones aquí descritas. DESCRIPCIÓN DETALLADA J. Introducción Moléculas hGH que comprendan al menos un aminoácidos no natural se proporcionan en la invención. En ciertas modalidades de la invención, el polipéptido hGH con al menos un aminoácido no natural incluye al menos una modificación post-traducción. En una modalidad, la modificación post-traducción como mínimo comprende conexión de una molécula incluyendo pero no limitada a una etiqueta, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietinel glicol, un fotoentrelazador o reticulador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo un fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un DNA, un RNA, un polinucleótido antisentido, un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inibitorio, un biomaterial, una nano partícula, una etiqueta de espín, un floróforo, una porción que contiene metal, una porción radiactiva, un grupo funcional novedoso, un grupo e interactuar covalente o no covalentemente con otras moléculas, una porción foto-enjaulada, una porción de radiación actínica excitable, una porción fotoisomerisable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, una porción que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente escindible, un grupo foto escindible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado a carbono, un agente redox activo, un aminotioácido, una porción toxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimio luminiscente, un grupo denso en electrones, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrones, o una combinación del compuesto o sustancia anterior o cualquier otro compuesto o sustancia conveniente, que comprende un segundo grupo reactivo con cuando menos un aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo se utiliza metodología química que se conoce por una persona con destreza en la técnica que es conveniente para el grupo reactivo particular. En ciertas modalidades del polipéptido hGH modificado de la presente invención, al menos un aminoácidos no natural (incluyendo pero no limitado a aminoácido no natural que contiene un grupo funcional ceto) que comprende al menos una modificación post-traducción, se utiliza en donde la modificación posttraducción como mínimo comprende una porción sacárido. En ciertas modalidades, la modificación post-traducción se realiza in vivo en una célula eucariótica o en una célula no eucariótica. En ciertas modalidades, la proteína incluye cuando menos una modificación post-traducción que se elabora en vivo por una célula anfitriona, en donde la modificación post-traducción normalmente no se elabora por otro tipo de célula anfitriona. En ciertas modalidades, la proteína incluye cuando menos una modificación post-traducción que se elabora in vivo por una célula eucariótica en donde la modificación posttraducción normalmente no se elabora por una célula no eucariótica. Ejemplos de modificaciones post-traducción incluyen pero no están limitados a glicosilación, acetilación, acilación, modificación con lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace glicolípido y semejantes. En una modalidad, la modificación post-traducción comprende conexión de un oligosacárido a una aspargina por un enlace GlcNAc-asparagina (incluyendo pero no limitado a, cuando el oligosacárido comprende (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc y semejantes) . En otra modalidad, la modificación post-traducción comprender conexión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitado a Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o trionina por un enlace GalNAc-serina, un GalNAc-treonina, un GlcNAc-serina, o un GlcNAc-treonina . En ciertas modalidades, una proteína o polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de secreción o localización, una etiqueta epítope, una etiqueta FLAG, una etiqueta polihistidina, una fusión GST, y/o semejantes. Ejemplos de secuencias de señal de secreción incluyen pero no están limitados a una secuencia de señal de secreción procariótica, una secuencia de señal de secreción eucariótica, una secuencia de señal de secreción eucariótica 5 ' -optimizada por expresión bacteriana, una secuencia de señal de secreción novedosa, una secuencia de señal de secreción pectato liasa, una secuencia señal de secreción Omp A y una secuencia de señal de secreción fago. Ejemplo de secuencias de señal de secreción incluyen pero no están limitados a STII (procariótico) , Fd Gilí y M13 (fago) , Bgl2 (levadura) , y la secuencia de señal bla derivada de un transposón.

La proteína o polipéptido de interés puede contener al menos uno, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez o más aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser iguales o diferentes, por ejemplo puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos no naturales diferentes. En ciertas modalidades, al menos uno, pero menos que todos de un aminoácido particular presentes en una versión de origen natural de la proteína se substituye con un amino ácido no natural . La presente invención proporciona métodos y composiciones con base en hormona de crecimiento, en particular hGH, que comprenden cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado. La introducción de al menos con aminoácidos no naturalmente codificado en hGH puede permitir la aplicación de químicas de conjugación que involucran reacciones químicas específicas, incluyendo pero no limitados a, con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados, mientras que no reacciona con los 20 aminoácidos de origen común. En algunas modalidades hGH comprende el aminoácido no naturalmente codificado ésta enlazado o unido a un polímero soluble en agua tal como polietilén glicol (PEG) mediante la cadena lateral del aminoácidos no naturalmente codificado. Esta invención proporciona un método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas con derivados PEG, que involucra la incorporación selectiva de aminoácidos no genéticamente codificados, incluyendo pero no limitados a aquellos aminoácidos que contienen grupos o sustituyentes funcionales que no se encuentran en los 20 aminoácidos incorporados naturalmente, incluyendo pero no limitados a una porción cetona, en proteínas, en respuesta a un codón selector y la modificación subsecuente de aquellos aminoácidos con un derivado PEG convenientemente reactivo. Una vez incorporadas, las cadenas laterales aminoácido pueden entonces ser modificadas al utilizar metodologías de química conocidos por aquellos con destreza en la técnica como convenientes para grupos o sustituyentes funcionales particulares presentes en el aminoácido no naturalmente codificado. Metodologías químicas conocidas de una amplia variedad son adecuadas para utilizar en la presente invención para incorporar un polímero soluble en agua en la proteína. La presente invención proporciona conjugados de polipéptido hGH que tienen una amplia variedad de grupos funcionales, sustituyentes o porciones, con otras sustancias que incluyen pero no están limitadas a una etiqueta; un colorante; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fósforeticulador o entrelazador; un radionúclido; un compuesto citotóxico; una droga; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de foto-afinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal; un cofactor un acido graso; un carbohidrato polinucleótido; un DNA; un RNA; un polinucleótido antisentido; un sacárido; un dendrímero soluble en agua; una cliclodextrina; un ácido ribonucleico inhibitorio; un biomaterial; una nano partícula: una etiqueta de espín; un floróforo; una porción que contiene metal; una porción radiactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas; una porción foto-enjaulada; una porción excitable de radiación actínica; una porción foto-isomerisable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo de escisión química; un grupo foto-escindible; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazado con carbono; un agente redox activo; un aminotioácido; una porción toxica, una porción isotópicamente etiquetada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimio- luminiscente; un grupo denso en electrones; un grupo magnético; un grupo de intercalado; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una pequeña molécula; un punto cuántico; un nanotransmisor; un radionúclido; un radiotransmisor; un agente de captura de neutrones o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia deseable . Está bien establecido en las técnica que PEG puede emplearse para modificar las superficies de biomateriales (ver por ejemplo la patente de los E.U.A 6,610,281; Mehvar, R. , J. Pharm Pharm Sci., 3(1): 125-136 (2000) , que aquí se incorpora por conferencia) . El derivado PEG puede unirse directamente al polímero mediante una porción reactiva. En forma alterna, el derivado PEG puede prepararse al conectar un agente de enlace que tiene una porción reactiva en un extremo con un polímero activado convencional de manera tal que el polímero resultante tiene la porción reactiva en su extremo. En forma alterna, un polímero soluble en agua que tiene al menos una porción nucleofílica o electrofílica activa se somete a una reacción con un agente de enlace, que tiene un grupo reactivo en un extremo, de manera tal que un enlace covalente se forma entre el polímero PEG y el agente de enlace, y el grupo reactivo se ubica en el extremo del polímero. Porciones nucleofílicas y electrofílicas incluyendo aminas, tioles, hidrazidas, hidrazinas, alcoholes, carboxilatos, aldehidos, cetonas, tioésteres y semejantes, se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Los derivados PEG pueden emplearse para modificar las propiedades de superficies y moléculas en donde son importantes la biocompatibilidad, estabilidad, solubilidad y falta de inmunogenisidad, mientras que al mismo tiempo proporcionan un medio más selectivo para conectar los derivados PEG a proteínas que lo previamente conocido la técnica. II. Familia de Súpergenes de Hormona de Crecimiento Las siguientes proteínas incluyen aquellas codificadas por genes de la familia súpergenes de hormona de crecimiento (GH) (Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J. F. Science 257: 410-413 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, O. and Ihle, J. N. , SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)): hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placentario, eritropoyetina (EPO) , trombopoyetina (TOP), interleucina-2 por(IL-2), IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-I 1, IL- 12 (subunidad p35) , IL- 13, IL- 15, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar (CNTF) , factor de inhibición de leucemia (LIF) , alfa interferona, beta interferona, epsilón interferona, gama interferona, omega interferona, tau interferona, factor de estímulos de colonia de granulosito (G-CSF) , factor de estímulo de colonia de granulosito-macrófago (GM-CSF) , factor de estímulos de colonia de macrófago (M-CSF) y cardiotrofina-1 (CT-I) ("las familias de súpergenes GH"). Se anticipa que miembros adicionales de esta familia de genes se identificaran en el futuro a través de clonación y secuenciado de genes. Miembros de la familia de súpergenes GH tienen estructuras secundaria y terciaria similares a pesar del hecho de que en general tienen identidad de secuencia de DNA o aminoácidos limitada. Las características estructurales compartidas permiten que nuevos miembros de la familia de genes se identifiquen fácilmente y los métodos y composiciones de aminoácidos no naturales aquí descritos se apliquen similarmente. Dada la extensión de homología estructural entre los miembros de la familia de súpergenes GH, aminoácidos no naturalmente codificados pueden incorporarse en cualesquiera miembros de la familia de súpergenes GH utilizando la presente invención. Cada miembro de esta familia de proteínas comprende un as de 4 hélices. Estructuras de una cantidad de citosinas, incluyendo G-CSF (Zink et al., FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)), GM-CSF (Diederichs, K. , et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al, J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J. F. and McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992), IL-4 (Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)), y IL-5 (Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)) se han determinado por estudios de difracción de rayos X y RMN y muestran una conservación marcada con la estructura GH, a pesar de una falta de homología de secuencia primaria significante. IFN se considera como un miembro de esta familia con base en modelado y otros estudios (Lee et al., J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4:1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Biol. EPO se considera como un miembro de esta familia con base en estudios de modelado y mutagénesis (Boissel et al., J. Biol. Chem. 268: 15983- 15993 (1993); Wen et al., J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994)). Todas las anteriores citosinas y factores de crecimiento ahora se considera que comprenden una gran familia de genes. Además de compartir estructuras secundarias y terciarias similares, miembros de ésta familia comparten la propiedad de que deben oligomerizar receptores de superficie celular para activar a rutas de señalización intracelular. Algunos miembros de familia GH, incluyendo pero no limitados a: GH y EPO, ligan un solo tipo de receptor y provoca que forme omodímeros . Otros miembros de familia incluyen pero no están limitados para IL-2, IL-4, y IL-6, ligan más de un tipo de receptor y provocan que los receptores formen heterodímeros o agregados de orden superior (Davis et al., (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995)) . Estudios de mutágenesis han mostrado que, como GH, estas otras citosinas y factores de crecimiento contienen sitios de enlace de múltiples receptores, típicamente dos y ligan sus receptores conatos secuencialmente (Mott and Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Nati. Acad. ScL USA 93: 9471-9476). Como GH, los sitios de enlace de receptor primarios para estos otros miembros de familia ocurren primordialmente en las cuatro hélices alfa y el bucle A-B. Los aminoácidos específicos en los ases helicoidales que participan en enlace receptor difieren entre los miembros de la familia. La mayoría de los receptores de superficie celular que interactuaron con miembros de la familia de súpergenes GH están estructuralmente relacionados y comprenden una segunda familia de múltiples genes grande. Vez por ejemplo la patente de los E.U.A número 6,608,183, que se incorpora aquí por referencia. Una conclusión general alcanzada de estudios mutacionales de diversos miembros de la familia de súpergenes GH es que los bucles que unen las hélices alfa generalmente tienden a no estar involucrados en enlaces de receptor. En particular, el bucles B-C corto parece ser no esencial para enlace de receptor en la mayoría sino en todos los miembros de la familia. Por esta razón, el bucle B-C puede estar sustituido con aminoácidos no naturalmente codificados como se describe aquí en miembros de la familia de súpergenes GH. El bucle A-B, el bucle C-D (y el bucle D-E de miembros tipo interferona/ IL-10 de la súper familia GH) también puede estar sustituido con un aminoácido que no es de origen natural . Aminoácidos próximos a la hélice A y distantes a la hélice final también tienden a no estar involucrados en enlace receptor y también pueden ser sitios para introducir aminoácidos que no son de origen natural. En algunas modalidades, un aminoácido no naturalmente codificado se substituye en cualquier posición dentro de una estructura de bucle, incluyendo pero no limitada a los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o más aminoácidos, del bucle A-B, B-C, C-D o D-E. En algunas modalidades, uno o más aminoácido no naturalmente codificados se substituyen dentro de los últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o más aminoácidos, del bucle A-B, B-C, C-D o D-E. Ciertos miembros de la familia GH incluyendo pero no limitados a EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12 p35, IL-13, IL-15 y beta interferona contienen azúcares N-enlazados y/u O-enlazados. Los sitios de glicosilación en las proteínas ocurren casi exclusivamente en las regiones bucle y no en los ases alfa helicoidales. Debido a que las regiones bucle en general no están involucradas en enlace de receptor y debido a que son sitios para la conexión covalente de grupos de azúcar, pueden ser sitios útiles para introducir sustituciones de „aminoácido que no sean de origen natural en las proteínas. Aminoácidos que comprenden los sitios se glicosilación N- y O-enlazados en las proteínas pueden ser sitios para las sustituciones de aminoácidos que no son de origen natural, debido a que estos aminoácidos están expuestos en superficie. Por lo tanto, la proteína natural puede tolerar grupos voluminosos azúcar conectados a las proteínas en estos sitios y los sitios de glicosilación tienden a ser ubicados lejos los sitios de enlace de receptor. Miembros adicionales de la familia de súpergenes GH probablemente se descubrirán en el futuro. Nuevos miembros de la familia de súpergenes GH pueden identificarse a través de análisis de estructura terciaria y secundaria auxiliado por computadora de las secuencias de proteína pronosticadas, y por técnicas de selección diseñadas para identificar moléculas que ligan a un objetivo o diana particular. Miembros de la familia de súpergenes GH típicamente poseen cuatro o cinco hélices antipáticas unidas por aminoácidos no helicoidales (las regiones bucles) . Las proteínas pueden contener una secuencia de señal hidrofóbica en su extremo N para promover secreción de la célula. Estos miembros descubiertos posteriormente de la familia de súpergenes GH también se incluyen en esta invención. Una solicitud relacionada es la solicitud de patente Internacional "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses" publicada como WO 05/074650 en agosto 18, 2005, que se incorpora aquí por referencia. De esta manera, la descripción de hGH se proporciona para propósitos ilustrativos y la manera de ejemplo solamente y no como un límite en el alcance de los métodos composiciones, estrategias y técnicas aquí descritas. Además, referencia a polipéptidos hGH en esta solicitud se pretende para utilizar el término genérico como un ejemplo de cualquier hormona de crecimiento. Esto es, se entiende que las modificaciones y químicas aquí descritas con referencia a polipéptidos hGH o proteína puede ser igualmente aplicadas a cualquier miembro de la familia de súpergenes GH incluyendo aquellos aquí específicamente citados. III. CODONES SELECTORES Codones Selectores de la invención expanden el marco de codones genéticos de la maquinaria biosintética de proteína. Por ejemplo, un codón selector incluye pero no está limitado a, un codón de tres bases único, un codón sin sentido, tal como un codón de parada, incluyendo pero no limitado a, un codón ámbar (UAG) , un codón ocre, o un codón ópalo (UGA) , un codón no natural, un codón de cuatro o más bases, un codón raro o semejantes. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad que hay un amplio rango en el números de codones selectores que puedan introducirse en un gen o polinucleótido deseado, incluyendo pero no limitados a, uno o más, dos o más, tres o más, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un solo polinucleótido que codifica al menos una porción del polipéptido hGH. En una modalidad, los métodos involucran el uso de un codón selector que es un codón de parada para la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales in vivo. Por ejemplo, un O-tRNA se produce que reconoce el codón de parada, incluyendo pero no limitado a UAG, y está aminoacilado por una O-RS, con un aminoácido no natural deseado. Este O-tRNA no se reconoce por las aminoacil-tRNA sintetasas de anfitrión de origen natural. Mutagénesis dirigida por sitio convencional puede utilizarse para introducir el codón de parada, incluyendo pero no limitado a TAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Ver por ejemplo Sayers, J.R., et al. (1988), 5 '-3 ' Exonucleases in phosphorothioate-based oligoniicleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802. Cuando O-RS, O-tRNA y el ácido nucleico que codifica el polipéptidos de interés se combinan in vivo, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar un polipéptido que contiene el aminoácido no natural en la posición especificada . La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo puede realizarse sin perturbación significante de la célula anfitriona eucariótica. Por ejemplo, debido a que la eficiencia de supresión para el codón UAG depende de la competencia entre el O-tRNA, incluyendo pero no limitado al tRNA supresor ámbar, y el factor de liberación eucariótico (incluyendo pero no limitado a eRF) (que liga a un codón de parada e inicia la liberación del péptido de crecimiento del ribosoma) , la eficiencia de supresión puede modularse por, incluyendo pero no limitado a, incrementar el nivel de expresión de O-tRNA, y/o el tR?A supresor. Aminoácidos no naturales también pueden codificarse con codones raros. Por ejemplo, cuando la concentración de arginina en una reacción de síntesis de proteína in vitro se reduce, el codón arginina raro, AGG ha demostrado ser eficiente para inserción de Ala por un tR?A sintético acilado con alanina. Ver por ejemplo Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993). En este caso, el tR?A sintético compite con el tRNAArg de origen natural, que existe como una especie menor en Escherichia coli . Algunos organismos no utilizan todos los codones tripletes. Un codón no asignado AGA en Micrococcus luleus se ha utilizado para inserción de aminoácidos en un extracto de transcripción/traducción in vitro. Ver Kowal and Oliver, ?ucl . Acid. Res., 25:4685 (1997). Componentes de la presente invención puede generarse para utilizar estos codones raros in vivo.

Codones Selectores también comprenden codones extendidos, incluyendo pero no limitados a codones de cuatro, cinco, seis, o más bases. Ejemplos de codones de cuatro bases incluyen pero no están limitados a AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y semejantes. Ejemplos de codones de cinco bases incluyen pero no están limitados a AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y semejantes. Una característica de la invención incluye utilizar codones extendidos con base en supresión desplazamientos de marco de lectura. Codones de cuatro o más bases pueden insertar, incluyendo pero no limitados a uno o múltiples aminoácidos no naturales en la misma proteína. Por ejemplo, en la presencia de O-tRNA mutados, incluyendo pero no limitados a, un tRNAs supresores de desplazamiento de marco de lectura especial, con bucles anti codón, por ejemplo, con al menos bucles anti codón de 8-10 nt , el codón de cuatro o más bases se lee como un solo aminoácido. En otras modalidades, los bucles anticodón pueden descodificar, incluyendo pero no limitados a al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases, o al menos un codón de seis bases o más. Ya que hay 256 codones de cuatro bases posibles, múltiples aminoácidos no naturales pueden ser codificados en la misma célula utilizando un codón de cuatro o más bases. Ver, Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769. Por ejemplo, codones de cuatro bases se han utilizado para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas utilizando métodos biosintéticos in vitro. Ver Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; and Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34. CGGG y AGGU se emplearon para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado NBD de lisina en estreptavidina in vitro con dos tRNAs supresores de desplazamiento de marco de lectura acilados químicamente. Ver, Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:12194. En un estudio en vivo, Moore et al. examinó la capacidad de derivados de tRNALeu con anticodones NCUA para suprimir codones UAGN (N puede ser U, A, G, o C) , y encontró que el UAGA cuádruple puede descodificarse por un tRNALeu con un anticodón UCUA, con una eficiencia de 13 a 26% con poca descodificación en el marco 0 o -1. Ver Moore et al., (2000V J. Mol. Biol., 298:195. En una modalidad, codones extendidos basados en codones raros o codones sin sentido pueden utilizarse en la presente invención, que puede reducir supresión de desplazamiento de marco de lectura y lectura en sentido equivocado o falso en otros sitios indeseados . Para un sistema determinado un codón selector también puede incluir uno de los tres codones base naturales, en donde el sistema endógeno no utiliza (o utiliza raramente) el codón base natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de un tRNA que reconoce el codón de tres bases natural y/o un sistema en donde el codón de tres bases es un codón raro. Codones selectores opcionalmente incluyen pares base no naturales. Estos pares base no naturales además expanden el alfabeto genético existente. Un par base extra incrementa el número de codones triplet de 64 a 125. Propiedades de los terceros pares base incluyen apareamiento base estable selectivo, incorporación enzimática eficiente en D?A con alta fidelidad por una polimerasa y la extensión de cebador continua eficiente después de síntesis del par base no natural naciente. Descripciones de pares base no naturales que pueden adaptarse para métodos y composiciones incluyen por ejemplo, Hirao, et al., (2002). Otras publicaciones relevantes se citan a continuación.

Para uso in vivo, el nucleósido no natural es permeable a membrana y se fosforila para formar el trifosfato correspondiente. Además, la información genética incrementada es estable y no se destruye por enzimas celulares. Esfuerzos previos por Benner y otros aprovecharon los patrones de enlaces de hidrógeno que son diferentes de aquellos en los pares Watson-Crick canónicos, el ejemplo más notable de los cuales es el par iso-C:iso-G. Ver por ejemplo Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc, 111:8322; and Piccirilli et al., (1990) Nature. 343:33; Kool , (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Estas bases en general tienen mal apareamiento en cierto grado con bases naturales y no pueden ser replicadas enzimáticamente. Kool y colaboradores demostraron que las interacciones de empaque hidrofóbico entre bases pueden reemplazar uniones de hidrógeno para dirigir la formación del par base. Ver Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; and Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. En un esfuerzo por desarrollar un par base no natural que satisface todos los requerimientos anteriores, Schuitz, Romesberg y colaboradores han sintetizado y estudiado sistemáticamente una serie de bases hidrofóbicas no naturales. Un auto-par PICS:PICS se encuentra que es mas estable que los pares bases naturales, y puede incorporarse eficientemente en DNA por fragmento Klenow de DNA polimerasa I de Escherichia coli (KF) . Ver McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11585-6; and Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274. Un auto-par 3MN:3MN puede sintetizarse por KF con eficiencia y selectividad suficientes para función biológica. Ver Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803. Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para mayor replicación. Una DNA polimerasa mutante recientemente se ha desarrollado que puede utilizarse para replicar el auto par PICS. Además, un auto par 7AI puede replicarse. Ver por ejemplo See, e.g., Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439. Un par metalobase novedoso, Dipic:Py, también se ha desarrollado, que forma un par estable al ligar Cu (II) . Ver Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:10714. Debido a que codones extendidos y codones no naturales son intrínsecamente ortogonales a codones naturales, los métodos de la invención pueden aprovechar esta propiedad para generar tRNAs ortogonales para ellos. Un sistema de derivación de traducción también puede utilizarse para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido deseado. En un sistema de derivación de traducción, una gran secuencia se incorpora en un gen pero no se traduce en proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como una guía para inducir al ribosoma que salte sobre la secuencia y reanude la traducción corriente debajo de la inserción. En ciertas modalidades, la proteína o polipéptido de interés (o su porción) en los métodos y/o composiciones de la invención se codifica por un ácido nucleico. Típicamente, el ácido nucleico comprende cuando menos un codón selector, al menos dos codones selectores, al menos tres codones selectores, al menos cuatro codones selectores, al menos cinco codones selectores, al menos seis codones selectores, al menos siete codones selectores, al menos ocho codones selectores, al menos nueve codones selectores, diez o más codones selectores. Genes que codifican proteínas o polipéptidos de interés pueden mutagenizarse utilizando métodos bien conocidos por una persona con destreza en la técnica y aquí descritos para incluir por ejemplo uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoácido no natural. Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés se mutageniza para incluir uno o más codones selectores, proporcionando la incorporación de uno o más aminoácido no naturales. La invención incluye cualquier variante semejante, incluyendo pero no limitada a, mutante, versiones de cualquier proteína, por ejemplo incluyendo cuando menos un aminoácido no natural .

Similarmente, la invención también incluye ácidos nucleicos correspondientes, es decir cualquier ácido nucleico con uno o más codones selectores que codifican uno o más aminoácidos no naturales. Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de interés tal como polipéptido HGH pueden mutarse fácilmente para introducir una cisteína en cualquier posición deseada del polipéptido. Cisteína se emplea ampliamente para introducir moléculas reactivas, polímeros solubles en agua, proteínas o una amplia variedad de otras moléculas en una proteína de interés . Métodos adecuados para la incorporación de cisteína en una fusión deseada de un polipéptido se conoce por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, tales como aquellos descritos en la patente de los E.U.A. número 6,608,183, que se incorpora aquí por referencia y técnicas de mutagénesis estándar. IV. Aminoácidos no naturalmente codificados Una muy amplia variedad de aminoácidos no naturalmente codificados son adecuados para utilizar en la presente invención. Cualquier cantidad de aminoácidos no naturalmente codificados puede introducirse en un polipéptido HGH. En general, los aminoácidos no naturalmente codificados introducidos son substancialmente inertes químicamente hacia los 20 aminoácidos genéticamente codificados comunes (es decir alanina, arginina, esparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilananina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina) . En algunas modalidades, los aminoácidos no naturalmente codificados incluyen grupos funcionales de cadena lateral que reaccionan eficiente y selectivamente con grupos funcionales no encontrados en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitados a grupos azido, cetona, aldehido y amino oxi) para formar conjugados estables. La estructura genética de un alfa aminoácido se ilustra como sigue (Formula I) . (I) Un aminoácido no naturalmente codificado típicamente es cualquier estructura que tiene la fórmula anteriormente citada en donde el grupo R es cualquier sustituyente diferente a uno empleado en los 20 aminoácidos naturales y puede ser adecuado para utilizar en la presente invención. Debido a que los aminoácidos no naturalmente codificados de la invención típicamente difieren de los aminoácidos naturales solo en la estructura de la cadena lateral, los aminoácidos no naturalmente codificados forman enlaces amida con otros aminoácidos, incluyendo pero no limitados a, natural o no naturalmente codificados, en la misma forma en la que se forman en los polipéptidos de origen natural. Sin embargo, los aminoácidos no naturalmente codificados tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R opcionalmente comprende un grupo alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno, sulfonilo, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfino, heterocíclico, enona, imina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina, amino o semejantes o cualquier combinación de los mismos. Otros aminoácidos que no son de origen natural de interés, que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitados a aminoácidos que comprenden un entrelazador o reticulador fotoactivable, aminoácidos con etiqueta espín, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de enlace de metal, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos radioactivos, aminoácidos con grupos funcionales novedosos, aminoácidos que interactúan covalente o no covalentemente con otras moléculas, aminoácidos fotoenjaulados y/o fotoisomerizables, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tales como una serina substituida con azúcar, otros aminoácidos modificados con carbohidrato, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprende polietilenglicol o poliéter, aminoácidos substituidos con átomos pesados, aminoácidos de escisión química y/o foto escisión, aminoácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con aminoácidos naturales, incluyendo pero no limitados a poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, incluyendo pero no limitados a más de aproximadamente 5 o más de aproximadamente 10 átomos de carbono, aminoácidos que contienen azúcar enlazada con carbono, aminoácidos redox activos, aminoácidos que contienen aminotioácido y aminoácidos que comprenden una o más porciones tóxicas. Aminoácidos no naturalmente codificados ejemplares que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención y que son útiles para reacciones con polímeros solubles en agua, incluyen pero no están limitados a aquellos con grupos reactivos carbonilo aminooxi, hidracina, hidrazida, semicarbazida, azida y alquino. En algunas modalidades, aminoácidos no naturalmente codificados comprenden una porción sacárido. Ejemplos de estos aminoácidos incluyen N-acetil -L-glucosaminil-L-serina, N-acetil -L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, JV-acetil-L- glucosaminil-L-asparagina y O-mannosaminil-L-serina. Ejemplos de estos aminoácidos también incluyen ejemplos en donde el enlace N u O de origen natural entre el aminoácido y el sacárido se reemplaza por un enlace covalente que no se encuentra comúnmente en la naturaleza- incluyendo pero no limitado a un alqueno, una oxima, un tioéter, una amida y semejantes. Ejemplos de estos aminoácidos también incluyen sacáridos que no se encuentran comúnmente en proteínas de origen natural tales como 2-deoxi-glucosa, 2-deoxigalactosa y semejantes . Muchos de los aminoácidos no naturalmente codificados que aquí se proporcionan están comercialmente disponibles, por ejemplo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Novabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) o Peptech (Burlington, MA, USA). Aquellos que no están comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente como aquí se dispone o utilizando métodos estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Para técnicas de síntesis orgánica, ver por ejemplo Organic Chemistry por Fessendon and Fessendon, (1982, Segunda Edición, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (tercera Edición, 1985, Wiley and Sons, New York) ; y Advanced Organic Chemistry por Carey and Sundberg (tercera Edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Ver también las publicaciones de solicitud de patente de los E.U.A 2003/0082575 y 2003/0108885, que aquí se incorporan por referencia. Además de aminoácidos no naturales que contienen cadenas laterales novedosas, aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para uso en la presente invención también comprenden opcionalmente estructuras principales modificadas, incluyendo pero no limitadas a, como se ilustra por las estructuras de la formula II y III. II III En donde Z típicamente comprende OH, NH2, SH, NH-R1, o S-R'; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes típicamente comprenden S u 0, y R y R', que opcionalmente son iguales o diferentes, típicamente se eligen de la misma lista de constituyentes" para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos no naturales que tienen la fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, aminoácidos no naturales de la invención opcionalmente comprende substituciones en el grupo amino o carbxilo como se ilustra por las fórmulas II y III. Aminoácidos no naturales de este tipo incluyen pero no están limitados a ahidroxiácidos, a tioácidos, aaminotiocarboxilatos incluyendo pero no limitados a, con cadenas laterales que corresponden a los 20 aminoácidos naturales comunes o cadenas laterales no naturales. Además, substituciones en el carbono a opcionalmente incluyen pero no están limitadas a L, D o a - a - y sustituidos aminoácidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico y semejantes. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina así como análogos de prolina con anillo de 3, 4 ,6, 7, 8, y 9 miembros, ß y ? aminoácidos tales como ácido ?-alanina y ? -aminobutírico subsituido. Muchos aminoácidos no naturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y semejantes y son adecuados para utilizar en la presente invención. Análogos de tirosina incluyen pero no están limitados a tirosinas para-substituidas, tirosinas orto-sustituidas y tirosinas meta-sustituidas, en donde la tirosina sustituida comprende, incluyendo pero no limitada a un grupo ceto (incluyendo pero no limitado a un grupo acetilo) un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidracina, una hidroxilamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo de cadena recta o ramificada C6 - C20, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, un grupo alquinilo o semejantes. Además, también se contemplan anillos arilo de substitución múltiple. Análogos glutamina que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitados a derivados a-hidroxi, derivados ? substituidos, derivados cíclicos y derivados de glutamina substituidos con amida. Análogos de fenilalanina ejemplares que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitados a fenilalaninas para-substituidas, fenilalaninas orto-substituidas y fenilalaninas meta substituidas, en donde el substituyente comprende, incluyendo pero no limitado a, un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un grupo aldehido, uno azido, un yodo, un bromo, un zeto (incluyendo pero no limitado a un grupo acetilo) un benzoilo, un grupo alquinilo o semejantes. Ejemplos específicas de aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitados a p-acetil-L- fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una O-4-allil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-0-acetil-GlcNAc ?-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil -L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-iodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, y una p-propargiloxi-fenilalanina, y semejantes. Ejemplos de estructuras de una variedad de aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención se proporcionan por ejemplo en WO 2002/085923, con título "In vivo incorporation of unnatural amino acids.". ver también Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, que se incorpora aquí por referencia para adicionales análogos de metionina. En una modalidad, composiciones de un polipéptido HGH que incluyen un aminoácido no natural (tal como p- (propargiloxi) -fenialanina) se proporciona.

Diversas composiciones que comprenden p- (propargiloxi) -fenialanina e incluyen pero no están limitadas a proteínas y/o células, también se proporcionan. En un aspecto, una composición que incluye el aminoácido no natural p- (propargiloxi) -fenialanina además incluye un tRNA ortogonal. El aminoácido no natural puede unirse (incluyendo pero no limitado a covalentemente) al tRNA ortogonal, incluyendo pero no limitado a, unido covalentemente al tRNA ortogonal a través de un enlace aminoacilo, unido covalentemente a un 3 ' OH o un 2 ' OH de un azúcar ribosa terminal del tR?A ortogonal, etc. Las porciones químicas mediante aminoácidos no naturales que pueden incorporarse en proteínas, ofrecen una variedad de ventajas y manipulaciones de la proteína. Por ejemplo, la reactividad única de un grupo funcional ceto permite modificación selectiva de proteínas con cualquiera de una cantidad de reactivos que contienen hidrazina o hidroxilamina in vitro e in vivo. Un aminoácido no natural con átomo pesado por ejemplo puede ser útil para puesta en fase de datos de estructura de rayos X. La introducción específica de sitio de átomos pesados utilizando aminoácidos no naturales también proporciona selectividad y flexibilidad para seleccionar posiciones para átomos pesados. Aminoácidos no naturales fotoreactivos (incluyendo pero no limitados a aminoácidos con cadenas laterales benzofenona y arilazidas (incluyendo pero no limitados a fenilazida) ) , por ejemplo permiten fotoreticulación o fotoentrelazamiento in vivo e in vitro de proteína. Ejemplos de aminoácidos no naturales fotoreactivos incluyen pero no están limitados a p-azido-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina. La proteína con los aminoácidos no naturales fotoreactivos puede ser entonces reticulada o entrelazada a voluntad por excitación del control temporal que proporciona el grupo reactivo. En un ejemplo, el grupo metilo de un amino no natural puede ser sustituido con un grupo isotópicamente etiquetado, incluyendo pero no limitado a metilo, como una sonda de estructura y dinámica local, incluyendo pero no limitado a, con el uso de resonancia magnética nuclear y espectroscopia de vibración. Grupos funcionales alquinilo o azido por ejemplo permiten la modificación selectiva de proteínas con moléculas a través de una reacción de cicloadición [3+2] . Un aminoácido no natural incorporado en un polipéptido en el extremo amino, puede estar compuesto de un grupo R que es cualquier sustituyente diferente a aquel empleado en los aminoácidos naturales y un segundo grupo reactivo diferente del grupo NH2 normalmente presente en a -aminoácidos (ver Fórmula I). Un aminoácido no natural similar puede ser incorporado en el extremo carboxilo con un segundo grupo reactivo diferente del grupo COOH normalmente presente en -aminoácidos (ver Fórmula I) .

Los aminoácidos no naturales de la invención pueden seleccionarse o diseñarse para proporcionar características adicionales no disponibles en los 20 aminoácidos naturales. Por ejemplo, aminoácido no natural puede ser diseñado o selecto opcionalmente para modificar las propiedades biológicas de una proteína, por ejemplo en la cual se incorporan. Por ejemplo, las siguientes propiedades pueden ser modificadas opcionalmente por inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, solubilidad, estabilidad, por ejemplo térmica, hidrolítica, oxidativa, resistencia a degradación enzimática y semejantes. Facilidad de purificación y procesamiento, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, actividad catalítica, potencial redox, vida media, habilidad para reaccionar con otras moléculas, por ejemplo en forma covalente o no covalente, y semejantes. La solicitud de patente de los E.U.A. número de serie 11/046,432, que se incorpora aquí por referencia, discute una cantidad de diferentes aminoácidos no naturalmente codificados . SÍNTESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Muchos de los aminoácidos no naturales adecuados para utilizar en la presente invención están comercialmente disponibles, por ejemplo de Sigma (USA) o Aldrich (Milwaukee, Wl, USA). Aquellos que no están comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente como se proporciona aquí o como se proporciona en diversas publicaciones o utilizando métodos estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Para técnicas de síntesis orgánica, ver por ejemplo Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Segunda Edición, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edición, 1985, Wiley and Sons, New York) ; y Advanced Organic Chemistry por Carey and Sundberg (Tercera Edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Publicaciones adicionales que describen la síntesis de aminoácidos no naturales incluyen por ejemplo WO 2002/085923 con título "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem. , 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of ?-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates . J . Chem. Soc. 3315-3319; Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti -Tumor Agents . J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [ [4 - (diethyla ino) -1 -methylbutyl] amino] quinoline (Chloroquine) . J . Org .

Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M. , Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Ant imalar i ais, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4 -Substi tuted Prolines as Conformationally Constrained Aminoácido Analogues . J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Puré Pipecolates from L-Asparagine . Application to the Total Synthesis of (+) -Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Minium Ion Cyclization . J. Org. Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alpha -Amino-Acids and Deriva tives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D- alpha- Amino -Adipic Acids, L -alpha -aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives . Tetrahedron 43:4297-4308; y, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues : synthesis ofbeta -heterocyclic 2 -aminopropanoic acid derivatives and their activi ty at a novel quisqualate-sensi tized si te . J. Med. Chem. 35:4602-7. Ver también la publicación de patente de los E.U.A. número 2004/0198637 con título "Protein Arrays" que aquí se incorpora por referencia. Por ejemplo, la síntesis de p-acetil- (+/-) -fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se describe por Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), que se incorpora aquí por referencia. Otros aminoácidos que contienen carbonilo pueden ser preparados en forma similar por una persona con destreza ordinaria en la técnica. La funcionalidad carbonilo puede reaccionarse selectivamente con un reactivo que contiene hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, o semicarbazida bajo condiciones ligeras en solución acuosa para formar los correspondientes enlace hidrazona, oxima o semicarbazona, respectivamente que son estables bajo condiciones fisiológicas. Ver por ejemplo Jencks, W. P., J. Am . Chem . Soc . 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tam, J. P., J. Am . Chem . Soc . 117:3893-3899 (1995). Aún más, la reactividad única del grupo carbonilo permite una modificación selectiva en la presencia de las otras cadenas laterales de aminoácido. Ver por ejemplo Cornish, V. W., et al . , J. Am . Chem . Soc . 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconj ug. Chem . 3: 138- 146 (1992); Mahal , L. K. , et al , Science 276:1125-1128 (1997). BIOSÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Muchas rutas biosintéticas ya existen en células para la producción de aminoácidos y otros compuestos. Mientras que un método biosintético para un aminoácido no natural particular puede no existir en la naturaleza, incluyendo pero no limitado a, en una célula, la invención proporciona estos métodos. Por ejemplo, rutas biosintéticas para aminoácidos no naturales se generan opcionalmente en la célula anfitriona al agregar nuevas enzimas o modificar rutas de células anfitrionas existentes. Adicionales nuevas enzimas son enzimas de origen natural opcionalmente o enzimas de evolución artificial. Por ejemplo, la biosíntesis de p-aminofenilalanina (como se presenta en un ejemplo en WO 2002/085923 con título "In vivo incorporation of unnatural amino acids") se basa en la adición de una combinación de enzimas conocidas de otros organismos. Los genes para estas enzimas pueden introducirse en una célula eucariótica al transformar la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la célula, proporcionan una ruta enzimática para sintetizar el compuesto deseado. Ejemplos de los tipos de enzimas que se agregan opcionalmente, se proporcionan en los siguientes ejemplos. Se encuentran secuencias de enzimas adicionales por ejemplo en Genbank. Enzimas de evolución artificial también se agregan opcionalmente en una célula en la misma forma. De esta manera, la maquinaria celular y los recursos de una célula se manipulan para producir aminoácidos no naturales . Una variedad de métodos están disponibles para producir enzimas novedosas para utilizar en rutas biosintéticas o para evolución de rutas existentes. Por ejemplo, recombinación recursiva, incluyendo pero no limitada a, como se desarrolla por Maxygen, Inc. (disponible en la red mundial en maxygen.com), se emplea opcionalmente para desarrollar novedosas enzimas y rutas. Ver por ejemplo Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vi tro by DNA shuffling, Nature 370(4) : 389-391; y, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vi tro recombination for molecular evolution, Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. similarmente, DesignPathMR, desarrollado por Genencor (disponible en la red mundial en genencor.com) se emplea opcionalmente para ingeniería de ruta metabólica, incluyendo pero no limitado a ingeniería de una ruta para crear 0-metil-L-tirosina en una célula. Esta tecnología reconstruye rutas existentes en organismos anfitriones utilizando una combinación de nuevos genes, incluyendo pero no limitado a, identificar a través de genómica funcional, y evolución y diseño molecular. Diversa Corporation (disponible en la red mundial en diversa.com) también proporciona tecnología para rápida supervisión o criba de bibliotecas de genes y rutas de genes, incluyendo pero no limitadas a crear nuevas rutas. Típicamente, el aminoácido no natural producido con una ruta biosintética de ingeniería de la invención se produce en una concentración suficiente para biosíntesis de proteína eficiente, incluyendo pero no limitado a una cantidad celular natural, pero no a un grado tal que afecte la concentración de los otros aminoácidos o agote los recursos celulares. Concentraciones típicas producidas in vivo de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 M. Una vez que una célula se transforma con un plásmido que comprende los genes empleados para producir enzimas deseadas para una ruta específica y se genera un aminoácido no natural, selecciones in vivo se emplean opcionalmente para optimizar más la producción del aminoácido no natural tanto para síntesis de proteína ribosomal como crecimiento celular. ABSORCIÓN CELULAR DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Absorción de aminoácidos no natural por una célula es un aspecto que típicamente se considera al diseñar y seleccionar aminoácidos no naturales, incluyendo pero no limitados a, para incorporar en una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de -aminoácidos sugiere que estos compuestos sea poco probable que sean permeables a células. Aminoácidos naturales son absorbidos en la célula eucariótica mediante una conexión de sistemas de transporte basados en proteína. Un cribado o supervisión rápida puede realizarse que estima que aminoácidos no naturales de haber son absorbidos por las células. Ver por ejemplo los ensayos de toxicidad en ver por ejemplo en la Publicación de Patentes de los E.U.A. Número 2004/0198637 con título "Protein Arrays", que se incorpora aquí por referencia; y Liu, D.R. & Schuitz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism wi th, an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Aunque la absorción se analiza fácilmente con diversos ensayos, una alternativa a diseñar aminoácidos no naturales que so susceptibles a rutas de absorción celular es proporcionar rutas biosintéticas para crear aminoácidos in vivo . V. POLIPÉPTIDOS CON AMINOÁCIDOS NO NATURALES La incorporación de un aminoácido no natural puede realizarse para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitado a, ajustar a la medida cambios en estructura y/o función de proteína, cambiar tamaño, acidez, nucleofilicidad, enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad, accesibilidad de sitios diana de proteasa, hacer diana en una porción (incluyendo pero no limitado a, arreglo de proteínas) , agregar una molécula biológicamente activa, conectar un polímero, conectar un radionúclido, modular vida media en suero, modular penetración de tejido (por ejemplo tumores), modular transporte activo, modular especificidad o distribución de tejido célula u órgano, modular inmunogenicidad, modular resistencia a proteasa, etc. Proteínas que incluyen un aminoácido no natural pueden tener propiedades mejoradas o incluso totalmente nuevas catalíticas o biofísicas. Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente por inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, habilidad catalítica, vida media (incluyendo pero no limitado a, vida media en suero) , habilidad para reaccionar con otras moléculas, incluyendo pero no limitado a covalentemente y no covalentemente, y semejantes. Las composiciones, incluyendo proteínas que incluyen al menos un aminoácido no natural son útiles para, incluyendo pero no limitado a, agentes terapéuticos novedosos, de diagnóstico, enzimas catalíticas, enzimas industriales, proteínas de enlace (incluyendo pero no limitadas a anticuerpos) , incluyendo pero no limitados a el estudio de estructura y función de proteína, ver por ejemplo Dougherty, (2000) Unnatural Aminoácidos as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652. En un aspecto de la invención, una composición incluye cuando menos una proteína con al menos uno, incluyendo pero no limitado a, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez o más aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser iguales o diferentes, incluyendo pero no limitados a, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más aminoácidos no naturales diferentes. En otro aspecto, una composición incluye una proteína con al menos uno, pero menos que todo de un aminoácido particular presente en la proteína está sustituido con el aminoácido no natural . Para una proteína determinada con más de un aminoácido no natural, los aminoácidos no naturales pueden ser idénticos o diferentes (incluyendo pero no limitados a, la proteína puede incluir dos o más diferentes tipos de aminoácidos no naturales, puede incluir dos del mismo aminoácido no natural) . Para una proteína determinada con más de dos aminoácidos no naturales, los aminoácidos no naturales pueden ser iguales, diferentes o una combinación de múltiples aminoácidos no naturales del mismo tipo con al menos un aminoácido no natural diferente . Proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural son una característica de la invención. La invención también incluye polipéptidos o proteínas con al menos un aminoácido no natural producido utilizando las composiciones y métodos de la invención. Un excipiente (incluyendo pero no limitado a, un excipiente farmacéuticamente aceptable) también puede estar presente con la proteína. Al producir proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural en células eucarióticas, proteínas o polipéptidos típicamente incluirán modificaciones post-traducción eucarióticas. En ciertas modalidades, una proteína incluye cuando menos un aminoácido no natural y al menos una modificación post-traducción que se realiza in vivo por una célula eucariótica, en donde la modificación post-traducción no se realiza por una célula procariótica. Por ejemplo, la modificación post-traducción incluye, incluyendo pero no limitado a, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace glicolípido, glicosilación y semejantes. En un aspecto, la modificación post-traducción incluye conexión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitado a, (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc) ) con una asparagina mediante un enlace GlcNAc-asparagina. Ver Tqabla I que cita algunos ejemplos de oligosacáridos N-enlazados de proteínas eucarióticas (residuos adicionales también pueden estar presentes, que no se muestran) . En otro aspecto, la modificación post-traducción incluye enlace de un oligosacárido (incluyendo pero no limitado a, Gal- GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o trionina por un enlace GalNAc-serina o GalNAc-treonina, o un enlace GlcNAc-serina o GlcNAc-treonina . Tabla 1: Ejemplos de oligosacáridos a través de enlace GLCNAC Todavía en otro aspecto, la modificación posttraducción incluye procesamiento proteolítico de precursores, armado en una proteína de multiples- subunidades o montaje macromolecular, traducción a otro sitio en la célula (incluyendo pero no limitado a organelos, tales como el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, el núcleo, lisosomas, peroxisomas, mitocondrios, cloroplastos, vacuolas, etc., o a través de la ruta secretoria) . En ciertas modalidades, la proteína comprende una secuencia de secreción o localización, una etiqueta epítope, una bandera FLAG, una etiqueta polihistidina, una fusión GST, o semejantes. Las patentes de los E.U.A. Nos. 4,963,495 y 6,436,674, que se incorporan aquí por referencia, detallan construcciones diseñadas para mejorar secreción de polipéptidos hGH. Una ventaja de un aminoácido no natural es que presenta porciones químicas adicionales que pueden emplearse para agregar moléculas adicionales. Estas modificaciones pueden realizarse in vivo en una célula eucariótica o no eucariótica, o in vi tro . De esta manera, en ciertas modalidades, la modificación post-traducción es a través del aminoácido no natural . Por ejemplo, la modificación post-traducción puede ser a través de una reacción nucleofílica-electrofílica . La mayoría de las reacciones actualmente empleadas para la modificación selectiva de proteínas, involucran formación de enlace covalente entre patrones de reacción nucleofílicos y electrofílicos, incluyendo pero no limitados a la reacción de a -halocetonas con cadenas laterales histidina o cisteína. La selectividad en estos casos se determina por el número y accesibilidad de los residuos nucleofílicos en la proteína. En proteínas de la invención, otras reacciones más selectivas pueden emplearse tales como la reacción del ceto aminoácido no natural con hidrazidas o compuestos aminooxi, in vi tro e in vivo . Ver, por ejemplo, Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal , et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026- 9027; Chin, et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sd., 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Nati. Acad. Sd.. 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry. 42:6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science. 301:964-7, todos los cuales aquí se incorporan por referencia. Esto permite el etiquetado selectivo virtualmente de cualquier proteína con un grupo de reactivos incluyendo fluoróforos, agentes de reticulación o entrelazamiento, derivados sacárido y moléculas citotóxicas. Ver también, la patente de los E.U.A. No. 6,927,042 con título "Glycoprotein Synthesis", que aquí se incorpora por referencia. Modificaciones post-traducción, incluyendo pero no limitadas a, a través de un azido aminoácido, también pueden realizarse a través de la ligación Staudinger (incluyendo pero no limitado a, con reactivos triarilfosfina) . Ver, por ejemplo, Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24. Esta invención proporciona otro método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas, que involucra la incorporación genética de aminoácidos no naturales. Una molécula que puede agregarse a una proteína incluye, pero no está limitada a, colorantes, fluoróforos, agentes de entrelazamiento, derivados sacárido, polímeros (incluyendo pero no limitados a, derivados de polietilen glicol) , fotoentrelazadores o reticuladores, compuestos citotóxicos, etiquetas de afinidad, derivados de biotina, resinas, perlas, una segunda proteína o polipéptido (o más), polinucleótido (s) (incluyendo pero no limitados a, DNA, RNA, etc.), quemadores de metal, cofactores, ácidos grasos, carbohidratos, y semejantes. En una modalidad, el método además incluye incorporar en la proteína el aminoácido no natural, en donde el aminoácido no natural comprende un primer grupo reactivo; y contactar la proteína con una molécula (incluyendo pero no limitado a una etiqueta, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietinel glicol, un fotoentrelazador o reticulador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo un fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un DNA, un RNA, un polinucleótido antisentido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inibitorio, un biomaterial, una nano partícula, una etiqueta de espín, un floróforo, una porción que contiene metal, una porción radiactiva, un grupo funcional novedoso, un grupo e interactuar covalente o no covalentemente con otras moléculas, una porción foto-enjaulada, una porción de radiación actínica excitable, una porción fotoisomerisable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, una porción que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente escindible, un grupo foto escindible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado a carbono, un agente redox activo, un aminotioácido, una porción toxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimio luminiscente, un grupo denso en electrones, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrones, o cualquier combinación de los anteriores, o cualquier otro compuesto o sustancia conveniente) , que comprende un segundo grupo reactivo . VI. Generación in vivo de polipéptidos hGH que comprenden aminoácidos no-genéticamente codificados . Los polipéptidos hGH de la invención pueden generarse in vivo utilizando tRNA y tRNA sintetasas modificadas para agregar a o substituir aminoácidos que no se codifican en sistemas de origen natural . Métodos para generar tRNAs y tRNA sintetasas que utilizan aminoácidos que no están codificados en sistemas de origen natural, se describen por ejemplo en las publicaciones de solicitudes de patente de los E.U.A. Nos. 2003/0082575 (No. de Serie 10/126,927) y 2003/0108885 (No. de Serie 10/126,931) que aquí se incorporan por referencia. Estos métodos involucran generar una maquinaria de traducción que funciona independientemente de las sintetasas y tRNAs endógenas al sistema de traducción (y por lo tanto en ocasiones se refieren como "ortogonales"). Típicamente, el sistema de traducción comprende un tR?A ortogonal (O-tRNA) o una aminoacil tR?A sintetasa ortogonal (O-RS) . Típicamente, la O-RS de preferencia aminoacila el O-tRNA con al menos un aminoácido que no es de origen natural y en el sistema de traducción y la O-tRNA reconoce al menos un codón selector, que no se reconoce por otros tRNAs en el sistema. El sistema de traducción de esta manera inserta el aminoácido no-naturalmente-codificado en una proteína producido en el sistema, en respuesta a un codón selector codificado, de esta manera "substituyendo" un aminoácido en una posición en el polipéptido codificado. Una amplia variedad de tRNAs ortogonales y aminoacil tRNA sintetasas se ha descrito en la técnica para insertar aminoácidos sintéticos particulares en polipéptidos, y en general son adecuados para utilizar en la presente invención. Por ejemplo, O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetasas ceto-específicas se describen en Wang, L., et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) and Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22): 6735 -6746 (2003). Ejemplares O-RS, o sus porciones, se codifican por secuencias polinucleótido e incluyen secuencias aminoácido descritas en las publicaciones de patente de las E.U.A. Nos. 2003/0082575 y 2003/0108885, cada una incorporada aquí por referencia. Correspondientes moléculas O-tRNA para utilizar con las O-RSs también se describen en las publicaciones de solicitud de patente de los E.U.A. ?o. 2003/0082575 (?o. de Serie 10/126,927) y 2003/0108885 (?o. de Serie 10/126,931) que aquí se incorporan por referencia.

Un ejemplo de un sistema O- tRNA/aminoacil -tRNA sintetasa específico de azida se describe en Chin, T. W. , et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Secuencias O-RS ejemplares para p-azido-L-Phe incluyen pero no están limitadas a secuencias nucleótido SEQ ID ?Os: 14-16 y 29-32 y secuencias aminoácido SEQ ID ?Os : 46-48 y 61-64 como se describe en la publicación de solicitud de patente de los E.U.A. ?o. 2003/0108885 (?o. de Serie 10/126,931) que se incorpora aquí por referencia. Secuencias O-tRNA ejemplares adecuadas para utilizar en la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, secuencias nucleótido SEQ ID ?Os: 1-3 como se describe en la publicación de solicitud de patente de los E.U.A. ?o. 2003/0108885 (?o. de Serie 10/126,931) que se incorpora aquí por referencia. Otros ejemplos de pares O-tR?A/aminoacil-tR?A sintetasa específicos a aminoácidos no naturalmente codificados particulares se describen en la publicación de solicitud de patente de los E.U.A. ?o. 2003/0082575 (?o . de Serie 10/126,927) que se incorpora aquí por referencia. O-RS y O-tR?A que incorporan tanto aminoácidos que contienen ceto como azida en S . cerevi siae se describen en Chin, J. W. , et al, Science 301:964-967 (2003). Diversos otros pares ortogonales se han reportado. Glutaminilo (ver, e.g., Liu, D., and Schuitz, P. G. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 96:4780-4785), aspartilo (ver, e.g., Pastrnak, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286), y tirosilo (ver, e.g., Ohno, S., et al., (1"998) J. Biochem. (Tokyo. Jpn? 124:1065-1068; y, Kowal , A. K. , et al., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273) sistemas derivados de tRNA de S . cerevisiae y sintetasas se han descrito para la incorporación potencial de aminoácidos no naturales en E. coli . Sistemas derivados de glutaminilo E. coli (ver , por ejemplo, Kowal , A. K. , et al., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273) y tirosilo (ver, por ejemplo, Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641) sintetasas se han descrito para utilizar en S . cerevisiae . El sistema tirosil de E. coli se ha empleado para la incorporación de 3 -yodo-L-tirosina in vivo, en células de mamífero. Ver, Sakamoto, K. , et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699. El uso de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetasas involucra selección de un codón específico que codifica el aminoácido no-naturalmente codificado. Mientras que cualquier codón puede utilizarse, en general es conveniente el seleccionar un codón que es rara o nunca usado en la célula en donde se expresa la O-tRNA/aminoacil -tRNA sintetasa. Por ejemplo, codones ejemplares incluyen codón sin sentido tales como codones de parada (ámbar, ocre y ópalo) , codones de cuatro o más bases y otros codones de tres bases naturales que son raramente o no usados . Codón (s) selectores específicos pueden introducirse en posiciones apropiadas en la secuencia de codificación de polinucleótido hGH utilizando métodos de mutagénesis conocidos en la especialidad (incluyendo pero no limitados a, mutagénesis específica de sitio, mutagénes de cassette, mutagénesis de selección de restricción, etc.). Métodos para generar componentes de la maquinaria biosintética de proteína, tales como O-RSs, OtRNAs, y pares O-tRNA/O-RS ortogonales que pueden emplearse para incorporar un aminoácido no naturalmente codificado, se describen en Wang, L., et al, Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003) . Métodos y composiciones para la incorporación in vivo de aminoácidos no-naturalmente codificados, se describen en la publicación de solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0082575 (No. de Serie 10/126,927) que se incorpora aquí por referencia. Métodos para seleccionar un par ortogonal tRNA-iRNA sintetasa para utilizar en el sistema de traducción in vivo de un organismo también se describen en las publicaciones de solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0082575 (No. de Serie 10/126,927) y 2003/0108885 (No. de Serie 10/126,931) que aquí se incorporan por referencia. La Publicación PCT No. WO 04/035743 con título "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins", que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, describe pares RS y tRNA ortogonales para la incorporación de ceto aminoácidos. La Publicación PCT ?o. WO 04/094593 con título "Expanding the Eukaryotic Genetic Code", que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, describe pares RS y tRNA ortogonales para la incorporación de aminoácidos no naturalmente codificados en células anfitrionas eucarióticas. Métodos para producir al menos una aminoacil -tRNA sintetasa ortogonal recombinante (ORS) comprenden: (a) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutante) derivada de al menos una aminoacil -tR?A sintetasa (RS) de un primer organismo, incluyendo pero no limitados a, un organismo procariótico, tal como Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A . fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilics , o semejantes, o un organismo eucariótico; (b) seleccionar (y/o cribar) la biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para miembros que aminoacilan un tRNA ortogonal (O-tRNA) en la presencia de un aminoácido no-naturalmente codificado y un aminoácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs activos (opcionalmente mutantes) ; y/o, (c) seleccionar (opcionalmente a través de selección negativa) el conjunto de RSs activos (incluyendo pero no limitado a RSs mutante) que de preferencia aminoacilan en O-tRNA en la ausencia del aminoácido no-naturalmente codificado, de esta manera proporcionando la O-RS recombinante como mínimo; en donde la O-RS recombinante como mínimo de preferencia aminoacila el O-tRNA con el aminoácido no-naturalmente codificado. En una modalidad, el RS es un RS inactivo. El RS inactivo puede generarse al mutar un RS activo. Por ejemplo, el RS inactivo puede generarse al mutar al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 10 o más aminoácidos a diferencia aminoácidos, incluyendo pero no limitado a alanina. Bibliotecas de RSs mutantes pueden generarse utilizando diversas técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo pero no limitadas a diseño racional con base en estructura RS tri-dimensional de proteína, o mutagénesis de nucleótidos RS en una técnica de diseño al azar o racional. Por ejemplo, los RSs mutantes pueden generarse por mutaciones específicas de sitio, mutaciones al azar, mutaciones de recombinación que genera diversidad, construcciones quiméricas, diseño racional y por otros métodos descritos aquí o conocidos en la especialidad. En una modalidad, la selección (y/o cribado) de la biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) para miembros que son activos, incluyendo pero no limitados a, que aminoacilan un tRNA ortogonal (O-tR?A) en la presencia de un aminoácido no-naturalmente codificado y un aminoácido natural, incluyen: introducir un marcador de cribado o selección positiva, incluyendo pero no limitado a un gen de resistencia antibiótico o semejante, y la biblioteca de RSs (opcionalmente mutante) en una pluralidad de células, en donde el marcador de cribado y/o selección positiva comprende al menos un codón selector, incluyendo pero no limitado a, un codón ámbar, ocre u ópalo; desarrollar la pluralidad de células en la presencia de un agente de selección; identificar células que sobreviven (o muestran una respuesta específica) en la presencia del agente de selección y/o cribado al suprimir el codón selector como mínimo en el marcador de cribado o selección positiva, de esta manera proporcionando un sub-conjunto de células selectas en forma positiva que contienen el conjunto de RSs activos (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, puede variarse la concentración de agente de cribado y/o selección. En un aspecto, el marcador de selección positiva es un gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y el codón selector es un codón de parada ámbar en el gen CAT. Opcionalmente, el marcador de selección positiva es un gen mlactamasa, y el codón selector es un codón de parada ámbar en el gen ?-lactamasa. En otro aspecto, el marcador de cribado positivo comprende un marcador de cribado fluorescente o luminescente en un marcador de cribado basado en afinidad (incluyendo pero no limitado a un marcador de superficie celular) . En una modalidad, la criba o selección negativa del conjunto para RSs activos (opcionalmente mutantes) que presencia aminoacilan el O-tRNA en la ausencia del aminoácido no naturalmente codificado, incluye: introducir un marcador de criba o selección negativa con el conjunto de RSs activos (opcionalmente mutantes) de la selección o criba positiva en una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el marcador de criba o selección negativa comprende al menos un codón selector (incluyendo pero no limitado) a un gen de resistencia a antibióticos, incluyendo pero no limitado a un gen clorafenicol acetiltransferasa (CAT) ; e identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de criba específica en un primer medio suplementado con el aminoácido no naturalmente codificado y un agente de criba o selección, pero que fallan en sobrevivir o mostrar la respuesta específica en un segundo medio no suplementado con el aminoácido no naturalmente codificado y el agente de selección no criba, de esta manera proporcionando células supervivientes o células cribadas con la O-RS recombinante como mínimo. Por ejemplo, un protocolo con identificación CAT opcionalmente actúa como una criba negativa y/o selección positiva en determinación de recombinantes O-RS apropiadas. Por ejemplo, un conjunto de ciónos opcionalmente replicados en placas de crecimiento que contienen CAT (que comprende al menos un codón selector) ya sea con o sin uno o más aminoácidos no naturalmente codificados. Colonias que crecen exclusivamente en las placas que contienen los aminoácidos no naturalmente codificados de esta manera se consideran como que contienen O-RS recombinantes. En un aspecto, la concentración del agente de selección (y/o cribado) se varía. En algunos aspectos, el primer y segundo organismo son diferentes. De esta manera, el primer y/o segundo organismo opcionalmente comprende: un procariota, un eucariota, un mamífero, una Escherichia coli , un hongo, una levadura, un arquibacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un protista, etc. En otras modalidades, el marcador de criba comprende un marcador de criba luminiscente o fluorescente o un marcador de criba basado en afinidad. En otra modalidad, la criba o selección (incluyendo pero no limitada a, selección negativa) del conjunto para RSs activos (opcionalmente mutantes) incluye: aislar el conjunto de RSs de mutantes activos de la etapa de selección positiva RSs; introducir un marcador de criba o selección negativa, en donde el marcador de criba o selección negativa comprende al menos un codón selector (incluyendo pero no limitado a, un gen marcador tóxico, incluyendo pero no limitado a un gen ribunuclease barnaza, que comprende al menos un codón selector) , y el conjunto de RSs activos (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células de un segundo organismo; e identificar células que sobrevivan o muestran una respuesta de criba específica en un primer medio no suplementado con el aminoácido no naturalmente codificado, pero que fallan en sobrevivir o mostrar una respuesta de criba específica en un segundo medio suplementado con el aminoácido no naturalmente codificado, y de esta manera proporcionar a las células supervivientes o cribadas con al menos una O-RS recombinante, en donde la O-RS recombinante como mínimo es específica para el aminoácido no naturalmente codificado. En un aspecto, el codón selector como mínimo comprende aproximadamente dos o más codones selectores. Estas modalidades opcionalmente pueden incluir en donde el codón selector como mínimo comprende dos o más codones selectores y en donde el primer y segundo organismo son diferentes (incluyendo pero no limitados a cada organismo es opcionalmente, incluyendo pero no limitado a un procariota, un eucariota, un mamífero, una Escherichia coli , un hongo, una levadura, una arquibacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un protista, etc.) . También, algunos aspectos incluyen en donde el marcador de selección negativa comprende un gen ribunucleasa barnaza (que comprende al menos un codón selector) . Otros aspectos incluyen en donde el marcador de criba opcionalmente comprende un marcador de criba fluorescente o luminiscente o un marcador de criba basado en afinidad. En las modalidades presentes, las cribas y/o selecciones opcionalmente incluyen variación de la severidad de criba y/o selección. En una modalidad, los métodos para producir la aminoacil -tRNA sintetasa ortogonal recombinante (O-RS) además pueden comprender: (d) aislar la O-RS recombinante como mínimo; (e) generar un segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutadas) derivadas de la O-RS recombinante como mínimo; y, (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta una O-RS mutada se obtiene que comprende una habilidad para aminoacilar de preferencia el O-tRNA . Opcionalmente, se repiten las etapas (d) - (f) incluyendo pero no limitado a cuando menos aproximadamente dos veces. En un aspecto, el segundo conjunto de O-RS mutadas derivadas de al menos una O-RS recombinante puede generarse por mutagénesis, incluyendo pero no limitado a mutagénesis al azar, mutagénesis específica de sitio, recombinación o una combinación de las mismas. La severidad de las etapas de selección/criba incluyendo pero no limitadas a, la etapa de criba/selección positiva (b) , la etapa de criba/selección negativa (c) o ambas etapas de criba/selección positiva y negativa (b) y (c) , en los métodos anteriormente descritos, opcionalmente incluye variar la severidad de selección/criba. En otra modalidad, la etapa de criba/selección positiva (b) , la etapa de criba/selección negativa (c) o ambas etapas de criba/selección positiva y negativa (b) y (c) comprenden utilizar un reportero, en donde el reportero se detecta por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS= fluorescence-activated cell sorting) o en donde el reportero se detecta por luminiscencia. Opcionalmente, el reportero se exhibe en una superficie celular, o en una exhibición fago o semejantes, y selecciona con base en afinidad o actividad catalítica que involucra el aminoácido no naturalmente codificado o un análogo. En una modalidad, la sintetasa mutada se exhibe en una superficie celular o en una exhibición fago o semejantes. Métodos para producir una tRNA ortogonal recombinante (O-tRNA) incluyen: (a) generar una biblioteca de tRNAs mutantes derivadas de al menos un tRNA, incluyendo pero no limitado a un tRNA supresor, de un primer organismo; (b) seleccionar (incluyendo pero no limitado a, selección negativa) o criba de la biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por una aminoacil -tRNA sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de una RS de primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de tR?As (opcionalmente mutantes) ; y, (c) seleccionar o cribar el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal introducida RS (O-RS) , de esta manera proporcionando cuando menos un 0-tR?A recombinante; en donde el O-tR?A recombinante como mínimo reconoce un codón selector y no se reconoce en eficiencia por la RS del segundo organismo y de preferencia se aminoacila por la O-RS. En algunas modalidades, el tRNA como mínimo es un tR?A supresor y/o comprende un codón de tres bases único de bases naturales y/o no naturales, o es un codón sin sentido, un codón raro, un codón no natural, un codón que comprende al menos cuatro bases, un codón ámbar, un codón ocre o un codón de parada ópalo. En una modalidad, el O-tRNA recombinante posee una mejora de ortogonalidad. Se apreciará que en algunas modalidades, O-tRNA se importa opcionalmente en un primer organismo de un segundo organismo sin necesidad de modificación. En diversas modalidades, el primer y segundo organismos ya son iguales o diferentes y se eligen opcionalmente de, incluyendo pero no limitado a procariotas (incluyendo pero no limitado a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli , Halobacterium, etc.) eucariotas, mamíferos, hongos, levaduras, arqueobacterias, eubacterias, plantas, insectos, protistas, etc. Adicionalmente, el tRNA recombinante se aminoacila opcionalmente por un aminoácido no naturalmente codificado, en donde el aminoácido no naturalmente codificado se biosintetiza in vivo ya sea naturalmente o a través de manipulación genética. El aminoácido no naturalmente codificado opcionalmente se agrega a un medio crecimiento para al menos el primer o segundo organismos. En un aspecto, la selección (incluyendo pero no limitada a selección negativa) , o criba de la biblioteca para tRNAs (opcaionalmente mutantes) que se aminoacilan por una aminoacil -tR?A sintetasa (etapa (b) ) incluye: introducir un gen marcador tóxico, en donde el gen marcador tóxico comprende al menos uno de los codones selectores (o un gen que lleva a la producción de un agente tóxico o estático o un gen esencial para el organismo en donde este gen marcador comprende al menos un codón selector) y la biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; y seleccionar células supervivientes, en donde las células supervivientes contienen el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) que comprenden al menos un tR?A ortogonal o tR?A no funcional. Por ejemplo, células supervivientes pueden seleccionarse al utilizar un ensayo de densidad celular de relación de comparación. En otro aspecto, el gen marcador tóxico puede incluir dos o más codones selectores. En otra modalidad de los métodos, el gen marcador tóxico en un gen ribonucleasa barnaza, en donde el gen ribonucleasa barnaza comprende al menos un codón ámbar. Opcionalmente, el gen ribonucleasa barnaza puede incluir dos o más codones ámbar. En una modalidad, la selección o criba del conjunto de tR?As (opcionalmente mutante) por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal (O-RS) introducida, puede incluir: introducir un gen marcador de criba o selección positiva, en donde el gen marcador positivo comprende un gen de resistencia a droga (incluyendo pero no limitado a gen /?-lactamasa, que comprende al menos uno de los codones selectores, tal como al menos un codón de parada ámbar) , o un gen esencial al organismo, o un gen que lleva a la desintoxicación de un agente tóxico, junto con la ORS, y el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; e identificar células supervivientes o cribadas desarrolladas en la presencia de un agente de selección o criba, incluyendo pero no limitado a un antibiótico, de esta manera proporcionando un conjunto de células que poseen el tRNA recombinante como mínimo, en donde el tR?A recombinante como mínimo se aminoacila por la O-RS e inserta un aminoácido en un producto de traducción codificado por el gen marcador positivo, en respuesta a los codones selectores como mínimo. En otra modalidad, la concentración del agente de selección y/o criba se varía. Métodos para generar pares O-tRNA/O-RS específicos se proporcionan. Métodos incluyen: (a) generar una biblioteca de tR?As mutante derivada de al menos un tR?A de un primer organismo; (b) seleccionar o cribar negativamente la biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por una aminoacil sitanterasa tRNA de un segundo organismo en la ausencia de una RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) ; (c) seleccionar o cribar el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal (O-RS) introducida, proporcionar de esta manera al menos un OtRNA recombinante. El OtR?A recombinante como mínimo reconoce un codón selector y no se reconoce en eficiencia por la RS del segundo organismo y de preferencia se aminoacila por la 0- RS . El método también incluye (d) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivados de al menos una aminoacil tR?A sintetasa (RS) de un tercer organismo; (e) seleccionar o cribar la biblioteca de RSs mutantes por miembros que de preferencia amoniacilan el OtR?A recombinante como mínimo en la presencia de un aminoácido no naturalmente codificado y una aminoácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) ; (f) selección o criba negativa del conjunto para RSs activas (opcionalmente mutantes) que de preferencia aminoacilan el OtR?A recombinante como mínimo eh la ausencia del aminoácido no naturalmente codificado, de esta manera proporcionando el par 0-tR?A/0-RS específico como mínimo, en donde el par 0- tRNA/O-RS específico como mínimo comprende al menos una 0- RS recombinante que es especifica para el aminoácido no naturalmente codificado y el OtR?A recombinante como mínimo. Pares 0-tR?A/O-RS específicos producidos por los métodos se incluyen. Por ejemplo, el par 0-tRNA/O-RS específico puede incluir, incluyendo pero no limitado a un par mutR?ATyr-mutTyrRS , tal como un par mutR?ATyr-SS12TyrRS, un par mutR?ALeu-mutLeuRS, un par mutR?AThr-mutThrRS, un par mutRNAGlu- mutGluRS o semejantes. Adicionalmente, estos métodos incluyen, en donde el primer y el tercer organismo son los mismos (incluyendo pero no limitado a Methanococcus jannaschii ) . Métodos para seleccionar un par ortogonal tR?A-tR?A sintetasa para utilizar en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo que también se incluyen en la presente invención. Los métodos incluyen: introducir un gen marcador, un tR?A y una aminoacil -tR?A sintetasa (RS) aislado o derivado de un primer organismo en un primer conjunto de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el tR?A en un conjunto de células duplicadas de un segundo organismo; y seleccionar células supervivientes en el primer conjunto que fallan en sobrevivir en el conjunto de células duplicadas o criba por células que muestran una respuesta de criba específica que falla en dar esa respuesta en el conjunto de células duplicadas, en donde el primer conjunto y el conjunto de células duplicadas se desarrollan en la presencia de un agente de selección o criba, en donde las células supervivientes o cribadas comprenden el par ortogonal tRNA- tRNA sintetasa, para utilizar en el sistema de traducción in vivo del segundo organismo. En una modalidad, comparar y seleccionar o criba incluyen un ensayo de complementación in vivo . La concentración del agente de selección o criba puede variarse. Los organismos de la presente invención comprenden una variedad de organismos y una variedad de combinaciones. Por ejemplo, el primer y segundo organismo de los métodos de la presente invención pueden ser iguales o diferentes. En una modalidad, los organismos opcionalmente son un organismo procariótico, incluyendo pero no limitado a Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A . fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilus o semejantes. En forma alterna, los organismos opcionalmente comprenden un organismo eucariótico, incluyendo pero no limitado a plantas (incluyendo pero no limitado a, plantas complejas tales como monocotiledóneas o dicotiledóneas) algas, protistas, hongos (incluyendo pero no limitados a levadura, etc.), animales incluyendo pero no limitado a mamíferos, insectos, artrópodos, etc. (o semejantes). En otra modalidad, el segundo organismo es un organismo procariótico, incluyendo pero no limitado a Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, o semejantes. En forma alterna, el segundo organismo puede ser un organismo eucariótico, incluyendo pero no limitado a una levadura, una célula de animal, una célula de planta, un hongo, una célula de mamífero o semejantes. En diversas modalidades, el primer y segundo organismo son diferentes. VII. Ubicación de aminoácidos que no son de origen natural en polipéptidos hGH La presente invención contempla incorporar uno o más aminoácidos que no son de origen natural en GH, por ejemplo polipéptidos hGH. Uno o más aminoácidos que no son de origen natural pueden incorporarse en una posición particular que no interrumpe la actividad del polipéptido. Esto puede lograrse al hacer sustituciones "conservadoras", incluyendo pero no limitado a, sustituir aminoácidos hidrofóbicos con aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos voluminosos por aminoácidos voluminosos, aminoácidos hidrofílicos por aminoácidos hidrofílicos y/o insertar el aminoácido que no es de origen natural en un sitio que no se requiere para actividad. Regiones de GH, por ejemplo, hGH pueden ilustrarse como sigue, en donde las posiciones de aminoácido en Hgh se indican en la hilera media (SEQ ID NO: 2) : Hélice A Hélice B Hélice C Hélice D [1-5] - [6-33] - [34-74] - [75-96] - [97-105] - [106-129] - [130-153] - [154-183] - [184-191J extremo-N bucle A-B bucle B-C bucle C-D extremo-C Una variedad de enfoques bioquímicos y estructurales puede emplearse para seleccionar los sitios deseados para sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado dentro de GH, por ejemplo el polipéptido hGH. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza en la técnica que cualquier posición de la cadena polipéptido es adecuada para selección para incorporar un aminoácido no naturalmente codificado, y la selección puede basarse en diseño racional o por selección aleatoria para cualquiera o ningún propósito particular deseado. La selección de sitios deseados pueden ser para producir un GH, por ejemplo una molécula hGH que tiene cualquier propiedad o actividad deseada, incluyendo pero no limitados a agonistas superagonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de enlace receptor, moduladores de enlace receptor, formación del dímero o multímero, sin cambio de actividad o propiedad en comparación con la molécula nativa, o manipulación de cualquier propiedad física o química del polipéptido tal como solubilidad, agregación o estabilidad. Por ejemplo, ubicaciones en el polipéptido requerido para actividad biológica de GH, por ejemplo polipéptidos hGH pueden identificarse utilizando análisis de mutación punto, métodos de cribado de alanina o cribado homólogo conocidos en la técnica. Ver por ejemplo Cunningham, B. and Wells, J. , Science, 244:1081-1085 (1989) (que identifica 14 residuos que son críticos para GH, por ejemplo bioactividad hGH) y Cunningham, B., et al. Science 243: 1330-1336 (1989) (identificar anticuerpo y epítopes de receptor utilizando mutagénesis de criba homologa) . Las patentes de los E.U.A. Números 5,580,723; 5,834,250; 6,013,478; 6,428,954; y 6,451,561, que se incorporan aquí por referencia, describen métodos para el análisis sistemático de estructura y función de polipéptidos tales como hGH al identificar dominios activos que influencian la actividad del polipéptido con una sustancia diana. Residuos diferentes a aquellos identificados como críticos para actividad biológica por mutagénesis de criba de homología o alanina pueden ser buenos candidatos para sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado, dependiendo de la actividad deseada que se busca para el polipéptido. En forma alterna, los sitios identificados como críticos para la actividad biológica también pueden ser buenos candidatos para sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado, de nuevo dependiendo de la actividad deseada que se busca para el polipéptido. Otra alternativa sería el simplemente hacer sustituciones en serie en cada posición de la cadena polipéptido con un aminoácido no naturalmente codificado y observar el efecto en las actividades del polipéptido. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la técnica que cualesquiera medios, técnica o método para seleccionar una posición para sustitución con un aminoácido no natural en cualquier polipéptido es adecuado para utilizar en la presente invención. La estructura y actividad de mutantes de origen natural de polipéptidos hGH que contienen deleciones también pueden examinarse para determinar regiones de la proteína que sean probablemente tolerantes de sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado. Ver Kostyo et ah, Biochem. Biophys. Acta, 925: 314 (1987); Lewis, U., et ah, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978) para hGH. En una forma similar, los anticuerpos monoclonales y digestión de proteasa pueden utilizarse para identificar regiones de hGH que son responsables para enlace del receptor hGH. Ver Cunningham, B., et a Science 243: 1330-1336 (1989); Mills, J. , et ah, Endocrinology, 107:391-399 (1980); Li , C, Mol. Cell. Biochem., 46:31-41 (1982) (indicando que aminoácidos entre los residuos 134-149 pueden eliminarse sin perdida de actividad) . Una vez que los residuos probables a ser intolerantes a sustitución con aminoácidos no naturalmente codificados se han eliminado, el impacto de sustituciones propuestas en cada una de las posiciones restantes puede examinarse de la estructura de cristal tridimensional de hGH y sus proteínas de enlace. Ver See de Vos, A., et ah, Science, 255:306-312 (1992) para hGH; todas las estructuras de cristal para hGH están disponibles en el Protein Data Bank (incluyendo 3HHR, 1AXI , y 1HWG) (PBB, disponible en la red mundial en rcsb.org), una base de datos centralizada que contiene datos estructurales tridimensionales de grandes moléculas de proteínas y ácidos nucleicos. Pueden elaborarse modelos al investigar la estructura secundaria y terciaria de polipéptidos, si no están disponibles datos estructurales tridimensionales. De esta manera, aquellos con destreza ordinaria en la especialidad pueden identificar fácilmente posiciones de aminoácidos que pueden ser sustituidas con aminoácidos no naturalmente codificados.

En algunas modalidades, el GH, por ejemplo polipéptidos hGH de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no son de origen natural ubicados en una región de la proteína que no interrumpe las hélices o estructura secundaria de hoja beta del polipéptido. Residuos ejemplares de incorporación de un aminoácido no naturalmente codificado pueden ser aquellos excluidos de regiones de enlace de receptor potenciales (incluyendo pero no limitadas a sitio I y sitio II (pueden ser total o parcialmente expuestos a solvente, tienen mínimas o no tienen interacciones de enlaces de hidrógeno con residuos cercanos, pueden estar mínimamente expuestos a residuos reactivos cercanos y pueden estar en regiones que son altamente flexibles (incluyendo pero no limitadas al Bucle C-D) o estructuralmente rígidos (incluyendo pero no limitados a hélice B) como se pronostica por la estructura de cristal tridimensional, estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de hGH, ligada o no ligada a su receptor. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se incorporan en cualquier posición en una o más de las siguientes regiones correspondientes a estructuras secundarias en hGH como sigue: posiciones correspondientes a 1-5 (extremo-N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre la hélice A y la hélice B, el bucle A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre la hélice B y la hélice C, bucle B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre la hélice C y hélice D, el bucle C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (extremo C) de SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, polipéptidos GH, por ejemplo polipéptidos hGH de la invención comprenden a menos un aminoácido que no es de origen natural substituido por al menos un aminoácido ubicado en al menos una región de GH, por ejemplo hGH seleccionado de un grupo que consiste de regiones correspondientes al extremo N- (1-5) , el extremo N- Terminal del bucle A-B (32-46) ; el bucle B-C (97-105) , el bucle C-D (132-149) , y el extremo C- (184-191) de SEQ ID NO : 2. En algunas modalidades, uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se incorporan en una o mas de las siguientes posiciones de GH, por ejemplo hGH que corresponde a: antes de la posición 1 (es decir, en el extremo N) 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir, en el extremo carboxilo de la proteína) de SEQ ID NO: 2, o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO : 1 ó 3. Sitios ejemplares de incorporación de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados correspondientes a 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186, y 187, o cualquier combinación de los mismos de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO : 1 ó 3. Un subconjunto de sitios ejemplares para incorporación de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados incluye sitios que corresponden a 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186, y 187, o cualquier combinación de los mismos de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. Un examen de la estructura de cristal de GH, por ejemplo hGH y sus interacciones con el GH, por ejemplo receptor hGH indica de las cadenas laterales de estos residuos aminoácido están total o parcialmente accesibles a solvente y la cadena lateral de un aminoácido no naturalmente codificado puede dirigir lejos de la superficie de la proteína y fuera hacia el solvente . Posiciones ejemplares para incorporación de uno 0 más aminoácidos no naturalmente codificados incluyen sitios correspondientes a 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145, y 155, o cualquier combinación de los mismos de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. Un examen de la estructura de cristal de GH, por ejemplo hGH y sus interacciones con el GH, por ejemplo receptor hGH indica que las cadenas laterales de estos residuos aminoácido están totalmente expuestas al solvente y la cadena lateral del residuo nativo dirige fuera hacia el solvente. Un subconjunto de sitios ejemplares para incorporación de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados, incluye sitios correspondientes a 30, 74, 103, o cualquier combinación de los mismos de SEQ ID NO: 2, o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. Otro subconjunto de sitios ejemplares para incorporación de uno o mas aminoácidos no naturalmente codificados incluye sitios correspondientes a 35, 92, 143, 145, o cualquier combinación de las mismos, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. Un subconjunto adicional de sitios ejemplares para incorporación de uno o mas aminoácidos no naturalmente codificados incluye sitios correspondientes a 35, 92, 131, 134, 143, 145, o cualquier combinación de los mismos, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. Un subconjunto aún adicional de sitios ejemplares para incorporación de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados incluye sitios correspondientes a 30, 35, 74, 92, 103, 145, o cualquier combinación de los mismos, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. Todavía un subconjunto adicional de sitios ejemplares para incorporación de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados, incluye sitios correspondientes a 35, 92, 143, 145, o cualquier combinación de los mismos, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En ciertas modalidades, sitios para incorporación de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados incluyen un sitio correspondiente a 35 de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, al menos uno de los aminoácidos no naturalmente codificados incorporados en GH, ejemplo hGH contienen un grupo carboxilo, por ejemplo un grupo cetona. En ciertas modalidades, al menos uno de los aminoácidos no naturalmente codificados incorporados en el GH, por ejemplo hGH es para acetilfenilananina . En algunas modalidades en donde el GH, por ejemplo hGH contiene una pluralidad de aminoácidos no naturalmente codificados, más de uno de los aminoácidos no naturalmente codificados incorporados en GH, por ejemplo hGH es para acetil fenilananina . En algunas modalidades en donde el GH, por ejemplo hGH contiene una pluralidad de aminoácidos no naturalmente codificados sustancialmente todos los aminoácidos no naturalmente codificados incorporados en el GH, por ejemplo hGH son para-acetilfenilalanina . En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural se enlaza a un polímero soluble en agua en una o más posiciones, incluyendo pero no limitado a, posiciones correspondientes a: antes de la posición 1 (es decir, en el extremo N) 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir el extremo carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural se envasa a un polímero soluble enagua en las posiciones incluyendo pero no limitadas a, posiciones correspondientes a una o mas de estas posiciones 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO : 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural se enlaza a un polímero soluble en agua en las posiciones incluyendo pero no limitadas a, posiciones correspondientes a una o mas de esas posiciones 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural se enlaza a un polímero soluble en agua en las posiciones incluyendo pero no limitadas a, posiciones correspondientes a una o mas de estas posiciones 35, 92, 131, 134, 143, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural se enlaza a un polímero soluble en agua en las posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a una o mas de estas posiciones 30, 35, 74, 92, 103, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2, o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural se enlaza a un polímero soluble en agua en las posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a una o más de estas posiciones 35, 92, 143, 145, o cualquier combinación de las mismas de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural se enlaza a un polímero soluble en agua en una posición correspondiente a, pero no limitada a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3 se enlazan a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el o los polímeros solubles en agua enlazados al GH, por ejemplo hGH incluyen una o mas moléculas de polietilen glicol (PEGs) . El polímero, por ejemplo PEG puede ser lineal o ramificado. Típicamente, polímeros lineales, por ejemplo PEGs empleados en la invención pueden tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. Típicamente, polímeros ramificados, por ejemplo PEGs empleados en la invención pueden tener un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. Polímeros tales como PEGs se describen más aquí. En ciertas modalidades, el enlace entre el GH por ejemplo hGH y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG es un enlace oxima. Ciertas modalidades de la invención abarcan composiciones que incluyen un GH por ejemplo hGH, enlazado a cuando menos un polímero soluble en agua por un enlace covalente en donde en enlace covalente es un enlace oxima. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG, por ejemplo un PEG lineal. En algunas modalidades que abarcan al menos un PEG lineal enlazado por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG lineal enlazado por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH, PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, que abarcan al menos un PEG ramificado unido por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG ramificado unido por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, el GH, es un GH, por ejemplo hGH y en ciertas de estas modalidades, el GH, por ejemplo hGH tiene una secuencia que es al menos aproximadamente 80% idéntica a SEQ ID NO: 2; en algunas modalidades, el GH, por ejemplo hGH tiene una secuencia que es la secuencia de SEQ ID NO: 2. en algunas modalidades el GH, por ejemplo hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado; y en algunas modalidades al menos un enlace oxima está entre el aminoácido no naturalmente codificado y al menos un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado contiene un grupo carbonilo, tal como un grupo cetona; en algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado es para-acetilfenilalanina . En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina está sustituida en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2. De esta manera, en algunas modalidades, la invención proporciona un GH, e.g., hGH, enlazado con al menos un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG por un enlace covalente, en donde el enlace covalente es un enlace oxima. En ciertas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG y el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima a un GH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG esto es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG ramificado unido por un enlace oxima a un GH, e.g., hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona GH, e.g., hGH, en donde el GH, por ejemplo hGH contiene un aminoácido no naturalmente codificado, en donde el GH se enlaza a cuando menos un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG por un enlace covalente, y donde el enlace covalente es un enlace oxima entre el aminoácido no naturalmente codificado y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado se incorpora en el GH, por ejemplo hGH, en una posición que corresponde a la posición 35 de SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH el PEG tiene un MW de aproximadamente aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades en donde el polímero soluble en agua es PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PRG ramificado unido por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona un GH, por ejemplo hGH, en donde por el GH, por ejemplo hGH contiene un aminoácido no naturalmente codificado que es un aminoácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo, en donde el GH se enlaza a cuando menos un polímero soluble en agua, por ejemplo, un PEG por un enlace covalente y en donde el enlace covalente es un enlace oxima entre el aminoácido que contiene carbonilo no naturalmente codificado y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG. En algunas modalidades, el aminoácido que contiene carbonilo no naturalmente codificado se incorpora en un GH, por ejemplo hGH en una posición correspondiente a la Posición 35 de SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene una MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH el PEG tiene una MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el polímero ramificado tiene una MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG ramificado unido por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH, el PEG tiene una MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona un GH, por ejemplo hGH que contiene un aminoácido no naturalmente codificado que incluye un grupo cetona, en donde el GH se enlaza a cuando menos un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG, por un enlace covalente y en donde el enlace covalente es un enlace oxima entre el aminoácido no naturalmente codificado que contiene un grupo cetona y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado que contiene un grupo cetona, se incorpora en el GH, por ejemplo hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2. en ciertas modalidades en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima a un GH, por ejemplo hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene una MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG ramificado unido por un enlace oxima a u GH, por ejemplo hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, por ejemplo una hGH, que contiene un aminoácido no naturalmente codificado que es una para-acetilfenilalanina, en donde la GH enlazada a cuando menos un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG, por un enlace covalente, y en donde el enlace covalente es un enlace oxima entre la para-acetilfenilalanina y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG. En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina se incorpora en la GH, por ejemplo hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene una MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima a una GH, por ejemplo hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG ramificado unido por enlace oxima a un GH, por ejemplo, hGH, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, la invención proporciona una GH, por ejemplo, hGH que incluye SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, por ejemplo, hGH se sustituye en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 con una para-acetilfenilalanina que está unidad por un enlace oxima a un PEG lineal de MW de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida por un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a posiciones correspondientes a: antes de la posición 1 (es decir en el extremo N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 1.52, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir en el extremo carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no-naturalmente-codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a las posiciones correspondientes a: 35, 92, 131, 134, 143, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO : 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO : 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitada a las posiciones correspondientes a: 35, 92, 143, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a posiciones correspondientes a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En modalidades en donde el PEG es un PEG lineal, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH incluye la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a posiciones correspondientes a: antes de la posición 1 (es decir en el extremo N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir, en el extremo carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitado a las posiciones que corresponden a: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a, posiciones correspondientes a: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo, pero no limitado a, posiciones correspondientes a: 35, 92, 131, 134, 143, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida por un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia aminoácido de SEQ ID NO : 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo, pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 35, 92, 143, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, e.g., hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, e.g., hGH comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, y en donde la GH, e.g., hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 ó 3. En modalidades en donde el PEG es un PEG lineal, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa.

En algunas modalidades, la invención proporciona una GH, e.g., hGH, en donde la GH, e.g., hGH contiene cuando menos un aminoácido no-naturalmente codificado, en donde la GH está unida a una pluralidad de polímeros solubles en agua, por ejemplo una pluralidad de PEGs, por enlaces covalentes, en donde uno o más de los enlaces covalentes es un enlace oxima entre al menos uno del aminoácido no-naturalmente codificado y el polímero soluble en agua, e.g., PEG. La GH, e.g., hGH, puede estar enlazada a aproximadamente 2-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 2-50 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs o aproximadamente 2-25 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 2-10 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 2-5 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 5-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 5-50 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 5-25 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 5-10 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 10-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 10-50 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 10-20 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 20-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 20-50 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 50-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs. El uno o más aminoácidos no-naturalmente-codificados puede ser incorporado en la GH, e.g., hGH, en cualquier posición aquí descrita. En algunas modalidades, al menos un aminoácido no-naturalmente-codificado se incorpora en la GH, e.g., hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, los aminoácidos no-naturalmente codificados incluyen al meno sun aminoácido no-naturalmente codificado que es un aminoácido no-naturalmente codificado que contiene carbonilo, por ejemplo una cetona que contiene un aminoácido no-naturalmente codificado tal como para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la GH, e.g., hGH, incluye una para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina se incorpora en la GH, e.g., hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2, en donde la para-acetilfenilalanina se enlaza a uno de los polímeros, por ejemplo uno de los PEGs, por un enlace oxima. En algunas modalidades, al menos uno de los polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, se enlaza a GH, e.g., hGH, mediante un enlace covalente con al menos uno de los aminoácidos no-naturalmente-codificados . En algunas modalidades, el enlace covalente es un enlace oxima. En algunas modalidades, una pluralidad de polímeros solubles en agua, e.g., PEGs, se enlazan a la GH, e.g., hGH, por enlaces covalentes a una pluralidad de aminoácidos no-naturalmente-codificados . En algunas modalidades, al menos uno de los enlaces covalentes es un enlace oxima; en algunas modalidades, una pluralidad de los enlaces covalentes son enlaces oxima; en algunas modalidades, sustancialmente todos los enlaces son enlaces oxima. La pluralidad de polímeros solubles en agua, por ejemplo PEG, puede ser lineal, ramificada, o cualquier combinación de los mismos. En modalidades que incorporan uno o más PEGs lineales, los PEGs lineales tienen un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En modalidades que incorporan uno o más PEGs ramificados, los PEGs ramificados tienen una MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. Se apreciará que modalidades que emplean una pluralidad de polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, en general emplearán estos polímeros a menores MWs que modalidades en donde un solo PEG se emplea. De esta manera, en algunas modalidades, el MW total de la pluralidad de PEGs es aproximadamente 0.1-500 kDa, o aproximadamente 0.1-200 kDa, o aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-1000 kDa, o aproximadamente 1-500 kDa, o aproximadamente 1-200 kDa, o aproximadamente 1-100 kDa, o aproximadamente 10-1000 kDa, o aproximadamente 10-500 kDa, o aproximadamente 10- 200 kDa, o aproximadamente 10-100 kDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20-1000 kDa, o aproximadamente 20-500 kDa, o aproximadamente 20-200 kDa, o aproximadamente 20-100 kDa, o aproximadamente 20-80 kDa, about 20-60 kDa, about 5- lOOkDa, about 5-50 kDa, o aproximadamente 5-20 kDa. Antagonistas de GH humana incluyen, pero no están limitados a aquellos con sustituciones en: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o una adición en la posición 1 (es decir en el extremo N) , o cualquier combinación de los mismos (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 1, 3, o cualquier otra secuencia GH) . Una amplia variedad de aminoácidos no-naturalmente codificados puede sustituirse por o incorporarse en una posición determinada en una GH, por ejemplo un polipéptido hGH. En general, un aminoácido no-naturalmente codificado particular se elige para incorporación con base en un examen de la estructura cristalina tri-dimensional de una GH, por ejemplo polipéptido hGH con su receptor, una preferencia para sustituciones conservadoras (es decir, aminoácidos no-naturalmente codificados basados en arilo, tales como p-acetilfenilalanina o O-propargiltirosina sustituyendo a Tyr o Trp) , y la química de conjugación específica que se desee introducir en la GH, por ejemplo polipéptido hGH (por ejemplo, la introducción de 4 -azidofenilalanina si se desea efectuar una cicloadición Huisgen [3+2] con un polímero soluble en agua que contiene una porción alquino o una formación de enlace amida con un polímero soluble en agua que contiene un aril éster, que a su vez incorpora una porción fosfina) . En una modalidad, el método además incluye incorporar en la proteína el aminoácido no natural, en donde el aminoácido no natural comprende un primer grupo reactivo; y contactar la proteína con una molécula (incluyendo pero no limitado a una etiqueta, una etiqueta, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietinel glicol, un fotoentrelazador o reticulador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo un fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, uno DNA, un RNA, un polinucleótido antisentido, un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inibitorio, un biomaterial, una nano partícula, una etiqueta de espín, un floróforo, una porción que contiene metal, una porción radiactiva, un grupo funcional novedoso, un grupo e interactuar covalente o no covalentemente con otras moléculas, una porción foto-enjaulada, una porción de radiación actínica excitable, una porción fotoisomerisable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, una porción que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente escindible, un grupo foto escindible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado a carbono, un agente redox activo, un aminotioácido, una porción tóxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimio luminiscente, un grupo denso en electrones, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrones, o cualquier combinación del compuesto o sustancia anterior o cualquier otro compuesto o sustancia conveniente) , que comprende un segundo grupo reactivo. El primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo para conectar la molécula al aminoácido no natural a través de una cicloadición [3+2] . En una modalidad, el primer grupo reactivo es una porción alquinilo o azido y el segundo grupo reactivo es una porción azido o alquinilo. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es la porción alquinilo (incluyendo pero no limitado a, en el aminoácido no natural p-propargiloxifenilalanina) y el segundo grupo reactivo es la porción azido. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es la porción azido (incluyendo pero no limitado al aminoácido no natural p-azido-L- fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es la porción alquinilo. En algunos casos, la o las sustituciones de aminoácido no-naturalmente codificados se combinarán con otras adiciones, sustituciones o eliminaciones dentro de la GH, por ejemplo polipéptido hGH para afectar a otras características biológicas del GH, por ejemplo polipéptido hGH. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones pueden incrementar la estabilidad (incluyendo pero no limitadas a, resistencia a degradación proteolítica) de la GH, por ejemplo polipéptido hGH o incrementar la afinidad de la GH, por ejemplo polipéptido hGH por su receptor. En algunas modalidades, la GH, por ejemplo polipéptido hGH que comprende una sustitución aminoácido seleccionada del grupo que consiste de FlOA, FlOH, F10I ; M14W, M14Q, M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F176Y, I179T o cualquier combinación de los mismas en SEQ ID NO: 2. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones pueden incrementar la solubilidad (incluyendo pero no limitado a cuando se expresa en E. coli u otras células anfitrionas) de la GH, por ejemplo polipéptido hGH. En algunas modalidades, adiciones, sustituciones o deleciones pueden incrementar la solubilidad polipéptido después de expresión en E. coli u otras células o anfitrionas recombinantes. En algunas modalidades, se eligen sitios para sustitución con un aminoácido naturalmente codificado o no-natural además de otro sitio para incorporación de un aminoácido no-natural que resulta en incrementar la solubilidad polipéptido después de expresión en E. coli u otras células anfitrionas recombinantes. En algunas modalidades, la GH, por ejemplo polipéptido hGH comprenden otra adición, sustitución o deleción que modula la afinidad para la GH, por ejemplo receptor de polipéptido hGH, modula (incluyendo pero no limitado a, incremento o disminuye) dimerización de receptor, estabiliza dímeros de receptor, modula vida media en circulación, modula liberación o bio-disponibilidad, facilita purificación o mejora o altera una ruta particular de administración. Por ejemplo, además de introducir uno o más aminoácidos no-naturalmente codificados como se establece aquí, una o más de las siguientes sustituciones se introducen: FlOA, F10H O FlOI; M14W, M14Q, o M14G; H18D; H21N; R167N; D171S; E174S; F176Y y I179T para incrementar la afinidad de la GH, por ejemplo variante hGH por su receptor. Similarmente, GH, por ejemplo polipéptido hGH puede comprender sitios de escisión química o enzimática, secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace de anticuerpo (incluyendo pero no limitados a, FLAG o poly-His) u otras secuencias basadas en afinidad (incluyendo pero no limitadas a, FLAG, poly-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo pero no limitadas a, biotina) que mejora la detección (incluyendo pero no limitadas a, GFP) , purificación, transporte a través de tejidos o membranas celulares, liberación o activación de prodroga, reducción de tamaño de hGH, u otras características del polipéptido.

En algunas modalidades, la sustitución de un aminoácido no-naturalmente codificado genera una GH, por ejemplo antagonista hGH. Un sub-conjunto de sitios ejemplares para incorporación de uno o más aminoácidos no-naturalmente codificados incluye: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 127, o una adición antes de la posición 1 (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 1, 3, o cualquier otra secuencia GH) . En algunas modalidades, GH, por ejemplo antagonistas hGH comprenden cuando menos una sustitución en las regiones 1-5 (extremo N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre hélice A y hélice B, el bucle A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre hélice B y hélice C, el bucle B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre hélice C y hélice D, el bucle C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (extremo C) que provoca que GH actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios ejemplares de incorporación de un aminoácido no-naturalmente codificado incluyen residuos dentro de la región amino terminal de la hélice A y una porción de la hélice C. En otra modalidad, la sustitución de G 120 con un aminoácido no-naturalmente codificado tal como p-azido-L-fenilalanina o O-propargil-L-tirosina. En otras modalidades, las sustituciones anteriormente citadas se combinan con sustituciones adicionales que provocan que la GH, por ejemplo polipéptido hGH sea un GH, por ejemplo un antagonista hGH. Por ejemplo, un aminoácido no-naturalmente codificado se sustituye en una de las posiciones aquí identificadas y una sustitución simultánea se introduce en G120 (e.g., G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F, o G120E) . En algunas modalidades, la GH, por ejemplo antagonista hGH comprende un aminoácido no-naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente en una región de enlace receptor de la GH, por ejemplo molécula hGH. En algunos casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más aminoácidos se sustituyen con uno o más aminoácidos no-naturalmente-codificados . En algunos casos, la GH, por ejemplo polipéptido hGH además incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sustituciones de uno o más aminoácidos no-naturalmente codificados para aminoácidos de origen natural. Por ejemplo, en algunas modalidades, uno o más residuos en las siguientes regiones de GH, por ejemplo hGH se sustituyen con uno o más aminoácidos no-naturalmente codificados: 1-5 (extremo N) ; 32-46 (extremo N-terminal del bucle A-B) ; 97-105 (bucle B-C) ; y 132-149 (bucle C-D) ; y 184-191 (extremo C) . En algunas modalidades, uno o más residuos de las siguientes regiones de GH, por ejemplo hGH se sustituyen con uno o más aminoácidos no-naturalmente codificados: 1- (extremo N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre hélice A y hélice B, el bucle A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre hélice B y hélice C, el bucle B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre hélice C y hélice D, el bucle C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (extremo C) . En algunos casos, el uno o más residuos no-naturalmente codificados se enlazan con uno o más PEGs de bajo peso molecular lineales o ramificados (aproximadamente ~ 5-20 kDa en masa o menos) , de esta manera mejorando la afinidad de enlace y vida media en suero comparable respecto a las especies conectadas a un solo PEG de superior peso molecular. En algunas modalidades, hasta dos de los siguientes residuos de GH, e.g., hGH están sustituidos con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados en la posición: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186, y 187. En algunos casos, cualquiera d elos siguientes pares de sustituciones se realizan: K38X* y K140X*; K41X* y K145X*; Y35X* y E88X*; Y35X* y F92X* ; Y35X* y Y143X*; F92X* y Y143X* en donde X* representa un aminoácido no naturalmente codificado. Sitios preferidos para incorporación de dos o más aminoácidos no naturalmente codificados incluyen combinaciones de los siguientes residuos: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186, y 187. Sitios para incorporación particularmente preferidos de dos o más aminoácidos no naturalmente codificados incluyen combinaciones de los siguientes residuos: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145, y 155. Sitios para incorporación preferidos en GH, e.g., hGH de dos o más aminoácidos no naturalmente codificados incluyen combinaciones de los siguientes residuos: antes de la posición 1 (es decir en el extremo N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir en el extremo carboxilo de la proteína) o cualquier combinación de los mismos de SEQ ID NO: 2. VIII. Medición de actividad de polipéptido hGH y afinidad de polipéptido hGH para el receptor de polipéptido hGH Actividad de hGH puede medirse utilizando cualquiera de las varias técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo pero no limitadas a, ensayos de enlace celular o ensayo pSTAT5 en células IM9s. Para estimar la actividad biológica de polipéptidos hGH modificados, ensayos que supervisan la interacción entre hGH y su receptor pueden utilizarse. Por ejemplo, un ensayo que mide fosforilación de tirosina de un transductor de señal y activador de miembro de familia de transcripción, STAT5 , en la línea celular de linfocitos IM-9 (ATCC, Manassas, VA) puede emplearse. Ver por ejemplo Silva et al., Mol. Endocrinol. (1996) 10(5) :508-518. Las células IM-9 se agotaron durante la noche en medio de ensayo (RPI libre de rojo fenol, Hepes lOmM, FBS tratado con dextran/carbón termoinactivado al 1%, piruvato de sodio, penicilina y estreptomicina (antes de estímulo con un rango de dosis de 12 puntos de polipéptidos hGH por 10 minutos a 370C. Células estimuladas se fijaron con formaldehído al 1% antes de permeabilización con metanol enfriado con hielo al 90% por una hora en hielo. El nivel de fosforilación STAT5 se detectó por tinción intracelular con un anticuerpo phospho-STAT5 primario (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) a temperatura ambiente por 30 minutos seguido por un anticuerpo secundario conjugado con PE. Adquisición de muestra se realiza en el arreglo FACS con datos adquiridos analizados en el soporte lógico Flowjo (Tree Star Inc., Ashland, OR) . Valores EC50 se derivaron de curvas de respuesta de dosis trazadas con intensidad fluorescente promedio (MFl = Mean Fluorescent Intensity) contra concentración de proteína utilizando SigmaPlot . En forma alterna, estudios de proliferación con BrdU pueden realizarse en una línea celular tal como BAF3 transectada en forma estable con receptor de hormona de crecimiento de rata. Receptor de hormona de crecimiento de rata agotada en suero, GHR, (L43R) que expresa la línea celular BAF3 , 2E2-2B12-F4, se revistió a una densidad de 5 X 104 células/pozo en una placa de 96 pozos. Se activaron células con un rango de dosis de 12 puntos de proteínas hGH y etiquetaron al mismo tiempo con BrdU 50 uM (Sigma, St . Louis, MO) . Después de 48 horas en cultivo, las células se fijaron/permeabilizaron con 100 ul de solución BD cytofix/cytoperm (BD Biosciences) por 30 minutos a temperatura ambiente. Para exponer epítopes BrdU, células fijas/permeabilizadas se trataron con 30 ug/pozo de DNasa (Sigma) por 1 hora a 370C. Tinción inmunoflorescente con anticuerpo anti-BrdU conjugado con APC (BD Biosciences) permitió análisis de muestra en el arreglo FACS. El receptor hGH puede prepararse como se describe por McFarland et al, Science, 245: 494-499 (1989) y Leung, D., et al, Nature, 330:537-543 (1987). Actividad de polipéptido hGH puede determinarse utilizando ensayo in vi tro o in vivo estándar o conocidos. Por ejemplo, líneas celulares que proliferan en la presencia de hGH (por ejemplo una línea celular que expresa el receptor hGH o receptor lactogénico) puede usarse para supervisar enlace de receptor hGH. Ver Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271 (36) : 21969 (1996); Wada, et al., Mol. Endocrinol. 12:146-156 (1998); Gout , P. W. , et al. Cáncer Res. 40, 2433-2436 (1980); WO 99/03887. Para un polipéptido hGH no-modificado con polietilen glicol o modificado con polietilen glicol que comprende un aminoácido no natural, la afinidad de la hormona por su receptor puede medirse al utilizar un biosensor BIAcoreMR (GE Healthcare) . Ver por ejemplo la Patente de los E.U.A.

Número 5,849,535; Spencer, S. A., et al, J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988). Modelos de animales in vivo para prueba de actividad hGH incluyen aquellos descritos en Clark et al, J. Biol. Chem. 271 (36) : 21969-21977 (1996).

Ensayos para capacidad de dimerización de polipéptido a hGh que comprenden uno o más aminoácidos no naturalmente codificados, pueden conducirse como se describe en Cunningham, B., et al, Science, 254:821-825 (1991) y Fuh, G., et al, Science, 256: 1677-1680 (1992). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia. La compilación de referencias anterior para metodologías de ensayo no es exhaustiva, y aquellos con destreza ordinaria en la técnica reconocerán otros ensayos útiles para probar el resultado final deseado. La Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404 presentada en enero 28, 2005 y con título "Modified Growth Hormone Polypeptides and Their Uses, " que se incorpora aquí por referencia, detalla adicionalmente residuos de hGH para incorporación de uno o más aminoácidos que no son de origen natural, aminoácidos no naturalmente codificados, tRNA ortogonal, aminoacil tRNA sintetasas ortogonales, y métodos para caracterizar hGH. IX. Medición de potencia, vida media funcional in vivo y parámetros farmacocinéticos Un aspecto importante de la invención es la vida media biológica prolongada que se obtiene por construcción del polipéptido hGh con o sin conjugación del polipéptido a una porción de polímero soluble en agua. La disminución rápida de concentraciones en suero de polipéptido hGH ha hecho importante el evaluar respuestas biológicas para tratamiento con polipéptido hGH conjugado y no conjugado y sus variantes. El polipéptido hGH conjugado y no conjugado y sus variantes de la presente invención pueden tener vidas medias en suero prolongadas también después de administración subcutánea o i.v., haciendo posible medir, por ejemplo por método ELISA o por un ensayo de criba primario. Equipos ELISA o RÍA ya sea de BioSource International (Camarillo, CA) o Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX) pueden emplearse. La medición de la vida media biológica in vivo se lleva a cabo como se describe aquí . La potencia y vida media in vivo funcional de un polipéptido hGh que comprende un aminoácido no naturalmente codificado, pueden determinarse de acuerdo con el protocolo descrito en Clark, R. , et al, J. Biol Chem. 271(36): 21969-21977 (1996). Parámetros farmacocinéticos de un polipéptido hGH que comprenden un aminoácido no naturalmente codificado, pueden evaluarse en ratas macho Sprague-Dawley normales (N=5 animales por grupos de tratamiento) . Los animales recibirán ya sea una sola dosis de 25 ug/rata iv o 50 ug/rata se, y aproximadamente 5 a 7 muestras de sangre se tomarán de acuerdo con un curso de tiempo predefinido, cubriendo generalmente aproximadamente 6 horas para un polipéptido hGh que comprende un aminoácido no naturalmente codificado no conjugado a un polímero soluble en agua y aproximadamente 4 días para un polipéptido hGH que comprende un aminoácido no naturalmente codificado y conjugado a un polímero soluble en agua. Datos farmacocinéticos para polipéptidos hGH están bien estudiados en varias especies y pueden ser comparados directamente a los datos obtenidos para polipéptidos hGH que comprenden un aminoácido o naturalmente codificado. Ver Mordenti J. , et al, Pharm. Res. 8 (11) : 1351-59 (1991) para estudios relacionados a hGH. Parámetros farmacocinéticos también pueden evaluarse en un primate, por ejemplo monos cynomolgus. Típicamente, una sola inyección se administra ya sea subcutáneamente o intravenosamente y los niveles hGH en suero se supervisan con el tiempo. La actividad específica de polipéptidos hGH de acuerdo con esta invención puede determinarse por varios ensayos conocidos en la técnica. La actividad biológica de las proteínas de polipéptidos hGH o sus fragmentos obtenidas y purificadas de acuerdo con esta invención, puede probarse por métodos descritos o referidos aquí o conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la técnica . X. Usos terapéuticos de polipéptidos hGH Los polipéptidos agonistas hGH pueden ser útiles por ejemplo para tratar deficiencia de crecimiento, desórdenes inmunes y para estimular la función cardiaca. Individuos con deficiencias de crecimiento incluyen por ejemplo individuos con el Síndrome de Turner, individuos deficientes en GH (incluyendo niños) , niños que experimentan un frenado o retardo en su curva de crecimiento normal, aproximadamente 2 a 3 años antes de que cierre su placa de crecimiento (en ocasiones conocidos como "niños normales bajos") , e individuos en donde la respuesta al factor de crecimiento tipo insulina-I (IGF-I = Insulin-like Growth Factor- I) a GH se ha bloqueado químicamente (es decir por tratamiento con glucocorticoide) o por una condición natural tal como en pacientes adultos en donde la respuesta IGF- I a GH se reduce naturalmente. Los polipéptidos hGH de la invención pueden ser útiles para tratar individuos con las siguientes condiciones: deficiencia en la hormona de crecimiento pediátrico, estatura corta idiopática, deficiencia en la hormona de crecimiento de adulto de inicio en la infancia, deficiencia en la hormona de crecimiento de adulto de inicio en adultos, o deficiencia de hormona de crecimiento secundaria. Adultos diagnosticados con deficiencia de hormona de crecimiento en la edad adulta, pueden haber tenido un tumor pituitario o radiación. Condiciones incluyendo pero no limitadas a, síndrome metabólico, lesión de la cabeza, obesidad, osteoporosis o depresión, pueden resultar en síntomas tipo deficiencia de hormona de crecimiento en adultos. Una variante hGH agonista puede actuar para estimular el sistema inmune de un mamífero al incrementar su función inmune, ya sea que el incremento se deba a mediación de anticuerpo o mediación de célula, y si el sistema inmune es endógeno al anfitrión tratado con el polipéptido hGH o es trasplantado de un donador al recipiente anfitrión dado el polipéptido hGH (como en transplantes de médula ósea). "Desórdenes inmunes" incluyen cualquier condición en donde el sistema inmune de un individuo tiene reducida respuesta de anticuerpo o celular a antígenos que lo normal incluyendo aquellos individuos con bazos pequeños con reducida inmunidad debido a tratamientos con drogas (por ejemplo quimioterapéuticos) . Ejemplos de individuos con desórdenes inmunes incluyen por ejemplo pacientes mayores, individuos que se someten a quimioterapia o terapia de radiación, individuos que se recuperan de una enfermedad mayor, o están por someterse a cirugía, individuos con SIDA (AIDS) , pacientes con deficiencias congénitas y de células B adquiridas tales como hipogamaglobulinemia, agamaglobulinemia variada común y deficiencias de inmunoglobulina selectivas (por ejemplo deficiencia en IgA, pacientes infectados con virus tales como rabia con un tiempo de intubación más corto que la respuesta inmune del paciente; e individuos con desórdenes hereditarios tales como el síndrome diGeorge . Polipéptidos antagonistas hGH pueden ser útiles para el tratamiento de gigantismo y acromegalia, diabetes y complicaciones (retinopatía diabética, neuropatía diabética) que surgen de diabetes, enfermedades vasculares de los ojos (por ejemplo que involucran neovascularización proliferativa) , nefropatía, y malignidades de respuesta a GH. Enfermedades vasculares de los ojos incluyen por ejemplo retinopatía (provocada por, por ejemplo anemia de células falsiformes o de premadurez) y degeneración macular. Malignidades de respuesta GH incluyen, por ejemplo tumor de Wilm, sarcomas (por ejemplo sarcoma osteogénico) , cáncer de mama, colon, próstata y tiroides y cánceres de tejidos que expresan MRA receptor de GH (es decir placenta, timo, cerebro, glándula salivar, próstata, médula ósea, músculo esquelético, traquea, columna cervical, retina, nodo linfático y de linfoma de Burkitt, carcinoma colorectal, carcinoma pulmonar, leucemia lifoblástica y melanoma) . Los GH, por ejemplo polipéptidos agonistas hGH de la invención pueden ser útiles, por ejemplo para tratar falla renal crónica, falla de crecimiento asociada con insuficiencia renal crónica (CRI = Chronic Renal Insufficieney) , estatura corta asociada con el síndrome de Turner, síndrome Prader-Willi pediátrico (PWS Prader-Willi Syndrome) , pacientes de HIV con desgaste o caquexia, niños nacidos pequeños por edad gestacional (SGA = Small for Gestational Age) , obesidad, y osteoporosis . Polipéptidos hGH de la invención incluyen hGH modificado con polietilen glicol, pueden administrarse por cualquier ruta convencional adecuada para proteínas o péptidos, incluyendo pero no limitada a parenteralmente, por ejemplo inyecciones incluyendo pero no limitadas a subcutánea o intravenosamente o cualquier otra forma de inyecciones o infusiones. Composiciones de polipéptidos pueden ser administradas por una cantidad de rutas incluyendo pero no limitadas a medios orales, intravenosos, intraperitoneales, intramusculares, transdérmicos, subcutáneos, tópicos, sublinguales o rectales. Composiciones que comprenden polipéptidos de aminoácidos no naturales, modificados o no modificados también pueden administrarse mediante liposomas. Estas rutas de administración y formulaciones apropiadas en general se conocen por aquellos con destreza en la técnica. El polipéptido hGH que comprende un aminoácido no natural, incluyendo hGH modificado con polietilen glicol puede utilizarse solo o en combinación con otros componentes convenientes tales como un portador farmacéutico . Cantidades promedio de la hGH pueden variar y en particular deberán basarse en las recomendaciones y receta de un médico calificado. La cantidad exacta de hGH es una cuestión de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto de condición que se trata, la condición del paciente que se trata, así como los otros ingredientes en la composición. La cantidad a suministrar puede ser determinada fácilmente por una persona con destreza en la técnica basada en terapia con hGH. Composiciones farmacéuticas de la invención pueden fabricarse en forma convencional . XJ. Métodos de ácido nucleico recombinante generales para utilizar con la invención En numerosas modalidades de la presente invención, ácidos nucleicos que codifican un polipéptido hGh de interés se aislarán, clonarán y a menudo alterarán utilizando métodos recombinantes. Estas modalidades se utilizan incluyendo pero no limitadas a, expresión de proteína o durante la generación de variantes, derivados, cartuchos de expresión u otras secuencias derivadas de un polipéptido hGH. En algunas modalidades, las secuencias que codifican los polipéptidos de la invención se enlazan operativamente a un promotor heterólogo. Aislamiento de hGH y producción de GH en las células anfitrionas se describen por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Números 4,601,980, 4,604,359, 4,634,677, 4,658,021, 4,898,830, 5,424,199, 5,795,745, 5,854,026, 5,849,535; 6,004,931; 6,022,711; 6,143,523 y 6,608,183, que aquí se incorporan por referencia. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido hGH comprende un aminoácido no naturalmente codificado puede ser sintetizada en base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido precursor y después cambiar la secuencia de nucleótidos para efectuar la introducción (es decir incorporación o substitución) o remoción (es decir selección o substitución) de el o los residuos aminoácidos relevantes. La secuencia de nucleótidos puede modificarse convenientemente por mutagénesis dirigida de sitio de acuerdo con métodos convencionales. En forma alterna, la secuencia de nucleótidos puede preparase por síntesis química, incluyendo pero no limitada a, al utilizar un sintetizador de oligonucleótidos, en donde los oligonucleótidos se diseñan con base en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y de preferencia seleccionar aquellos codones que se favorecen en la célula anfitriona en donde se producirá el polipéptido re-combinante . Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y ensamblarse por reacción PCR, ligación o cadena de ligación. Ver por ejemplo Barany, et al., Proc. Nati. Acad. ScL 88: 189-193 (1991); patente de los E.U.A. número 6,521,427, que se incorpora aquí por referencia. Esta invención utiliza técnicas rutinarias en el campo de genética re-combinante. Textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990) ; and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds., 1994) ) . Textos generales que describen técnicas de biología molecular incluyen Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual ("2da Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology. F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")). Estos textos describen mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados a, incluyendo pero no limitados a, la generación de genes o polinucleótidos que incluyen codones selectores para producción de proteínas que incluyen aminoácidos no naturales, tRNAs ortogonales, tR?A sintetasas ortogonales y sus pares. Diversos tipos de mutagénesis se emplean en la invención para una variedad de propósitos incluyendo pero no limitados a producir sintetasas novedosas o tRNAs , para mutar moléculas tR?A, para mutar polinucleótidos que codifican sintetasas, para producir bibliotecas de tRNAs , para producir bibliotecas de sintetasas, para producir codones selectores, para insertar codones selectores que codifican aminoácidos no naturales en una proteína o polipéptido de interés. Incluyen pero no están limitados a mutagénesis punto aleatoria dirigida por sitio, recombinación homologa, entremezclado de D?A u otros métodos de mutagénesis recursiva, construcción quimérica, mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis de DNA modificada por fosforotioato, mutagénesis utilizando DNA dúplex con espacios o semejantes, o cualquier combinación de las mismas. Métodos adecuados adicionales incluyen reparación de apareamiento incorrecto o mal apareamiento punto, mutagénesis utilizando cepas anfitrionas deficientes en reparación, selección-restricción y purificación-restricción, mutagénesis de deleción, mutagénesis por síntesis de genes total, reparación de ruptura de doble hebra y semejantes. Mutagénesis, incluyendo pero no limitadas a que involucran construcciones quiméricas, también se incluyen en la presente invención. En una modalidad, la mutagénesis puede guiarse por información conocida de la molécula de origen natural o molécula de origen natural mutada o alterada, incluyendo pero no limitada a secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura secundaria o terciaria o cuaternaria, estructura de cristal o semejantes. Los textos y ejemplos que se encuentran aquí describen estos procedimientos. Se encuentra información adicional en las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Cárter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids S. Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlín) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Nati. Acad. Sci. 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Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucí. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al . , Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, CeU 38:879-887 (1984); Cárter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors, Nucí. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) ; Cárter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987) ; Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to genérate large deletions, Nucí. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415- 423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) , Nucí. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrdm et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ' shot-gun' gene synthesis, Nucí. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985) ; Mandecki, Oligonucleotide-directed double- strand break repair inplasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinión in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); y, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995) . Detalles adicionales en muchos de loa métodos anteriores pueden encontrarse en Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para solución de problemas con diversos métodos de mutagénesis. Oligonucleótidos, por ejemplo para utilizar en mutagénesis de la presente invención, por ejemplo bibliotecas mutantes de sintetasas, o alterar tRNAs, típicamente se sintetizan en forma química de acuerdo con el método de fosforoamidita triéster en fase sólida descrito por Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22 (20) :1859-1862, (1981), por ejemplo utilizando un sintetizador automatizado como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984) .

La invención también se refiere a células anfitrionas eucarióticas, células anfitrionas no eucarióticas, y organismos para la incorporación en vivo de un aminoácido no natural mediante pares tRNA/RS ortogonales. Células anfitrionas se someten a ingeniería genética (incluyendo pero no limitadas a, transformadas, translicudas o transectadas) con los polinucleótidos de la invención o construcciones que incluyen un polinucleótido de la invención, incluyendo pero no limitado, un vector de la invención, que puede por ejemplo ser un vector de clonación o un vector de expresión. Por ejemplo, las regiones de codificación para el copiado ortogonal, la tRNA sintetasa ortogonal, y la proteína a derivatizar se entrelazan operativamente a elemento de control de expresión de genes que son funcionales en la célula anfitriona deseada. El vector por ejemplo puede estar en la forma de un plásmido, un cósmico, un fago, una bacteria, un virus, un plonucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos por métodos estándar incluyendo electroporación (Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), infección por vectores pirales, penetración balística de alta velocidad por pequeñas partículas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas o en la superficie (Klein et al., Nature 327. 70-73 (1987)) y/o semejantes. Las células anfitrionas de ingeniería pueden cultivarse en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para estas actividades, tal como por ejemplo etapas de cribado, promotores de activación o transformantes de selección. Estas células pueden cultivarse opcionalmente en organismos transgénicos. Otras referencias útiles incluyen pero no están limitadas a aislamiento y cultivo celular (por ejemplo para subsecuente aislamiento de ácido nucleico) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley- Liss, New Cork y las referencias ahí citadas; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag (Berlín Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleicos diana en células están disponibles, cualquiera de los cuales puede utilizarse en la invención. Estos incluyen: fusión de las células recipientes con protoplastos bacterianos que contienen el DNA, electroporación, bombardeo de proyectiles e infección con vectores virales (discutido más a continuación) etc. Células bacterianas pueden ser utilizadas para amplificar el número de plásmidos que contienen las construcciones DNA de esta invención. Las bacterias se desarrollan en fase log y los plásmidos dentro de las bacterias pueden aislarse por una variedad de métodos conocidos en la especialidad (ver por ejemplo Sambrook). Además, equipos están comercialmente disponibles para la purificación de plásmidos de bacterias (ver por ejemplo EasyPrepMR, FlexiPrepMR, ambos de GE Healthcare; StrataCleanMR de Stratagene; y QIAprepMR de Qiagen) . Los plásmidos aislados y purificados después de manipulan adicionalmente para producir otros plásmidos, empleados para transectar células o incorporados en vectores relacionados para infectar organismos. Vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de inicio de transcripción y traducción, y promotores útiles para regular la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores adicionalmente comprenden casetes de expresión genérica que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten replicación en el cásete de eucariotas o procariotas o ambos (incluyendo pero no limitados a vectores lanzadera) , y marcadores de selección tanto para sistemas procarióticos como eucarióticos. Vectores son adecuados para replicación e integración en procariotas, eucariotas o ambos. Ver Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al, Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra) . Un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para clonar se proporciona por ejemplo por la ATCC, e.g., The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al (eds) publicada por la ATCC. Procedimientos básicos adicionales para secuenciado, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideración estérica subyacentes también se encuentran en Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edición Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y actualmente cualquier ácido nucleico etiquetado, ya sea estándar o no estándar) puede ordenarse a la medida o estándar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales tales como Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponible en la red mundial en mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponible en la red mundial en genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible en la red mundial en expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchos otros. XII. Expresión en no-eucariotas y eucariotas Para obtener un alto nivel de expresión de un polipéptido hGH clonado, típicamente se subclonan polinucleótidos que codifican un polipéptido hGH de la invención en un vector de expresión que contiene un fuerte promotor para dirigir transcripción, un terminados de transcripción/traducción y si es para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de enlace ribosoma para inicio de traducción. Promotores bacterianos convenientes se conocen por aquellos con destreza ordinaria' en la técnica y se describen por ejemplo en in Sambrook et al. and Ausubel et al. Sistemas de expresión bacteriana para expresar polipéptidos hGH de la invención están disponibles en, incluyendo pero no limitados a E. coli, Bacillus sp . , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, and Salmonella (Palva et al, Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al, Nature 302:543-545 (1983)). Equipos para estos sistemas de expresión están comercialmente disponibles. Sistemas de expresión de eucarióticos para células de mamífero, levadura y células de insecto se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica y también están comercialmente disponibles.

En casos en donde los tRNA ortogonales y aminoacil tRNA sintetasa se emplean para expresar los polipéptidos hGH de la invención, se eligen células anfitrionas para expresión con base en su habilidad para utilizar los componentes ortogonales. Células anfitrionas ejemplares incluyen bacterias Gram positivas (incluyendo pero no limitadas a B . brevis, B . subtilis, o Streptomyces) y bacterias Gram Negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), así como levadura y otras células eucarióticas. Células que comprenden pares O-tRNA/O-RS pueden emplearse como se describe aquí . Una célula anfitriona eucariótica o una célula anfitriona no eucariótica de la presente invención proporcionan la capacidad para sintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. En un aspecto, la composición opcionalmente incluye, aunque en forma no limitada, al menos 10 microgramos, al menos 50 microgramos, al menos 75 microgramos, al menos 100 microgramos, al menos 200 microgramos, al menos 250 microgramos, al menos 500 microgramos, al menos 1 miligramo, al menos 10 miligramos, al menos 100 miligramos, al menos 1 gramo o mas de la proteína que comprende un aminoácido no natural, o una cantidad que puede lograrse con métodos de producción de proteína in vivo (detalles en la producción y purificación de proteínas recombinantes se proporcionan aquí) . En otro aspecto, la proteína opcionalmente esta presente en la composición a una concentración de, incluyendo pero no limitada a, al menos 10 microgramos de proteína por litro, al menos 50 microgramos de proteína por litro, al menos 75 microgramos de proteína por litro, al menos 100 microgramos de proteína por litro, al menos 200 microgramos de proteína por litro, al menos 250 microgramos de proteína por litro, al menos 500 microgramos de proteína por litro, al menos 1 miligramo de proteína por litro, al menos 10 miligramos de proteína por litro o más, incluyendo pero no limitado a un lisado celular, un amortiguador, un amortiguador farmacéutico u otra suspensión líquida (incluyendo pero no limitada a, en un volumen de, incluyendo pero no limitado a en cualquier punto desde aproximadamente 1 ni a aproximadamente 100 L o más) . La producción de grandes cantidades (incluyendo pero no limitadas a, mayores a lo típicamente posible con otros métodos, incluyendo pero no limitados a, traducción in Vitro (de una proteína en una célula eucariótica o una célula no eucariótica incluyendo al menos un aminoácido no natural es una característica de la invención.

Una célula anfitriona eucariótica o una célula anfitriona no eucariótica de la presente invención proporciona la capacidad para sintetizar bio-proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. Por ejemplo, proteínas que comprenden un aminoácido no natural pueden producirse a una concentración de, incluyendo pero no limitada a, cuando menos 10 µg/litro, al menos 50 µg/litro, al menos 75 µg/litro, al menos 100 µg/litro, al menos 200 µg/litro, al menos 250 µg/litro, o al menos 500 µg/litro, al menos 1 mg/litro, al menos 2mg/litro, al menos 3 mg/litro, al menos 4 mg/litro, al menos 5 mg/litro, al menos 6 mg/litro, al menos 7 mg/litro, al menos 8 mg/litro, al menos 9 mg/litro, al menos 10 mg/litro, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro o mas de proteína en un extracto celular, lisado celular, medio de cultivo, un amortiguador y/o semejantes. Sistemas de expresión, cultivo y aislamiento hGH puede expresarse en cualquier cantidad de sistemas de expresión convenientes incluyendo por ejemplo levadura, células de insecto, células de mamífero y bacterias. Una descripción de sistemas de expresión ejemplares se proporciona a continuación. Levadura Como se emplea aquí, el término "levadura" incluye cualquiera de las diversas levaduras capaces de expresar un gen que codifica hGH. Estas levaduras incluyen pero no están limitadas a levaduras ascosporogenosas (Endomycetales) , levaduras basidioesporogenosas y levaduras que pertenecen al grupo hongos imperfectos (Blastomycetes) . Las levaduras ascosporogenosas están divididas en dos familias, Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae . Esta última comprende cuatro subfamilias Schizosaccharomycoideae (e.g., género Schizosaccharomyces) , Nadsonioideae, Lipomycoideae and Saccharomycoideae (por ejemplo géneros Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces) . Las levaduras basidioesporogenosas incluyen los géneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium y Filobasidiella . Levaduras que pertenecen al grupo hongos imperfectos (Blastomycetes) se dividen en dos familias Sporobolomycetaceae (por ejemplo géneros Sporobolomyces y Bullerd) y Cryptococcaceae (por ejemplo género Candida) . De interés particular para utilizar con la presente invención son especies dentro de los géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis y Candida, incluyendo pero no limitadas a P. pastoris, P. guillerimondii , S. cerevisiae, S. carisbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa, y H. polymorpha. La selección de levadura conveniente para expresión de hGH está dentro de la destreza de la persona con destreza ordinaria en la técnica. Para seleccionar anfitriones de levadura para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos que se muestra que tienen por ejemplo buena capacidad de secreción baja actividad proteolítica y robustez total. Levaduras en general están disponibles de una variedad de fuentes incluyendo pero no limitadas a Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) , and the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). El término "anfitrión de levaduras" o "célula anfitriona de levadura" incluye levadura que puede ser, o ha sido empleada como un recipiente para vectores recombinantes u otro DNA de transferencia. El término incluye la progenia de la célula anfitriona de levadura original que ha recibido los vectores recombinantes u otro DNA de transferencia. Se entiende que la progenia de unas sola célula precursora puede no necesariamente ser completamente idéntico en morfología o en complemento DNA genómico o total al precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenia de una célula precursora que es suficientemente similar a la precursora al caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótido que codifica un hGH, se incluye en la progenia pretendida por esta definición. Vectores de expresión y transformación, incluyendo replicones extracromosomales o vectores de integración, se han desarrollado para transformación en muchos anfitriones de levadura. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para S. cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1989) 122:19; Ito et al., J.

BACTERIOL . (1983) 153:163; Hinnen et al., PROC. NATL .

ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL . CELL . BIOL . (1986) 6:142); C. mal tosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL . (1985) 25:141); H. polymorpha (Gleeson et al., J". GEN. MICROBIOL . (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., MOL . GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J". BACTERIOL . (1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J".

BACTERIOL . (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J". BASIC MICROBIOL . (1985) 25:141); P. pastoris (Patente de los E.U.A números 5,324,639; 4,929,555; y 4,837,148; Cregg et al., MOL . CELL . BIOL . (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., NATURE (1982) 300:706); y Y. lipolytica ; A . nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS . RES . COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221; y Yelton et al., PROC. NATL . ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479) ; T. reesia (EP 0 244 234) ; y hongos filamentosos tales como por ejemplo neuroespora, penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357) , cada uno de el cuales aquí se incorpora por referencia. Secuencias de control para vectores de levadura se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica e incluyen, pero no están limitados a regiones promotoras de genes tales como alcohol de hidrogenasa (7ADH) (EP 0 284 044) ; enolasa; glucocinasa; glucosa-e-fosfato isomerasa; gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (BOQUETE o GAPDH) ; hexocinasa; fosfofructocinasa; 3-fosfogliceratomutasa; y piruvatocinasa (PyK) (EP 0 329 203) . El gen PH05 de levadura, que codifica fosfatasa acida, también proporciona secuencias promotoras útiles (Miyanohara et el al, PROC. NATL . ACAD. SCI . USA (1983) 80:1). Otras secuencias promotoras convenientes para utilizar con anfitriones de levadura pueden incluir los promotores para quinasa 3-fosfoglicerato (Hitzeman et al., J". BIOL .

CHEM. (1980) 255:12073; y otras enzimas glicolíticas, tales como piruvato descarboxilasa, triosafosfato isomerasa, y fosfoglucosa isomerasa (Holanda et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess et al., ADV del J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:7:149). Promotores de levadura inducibles tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento pueden incluir las regiones promotoras para el alcohol dehidrogenasa 2 ; isocitocromo C; fosfatasa acida; metalotioneina; gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa; enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno; y enzimas responsables por utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores convenientes para utilizar en expresión de levadura además se describen en EP 0 073 657. Mejoradores de levadura también pueden emplearse con promotores de levadura. Además, promotores sintéticos también pueden funcionar como promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias de activación corriente arriba (UAS = upstream activating sequences) de un promotor de levadura pueden unirse con la región de activación de transcripción de otro promotor de levadura, creando a un promotor híbrido sintético. Ejemplos de estos promotores híbridos incluyen la secuencia regulatoria ADH enlazada a la región de activación de transcripción GAP. Ver las patentes de los E.U.A. números 4,880,734 y 4,876,197. Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que consisten de las secuencias regulatorias de los genes ADH2 , GAL4 , GALIO, o PH05, combinadas con la región de activación de transcripción de un gene de enzima glicolítica tal como GAP o PyK. Ver Ep 0 164 556. Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen natural de origen no-levadura que tienen la capacidad por ligar polimerasa RNA de levadura e iniciar la transcripción. Otros elementos de control que pueden comprender parte de los vectores de expresión de levadura incluyen terminadores, por ejemplo de GAPDH o los genes enolasa (Holland et al., J. BIOL . CHEM. (1981) 256:1385). Además, el origen de replicación del origen de plásmido 2µ es adecuado para levadura. Un gen de selección conveniente para utilizar en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura. Ver Tschumper et al., GENE (1980) 10:157; Kingsman et al., GENE (1979) 7:141. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad por desarrollar en triptófano. Similarmente, cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2.

Métodos para introducir DNA exógeno en anfitriones de levadura se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica y típicamente incluyen, pero no están limitados a, ya sea la transformación de esferoplastos o de células anfitrionas de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Por ejemplo, transformación de levadura pueden llevarse a cabo de acuerdo con el método descrito en Hsiao et al . , PROC. NATL . ACAD. SCI . USA (1979) 76:3829 and Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946. Sin embargo, otros métodos para introducir DNA en células tales como por inyección nuclear, electroporación o fusión de protoplastos también pueden emplearse como se describe en general en SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB . MANUAL (2001). Células anfitrionas de levadura pueden entonces cultivarse utilizando técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Otros métodos para expresión de proteínas heterólogas en células anfitrionas de levadura son conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Ver en general la solicitud de patente de los E.U.A número 20020055169, patentes de los E.U.A números 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723; 6,017,731; 5,674,706; 5,629,203; 5,602,034; y 5,089,398; patentes reexaminadas de los E.U.A números RE37,343 y RE35,749; solicitudes de patente publicadas del PCT WO 99/078621; WO 98/37208; y WO 98/26080; solicitudes de patente europeas EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; y EP 0 164 556, que se incorporan aquí por referencia. Ver también Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2) :79-93; Romanos et al., YEAST (1992) 8 (6) : 423-488 ; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7, cada una se incorpora aquí por referencia. Las cepas anfitrionas de levadura pueden desarrollarse en fermentadores durante la etapa de amplificación utilizando métodos de fermentación por lotes de alimentación estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Los métodos de fermentación pueden adaptarse para tomar en cuenta diferencias en la ruta de utilización de carbón del anfitrión de levadura particular o modo de control de expresión. Por ejemplo, fermentación de un anfitrión de levadura de Saccharomyces puede requerir una alimentación de glucosa sencilla, fuente de nitrógeno compleja (por ejemplo hidrolisado de caseína), y suplemento de múltiples vitaminas. En contraste, la levadura metilotrófica P . pas tori s puede requerir glicerol, metanol y alimentaciones de mineral en trazas, pero sólo sales de amonio simples (nitrógeno) para óptimo crecimiento y expresión. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A número 5,324,639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; y Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113. Estos métodos de fermentación sin embargo pueden tener ciertas características comunes independientes de la cepa anfitriona de levadura empleada. Por ejemplo, un nutriente limitante de crecimiento, típicamente carbono, puede agregarse al fermentador durante la fase de amplificación para permitir crecimiento máximo. Además, métodos de fermentación en general emplean un medio de fermentación diseñado para contener cantidades adecuadas de carbono, nitrógeno, sales básales, fósforo y otros nutrientes menores (vitaminas, minerales y sales en trazas, etc.) . Ejemplos de medio de fermentación adecuado para utilizar con Pichia se describen en las patentes de los E.U.A números 5,324,639 y 5,231,178, que aquí se incorporan por referencia . Células de Insecto Infectadas con Baculovirus El término "anfitrión de insecto" o "célula anfitriona de insecto" se refiere a un insecto que puede ser o ha sido empleado como un recipiente para vectores recombinantes u otro DNA de transferencia. El término incluye la progenie de la célula anfitriona de insecto original que se a transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula precursora puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento DNA total o genómico al precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula precursora que es suficientemente similar al precursor para caracterizar por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido hGH, se incluyen en la progenie pretendida por esta definición. La selección de células de insecto convenientes para expresión de hGH se conoce por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Varias especies de insectos están bien descritas en la técnica y están comercialmente disponibles incluyendo Aedes aegypti , Bombyx mori , Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni . Para seleccionar anfitriones de insectos para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos que muestran tener, inter alia, buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica y robustez total . Insectos en general están disponibles de una variedad de fuentes incluyendo pero no limitaba a, Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) ; and the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . En general, los componentes de un sistema de expresión de insectos infectados con baculovirus incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de baculovirus, y un sitio de restricción conveniente para inserción del gen heterólogo a expresar; un baculovirus del tipo silvestre con secuencias homologas al fragmento específico de baculovirus en el vector la transferencia (esto permite la recombinación homologa del gen heterólogo en el genoma de baculovirus) ; y células anfitrionas de insecto apropiadas y medio de crecimiento. Los materiales, métodos y técnicas empleados para construir vectores, transectar células, seleccionar placas, desarrollar células en cultivo y semejantes se conocen en la técnica y están disponibles manuales que describen estas técnicas. Después hace insertar el gen heterólogo en el vector de transferencia, el vector y genoma viral tipo silvestre se transfectan en una célula anfitriona de insecto en donde el vector y el genoma viral se recombinan. El virus recombinante empacado se expresa y se identifican en placas recombinantes y purifican. Materiales y métodos para sistemas de expresión de células de insecto/baculovirus están comercialmente disponibles en forma de paquete o equipo, por ejemplo de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) . Estas técnicas en general se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad y se describen completamente en SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987), aquí incorporado por referencia. Ver también RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); y O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS : A LABORATORY MANUAL (1992) . Sin duda, la producción de diversas proteínas heterólogas utilizando sistemas de expresión de células de insecto/baculovirus se conoce por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Ver por ejemplo las patentes de los E.U.A números 6,368,825; 6,342,216 6,338, 846 6,261,805; 6,245,528, 6,225,060 6, 183, 987 6,168,932 6,126,944; 6,096,304; 6,013,433 5,965,393 5,939,285 5,891,676; 5,871,986; 5,861,279 5, 858,368 5, 843, 733 5,762,939; 5,753,220; 5,605,827 5, 583, 023 5,571,709 5,516,657; 5,290,686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332 WO 96/29400 WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672 WO 93/03173 WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801 WO 90/14428 O 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186 WO 90/01556 WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082, que se incorporan aquí por referencia. Vectores que son útiles en sistemas de expresión de células de insecto/baculovirus se conocen en la técnica e incluyen por ejemplo expresión de insectos y vectores de transferencia derivados del virus de polihedrosis nuclear Autographa calif ornica baculovirus (AcNPV) que es un vector de expresión viral independiente auxiliar. Vectores de expresión viral derivados de este sistema usualmente utilizan el promotor de gen de polihedrina viral fuerte para dirigir la expresión de genes heterólogos. Ver en general O'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS : A LABORATORY MANUAL (1992) . Antes de insertar el gen ajeno en el genoma de baculovirus, los componentes anteriormente descritos que comprenden un promotor, líder (si se desea) , secuencia de codificación de interés, y secuencia de terminación de transcripción, típicamente se ensamblan en una construcción de sustitución intermedia (vector de transferencia) . Construcciones de sustitución intermedias a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento cromosomal extra (por ejemplo plásmidos) capaz de mantenimiento estable en un anfitrión, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de esta manera que se mantenga en un anfitrión conveniente para clonación y amplificación. Más específicamente, el plásmido puede contener la señale de poliadenilasión polihedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177) y un gen de resistencia a ampicilina (amp) procariótico y origen de replicación para selección y propagación en E. coli . Un vector de transferencia comúnmente empleado para introducir genes ajenos en AcNPV es pAc373. Muchos otros vectores, conocidos por aquellos con destreza en la técnica, también se han diseñado incluyendo, como por ejemplo pVL985, que altera el codón de inicio polihedrina de ATG a ATT, y que introduce el sitio de clonación BamHl 32 pares base corriente abajo de ATT. Ver Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989). Otros vectores comercialmente disponibles incluyen por ejemplo PBlueBac4.5/V5-HÍS; pBlueBacHis2 ; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . Después de inserción del gen heterólogo, el vector de transferencia y genoma baculoviral de tipo silvestre se co-transfectan en una célula anfitriona de insecto. Métodos para introducir DNA heterólogo en el sitio deseado en el virus baculovirus se conoce en la técnica. Ver SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith et al., MTL . CELL . BIOL . (1983) 3:2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31. Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como un gen polihedrina, por recombinación de cruce doble homologa; inserción también puede ser en un sitio de enzima de restricción de ingeniería en el gen de baculovirus deseado. Ver Miller et al., BiOESSAYS (1989) 11(4): 91. Transfección puede lograrse por electroporación. Ver TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995) ; Mann and King, J". GEN. VIROL . (1989) 70:3501. En forma alterna, pueden emplearse liposomas para transfectar las células de insecto, con el vector de expresión recombinante y baculovirus. Ver por ejemplo, Liebman et al., BlOTECHNlQUES (1999) 26(1) :36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998) ; Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost et al., GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. BiOL . CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J". BiOL . CHEM. (1996) 271 (37) : 22376 ; Reverey et al., J. BiOL . CHEM. (1996) 271 (39) : 23607-10 ; Stanley et al., J. BiOL . CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VlROL . (1994) 68(2) :766; and Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2) :274. Liposomas comercialmente disponibles incluyen por ejemplo Cellfectin® y Lipofectin® (Invitrogen, Corp., (Carlsbad, CA) . Además, transfección de fosfato de calcio se puede emplear. Ver TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995) ; Kitts, NAR (1990) 18(19) :5667; and Mann and King, J. GEN. VlROL. (1989) 70:3501. Vectores de expresión de Baculovirus usualmente contienen un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovius es cualquier secuencia de DNA capaz de ligar una RNA polimerasa baculovirus e iniciar la transcripción corriente abajo (3 ' ) de una secuencia de codificación (por ejemplo gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que usualmente se coloca próxima al extremo 5 ' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción típicamente incluye un sitio de enlace RNA polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor de baculovirus también puede tener un segundo dominio denominado un mejorador, que de estar presente es usualmente distante al gen estructural. Aún más, la expresión ya puede ser regulada o constitutiva. Genes estructurales, transcritos en forma abundante en últimos tiempos del ciclo de infección, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína polihedron viral (FRIESEN ET AL., Tlie Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EP 0 127 839 and 0 155 476) and the gene encoding the plO protein (Vlak et al., J. GEN. VlROL . (1988) 69:765. El vector de expresión baculovirus recientemente formado se empaca en un baculovirus recombinante infeccioso y placas desarrolladas subsecuentemente pueden purificarse por técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad Ver Miller et al., BlOESSA YS (1989) 11(4): 91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987) . Vectores de expresión de baculovirus recombinantes se han desarrollado para infección en diversas células de insecto. Por ejemplo, baculovirus recombinante se han desarrollado para inter alia , Aedes aegypti (ATCC No. CCL- 125) , Bombyx mori (ATCC No. CRL- 8910) , Drosophila melanogaster (ATCC No. 1963) , Spodoptera frugiperda , and Trichoplusia ni . Ver NATURE (1986) 321:718; Carbonell et al., J. ViROL . (1985) 56:153; Smith et al., MOL . CELL . BIOL . (1983) 3:2156. Ver en general Fraser et al., IN VITRO CELL . DEV. BIOL . (1989) 25:225. Más específicamente, las líneas celulares empleadas para sistemas de vector expresión de baculovirus comúnmente incluyen, pero no están limitadas a Sf9 ( Spodoptera frugiperda) (ATCC No. CRL-1711) , Sf21 ( Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., Cat. No. 11497-013 (Carlsbad, CA) ) , Tri-368 (Trichopulsia ni), and High-FiveMR BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni) . Células y medio de cultivo están comercialmente disponibles tanto para expresión directa como fusión de polipéptidos heterólogos en un baculovirus/expresión, y tecnología de cultivo celular en general se conoce por aquéllos con destreza ordinaria en la especialidad. E. coli , especies Pseudomonas y otros procariotas Técnicas de expresión bacterianas se conocen para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Una amplia variedad de vectores están disponibles para utilizar en anfitriones bacterianos. Los vectores pueden ser de una sola copia o vectores de múltiples copias altas o bajas. Vectores pueden servir para clonación y/o expresión. En vista de la amplia literatura referente a vectores, la disponibilidad comercial de muchos vectores e incluso manuales que describen vectores y sus mapas y características de restricción, no se requiere discusión extensa aquí. Como es bien conocido, los vectores normalmente involucran marcadores que permiten selección, estos marcadores pueden proporcionar resistencia a agente citotóxico, prototropía o inmunidad. Frecuentemente, una pluralidad de marcadores están presentes que proporcionan diferentes características. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia DNA capaz de ligar RNA polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción corriente abajo (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo gen estructural) en mR?A. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que usualmente se coloca próxima al extremo 5 ' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción típicamente incluye un sitio enlace R?A polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio denominado un operador, que puede súper poner a un sitio de enlace RNA polimerasa adyacente en el cual empieza la síntesis de RNA . El operador permite transcripción regulada (inducible) negativa, como una proteína represora de gen puede ligar el operador y de esta manera inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en la ausencia de elementos regulatorios negativos, tales como el operador. Además, regulación positiva puede lograrse por una secuencia de enlace de proteína activadora de gen, que de estar presente es usualmente próxima (5') a la secuencia de enlace RNA polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de gen es la proteína activadora de catabolito (CAP=catabolite activator protein) , que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli ) [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173] . La expresión regulada puede por lo tanto ser ya positiva o negativa, de manera ya sea mejorando o reduciendo la transcripción. Secuencias que codifican enzimas de ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas que metabolizan azúcar tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056], y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel et al., Nuc . ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL . ACIDS RES . (1981) 9:731; patente de los E.U.A número 4,738,921; publicaciones EPO números 036 776 y 121 775, que se incorporan aquí por referencia] . El sistema promotor g-lactamatasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Ed. I. Gresser) ] , bacteriophage lambda PL [Shimatake et al . , NATURE (1981) 292:128] y sistemas promotores T5 [patente de los E.U.A número 4,689,406] también proporcionan secuencias promotoras útiles. Métodos preferidos de la presente invención utilizan fuertes promotores, tales como el promotor T7 para inducir hGH en altos niveles. Ejemplos de éstos vectores se conocen por aquéllos con destreza ordinaria en especialidad e incluye la serie pET29 de Novagen, y los vectores thepPOP descritos en WO99/05297. Estos sistemas de expresión producen altos niveles de hGH en el anfitrión sin comprometer la viabilidad de células anfitrionas o los parámetros de crecimiento. pET19 (Novagen) es otro vector conocido en la técnica. Además, promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza también funciona como promotores bacterianos. Por ejemplo, secuencias de activación de transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden unirse con las secuencias operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [patente de los E.U.A Número 4,551,433, que se incorpora aquí por referencia] . Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido que comprende tanto las secuencias operón lac y promotor trp regulados por el represor lac [Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL . ACAD. SCI . (1983) 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural, de origen no-bacteriano que tienen la capacidad por ligar RNA polimerasa bacteriana e iniciar transcripción. Un promotor de origen natural de origen no-bacteriano también puede acoplarse con una RNA polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema promotor/T7 R?A polimerasa bacteriofase es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL . BIOL . (1986) 189: 113; Tabor et al., Proc Nati . Acad . Sci . (1985) 82: 1074]. Además, un promotor híbrido también puede comprender un promotor bacteriófago y una región de operador E. coli (publicación de EPO ?o . 267 851) . Además de una secuencia promotora funcional, un sitio de enlace de ribosoma eficiente también es útil para la expresión de genes ajenos en procariotas. En E. coli , el sitio de enlace ribosoma se denomina la secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3 a 9 nucleótidos de longitud ubicada a 3-11 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio [Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. La secuencia SD se considera que promueve enlaces de niRNA al ribosoma al aparear bases entre la secuencia de SD y el 3' y de 16S rRNA de E. coli [Steitz et al. " Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA" , In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)] . Para expresar genes eucarióticos y genes procarióticos con sitio de enlace de ribosoma débil [Sambrook et al. " Expression of cloned genes in Escherichia coli " , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989] . El término "anfitrión bacteriano" o "célula anfritiona bacteriana" se refiere a una bacteria que puede ser o ha sido empleada como un recipiente para vectores recombinantes u otro DNA de transferencia. El término incluye la progenie de la célula anfitriona bacteriana original que se a transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula progenitora o precursora no necesariamente puede ser completamente idéntica en morfología o en complemento DNA total o genómico al precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula precursora que es suficiente similar al precursor para caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un hGH, se incluye en la progenie pretendida por esta definición. La selección de bacterias anfitrionas convenientes para expresión de hGH se conoce por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Para seleccionar anfitriones bacterianos para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos que muestran tener, ipter alia, buena capacidad de formación de cuerpos de inclusión, baja actividad proteolítica y robustez total. Anfitriones bacterianos en general están disponibles de una variedad de fuentes incluyendo pero no limitados a, Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) ; y the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . Fermentación industrial/farmacéutica en general utiliza bacterias derivadas de cepas K (por ejemplo W3110) O bacterias derivadas de cepas B (por ejemplo BL21) . Estas cepas son particularmente útiles debido a que sus parámetros de crecimiento son extremadamente bien conocidos y robustos. Además, estas cepas no son patogénicas, lo que es importante comercialmente por razones de seguridad y ambientales. En una modalidad, la cepa de E. coli es una cepa de DH10B, incluyendo pero no limitada a DHlOB(fis). Otros ejemplos de anfitriones de E. coli convenientes incluyen pero no están limitados a cepas BL21, DH10B, o sus derivados. En otra modalidad, el anfitrión E. coli es una cepa de W3110. Cepas de células anfitrionas recombinantes pueden modificarse por mutación genética para optimizar características deseadas. Por ejemplo, cepas de células anfitrionas pueden ser modificados genéticamente para modular la expresión de genes importantes metabólicamente, tales como aquellos involucrados en metabolismo de fuentes del carbono, metabolismo de aminoácidos o producción de proteasa. Estos genes puedan ser mutados para disminuir, incrementar, desactivar (knock-out) o activar (knock- in) la expresión en la cepa anfitriona deseada. La cepa W3110, puede modificarse para efectuar una mutación genética en uno o más genes involucrados en el metabolismo de arabinosa incluyendo pero no limitados al gen araB . Las cepas, por ejemplo pueden ser modificadas para efectuar una mutación genética o hacer inoperativos a otros genes. Métodos para mutar o hacer inoperativos a genes se conocen por una persona con destreza en la especialidad. También pueden mutarse cepas para modular actividad de proteasa endógena para incrementar la producción de hGH de longitud integrada y/o minimizar la necesidad por la adición de inhibidores químicos exógenos a proteasa. Otras cepas de células anfitrionas incluyen pero no están limitadas a BL21. En otra modalidad de los métodos a la presente invención, el anfitrión E. coli es una cepa menos proteasa incluyendo pero no limitada a OMP- y LON- . La cepa de célula anfitriona puede ser una especie de Pseudomonas, incluyendo pero no limitada a Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, and Pseudomonas putida . Pseudomonas fluorescens biovar 1, designada cepa MB101 , se conoce que es útil para producción recombinante y está disponible para procesos de producción de proteínas terapéuticas. Ejemplos de un sistema de expresión de Pseudomonas incluye el sistema disponible de The Dow Chemical Company como una cepa anfitriona (disponible en la Red Mundial en Midland, MI de dow.com) . La patente de los E.U.A números 4,755,465 y 4,859,600, que aquí se incorporan por referencia, describen el uso de cepas de Pseudomonas como una célula anfitriona para la producción de hGH. Una vez que una cepa de célula anfitriona recombinante se ha establecido (es decir la construcción de expresión se ha introducido en la célula anfitriona y células anfitrionas con la construcción de expresión adecuada se aislan) , la cepa de célula anfitriona recombinante se cultiva bajo condiciones apropiadas para producción de hGH. Como será aparente para una persona con destreza en la especialidad, el método de cultivo de la cepa de célula anfitriona recombinante dependerá de la naturaleza de la construcción de expresión utilizada y la identidad de la célula anfitriona. Cepas anfitrionas recombinantes normalmente se cultivan utilizando métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Células anfitrionas recombinantes típicamente se cultivan en medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales y inorgánicas y opcionalmente contienen vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento y otros suplementos de cultivo proteínaceo conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Medio o composición de alimentación y/o requerimientos de nutrientes para crecimiento óptimo pueden diferir de diferentes células anfitrionas recombinantes y/o como para preparaciones de menor contra mayor escala. Metales en trazas o vitaminas requeridas, por ejemplo pueden alterarse conforme cambian las condiciones de crecimiento y/o se emplean células anfitrionas alternativas. Para optimizar la producción de polipéptido hGH, condiciones adecuadas para inducción pueden ser alteradas dependiendo de la célula anfitriona recombinante empleada, la construcción de expresión y/o modificaciones tales como mutaciones hechas a la célula anfitriona, incluyendo pero no limitadas a alteraciones en niveles de arabinosa para inducción. Niveles de arabinosa en la fermentación pueden estar entre aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 0.1%, incluyendo pero no limitados a 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.0095%, 0.009%, 0.0085%, 0.008%, 0.0075%, 0.007%, 0.0065%, 0.006%, 0.0055%, 0.005%, 0.0045%, 0.004%, 0.0035%, 0.003%, 0.0025%, 0.002%, 0.0015%, 0.001%, 0.00095%, 0.0009%, 0.00085%, 0.0008%, 0.00075%, 0.0007%, 0.00065%, 0.0006%, 0.00055%, 0.0005%, 0.00045%, 0.0004%, 0.00035%, 0.0003%, 0.00025%, 0.0002%, 0.00015%, 0.0001%. En algunas modalidades, los niveles de arabinosa están entre 0.0005% y 0.05%. En algunas modalidades, los niveles de arabinosa están entre 0.001% a 0.02%. Alteraciones para proporcionar una superior densidad celular para cosecha también pueden realizarse; etapas incluyen, pero no están limitadas a, la adición de una segunda alimentación puede realizarse. Medio líquido para cultivo de células anfitrionas puede contener opcionalmente antibióticos o antifungales para evitar el crecimiento de microorganismos y/o compuestos indeseables, incluyendo pero no limitados a antibióticos para seleccionar células anfitrionas que contienen el vector de expresión. Células anfitrionas recombinantes pueden cultivarse en formatos por lotes o continuos, ya sea con cosechas de células (en el caso en donde la hGH variante se acumula intracelularesmente) o cosechar sobrenadante de cultivo ya sea en formatos por lotes o continuos. Para producción en células anfitrionas procarióticas, se prefieren cosechas de células y cultivo por lotes. Supresión modulada, supresión continua o supresión inducida pueden realizarse. Es fácilmente aparente por aquellos con destreza en la especialidad que el aminoácido no naturalmente codificado puede agregarse al cultivo celular en una amplia variedad de diferentes tiempos durante el crecimiento celular, o puede estar presente en forma continua durante el crecimiento celular. La adición de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados para incorporación en hGH puede ocurrir antes de inducción, al tiempo de inducción o después se inducción de expresión hGH por las células anfitrionas. En una modalidad, el aminoácido no naturalmente codificado se agrega antes de inducción de expresión de hGH. En una modalidad, el aminoácido no naturalmente codificado se agrega a aproximadamente una hora antes de inducción. En otra modalidad, los aminoácidos no naturalmente codificados están presentes a través del crecimiento celular. Células anfitrionas recombinantes que expresan hGH, ya sea solubles, secretadas o insolubles, pueden desarrollarse en una amplia variedad de volúmenes de cultivo. Los procesos a la presente invención son susceptibles a volúmenes de cultivo en pequeña escala de laboratorio así como en grandes volúmenes a escala comercial . Es fácilmente aparente a una persona con destreza ordinaria en la especialidad que procesos de la presente invención aquí descritos se puedan ajustar en escala a volúmenes de cultivo más grandes. Volúmenes de cultivo comerciales a gran escala pueden ser de un amplio rango, por ejemplo desde uno o más litros cada uno hasta cientos de litros, miles de litros, 5000 litros, 10,000 litros, 20,000 litros, 30,000 litros, 40,000 litros, 50,000 litros, hasta 100,000 litros o más. Para producir volúmenes a gran escala, la modificación a algunas etapas del proceso puede ser necesaria y es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. La hGH de la invención normalmente se purifica después de expresión en sistemas recombinantes. hGH puede purificarse de células anfitrionas o medio de cultivo por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. hGH producida en células anfitrionas bacterianas puede ser débilmente soluble o insoluble (en la forma de cuerpos de inclusión) . En el caso de proteína insoluble, la proteína puede recolectarse de lisados de células anfitrionas por centrifugación y además puede ser seguida por homogeneización de las células. En el caso de proteína deficientemente soluble, compuestos incluyendo pero no limitados a polietilen imina (PEÍ) pueden agregarse para inducir la precipitación de proteína parcialmente soluble. La proteína precipitada puede entonces recolectarse convenientemente por centrifugación. Células anfitrionas recombinante pueden romperse u homogenizarse para liberar los cuerpos de inclusión del interior de las células utilizando una variedad de métodos conocidos por aquéllos con destreza ordinaria en la especialidad. Ruptura de células anfitrionas u homogeneización pueden realizarse utilizando técnicas bien conocidas incluyendo pero no limitadas a ruptura de células enzimáticas, sonicación, homogenización dounce, o ruptura con alta liberación de presión. En una modalidad del método de la presente invención, la técnica de liberación con alta presión se emplea para romper las células anfitrionas de E. coli para liberar los cuerpos de inclusión de hGH. hGH insoluble o precipitado puede entonces solubilizarse utilizando cualquiera de una cantidad de agentes de solubilización convenientes conocidos en la especialidad. hGH puede estar solubilizado con urea o hidrocloruro de guanidina. El volumen de la hGH solubilizado deberá minimizar de manera tal que pueden producirse grandes lotes utilizando tamaño de lotes convenientemente manejables. Este factor puede ser significante en un ambiente comercial a gran escala en donde el anfitrión recombinante puede desarrollarse en lotes que son de miles de litros en volumen. Además, cuando se fabrica hGH en un ambiente comercial a gran escala, en particular para usos farmacéuticos humanos, evitar productos químicos fuertes que pueden dañar la maquinaria y recipientes, o el propio producto de proteína, habrán de evitarse, de ser posible. Se ha mostrado en el método de la presente invención que el agente de desnaturalización más suave urea puede utilizarse para solubilizar los cuerpos de inclusión hGH en lugar del agente de desnaturalización más duro hidrocloruro de guanidina. El uso de urea reduce significativamente el riesgo de daño a equipo de acero inoxidable utilizado en el proceso de fabricación y purificación de hGH mientras que solubiliza eficientemente los cuerpos de inclusión hGH. En el caso de proteína hGH soluble, la hGH puede secretarse en espacio periplásmico o en el medio de cultivo. Además, hGH soluble puede estar presente en el citoplasma de las células anfitrionas. Puede ser conveniente el concentrar hGH soluble antes de realizar las etapas de purificación. Técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad pueden emplearse para concentrar hGH soluble por ejemplo de lisados celulares o medio de cultivo. Además, técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad pueden utilizarse para romper células anfitrionas y liberar hGH soluble de citoplasma o espacio periplásmico de las células anfitrionas. Cuando hGH se produce como una proteína de fusión, las secuencias de fusión puede retirarse. Retirar una secuencia de fusión puede lograrse por esición enzimática o química. La remoción enzimática de secuencias de fusión puede lograrse utilizando métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. La selección de enzima para retirar la secuencia de fusión será determinada por la identidad de la fusión, y las condiciones de reacción serán especificadas por la selección de enzima como será aparente para una persona con destreza ordinaria en la especialidad. La escisión química puede lograrse utilizando reactivos conocidos por aquellos con destreza ordinaria la especialidad, incluyendo pero no limitados a bromuro de cianógeno, TEV proteasa y otros reactivos. La hGH escindida puede purificarse de la secuencia de fusión escindida por métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Estos métodos serán determinados por la identidad y propiedad de la secuencia de fusión y la hGH, como será aparente para una persona con destreza ordinaria en la especialidad. Métodos para purificación pueden incluir, pero no están limitados a cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio de iones o diálisis o cualquiera de sus combinaciones. hGH puede ser purificada para retirar DNA de la solución de proteína. DNA puede retirarse por cualquier método conveniente conocido en la especialidad, tal como precipitación o cromatografía de intercambio de iones, pero puede retirarse por precipitación con un agente de precipitación de ácido nucleico, tal como, pero no limitado a sulfato de protamina. hGH puede separarse del DNA precipitado utilizando métodos bien conocidos estándar, incluyendo pero no limitados a centrifugación o filtración. La remoción de moléculas de ácido nucleico anfitrionas es un factor importante en un ambiente en donde la hGH habrá de utilizarse para tratar a humanos y los métodos de la presente invención reducen DNA de células anfitrionas a niveles farmacéuticamente aceptables. Métodos para fermentación a escala pequeña o a gran escala también puede utilizarse en expresión de proteínas, incluyendo pero no limitados a fermentadores, matraces de agitación, biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibras huecas, sistemas de cultivo de botellas giratorios, y sistemas de biorreactores de tanque agitado. Cada uno de estos métodos puede realizarse en un proceso de modo por lotes, lotes de alimentación o continuos. Polipéptidos hGH humanos de la invención en general puede recuperarse utilizando métodos estándar en la técnica. Por ejemplo, medio de cultivo o lisado celular puede centrifugarse o filtrarse para retirar desechos celulares. El sobrenadante puede concentrarse o diluirse a un volumen deseado o diafiltrarse en un amortiguador conveniente para acondicionar la preparación para mayor purificación. Purificación del polipéptido hGH puede incluirse para formas desamidadas y recortadas de la variante de polipéptido hGH de la forma intacta. Cualquiera de los siguientes procedimientos ejemplares puede emplearse para purificación de polipéptidos hGH de la invención: Cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de aniones o cationes (utilizando, incluyendo pero no en forma limitada a DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; cromatografía de líquido con alto desempeño (HPLC) ; HPLC de fase inversa; filtración de gel (utilizando, incluyendo pero no limitado a SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de exclusión de tamaño; cromatografía de quelato de metal; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo pero no limitados a enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (incluyendo pero no limitado a precipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción. Proteínas de la presente invención incluyendo pero no limitadas a proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, anticuerpos a proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, socios de enlace para proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, etc. pueden purificarse, ya sea parcialmente o sustancialmente hasta homogeneidad, de acuerdo con procedimientos estándar conocidos a y utilizados por aquellos con destreza en la técnica. De acuerdo con esto, polipéptidos de la invención pueden recuperarse y purificarse por cualquiera de una cantidad de métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la técnica, incluyendo pero no limitados a precipitación de etanol o sulfato de amonio, extracción de ácido base, cromatografía en columna, cromatografía en columna de afinidad, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía con lectina, electroforesis en gel y semejantes. Pueden emplearse etapas de plegado de proteínas, como se desee, para producir proteínas maduras correctamente plegadas. Cromatografía de líquido de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de afinidad u otros métodos convenientes pueden emplearse en etapas de purificación finales en donde se desea alta pureza. En una modalidad, anticuerpos elaborados contra aminoácidos no naturales (o proteínas que comprenden aminoácidos no naturales) se emplean como reactivos de purificación, incluyendo pero no limitados a purificación basada en afinidad de proteínas que comprenden uno o más aminoácidos no naturales. Una vez purificados, parcialmente o a homogeneidad según se desee, los polipéptidos se emplean opcionalmente para una amplia variedad de servicios, incluyendo pero no limitados a como componentes de ensayo, terapéuticos, profilaxis, diagnóstico, reactivos de investigación y/o como inmunógenos para la producción de anticuerpos. Además de otras referencias aquí anotadas, una variedad de métodos de plegado de proteínas/purificación se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica, incluyendo pero no limitados a aquellos establecidos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982) ; Deutscher, Methods in Enzymologv Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2da Edición Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3rd Edición Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Second Edición Wiley- VCH, NY; and Walker (1998) , Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias allí citadas. Una ventaja de producir una proteína o polipéptido de interés con un aminoácido no natural en una célula anfitriona eucariótica o célula anfitriona no eucariótica es que típicamente las proteínas o polipéptidos se plegarán en sus conformaciones nativas. Sin embargo, en ciertas modalidades a la invención, aquellos con destreza en la técnica reconocerán que, después de síntesis, expresión y/o purificación, las proteínas pueden poseer una conformación diferente a las conformaciones deseadas de los polipéptidos relevantes. En un aspecto de la invención, la proteína expresada opcionalmente se desnaturaliza y después renaturaliza. Esto se logra utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a, por adición de una chaperonina a la proteína o polipéptido de interés, al solubilizar las proteínas en un agente caótropico tal como HCl guanidina, utilizando proteína disulfuro isomerasa, etc. En general, ocasionalmente es conveniente desnaturalizar y reducir polipéptidos expresados y después provocar que los polipéptidos se re-plieguen en la conformación preferida. Por ejemplo, pueden agregarse guanidina, urea, DTT, DTE, y/o una chaperonina ' a un producto de traducción de interés. Métodos para reducir, desnaturalizar y renaturalizar proteínas se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad (ver las referencias anteriores y Debinski, et al. (1993) J. Biol. Cheni., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; and Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski, et al., por ejemplo, describe la desnaturalización y reducción de proteínas de cuerpos de inclusión en guanidina-DTE . Las proteínas pueden plegarse en un amortiguador redox que contiene, incluyendo pero no limitado a glutation oxidada y L-arginina. Agentes de plegamiento se pueden hacer fluir o de otra forma moverse en contacto con uno o más polipéptidos u otro producto de expresión o viceversa. En el caso de producción procariótica de hGH, la hGH así producida puede ser mal plegada y de esta manera carecer o tener actividad biológica reducida. La bioactividad de la proteína puede restaurarse por "plegado". En general, hGH mal plegadas se re-pliega por solubilización (en donde la hGH es también insoluble) , desplegar y reducir la cadena polipéptido utilizando por ejemplo uno o más agentes caótropicos (por ejemplo urea y/o guanidina) y un agente reductor capaz de reducirse enlaces de disulfuro (por ejemplo ditiotreitol, DTT o 2-mercaptoetanol , 2 -ME) . A una concentración moderada de caótropo, se agrega entonces un agente oxidante (por ejemplo, oxígeno, cistina o cistamina) , que permite la reformación de enlaces disulfuro. hGH puede plegarse utilizando métodos estándar conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en las patentes de los E.U.A números 4,511,502, 4,511,503, y 4,512,922. Después de plegar, hGH puede ser adicionalmente purificada. Purificación de hGH puede lograrse utilizando una variedad de técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la técnica, incluyendo cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de líquido de alto desempeño en fase inversa, cromatografía de afinidad y semejantes o cualquier combinación de las mismas. Purificación adicional también puede incluir una etapa de secado o precipitación de la proteína purificada. Después de purificación, hGH puede intercambiarse en diferentes amortiguadores y/o concentrarse por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a ultrafiltración, diafiltración y diálisis. hGH que se proporciona como una proteína purificada sencilla puede estar sometida a agregación y precipitación. Una amplia variedad de materiales para amortiguar polipéptidos concentrados o de intercambio se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. La hGH purificada puede ser al menos 90% pura (como se mide por cromatografía de líquido con alto desempeño en fase inversa, RP-HPLC, o electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio, SDS-PAGE) o al menos 95% pura, o al menos 98% pura, o al menos 99% o mayor de pureza. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza del hGH, la hGH es suficientemente pura para utilizar como un producto farmacéutico o para mayor procesamiento, tal como conjugación con un polímero soluble en agua tal como PEG. Ciertas moléculas hGH pueden emplearse como agentes terapéuticos en la ausencia de otros ingredientes activos o proteínas (aparte de exipientes portadores y estabilizantes, albúmina de suero y semejantes) o puede complej arse con otra proteína o un polímero. XIII. Métodos de Purificación Cualquiera de una variedad de etapas de aislamiento pueden realizarse en el lisado celular, extracto, medio de cultivo, cuerpos de inclusión, espacio periplásmico de las células anfitrionas, citoplasma de las células anfitrionas u otro material, que comprende hGH o cualesquiera mezclas hGH que resultan de cualesquiera etapas de aislamiento incluyendo pero no limitados a cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración de gel, cromatografía de líquido de alto desempeño ("HPLC"), HPLC de fase inversa ("RP-HPLC"), adsorción de lecho expandido o cualquier combinación y/o por repetición de las mismas y en cualquier orden apropiado. Equipo y otros materiales necesarios empleados para realizar las técnicas descritas aquí están comercialmente disponibles. Bombas, recolectores de fracciones, monitores, grabadoras y sistemas completos están disponibles por ejemplo de Applied Biosystems (Foster City, CA) , Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) , and GE Healthcare, Inc. (Piscataway, NJ) . Materiales cromatográficos, incluyendo pero no limitados a materiales de matriz de intercambio, medios y amortiguadores también están disponibles de estas compañías . Equilibrio y otras etapas en los procesos cromatográficos de columna aquí descritos tales como lavado y elución, puede lograrse más rápidamente utilizando equipo especializado tal como una bomba. Bombas comercialmente disponibles que incluyen pero no están limitados a HILO AD® Pump P-50, Peristaltic Pump P-I, Pump P-901, y Pump P-903 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Ejemplos de recolectores de fracciones incluyen RediFrac Fraction Collector, FRAC-100 y FRAC-200 Fraction Collectors, y SUPERFRAC® Fraction Collector (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Mezcladores también están disponibles para formar gradientes de concentración lineal y pH. Mezcladores comercialmente disponibles incluyen Gradient Mixer GM-I and In-Line Mixers (GE Healthcare, Piscataway, NJ) .

El proceso cromatográfico puede supervisarse utilizando cualquier monitor comercialmente disponible. Estos monitores pueden emplearse para recolectar información como UV, pH y conductividad. Ejemplos de detectores incluyen Monitor UV-I, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900, y Conductivity Monitor (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Sin duda, sistemas enteros están comercialmente disponibles incluyendo diversos sistemas AKTA® de GE Healthcare (Piscataway, NJ) . Como se establece aquí, el pH de la primer muestra hGH puede ajustarse antes de realizar cualesquiera etapas de aislamientos subsecuentes. Además, la primer mezcla hGH o cualquier mezcla subsecuente de la misma puede concentrarse utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Aún más, el amortiguador de elución que comprende la primera mezcla hGH o cualquier mezcla subsecuente del mismo puede intercambiarse por un amortiguador adecuado para la siguiente etapa de aislamiento utilizando técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria especialidad. Cromatografía de Intercambio de Iones. En una modalidad, y como una etapa adicional opcional, puede realizarse cromatografía de intercambio de iones en la primera mezcla hGH. Ver en general ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1114-21, GE Healthcare (Piscataway, NJ) ) . Columnas de intercambio de iones comercialmente disponibles incluyen las columnas HITRAP®, HIPREP®, y HILOAD® Columns (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Estas columnas utilizan fuertes intercambiadores de aniones tales como los intercambiadores Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance, y Q SEPHAROSE® XL; intercambiadores de cationes fuertes tales como SP SEPHAROSE® High Performance, SP SEPHAROSE® Fast Flow, y SP SEPHAROSE® XL; intercambiadores de aniones débiles tales como DEAE SEPHAROSE® Fast Flow; e intercambiadores de cationes débiles tales como CM SEPHAROSE® Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Cromatografía en columna de intercambio de aniones o cationes puede realizarse en la hGH en cualquier etapa del proceso de purificación para aislar hGH sustancialmente purificada. Source 30Q y Source 30S son medios de intercambio de iones (GE Healthcare) . La etapa de cromatografía de intercambio de cationes puede realizarse utilizando cualquier matriz de intercambio de cationes conveniente. Matrices de intercambio de cationes útiles incluyen pero no están limitadas a materiales fibrosos, porosos, no porosos, microgranulares, con perlas o de matriz de intercambios de cationes entrelazada. Estos materiales de matriz de intercambio de cationes incluyen pero no están limitados a celulosa, agarosa, dextrano, poliacrilto, polivinilo, poliestireno, sílice, ploiéter o compuestos de cualquiera de los anteriores. La matriz de intercambio de cationes puede ser cualquier intercambiador de cationes conveniente incluyendo intercambiadores de cationes fuertes y débiles. Intercambiadores de cationes fuertes pueden permanecer ionizados sobre un amplio rango de pH y de esta manera pueden ser capaces de ligar a hGH sobre un amplio rango de pH. Intercambiadores de cationes débiles sin embargo pueden perder ionización como una función del pH. Por ejemplo, un intercambiador de cationes débil puede perder carga cuando el pH cae por debajo de aproximadamente pH 4 o pH 5. Intercambiadores de cationes fuertes convenientes incluyen pero no están limitados a grupos funcionales cargados tales como sulfopropilo (SP) , metilo sulfonato (S) , o sulfoetilo (SE) . La matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuerte, que tiene un pH de enlaces de hGH en el rango de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 6.0. En forma alterna, el fuerte intercambiador de cationes fuerte puede tener con pH de enlace hGH en el rango de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 5.5. La matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuerte que tiene un pH de enlace hGH de aproximadamente 3.0. En forma alterna, la matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuerte que tiene un pH de enlace hGH en el rango de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. La matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuerte que tiene un pH de enlace hGH en el rango de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 12.5. En forma alterna, el intercambiador de cationes fuerte puede tener un pH de enlace hGH en el rango de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 12.0. Antes de cargar la hGH, la matriz de intercambio de cationes puede equilibrarse, por ejemplo utilizando varios volúmenes de columna de un ácido débil, diluido, por ejemplo cuatro volúmenes de columna de ácido acético 20 mM, pH 3. Después de equilibrio, la hGH puede agregarse y la columna puede lavarse una o varias veces antes de elución de hGH sustancialmente purificada, también utilizando una solución de ácido débil tal como ácido acético débil o solución de ácido fosfórico. Por ejemplo, aproximadamente 2 a 4 volúmenes de columna de ácido acético 20 mM, pH 3 puede emplearse para lavar la columna. Lavados adicionales utilizando por ejemplo 2 a 4 volúmenes de columna de acetato de sodio 0.05 M, pH 5.5 o acetato de sodio 0.05 M en mezcla con cloruro de sodio 0.1 M, pH 5.5 también puede emplearse. En forma alterna, utilizando métodos conocidos en la técnica, la matriz de intercambio de cationes puede equilibrarse utilizando varios volúmenes de columna de una base débil diluida. En forma alterna, hGH sustancialmente purificada puede eluirse al contactar la matriz de intercambio de cationes con un amortiguador que tiene un suficientemente bajo pH o concentración iónica para desplazar la hGH de la matriz. El pH del amortiguador de elución puede estar en el rango desde aproximadamente 2.5 a aproximadamente 6.0. Más específicamente, el pH del amortiguador de elución puede estar en el rango desde aproximadamente 2.5 a aproximadamente 5.5, a aproximadamente 2.5 a aproximadamente 5.0. El amortiguador de elución puede tener un pH de aproximadamente 3.0. Además, la cantidad del amortiguador de elución puede variar ampliamente y en general está en el rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 volúmenes de columna. Aún más, amortiguadores convenientes conocidos por aquellos con destreza en la técnica pueden encontrar uso aquí incluyendo pero no limitados a citrato, fosfato, formeato, HEPES, y MES, en el rango de concentración de al menos aproximadamente 5 mM a al menos aproximadamente 100 mM.

Después de adsorción de la hGH en la matriz de intercambio de cationes, hGH sustancialmente purificada puede eluirse al contactar la matriz con un amortiguador que tiene suficientemente alto pH o concentración iónica para desplazar la hGH de la matriz. El pH de amortiguador de elución puede estar en el rango desde aproximadamente 8.0 a aproximadamente 12.5. Más específicamente, el amortiguador de elución puede estar en el rango desde aproximadamente 8.0 a aproximadamente 12.0. Amortiguadores convenientes para utilizar en elución de alto pH de hGH sustancialmente purificada incluyen pero no están limitados a citrato, fosfato, formeato, acetato, HEPES, y MES en rango de concentración del menos 5 mM a cuando menos 100 mM. Además, un amortiguador que tiene borato de potasio al 01 M, cloruro de potasio al 0.6 M, EDTA al 0.1 mM, pH 8.7 puede utilizarse. hGH sustancialmente purificada también puede eluirse utilizando amortiguadores estándar tales como un amortiguador bicina que incluye bicina de aproximadamente 50 a 100 mM, bicina a aproximadamente 75 mM; cloruro de sodio de 25 a aproximadamente 100 mM, específicamente cloruro de sodio de aproximadamente 50 mM y EDTA de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.5 más específicamente EDTA de aproximadamente 0.1 mM pH 7.5. Cromatografía de Fase Inversa RP-HPLC puede realizarse para purificar proteínas siguiendo protocolos convenientes que se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Ver por ejemplo Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J". CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402. RP-HPLC puede realizarse en hGH para aislar hGH sustancialmente purificada. En este aspecto, resinas con derivados de sílice con funcionalidades alquilo con una amplia variedad de longitud, incluyendo pero no limitadas a resinas con cuando menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente C30, al menos aproximadamente C3 al menos aproximadamente C20, o al menos aproximadamente C3 a al menos aproximadamente CX8, pueden emplearse. En forma alterna, una resina polimérica puede ser utilizada. Por ejemplo, la resina TosoHaas Amberchrome CGlOOOsd puede utilizarse que es una resina de polímero de estireno. Resinas ciano o poliméricas con una amplia variedad de longitudes de cadena alquilo también pueden emplearse. Aún más, la columna RP-HPLC puede lavarse con un solvente tal como etanol. La columna Source RP es otro ejemplo de una columna RP-HPLC. Un amortiguador de elución conveniente que contiene un agente de apareamiento de iones y un modificador orgánico tal como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, acetonitrilo o etanol, puede emplearse para eluir la hGH de la columna RP-HPLC. Los agentes de apareamiento de iones más comúnmente empleados incluyen pero no están limitados a ácido ascético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutirico, trietilamina, tetrametilamonio, tetrabutilamonio, acetato trietilamonio. La elución puede realizarse utilizando uno o más gradientes o condiciones isocráticas, con condiciones de gradiente preferidas para reducir el tiempo de separación y disminuir el ancho pico o máximo. En general, el gradiente puede ser desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 80% (v/v) , a aproximadamente 5% a aproximadamente 75% (v/v) , a aproximadamente 5% hasta aproximadamente 70% (v/v) , la aproximadamente 5% hasta aproximadamente 65% (v/v) , a aproximadamente 5% hasta aproximadamente 60% (v/v) , a aproximadamente 5% hasta aproximadamente 55% (v/v) , o aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50% (v/v), de solvente en agua. Otro método involucra el uso de dos gradientes con diferentes rangos de concentraciones de solvente. Ejemplos de amortiguadores de elución convenientes para utilizar aquí fueron incluirse o no están limitados a soluciones de acetato de amonio y acetonitrilo.

La hGH derivada de un anfitrión de E. coli recombinante puede además ser aislada o purificado por cromatografía de fase inversa. La hGH puede aislarse, por ejemplo utilizando una columna SOURCE RP, con un gradiente de acetonitrilo de aproximadamente 10% a aproximadamente 60% acetonitrilo. Técnicas de Purificación de Cromatografía por Interacción Hidrofóbica La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC = Hydrophobic interaction chromatography) puede realizarse en la hGH. Ver en general HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, GE Healthcare (Piscataway, NJ) que se incorpora equipo referencia. Matrices HIC convenientes pueden incluir pero no están limitadas a matrices sustituidas con alquilo o arilo tales como mactrices sustituidas con butilo, hexilo, octilo o fenilo, incluyendo matrices de agarosa, agarosa entrelazada, sefarosa, celulosa, sílice, dextrano, poliestireno, poli (metacrilato) y resinas de modo mixto incluyendo pero no limitadas a resina polietilenamina o una matriz de poli (metacrilato) sustituida con butilo o fenilo. Fuentes comercialmente disponibles para cromatografía de columna por interacción hidrofóbica incluyen pero no están limitadas a columnas HITRAP®, HIPREP®, y columnas HILOAD® (GE Healthcare, Piscataway, NJ) y resinas TSKgel Phenyl-650S y Phenyl-5PW (30 urn) (Tosoh Bioscience) . Brevemente, antes de carga, la columna HIC puede equilibrarse utilizando amortiguadores estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, tales como una solución de ácido ascético/cloruro de sodio o sulfato de amonio que contienen HEPES, o sulfato de amonio en una solución de fosfatos de sodio con pH 6.5 o sulfato de sodio en una solución TRIS de pH 7-8. Sulfato de amonio puede emplearse como el amortiguador para cargar la columna HIC. Después de cargar la hGH, la columna puede ser lavada utilizando amortiguadores estándar y bajo condiciones tales como aquéllas aquí descritas para retirar materiales indeseados pero reteniendo la hGH en la columna HIC. hGH puede eluirse con aproximadamente 3 a aproximadamente 10 volúmenes de columna de un amortiguador estándar, tal como amortiguador HEPES que contiene EDTA y menor concentración de sulfato de amonio que el amortiguador de equilibrio, o un amortiguador de ácido acético/cloruro de sodio, entre otros. Un gradiente de sal lineal decreciente utilizando por ejemplo un gradiente de fosfato de potasio, también puede emplearse para eluir las moléculas hGH. Mejoradores de elución también pueden agregarse al amortiguador de elución, incluyendo pero no limitados a etilen glicol, glicerol o urea (0.5- 1.5M) . El eluyente puede ser entonces concentrado, por ejemplo por filtración tal como diafiltración o ultrafiltración. Diafiltración puede emplearse para retirar la sal empleada para eluir hGH. Otras Técnicas de Purificación Todavía otra etapa de aislamiento utilizando por ejemplo filtración en gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No . 18-1022-18, GE Healthcare, Piscataway, NJ) que se incorpora aquí por referencia, cromatografía de hidroxiapatita (matrices convenientes se incluyen pero no están limitadas a HA-Ultrogel, High Resolution (Calbiochem) , CHT Ceramic Hydroxyapatite (BioRad) , Bio - Gel HTP Hydroxyapatite (BioRad) ) , HPLC, adsorción del lecho expandido, ultrafiltración, diafiltración, liofilización y semejantes, pueden realizarse en las primeras mezclas de hGH o cualquier mezcla subsecuente de la misma, para retirar cualesquiera excesos de sales y para reemplazar el amortiguador con un amortiguador conveniente para la siguiente etapa de aislamiento o incluso formulación del producto de droga final . El aminoácido no naturalmente codificado presente en la molécula hGH también puede utilizarse para proporcionar separación de otras proteínas celulares que no contienen el aminoácido no naturalmente codificado. Ya que el aminoácido no naturalmente codificado puede comprender grupos funcionales químicos únicos, el acoplamiento del grupo funcional único a otra molécula puede proporcionar una etapa de purificación sustancial. Por ejemplo, el aminoácido no naturalmente codificado puede acoplarse a otra molécula que facilita la separación de otras proteínas. Estas moléculas para acoplamiento al aminoácido no natural incluyen pero no están limitados a PEG y otros polímeros. El rendimiento de hGH incluyendo hGH sustancialmente purificada puede supervisarse en cada etapa descrita aquí utilizando técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Estas técnicas también pueden emplearse para estimar el rendimiento de hGH sustancialmente purificada siguiendo la última etapa de aislamiento. Por ejemplo, el rendimiento de hGH puede supervisarse utilizando cualesquiera de varias columnas de cromatografía de líquido con alta presión en fase inversa que tienen una variedad de longitudes de cadena alquilo tales como ciano RP-HPLC, C18RP-HPLC; así como HPLC intercambio de cationes y HPLC de filtración de gel.

Modalidades específicas de la presente invención, el rendimiento de hGH después de cada etapa de purificación puede ser al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 99.9%, o al menos aproximadamente 99.99%, de la hGH en el material de partida para cada etapa de purificación. La pureza puede determinarse utilizando técnicas estándar tal como SDS-PAGE o al medir hGH utilizando transferencia Western y ensayos ELISA. Por ejemplo, anticuerpos policlonales pueden generarse contra proteínas aisladas de una fermentación de levadura de control negativo y la recuperación de intercambio de cationes. Los anticuerpos también pueden emplearse para sondear la presencia de proteínas de célula anfitrión contaminantes . El material RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) que consiste en partículas de gel de sílice, del cual las superficies transportan cadenas C4 -alquilo. La separación de polipéptidos de las impurezas proteinaceas se basa en diferencias en la fuerza de las interacciones hidrofóbicas. Se realiza elución con o un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluroacético diluido. HPLC preparativa se realiza empleando una columna de acero inoxidable (llena con 2.8 a 3.2 litros de gel de sílice Vydac C4). El eluato Hydroxiapatita Ultrogel se acidifica al agregar ácido trifluoroacético y cargar en la columna Vydac C4. Para lavado y elución un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluroacético diluido se emplea. Fracciones se recolectan y neutralizan inmediatamente con amortiguador fosfato. Las fracciones polipéptido que están dentro de los límites IPC se reúnen. Material de DEAE Sepharosa (GE Healthcare) consiste de grupos dietilaminoetilo (DEAE) que se ligan covalentente a la superficie de perlas de Sepharosa. El enlace de un polipéptido de selección a los grupos de DEAE está mediado por interacciones iónicas. Acetonitrilo y ácido trifluoroacético pasan a través de la columna sin ser retenidos. Después de que esta sustancia se han lavado por arrastre, se retiran las impurezas en trazas a lavar la columna con amortiguador acetato a bajo pH. Después la columna se lava con amortiguador fosfato neutro y se eluye polipéptido con un amortiguador con concentración iónica incrementada. La columna se empaca con DEAE Sepharose fast flow. El volumen de columna se ajusta para asegurar una carga de polipéptido en el rango de 3-10 mg polipéptido/ml de gel. La columna se lava con agua y amortiguador de equilibrio (fosfato de sodio/potasio) . Las fracciones reunidas del eluato de HPLC se cargan y la columna se lava con amortiguador de equilibrio. Después, la columna se lava con amortiguador de lavado (amortiguador acetato de sodio) seguido por lavado con amortiguador de equilibrio. Subsecuentemente, se eluye polipéptido de la columna con amortiguador de elución (cloruro de sodio, fosfato de sodio/potasio) y recolecta en una sola fracción de acuerdo con el perfil de elución maestro. El eluato de la columna de DEAE Sepharose se ajusta a la conductividad específica. La sustancia de droga resultante se filtra estéril en botellas de teflón y almacena a -70 grados C. Métodos y procedimientos que pueden emplearse para estimar el rendimiento y pureza de hGH incluyen pero no están limitados al ensayo Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE con tinción de plata, SDS-PAGE con tinción de coomassie, espectrometría de masas (incluyendo pero no limitada a MALDI-TOF) y otros métodos para caracterizar proteínas que se conocen por una persona con destreza ordinaria en la especialidad. Métodos adicionales incluyen pero no están limitados a: SDS-PAGE acoplado con métodos de tinción de proteína, inmunotransferencia, espectrometría de masa con ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-MS = matrix assisted láser desorption/ionization-mass spectrometry) , espectrometría de masa/cromatografía de líquidos, enfoque isoeléctrico, intercambio de aniones analítico, cromatoenfoque y dicroísmo circular. Métodos adicionales que pueden emplearse incluyen las etapas de retirar endotoxinas . Endotoxinas son el lipopolisacáridos (LPSs) que están ubicados en la membrana exterior de células anfitrionas Gram-negativas, tales como por ejemplo Escherichia coli . Métodos para reducir los niveles de endotoxina se conocen por una persona con destreza ordinaria de especialidad e incluyen pero no están limitados a técnicas de purificación utilizando soportes de sílice, polvo de vidrio o hidroxiapatita, cromatografía de fase inversa, afinidad, de exclusión de tamaño, de intercambio de aniones, cromatografía de interacción hidrofóbica, filtración, una combinación de estos métodos y semejantes. Modificaciones o métodos adicionales pueden ser requeridos para retirar contaminantes tales como migración de proteínas del polipéptido de interés. Métodos para medir niveles de endotoxina se conocen por una persona con destreza ordinaria en la técnica e incluyen pero no están limitados a ensayos de Lisado de Amebocito Limulus (LAL = Limulus Amebocyte Lysate) . Aunque la invención se ha descrito con referencia a modalidades métodos construcción y uso particulares, será aparente para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad que diversos cambios y modificaciones pueden realizarse sin apartarse de la invención. Alteraciones a los reactivos materiales y condiciones de purificación indicadas son aparentes para aquellos con destreza ordinaria en especialidad. Por ejemplo, una resina de superior capacidad puede ser sustituida en una etapa de cromatografía si dicha capacidad se desea. XIV. Expresión en Sistemas Alternos . Varias estrategias se han empleado para introducir aminoácidos no naturales en proteínas en células anfitrionas no recombinantes, células anfitrionas mutageniciadas, o en sistemas libres de células. Estos sistemas son también adecuados para utilizar en elaborar los polipéptidos hGH de la presente invención. La derivatización de aminoácidos con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr resultó en la conversión de lisina en N2-acetil-lisina . Síntesis química también proporciona un método directo para incorporar aminoácidos no naturales . Con el reciente desarrollo de ligación enzimática y ligación química nativa de fragmentos péptido, es posible hacer más grandes proteínas. Ver por ejemplo P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000). Ligación de péptido químico y ligación química nativa se describen en la publicación de patente de los E.U.A. número 6,184,344, la publicación de la patente en los E.U.A. número 2004/0138412, la publicación de los E.U.A número 2003/0208046, WO 02/098902, y WO 03/042235, que se incorporan aquí por referencia. Un método biosintético in vitro en general en donde un tRNA supresor acilado químicamente con el aminoácidos no natural deseado se agrega a un extracto in vitro capaz de soportar biosíntesis de proteína, se ha empleado para incorporar específicamente en sitio más de 100 aminoácidos no naturales en una variedad de proteínas virtualmente de cualquier tamaño Ver por ejemplo V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schuitz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34:621 (1995); CJ . ?oren, SJ. Anthony-Cahil1 , M.C. Griffith, P.G. Schuitz, A general method or site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); and, J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989) . Un amplio rango de grupos funcionales se ha introducido en proteínas para estudios de estabilidad de proteína, plegado de proteína, mecanismo de enzima, y transducción de señal . Un método in vivo denominado incorporación de presión selectiva, se desarrolló para explotar la promiscuidad de sintetazas de tipo silvestre. Ver por ejemplo N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J. , 13:41 (1999) . Una cepa auxotrófica en donde la ruta metabólica relevante suministra a la célula con un aminoácido natural particular se desactiva, se desarrolla en medio mínimo que contiene concentraciones limitadas del aminoácido natural, mientras que la transcripción del gen diana se reprime. Al inicio de la fase de crecimiento estacionaría, el aminoácido natural se agota y reemplaza con el análogo de aminoácidos no natural . Inducción de expresión de la proteína recombinante resulta en la acumulación de una proteína que tiene un análogo no natural. Por ejemplo, utilizando esta estrategia, o, m y p-fluorofenilalanina se han incorporado en proteínas y exhiben dos hombros característicos en el espectro UV que pueden ser fácilmente identificados, ver por ejemplo C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000); trifluorometionina sea empleado para reemplazar metionina en bacteriófago T4 lisosima para estudiar su interacción con ligandos quitooligosacárido por 19F NMR, ver H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997) ; y trifloroleucina se ha incorporado en lugar de leucina, resultando en estabilidad térmica y química incrementada de una proteína cremallera de leucina. Ver por ejemplo Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Aún más, selenometionina y telurometionina se incorporan en diversas proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía de rayos X. Ver por ejemplo W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J. , 9:1665 (1990); J. 0. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct. Biol.. 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); and, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol. 270:616 (1997). Análogos del metionina con funcionalidades alqueno o alquino también han sido incorporado eficientemente, permitiendo modificación adicional de proteínas por medios químicos. Ver por ejemplo J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tin-ell, J. Am. Chem. Soc. 122:1282 (2000); y, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); patente de los E.U.A. número 56:9487, la publicación de la patente en los E.U.A. número 2002/0042097, que se incorporan aquí por referencia. El éxito de este método depende del reconocimiento de análogos de aminoácidos no naturales por aminoacil tRNA sintetasas, que, en general requieren alta selectividad para asegurar la fidelidad de traducción de la proteína. Una forma de expansión del alcance de este método es relajar la especificidad del substrato de aminoacil tRNA sintetasas, que se ha logrado en una cantidad limitada de casos. Por ejemplo, el reemplazo de Ala294 por Gly en fenilalanil-tRNA sintetasa (PheRS) de Escherichia coli aumenta el tamaño de la cavidad de enlace de substrato, y resulta en la acilación del tRNAPhe por p-Cl-p-Cl-fenilalanina (p-p-Cl-Phe-Phe) .

Ver M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994) . Una cepa de Escherichia coli que aloja esta PheRS mutante permite la incorporación del p-Cl-p-Cl-fenilalanina o del p-Br-p-Br-fenilalanina en lugar del fenilalanina. Ver por ejemplo M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett.. 364:272 (1995); and, N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tin-ell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Similarmente, una mutación punto Phel30Ser cerca del sitio de enlace aminoácido del tirosil- tRNA sintetasa de Escherichia coli se mostró que permite azatyrosine sea incorporada en forma más eficientemente que el tirosina Ver F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil and S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000). Otra estrategia para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas in vivo es modificar sintetazas que tienen mecanismos de revisión. Estas sintetazas no pueden discriminar y por lo tanto activar aminoácidos que son estructuralmente similares a los aminoácidos naturales conato. Éste error se corrige en un sitio separado, que desasila el aminoácido mal encargado del tRNA para mantener la fidelidad de la traducción de proteína. Sí la actividad de revisión de las sintetasa se desactiva, análogos estructurales que están mal activados pueden escapar la función de edición y ser incorporados. Este enfoque se a demostrado recientemente con la valyl-tRNA synthetase (ValRS) . Ver V. Doling, H.

D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science, 292:501 (2001) . ValRS puede mal aminoacilar tRNAVal con Cys, Thr, o aminobutirato (Abu) ; estos aminoácidos no conato subsecuentemente se hidrolizan por el dominio de edición. Después de mutagénesis aleatoria del cromosoma de Escherichia coli una cepa de Escherichia coli mutante se elige que tiene una mutación en el sitio de edición de VaIRS. Esta ValRS defectuosa en edición carga incorrectamente tRNAVal con Cys. Debido que Abu semeja estéricamente Cys (grupo -SH de Cys se reemplaza con CH3 en Abu) , la ValRS mutante también incorpora Abu en proteínas cuando ésta cepa de Escherichia coli mutante se desarrolla en la presencia de Abu. Análisis espectrométrico de masas mostró que aproximadamente 24% de valinas se reemplazan por Abu en cada posición valina en las proteína nativa. Síntesis de fase sólida y métodos semisintéticos también han permitido la síntesis de una cantidad de proteínas que contienen aminoácidos novedosos. Por ejemplo, ver las siguientes publicaciones y referencias citadas que son como sigue: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K. , Bohn, H. Studies on polypeptides .

XXXVI. The effect of pyrazole- imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88 (24) : 5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Ace Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc. 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M. , Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256 (5054) : 221-225 (1992); Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem. 1 1 (3) : 255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means Protein Eng. 1(3):151-157 (1987); and, Jackson, D.Y., Burnier, J. , Quan, C, Stanley, M. , Tom, J. , Wells, J.A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science. 266 (5183) : 243 (1994) . Modificación química se ha empleado para introducir una variedad de cadenas laterales no naturales incluyendo cofactores, etiquetas de espín y oligonucleótidos en proteínas in vitro. Ver Corey, D.R., Schuitz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxiribonuclease, Science. 238(4832): 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D. S. Chemical mutation ofenyzme active sites, Science, 226 (4674) : 505- 511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem. 243 (24) :6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc. 88:3153-3154 (1966); and, Pollack, SJ. , Nakayama, G. Schuitz, P.G. Introduction ofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 242 (4881) : 1038-1040 (1988) . En forma alterna, métodos biosintéticos que emplean aminoacil -tRNAs químicamente modificadas se han empleado para incorporar varias sondas biofísicas en proteínas sintetizadas in vitro. Ver las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Brunner, J. ?ew Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem. 62:483-514 (1993); and, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Nati. Acad. Sci. 83 (22) :8604- 8608 (1986) .

Previamente, se ha mostrado que aminoácidos no naturales pueden ser incorporados específicamente en sitio en proteínas in vitro por la adición de tRANs supresores aminoacilados químicamente a reacciones de síntesis de proteína programadas con un gen que contiene una mutación sin sentido ámbar. Utilizando estos enfoques, se puede sustituir una cantidad de los veinte aminoácidos comunes con homólogos estructurales cercanos, por ejemplo fluorofenilalanina por fenilalanina, utilizando cepas auxotrópicas para un aminoácido particular. Ver por ejemplo Noren, CJ. , Anthony-Cahil1 , Griffith, M.C., Schuitz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science. 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahi11 , S., Noren, C.J., Schuitz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site- specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schuitz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995) . Por ejemplo, un tRNA supresor se prepara que reconoce el codón de parada UAG y se aminoacilo químicamente con un aminoácido no natural. Mutagénesis dirigida de sitio convencional se utiliza para introducir el codón de parada TAG, en el sitio de interés en el gen de proteína. Ver por ejemplo Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5' -3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, ?ucleic Acids Res, 16(3): 791-802 (1988). Cuando el tR?A supresor acilado y el gen mutante se combinan en un sistema de transcripción/traducción in vitro, el aminoácido no natural se incorporó en respuesta al codón UAG que dio una proteína que contiene ése aminoácido en la posición especificada. Experimentos utilizando [3H] -Phe y experimentos con a -hidroxiácidos demostraron que sólo el aminoácido deseado se incorpora en la posición especificada por el codón UAG y que este aminoácido no se incorpora en cualquier otro sitio de la proteína. Ver por ejemplo et al, supra; Kobayashi et al., (2003) ?ature Structural Biology 10 (6) : 425-432 ; and, Ellman, J.A. , Mendel, D., Schuitz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255 (5041) :197-200 (1992).

Un tRNA puede ser aminoacilado con un aminoácido deseado por cualquier método o técnica, incluyendo pero no limitado a aminoacilación química o enzimática . La aminoacilación puede lograrse por aminoacil tRNA sintetazas o por otras moléculas enzimáticas, incluyendo pero no limitada a ribozimas. El término "ribozima" es intercambiable con "RNA catalítico". Cech y colaboradores (Cech, 1987, Science, 236:1532- 1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demostró la presencia de R?As de origen natural que puede actuar como catalizadores (ribozimas) . Sin embargo, aunque estos catalizadores RNA naturales se han solo mostrado que actúan en sustratos de ácido ribonucleico para ecición y corte y empalme, el desarrollo reciente de la evolución artificial de ribozimas ha expandido el repertorio de catálisis a diversas reacciones químicas. Estudios han identificado moléculas de R?A que pueden catalizar enlaces aminoacil -RNA en sus propios extremos (2 ' ) 3 ' -termini (Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647), y una molécula de RNA que puede transferir un aminoácido desde una molécula de R?A a otra (Lohse et al., 1996, ?ature 381:442-444). La publicación de la solicitud de patentes de los E.U.A. número 2003/0228593, que se incorpora aquí por referencia describe métodos para construir ribozimas y su uso en aminoacilación de tRNAs con aminoácidos naturalmente codificados y no naturalmente codificados. Formas inmovilizadas en sustrato de moléculas enzimáticas que pueden aminoacilar tRNAs, incluyendo pero no limitadas a ribozimas, pueden permitir purificación de afinidad deficiente de los productos aminoacilados . Ejemplos de sustratos convenientes incluyen agarosa, sefarosa y perlas magnéticas. La producción y uso de una forma inmovilizada con sustrato de ribozima para aminoacilación se describe en in Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 y la publicación de la solicitud de patente de los E.U.A. número 2003/0228593, que se incorporan aquí por referencia. Métodos de aminoacilación química incluyen pero no están limitados a aquellos introducidos por Hecht y colaboradores (Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P . ; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) and by Schuitz, Chamberlin, Dougherty and others (Cornish, V. W. ; Mendel, D.; Schuitz, P. G. Angew. Chem. Tnt . Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schuitz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J. ; Anthony-Cahill , S. J. ; Griffith, M. C; Schuitz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G. ; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.,- Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34), que se incorporan aquí por referencia, para evitar el uso de sintetasas en aminoacilación. Estos métodos u otros métodos de aminoacilación química pueden emplearse para aminoacilar moléculas de tRNA . Métodos para generar R?A catalítico pueden involucrar el generar conjuntos separados de secuencias de ribozimas aleatorizadas, realizando evolución directa en los conjuntos, supervisando los conjuntos por actividad de aminoazilación deseable y seleccionar secuencias de esas ribozimas que exhiben actividad de aminoacilación deseada. Las ribozimas pueden comprender motivos y/o regiones que facilitan actividad de acilación tales como un motivo GGU y una región rica en U. Por ejemplo, se ha reportado que regiones ricas en U puedan facilitar el reconocimiento de un sustrato aminoácido, y un motivo GGU puede formar pares base con los extremos 3 ' de un tR?A.

En combinación, a GGU y motivo y región rica en U facilitan reconocimientos simultáneos de tanto el aminoácido como tRNA simultáneamente, y de esta manera facilitan aminoacilación del extremo 3 ' del tRNA. Las ribozimas pueden generarse por selección in vi tro utilizando un r24mini parcialmente al azar conjugado con tRNAAsnCccG/ seguido por ingeniería sistemática de una secuencia consenso que se encuentra en los ciónos activos. Una ribozima ejemplar obtenida por este método se denomina "ribozima Fx3 " y se describe por la solicitud de publicación U.S. No. 2003/0228593, los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia, actúa como un catalizador versátil para la síntesis de diversos aminoacil - tRNAs cargados con aminoácidos no naturales conato. Inmovilización en un substrato puede emplearse para permitir purificación de afinidad eficiente de los tR?As aminoacilados . Ejemplos de substratos convenientes incluyen pero no están limitados a, agarosa, sefarosa y perlas magnéticas. Ribozimas pueden inmovilizarse en resinas al aprovechar la estructura química del RNA, tal que el 3 ' -cis-diol de la ribosa de RNA puede oxidarse con peryodato para dar por resultado el dialdehído correspondiente para facilitar inmovilización del R?A en la resina. Diversos tipos de resina pueden emplearse incluyendo resinas hidrazida económicas en donde la aminación reductiva hace la interacción entre la resina y la ribozima un enlace irreversible. Síntesis de aminoacil-tRNAs puede facilitarse significativamente por esta técnica de aminoacilación en-columna. Kourouldis et al. Methods 2005; 36:239-4 describe un sistema de aminoacilación basado en columna. Aislamiento de tRNAs aminoacilados puede lograrse en una variedad de formas. Un método conveniente es eluir los tRNAs aminoacilados de una columna con un amortiguador tal como una solución de acetato de sodio con EDTA 10 mM, un amortiguador que contiene ácido N- (2-hidroxietil) piperazin-N' - (3-propansulfónico) 50 mM , KCl 12.5 mM, pH 7.0, EDTA 10 mM, o simplemente agua amortiguada con EDTA (pH 7.0) . Los tRNAs aminoacilados pueden agregarse a reacciones de traducción a fin de incorporar el aminoácido con el cual el tRNA puede aminoacilarse en una posición de selección en un polipéptido elaborado por la reacción de traducción. Ejemplos de sistemas de traducción en donde los tRNAs aminoacilados de la presente invención pueden emplearse, incluyen pero no están limitados a lisados celulares. Lisados celulares proporcionan componentes de reacción necesarios para la traducción in vi tro de un polipéptido a partir de un mRNA de alimentación. Ejemplos de estos componentes de reacción incluyen pero no están limitados a proteínas ribosomales, rRNA, aminoácidos, tRNAs, GTP, ATP, factores de inicio y elongación de traducción y factores adicionales asociados con traducción. Adicionalmente, sistemas de traducción pueden ser traducciones por lotes o traducción de compartimiento. Sistemas de traducción por lotes combinan componentes de reacción en un solo compartimiento mientras que los sistemas de traducción en compartimiento separan los componentes de reacción de traducción de los productos de reacción que pueden inhibir la eficiencia de traducción. Estos sistemas de traducción están comercialmente disponibles. Además, un sistema de traducción/transcripción acoplado puede emplearse. Los sistemas de traducción/transcripción acoplados permiten tanto transcripción de un DNA de alimentación en un mRNA correspondiente, que a su vez se traduce por los componentes de reacción. Un ejemplo de una traducción/transcripción acoplada comercialmente disponible es el Sistema de Traducción Rápida (RTS = Rapid Translación System, Roche Inc.). El sistema incluye una mezcla que contiene lisado de E. coli para proporcionar componentes de traducción tales como ribosomas y factores de traducción. Adicionalmente, una RNA polimerasa se incluye para la transcripción del DNA de alimentación en una plantilla de mRNA para utilizar en traducción. RTS puede utilizar compartamentalización de los componentes de reacción mediante una membrana intercalada entre los compartimientos de reacción, incluyendo un compartimiento de suministro/desecho y un compartimiento de transcripción/traducción. Aminoacilación de tRNA puede realizarse por otros agentes, incluyendo pero no limitada a, transferasas, polimerasas, anticuerpos catalíticos, proteínas multi-funcionales, y semejantes. Lu et al. en Mol Cell. 2001 Oct; 8(4):759-69 describe un método en donde una proteína se liga químicamente a un péptido sintético que contiene aminoácidos no naturales (ligación de proteína expresada) . Técnicas de microinyección también han utilizado aminoácidos no naturales incorporados en proteínas. Ver, por ejemplo M. W. ?owak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. ?. Abelson, ?. Davidson, P. G. Schuitz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science. 268:439 (1995); and, D. A. Dougherty, Curr. Qpin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Un oocito de Xenopus se coinyectó con dos especies de R?A hechas in vitro: un mRNA que codifica la proteína Diana con un codón de parada UAG en la posición de aminoácido de interés y un tRNA supresor ámbar aminoacilado con el aminoácido no natural deseado. La maquinaria de traducción del oocito después inserta el aminoácido no natural en la posición especificada por UAG. Este método ha permitido estudios de function-estructura in vivo de proteínas de membrana integral que en general no son susceptibles a sistemas de expresión in vi tro. Ejemplos incluyen la incorporación de un aminoácido fluorescente en receptor taquiquinina neuroquinina-2 , para medir distancias por transferencia de energía de resonancia por fluorescencia, ver por ejemplo G. Turcatti, K. ?emeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996); la incorporación de aminoácidos biotinilados para identificar residuos expuestos de superficie en canales de iones, ver por ejemplo J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); el uso de análogos de tirosina enjaulados para supervisar cambios de conformación en un canal de iones en tiempo real, ver por ejemplo J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, ?euron, 20:619 (1998); y el uso de alfa hidroxi aminoácidos para cambiar estructuras principales de canal de iones para sondear sus mecanismos de compuerta. Ver por ejemplo, P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); and, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schuitz and J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001). La habilidad de incorporar aminoácidos no naturales directamente en proteínas in vivo ofrece una amplia variedad de ventajas de incluir pero no limitado a altos rendimientos de proteínas mutantes, facilidad de técnica, el potencial por estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos y el uso de estas proteínas mutantes en tratamientos terapéuticos y usos de diagnóstico. La habilidad para incluir aminoácidos no naturales con diversos tamaños, acideces, nucleofilicidades, hidrofobicidades y otras propiedades en proteínas puede expandir enormemente nuestra capacidad para manipular en forma racional y sistemática las estructuras de proteínas, tanto para sondear la función de proteínas como crear nuevas proteínas u organismos con propiedades novedosas. Sin embargo, el proceso es difícil debido a la naturaleza compleja de interacciones tRNA-sintetasa que se requieren para lograr un alto grado de fidelidad en traducción de proteína. En un intento por incorporar específicamente en sitio para-F-Phe, un par tR?APheCUA/fenilalanil-tR?A sintetasa supresor ámbar de levadura se emplea en una cepa de Escherichia coli autotrófica de Phe resistente a p-F-Phe, ver, por ejemplo R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998) . También puede ser posible obtener expresión de un polinucleótido hGH de la presente invención utilizando un sistema de traducción libre de células ( in-vi tro) . Los sistemas de traducción pueden ser celulares o libres de células, y pueden ser procarióticos o eucarióticos. Sistemas de traducción celular incluyen, pero no están limitados a, preparaciones de células enteras tales como células permeabilizadas o cultivos celulares en donde una secuencia de ácido nucleico deseada puede transcribirse en mRNA y el mR?A traducirse. Sistemas de traducción libre de células están comercialmente disponibles y muchos diferentes tipos y sistemas son bien conocidos. Ejemplos de sistemas libres de células incluyen pero no están limitados a, lisados procarióticos tales como lisados de Escherichia coli , y lisados eucarióticos tales como extractos de germen de trigo, lisados de células de insectos, lisados de reticulocitos de conejo, lisados de oocitos de conejo y lisados de células de humanas. Extractos y lisaods eucarióticos pueden ser preferidos cuando la proteína resultante se glicosila, fosforila o de otra forma modifica debido a que muchas de estas modificaciones son solo posibles en sistemas eucarióticos. Algunos de estos extractos y lisados están disponibles comercialmente (Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif; Amersham; Arlington Heights, 111.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.). Extractos membranosos, tales como los extractos pancreáticos caninos que contienen membranas microsomales, también están disponibles que son útiles para traducir proteínas secretorias. En estos sistemas, que pueden incluir ya sea mRNA como una plantilla (traducción in-vi ro) o D?A como una plantilla (transcripción y traducción in vi tro combinadas), la síntesis in vi tro es dirigida por los ribosomas. Esfuerzo considerable se ha aplicado al desarrollo de sistemas de expresión de proteínas libres de células. Ver, por ejemplo Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001); Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999) ; and Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); patente de los E.U.A. ?o. 6,337,191; publicación de patente de los E.U.A. ?o . 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, que aquí se incorporan por referencia. Otro enfoque que puede aplicarse a la expresión de polipéptidos hGH comprende un aminoácido no naturalmente codificado incluye la técnica de fusión de mRNA-péptido. Ver, por ejemplo, R. Roberts and J. Szostak, Proa Nati Acad. ScL (USA) 94:12297-12302 (1997); A. Frankel, et al, Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003) . En este enfoque, una plantilla mRNA enlazada a puromicina se traduce en péptido en el ribosoma. Si una o más moléculas tRNA se ha modificado, pueden incorporarse aminoácidos no naturales en el péptido por igual. Después de que se ha leído el último codón mR?A, puromicina captura el extremo C del péptido. Si el conjugado resultante mRNA-péptido se encuentra que tiene propiedades interesantes en un ensayo in vi tro, su identidad puede fácilmente revelarse de la secuencia de mRNA . De esta manera, se pueden supervisar bibliotecas de polipéptidos hGH que comprenden uno o más aminoácidos no-naturalmente codificados para identificar polipéptidos que tienen propiedades deseadas. Más recientemente, traducciones de ribosomas in vitro con componentes purificados se han reportado que permiten la síntesis de péptidos sustituidos con aminoácidos no naturalmente codificados. Ver, por ejemplo A. Forster et al, Proc. Nati Acad. Sd. (USA) 100:6353 (2003). Sistemas de traducción reconstituida también pueden emplearse. Mezclas de factores de traducción purificados también se han utilizado exitosamente para traducir mRNA en proteína así como combinaciones de lisados o lisados suplementados con factores de traducción purificada tales como factor de inicio-1 (IF-I), IF-2, IF-3 ( o ß ) , factor de elongación T (EF-Tu) , o factores de terminación. Sistemas libres de células también pueden ser sistemas de traducción/transcripción acopladas, en donde D?A se introduce al sistema, transcribe en mR?A y mRNA se traduce como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editors, Wiley Interscience, 1993), que aquí se incorpora específicamente por referencia. RNA transcrito en sistemas de transcripción eucarióticos puede estar en la forma de RNA heteronuclear (hnR?A) o tapas de extremo 5' (7-metil guanosina) y extremo 3' mR?A maduro con cola poli A, que puede ser una ventaja en ciertos sistemas de traducción. Por ejemplo, mR?As terminados en extremo se traducen con alta eficiencia en el sistema de lisado de reticulocito . XV. Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipéptidos hGH Diversas modificaciones a los polipéptidos aminoácidos no naturales descritos aquí pueden ser efectuadas utilizando las composiciones, métodos, técnicas y estrategias aquí descritas. Estas modificaciones incluyen la incorporación de adicional funcionalidad en el componente aminoácido no natural del polipéptido, incluyendo pero no limitado a una etiqueta, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietinel glicol, un fotoentrelazador o reticulador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo un fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un DNA, un RNA, un polinucleótido antisentido, un sacárido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inibitorio, un biomaterial, una nano partícula, una etiqueta de espín, un floróforo, una porción que contiene metal, una porción radiactiva, un grupo funcional novedoso, un grupo e interactuar covalente o no covalentemente con otras moléculas, una porción foto-enjaulada, una porción de radiación actínica excitable, una porción fotoisomerisable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, una porción que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente escindible, un grupo foto escindible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado a carbono, un agente redox activo, un aminotioácido, una porción tóxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimio luminiscente, un grupo denso en electrones, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrones, o cualquier combinación de los anteriores, o cualquier otro compuesto o sustancia conveniente. Como un ejemplo ilustrativo, no-limitante de las composiciones, métodos, técnicas y estrategias aquí descritas, la siguiente descripción se enfocará en agregar polímeros macromoleculares al polipéptido aminoácido no natural entendiéndose que las composiciones, métodos, técnicas y estrategias aquí descritas son también aplicables (con modificaciones apropiadas, de ser necesario y para los cuales una persona con destreza en la técnica podrá ser con las presentes descripciones) para agregar otras funcionalidades, incluyendo pero no limitadas a aquellas anteriormente citadas. Una amplia variedad de polímeros macromoleculares y otras moléculas pueden enlazarse a polipéptidos hGH de la presente invención para modular propiedades biológicas del polipéptido hGH, y/o proporcionar nuevas propiedades biológicas a la molécula hGH. Estos polímeros macromoleculares pueden enlazarse al polipétido hGH mediante un aminoácido naturalmente codificado, mediante un aminoácido no naturalmente codificado, o cualquier sustituyente funcional de un aminoácido natural o no natural, o cualquier substituyente o grupos funcional agregado a un aminoácido natural o no natural. El peso molecular del polímero puede ser de un amplio rango incluyendo pero no limitado a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero puede estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero está entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero está entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero está entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero está entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero está entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. La presente invención proporciona preparaciones sustancialmente homogéneas de conjugados polímeros :proteína . "Sustancialmente homogéneo (a)" como se emplea aquí, significa que las moléculas conjugadas de polímero :proteína se observan mayores que la mitad de la proteína total. El conjugado polímero :proteína tiene actividad biológica y las presentes preparaciones de polipéptido hGH modificadas con PEG "sustancialmente homogéneas" que aquí se proporcionan son aquellas que son suficientemente homogéneas para exhibir las ventajas de una preparación homogénea, por ejemplo facilidad en aplicación química para pronosticar farmacocinética de lote a lote. También se puede elegir preparar una mezcla de moléculas de conjugado polímero :proteína, y la ventaja que aquí se proporciona es que se puede seleccionar la proporción de conjugado mono-polímero : proteína para incluirlo en la mezcla. De esta manera, si se desea, se puede preparar una mezcla de diversas proteínas con diversos números de porciones de polímero conectadas (es decir, di-, tri-, tetra-, etc.) y combinar estos conjugados con el conjugado de mono-polímero :proteína preparado utilizando los métodos de la presente invención, y tener una mezcla con una proporción predeterminada de conjugados mono-polímero : proteína . El polímero selecto puede ser soluble en agua de manera tal que la proteína a la cual se conecta no precipita en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero puede estar ramificado o sin ramificar. Para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable . Ejemplos de polímeros incluyen pero no están limitados a polialquil esteres y sus análogos con terminación alcoxi (por ejemplo, polioxietilen glicol, polioxietilen/propilen glicol y sus análogos terminados en extremo metoxi o etoxi, en especial polioxietilen glicol, este ultimo también se conoce como polietilenglicol o PEG); polivinilpirrolidonas; polivinilalquil éteres; polioxazolinas, polialquil oxazolinas y polihidroxialquil oxazolinas; poliacrilamidas, polialquil acrilamidas, y polihidroxialquil acrilamidas (por ejemplo polihidroxipropilmetacrilamida y sus derivados) ; polihidroxialquil acrilatos; ácidos polisiálicos y sus análogos; secuencias de péptidos hidrofílicos; polisacáridos y sus derivados, incluyendo dextran y dextran derivados, por ejemplo carboximetildextran, dextran sulfatos, aminodextran; celulosa y sus derivados, por ejemplo carboximetil celulosa, hidroxialquil celulosas; quitina y sus derivados, por ejemplo quitosana, succinil quitosana, carboximetilquitina, carboximetilquitosana; ácido hialurónico y sus derivados; almidones; alginatos; sulfato de condroitina; albúmina; pululano y carboximetil pululano; poliaminoácidos y sus derivados, por ejemplo ácidos poliglutámicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas,-copolímeros de anhídrido maleico tales como: copolímero de anhídrido estiren maleico, copolímero de anhídrido diviniletil éter maleico; alcoholes polivinílicos; sus copolímeros; sus terpolímeros; sus mezclas; y derivados de los anteriores. La proporción de moléculas de polietílen glicol a moléculas de proteína variará, así como sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la proporción óptima (en términos de eficiencia de reacción ya que hay un exceso mínimo de proteína o polímero sin reaccionar) puede determinarse por el peso molecular del polietilen glicol seleccionado y el número de grupos reactivos disponibles. En lo que se refiere a peso molecular, típicamente entre mayor sea el peso molecular del polímero, menor será el número de moléculas de polímero que pueden ser conectadas a la proteína. Similarmente, la ramificación del polímero no deberá tomarse en cuenta cuando se optimizan estos parámetros. En general, entre mayor sea el peso molecular (o más ramificaciones) mayor será la proporción de polímero proteína . Como se emplea aquí, y cuando se contemplan conjugados de polipéptido PEG: hGH, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que da el beneficio deseado a un paciente. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de una cantidad de factores, incluyendo la condición física tota del paciente y la causa subyacente de la condición a tratar. La cantidad del polipéptido hGH empleado para terapia da una velocidad de cambio aceptable y mantiene respuesta deseada a un nivel benéfico. Una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones puede evaluarse fácilmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad utilizando materiales y procedimientos disponibles al público. El polímero soluble en agua puede ser cualquier forma estructural incluyendo pero no limitado a lineal, bifurcada o ramificada. Típicamente, el polímero soluble en agua es un poli (alquilen glicol), tal como poli (etilen glicol) (PEG) , pero otros polímeros solubles en agua también pueden emplearse. A manera de ejemplo, PEG se utiliza para describir ciertas modalidades de esta invención. PEG es un polímero soluble en agua bien conocido que está comercialmente disponible o que puede prepararse por polimerización de abertura de anillo de etilen glicol de acuerdo con métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad (Sandler and Karo, Polimer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161). El término "PEG" se utiliza ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilen glicol sin consideración al tamaño o a modificación en un extremo de PEG, y puede representarse enlazado al polipéptido hGH por la formula: XO- (CH2CH20)n-CH2CH2-Y en donde n es 2 a 10,000 y X es H o una modificación terminal, incluyendo pero no limitado a, un alquilo C?-un grupo protector o un grupo de modificación terminal. En algunos casos, un PEG empleado en la invención termina en un extremo con hidroxi o metoxi, es decir, X es H o CH3 ("PEG metoxi") . En forma alterna, el PEG puede terminar con un grupo reactivo, formando de esta manera un polímero bifuncional. Grupos reactivos típicos pueden incluir aquellos grupos reactivos que comúnmente se emplean para reaccionar con los grupos funcionales que se encuentran en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitados a, grupos maleimida, carbonatos activados (incluyendo pero no limitados a, p-nitrofenil éster) , esteres (incluyendo pero no limitados a, N-hidroxi succinimida, p-nitrofenil éster) y aldehidos) así como grupos funcionales que son inertes a los 20 aminoácidos comunes pero que reaccionan específicamente con grupos funcionarios complementarios presentes en aminoácidos no naturalmente codificados. Se nota que el otro extremo de PEG que se ilustra en la formula anterior por Y, se conectará ya sea ya directamente o indirectamente a un polipéptido hGH mediante un aminoácido de origen natural o no naturalmente codificado. En algunas modalidades, un fuerte nucleofilo (incluyendo pero no limitado a, hidrazina, hidrazida, hidroxi lamina, semicarbazida) puede reaccionarse con un grupo aldehido o cetona presente en un aminoácido no naturalmente codificado para formar una hidrazona, oxima o semicarbazona, como aplique, en algunos casos puede además reducirse por tratamiento con un agente reductor apropiado. En forma alterna, el fuerte nucleofilo puede incorporarse en el polipéptido hGH mediante un aminoácido no naturalmente codificado y emplearse para reaccionar preferencialmente con un grupo cetona o aldehido presente en el polímero soluble en agua. Cualquier masa molecular para un PEG puede utilizarse como sea prácticamente deseado, incluyendo pero no limitada a, de aproximadamente 100 Daltons (Da) a 100,000 Da o más según se desee (incluyendo pero no limitado a, en ocasiones 0.1-50 kDa o 10-40 kDa). El peso molecular de PEG puede ser de un amplio rango, incluyendo pero no limitado a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular de PEG puede estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. PEGs de cadena ramificada, incluyendo pero no limitado a, Moléculas de PEG con cada cadena que tiene un MW en el rango de 1-100 JkDa (incluyendo pero no limitado a, 1-50 kDa o 5-20 kDa) también pueden emplearse. El peso molecular del PEG de cadena ramificada puede ser, incluyendo pero no limitado a, entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del PEG de cadena ramificada puede estar entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, y 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 1,000 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 5,000 Da y 20,000 Da. Un amplio rango de moléculas de PEG se describen en, incluyendo pero no limitado a, el catálogo Shearwater Polimers, Inc., catálogo Nektar Therapeutics, incorporado aquí por referencia. En general, al menos un extremo de la molécula PEG está disponible para reacción con el aminoácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, la variante de polipéptido hGH con un derivado PEG contiene una funcionalidad química que es reactiva con la funcionalidad química presente en la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. La estructura principal del polímero soluble en agua puede ser poli (etilen glicol). Sin embargo, deberá comprenderse que una amplia variedad de polímeros solubles en agua incluyendo pero no limitado a poli (etilen) glicol y otros polímeros relacionados, incluyendo poli (dextrano) y poli (propilen glicol), también son adecuados para utilizar en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli (etilen glicol) se pretende que abarque e incluya todas estas moléculas. El término PEG incluye, pero no está limitado a, poli (etilen glicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG bifuncional, PEG de múltiples brazos, PEG derivatizado, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG secundario (es decir PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales secundarios a la estructura principal de polímero) , o PEG con enlaces degradables . PEG típicamente es claro, incoloro, inoloro, soluble en agua, estable al calor, inerte a muchos agentes químicos, no se hidroliza o deteriora, y en general no es tóxico. Poli (etilen glicol) se considera biocompatible, es decir que PEG es capaz de coexistencia con tejidos u organismos vivos sin provocar el daño. Más específicamente, PEG es substancialmente no inmunogénico, es decir que PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando se conecta a una molécula que tiene alguna función conveniente en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo, el PEG tiende a enmascarar el agente y puede reducir o eliminar cualquier respuesta inmune de manera tal que un organismo pueda tolerar la presencia del agente. Los conjugados de PEG tienden a no producir una inmuno respuesta substancial o provocar coagulación u otros objetos indeseables. PEG tiene la formula - CH2CH20- (CH2CH20) n --CH2CH2-, en donde n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4000, típicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, es adecuado para utilizar en la presente invención. PEG que tiene un peso molecular desde aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da. En algunas modalidades de la presente invención son particularmente útiles como la estructura principal del polímero. El peso molecular de PEG puede ser de un amplio rango, incluyendo pero no limitado a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular de PEG puede estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG está entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. La estructura principal de polímero puede ser lineal o ramificada. Estructuras principales de polímero ramificadas en general se conocen en la técnica. Típicamente, un polímero ramificado tiene una porción de núcleo de ramificación central y una pluralidad de cadenas de polímero lineales enlazadas al núcleo de ramificación central. PEG se emplea comúnmente en formas ramificadas que pueden ser preparadas por adición de etilen óxido a diversos polioles, tal como glicerol, olígomeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La porción de ramificación central también puede derivarse de varios aminoácidos tales como lisina. El poli (etilen glicol) ramificado puede ser representada en la forma general como R(-PEG-OH)m en donde R se deriva de una porción núcleo tal como glicerol, olígomeros de glicerol, o pentaeritritol, y m representa el número de brazos. Moléculas de PEG de múltiples brazos tales como aquellas descritas en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,932,462 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; Solicitud de Patente de los E.U.A. No. 2003/0143596; WO 96/21469; y WO 93/21259, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia en su totalidad, pueden ser también empleadas como la estructura principal del polímero.

PEG ramificado también puede estar en la forma de un PEG bifurcado representado por PEG(YCHZ2)n, en donde Y es un grupo enlace y Z es un grupo terminal activado enlazado a CH por una cadena de átomos de longitud definida. Todavía otra forma ramificada, el PEG secundario tiene grupos reactivos tales como carboxilo, sobre la estructura principal PEG en vez de en el extremo de cadenas PEG. Además de estas formas de PEG, el polímero también puede prepararse con enlaces débiles o degradables en la estructura principal. Por ejemplo, PEG puede prepararse con enlaces éster en la estructura principal de polímero que están sujetos a hidrólisis. Como se muestra a continuación, esta hidrólisis resulta en escisión del polímero en fragmentos de menor peso molecular: -PEG-C02-PEG-+H20 -> PEG-C02H+HO-PEG- Se entiende por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad que el término poli (etilen glicol) o PEG representa o incluye todas las formas conocidas en la técnica incluyendo pero no limitadas a aquellas aquí descritas . Muchos otros polímeros también son adecuados para utilizar en la presente invención. En algunas modalidades, estructuras principales de polímero que son solubles en agua, con de 2 a aproximadamente 300 términos, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros convenientes incluyen pero no están limitados a otros poli (alquilen glicoles), tal como polipropilen glicol) ("PPG"), sus copolímeros (incluyendo pero no limitados a copolimeros de etilen glicol y propilen glicol) , sus terpolímeros, sus mezclas y semejantes. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura principal del polímero puede variar, típicamente está en el rango desde aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, a menudo es de aproximadamente 6,000 Da a aproximadamente 80,000 Da. El peso molecular de cada cadena en la estructura principal del polímero puede estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena del polímero en la estructura principal está entre aproximadamente 100 Da y 50,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena en la estructura principal del polímero está entre aproximadamente 100 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena en la estructura principal del polímero está entre aproximadamente 1,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena en la estructura principal del polímero está entre aproximadamente 5,000 Da y 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena en la estructura principal del polímero está entre aproximadamente 10,000 Da y 40,000 Da. Aquellos con destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que la lista anterior para estructuras principales substancialmente solubles en agua de ninguna manera es exhaustiva y solamente es ilustrativa y que todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades anteriormente descritas se contemplan como adecuados para uso en la presente invención. En algunas modalidades de la presente invención los derivados de polímero son "multifuncionales", significando que la estructura principal de polímero tiene cuando menos dos términos y posiblemente tantos como aproximadamente 300, funcionalizados o activados con un grupo funcional. Derivados de polímero multifuncionales incluyen pero no están limitados a, polímeros lineales que tienen dos términos, cada término está unido a un grupo funcional que puede ser igual o diferente . Polímeros solubles en agua pueden enlazarse a los polipéptidos hGHs de la invención. Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse mediante un aminoácido no naturalmente codificado incorporado en el polipéptido hGH o cualquier grupo funcional o substituyente de un aminoácido no naturalmente codificado o naturalmente codificado, o cualquier grupo funcional o substituyente agregado a un aminoácido no naturalmente codificado o naturalmente codificado. En forma alterna, los polímeros solubles en agua se enlazan a un polipéptido hGH que incorpora un aminoácido no naturalmente codificado mediante un aminoácido de origen natural (incluyendo pero no limitado a, cisteína, lisina o el grupo amina del residuo N-terminal). En algunos casos, los polipéptidos hGHs de la invención comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos no naturales, en donde uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se enlazan a uno o varios polímeros solubles en agua (incluyendo pero no limitados a, PEG y/u oligosacáridos) . En algunos casos, los polipéptidos hGHs de la invención además comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más aminoácidos naturalmente codificados enlazados a polímeros solubles en agua. En algunos casos, los polipéptidos hGHs de la invención comprenden uno o más aminoácidos no naturalmente codificados enlazados a polímeros solubles en agua y uno o más aminoácidos de origen natural enlazados a polímeros solubles en agua. En algunas modalidades, los polímeros solubles en agua empleados en la presente invención mejoran la vida media en suero del polpéptido hGH respecto a la forma no conjugada. El número de polímeros solubles en agua enlazados a un polipéptido hGH (es decir, la extensión de modificación con PEG o glicosilación) de la presente invención puede ajustarse para proporcionar una característica alterada (incluyendo pero no limitada a, incrementada o disminuida) farmacológica, farmacocinética o farmacodinámica tal como vida media in vivo . En algunas modalidades, la vida media de hGH se aumenta al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, 2-veces, 5-veces, 10-veces, 50-veces, o al menos aproximadamente 100 -veces sobre un polipéptido no modificado. El grado y sitios en los cuales el o los polímeros solubles en agua se enlazan al polipéptido hGH pueden modular en enlace de polipéptido hGH al receptor de polipéptido hGH en el sitio 1 o socio de enlace. En algunas modalidades, los enlaces se disponen de manera tal que el polipéptido hGH liga al receptor de polipéptido hGH en el sitio 1 con una K¿ de aproximadamente 400 nM o menor, con una Kd de 150 nM o menor y en algunos casos con una K¿ de 100 nM o menor, como se mide por un ensayo de enlace en equilibrio tal como el descrito en Spencer et ah, J. Biol. Chem., 263:7862- 7867 (1988) para hGH. Métodos y químicas para activación de polímeros así como para conjugación de péptidos, se describen en la literatura y se conocen en la especialidad. Métodos comúnmente empleados para activación de polímeros incluyen pero no están limitados a, activación de grupos funcionales con bromuro de cianogeno, peryodato, gutaraldehido, bioepoxidos, epicloridina, divinilsulfona, carbodiimida, sulfonil haluros, triclorotriacina, etc. (ver, R. F. Taylor, (1991) , PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992) , CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Ratón; G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LlGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991) . Varias revisiones y manografías de la funcionalización y conjugación de PEG están disponibles. Ver por ejemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delqado et al, Critical Reviews in Hierapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995). Métodos para activación de polímeros también pueden encontrarse en WO 94/17039, patente de los E.U.A. Pat. No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, patente de los E.U.A. No. Pat. No. 5,219,564, patente de los E.U.A. No. Pat. No. 5,122,614, WO 90/13540, PATENTE DE LOS E.U.A. NO. Pat. No. 5,281,698, y WO 93/15189, y para conjugación entre polímeros activados y enzimas incluyendo pero no limitado a factor de coagulación VIII (WO 94/15625) , hemoglobulina (WO 94/09027) , moléculas que transportan oxígeno (patente de los E.U.A. No. Pat. No. 4,412,989), ribonucleasa y súperoxido dismutasa (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia.

Los productos de reacción subsecuentemente se someten a cromatografía de interacción hidrofóbica para separar las variantes de polipéptido hGH modificado con polietilenglicol de PEG libre. Las condiciones convenientes varían dependiendo de los tamaños relativos de los complejos entrelazados o reticulados contra los conjugados deseados y se determina fácilmente por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. El eluyente que contiene los conjugados deseados puede concentrarse por ultrafiltración y desalificarse por diafiltración. De ser necesario, el polipéptido hGH modificado con PEG obtenido de la cromatografía hidrofobica, pueda purificarse más por uno o más procedimientos conocidos por aquéllos con destreza ordinaria en la especialidad incluyendo pero no limitados a cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de aniones o cationes (utilizando, incluyendo pero no limitado a DEAE SEPHAROSE); cromatografía en silice; HPLC fase inversa; filtración en gel (utilizando, incluyendo pero no limitado a SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofobica; cromatografía exclusión de tamaño, cromatografía de metal -quelato; ultrafiltración/diafiltracion; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforeticos (incluyendo pero no limitados a enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (incluyendo pero no limitada a precipitación con sulfato de amonio) , o extración. Peso molecular aparente puede estimarse por GPC por comparación a normas de proteína globulares (Preneta, AZ en PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306) . La pureza del conjugado hGH-PEG puede estimarse por degradación proteolítica (incluyendo pero no limitada a esición de tripsina) seguido por análisis de espectrometría de masas. Pepinsky RB . , et ah, J. Pharmcol. & Exp. Titer. 297(3): 1059-66 (2001). 297(3): 1059-66 (2001) . Un polímero soluble en agua enlanzado a un amino ácido de un polipéptido hGH de la invención, puede ser adicionalmente derivatizado o substituido sin limitación. Otros derivados PEG y técnicas de modificación con PEG generales Otras moléculas PEG ejemplares que pueden estar enlazadas a polipéptidos hGH, así como métodos de modificación con PEG incluyen aquellos descritos por ejemplo en las publicaciones de patentes de los E.U.A. números 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637 2003/0228274; 2003/0220447 2003/0158333; 2003/0143596 2003/0114647; 2003/0105275 2003/0105224; 2003/0023023 2002/0156047; 2002/0099133 2002/0086939; 2002/0082345 2002/0072573; 2002/0052430 2002/0040076; 2002/0037949 2002/0002250; 2001/0056171 2001/0044526; 2001/0021763 patentes de los E.U.A. números 6,646,110; ,824,778; 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384 5,736,625 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034 5,516,673 5,382,657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100, 6,461,603 6,436,386; 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461, 5,739,208 5,672,662; 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460, 5,324,844 5,252,714; 6,420,339; 6,201,072; 6,451,346 6, 306, 821 5,559,213; 5,747,646; 5,834,594; 5,849,860 5,980,948 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316, que aquí se incorporan por referencia. Cualquiera de las moléculas PEG aquí descritas puedan emplearse en cualquier forma, incluyendo pero no limitadas a de cadena sencilla, cadena ramificada, cadena de múltiples brazos, funcional sencilla, bifuncional, multifuncional o cualquier combinación de las mismas. Mejorar afinidad para albúmina de suero Diversas moléculas también pueden fucionarse a los polipéptidos hGH de la invención para modular la vida media de polipéptidos hGH en suero. En algunas modalidades, se enlanzan moléculas o fusionan a polipéptidos hGH de la invención para mejorar la afinidad para albúmina de suero endógena en un animal . Por ejemplo, en algunos casos una fusión recombinante de un polipéptido hGH y una secuencia de enlace de albúmina se realiza. Secuencias de enlace de albúmina ejemplares incluyen pero no están limitadas al dominio de enlace de albúmina de proteína estreptococal G (ver por ejemplo Makrides et al, J. Pharmacol. Exp. flier. 277:534-542 (1996) y Sjolander et al, J Immunol . Methods 201:115-123 (1997)), o péptidos de enlace de albúmina tales como aquellos descritos en e.g., Dennis, et al, J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002). 277:35035-35043 (2002) . En otras modalidades, los polipéptidos hGH de la presente invención se acilan con ácidos grasos. En algunos casos, los ácidos grasos promueven enlace a albúmina de suero. Ver por ejemplo Kurtzhals, et al, Biochem. J. 312:725-731 (1995). 312:725-731 (1995). En otras modalidades, los polipéptidos hGH de la invención se fusionan directamente con albúmina de suero (incluyendo pero no limitado a albúmina de suero humano) . Aquellos con destreza en la técnica reconocerán que una amplia variedad de otras moléculas también pueden enlazarse a hGH en la presente invención, para modular el enlace a albúmina de suero u otros componentes de suero. XVI. Glicosilacion de Polipeptidos hGH La invención incluye polipéptidos hGH que incorporan uno o más aminoácidos no naturalmente codificados que contienen residuos sacárido. Los residuos sacárido ya pueden ser naturales (incluyendo pero no limitados a N-acetilglucosamina) o no naturales (incluyendo pero no limitados a fluorogalactosa) . Los sacáridos pueden enlazarse a los amino ácidos no naturalmente codificados ya sea por un enlace glicosidico N- u O- enlazado (incluyendo pero no limitado a N-acetilgalactosa-L-serina) o un enlace no natural (incluyendo pero no limitado a una oxima o el glicósido C- o S-enlazado correspondiente) . Las porciones sacárido (incluyendo pero no limitadas a glicósilo) pueden agregarse a polipéptidos hGH ya sea in vivo o in vitro. En ^algunas modalidades de la invención, un polipéptidos hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado que contienen carbonilo, se modifica con un sacárido derivatizado con un grupo aminooxi para generar el polipéptido glicosilado correspondiente enlazado por un enlace oxima. Una vez conectado al amino ácido no naturalmente codificado, el sacárido puede ser adicionalmente elaborado por tratamiento con glicosiltranferasas y otras enzimas para generar un oligosacárido ligado al polipéptido hGH. Ver por ejemplo, H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003) . XVII. Miembros de familias de súper genes GH dímeros y multímeros La presente invención también proporciona combinaciones de miembros de la familia de súper genes GH (incluyendo pero no limitados a hGH y análogos hGH) tales como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros (es decir trímeros, tetrámeros, etc.) en donde un polipéptidos miembro de la familia de súper genes GH tal como un hGH que contiene uno o más amino ácidos no naturalmente codificados se liga a otro miembro de la familia de súper genes GH o su variante o cualquier otro polipéptido que es un miembro de la familia de súper genes no-GH o su variante, ya sea directamente a la estructura principal de polipéptido o mediante un enlazador. Debido al peso molecular incrementado en comparación con monómeros, el miembro de la familia de súper genes GH, tal como hGH, conjugados dímero o multímeros puedan exhibir propiedades nuevas o deseables, incluyendo pero no limitados a diferentes farmacológicas, fármacocinéticas, farmacodinámicas, de vida media terapéutica modulada o de vida media en plasma modulada, respecto al miembro de familia de súper genes GH monómerico. En algunas modalidades, en miembro de la familia de súper genes GH tal como hGH, dímeros de la invención modularán la dimerización del receptor de miembro de la familia de súper genes GH. En otras modalidades, el miembro de la familia de súper genes GH dímeros o multímeros de la presente invención, actuarán como un antagonista, agonista o modulador de receptor de miembro de la familia de súper genes GH. En algunas modalidades, una o más de las moléculas hGH presentes en un dímero o multímero que contiene hGH comprende un amino ácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente dentro de la región de enlace de sitio II. Como tal, cada uno de las moléculas hGH del dímero o multímero son accesibles para enlazar al receptor de polipéptido hGH mediante la interfase de sitio I, pero no están disponibles para enlazar a un segundo polipéptidos hGH receptor mediante la interfase de sitio II. De esta manera, el dímero o multímero de polipéptido hGH puede acoplar los sitios de enlace de sitio I de cada uno de dos receptores polipéptido hGH distintos pero ya que las moléculas hGH tienen polímero soluble en agua conectado a un amino ácido no genéticamente codificado presente en la región de sitio II, los receptores de polipéptidos hGH no pueden acoplar a la región de sitio II del ligando polipéptido hGH y el dímero o multímero actúa como un antagonista de polipéptido hGH. En algunas modalidades, una o más de las moléculas hGH presentes en un polipéptido hGH que contienen dímero o multímero, comprenden un amino ácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente dentro de la región de enlace de sitio I, permitiendo enlace a la región de sitio II. En forma alterna, en algunas modalidades una o más de las moléculas hGH presentes en un polipéptido hGH que contienen el dímero o multímero, comprende un amino ácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente en un sitio que no está dentro de la región de enlace de sitio I o sitio II, tal que ambas estén disponibles para enlace. En algunas modalidades, una combinación de moléculas hGH se utiliza que tienen un sitio I, sitio II o ambos disponibles para enlace. Una combinación de moléculas hGH en donde al menos un sitio I disponible para enlace y al menos un sitio II disponible para enlace puede proporcionar moléculas que tienen una actividad o propiedad deseada. Además, una combinación de moléculas hGH que tienen tanto sitio I y sitio II disponibles para enlace, puede producir una molécula hGH súper agonista. En algunas modalidades, los polipéptidos miembros de familia de súper genes GH se enlazan directamente, incluyendo para no limitados a, mediante un enlace Asn-Lsy amida o un enlace disulfuro Cys-Cys. En algunas modalidades, los polipéptidos de miembro de familia de súper genes GH enlazados y/o el miembro de familia súper genes no-GH enlazado comprenderán diferentes amino ácidos no naturalmente codificados para facilitar la dimerización. En forma alterna, los dos polipéptidos de miembros de la familia súper genes GH y/o el miembro de la familia de súper genes no-GH enlazado, se unen por un enlazador. Cualquier enlazador hetero- u homo-bifuncional puede emplearse para enlazar los dos miembros de la familia de súper genes GH, y/o el miembro de la familia de súper genes no-GH enlazado, polipéptidos, que pueden tener la misma o diferente secuencia primaria. En algunos casos, el enlazador utilizado para atar al miembro de la familia de súper genes GH y/o el miembro de la familia de súper genes no-GH enlazado, polipéptidos en conjunto pueden ser un reactivo PEG no bifusional. El enlazador puede tener un amplio rango de peso molecular o longitud molecular. Enlazadores de peso molecular más grande o más pequeño pueden emplearse para proporcionar una relación o conformación espacial deseada entre la hGH y la entidad enlazada. En algunas modalidades, la invención proporciona enlazadores bifuncionales solubles en agua que tienen una estructura de campana que incluyen: a) un primer grupo funcional en al menos un primer extremo de una estructura principal de polímero; y b) al menos un segundo grupo funcional en un segundo extremo de la estructura principal de polímero. El segundo grupo funcional puede ser igual o diferente al primer grupo funcional. El segundo grupo funcional, en algunas modalidades no es reactivo con el primer grupo funcional. La invención proporciona, en algunas modalidades compuestos solubles en agua que comprenden al menos un brazo de una estructura molecular ramificada. Por ejemplo, la estructura molecular ramificada puede ser dendrítica. En algunas modalidades, la invención proporciona multímeros que comprenden uno o más miembros de familia de súper genes GH, tales como hGH, formados por reacciones con polímeros activados solubles en agua. XVIII. Punto de Administración y Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo pero no limitados a hGH, sintetasas, proteínas que comprenden uno o más amino ácidos no naturales, etc.) se emplean opcionalmente para usos terapéuticos, incluyendo pero no limitados a, en combinación con un portador farmacéutico conveniente. Estas composiciones, por ejemplo comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Este portador o excipiente incluye pero no está limitado a salino, salino amortiguado, dextrosa, agua, glicerol, etanol y/o sus combinaciones. La formulación se hace para ajustar al modo de administración. En general, métodos para administrar proteínas se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad y pueden aplicarse para administración de los polipéptidos de la invención. Composiciones terapéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de la invención se prueban opcionalmente en uno o más modelos de enfermedad en animales in vito y/o in vivo apropiados, para confirmar eficacia, metabolismo de tejido y para estimar dosis, de acuerdo con métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. En particular, dosis pueden determinarse inicialmente por actividad, estabilidad u otras medidas convenientes de homólogos amino ácidos no naturales aquí a naturales (incluyendo pero no limitados a comparación de un polipéptido hGH modificado para incluir uno o más amino ácidos no naturales a un polipéptido hGH amino ácido natural) , es decir en un ensayo relevante. . Las administraciones por cualquiera de las rutas normalmente empleadas para introducir una molécula en contacto final con la sangre o células de tejido. Los polipéptidos de amino ácido no natural de la invención se administran en cualquier forma conveniente, opcionalmente con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Métodos convenientes para administrar estos polipéptidos en el contexto de la presente invención a un paciente, están disponibles y aunque más de una ruta puede emplearse para administrar una composición particular, una ruta particular a menudo puede proporcionar una acción o reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta . Portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular administrada, así como por el método particular empleado para administrar la composición. De acuerdo con esto, hay una amplia variedad de formulaciones convenientes de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Polipéptidos hGH de la invención pueden administrarse por cualquier ruta convencional adecuada para proteínas o péptidos, incluyendo pero no limitada a inyecciones parenterales, por ejemplo inyecciones que incluye pero está limitadas a subcutáneas o intravenosas, o cualquier otra forma de inyección o infunciones. Composiciones de polipéptidos pueden administrarse por una cantidad de rutas incluyendo pero no limitadas a medios orales, intravenosos, intraperitoneales, intramusculares, trasndermicos, subcutáneos, tópicos, sublinguales o rectales. Composiciones que comprenden polipéptidos amino ácidos no naturales, modificados o no modificados también pueden administrarse mediante liposomas. Estas rutas de administración y formulaciones apropiadas en general se conocen por aquellos con destreza en la técnica. El polipéptido hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, puede emplearse solo o en combinación con otros componentes convenientes tales como portador farmacéutico. El polipéptido hGH que comprende un amino ácido no natural, solo o en combinación con otros componentes convenientes, también puede elaborarse en formulaciones de aerosol (es decir pueden "nebulizarse" ) para ser administrado mediante inhalación. Formulaciones en aerosol pueden colocarse en propulsores aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y semejantes. Formulaciones adecuadas para administración parenteral tales como por ejemplo por rutas interarticular (en las articulaciones) , intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutáneas, incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que puedan contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que puedan incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. Las formulaciones de hGH pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitarias o múltiples dosis, tales como ampolletas y frasquitos. Administración parenteral y administración intravenosa son métodos preferidos de administración. En particular, las rutas de administración que ya están en uso para agentes terapéuticos homólogos de amino ácidos naturales (incluyendo pero no limitados a, aquéllos típicamente empleados para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticuerpos y/o cualquier otra proteína suministrada farmacéuticamente) junto con formulaciones en uso actual, proporcionan rutas preferidas de administración y formulación para los polipéptidos de la invención. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención es suficiente para tener una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el tiempo, u otra actividad apropiada dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia del vector particular o formulación y la actividad, estabilidad o vida media de suero del polipéptido amino ácido no natural empleado y la condición del paciente, así como el peso corporal o área superficial del paciente a tratar. El tamaño de la dosis también se determina por la existencia, naturaleza y extensión de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompañan a la administración de un vector particular, formulación o semejantes en un paciente particular. Para determinar la cantidad efectiva del vector o formulación a administrarse en el tratamiento o profilaxis de enfermedad (incluyendo pero no limitado a cánceres, enfermedades heredadas, diabetes, SIDA o semejantes), el médico evalúa niveles de circulación en plasma, toxicidad de formulación, avance de la enfermedad y/o cuando sea relevante, la producción de anticuerpos de polipéptido amino ácido anti-no naturales. La dosis administrada por ejemplo, a un paciente de 70 kilogramos, típicamente esta en el rango equivalente a dosis de proteínas terapéuticas actualmente empleadas, ajustadas para la actividad alterada o vida media en suero de la composición relevante. Los vectores o formulaciones farmacéuticas de esta invención pueden suplementar condiciones de tratamiento por cualquier terapia convencional conocida, incluyendo administración de anticuerpo, administración de vacuna, administración de agentes citotóxicos, polipéptidos de amino ácido natural, ácidos nucleicos, análogos nucleótidos, modificadores de respuesta biológica y semejantes. Para administración, las formulaciones de la presente invención se administran a una velocidad determinada por la LD-50 o ED-50 de la formulación relevante, y/u observación de cualesquiera efectos secundarios de los polipéptidos de amino ácidos no naturales en diversas concentraciones, incluyendo pero no limitadas a cómo se aplica a la masa y salud total del paciente. Administración puede lograrse por dosis sencillas o divididas. Si un paciente se somete a infusión de una formulación desarrolla fiebre, calosfríos, o dolores musculares, recibe la dosis apropiada de aspirina, ibuprofren, acetaminofen u otra drogas para control del dolor/fiebre. Pacientes que experimentan las reacciones a la infusión tales como fiebre, dolores musculares y calofríos, son pre-medicados 30 minutos antes de las incursiones futuras ya sea con aspirina, acetaminofen o incluyendo pero no limitados a difenhidramina. Meperidina se utiliza para calofríos y dolores musculares más severos que no responden rápidamente a los antipiréticos y antiestaminas . La infusión celular se frena e interrumpe dependiendo de la severidad de la reacción. Polipéptidos hGH humanos de la invención pueden administrarse directamente a un sujeto mamífero. La administración es mediante cualquiera de las rutas normalmente empleadas para introducir polipéptidos hGH a un sujeto. Las composiciones de polipéptidos hGH de conformidad con modalidades de la presente invención, incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, inhalación (incluyendo pero no limitada a vía aerosol) , bucal (incluyendo pero no limitado a sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo pero no limitada a subcutánea, intramuscular, intradérmica, interarticular, intrapleural , intraperitoneal, intracerebral, intraarterial o intravenosa), tópica (por ejemplo tanto superficies de la piel como de mucosa, incluyendo superficies de vías respiratorias) y transdérmica, aunque la ruta más conveniente en cualquier caso determinado, dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se trata. La administración ya puede ser local o sistémica. Las formulaciones de compuestos pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitarias o múltiples dosis, tales como ampolletas y frasquitos. Polipéptidos hGH de la invención pueden prepararse en una mezcla en una forma inyectable de dosis unitaria (incluyendo pero no limitada a solución, suspensión o emulsión) con un portador farmacéuticamente aceptable. Polipéptidos hGH de la invención también puedan administrarse por infusión continua (usando, incluyendo pero no limitado a mini bombas tales como bombas osmóticas) , formulaciones de depósito de un solo bolo o de liberación lenta. Formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen isotónica a la formulación, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que puedan incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. Soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos estériles, granulos y tabletas del tipo previamente descrito. El secado por congelamiento es una técnica comúnmente empleada para presentar proteínas que sirven para retirar agua de la preparación de proteínas de interés. El secado por congelamiento o liofilización es un proceso por el cual el material a secarse primero se congela y después el cielo o solvente congelado se retira por sublimación en un ambiente de vacío. Un excipiente puede incluirse en formulaciones pre-liofilizadas para mejorar la estabilidad durante el proceso de secado por congelamiento y/o para mejorar la estabilidad del producto liofilizado ante almacenamiento. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) y Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991). 8(3):285-291 (1991). El secado por rocío de productos farmacéuticos también se conoce por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Por ejemplo, ver Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12) , 1169-1206 (1992) . Además de productos farmacéuticos de moléculas pequeñas, una variedad de materiales biológicos se han secado por rocío y estos incluyen: encimas, sueros, plasma, microorganismos y levaduras. El secado por rocío es una técnica útil debido a que pueda convertir una preparación farmacéutica líquida en un polvo fino, sin material pulverulento fino o aglomerado en un proceso de una etapa. La técnica básica comprende las siguientes cuatro etapas: a) atomización de la solución de alimentación en un rocío; b) contacto de rocío-aire; c) secado del rocío; y d) separación del producto seco del aire de secado. Las patentes de los E.U.A. números 6,235,710 y 6,001,800, que se incorporan aquí por referencia, describen la preparación de eritropoyetina recombinante mediante secado por rocío. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un portador, excipientes o estabilizante farmacéuticamente aceptable. Portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular empleado para administrar la composición. De acuerdo con esto, hay una amplia variedad de formulaciones convenientes de composiciones farmacéuticas (incluyendo portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales) de la presente invención (ver por ejemplo Remington 's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985)). 1985) ) . Portadores convenientes incluyen pero no están limitados a amortiguadores que contienen succinato, fosfato, aborato, HEPES, citrato, histidina o derivados de histidina, imidazol, acetato, bicarbonato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo pero no limitados a ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular incluyendo pero no limitados a aquellos con menos de aproximadamente 10 residuos; proteínas, incluyendo pero no limitadas a albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofíleos incluyendo pero no limitados a polivinilpirrolidona; amino ácidos incluyendo pero no limitados a glicina, glutamina, histidina o derivados de histidina, metionina, asparagina, arginina, glutamato o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo pero no limitados a tríalos, sacarosa, glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes incluyendo pero no limitados a, EDTA; iones de metales divalentes incluyendo pero no limitados a, zinc, cobalto o cobre; azúcar, alcoholes incluyendo pero no limitados a manitol o sorbitol; contra iones formadores de sal incluyendo pero no limitados a sodio; y/o surfractantes no iónicos incluyendo pero no limitados a TweenMR (incluyendo pero no limitado a Tween 80) (polysorbate 80) y Tween 20 (polysorbate 20; PS20) ) , PluronicsMR y otros ácidos pluronicos, incluyendo pero no limitados a ácidos pluronico F68 (poloxamero 188) , o PEG. Surfractantes convenientes incluyen por ejemplo pero no están limitados a poliéteres con base en poli (etilen oxido) -poli (propilen oxido) -poli (etilen oxido) , es decir (PEO-PPO-PEO), o polipropilen oxido) -poli (etilen oxido) -poli (propilen oxido) , es decir (PPO-PEO-PPO) , o su combinación. PEO-PPO-PEO y PPO-PEO-PPO están disponibles comercialmente bajo los nombres comerciales PluronicsMR, R-PluronicsMR, TetronicsMR y R-TetronicsMR (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) y además se describen en la patente de los E.U.A. número 4,820,352 aquí incorporada en su totalidad por referencia. Otros polímeros de bloque etileno/polipropileno pueden ser surfractantes convenientes. Un surfactante o una combinación de surfractantes puede emplearse para estabilizar hGH modificado con PEG contra uno o más tensiones incluyendo pero no limitados a tensión que resulta de agitación. Algunos de los anteriores pueden ser referidos como "agentes espesantes". Algunos pueden ser referidos como "modificadores de tonicidad" . Polipéptidos hGH de la invención, incluyendo aquellos enlazados con polímeros solubles en aguas tales como PEG también pueden administrarse por o como parte de sistemas de liberación sostenida. Composiciones de liberación sostenida incluyen, incluyendo pero no limitado a matrices de polímeros semipermeables en la forma de artículos conformados, incluyendo pero no limitados a películas o micro cápsulas. Matrices de liberación sostenida incluyen desde materiales biocompatibles tales como poli (2-hidroxietil metacrilato) (Langer et ah, J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etilen vinil acetato (Langer et ah, supra) o ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutirico (EP 133,988), polilactidas (ácido poliláctico) (patente de los E.U.A número 3,773,919; EP 58,481), poliglicolido (polímero de ácido glicolico) , polilactida co-glicolido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) polianhidridos, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et ah, Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli (orto) esteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolipidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliamino ácidos, amino ácidos tales como fenilalanina, tiroxina, isoleucina, poli nucleótidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicona. Composiciones de liberación sostenida también incluyen un compuesto atrapado liposomalmente . Liposomas que contienen el compuesto se preparan por métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Eppstein et al, Proc. Nati. Acad. ScL U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati. Acad. Set U.S.A., 77: 4030- 4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; patente de los E.U.A. 4,619,794; EP 143,949; patente de los E.U.A. número 5,021,234; solicito de patente japonesa 83-118008, Patente de los E.U.A. números 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Todas las referencias de patente citadas se incorporan aquí por referencia. Polipéptidos hGH liposomalmente atrapados pueden prepararse por métodos escritos en por ejemplo, DE 3,218,121; Eppstein et al., Proc. Nati. Acad. ScL U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati. Acad. ScL U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; patente de los E.U.A. número 4,619,794; EP 143,949; Patente de los E.U.A. número 5,021,234; solicito de patente japonesa 83-118008, patente de los E.U.A. números 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Composición y tamaño de liposomas son bien conocidos o capaces de determinar se fácilmente en forma empírica por una persona con destreza ordinaria en en la especialidad. Algunos ejemplos de liposomas se describen por ejemplo en Park JW, et al., Proc. Nati. Acad. ScL USA 92:1327-1331 (1995) , Lasic D y Papahadjopoulos D (eds) : MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cáncer therapy, in Teicher B (ed) : CÁNCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al, CHn. Cáncer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys. Acta 1591(1- 3): 109-118 (2002); Mamot C, et al, Cáncer Res. 63: 3154-3161 (2003) ) . Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia. La dosis administrada a un paciente en el contexto de la presente invención deberá ser suficiente para provocar una respuesta benéfica en el sujeto con el tiempo. En general, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del polipéptido hGH de la presente invención administrada parenteralmente por dosis está en el rango de aproximadamente 0.01 µg/xg/kg/día a aproximadamente 100 µg/kg o aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, del peso corporal del paciente, aunque esto está sujeto a discreción terapéutica. La frecuencia de dosificación también está sujeta a discreción terapéutica y puede ser más frecuente o menos frecuente que los productos de polipéptidos hGH comercialmente disponibles aprobados para uso en humanos. En general, un polipéptido hGH modificado con PEG de la invención puede administrarse por cualquiera de las rutas de administración descritas anteriormente. Se considera que una persona con destreza ordinaria en la especialidad, utilizando la descripción precedente puede emplear la presente invención en la expresión más amplia. Los siguientes ejemplos son solamente ilustrativos y no limitan las reivindicaciones o la presente descripción en forma alguna. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada. Ejemplo 1 Fermentación de ocho litros Este ejemplo describe métodos de expresión empleados para polipéptidos hGH que comprenden un amino ácido no natural. Células anfitrionas se transformaron con construcciones para tRNA ortogonal, aminoacil tR?A sintetasa ortogonal, y un polinucleotido que codifica polipéptidos hGH que comprende un codon selector. Preparación Base estéril, carbonato de potasio 5.5 M (0.5 L) , se prepara y esteriliza por vapor o filtración.

Desespumante poliaquileno 25% v/v estéril tal como Struktol J673 (0.1 L), se prepara y esteriliza con vapor. ?o se requiere ácido. Medio de alimentación concentrado (4 L definido) se prepara y esteriliza con filtro en un tanque de alimentación estéril o en una bolsa de bio-proceso. El fermentador se configura. Se esteriliza con solución de sales base de 3.91 L. El fermentador se lleva a las siguientes condiciones: Temperatura = 370C, pH = 6.9, aire 1 WM. 0.092 Medio de alimentación concentrado de 0.92 L se agrega al fermentador. 4 mL de 50 mg/mL de canamicina se agregan. Soluciones de glicerol y arabinosa (un extracto de levadura opcional) así como los siguientes reactivos, se prepararon: Metales en trazas (vapor esterilizado o esterilizado por filtro) Componente g/l Citrato de N3 74 FeCl3 . 6H20 27 CoCl2 . 6H20 2 Na2Mo04 . 2H20 2 ZnS04 . 7H20 3 MnS04 . nH20 2 CuCl2 . 2H20 1 . 3 CaCl2 . 2H20 1 H3BO3 0 . 5 Vitaminas (esterilizadas con filtro) Componente g/l Niacina 6 . 1 Ácido pantotenico 5.4 piridoxina. HCL 1.4 Tiamina. HCl 1 Riboflaviana 0.42 Biotina 0.06 Ácido fólico 0.04 Glucosa (esterilizada con vapor o esterilizado con filtro) Componente g/l Glucosa 600 1.8-2 MgS0 1 M (esterilizado con vapor o esterilizado con filtro) Componente g/l MgS04.7H20 246 Sulfato de amonio, 400 g/l (esterilizado con vapor o esterilizado con filtro) Componente g/l Sulfato de amonio 400 K2C03 5.5 M (esterilizado con vapor o esterilizado con filtro) Componente g/l K2C03 760 H20 0.76 L-leucina 1 M (esterilizado con filtro) Componente g/l L-leucina 131 HCl Conc. 0.1 L-leucina 1 M (esterilizado con filtro) Componente g/l L-isoleucina 131 HCl Conc. 0.1 Sales base IX (esterilizado con vapor o esterilizado con filtro) Componente g/l Na2HP04 . 7H20 15 . 4 KH2P04 6 . 8 NH2C1 4 Alimentación concentrada Componente g/l Solución de sulfato de amonio 0 . 194 Solución de glucosa 0.537 Solución de magnesio 0.029 Solución de concentrado de metales en trazas 0.045 Solución de concentrado de vitaminas 0.045 L-isoleucina 0.054 L-leucina 0.096 Medio de lote Componente g/l o 1/1 Solución de sales base, IX 0.977 Medio de alimentación concentrado 0.023 Proceso El proceso realizado se describe cómo se indica en la tabla 2. Tabla 2 Días Reloj Hora (hr) Acción -2 0800 -46 2 ml de cultivo inicial se empiezan con material glicerol 1 µ li . El cultivo se agita a 37 grados C, 250 rmp hasta OD60o=2.6. -1 0800 -22 150 µ L de cultivo de inicio se transfieren a 150 mL de medio de definido en un matraz de agitación. El cultivo se incuba a 28-37 grados C con aeración hasta OD6oo = 2-5. 1 0600 0 100 mL de cultivo de siembra se transfieren al fermentador. 1 1400 8 La bomba de alimentación se inicia. La sincronización exacta de estos se dicta por cuando el cultivo agota los nutrientes del lote aproximadamente 2.6 L de medio de alimentación concentrado se alimenta el cultivo sobre 19.5 horas utilizando un programa de alimentación predefinido. La velocidad de alimentación mínima fue de 0.31 mL/minuto y la velocidad de alimentación máxima fue 6 mL/minuto. Si se requiere el DO (oxígeno disuelto) se controla con cascada de agitación y suplemento de 02. 0830 26.5 200 mL de bolo de glicerol al 80% se agregan al cultivo mientras que se mantiene el programa de alimentación de alimentación concentrada. 0930 27.5 La alimentación concentrada se interrumpe. La alimentación se cambia a una solución de glicerol al 40%, y la línea de alimentación se purga. La alimentación se detiene. El amino ácido no natural pAF se agrega a una concentración final de 4 mM. El cultivo se induce con un bolo de 8 mL de arabinosa al 20%. 2 1130 29.5 La alimentación de glicerol al 40% se activa. 2 1930 37.5 Se cosechan las células. Densidades de células húmedas apretadas fueron de 0.2 a 0.3 kg/L. La pasta celular fue congelada a -80 grados C. El programa de alimentación fue cómo se indican la Tabla 3 y el gasto de flujo de alimentación de fermentación se muestra como en la Figura 1. Ver también la Figura 2. TABLA 3 tiempo Gasto de Notas aproximado flujo (h) (ml/min) 0 0 Tiempos indicados son post- inoculación. 8 0 8 0.31 Gastos de flujo aumentaron linealmente de un punto de ajuste al siguiente. 10 0.42 12 0.57 14 0.77 16 1.04 18 1.40 20 1.90 22 2.57 24 3.47 26 4.69 27.5 6.00 El flujo se interrumpe a 27.5 horas después de purgar la línea con glicerol al 40%. 27.5 0.00 29.5 0 29.5 1.90 Alimentación de glicerol al 40% se activa a 29.5 horas. 37.5 1.90 37.5 0 Fermentación se recolecta. Modificaciones a este esquema se han completado en la etapa de inducción (etapa IV) y la etapa de cosecha (etapa V) . Después de que el cultivo alcanzó un OD6oo de aproximadamente 100 a aproximadamente 120 a) el bolo de glicerol se suministra a 1.5 horas antes de inducción; b) el pAF de agrega y cambia a alimentación de extracto de levadura/glicerol se realiza 1 hora antes de inducción; 3) arabirosa se agrega a 0 horas antes de inducción; 4) de inducción se completa por 8 horas.

Ejemplo 2 Purificación hGH, Modificación con PEG, y Proceso de Purificación hGH-PEG Preparación citoplásmica a Partir de E. coli 1. Lisis celular y oxidación hGH 850 gramos de precipitado celular bacterial se resuspenden en 2550 ml (3 volúmenes) de TRIS 20 mM, amortiguador de lisis pH 8.5 para obtener una mezcla que es 25% sólida. Aproximadamente cuatro litros de cultivo en caldo de fermentación producirán este precipitado bacteriano de 850 gramos. Esta mezcla se agita a temperatura ambiente por 30-60 minutos, y la suspensión se pasa a través de un procesador microfluidizador dos veces con enfriamiento a 1034.2 bar (15,000 psi) . El lisado se centrifuga a 13,500 xg por 45 minutos en un rotor JA10 a 4 grados C, y el sobre nadante se recolecto. GSSG 0.1 M recientemente preparado (FW 612.6) se agrega de manera tal que la proporción molar de GSSG a hGH fue aproximadamente 16. La combinación se agita para mezclar bien, y el pH se ajusta a 7.2 - 7.4 con 1 M NaOH. Después de que la mezcla se agita durante la noche a 4 grados C, se diluyó hasta que su conductividad es 1.6 —1.9 mS/cm con agua. La muestra se designa como GHQFFload con el número de lote. 2. Columna 1 - Cromatografía Q Sefarosa FF La dimensión de columna fue como se indica: INdEX100/500, lOOOmml.D. x 21.5 cm = 1688 ml . Amortiguador GHQFF A consistió de Bis-TRIS 10 mM, pH 6.5 con la conductividad de 0.5 mS/cm, y amortiguador GHQFF B que consiste de Bis-TRIS 10 mM, NaCl 1 M, pH 6.5 con una conductividad de 90 mS/cm. El gasto del flujo fue 90 ml/min para procesar la muestra y 40 ml/min para limpiar. El sistema AKTA fue despirogenado. Para despirogenar y equilibrar la columna QFF, el programa "QFF depy equi" se empleó: La columna se lava con 2 volúmenes de columna de MilliQ, 2 volúmenes de columna NaOH/lM 1 M NaCl incubó por 30 minutos, lavo con 3 volúmenes de columna de amortiguador GHQFF B después equilibró con cuatro volúmenes de columna de amortiguador GHQFF A. La muestra GHQFFload se cargó sobre una columna de intercambio aniones. La columna se lavo con 5 volúmenes de columna de amortiguador GHQFF A y eluyó con 4 volúmenes de columna de amortiguador GHQFF B al 6% en A. El pico mayor se recolecto. La recolección de muestra se inició a aproximadamente 0.85 mS/cm y 166 mAU y terminó a aproximadamente. 220 mAU. El eluato recolectado se designo como GHQFFpool con el número de lote, y fue de color naranja cafetoso. El recolectado se almacenó a 4 grados C durante la noche. El rendimiento de etapa promedio de tres lotes fue 84.7%. La columna se lavo con 2 a 3 volúmenes de columna de amortiguador GHQFF B. 2 volúmenes de columna de NaOH/lM NaCl 1 M se ingresan por bombeo, y la columna se incuba por 1 a 6 días. Si la columna no se emplea en 6 días, se enjuago con 1 volumen de columna de NaOH/lM NaCl 1 M, 3 volúmenes de columna de amortiguador B, 2 volúmenes de columna de agua MilliQ, y 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20%. Una limpieza extensa de la columna se realizó cada 3 a 5 ciclos. Siguiendo la incubación de NaOH/lM NaCl 1 M, se realizó lo siguiente: flujo ascendente de lavado con 2.5 volúmenes de columna de amortiguador Q Column Cleaning incubaron por un 60-80 horas, lavaron con 1.5 volúmenes de columna de agua MilliQ, 1 volumen de columna de 0 a 70% de EtOH, 5 volúmenes de columna de EtOH al 70%, 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20%. El amortiguador Q Column Cleaning consistió de Tritón X-100 al 0.5%, ácido acético 0.1 M. 3. UF/DF (Ultrafiltración/Diafltración) I El siguiente filtro se utiliza para este procedimiento: Cassette Sartorius Sartocon Slice 10K Hydrosart, 1000 cm2. La muestra GHQFFpool se concentró a - 450 ml (o - 200 ml en el matraz de retenido) . Después se diafiltró con 2.7 L (6 - volúmenes) de amortiguador GHCHT A qué consiste de Bis-TRIS 10 mM, 1 mM MgCl2, pH 6.3. Después de recolectar el retenido, el sistema se enjuaga con 300 ml del amortiguador y la solución de enjuague se combina con el retenido. El retenido se centrifuga a 4,000 rpm (2,862 xg) por 5 minutos, y el sobre nadante se recolecta. El sobre nadante se designa como GHQFFload con el número de lote. Esta muestra ya se procesa en 2 horas o se almacena a 4 grados C durante la noche . 4. Columna 2 - Cromatografía de Hidroxiapatita Cerámica (CHT = Ceramic Hydroxyapatite Chromatography) (Tipo I CHT, 40 µm) La dimensión de columna fue como sigue: INdEX100/500, lOOmml.D. x 10.5cm = 824 ml . Amortiguador GHQFF A consiste de Bis-TRIS 10 mM, MgCl21 M, pH 6.3 con una conductividad de 0.94 mS/cm. Amortiguador GHQFF B consisto de Bis-TRIS 10 mM, MgCl2 0.5 mM, pH 6.3 con una conductividad de 80.5 mS/cm. El gasto de flujo fue 90 ml/min para procesamiento, y 40 ml/min para limpieza. El sistema AKTA fue despirogeno. Para despirogenar y equilibrar la columna CHT, el programa "CHT depy equi" se operó: la columna CHT se lavo con 2 volúmenes de columna de MilliQ, 2 volúmenes de columna de NaOH/lM 1 M NaCl incubó por 30 minutos, lavo con 3 volúmenes de columna de NaP04/pH 0.5 M 7.0 y después se equilibró con 4 volúmenes de columna de amortiguador GHQFF A. La muestra GHCHTload después se carga en la columna. La columna se lava con 5 volúmenes de columna con amortiguador GHCHT A. Se realizó elución con un gradiente lineal de amortiguador GHCHT B de 0 a 40% sobre 5 volúmenes de columna, o un gradiente de escalón de GHCHT B 40% sobre 3 volúmenes de columna y lavo con amortiguador GHCHT B al 100% sobre 2 volúmenes de columna. Se recolectó el pico principal. La recolección se inició a aproximadamente 26mAU, 20mS/cm, amortiguador GHCHT B 28% y se terminó a aproximadamente 86mAU, 34mS/cm, amortiguador GHCHT B al 40%. El eluato recolectado se designa como GHCHTpool con el # de lote. El recolectado se almacena a 4 grados C durante la noche. El rendimiento de etapa promedio de 3 lotes fue 96.3%. La columna CHT se lava con 3 volúmenes de columna de NaPO40.5 M/pH 7.0. La columna se dejó en este amortiguador fosfato o se realizó lo siguiente: Lavo la columna con flujo ascendente con 2 volúmenes de NaOH/lM NaCl 1 M, 3 volúmenes de columna de NaPO4/0.5 M pH 7.0, 2.5 volúmenes de columna de agua MilliQ, y 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20%.

. Columna 3 - Cromatografía HP de Fenil Sefarosa La dimensión de columna fue como sigue: INdEX100/500, lOOmml.D. x 9.7cm = 661 ml . El amortiguador GHPhe A consistió de NaP04 20 mM, NaCl 2 M, pH 7.0 con una conductividad de 163 mS/cm, y el amortiguador GHPhe B consisto de NaP04 20 mM, NaCl 1 M, pH 7.0 con una conductividad de 3.2 mS/cm. El gasto de flujo fue 90 ml/min para procesamiento, y 40 ml/min para limpieza. El sistema AKTA fue despirogenado. Para despirogenar y equilibrar la columna Phe, se ejecuta el programa "PheHP depy equi": la columna se lava con 2 volúmenes de columna de agua MilliQ, 2 volúmenes de columna NaOH/lM 1 M NaCl incuban por 30 minutos, después equilibra con 4 volúmenes de columna de amortiguador GHPhe A. NaCl sólido se agrega a GHCHTpool a 2 M. La mezcla se agita a temperatura ambiente por 1 a 2 horas para disolver y la solución se calienta a aproximadamente 20 grados C. Para calcular la cantidad de NaCl se le a requerido (Z g) (V + Z/4000) x 2 x 58.44 = Z, o Z = 116.88V/(1- 116.88/4000), en donde V es el volumen de GHCHTpool en litros. La mezcla GHCHTpool + NaCl se cargó en la columna. La columna se lavo con 3 volúmenes de columna de amortiguador GHPhe A. La elución se realizó con el siguiente gradiente complejo: etapa de 10% de amortiguador GHPhe B sobre 3 volúmenes de columna, gradiente de amortiguador GHPhe B 10 a 80% sobre 7 volúmenes de columnas, etapa de amortiguador GHPhe B al 80% sobre 2 volúmenes de columna y etapa de amortiguador GHPhe B al 100% sobre 3 volúmenes de columna. Se recolectó el pico principal. La recolección se inició a aproximadamente 17.3mAU, 111 mS/cm, amortiguador GHPhe B al 46.7%, y se terminó a aproximadamente 43mAU, 54mS/cm, amortiguador GHPhe B al 80%. El eluato recolectado se designa como GHPhepool con el número de lote, y fue una solución incolora. La siguiente etapa ya se realizó en dos horas, o el recolectado se almacenó a 4 grados C durante la noche. El rendimiento de etapa promedio de 3 lotes es 94.6%. La columna Phe se lava con flujo ascendente con 2 volúmenes de columna de NaOH ÍM incuba por 30 minutos, lava con 3 volúmenes de columna de amortiguador GHPhe A, 3 volúmenes de columna de agua MilliQ, y 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20%. Después de 3 a 5 ciclos, la columna Phe se lava con flujo ascendente con 2 volúmenes de columna de NaOH ÍM, incuba por 30 minutos, lava con 3 volúmenes de columna de amortiguador GHPhe A, 3 volúmenes de columna de agua MilliQ, EtOH al 0-70% sobre un volumen de columna, 3 volúmenes de columna de EtOH al 70% y almacenó en EtOH al 20%. 6. UF/DF (Ultrafiltración/Diafiltración) II El siguiente filtro se emplea para este procedimiento: cásete Sartorius Sartocon Slice 10K Hydrosart, 1000 cm2. El GHPhe pool se concentra hasta -450 ml (o - 200 ml en el matraz de retenido) . Después se diafiltra con 2.7 L (6-volúmenes) de amortiguador de formulación GH que consiste de citrato de sodio 20 mM, 20 g/L de Glicina, 5 g/L de Manitol, pH 6.0. La muestra se concentra hasta -360 ml . El retenido se recolecta. El sistema se enjuaga con 300 ml de amortiguador de formulación GH, y la solución de enjuague se combina con el retenido. El retenido se centrifuga a 4,000 rpm (2,862 x g) por 5 minutos, y el sobrenadante se recolecta. El sobrenadante se designa como Y35pAF-cBx, y también se refiere como "carga en proceso" . El carga en proceso se toma en alícuota y almacena a -80 grados C. El rendimiento total de Y35pAF fue 435 mg por litro de cada fermentación. La pureza fue >90% con base en 3 métodos HPLC (RP-HPLC, SEC-HPLC, IEX-HPLC) y análisis SDS-PAGE. 7. UF/DF (Ultrafiltración/Diafiltración) lia Se empleó el siguiente concentrador/filtro para este procedimiento: Amicon Stirred Cell (200 ml) con una membrana YM10 (63.5 mm) . Amortiguador de reacción consistió de acetato de sodio 20 mM, 20 g/L de Glicina, 5 g/L de manitol, EDTA 1 mM, pH 4.0. Una porción del carga en proceso de la etapa 6 se utiliza tal como 250 mg de Y35pAF, y el pH se ajusta aproximadamente a 4 agregando 10-12% (v/v) de ácido acético al 10%. La muestra se concentró a 25-50 ml , y se agregó el amortiguador de reacción a aproximadamente 180 ml . El proceso se repitió hasta que un total de >500-veces de intercambio de amortiguador se logró. La muestra se concentró a aproximadamente 25 ml . El retenido se recolecta y centrifuga a 2,000 x g por 3 minutos para retirar cualquier precipitado. El sobrenadante se designa como Y35pAF-cBx/pH4 con la fecha. La concentración de proteína de Y35pAF-cBx/pH4 se determina al medir A276 de una muestra diluida a 20-veces, utilizando A276lm9/ml = 0.818. La concentración de Y35pAF- cBx/pH4 se ajusta a 8 mg/ml al diluir con el amortiguador de reacción. 8. Reacción de modificación con PEG La cantidad de 30K MPEG-Oxiamina requerida se calcula utilizando la proporción molar de PEG:Y35pAF = 10. El polvo de PEG se pesa y agrega a la solución de 8 mg/ml de solución Y35pAF a temperatura ambiente lentamente, y mezcla con una espátula después de cada adición. La mezcla de reacción se coloca a 280 grados C con ligera agitación por 18-48 horas. Modificación con PEG se confirma al correr un gel SDS. La reacción formó un enlace oxíma entre hGH y PEG. 9. Columna 4 - Cromatografía Source Q (30 m) La dimensión de columna fue como sigue: XK26/20, 26mmI.D. x 17 cm = 90 ml . Amortiguador SourceQ A consistió de TRIS 10 mM, pH 7.0 con una conductividad de 0.9 mS/cm. Amortiguador SourceQ B consistió de TRIS 10 mM, 1 M NaCl, pH 7.0 con una conductividad de 93 mS/cm. El gasto de flujo fue 6 ml/min. El sistema AKTA fue despirogenado. Para despirogenar y equilibra la columna SourceQ, se ejecutó el "SourceQ depy equi" lavó la columna SourceQ con 2 volúmenes de columna de MilliQ, 2 volúmenes de columna de NaOH/lM/ NaCl m, incubó por 30 minutos, lavó con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ B, después se equilibró con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ A. 20% (v/v) de base TRIS 0.5 se agregan a la mezcla de reacción de la etapa 8. Una dilución de 20 veces se realiza con 9-volúmenes de amortiguador SourceQ A y 10-volúmenes de agua MilliQ. La mezcla después se carga en la columna. La columna se lava con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ A. La elución se realiza con un gradiente lineal de amortiguador SourceQ B 0-10% sobre 20 volúmenes de columna. Se recolectó el primer pico mayor. El eluato recolectado se designa como SourceQ pool con el número de lote. El recolectado se almacena a 4 grados C durante la noche. 10. UF/DF (Ultrafiltración/Diafiltración) III El siguiente concentrador/filtro se emplea para este procedimiento: Amicon Stirred Cell (200 ml) con una membrana YMlO (63.5 mm) . Amortiguador WHO consistió de 2.5 g/L de NaHC03, 20 g/L de glicina, 2 g/L de manitol, 2 g/L Lactosa, pH 7.3. El SourceQ pool se concentra a 20-30 ml , y el amortiguador WHO se agrega a aproximadamente 180 ml . El proceso se repite hasta que se alcanzó un total de >600-veces de intercambio de amortiguad. La muestra después se concentra a 2 mg/ml de la concentración deseada. El retenido se recolecta, y el filtro se esteriliza con una membrana 0.2 µm en una campana. La muestra estéril se designa como PEG30-cY35pAF con el número de lote. La concentración hGH equivalente de PEG30-cY35pAF se determina al medir A276 de muestra diluida al utilizar A2761mg/ml = 0.818 con diluciones y mediciones en triplicado. El rendimiento total de la etapa 7 es aproximadamente 20%. La pureza de PEG-Y35pAF fue >95% con base en HPLC y análisis SDS-PAGE.

Ejemplo 3 Purificación hGH, modificación con PEG, y proceso de purificación hGH-PEG Preparación Periplásmica de E. coli 1. Liberación Periplásmica de hGH Un precipitado de células bacterianas de 800 gramos obtenido de aproximadamente 4 litros de caldo de fermentación se resuspende en 3200 ml (4 -volúmenes) de amortiguador PR 4-6 grados C (TRIS 50 mM, EDTA 2 mM, Tritón X-100 0.07%, pH 8.0; conductividad = 3 mS/cm) para obtener 20% de sólidos. Después de agitar la suspensión a 4-6 grados C por 1 hora, 150 ml de urea 8M se agregan para obtener una concentración final de urea de 0.3 M. Esta suspensión después se agita a 4-6 grados C por 1 hora. La suspensión se centrifuga a 15,000 x g por 25 minutos en un rotor J20 (Avanti J20 XP centrífugo-Beckman Coulter) a 4 grados C. El sobrenadante se recolecta, y su volumen se mide (aproximadamente 3.4 L) . La muestra se designa como PRS con la fecha y número de lote. 2. UF/DF (Ultrafiltración/Diafiltración) I El siguiente filtro se emplea para este procedimiento: cásete Sartorius Sartocon Slice 10K Hydrosart, 1000 cm2. Parámetros adicionales incluyen: gasto de flujo de filtrado de 80 ml/minuto y TMP de aproximadamente 0.965 bar (14 psi).

El sistema se despirogena con NaOH ÍN, y la circulación se deja durante 30-45 minutos. El sistema se enjuaga con aproximadamente 2 litros de MilliQ hasta que el pH bajó a menos de 8. El equilibrio se completa con amortiguador QFF A (Bis-TRIS 10 mM, pH 6.5) por al menos 5 minutos. PRS se concentra a aproximadamente 1.6 litros (o aproximadamente 1.4 litros en el recipiente de retenido) . Después se diafiltra con 5-volúmenes (7 litros) de amortiguador QFF A. Después de recolectar el retenido, el sistema se enjuaga con 300 ml del amortiguador, y la solución de enjuague se combina con el retenido. La muestra combinada se designa como QFFload con el número de lote. Fue de color cafetosa. Esta muestra ya se procesó en 2 horas o almacenó a 4 grados C durante la noche. El sistema se enjuagó con agua MilliQ y limpió con NaOH ÍN y circuló por 30-45 minutos. El enjuague después se completa con agua MilliQ hasta que el pH fue menor a 8. El cásete se almacenó en NaOH 0.1 N. 3. Columna 1 - cromatografía Q Sepharose FF La dimensión de columna fue como sigue: 50mm ID. x 6.3 cm = 123 ml (columna XK26/20) . El gasto de flujo fue 35 ml/min. Amortiguador QFF A consistió de Bis-TRIS 10 mM, pH 6.5 con una conductividad de 0.6 mS/cm. El amortiguador High Salt consistió de TRIS 10 mM, NaCl 1 M, pH 7.0 con una conductividad de 156 mS/cm. Amortiguador QFF B consistió de Bis-TRIS 10 mN, NaCl 0.1 M, pH 6.5 con una conductividad de 11.5 mS/cm. El sistema AKTA fue despirogenado. Para lograr esto, se ejecutó el programa "AKTA depy" tres veces: todas las líneas de amortiguador se colocaron en MilliQ para la primer ejecución del programa, y después en NaOH ÍN para la segunda ejecución. Se completó una incubación por 30 minutos, y las líneas de amortiguador se colocaron en agua MilliQ de nuevo para la tercer ejecución. El programa "QFF depy equi" se ejecuta para despirogenar y equilibrar la columna QFF: la columna QFF se lava con 2 volúmenes de columna de MilliQ H20, volúmenes de columna de NaOH 1 N/NaCl 1 M, incubó por 30 minutos, lavó con tres volúmenes de columna de amortiguador High SALT, después se equilibró con 4 volúmenes de columna de amortiguador QFF A. QFFload se carga entonces en la columna. La columna se lava con 5 volúmenes de columna de amortiguador QFF A, y 5.5 volúmenes de columna de amortiguador QFF B al 15% en A. La elución se realizó con 4.5 volúmenes de columna de amortiguador QFF B al 60% en A, y el pico de elución se recolectó. El eluato recolectado se designa como QFFpool con el número de lote, y fue de color amarillo claro. El recolectado se almacenó a 4 grados C durante la noche. La columna se lavó con 3 volúmenes de columna de amortiguador High Salt. Después, 3 volúmenes de columna de NaOH 1 N/NaCl 1 M admite o se ingresa por bombeo, y se realiza una incubación por 1 a 6 días. Si la columna no se emplea en 6 días, se enjuaga con 1 volumen de columna de NaOH 1 N/NaCl 1 M, 3 volúmenes de columna de amortiguador High SALT, Buffer, 3 volúmenes de columna de MilliQ H20, y 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20% o NaOH 10 mM. Una limpieza extensa de la columna se realiza cada 3 a 5 ciclos de manera tal que después de la incubación de NaOH 1 N/NaCl 1 M, se lava con flujo ascendente con tres volúmenes de columna de amortiguador Q Column Cleaning (Tritón X-100 0.5%, ácido acético 0.1 M) , incubó por 60-80 horas, lavó con 1.5 volúmenes de columna de MilliQ H20, 1 volumen de columna de EtOH 0 a 70%, 5 volúmenes de columna de EtOH al 70% y 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20%. 4. Columna 2 - cromatografía de Phenyl Sepharose HP La dimensión de columna fue como sigue: 50 mm ID. x 7.5cm = 147 ml (columna XK26/20) . El gasto de flujo fue 35 ml/minuto. Amortiguador Phe A consistió de TRIS 10 mM, NaCl 2 M, pH 7.0 con una conductividad de 156 mS/cm. Amortiguador pH B consistió de TRIS 10 mM, pH 7.0 con una conductividad de 0.9 mS/cm. El sistema AKTA fue despirogenado. El programa "AKTA depy" se ejecutó 3 veces: todas las línea de amortiguador se colocaron en agua MilliQ por la primer corrida y después en NaOH 1 N para la segunda corrida. Se completó una incubación por 30 minutos, y después todas las líneas de amortiguador se colocaron en agua MilliQ de nuevo para la tercer corrida. El programa "PheHP depy equi" se ejecuta para despirogenar y equilibrar la columna pH: se lavó con 2 volúmenes de columna de MilliQ H20, 2 volúmenes de columna de NaOH 1 M/NaCl 1 M, incubaron por 30 minutos, después equilibraron con 4 volúmenes de columna de amortiguador Phe A. NaCl sólido se agrega al QFFpool a 2 M. La mezcla se agita a temperatura ambiente por 1-2 horas para disolver el NaCl , y la solución se calentó a aproximadamente 20 grados C. Para calcular la cantidad de NaCl requerido (Z g) : (V + Z/4000) x 2 x 58.44 = Z, o Z = 116.88V/ (1-116.88/4000) , en donde V es el volumen de QFFpool en litros. El QFFpool + NaCl se carga en la columna. La columna se lava con 5 volúmenes de columna de amortiguador Phe A. La elución se realiza con el siguiente gradiente complejo: gradiente lineal B 0-45% sobre 10 volúmenes de columna, etapa B al 45% sobre 2 volúmenes de columna, y etapa B 100% B sobre 3 volúmenes de columna. El pico principal se recolecta durante la elución de gradiente. El eluato recolectado se designa como Phe pool con el número de lote y fue una solución incolora. La siguiente etapa se realiza o el recolectado se almacena a 4 grados C. La columna Phe se lava con flujo ascendente con 2 volúmenes de columna de NaOH 1 M, incubó por 30 minutos, lava con 3 volúmenes de columna de amortiguador Phe A, 3 volúmenes de columna de H20, y 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20% o NaOH 10 mM. Después de 3 a 5 ciclos, la columna Phe se lava con flujo ascendente con 2 volúmenes de columna de NaOH 1 M, incuba por 30 minutos, lava con 3 volúmenes de columna de amortiguador GH Phe A, 3 volúmenes de columna de H20, EtOH 0 a 70% sobre 1 volumen de columna, 3 volúmenes de columna de EtOH al 70%, y finalmente almacena en EtOH al 20%. 5. UF/DF (Ultrafiltración/Diafiltración) II El siguiente filtro se emplea para este procedimiento: cásete Sartorius Sartocon Slice 10K Hydrosart, 200 cm2. Parámetros adicionales incluyen gasto de flujo de filtrado de 15 ml/min y TMP de 0.965 bar (14 psi) . El amortiguador de formulación preliminar consistió de citrato de sodio 20 mM, 20 g/L de glicina, 5 g/L de manitol, pH 6.0 con una conductividad de 4.7 mS/cm. El sistema se despirogenó con NaOH ÍN, y la circulación permitió por 30-45 minutos. El sistema se enjuagó con aproximadamente 2 litros de agua MilliQ hasta que el pH bajó a menos de 8. El equilibrio se completa con amortiguador de formulación preliminar por al menos 5 minutos . El recolectado GH Phe pool se concentró hasta aproximadamente 350 ml (o aproximadamente 200 ml en el matraz de retenido) . Se completó la diafiltración con 2.1 litros (6-volúmenes) del amortiguador de formulación preliminar. Después la muestra se concentró a aproximadamente 350 ml , y se recolectó el retenido. El sistema se enjuaga con 300 ml del amortiguador, y la solución de enjuague se combina con el retenido. El retenido se centrífuga a 4,000 rpm (2,862 x g) por 5 minutos, y el sobrenadante se recolecta. El sobrenadante se designa como Y35pAF-pBx, y también se refiere como "carga en proceso" . La concentración de proteína de Y35pAF-pBx se determina al medir A276 de muestra diluida, utilizando A2761mg/tr?l = 0.818. El carga en proceso puede almacenarse a 4 grados C. Para almacenamiento a largo plazo, se tomó en alícuotas y mantuvo a -80 grado C. El sistema se enjuaga con agua MilliQ y limpia con NaOH 1 N al circular durante 30-45 minutos. Después se enjuagó con agua MilliQ hasta que el pH fue inferior a 8. El cásete se almacenó en NaOH 0.1 N. 6. UF/DF (Ultrafiltración/diafiltración) lía Se utiliza el siguiente concentrador/filtro: celda agitada Amicon (350 ml) con una membrana YM10 (76 mm) . Amortiguadores de reacción consistió de: Acetato de sodio 20 mM, 20 g/L de Glicina, 5 g/L de Manitol, EDTA 1 mM, pH 4.0 con una conductividad de 2.6 mS/cm. El sistema se despirogena con Pyroclean. Todos los componentes se incuban en Pyroclean por 30 minutos. Enjuague con agua MilliQ se completa hasta que A20s fue menos que 0.01. El pH de una porción del carga en proceso, tal como 300 mg, se ajusta a aproximadamente 4 al agregar 10- 12% (v/v) de ácido acético al 10%. Esta muestra se concentra a 25-50 ml , y el amortiguador de reacción se agrega a aproximadamente 350 ml . El proceso se repite hasta que un total de >500-veces intercambio de amortiguador se logra. La muestra después se concentra a aproximadamente 30 ml. El retenido se recolecta y centrifuga a 2,000 x g por 3 minutos para retirar cualquier precipitado. El sobrenadante se designa como Y35pAF-pBx/pH4 con la fecha. Para almacenamiento a largo plazo, se tomó en alícuotas y mantuvo a -80 grados C. La concentración de proteína de Y35pAF-pBx/pH4 se determina al medir A276 de una muestra diluida 20 -veces al utilizar A2761mg/ml = 0.818. La concentración de Y35pAF- pBx/pH4 se ajusta a 8 mg/ml por dilución con el amortiguador de reacción. 7. Reacción de modificación con PEG La cantidad de 30K MPEG-Oxiamina requerida se calcula utilizando la proporción molar de PEG:Y35pAF = 5. El polvo de PEG se pesa y agrega a 8 mg/ml de solución Y35pAF- pBx/pH4 a temperatura ambiente lentamente con agitación. La mezcla de reacción se coloca a 28 grados C con ligera agitación por 39-50 horas. La modificación con PEG se confirma al realizar SDS-PAGE. La reacción formó un enlace oxima entre hGH y PEG. 8. Columna 3 - Cromatografía Source Q (30µm) Las dimensiones de columna fueron como sigue: XK26/20, 26 mm ID. x 17 cm = 90 ml . El gasto de flujo fue 8 ml/minuto. El amortiguador SourceQ A consistió de 10 mM TRIS, pH 7.0 con una conductividad de 0.9 mS/cm. El amortiguador SourceQ B consistió de TRIS 10 mM, NaCl 1 M, pH 7.0 con una conductividad de 87 mS/cm.

Para despirogenar el sistema AKTA, el programa "AKTA depy" se ejecutó 3 veces: todas las líneas de amortiguador se colocaron en agua MilliQ para la primer corrida y en NaOH 1 N para la segunda corrida. Una incubación se completó por 30 minutos, y todas las líneas de amortiguador se colocaron en agua MilliQ de nuevo para la tercer corrida. Para despirogenar y equilibrar la columna SourceQ, el programa "SourceQ depy equi" se ejecuta: la columna SourceQ se lava con 2 volúmenes de columna de MilliQ H20, 2 volúmenes de columna de NaOH/IM NaCl 1 M, incubaron por 30 minutos, lavaron con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ B, después equilibraron con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ A. 20% (v/v) de base TRIS 0.5 M se agregan a la mezcla de reacción de la etapa previa. Una dilución de 20 -veces se realiza con 9 volúmenes de amortiguador SourceQ A y 10 volúmenes de MilliQ H20. El material diluido se pasa a través de un filtro 0.45 µm. El filtrado después se carga en la columna. La columna se lava con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ A. La elución se ejecutó con un gradiente lineal de amortiguador SourceQ B 0 a 10% sobre 20 volúmenes de columna. Frac- 950 se emplea para recolectar fracciones de elución a 13 ml/fracción. SDS-PAGE se ejecuta en el primer pico mayor para determinar el recolectado. Las fracciones recolectadas se designaron como recolectado SourceQ con el número de lote. El recolectado se almacena a 4 grados C durante la noche. 9. UF/DF (Ultrafiltración/diafiltración) III Se utiliza el siguiente concentrador/filtro: celda agitada Amicon (350 ml) con una membrana (76 mm) . Amortiguador de formulación preliminar consiste de citrato de sodio 20 mM, 20 g/L de Glicina, 5 g/L de Manitol, pH 6.0 con una conductividad de 4.7 mS/cm. El sistema se despirogena con Pyroclean. Todos los componentes se incuban en Pyroclean por 30 minutos. Enjuague con agua MilliQ se completa hasta que A20s < 0.01. El recolectado SourceQ se concentra a 20-40 ml , y el amortiguador de formulación preliminar se agrega a aproximadamente 350 ml . El proceso se repite hasta que un total de >600 -veces de intercambio de amortiguador se logra. La muestra se concentra a 2 mg/ml o la concentración deseada. El retenido se recolecta y el filtro esteriliza con una membrana 0.2 µm en una campana. La muestra estéril se designa como PEG30-pY35pAF con el número de lote . La concentración de hGH equivalente de PEG30-pY35pAF se determina al medir A276 de muestra diluida al utilizar A2761mg/ml = 0.818, y diluciones triplicadas y mediciones se efectuaron. PEG30-pY35pAF se almacena a 4 grados C. Para almacenamiento a largo plazo, se tomó en alícuotas y mantuvo a -80 grados C. Preparaciones de liberación periplásmica se han completado con cepas de DHlOB(fis) y W3110 con el gen araB inoperativo knocked out. Ambas cepas se transformaron con tRNA ortogonal, aminoacil tR?A sintetasa ortogonal, y construcciones hGH. La pureza de PEG-Y35pAF fue >95% con base en análisis HPLC y SDS-PAGE. Ejemplo 4 Comparación de preparaciones hGH: desprendimiento periplásmico contra citoplásmico (homogeneización) La Figura 3, Panel A y B muestran análisis SDS-PAGE de hGH producido en E. coli. Un lote de liberación periplásmica (lote de fermentación 050425B2; 800 gramos de pasta celular) y un lote citoplásmico (lisado por microfluidizador; lote de fermentación 050414B1; 60 gramos de pasta celular) se elaboraron.

Cada lote se corre sobre una columna QFF de 123 ml cpm amortiguador QFF A que consiste de Bis-TRIS 10 mM, pH 6.5 y amortiguador QFF B que consiste de Bis-TRIS 10 mM, pH 6.5, ?aCl 0. ÍM . Se realizaron tres cortes durante la elución: 15, 60, y amortiguador B al 100% (?aCl 15 M, NaCl 60 M, y NaCl 100 mM, respectivamente) . Las alícuotas de la separación se analizaron por SDS-PAGE.

Las pistas para el Panel A y B son como siguen: pista 1 = WHO hGH estándar; pista 2 = carga; pista 3 = BE / FT; pista 4 = amortiguador B 15%; pista 5 = amortiguador B 60%; y pista 6 - amortiguador B 100%. Ejemplo 5 Proceso de fermentación de 5 litros Este ejemplo describe métodos de expresión utilizados para polipéptidos hGH que comprenden un amino ácido no natural . Las cepas de células anfitrionas utilizada fue una línea celular W3110 modificada. Las células anfitrionas se transformaron con construcciones de tRNA ortogonal, aminoacil tRNA sintetasa ortogonal, y un polinucleótido que codifica polipéptido hGH que comprende un codón selector. El flujo de proceso se muestra como Figura 4. Preparación Se prepararon los siguientes reactivos: Elementos en trazas (esterilizados con vapor) Componente g/l Citrato de Na3 74 FeCl3.6H20 27 CoCl2.6H20 2 Na2Mo04.2H20 2 ZnS04JH20 3 MnS04 . nH20 2 CuCl2 . 2H20 1 . 3 CaCl2 . 2H20 1 H3B03 0 . 5 Vitaminas (esterilizadas con filtro) Componente g/l Niacina 6.1 Ácido Pantoténico 5.4 Piridoxina. HCl 1.4 Tiamina. HCl 1 Riboflavina 0.42 Biotina 0.06 Ácido Fólíco 0.04 MgS04 1 M (esterilizado con vapor) Componente g/l MgS04.7 H20 246 Hidróxido de amonio, 15% como NH3* para todos Componente 1/1 Hidróxido de amonio 15% 1 Sales Base, IX, para todos (esterilizado con vapor) Componente g/l Na2HP04J H20 15.4 KH2P04 6.8 NH4C1 4 Alimentación concentrada (componentes estériles mixtos asépticamente) Componente g o 1 por 1 Glicerol concentrado, 100% (p/v) 0.4 1 Solución de sulfato de magnesio 1 M* 0.05 1 Vitaminas 0.05 1 Elementos en trazas 0.05 1 Agua 0.45 1 *: Agregado después de esterilización con vapor, Medio de lote Componente 1/1 Solución de sales base, IX 0.98 Alimentación concentrada 0.02 Material canamicina 50 mg/ml 0.001 *: Agregado después de esterilización con vapor. Mezcla de extracto de levadura Marcor/Glicerol (Esterilizado al vapor) Componente g/l o 1/1 Polvo de extracto de levadura 200 g Glicerol concentrado 100% (p/v) 0.17 1 Material canamicina para todos (Esterilizado con Filtro) Componente mg/ml ml canamicina 50 3 En el día de uso, se prepararon los siguientes reactivos: p-Acetil Fenilalanina (pAF) * para todos (Esterilizado con Filtro) Componente g o ml p-Acetil Fenilalanina 4 g HCl 1 M 6.25 ml Agua 12.5 ml *: El volumen final se volvió 21.25 ml . Se usa toda la solución resultante después de filtración. L- (+) -Arabinosa 20% para todos (Esterilizado con Filtro) Componente g/l ml L- (+) -Arabinosa 200 1.25 * : Se usa toda la solución resultante después de filtración. Para cada fermentación se realizó lo siguiente: Struktol J 673 al 25% (0.1 L) se prepara y esteriliza por vapor. NH3* H0 al 15% (0.3 L) se prepara para control de pH y como fuente de nitrógeno. H3P04 al 10% (0.2 L) se prepara para control de pH. Alimentación concentrada, 1 L, se prepara en recipiente de alimentación 1. Mezcla YE/glicerol, 2 L, se prepara en el recipiente de alimentación 2. El fermentador se configuró. Se esterilizó con una solución de sales base 2.5 L. El fermentador se llevó a las siguientes condiciones: temperatura = 37 grados C, pH = 6.9, aire 1.0 WM con base en volumen de trabajo 5 L (Flujo de aire puede incrementarse hasta 2 WM) . La alimentación concentrada se agrega al fermentador y 2.5 ml de 50 mg/mL de canamicina se agrega. Programa de Proceso Día 1 ( etapa 1 : Aproximadamente 1 ul del E. coli MCB (banco de células maestro, material de glicerol) se pica y 1 µl de materiales de glicerol se transfiere en 2 ml de medio de lote + canamicina en un tubo de cultivo. La composición del medio de lote se describió anteriormente. Día 2 (Etapas II y III) : Etapa II : El tubo de cultivo contiene una densidad celular de aproximadamente 1-6 (OD6oo) • 0.01- 2 ml del cultivo del tubo se transfieren en 60 ml de medio de lote + canamicina en un matraz de agitación de 250 ml . Solo las células sanas que no se sometieron a agotamiento de carbón se emplearon. La composición del medio de lote se describió anteriormente. Etapa III : El fermentador se inoculó a un OD60o inicial de aproximadamente 0.05. La cantidad de las células (en L) requeridas de la Etapa II es : 2.5 x 0.05 = 0.031 L ( si el OD600 del matraz =4 ) Se deja que las células se desarrollen por lotes por aproximadamente 10 horas. El tiempo específico fue dictado por el agotamiento de glicerol en el cultivo. El agotamiento de glicerol se indica por una disminución súbita en velocidad de STIRR seguido por un aumento en la señal p02. La alimentación de glicerol concentrada se inició. La velocidad de alimentación se basa en la Formula I : 1 (0) - ^ x X(0) x V(0) x Ex?(juset x 0) x ? V X(0) = Yx/s * 8.0 g/l V(0) = 2.5 1; Exp(µset*0) = 1; Sf= 400 g/l Los valores anteriores se insertan en la ecuación F (O) = 7.5 ml/h. Un factor de ajuste en escala se emplea de manera tal que el real F(0) ' será 8.6 ml/h. F(t)'= F(0)'* Exp(µset*t). Para = 13 horas, F(t) '= 60.4 ml/hora.

El gasto de flujo se mantuvo a 60.4 ml/hora por 1 hora . Para la corrida, pAF se agrega al inicio de la alimentación 2. Inducción de arabinosa se agrega 1 hora después de admisión de pAF. El gasto de flujo de alimentación final 2 se mantiene hasta recolectar. Día 3 (etapas IV y V) etapa IV: El OD60o de cultivo alcanzó aproximadamente de 50 a 60. A una 1 antes de inducción (tiempo de alimentación = 14 horas) , 1) la alimentación concentrada (velocidad = 60.4 ml/hora en este tiempo) se detuvo. 2) YE/glicerol (200 g YE y 170 g de glicerol por litro) alimentado se inicia a 108.7 ml/hora. 3) un bolo de 21.25 ml que contiene 4.0 g pAF se agrega. El control del pH se continúa a pH 6.9, utilizando hidroxido de amonio al 15% y ácido fosfórico al 10% para ajustar el pH cuando se requiere. 3a) La velocidad de alimentación 2 se aumentó linealmente por 3 horas alcanzando 141.3 ml/hora al tiempo de alimentación = 17 horas. El cultivo OUR deberá permanecer a aproximadamente 250 mmol/l/hora. 3b) La transición de fuente de carbón se continuó por 1 hora. 3c) Una cantidad adecuada de células (OD6oo * ml = 2) se preparó para análisis SDS-PAGE. Al tiempo de inducción (tiempo de alimentación = 15 horas) , la inducción se realizó con 1.25 ml al 20% (p/v o 200 g/l) L- (+) -arabinosa. Cantidades adecuada de células (OD600 * ml = 4) se guardaron a 4 horas, 6 horas y 8 horas después de inducción para análisis SDS-PAGE. La inducción duró ocho horas. Etapa V: El OD6oo de cultivo se verificó al final de la inducción. Una cantidad adecuada de células (OD6oo * ml = 2) se separó para análisis SDS-PAGE. 2 x 200 ml de cultivo se recolectan por centrifugación para evaluación por ELISA. Las células se recolectaron utilizando centrifugación de cuba a 15,000 g por 22 minutos y las células se congelaron a -80 grados C. Este procedimiento se ha ajustado en escala a un cultivo de 100 litros. Ejemplo 6 Purificación hGH, Modificación con PEG y Proceso de Purificación hGH-PEG. Preparación Periplásmica de E. coli 1.Liberación Periplásmica de hGH. Una pasta celular bacteriana de 1.9 kilogramos se resuspende en aproximadamente 7.6 litros (4-volúmenes) de amortiguador PR a 4 grados C (TRIS 50 mM, EDTA 10 mM, Tritón X-100 0.07%, pH 8.0) para obtener un sólido al 20%. Después de agitar la suspensión a 4 grados C por 1 hora, urea 8 M se agrega para obtener una concentración final de urea de 0.3 M. La solución de urea de 8 M se emplea en 48 horas de preparación. Esta suspensión después se agita a 4 grados C por 1 hora. La suspensión se centrifuga 15,000 x g por 45 minutos en un rotor J20 de ángulo fijo (centrifuga Avanti J20 XP-Beckman Coulter) a 4 grados C. El sobre nadante se recolecta y su volumen se mide (aproximadamente 7.7 litros) . La muestra se designa como PRS con la fecha y número de lote. El PRS a se filtra a través de una cápsula de pre-filtro, Sartopure GF2 1.2 µm (1000 cm2) (Part # 5571303P800B) . El gasto del flujo del filtrado fue 0.86 L/minuto a un ajuste de bomba 1 (MasterFlex I/P modelo 7529-10) . El filtrado se recolecta y designa como PRSF con la fecha y número de lote. El volumen de PRSF se midió. El PRSF se filtra a través de una cápsula del filtro Sartopore 2 0.8+0.45 µm (500 cm2) (Parte # 5441306G700B) . El filtrado se recolecta y designa como PRSFF como con la fecha y número de lote. El volumen de PRSFF se mide. Análisis en proceso incluye análisis SDS-PAGE no reducido para confirmar la presencia de hGH en la forma correcta en comparación con una medición de A276 y ELISA para cuantificación. 2. UF/DF (Ultrafiltración/Diafiltración) I -Intercambio de Amortiguador por QFF. El siguiente filtro se emplea para este procedimiento: Cassette Sartorius Sartocon Slice 10K Hydrosart 2x1000 cm2. Parámetros adicionales incluyen: Gasto del flujo del filtrado (permeado) de 100-160 ml/minuto, presión de alimentación de 1.65 a 1.79 bar (24 a 26 psi) y presión de retenido de .34 a .41 bar (5 a 6 psi) . El sistema se despirogenó con NaOH ÍN y se permitió la circulación por 30-45 minutos. El sistema se enjuaga con aproximadamente 4 litros de MilliQ hasta que el pH baja a menos de 8. El equilibrio se completa con amortiguador QFF A (Bis-TRIS 10 mM, pH 6.5) por al menos 5 minutos . PRSFF se concentra hasta aproximadamente un décimo de su volumen. Después se diafiltra con 8 volúmenes de amortiguador QFF A. el detenido se recircula por 3-5 minutos. Después de recolectar de retenido, el sistema se lava por arrastre con 300-350 ml de amortiguador QFF A y la solución de enjuague se combina con el retenido. La muestra combinada se filtra a través de una cápsula Sartopore 20.8+0.45 µm (500 cm2) (Parte # 5441306G700B) , y el filtrado se recolectado se designa como carga QFF con la fecha y número de lote. Fue de color cafetoso. El volumen de la carga QFF se midió y la carga QFF ya se proceso dentro de 2 horas o almacenó a 4 grados C durante la noche. El sistema se enjuago con MilliQ y limpio con un NaOH 1 N al circular durante 30-45 minutos. El enjuague después se completa con MilliQ hasta que el pH fue menor a 8. El cassette se almacenó en NaOH 0.1N. Análisis en proceso incluye medición de A276 para cuantificar proteína total que determinar la cantidad de carga QFF para la siguiente etapa, ELISA, y análisis LAL, SDS-PAGE no reducido. 3. Columna 1 - 2 Cromatografía Q Sefarosa FF Q Sepharose Fast Flow se obtiene de GE Healthcare. Las dimensiones de columna fueron como sigue: 70mm ID. x 16 cm = 616 ml (INdEX70/500 columna) . La capacidad operativa fue 150 mg de proteína total (140-160 mg, con base en A276) o 10 mg de GH (con base en ELISA) por ml de QFF. El gasto de flujo fue 100 ml/minuto (velocidad lineal: 156 cm/h) . Amortiguador QFF A consistió de Bis-TRIS 10 mM, pH 6.5 con una conductividad de 0.6 mS/cm. Amortiguador QFF B consistió de Bis-TRIS 10 mM, NaCl 0.1 M, pH 6.5 1 con una conductividad de 11.5 mS/cm. El sistema explorador AKTA se despirogenó. Para lograr esto, el programa "AKTA depy" se ejecutó tres veces. Todas las líneas de amortiguador se colocaron en MilliQ para la primer corrida del programa y después en NaOH 1 N para la segunda corrida. Se completó una incubación por 30 minutos, y la línea de amortiguador se colocaron en MilliQ de nuevo para la tercer corrida. El programa "QFF depy equi" se ejecuta para despirogenar y equilibrar la columna QFF a 30 cm/h de velocidad lineal: la columna QFF se lava con 2 volúmenes de columna de MilliQ H20, 2 volúmenes de columna NaOH 1 N/ NaCl ÍM, incubaron por 30 minutos, lavaron con tres volúmenes de columna de amortiguador Q C (TRIS 10 mM, NaCl 2 M, pH 7.0 con una conductividad de 156 mS/cm) , después se equilibró con 4 volúmenes de columna de amortiguador QFF A. La carga QFF después se carga en la columna. La columna se lava con 4 volúmenes de columna de amortiguador QFF A, y 7 volúmenes de columna de amortiguador QFF B al 10% en A. La elución se realizó con 6 volúmenes de columna de amortiguador QFF B al 60% en A. La columna puede ser lavada con 3 volúmenes de columna de amortiguador QFF B. El pico de elución se recolecta. El eluato recolectado se designa como recolectado QFF con la fecha y número de lote. El recolectado se procesa dentro de 2 horas o almacena a 4 grados C durante la noche. La columna se lava con 3 volúmenes de columna de amortiguador Q C. Después tres volúmenes de columna de NaOH 1 N /NaCl ÍM se ingresan por bombeo, y una incubación se realiza por 1-6 días. Si la columna no se emplea en 6 días, se enjuaga con 1 volumen de columna de NaOH 1 N/NaCl ÍM, 3 volúmenes de columna de amortiguador Q C, 3 volúmenes de columna de MilliQ H20, y 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20% o NaOH 10 mM. Una limpieza extensa de la columna se realiza cada 3-5 ciclos de manera tal que siguiendo la incubación NaOH 1 N/NaCl 1 M, se lava con flujo ascendente con 3 volúmenes de columna de amortiguador Q Column Cleaning Buffer (Tritón X-100 0.5%, ácido acético 0.1 M) , incuba por 60-80 horas, lava con 1.5 volúmenes de columna de MilliQ H20, 1 volumen de columna de EtOH 0 a 70%, 5 volúmenes de columna de EtOH a 70% y 2.5 volúmenes de columna EtOH al 20%. NaCl 4M se agrega el recolectado QFF para alcanzar una concentración final de 0.1M. El producto se filtra a través de un filtro Sartobind Q100X (Parte #Q100X) , pre-equilibra con amortiguador QFF B, para retirar endotoxina. El filtrado se recolecta y etiqueta como QFF PoolQ con la fecha y número de lote. El filtrado se procesa en 2 horas o almacena a 4 grados C durante la noche . El QFF PoolQ se pasa a través de una cápsula de filtro Sartobran 0.45+0.2 µm (300 cm2) (Parte # 5231307H500B) y el filtrado se recolecta. El filtrado se designa QFF PoolQF con la fecha y número de lote. El QFF PoolQF se procesa en 2 horas o almacena a 4 grados C durante la noche. Análisis en proceso incluye medición de A276, ELISA, LAL, y análisis SDS-PAGE no reducida. 4. Columna 2 - Cromatografía de Fenil Sefarosa HP Phenyl Sepharose High Performance se obtiene de GE Healthcare. Las dimensiones de columna fueron como sigue: 100 mm ID. x 9.7 cm = 761 ml (INdEX100/500 columna) . La capacidad operativa fue 4.5 - 9 mg de proteína total de preferencia 6 - 8 mg de proteína total (con base en A276) , por ml de Phenyl HP . El gasto de flujo fue 100 ml/minuto (velocidad lineal: 76.4 76.4 cm/h). Amortiguador Phe A consistió de TRIS 20 mM, citrato de sodio 0.4 mM pH 7.0. Amortiguador Phe B consistió de TRIS 10 mM, pH 7.0 con una conductividad de 0.9 mS/cm. El sistema explorador AKTA fue despirogenado. El programa "AKTA depy" se ejecutó 3 veces: todas las líneas de amortiguador se colocaron en MilliQ para la primer corrida y después en NaOH 1 N para la segunda corrida. Se completo una incubación por 30 minutos, y después toda la línea de amortiguador se colocaron en MilliQ de nuevo para la tercer corrida. El programa "PheHP depy equi" se ejecuta para despirogenar y equilibrar la columna Phe a velocidad lineal 30 cm/h: se lavo con 2 volúmenes de columna de MilliQ H20, 2 volúmenes de columna NaOH lM/NaCl 1 M incubo por 30 minutos, después equilibro con 4 volúmenes de columna de amortiguador Phe A. Citrato de sodio 1.4 M se agrega a QFF PoolQF a una concentración final de 0.4 M. La mezcla se agita a temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora para disolver el citrato de sodio y la solución se calienta a aproximadamente > 16 grados C. El QFF PoolQF + citrato de Na se carga en la columna. La columna se lava con 4 volúmenes de columna de amortiguador Phe A, después 9 -17 volúmenes de columna de amortiguador Phe B al 27% en A. La duración de lavado de amortiguador Phe B al 27% depende de la cantidad total de proteína cargada en la columna. Entre más proteína se carga, menos volumen de columna de amortiguador Phe B al 27% se requiere. La elución se realiza con 8 - 10 volúmenes de columna de amortiguador Phe B al 48% en A. La columna se lava de nuevo con amortiguador Phe B al 100%. El pico de elución B al 48% se recolecta y designa como Phe Pool con el número de lote. La siguiente etapa se realiza en 2 horas, o el recolectado se almacena a 4 grados C durante la noche .

La columna Phe se lava con flujo ascendente con 2 volúmenes de columna de NaOH ÍM incuba por 30 minutos, lava con 3 volúmenes de columna de amortiguador Phe A, 3 volúmenes de columna H20 y 2.5 volúmenes de columna de EtOH al 20% o NaOH 10 mM. Después de 3 a 5 ciclos, la columna Phe se lava con flujo ascendente con 2 volúmenes de NaOH ÍM, incuba por 30 minutos, lava con 3 volúmenes de columna de amortiguador Phe A, 3 volúmenes de columna H20, EtOH al 0-70% sobre 1 volumen de columna, 3 volúmenes de columna de EtOH al 70% y finalmente almacena por EtOH al 20% o NaOH 10 mM. Análisis en proceso incluye medición de A276, ELISA, LAL, y análisis SDS-PAGE sin reducción. 5. UF/DF II -Formulación de GH de Carga en proceso El siguiente filtro se empleó para este procedimiento: cásete Sartorius Sartocon Slice 10K Hydrosart, 1000 cm2. Parámetros adicionales incluyen: gasto de flujo de filtrado (permeado) de 50-90 ml/min, presión de alimentación de 1.38 a 1.86 bar (20-27 psi), y presión de retenido de .206 a .275 bars (3-4 psi) . El amortiguador UF/DF II consiste de fosfato de sodio 10 mM, 20 g/L de Glicina, y 5 g/L de Manitol, pH 7.0. El sistema fue despirogenado con NaOH ÍN, y la circulación se deja por 30-45 minutos. El sistema se enjuaga con aproximadamente 4 litros de MilliQ hasta que el pH bajó a menos de 8. El equilibrio se completa con amortiguador UF/DF II por al menos 5 minutos. El Phe Pool se concentra a aproximadamente 700-900 ml (o aproximadamente 500-700 ml en el matraz de retenido). Diafiltración se completa con 4.2-5.4 litros (6-volúmenes) del amortiguador UF/DF II. El retenido se recircula por 3-5 minutos, y el retenido se recolecta. El sistema se lava por arrastre con 100-200 ml de amortiguador UF/DF II, y la solución de enjuague se combina con el retenido. La muestra combinada se filtra con una cápsula Sartobran 0.45+0.2 µm (150cm2) (Parte # 5231307H400B) , y el filtrado se designa como Y35pAF-pBx y también se refiere como "carga en proceso." La concentración de proteína de Y35pAF-pBx se determina al medir A276 de una muestra diluida utilizando A276 1 mg/ml = 1.037. El carga en proceso puede ser almacenado a 4 grados C por hasta 1 semana. Para almacenamiento a largo plazo, se toma en alícuotas y mantiene a -80 grados C. El sistema se enjuaga con agua MilliQ y limpia con NaOH 1 N al circular durante 30-45 minutos. Después se enjuaga con agua MilliQ hasta que el pH fue inferior a 8. El cásete se almacenó en NaOH 0.1 N. Análisis en proceso incluye RP-HPLC, medición de A276, ELISA, LAL, y análisis SDS-PAGE no reducida. 6. UF/DF lia - Concentración e intercambio de amortiguador para modificación con PEG El siguiente filtro se empleó para este procedimiento: cásete Sartoirius Sartocon Slice 10K Hydrosart, 200 cm2. Parámetros adicionales incluyen: gasto de flujo de filtrado (permeado) de 12- 14 ml/min, presión de alimentación de aproximadamente 1.72 bar (25 psi), y presión de retenido de 0 a .034 bar (0-0.5 psi) . El amortiguador de reacción consistió de Acetato de Sodio 20 mM, 20 g/L de Glicina, 5 g/L de Manitol, EDTA 1 mM, pH 4.0 con una conductividad de 2.6 mS/cm. El sistema se despirogenó con NaOH ÍN, y se permitió la circulación por 30-45 minutos. El sistema se enjuaga con aproximadamente 2 litros de agua MilliQ hasta que el pH bajó a menos de 8. El equilibrio se logró con amortiguador de reacción por al menos 5 minutos. El pH de una cantidad del carga en proceso de la etapa 5 se ajusta a aproximadamente 4 al agregar 3.7% (v/v) de ácido acético al 10%. Después se concentra al volumen diana con 8 mg/ml de concentración con base en la cantidad de hGH de partida empleado. La muestra después se diafiltra con 5 volúmenes del amortiguador de reacción. El retenido se recircula por 3-5 minutos, y después el retenido se recolecta. El sistema se lava por arrastre con 80-120 ml del amortiguador de reacción y se combina con el retenido. El retenido combinado se filtra a través de una cápsula Sartobran 0.45+0.2 µm (150cm2) (Parte # 5231307H400B) . El filtrado se designa como Y35pAF-pBx/pH4 con la fecha. La muestra puede almacenarse a 4 grados C durante la noche. La concentración de proteína de Y35pAF-pBx/pH4 se determina al medir A276 de una muestra diluida 20-veces utilizando A276 1 mg/ml = 1.037. La concentración de Y35pAF- pBx/pH4 se ajusta a 7 mg/ml (5-9 mg/ml) por dilución con el amortiguador de reacción. 7. Reacción de modificación de PEG El peso molecular de hGH con la p-acetil-fenilalanina substituida para la tirosina en la posición 35 (Y35pAF) fue 22,149 Da, y el peso molecular del lote de mPEG- oxiamina fue 30,961 Da. Ver SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. No. 2005/0170404 para la secuencia de hGH madura de tipo silvestre. La Figura 5 muestra la estructura química de PEG empleado. Utilizando la proporción molar de PEG:Y35pAF = 5, la cantidad de MPEG-Oxiamina 30K requerida fue calculada. El polvo PEG se pesó y agregó a los 7 mg/ml de solución Y35pAF a 25-28 grados C lentamente mientras que se agita. Grandes trozos de PEG sólido se rompieron manualmente. Siguiendo la última adición, la mezcla de reacción se coloca a 28 grados C con ligera agitación durante 39-50 horas. La reacción formó un enlace oxima entre hGH y PEG. Análisis en proceso incluye análisis SDS-PAGE no reducido para confirmar la modificación con PEG. 8. Columna 3 - Cromatografía Source 30Q Source 30Q se obtuvo de GE Healthcare. Las dimensiones de columna fueron como sigue: 70 mm ID. x 17.5 cm = 673 ml (columna INdEX 70/500). La capacidad de operación fue 2.4 mg (1-2.8 mg) GH por ml SourceQ. El gasto de flujo fue 80 ml/minuto (velocidad lineal: 125 cm/h) . Amortiguador SourceQ A consistió de TRIS 5 mM, pH 7.0. Amortiguador SourceQ B consisted of consistió de TRIS , MnaCl 0.1 M, pH 7.0. Para despirogenar el sistema explorador AKTA, el programa "AKTA depy" se ejecutó 3 veces: todas las líneas de amortiguador se colocaron en agua MilliQ para la primer corrida y en NaOH 1 N para la segunda corrida. Se completó una incubación por 30 minutos, y todas las líneas de amortiguador se colocaron en agua MilliQ de nuevo para la tercer corrida. Para despirogenar y equilibrar la columna SourceQ, el programa "SourceQ depy equi" se ejecutó: la columna SourceQ se lavó con 2 volúmenes de columna de MilliQ H20, 2 volúmenes de columna de NaOH 1 M/NaCl ÍM, incubaron por 30 minutos, lavaron con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ B, después se equilibraron con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ A. 20% (v/v) de base TRIS 0.5 M se agregan a la mezcla de reacción de la etapa previa (etapa 7) . La muestra después se pasa a través de una cápsula filtro Sartobran 0.45+0.2 µm (150 cm2) (Parte # 5231307H400B) . Una dilución de 20-veces se realiza con 9-volúmenes de amortiguador SourceQ A y 10 -volúmenes de MilliQ H20. La muestra diluida después se carga en la columna. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de amortiguador SourceQ A. La elución se realiza con un gradiente lineal de 0-50% de amortiguador SourceQ B sobre 10 volúmenes de columna. Las fracciones se recolectaron a aproximadamente 1/5 volumen/fracción de columna. SE-HPLC y análisis SDS-PAGE sin reducir se realiza en el primer pico mayor para determinar el recolectado. Las fracciones recolectadas se designan como SourceQ pool con la fecha y número de lote. El recolectado se almacena a 4 grados C durante la noche. 9. UF/DF (Ultrafiltración/Diafiltración) III - Concentrado e intercambio de amortiguador para el volumen formulado El siguiente filtro se emplea: cásete Sartorius Sartocon Slice 10K Hydrosart, 200 cm2. Parámetros adicionales incluyen: gasto de flujo de filtrado (permeado) de 12-14 ml/min, presión de alimentación de aproximadamente 1.72 bar (25 psi), y presión de retención de aproximadamente 0-0.034 bar (0-0.5 psi). El sistema se despirogenó con NaOH 1 N, y se permitió la circulación por 30-45 minutos. El sistema se enjuagó con aproximadamente 2 litros de agua MilliQ hasta que el pH bajó a menos de 8. El equilibrio después se realizó con amortiguador de formulación por al menos 5 minutos . El SourceQ pool (etapa 3.6) se concentra al volumen objetivo de 8 mg/ml concentración con base en la cantidad del material de partida empleado. Diafiltración se realiza con 6-volúmenes de amortiguador de formulación. El retenido se recircula por 3-5 minutos, y el retenido se recolecta. El sistema se lava por arrastre con 50-100 mis de amortiguador de formulación y combina con el retenido. El retenido combinado se filtra estéril con una cápsula Sartobran 0.45+0.2 µm (150 cm2) (Parte # 5231307H400B) utilizando técnica estéril en una campana de bioseguridad o una campana Clase 100. La muestra estéril se designó como PEG30-pY35pAF con el número de lote. La concentración de hGH equivalente de PEG30-pY35pAF se determina al medir A276 de una muestra diluida al utilizar A276 1 mg/ml = 1.145 con diluciones y mediciones triplicadas. El PEG30-pY35pAF puede almacenarse a 4 grados C por hasta 3 días. Para el almacenamiento a largo plazo, se tomó en alícuotas y mantuvo a -80 grados C. Material de una cepa de W3110 se ha procesado con este protocolo. La cepa empleada se transforma con tRNA ortogonal, aminoacil tRNA sintetasa ortogonal, y construcciones hGH. La pureza de PEG-Y35pAF fue >95% con base en análisis HPLC y SDS-PAGE. Ensayos de liberación completa incluyen pero no están limitados a, ensayos que evalúan atributos de PEG30-pY35pAF tales como apariencia, tiempo de disolución, identidad y pureza, potencia seguridad y otros atributos incluyendo pero no limitados a, pH. Métodos de prueba para evaluación incluyen pero no están limitados a, reducido y no reducido SDS-PAGE, SE-HPLC, RP-HPLC, IEX-HPLC, CEX-HPLC, medición de proteína de célula anfitriona, medición de D?A residual, A276 para concentración, ensayos de proliferación celular, LAL, pirógeno, esterilidad, biocarga (limite microbiano) , Karl Fisher (contenido de agua) , uniformidad de contenido y osmolalidad. El amortiguador empleado en el intercambio de amortiguador de UF/DF III puede ser cualquier amortiguador conveniente. Etapas adicionales después de UF/DFIII incluyen pero no están limitadas a, liofilización. La liofilización puede realizarse utilizando técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Este método se ha realizado con un precipitado de células bacterianas de aproximadamente 2.7 kg. Ejemplo 7 Métodos Adicionales Análisis de pureza por SDS-PAGE El siguiente método se emplea para evaluar la pureza de conjugados hGH recombinantes PEG y hGH recombinantes en volumen final y en proceso por SDS-PAGE, seguido por tinción de proteína total. Cualquier molécula cargada tal como una proteína migrará cuando se coloca en un campo eléctrico. La velocidad de migración de una proteína en un campo eléctrico depende de la fuerza del campo eléctrico, la carga eléctrica neta en la proteína y la resistencia a fricción. La resistencia a fricción es la función del tamaño y forma de la proteína. Cuando se desnaturaliza en la presencia de exceso de SDS, la mayoría de las proteínas ligan SDS en una proporción en el peso constante tal que tengan esencialmente idénticas densidades de carga y migran en geles de poliacrilamida de acuerdo con tamaño de proteína.

Proteínas separadas por electroforesis en gel pueden ser detectadas por tinción de azul brillante Coomassie. Equipo para este procedimiento incluye, los siguientes o sus equivalentes: XCell Surelock Mini -Cell (Invitrogen) , bloque de calentamiento ajustado a +70-80 grados C, fuente de energía (hasta 200V) , micro centrifuga (tal como Beckman Coulter Microfuge 18 o 22R) , y agitador recíproco. Los reactivos incluyen amortiguador NuPAGE MOPS SDS running buffer (20X, Invitrogen PN NPOOOl) ; NuPAGE MES SDS Running Amortiguador (20X, Invitrogen PN NP0002) ; NuPAGE LDS Sample Amortiguador (4X, Invitrogen PN NP0007) ; agente de reducción de muestra NuPAGE (10X, Invitrogen PN NP0009) ; gel de prevaciado NuPAGE Bis-Tris al 12%. 1. Omm x 10-pozos (Invitrogen PN NP0341BOX) ; gel de prevaciado NuPAGE Bis-Tris 4-12%, 1. Omm x 10-pozos (Invitrogen PN NP032 IBOX) ; marcador de peso molecular Pre-teñido (SeeBlue Plus2 , Invitrogen PN LC5925) ; MilliQ-quality H20 o equivalente; SimplyBlue SafeStain (Invitrogen PN LC6065) o equivalente; norma de referencia (norma WHO rhGH; soluciones de calibración para rhGH (Y35pAF-pB2/pB3, 2 mg/ml); soluciones de calibración para el conjugado pEG-rhGH (PEG30-pY35p AF-Ol, 2 mg/mL) . Concentraciones de proteína de las normas y el artículo de prueba se midieron utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad. Análisis de muestras de etapa de purificación pre-modificado con PEG 3 µ q de norma de referencia de (RS, por ejemplo solución de calibración Y35pAF-pB2/pB3) se prepararon bajo condiciones no reductoras. 3 µ g de la norma de referencia se agregan a 4X LDS y MilliQ H0 para obtener una muestra de 28 µ l en IX LDS. Similarmente, el artículo de prueba rhGH se prepara bajo condiciones no reductoras. Tanto el artículo de prueba rhGH y las normas de referencia se calentaron a +70-80 grados C por 8 a 10 minutos y centrifugaron antes de cargar en el gel. El gel pre vaciado Bis-Tris NuPAGE 12% se prepara con amortiguador IX MOPS SDS Running de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel se carga como sigue: Marcador de peso molecular pre-teñido, 3 //g de norma de referencia, artículos de prueba y se corren con un ajuste máximo de 200V por 50 minutos. El gel fue incubado en di-H20, teñido con agitación utilizando SimplyBlue o un equivalente y destiñó con agua. La posición de la banda principal del artículo de prueba rhGH se compara con los 3 /¿g de la norma de referencia. Análisis del rhGH de carga en proceso purificado /íg y 1 /íg de la norma de referencia de (RS, por ejemplo WHO rhGH) se prepararon bajo condiciones no reductoras y reductoras. Para condiciones no reducidas, 20 //g o l /íg de la norma de referencia se agregan 4X LDS y MilliQ H20 para obtener una muestra de 28 µ l en IX LDS. Para condiciones reducidas 20 o 1 µ g de la norma de referencia se agregan a 4X LDS, 10X Reducing Agent, y MilliQ H20 para obtener una muestra de 28 µ 1 en IX LDS y IX Reducing Agent. Tanto los artículos de prueba rhGH como las normas de referencia se calentaron a +70-80 grados C por 8 a 10 minutos y centrifugaron antes de cargar en el gel. Geles de pre vaciado Bis-Tris NuPAGE 12% se corren en amortiguador IX MOPS SDS Running de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una unidad para la condición no reductora y la otra unidad para la condición reductora. Los geles se cargaron como sigue: Marcador de peso molecular pre-teñido, 1 µ g de norma de referencia, 20 µ g de norma de referencia, pista en blanco, seguido por artículos de prueba a un ajuste máximo de 200V para 50 minutos. Los geles se incubaron en di-H20, tiñeron con agitación utilizando SimplyBlue o un equivalente y destiñeron con agua. La posición de banda principal del artículo de prueba rhGH se compara con la norma de referencia 20 µ g . En la pista del artículo de prueba es rhGH, ninguna banda aparte de la banda principal deber ser más intensa que la banda mayor en la pista de la norma de referencia 1 µ g (5%) . Análisis de modificación, PEG de rhGH y purificación de PEG-rhGH La norma de referencia de (RS, por ejemplo solución de calibración PEG30-Y35pAF-01) se prepara bajo condiciones no reductoras. 5 µ g se agregan a PEG30-pY35pAF-01 a 4X LDS y MilliQ H20 para obtener una muestra final de 28 µ 1 en IX LDS. 5 a 20 µ g del artículo de prueba, dependiendo del procedimiento que se analiza, se agregan a 4X LDS y MilliQ H20 para obtener una muestra final de 28 µ 1 en IX LDS. Para las mezclas de reacción de modificación con PEG, 15 a 20 µ g del artículo de prueba se emplean. Para análisis de la mezcla de reacción de modificación con PEG, se realiza una comparación entre: a) concentraciones en serie de rhGH antes de la adición de PEG a pH 4 para permitir estimación del por ciento relativo de rhGH no-modificado con PEG que queda en la mezcla de reacción de modificación con PEG; b) 10 µ 1 de una dilución 1/10 de la mezcla de reacción. 5-20 µ g del artículo de prueba se emplean de fracciones de columna durante la purificación posterior a modificación con PEG. Para el análisis de las fracciones de columna PEG-rhGH, se compararon fracciones de columna al utilizar volúmenes fijos de cada fracción de columna (típicamente 21 µ L de cada fracción de columna) . Artículo de prueba PEG-rhGH o muestras de norma de referencia PEG-rhGH no se calentaron. Las muestras se centrifugaron y cargaron en un gel de pre vaciado Bis-Tris NuPAGE 4 a 12% preparado con IX MES SDS Running Buffer de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel se cargo como sigue: El marcador de peso molecular pre-teñido, 5 µ g norma de referencia, seguido por los artículos de prueba y que se corre con un ajuste máximo de 200V por 35 minutos. Los geles se incubaron en di-H20, tiñeron con agitación utilizando SimplyBlue o un equivalente y destiñeron con agua. El electroferograma del artículo de prueba PEG-rhGH deberá adaptarse al electroferograma obtenido con la norma de referencia PEG-rhGH. Análisis de producto rhGH modificado con PEG 10 µ g de la norma de referencia (RS, por ejemplo solución de calibración PEG30-pY35pAF-01) se preparan bajo condiciones no reductoras y reductoras. 10 µ g de PEG30-pY35p (2 mg/mL) se agregan a 4X LDS y MilliQ H20 para obtener una muestra final de 28 µ 1 en IX LDS. Para condiciones reducidas, 10 µ g de la norma de referencia se agregan a 4X LDS, agente reductor 10X, y MilliQ H20 para obtener una muestran de 28 µ 1 en IX LDS y agente reductor IX. Similarmente, 10 Los artículos de prueba PEG-rhGH y la norma de referencia PEG-rhGH no se calentaron, pero se centrifugaron sometieron a centrífuga instantánea antes de cargar en geles de pre vaciado Bis-Tris NuPAGE 4 a 12% preparados con IX MES SDS Running Buffer de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los geles se cargaron en el orden de marcador de peso molecular pre-teñido, 10 /íg de norma de referencia, pista en blanco (recomendada para minimizar efectos de arrastre potencial) seguido por los artículos de prueba con un ajuste máximo de 200V por 35 minutos. Los geles se incubaron en di-H20, teñido con agitación utilizando SimplyBlue o un equivalente y destiñeron con agua. El electroferograma del artículo de prueba PEG-rhGH deberá adaptarse al electroferograma obtenido con la norma de referencia PEG-rhGH. El electroferograma del artículo de prueba PEG-rhGH deberá adaptarse al electroferograma obtenido con la norma de referencia PEG-rhGH. Cualesquiera bandas que no corresponden a la norma de referencia pueden ser producto de degradación o agregados. Bandas de superiores peso moleculares pueden representar agregados, y bandas de peso moleculares inferiores pueden representar polipéptido que no está más conjugado con PEG.

Análisis de pureza y degradación química de rhGH por CEX-HPLC/IEX-HPLC El siguiente método se emplea para estimar pureza relativa y degradación química potencial (es decir desamidación) de hormona de crecimiento humano recombinante modificada con PEG (rhGH) por cromatografía de líquido alto desempeño con intercambio de cationes (CEX-HPLC = cation-exchange high performance liquid chromatography) . CEX-HPLC es una técnica que se basa en interacción carga-carga entre una proteína y las cargas inmovilizadas en la resina. La cromatografía de intercambio de cationes aprovecha los iones cargados positivamente de una proteína que ligan a la resina cargada negativamente. Una modificación estructural común de desamidación rhGH de residuos asparagina (Asn) , y este método CEX-HPLC permite la separación de intermediarios desamidados y desamidación de rhGH modificado con PEG y no modificado con PEG. Este método se utiliza para soportar identificación y evaluación de pureza de rhGH modificado con PEG. Algunos productos de degradación parcial de rhGH se observan utilizando esta técnica. Equipo para este procedimiento incluye, los siguientes o sus equivalentes: Espectofotometro UV/Vis (Agilent 8453 o equivalente); cuba de cuarzo de 50 µ 1 ; 0.5 mL concentradores Vivaspin (si se requiere; Vivascience 10,000 MWCO, PES, VSO 102 o equivalente); PD- 10, NAP- 10, o NAP-5 columna (GE Healthcare, Cat #17-0851- 01, 17-0853-01, 17-0854-01); ampolletas HPLC y tapas (Alltech ampolletas de polipropileno con tapa roscada 100 µ l , tapas de forro de TFE #12962, tapas roscadas con orificio abierto #73048, #73044, o equivalente); botellas de vidrio limpias de 1 y 2 L; columna - PolyCAT A 4.6 x 200 mm, 5 µ , 1000 A (PolyLC, 204CT0510) y columna PolyCAT A guard, 4.6 x 10 mm, 5 µ , 1000 A (PolyLC, JGCCT0510) ; instrumento de cromatografía de líquido con alta presión capaz de realizar gradiente lineales (tales como Agilent 1100 HPLC equipado con desgasificador de vacío, bomba cuaternaria, auto muestreador con termostato, compartimiento de columna con termostato, detector de arreglo de diodos (DAD = diode array detector) , y soporte lógico o programa de cromatografía Chemstation) . Reactivos para este procedimiento incluyen agua (calidad Milli-Q o equivalente) y productos químicos sólidos son grado analítico o mejor y solventes son grado HPLC o mejor, a menos que se anote de otra forma. Almacenamiento de reactivos y etapas de procedimiento ocurren a temperatura ambiente, a menos de que se indique de otra forma. Ejemplos de estos productos químicos incluyen acetato de amonio, Spectrum A2149, grado HPLC o equivalente; Acetonitrilo, Fisher A998, grado HPLC o equivalente; bicarbonato de amonio, Fluka # 09830, Ultra > 99.5%, o equivalente; ácido acético glacial, Fisher # 64-19-7, grado HPLC o equivalente; citrato de sodio dihidratado, Spectrum S0165, grado USP o equivalente; Glicina, Spectrum AM125 o equivalente; Mannitol, Spectrum MA165, o equivalente; HCl 6N, Mallinckrodt 2662-46, o equivalente . Amortiguador de fase móvil A fue acetato de amonio 50 mM, pH 4.25, acetonitrilo al 40% (AcCN), y amortiguador de fase móvil B fue acetato de amonio 500 mM, pH 4.25, AcCN al 40%. Reactivos adicionales preparados fueron ácido acético al 10%; amortiguador para desamidación: bicarbonato de amonio 30 mM, pH 9.0; y amortiguador de dilución de muestra; citrato de sodio 20 mM, 20 g/L de glicina, 5 g/L de mannitol, pH 6.0, cada uno filtrado en estéril utilizando filtros PES 0.22 µ m (Corning #431098, o equivalentes). Se empleó rhGH de la organización mundial de la salud, OMS (WHO = World Health Organization) (Cat. # 98/574) como una norma hGH no-modificada con PEG. Fue reconstituida en 1.0 ml de agua y diluida a 1.1 mg/ml utilizando amortiguador de dilusión. 10% (v/v) de ácido acético al 10% se agrega para llevar el pH entre pH 3.8 -4.3 con una concentración final de 1.0 mg/ml (rango aceptable 0.9 - 1.1 mg/ml) . Otra norma hGH no modificada con PEG, la solución de calibración Y35pAF-pB2/pB3 , se prepara en una forma similar. Una norma hGH modificada con PEG, solución de calibración PEG30-pY35pAF-01 , también se prepara en una forma similar. Para la solución de resolución modificada con PEG, la solución de calibración PEG30-pY35pAF-01 se intercambia de amortiguador en bicarbonato de amonio 30 mM, amortiguador pH 9.0 utilizando una columna de desalificación PD-10, Nap-10, o Nap-5. La norma se concentra utilizando un concentrador Vivaspin 0.5 mL a aproximadamente 2 mg/ml (rango aceptable 1.9 - 2.1 mg/ml) , y la muestra se incuba a 37 grados C por 24 horas. La muestra o porción de la muestra requerida se diluye a 1.1 mg/ml utilizando amortiguador de dilución, y 10% (v/v) de ácido acético al 10% se agrega para llevar el pH entre pH 3.8 - 4.3 con una concentración final de 1.0 mg/ml (rango aceptable 0.9 - 1.1 mg/ml) . El artículo de pruebas se diluye a 1.1 mg/ml utilizando amortiguador de dilución y 10% (v/v) de ácido acético al 10% se agrega para llevar el pH entre pH 3.8 -4.3 con una concentración final de 1.0 mg/ml (rango aceptable 0.9 - 1.1 mg/ml) . Concentración de proteína de las normas y el artículo de prueba se miden utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad.

Procedimiento El instrumento se configura con las siguientes condiciones: 1) Columna: PolyCAT A 204CT0510 y JGCCT0510; 2) temperatura de auto muestreador: temperatura ambiente; 3) ajuste de bomba: gradiente de escalón: 81.5 acetato de amonio 81.5-108.5 mM pH 4.25 (7 - 13% B) , seguido por acetato de amonio 108.5 - 500 mM no pH 4.25 (13 - 100% B) ; 4) Tabla 4 ; Tabla 4 Tiempo Fase móvil Fase móvil Flujo Presión A B (ml/min) (bar) 0 100 0 1.0 140 10 100 0 1.0 140 11 93 7 1.0 140 91 87 13 1.0 140 102 0 100 1.0 140 118 0 100 1.0 140 119 100 0 1.0 140 115 100 10 1 140 ) ajuste de inyector — inyección: inyecciones estándar; volumen de inyección: 25 µ 1 ; velocidades de extracción: 50 µ l/min; velocidad de inyección: 50 µ l/min; lavado de ahuja: 15 µ l H20; tiempo de parada: igual que la bomba; 6) señales DAD: Tabla 5; Tabla 5 Muestra Bw Referencia Bw Unidades 280 600 100 nm 276 600 100 nm 214 600 100 nm 220 600 100 nm 250 600 100 Nm ancho pico: >0.1 min; ranura: 4 nm; tiempo de parada: igual que la bomba; 7) termostato de columna: temperatura: 30 grados C; registra la temperatura. La columna se equilibra con 10 a 15 volúmenes de columna de fase móvil A al 100%. 25 a 50 µ l de solución de calibración modificada con PEG PEG30-pY35p AF-01 se inyectan. El pico principal modificado con PEG eluido a un tiempo de retención de 56.97 min (+ 0.5 min) . A continuación 25-50 µ l de la solución WHO o de calibración Y35pAF-pB2/pB3 se inyecta y se ejecuta programa HPLC. El pico no-modificado con PEG principal eluyo a un tiempo de retención de 98.54 min (+ 0.5 min) un tiempo de retención relativo de 1.73 + 0.01 al pico modificado con PEG principal. -50 µ 1 de la solución de resolución modificada con PEG se inyectan. En el cromatograma obtenido, el pico modificado con PEG principal eluyó a un tiempo de retención de 56.97 min (+ 0.5 min), y el pico desamidado modificado con PEG eluyó a un tiempo de retención de 0.79 + 0.02 respecto al pico principal (45.23 ± 0.3 min; (condiciones actuales resultan en una resolución de 2.3 ± 0.02) . 25-50 µ 1 del artículo de prueba modificado con PEG se inyectan, y se ejecuta el programa HPLC. Las muestras se corren en triplicado, y se anotaron los tiempos de retención promedio. Se generaron, cromatogramas con absorbancia (280 nm) . Análisis de datos El tiempo de retención del artículo de prueba rhGH modificado con PEG se compara con la solución de calibración PEG30-pY35pAF-01. La pureza promedio del artículo de prueba se calcula utilizando: (área de integración de pico principal/área de integración de todos los picos) x 100%. Cualesquiera picos por el solvente fueron descartados. Determinación de pureza de rhGH por SEX-HPLC Este procedimiento se utiliza para estimar la pureza de hormona de crecimiento humano recombinante (rhGH) incluyendo material en proceso y rhGH modificado con PEG por cromatografía de líquido de alto desempeño con exclusión de tamaño (SEC-HPLC = size-exclusion high performance liquid chromatography) . Esta prueba separa monómero de dimero y otras sustancias relacionadas de superior peso molecular en la muestra, así como muestras modificadas con PEG y no modificadas con PEG. SEC-HPLC es una técnica que utiliza la fase estacionaría como una matriz porosa que se permea por moléculas de fase móvil. Moléculas muestra suficientemente pequeñas para entrar a la estructura de poros se retardan, mientras que moléculas más grandes se excluyen y por lo tanto arrastran rápidamente a través de la columna. De esta manera, cromatografía de exclusión de tamaño significa separación de moléculas por tamaño y el tiempo de elución cromatografico es característico para una molécula particular. Este procedimiento se emplea para determinar el por ciento de rhGH monómero (modificado con PEG y no modificado con PEG) . Dimero y otras proteínas de alto peso molecular se observan utilizando esta técnica. Referencia para ésta técnica incluyen European Pharmacopoeia 2002, p. 193; British Pharmacopoeia 2001, p.1941; "High-Performance Size-Exclusion Chromatographic Determination of the Potency of Biosynthetic Human Growth Hormone Products" por R.M. Riggin et al. Journal of Chromatography 435 (1988) , p. 307-318. 307-318.

Equipo para este procedimiento incluye lo siguiente o sus equivalentes: Espectrofotómetro UV/Vis (Agilent 8453 o equivalente); cuba de cuarzo 50 ul ; concentradores Vivaspin de 0.5 mL (de ser necesario; Vivascience 10,000 MWCO, PES, VSO102 o equivalente); ampolletas y tapas HPLC (Alltech ampolletas de polipropileno de etapa roscada de 100 µ 1 #12962, tapas con forro de TFE #73048, tapas roscadas de orificio abierto #73044, o equivalentes); botellas de vidrio limpias de 1 y 2 L; Columna - Tosohaas TSK Super SW3000 18675 y columna Super SW Guard 18762, una columna HPLC de exclusión de tamaño basada en sílice con una dimensión de 4.6 x 300 mm, tamaño de particulares de 4 µ m y tamaño de poro de 25QA junto con una columna guard que tiene una dimensión de 4.6 x 35 mm y un tamaño de partículas 4 µ ; instrumento de cromatografía de líquido de alta presión capaz de realizar gradientes lineales (tales como Agilent 1100 HPLC equipado con un desgacificador de vacío, bomba cuaternaria, auto muestreador con termostato, compartimiento de columna con termostato, detector de serie de diodos (DAD diode array detector) , detector de índice de refracción (RID Refractive Index detector) y programa de cromatografía Chemstation) . Reactivos para este procedimiento incluyen agua (calidad Milli-Q o equivalente) y productos químicos sólidos son grados analítico o mejor y solventes son grado HPLC o mejor, a menos de que se anote de otra forma. El almacenamiento de reactivos y etapas de procedimiento ocurren a temperatura ambiente, a menos que se indique de otra forma. Ejemplo de estos productos químicos incluyen fosfato de Sodio Monohidrato Monobásico, Spectrum grado U.S.P. S0130, o equivalente; fosfato de Sodio Heptahidrato Dibásico, Spectrum grado U.S.P. S0140, o equivalente; 2 -propanol, HPLC Fisher grado A451-4, o equivalente. Amortiguador de fase móvil fue 97% de fosfato de sodio 63 mM pH 7.0, 2 -propanol al 3%. Solución A fue fosfato de sodio 25 mM, pH 7.0. Ambos fueron de filtrado estéril utilizando filtros PES 0.22 µ m (Corning #431098, o equivalente) . rhGH de la organización mundial de la salud (WHO World Health Organization) (Cat. # 98/574) se utiliza como una norma hGH no modificada con PEG. Fue reconstituido con 1.0 ml de agua y diluido a 1 mg/ml utilizando de concentración (rango aceptable 0.9 - 1.1 mg/ml) en amortiguador WHO. Otra norma hGH no-modificada con PEG, solución de calibración Y35pAF-pB2/pB3 , se prepara en forma similar y diluye con citrato de sodio 20 M, glicina al 2%, manitol 0.5%, pH 6. Una norma hGH modificada con PEG, solución de calibración PEG30- pY35pAF-01, también se prepara en una forma similar y diluye con citrato de sodio 20 mM, glicina al 2% y manitol al 0.5%, pH 6. Para la solución de resolución, la norma de superior peso molecular PEG30-pY35pAF-02 se lleva a concentración de 1 mg/ml (rango aceptable 0.9 -1.1 mg/ml). Esta solución contiene aproximadamente 33% PEG-PEG-GH, 66.5% PEG-GH) . Material de ensayo se diluye a aproximadamente 1.0 mg/ml con la solución A (rango aceptable 0.9 - 1.1 mg/ml). Todas las concentraciones de muestras se midieron utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad. La dilución de muestras puede realizarse con cualquier amortiguador conveniente. Procedimiento El instrumento se configura con las siguientes condiciones: 1) Columna: TSK Super SW3000 18675 y columna Guard 18762; 2) configuración de la bomba -- gradiente: isocrático; gasto del flujo: 0.3 0.3 ml/min; duración: 25 min; presión máxima: 120 bar; 3) configuración de inyector -- inyección: e inyección estándar; volumen de inyección: 10 µ 1 ; velocidad de extracción: 100 µ l/min; velocidad de inyección: 100 µ l/min; lavado de aguja: 100 µ 1 H0; tiempo de parada: como la bomba; 4) señales de DAD: Tabla 6 ; Tabla 6 Muestra Bw Referencia Bw Unidades 214 4 600 100 nm 276 4 600 100 nm 220 8 600 100 nm 280 4 600 100 nm 250 8 600 100 nm Ancho pico: >0.05 min; ranura: 2 nm; tiempo de parada: como la bomba; 5) señal RID - temperatura: 35 grados C nm; tiempo de respuesta: >0.2 min 4s, estándar; 6) termostato de columna: temperatura: 23 grados C; registro de temperatura. La columna se equilibra con 10 volúmenes de columna (50 ml = 166 min a 0.3 ml/nm) de la fase móvil y el RID se purga por al menos 20 minutos antes de inyectar las muestras. Detectores de DAD y Rl se auto balancearon antes de corridas de muestra. 20 µ l de la solución de calibración Y35pAF-pB2/pB3 (o norma WHO) se inyecta, y se ejecuta el programa HPLC. En el cromatograma obtenido, el pico no modificado con PEG principal eluye a un tiempo de retención de 12.96 min (+ 0.05) min. El dímero rhGH no-modificado con PEG de superior peso molecular eluye a un tiempo de retención de 0.94 ± 0.02 respecto al pico principal . Agregados de superior peso molecular eluyen a tiempo de retención de 7.3 - 8.0 min. 20 µ 1 de la solución de calibración PEG30-pY35p AF-01 se inyectan. El pico modificado con PEG principal eluye a un tiempo de retención de aproximadamente 8.33 min (+ 0.08) min (tiempo de retención relativa de 0.64 a la rhGH no modificada con PEG) . Agregados de rhGh modificados con PEG de superior peso molecular eluyen a tiempo mayores a 8.0 min. 20 µ 1 de la solución de resolución se inyectan, y el programa HPLC se ejecuta. El pico modificado con PEG principal eluye a un tiempo de retención de 8.28 min, y las especies de superior peso molecular eluyen a 7.54 min, un tiempo de retención relativo de 0.9 (± 0.05) respecto al pico modificado con PEG principal . 20 µ 1 del artículo de prueba se inyectan, y se ejecuta el programa HPLC. Las muestras se corren en triplicado y se anotan los tiempos de retención promedio. El tiempo de retención del artículo de prueba rhGH se compara con las normas rhGh. Los datos SEC-HPLC del artículo de prueba se comparan con datos obtenidos de las normas de referencia. Para determinar la pureza de rhGH no modificado con PEG, las áreas pico principales integradas del artículo de prueba rhGH se comparan con el área pico total, y el por ciento de monómero en el artículo de prueba es rhGH se calcula por: (área pico principal de muestra rhGH/área pico total) x 100%. El porcentaje de dimero y/o agregados superiores se calcula en el artículo de prueba hGH. Cualesquiera picos debido al solvente se descartaron. Para determinar la pureza de rhGH modificada con PEG, las áreas pico principales integradas de la muestra rhGH modificada con PEG se comparan con el área de pico total, y el por ciento de monómero modificado con PEG en la muestra rhGH-PEG se calcula por: (área pico principal de muestra rhGH-PEG/área pico total) x 100%. El por ciento de dimero modificado con PEG, agregados superiores y monómero no modificado con PEG se calculan en el artículo de prueba hGH modificado con PEG. Cualesquiera picos debidos al solvente fueron descartados. Picos que eluyen en el cromatograma antes del pico hGH modificado con PEG principal representan especies de superior peso molecular. Estas especies de superior peso molecular pueden incluir pero no están limitadas a dimeros (tales como PEG-PEG-hGH y otros dimeros posibles) o agregados solubles. Picos que eluyen después del pico hGH modificado con PEG principal representan especies de menor peso molecular. Estas especies de menor peso molecular pueden incluir pero no están limitadas a monómero no-modificado con PEG y formas recortadas de hGH modificado con PEG. Análisis de degradación química y pureza de rhGH por RP-HPLC El siguiente método se emplea para estimar la pureza relativa y degradación química potencial (desadmidación y oxidación) de hormona de crecimiento humano recombinante (rhGH) por cromatografía de líquido de alto desempeño en fase inversa C4 (RP-HPLC) . RP-HPLC es una técnica que separa moléculas en base a hidrofobicidades relativas. Se pasan muestra sobre una base estacionaria de sílice ligada covalentemente a cadenas hidrocarburo. Las molecular de interés se retardan por la fase estacionaría y eluyen con un solvente isocrático. El tiempo de elución cromatografíca es característico para una molecular particular. Este método separa rhGH con base en diferencias sutiles en hidrofobicidad y comportamiento de retención asociado con modificaciones estructurales tales como desamidación. Este método se emplea para soportar identificación y evaluación de pureza de rhGH. Algunos productos de degradación parcial de rhGH se observan utilizando esta técnica. Referencias para ésta técnica incluyen la European Pharmacopoeia 2002, p. 193; British Pharmacopoeia 2001, p.1938 - 1939; A Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatographic Method for Characterization of Biosynthetic Human Growth Hormone" por R.M. Riggin et al. Analytical Biochemistry 167, 199-209 (1987) . Equipo para este procedimiento incluye, los siguientes o sus equivalentes: Espectrofotómetro UV/Vis (Agilent 8453 o equivalente); cuba de cuarzo 50 µ 1 ; PD- 10, Nap-10, o Nap 5 (dependiendo del volumen de muestra; columna GE Healthcare Nap5 17-0853-02 o equivalente); concentradores Vivaspin de 0.5 mL (de ser necesario; Vivascience 10,000 MWCO, PES, VSO102 o equivalente); ampolletas y tapas HPLC (ampolletas de polipropileno con tapa roscada Alltech de 100 µ l #12962, tapas con forro de TFE #73048, tapas roscadas de orificio abierto #73044, o equivalentes) ; botellas de vidrio de 1 y 2 L limpias; Columna - Vydac C4 214ATP54, o columna HPLC de fase inversa de sílice-C4 con una dimensión de 4.6 x 250mm, tamaño de partículas de 5 µ y tamaño de poros de 300A; instrumento de cromatografía líquida con alta presión capaz de realizar gradientes lineales (tales como Agilent 1100 HPLC equipado con un desgasificador de vacío, bomba cuaternaria, auto muestreador con termostato, compartimiento de columna con termostato, detector de serie de diodos (DAD) , y programa de cromatografía Chemstation) . Reactivos para este procedimiento incluyen agua (calidad Milli-Q o equivalente) y productos químicos sólidos son de grados analítico o mejor y solventes son grado HPLC o mejor, a menos de que se anote de otra forma. El almacenamiento de reactivos y etapas de procedimiento ocurren a temperatura ambiente, a menos que se indique de otra forma. Ejemplos de estos productos químicos incluyen TRIS - Trometamina, grado U.S.P., Spectrum TR149, o equivalente; N-propanol, grado HPLC, 99.9%, Sigma Aldrich 34871, o equivalente; bicarbonato de amonio, Ultra > 99.5%, Fluka # 09830, o equivalente, El amortiguador para control de desamidación fue bicarbonato de amonio 30 mM, pH 9.0. El amortiguador para control de oxidación fue TRIS 50 mM, pH 7.5. Cada una de estas soluciones se filtraron estériles utilizando filtros PES 0.22 µ m (Corning #431098, o equivalente) . Fase móvil: TRIS-HCl 50 mM 710 ml pH 7.5; 290 ml n-propanol (u otro volumen apropiado con Tris-HCl 50 mM 71%, pH 7.5 y n-propanol al 29%) . 6.05 g de trometamina (grado USP, Spectrum # TR149, o equivalente) se disuelven en 0.95 L Milli-Q H20. La solución se lleva a pH 7.5 con HCl y el volumen se lleva a 1 L con Milli-Q H20. Después de mezclar los dos solventes (TRIS y propanol) , la mezcla se filtra estéril utilizando filtros PES 0.22 µ m (Corning #431098, o equivalente) . La solución de acondicionamiento fue AcCN:H20 al 50%, TFA al 0.1%.

Muestras utilizadas como normas incluyen rhGH de la organización mundial de la salud (WHO) (Cat. # 98/574) Reconstituida a 1.9 - 2.1 mg/ml con 1.0 ml de agua y norma de referencia rhGH a concentración de 1.9 -2.1 mg/ml . La solución de resolución de desamidación se elaboró por intercambio de amortiguador de la norma WHO en bicarbonato de amonio 30 mM, amortiguador pH 9.0 utilizando una columna de desalificación PD-10, Nap- 10, o Nap-5 (dependiendo del volumen de muestra) . La norma se concentra utilizando un concentrador Vivaspin de 0.5 mL a 1.9 - 2.1 mg/ml y la muestra se incuba a 37 grados C por 24 horas. Para la solución de resolución de oxidación la norma WHO se intercambia de amortiguadores en TRIS 50 mM, pH 7.5 amortiguador utilizando una columna de desalificación PD-10, Nap-10, o Nap-5 (dependiendo del volumen de muestra) . La norma se concentra utilizando un concentrador Vivaspin 0.5 mL a 1.9 - 2.1 mg/ml y H202 se agrega una concentración final de 0.015%. La reacción se incuba a 4 grados C por 24 horas. La reacción se detiene al agregar 0.5 - 1 µ l de 20 mg/ml de catalasa. Para la muestra de prueba, el material de prueba se diluye a 2.0 mg/ml de concentración de proteína. Procedimiento El instrumento se configuro con las siguientes condiciones: 1) Columna: columna Vydac C4 214ATP54; 2) configuración de bomba -- gradiente: isocrático; gasto del flujo: 0.5 0.5 ml/min; duración: 60 min; presión máxima: 200; 3) temperatura de auto-muestreador : 4 grados C: 4) configuración de inyector -- inyección: inyección estándar; volumen de inyección: 20 µ l ; velocidad de extracción: 100 µ l/min; lavado de aguja: 100 µ 1 con agua; velocidad de inyección: 100 µ l/min; tiempo de parada: igual que la bomba; 5) señales de DAD (Tabla 7) ; Tabla 7 M Muueessttrraann B Bww rreeffeerreenncciiaa B Bww unidades 220 4 600 100 nm 276 4 600 100 nm 214 8 600 100 nm 220 4 600 100 nm Ancho pico: >0.1 min; ranura: 4nm nm; tiempo de parada: 60 min; 6) termostato de columna: temperatura: 45 grados C; registro de la temperatura; 7) evento de integración preliminares (programa Chemstation, Agilent) : sensibilidad dependiente: 0.1; ancho de pico: 0.5; rechazo de área: 1.0; rechazo de altura: 1.0; integración ON 10 min. La columna se pre-acondicionó con 300 mL de solución de acondicionamiento (AcCN de 50%, H20, TFA al 0.1%) a un gasto del flujo entre 0.5 y 1.5 ml/min. Pre- equilibrio deberá realizarse antes de que se haya empleado una columna, o si se ensanchan los picos, reacondicionar la columna con solución de acondicionamiento (200 - 300 mL) . La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna (41.5 ml = 83 min a 0.5 ml/min) de la fase móvil. 20 µ 1 de la norma o estándar se inyectan utilizando el automoestreador, y se ejecuta el programa HPLC. Si el tiempo de retención de la norma WHO no está entre 32.5 - 35 min, se ajusta la composición de fase móvil, la columna re-equilibra y la norma se vuelve a ejecutar. Ajustes sugeridos incluyen agregar menos de 5 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7.5 por litro de fase móvil si el tiempo de retención es menor a 32.5 min, y menos de 2 ml de n-propanol si el tiempo de retención es mayor a 35. Ya que la evaporación del propanol puede ocurrir. Se ejecuta una norma cada día que se van a probar muestras y de acuerdo con esto se ajustan los amortiguadores. 20 µ 1 de solución de resolución de desamidación se inyectan, y se ejecuta el programa HPLC. Desamido-hGH aparece como un pico pequeño a un tiempo de retención de aproximadamente 0.88 ± 0.03 respecto al pico principal. La resolución entre los picos correspondiente a hGH y desamido-hGH fue al menos 1.0 (condiciones actuales resultan en una resolución de 1.29 ± 0.04) y el factor de simetría del pico hGH es 0.8 a 1.8 (condiciones actuales resultan en una resolución de 1.26 ± 0.06) . 20 µ 1 de la solución de resolución de oxidación se inyectan, y se ejecuta el programa HPLC. hGH oxidado parece como un pequeño pico a un tiempo de retención de aproximadamente 0.88 respecto al pico principal . 20 µ 1 del artículo de prueba se inyectan, y el programa HPLC se ejecuta. Se corren muestras en triplicado. Tiempos de retención promedio se anotaron. Análisis de datos El tiempo de retención promedio del artículo de prueba se compara con la norma de referencia rhGH o la norma WHO. La pureza promedio del artículo de prueba se calcula: (área de integración de pico principal/áreas de integración de todos los picos) x 100%. Cualesquiera picos debido al solvente se descartaron. Cromatogramas mostraron absorbancia (220 nm) . Se entiende que los ejemplos y modalidades aquí descritos son para propósitos ilustrativos solamente y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos se sugerirán a personas con destreza ordinaria en la especialidad y habrán de incluirse dentro del espíritu y substancia de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes aquí citadas, aquí se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos . Tabla 8: SECUENCIAS CITADAS SEQ ID # Nombre de secuencia 1 Secuencia de amino ácido de longitud integra de hGH 2 La secuencia amino ácido madura de hGH (isoforma 1) 3 La variante hGH de 20 -kDa en donde los residuos 32-46 de hGH se eliminan

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso, que comprende: a) cultivar células anfitrionas recombinantes capaces de producir hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado en un medio nutriente líquido que contiene el amino ácido no naturalmente codificado bajo condiciones que favorecen el crecimiento; b) inducir producción de hGH que comprende el amino ácido no naturalmente codificado por las células; y c) purificar la hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado de las células o medio cultivo .
2. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la adición de uno o más amino ácidos no naturalmente codificados ocurre un tiempo seleccionado del grupo que consiste de continuamente durante crecimiento celular, un tiempo antes de inducción, al tiempo al inducción, o un tiempo después de inducción.
3. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la adición de uno o más amino ácidos no naturalmente codificados ocurre simultáneamente con la inducción.
4. 4. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la adición de uno o más amino ácidos no naturalmente codificados ocurre aproximadamente una hora antes de inducción.
5. 5. Un método que comprende las etapas de: (a) contactar hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado de la etapa c) de la reivindicación 1, con una matriz de cromatografía para intercambio de aniones, bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz; (b) eluir y recolectar la hGH de la matriz; (c) contactar la hGH de la etapa b) con una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz; y (d) eluir y recolectar la hGH de la matriz HIC, para proporcionar substancialmente hGH puro que comprende un amino ácido no naturalmente codificado.
6. 6. El método conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula anfitriona recombinante se elije del grupo que consiste de una célula procariótica y una célula eucariótica.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hGH substancialmente purificada se elije del grupo que consiste de hGH madura, variantes hGH maduras, polipéptidos hGH y variantes de polipéptido hGH.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el método comprende una etapa adicional después de la etapa a) de contactar la hGH eluido de la cromatografía de intercambio de aniones con una matriz de cromatografía de hidroxiapatita bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz seguido por elución y recolección de la hGH de la matriz de cromatografía de hidroxiapatita.
9. 9. Método que comprende las etapas de: (a) reaccionar hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado de un polietilen glicol derivatizado (PEG) bajo condiciones suficientes para formar conjugados hGH-PEG; y (b) aislar y purificar los conjugados hGH-PEG al contactar el conjugado hGH-PEG con una matriz de intercambio de aniones bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz seguido por elución y recolección de la hGH de la matriz de cromatografía de intercambio de aniones para proporcionar conjugado hGH-PEG substancialmente purificado.
10. 10. Método para aislar conjugados hGH-PEG substancialmente purificados que comprende las etapas de: a) cultivar células anfitrionas recombinantes capaces de producir hGH que comprenden un amino ácido . no naturalmente codificado en un medio nutriente líquido que contiene el amino ácido no naturalmente codificado bajo condiciones que favorecen el crecimiento; b) inducir producción de hGH que comprende el amino ácido no naturalmente codificado por la células; y c) contactar hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado de la etapa b) con una matriz de cromatografía de intercambio de aniones bajo condiciones que permiten enlazar hGH con la matriz, seguido por elución y recolección de la hGH de la matriz; d) contactar la hGH eluido de la cromatografía de intercambio de aniones de la etapa c) con una matriz de cromatografía de hidroxiapatita, bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz seguido por elución y recolección de la hGH de la matriz de cromatografía de hidroxiapatita; e) contactar la hGH de la etapa d) con una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz seguido por elución y recolección de la hGH de la matriz HIC para proporcionar hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado; f) reaccionar hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado de la etapa e) con un polietilen glicol (PEG) derivatizado bajo condiciones suficientes para formar conjugados hGH-PEG; y g) aislar y purificar los conjugados hGH-PEG al contactar el conjugado hGH-PEG con una matriz de intercambio de aniones bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz seguido por elución y recolección de hGH de la matriz de cromatografía de intercambio de aniones para proporcionar un conjugado hGH-PEG substancialmente purificado.
11. 11. Un método para aislar conjugados hGH-PEG substancialmente purificados, que comprende las etapas de: a) cultivar células anfitrionas recombinantes capaces de producir hGH que comprenden un amino ácido no naturalmente codificado en un medio nutriente líquido que contiene el amino ácido no naturalmente codificado, bajo condiciones que favorecen el crecimiento; b) inducir producción de hGH que comprende el amino ácido no naturalmente codificado por las células; c) contactar hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado de la etapa b) con una matriz de cromatografía de intercambio de aniones bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz seguido por elución y recolección de la hGH de la matriz; d) contactar la hGH de la etapa d) con una matriz de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz seguido por elución y recolección de la hGH de la matriz HIC, para proporcionar hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado; e) reaccionar hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado de la etapa d) con un polietilen glicol (PEG) derivatizado bajo condiciones suficientes para formar conjugados hGH-PEG; y f) aislar y purificar los conjugados hGH-PEG al contactar el conjugado hGH-PEG con una matriz de intercambio de aniones, bajo condiciones que permiten ligar la hGH con la matriz, seguido por elución y recolección de la hGH de la matriz de cromatografía de intercambio de aniones para proporcionar conjugado hGH-PEG substancialmente purificado.
12. 12. Un proceso, que comprende: a) cultivar células anfitrionas recombinantes capaces de producir hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado en un medio nutriente líquido que contiene el amino ácido no naturalmente codificado bajo condiciones que favorecen el crecimiento; b) inducir producción de hGH que comprende el amino ácido no naturalmente codificado mediante las células; c) reacciona hGH que comprende un amino ácido no naturalmente codificado de la etapa b) con un polietilen glicol (PEG) derivatizado bajo condiciones suficientes para formar conjugados hGH-PEG y d) purificar el conjugado hGH-PEG.