BR112021003420A2 - resina cromatográfica estéril e uso da mesma em processos de manufatura - Google Patents

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Abstract

RESINA CROMATOGRÁFICA ESTÉRIL E USO DA MESMA EM PROCESSOS DE MANUFATURA. A presente invenção refere-se a métodos de redução da bi-ocarga de uma resina cromatográfica que incluem expor um recipiente que inclui uma composição que compreende (i) uma resina cromato-gráfica e (ii) um líquido que inclui pelo menos álcool a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do recipiente e da resina cromatográfica, onde o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após/quando de exposição à dose de irradiação gama. A presente invenção também se refere a colunas cromatográficas com biocarga reduzida que incluem a resina cromato-gráfica com biocarga reduzida, composições que incluem uma resina cromatográfica e um líquido que inclui pelo menos um álcool, métodos para realizar cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando uma destas colunas cromatográficas com biocarga reduzida e processos integrados, fechados e contínuos para a produção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RESINA CROMATOGRÁFICA ESTÉRIL E USO DA MESMA EM PROCES- SOS DE MANUFATURA".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Pa- tente Provisório Norte-Americano Nº de série 62/726.043, depositado em 31 de agosto de 2018; todo o conteúdo do qual é incorporado ao presente documento a título de referência.
CAMPO TÉCNICO
[0002] A presente invenção refere-se a métodos de biotecnologia e biomanufatura de proteínas recombinantes.
ANTECEDENTES
[0003] Células de mamífero, que inclui um ácido nucleico que codi- fica uma proteína recombinante, são frequentemente usadas para pro- duzir proteínas terapêutica ou comercialmente importantes. No ambi- ente atual de diversas linhas de produtos, as empresas de biotecnolo- gia estão cada vez mais motivadas a desenvolver soluções inovadoras para a produção altamente flexível e econômica de substâncias medi- camentosas de uma proteína terapêutica. Uma das estratégias para isolar com eficiência proteínas recombinantes é através de processos que incluem cromatografia contínua (por exemplo, usando um sistema fechado). Uma limitação conhecida da cromatografia contínua é a pre- sença de agentes contaminantes no sistema (por exemplo, biocarga aumentada), o que resulta em um produto contaminado, uma redução no rendimento da produção e uma diminuição na vazão (ou aumento na pressão) no sistema. Por exemplo, o aumento da biocarga dentro de um sistema pode resultar no desligamento completo do sistema.
SUMÁRIO
[0004] A presente invenção refere-se, pelo menos em parte, à descoberta de que a irradiação gama da resina cromatográfica reduz a capacidade de ligação da resina cromatográfica e que a irradiação na presença de pelo menos um álcool pode ajudar a evitar esta redução na capacidade de ligação de uma resina cromatográfica causada pela irradiação gama.
Em vista desta descoberta, são fornecidos no pre- sente documento métodos de redução da biocarga de uma resina cromatográfica que incluem expor um recipiente que inclui uma com- posição que compreende (i) uma resina cromatográfica e (ii) um líqui- do que inclui pelo menos um álcool a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do recipiente e da resina cromato- gráfica, onde o pelo menos um álcool está presente em uma quantida- de suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resi- na cromatográfica após/quando de exposição à dose de irradiação gama.
Também são fornecidas colunas cromatográficas com biocarga reduzida que contêm uma resina cromatográfica com biocarga reduzi- da preparada por meio de qualquer um dos métodos descritos no pre- sente documento, composições que incluem (i) uma resina cromato- gráfica e (ii) um líquido que inclui pelo menos um álcool, métodos para realizar cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando pelo menos uma destas colunas cromatográficas com biocarga reduzida e processos integrados, fechados ou substancialmente fechados e con- tínuos para a produção de uma proteína recombinante purificada com biocarga reduzida que incluem o uso de pelo menos uma destas colu- nas cromatográficas com biocarga reduzida.
Qualquer uma das resi- nas cromatográficas produzidas por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, qualquer uma das colunas cromato- gráficas empacotadas produzidas por meio de qualquer um dos méto- dos descritos no presente documento, qualquer um dos métodos para realizar cromatografia em coluna e qualquer um dos processos descri- tos no presente documento pode ser estéril, absolutamente estéreis, assépticos ou com biocarga reduzida.
Qualquer uma das resinas cro-
matográficas produzidas por meio de qualquer um dos métodos descri- tos no presente documento, qualquer uma das colunas cromatográfi- cas produzidas por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento e qualquer um dos processos descritos no pre- sente documento pode ser asséptico e estéril, absolutamente estéri, assépticos ou com biocarga reduzida.
[0005] São fornecidos no presente documento métodos de redu- ção da biocarga de uma resina cromatográfica que incluem: expor um recipiente que inclui uma composição que compreende (i) uma resina cromatográfica e (i) um líquido que compreende pelo menos um álcool a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do recipiente e da resina cromatográfica, em que o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após exposição à do- se de irradiação gama.
[0006] Em algumas modalidades, o método pode incluir ainda, an- tes da exposição, colocar a composição no recipiente.
[0007] Em algumas modalidades, o recipiente é um recipiente de armazenamento.
[0008] Em algumas modalidades, o recipiente é uma coluna cro- matográfica.
[0009] Em algumas modalidades, o recipiente é uma coluna cro- matográfica empacotada.
[0010] Em algumas modalidades, a composição é uma suspensão de resina cromatográfica sedimentada.
[0011] Em algumas modalidades, a composição é uma mistura sólida úmida.
[0012] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o pelo menos um álcool é selecio- nado a partir do grupo de: álcool benzílico, ciclo-hexanol, álcool isobu-
tílico, 2-metil-2-butanol, metanol, etanol, propan-2-ol, propano-1-ol, bu- tan-1-ol, pentan-1-ol, hexadecan-1-ol, 2-fenil etanol, sec-fenil etanol, 3- fenil-1-propanol, 1-fenil-1-propanol, 2-fenil-1-propanol, 2-fenil-2-pro- panol, 1-fenil-2-butanol, 2-fenil-1-butanol, 3-fenil-1-butanol, 4-fenil-2- butanol, dl-1 -fenil-2-pentanol, 5-fenil-1-pentanol e 4-fenil-1-butanol.
[0013] Em algumas modalidades, o pelo menos um álcool inclui álcool benzílico.
[0014] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, a concentração da soma total de um ou mais álcoois no líquido é a partir de cerca de 0,01 % v/v a cerca de % v/v.
[0015] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o líquido pode incluir ainda pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante.
[0016] Em algumas modalidades, o líquido inclui pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após exposição à dose de irradiação gama.
[0017] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o líquido inclui pelo menos um agente antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: glutationa reduzida, tiorredoxina reduzida, cisteína reduzida, um caro- tenoide, melatonina, licopeno, tocoferol, ubiquinona reduzida, ascorba- to, bilirrubina, ácido úrico, ácido lipoico, um flavonoide, um ácido fenol- propanoide, lidocaína, naringenina, fulereno, glicose, manitol, 4-hidróxi -2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxila e dimetilmetoxicromanol.
[0018] Em algumas modalidades, o líquido inclui pelo menos um agente antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: manitol, ascorbato de sódio, histidina e metionina.
[0019] Em algumas modalidades, o líquido inclui manitol, ascorba-
to de sódio, histidina e metionina.
[0020] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o líquido inclui: (i) manitol entre 75 mM e cerca de 125 mM; (ii) metionina entre 75 mM e cerca de 125 MM; (iii) ascorbato de sódio entre 75 mM e cerca de 125 mM; (iv) histi- dina entre 75 mM e cerca de 125 mM; (v) metionina entre 30 mM e cerca de 70 mM e histidina entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM; (vi) metionina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM, histidina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM e ascorbato de sódio entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; ou (vii) ascorbato de sódio entre cerca de 5 mM a cerca de 45 mM, metionina entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, manitol entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM e histidina en- tre cerca de 5 mM a cerca de 45 mM.
[0021] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o líquido é uma solução tamponada.
[0022] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, o líquido inclui pelo menos um que- lante selecionado a partir do grupo que consiste em: ácido etilenodia- minotetracético (EDTA), ácido 2,3-dimercapto-1-propanossulfônico só- dico (DMPS), ácido dimercaptossuccínico (DMSA), metalotionina e desferroxamina.
[0023] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, a resina cromatográfica é selecio- nada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográ- fica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidrofóbica e re- sina cromatográfica de exclusão por tamanho.
[0024] Em algumas modalidades, a composição inclui uma resina cromatográfica de afinidade que inclui um ligante de proteína.
[0025] Em algumas modalidades, o ligante de proteína é a proteí-
na A.
[0026] Em algumas modalidades, a composição inclui uma resina cromatográfica de troca aniônica.
[0027] Em algumas modalidades, a resina cromatográfica de troca aniônica inclui grupos N-benzil-N-metil-etanolamina.
[0028] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, a dose está entre cerca de 15 kGy a cerca de 45 kGy.
[0029] Em algumas modalidades, a dose está entre cerca de 20 kGy a cerca de 30 kGy.
[0030] Em algumas modalidades, a dose está entre cerca de 23 kGy e cerca de 27 kGy.
[0031] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, a exposição é realizada em uma temperatura entre cerca de -25ºC e cerca de 0ºC, inclusive.
[0032] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos no presente documento, a exposição é realizada em uma temperatura entre cerca de 0ºC e cerca de 25ºC, inclusive.
[0033] São fornecidas no presente documento resinas cromatográ- ficas com biocarga reduzida produzidas por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento.
[0034] Em algumas modalidades, a resina possui um nível de ga- rantia de esterilidade (Sterility Assurance Level, SAL) de entre cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 10º.
[0035] Em algumas modalidades, a resina possui um nível de ga- rantia de esterilidade (SAL) de entre cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x
10.
[0036] Em algumas modalidades de qualquer uma das resinas descritas no presente documento, a resina cromatográfica inclui pelo menos uma resina selecionada a partir do grupo que consiste em: re-
sina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidrofóbica e resina cromatográfica de exclusão por tama- nho.
[0037] Em algumas modalidades, a resina cromatográfica inclui uma resina cromatográfica de afinidade que inclui um ligante de prote- Ína.
[0038] Em algumas modalidades, o ligante de proteína é a proteí- na A.
[0039] Em algumas modalidades, a resina cromatográfica inclui uma resina cromatográfica de troca aniônica.
[0040] Em algumas modalidades, a resina cromatográfica de troca aniônica inclui grupos N-benzil-N-metil-etanolamina.
[0041] São fornecidos no presente documento métodos para pro- duzir uma coluna cromatográfica com biocarga reduzida que inclui: fornecer qualquer uma das resinas cromatográficas com biocarga re- duzida descritas no presente documento; e empacotar a resina croma- tográfica em uma coluna com biocarga reduzida em um ambiente as- séptico.
[0042] São fornecidas no presente documento colunas cromato- gráficas empacotadas com biocarga reduzida produzidas por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento.
[0043] Em algumas modalidades, a resina na coluna empacotada possui um nível de garantia de esterilidade (SAL) de entre cerca de 1 x a cerca de 1 x 10º.
[0044] Em algumas modalidades, a resina possui um nível de ga- rantia de esterilidade (SAL) de entre cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x
10.
[0045] Em algumas modalidades de qualquer uma das resinas descritas no presente documento, a resina na coluna empacotada in-
clui pelo menos uma resina selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográ- fica de interação hidrofóbica e resina cromatográfica de exclusão por tamanho.
[0046] Em algumas modalidades, a resina inclui uma resina cro- matográfica de afinidade ou pseudoafinidade que inclui um ligante de proteína.
[0047] Em algumas modalidades, o ligante é a proteína A.
[0048] Em algumas modalidades, a resina inclui uma resina cro- matográfica de troca aniônica.
[0049] Em algumas modalidades, a resina cromatográfica de troca aniônica inclui grupos N-benzil-N-metil-etanolamina.
[0050] São fornecidas no presente documento composições que incluem (i) uma resina cromatográfica e (ii) um líquido que inclui pelo menos um álcool, em que o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica quando de tratamento com uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga da composição.
[0051] Em algumas modalidades, a composição é uma suspensão de resina cromatográfica sedimentada.
[0052] Em algumas modalidades, a composição é uma mistura sólida úmida.
[0053] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, o pelo menos um álcool é se- lecionado a partir do grupo de: álcool benzílico, ciclo-hexanol, álcool isobutílico, 2-metil-2-butanol, metanol, etanol, propan-2-ol, propano-1- ol, butan-1-ol, pentan-1-ol, hexadecan-1-ol, 2-fenil etanol, sec-fenil etanol, 3-fenil-1-propanol, 1-fenil-1-propanol, 2-fenil-1-propanol, 2-fenil- 2-propanol, 1-fenil-2-butanol, 2-fenil-1-butanol, 3-fenil-1-butanol, 4-fe-
nil-2-butanol, dl-1 -fenil-2-pentanol, 5-fenil-1-pentanol e 4-fenil-1- butanol.
[0054] Em algumas modalidades, o pelo menos um álcool inclui álcool benzílico.
[0055] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, a concentração da soma total de um ou mais álcoois no líquido é de cerca de 0,01 % v/v a cerca de % v/v.
[0056] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, o líquido inclui ainda pelo me- nos um agente antioxidante e/ou quelante.
[0057] Em algumas modalidades, o líquido inclui ainda pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográ- fica após exposição à dose de irradiação gama.
[0058] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, o líquido inclui pelo menos um agente antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: glutationa reduzida, tiorredoxina reduzida, cisteína reduzida, um caro- tenoide, melatonina, licopeno, tocoferol, ubiquinona reduzida, ascorba- to, bilirrubina, ácido úrico, ácido lipoico, um flavonoide, um ácido fenol- propanoide, lidocaína, naringenina, fulereno, glicose, manitol, 4-hidróxi -2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxila e dimetilmetoxicromanol.
[0059] Em algumas modalidades, o líquido inclui pelo menos um agente antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: manitol, ascorbato de sódio, histidina e metionina.
[0060] Em algumas modalidades, o líquido inclui manitol, ascorba- to de sódio, histidina e metionina.
[0061] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, o líquido inclui: (i) manitol entre
75 mM e cerca de 125 mM; (ii) metionina entre 75 mM e cerca de 125 MM; (iii) ascorbato de sódio entre 75 mM e cerca de 125 mM; (iv) histi- dina entre 75 mM e cerca de 125 mM; (v) metionina entre 30 mM e cerca de 70 mM e histidina entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM; (vi) metionina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM, histidina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM e ascorbato de sódio entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; ou (vii) ascorbato de sódio entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, metionina entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, manitol entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM e histidina en- tre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM.
[0062] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, o líquido é uma solução tam- ponada.
[0063] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, a composição inclui pelo me- nos um quelante selecionado a partir do grupo que consiste em: ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido 2,3-dimercapto-1-propanossul- fônico sódico (DMPS), ácido dimercaptossuccínico (DMSA), metalotio- nina e desferroxamina.
[0064] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, a resina cromatográfica inclui pelo menos uma resina selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidrofóbica e resina cromatográfica de exclusão por tama- nho.
[0065] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, a resina inclui uma resina cro- matográfica de afinidade que inclui um ligante de proteína.
[0066] Em algumas modalidades, o ligante de proteína é a proteí-
na A.
[0067] São fornecidos no presente documento métodos para rea- lizar cromatografia em coluna com biocarga reduzida que incluem: (a) fornecer qualquer uma das colunas cromatográficas empacotadas com biocarga reduzida descritas no presente documento; e (b) realizar cromatografia em coluna usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida e tampão com biocarga reduzida em um siste- ma fechado.
[0068] Em algumas modalidades, a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 4 dias.
[0069] Em algumas modalidades, a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 5 dias.
[0070] Em algumas modalidades, a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 7 dias.
[0071] Em algumas modalidades, a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 14 dias.
[0072] Em algumas modalidades, a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 28 dias.
[0073] Em algumas modalidades, a resina na coluna cromatográfi- ca empacotada com biocarga reduzida em (a) possui uma capacidade de ligação percentual entre cerca de 75 % e cerca de 100 % compara- do com a mesma resina não tratada com irradiação gama.
[0074] Em algumas modalidades, a resina na coluna cromatográfi- ca empacotada com biocarga reduzida inclui pelo menos uma resina selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidro- fóbica e resina cromatográfica de exclusão por tamanho.
[0075] Em algumas modalidades, a resina inclui uma resina cro- matográfica de afinidade a qual inclui um ligante de proteína.
[0076] Em algumas modalidades, o ligante de proteína é a proteí- na A.
[0077] Em algumas modalidades, a resina inclui uma resina cro- matográfica de troca aniônica.
[0078] São fornecidos no presente documento processos integra- dos, fechados e contínuos para a produção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada que incluem: (a) fornecer um meio de cultura líquido que compreende uma proteína recombinante que é substancialmente isenta de células; e (b) alimentar continua- mente o meio de cultura líquido em um sistema de cromatografia com múltiplas colunas (Multi-Column Chromatography System, MCCS) que compreende pelo menos uma de qualquer uma das colunas cromato- gráficas empacotadas com biocarga reduzida descritas no presente documento; em que o processo usa um tampão com biocarga reduzi- da, é integrado e é executado continuamente desde o meio de cultura líquido até um eluato proveniente do MCCS que é a proteína recombi- nante purificada.
[0079] Em algumas modalidades, o MCCS executa pelo menos duas operações unitárias diferentes.
[0080] Em algumas modalidades, o processo inclui a troca de co-
luna.
[0081] Em algumas modalidades, o MCCS realiza as operações unitárias de captura da proteína recombinante e inativação de vírus.
[0082] Em algumas modalidades, o MCCS realiza as operações unitárias de captura e purificação da proteína recombinante.
[0083] Em algumas modalidades, o MCCS inclui pelo menos duas colunas cromatográficas empacotadas com biocarga reduzida.
[0084] Em algumas modalidades, o MCCS é um sistema de cro- matografia contracorrente periódica.
[0085] Em algumas modalidades, o MCCS inclui uma pluralidade de colunas para cromatografia de afinidade ou pseudoafinidade, cro- matografia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica ou cro- matografia de exclusão por tamanho ou qualquer combinação das mesmas.
[0086] Em algumas modalidades, o MCCS inclui uma coluna para cromatografia de afinidade e a cromatografia de afinidade é realizada no processo com um mecanismo de captura selecionado a partir do grupo que consiste em: um mecanismo de captura por ligação à prote- Ína A, um mecanismo de captura por ligação a substrato, um meca- nismo de captura por ligação a anticorpo ou fragmento de anticorpo, um mecanismo de captura por ligação a aptâmero e um mecanismo de captura por ligação a cofator.
[0087] Em algumas modalidades, a cromatografia de afinidade é realizada no processo com um mecanismo de captura por ligação à proteína A e a proteína recombinante é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.
[0088] São fornecidos no presente documento processos integra- dos, fechados e contínuos para a produção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada que incluem: (a) fornecer um meio de cultura líquido que compreende uma proteína recombinante que é substancialmente isenta de células; (b) alimentar continuamente o meio de cultura líquido em um primeiro sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS1); (c) capturar a proteína recombinante no meio de cultura líquido usando o MCCS1; (d) produzir um eluato proveniente do MCCS1 que inclui a proteína recombinante e alimentar continuamente o eluato em um segundo sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS2); (e) alimentar continuamente a proteína recombinante proveniente do eluato no MCCS?2 e, subsequentemente, eluir a proteína recombinante para, deste modo, produzir a proteína recombinante purificada, em que: o processo usa um tampão com bio- carga reduzida, é integrado e é executado continuamente desde o meio de cultura líquido até a proteína recombinante purificada e pelo menos uma coluna no MCCS1 e/ou MCCS?2 contém qualquer uma das colunas cromatográficas empacotadas com biocarga reduzida descri- tas no presente documento.
[0089] Em algumas modalidades, o MCCS1 e/ou o MCCS? reali- zam pelo menos duas operações unitárias diferentes.
[0090] Em algumas modalidades, o processo envolve a troca de coluna.
[0091] Em algumas modalidades, o MCCS1 realiza as operações unitárias de captura da proteína terapêutica recombinante e inativação de vírus.
[0092] Em algumas modalidades, o MCCS?2 realiza as operações unitárias de purificação e refino da proteína recombinante.
[0093] Em algumas modalidades, o MCCS1 e/ou MCCS?2 incluem pelo menos duas colunas cromatográficas.
[0094] Em algumas modalidades, o MCCS1 é um primeiro sistema de cromatografia contracorrente periódica (Periodic Counter-current Chromatography System, PCCS1).
[0095] Em algumas modalidades, a captura é realizada usando cromatografia de afinidade, cromatografia de troca catiônica, cromato- grafia de troca aniônica ou cromatografia de exclusão por tamanho ou qualquer combinação das mesmas.
[0096] Em algumas modalidades, a cromatografia de afinidade é realizada com um mecanismo de captura selecionado a partir do grupo que consiste em: um mecanismo de captura por ligação à proteína A, um mecanismo de captura por ligação a substrato, um mecanismo de captura por ligação a anticorpo ou fragmento de anticorpo, um meca- nismo de captura por ligação a aptâmero e um mecanismo de captura por ligação a cofator.
[0097] Em algumas modalidades, a cromatografia de afinidade é realizada com um mecanismo de captura por ligação à proteína Ae a proteína recombinante é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.
[0098] Em algumas modalidades, o MCCS2 é um segundo siste- ma de cromatografia contracorrente periódica (PCCS2).
[0099] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos no presente documento, a proteína recombinante é uma pro- teína recombinante terapêutica.
[00100] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos no presente documento, o processo inclui ainda a formular a proteína recombinante terapêutica purificada em uma composição farmacêutica.
[00101] Em algumas modalidades de qualquer um dos processos descritos no presente documento, o processo é realizado continua- mente durante um período de pelo menos 4 dias.
[00102] Em algumas modalidades, o processo é realizado continu- amente durante um período de pelo menos 5 dias.
[00103] Em algumas modalidades, o processo é realizado continu- amente durante um período de pelo menos 7 dias.
[00104] Em algumas modalidades, o processo é realizado continu-
amente durante um período de pelo menos 14 dias.
[00105] Em algumas modalidades, o processo é realizado continu- amente durante um período de pelo menos 28 dias.
[00106] Conforme usado no presente documento, a palavra "um(a)" antes de um substantivo representa um ou mais do substantivo parti- cular. Por exemplo, a frase "uma coluna cromatográfica com biocarga reduzida" representa "uma ou mais colunas cromatográficas com bio- carga reduzida".
[00107] O termo "biocarga" é conhecido na técnica e refere-se ao nível de contaminantes biológicos autorreplicantes presentes em uma composição (por exemplo, sólida ou líquida) e/ou sobre a superfície (por exemplo, superfície externa e/ou interna) de (um) artigo(s). Por exemplo, biocarga pode referir-se a contaminantes biológicos autorre- plicantes presentes em uma composição que contém uma resina cro- matográfica ou uma resina cromatográfica empacotada (por exemplo, contaminantes biológicos autorreplicantes presentes em uma resina cromatográfica empacotada em uma coluna cromatográfica empaco- tada). Em outros exemplos, a biocarga pode referir-se a contaminantes biológicos autorreplicantes sobre a superfície interna de uma coluna cromatográfica e/ou dentro da resina cromatográfica dentro da coluna cromatográfica (por exemplo, contaminantes biológicos sobre a super- fície interna de uma coluna cromatográfica e contaminantes biológicos na resina cromatográfica empacotada dentro da coluna cromatográfi- ca). Biocarga também pode referir-se aos contaminantes biológicos autorreplicantes presentes dentro de um líquido (por exemplo, um tampão usado em qualquer um dos métodos ou processos descritos no presente documento). Exemplos não limitativos de contaminantes biológicos autorreplicantes podem ser bactérias (por exemplo, bacté- rias Gram-positivas ou Gram-negativas ou um esporo bacteriano), mi- cobactérias, vírus (por exemplo, um vesivírus, um vírus de Cache Val-
ley, um parvovírus, um vírus do herpes e um bunyavírus), parasitas, fungos, leveduras e protozoários. Métodos exemplificativos para de- terminar a biocarga são descritos no presente documento. Métodos adicionais para determinar a biocarga são conhecidos na técnica.
[00108] O termo "redução de biocarga" é conhecido na técnica e refere-se a uma diminuição (por exemplo, uma diminuição detectável) no nível de contaminantes biológicos autorreplicantes presentes em uma composição (por exemplo, sólido ou líquido) e/ou sobre a superfí- cie (por exemplo, superfície externa e/ou interna) de (um) artigo(s). Exemplos não limitativos de métodos para reduzir a biocarga de uma resina cromatográfica (por exemplo, resina cromatográfica empacota- da), tampão e/ou uma coluna cromatográfica (por exemplo, uma colu- na cromatográfica empacotada) são descritos no presente documento. Métodos adicionais para reduzir a biocarga de qualquer uma das com- posições descritas no presente documento são conhecidos na técnica.
[00109] O termo "resina cromatográfica com biocarga reduzida" significa uma resina cromatográfica que foi tratada para diminuir o ní- vel de contaminantes biológicos autorreplicantes presentes na resina cromatográfica (por exemplo, uma diminuição detectável no nível de contaminantes biológicos autorreplicantes presentes em uma compo- sição que contém uma resina cromatográfica, por exemplo, uma sus- pensão). Por exemplo, a resina cromatográfica com biocarga reduzida pode ser uma resina exposta à irradiação gama em uma dose suficien- te para diminuir o nível de contaminantes biológicos autorreplicantes na resina cromatográfica (por exemplo, uma composição que contém uma resina cromatográfica exposta à irradiação gama em um dose su- ficiente para diminuir o nível de contaminantes biológicos autorrepli- cantes na resina cromatográfica). Por exemplo, uma resina cromato- gráfica com biocarga reduzida pode ser uma resina que foi exposta a uma dose de entre cerca de 1 kKGy a cerca de 15 kGy, entre cerca de 1 kGy e cerca de 20 kGy de irradiação gama, entre cerca de 1 kKGy e cerca de 25 kGy de irradiação gama, entre cerca de 1 kGy e cerca de kGy de irradiação gama ou entre cerca de 1 kGy e cerca de 35 kGy de irradiação gama. Métodos exemplificativos para reduzir a biocarga de uma resina cromatográfica são descritos no presente documento. Métodos adicionais para reduzir a biocarga de uma resina cromatográ- fica são conhecidos na técnica.
[00110] O termo "coluna cromatográfica com biocarga reduzida" significa uma coluna cromatográfica (por exemplo, uma coluna croma- tográfica empacotada) que inclui uma resina cromatográfica tratada (por exemplo, resina cromatográfica tratada com irradiação gama) que possui um nível de contaminantes biológicos autorreplicantes menor do que o nível de contaminantes biológicos autorreplicantes presentes em uma coluna cromatográfica idêntica que inclui uma resina croma- tográfica não tratada. Por exemplo, uma coluna cromatográfica com biocarga reduzida pode incluir uma resina cromatográfica tratada que possui um nível de garantia de esterilidade de pelo menos ou cerca de 1x108, 1x107, 1x108, 1x10º ou 1x 10º.
[00111] O termo "tampão com biocarga reduzida" é conhecido na técnica e significa um líquido tratado (por exemplo, filtrado, autoclava- do e/ou tratado com irradiação gama) (por exemplo, uma solução tam- ponada tratada) que possui um nível de agente(s) contaminante(s) au- torreplicante(s) que é menor do que o nível de agente(s) contaminan- te(s) autorreplicante(s) encontrado em um líquido idêntico não tratado. Por exemplo, um tampão com biocarga reduzida pode ter um nível de garantia de esterilidade de pelo menos ou cerca de 1 x 108, 1x 107,1 x 108, 1x 10º ou 1 x 10º
[00112] "Esterilidade absoluta" ou "absolutamente estéril" são ter- mos usados para descrever uma composição ou processo que é com- pletamente isento de contaminantes biológicos autorreplicantes. Por exemplo, o termo pode ser aplicado a uma resina cromatográfica tra- tada com irradiação gama, à superfície interna e ao conteúdo (por exemplo, resina cromatográfica) de uma coluna cromatográfica e/ou um tampão. Uma composição ou processo absolutamente estéril pode ser limpo (conforme este termo é conhecido na técnica).
[00113] "Estéril" ou "esterilidade" são termos usados para descrever uma composição ou processo que possui um nível de garantia de es- terilidade de cerca ou menos de 1,0 x 106 (por exemplo, cerca ou me- nos de 1,0 x 107, cerca ou menos de 1,0 x 108, cerca ou menos de 1,0 x 10º ou 1 x 10º). A determinação de se uma composição ou pro- cesso é estéril pode ser testada usando uma série de processos de produção validados conhecidos na técnica. Por exemplo, uma compo- sição ou processo estéril pode ser completamente isento de contami- nantes biológicos autorreplicantes viáveis (por exemplo, qualquer um dos contaminantes biológicos autorreplicantes descritos no presente documento). Uma composição ou processo estéril também pode ser limpo (conforme este termo é conhecido na técnica).
[00114] O termo "esterilização" significa um processo validado usa- do para tornar uma composição estéril (conforme definido no presente documento). A taxa de inativação de contaminantes biológicos autor- replicantes indicadores resistentes (por exemplo, bactérias) durante um processo de tratamento pode ser medida a fim de determinar se a esterilidade (conforme definido no presente documento) foi alcançada para uma composição.
[00115] O termo "nível de garantia de esterilidade" ou "SAL" é co- nhecido na técnica e significa um nível de confiança de obtenção de esterilidade absoluta em um lote de unidades tratadas. A probabilidade é geralmente calculada com base nos resultados dos estudos de inati- vação realizados durante a validação e expressa na forma de 1 x 10".
[00116] O termo "asséptico" é usado para descrever uma composi-
ção ou processo que é isento de contaminantes biológicos autorrepli- cantes causadores de doenças ou causadores de sintomas (por exemplo, qualquer um dos contaminantes biológicos autorreplicantes descritos no presente documento). Uma composição ou processo as- séptico também pode ser limpo (conforme este termo é conhecido na técnica).
[00117] O termo "operação unitária" é um termo da técnica e signifi- ca uma etapa funcional que pode ser realizada em um processo de purificação de uma proteína recombinante a partir de um meio de cul- tura líquido. Por exemplo, uma unidade de operação pode ser filtrar (por exemplo, remoção de bactérias contaminantes, leveduras, vírus e/ou micobactérias e/ou partículas de um fluido que inclui uma proteí- na recombinante), capturar, remover um marcador de epítopo, purifi- car, reter ou armazenar, refinar, inativar vírus, ajustar a concentração iônica e/ou pH de um fluido que inclui a proteína recombinante e re- mover sais indesejados.
[00118] O termo "captura" significa uma etapa realizada para purifi- car ou isolar parcialmente (por exemplo, pelo menos ou cerca de 5 %, por exemplo, pelo menos ou cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou pelo menos ou cerca de 95 % em peso pura) e concentrar uma pro- teína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombi- nante) a partir de um ou mais de outros componentes presentes em um meio de cultura líquido ou um meio de cultura líquido diluído (por exemplo, proteínas do meio de cultura ou um ou mais outros compo- nentes (por exemplo, DNA, RNA ou outras proteínas) presentes ou secretados de uma célula de mamífero). Tipicamente, a captura é rea- lizada usando uma resina cromatográfica que se liga a uma proteína recombinante (por exemplo, através do uso de cromatografia de afini- dade). Métodos não limitativos para capturar uma proteína recombi-
nante a partir de um meio de cultura líquido ou meio de cultura líquido diluído são descritos no presente documento e outros são conhecidos na técnica. Uma proteína recombinante pode ser capturada a partir de um meio de cultura líquido usando pelo menos uma coluna cromato- gráfica e/ou membrana cromatográfica (por exemplo, qualquer uma das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas descri- tas no presente documento).
[00119] O termo "purificação" significa uma etapa realizada para isolar uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêu- tica recombinante) a partir de uma ou mais de outras impurezas (por exemplo, impurezas a granel) ou componentes presentes em um flui- do, incluindo uma proteína recombinante (por exemplo, proteínas do meio de cultura líquido ou um ou mais de outros componentes (por exemplo, DNA, RNA, outras proteínas, endotoxinas, vírus, etc.) pre- sentes ou secretados a partir de uma célula de mamífero). Por exem- plo, a purificação pode ser realizada durante ou após uma etapa de captura inicial. A purificação pode ser realizada usando uma resina cromatográfica, membrana ou qualquer outro suporte sólido que se liga a uma proteína recombinante ou contaminantes (por exemplo, através do uso de cromatografia de afinidade, cromatografia de intera- ção hidrofóbica, cromatografia de troca aniônica ou catiônica ou cro- matografia com peneiras moleculares). Uma proteína recombinante pode ser purificada a partir de um fluido que inclui a proteína recombi- nante usando pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica (por exemplo, qualquer uma das colunas cromatográfi- cas ou membranas cromatográficas descritas no presente documento).
[00120] O termo "refino" é um termo da técnica e significa uma eta- pa realizada para remover vestígios remanescentes ou pequenas quantidades de contaminantes ou impurezas de um fluido, incluindo uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante) que está próximo de uma pureza final desejada. Por exemplo, o refino pode ser realizado ao passar um fluido que inclui a proteína recombinante através de uma coluna cromatográfica ou ab- sorvente(s) de membrana que se liga(m) seletivamente à proteína re- combinante alvo ou a pequenas quantidades de contaminantes ou im- purezas presentes em um fluido que inclui uma proteína recombinante. Em tal exemplo, o eluato/filtrado da(s) coluna(s) cromatográfica(s) ou absorvente(s) de membrana inclui a proteína recombinante.
[00121] O termo "filtração" significa a remoção de pelo menos parte (por exemplo, pelo menos 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %) de contaminantes biológicos indesejados (por exemplo, uma célula de mamífero, bactérias, células de levedura, vírus ou micobactérias) e/ou matéria em partículas (por exemplo, proteínas precipitadas) de um líquido (por exemplo, um meio de cultura líquido ou fluido presente em qualquer um dos processos descritos no presente documento).
[00122] O termo "eluato/filtrado" é um termo da técnica e significa um fluido que é emitido a partir de uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma quantidade detectável de uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante).
[00123] O termo "processo integrado" significa um processo que é realizado usando elementos estruturais que funcionam de forma coo- perativa para atingir um resultado específico (por exemplo, a purifica- ção de uma proteína recombinante a partir de um meio de cultura lí- quido).
[00124] O termo "processo contínuo" significa um processo que alimenta continuamente fluido através de pelo menos uma parte do sistema. Por exemplo, um processo contínuo é um processo que ali- menta continuamente um meio de cultura líquido que inclui uma prote- Ína recombinante proveniente de um biorreator através de um MCCS.
Outro exemplo de um processo contínuo é um processo que alimenta continuamente um meio de cultura líquido que inclui uma proteína re- combinante proveniente de um biorreator através de um primeiro e se- gundo MCCS (MCCS1 e MCCS2). Exemplos adicionais incluem um processo que alimenta continuamente um meio de cultura líquido que inclui uma proteína recombinante através de um MCCS, um processo que alimenta continuamente um meio de cultura líquido que inclui uma proteína recombinante através de um MCCS1 e um MCCS2 ou um processo que alimenta continuamente um fluido que inclui uma proteí- na recombinante através de um MCCS2.
[00125] O termo "processo fechado" é um termo da técnica e signi- fica um processo que é realizado de modo que os componentes do processo (por exemplo, resinas cromatográficas e/ou tampões) que contatam a proteína recombinante ou líquidos, incluindo a proteína re- combinante, não são intencionalmente expostos a agentes contami- nantes durante um período de tempo significativo (por exemplo, não intencionalmente expostos ao ar durante um período significativo de tempo).
[00126] O termo "substância medicamentosa de proteína terapêuti- ca" significa uma proteína recombinante (por exemplo, uma imunoglo- bulina, fragmento de proteína, proteína manipulada ou enzima) que foi suficientemente purificada ou isolada de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos contaminantes (por exemplo, proteínas, lipídios contaminan- tes e ácidos nucleicos presentes em um meio de cultura líquido ou provenientes de uma célula hospedeira (por exemplo, de uma célula hospedeira de mamífero, levedura ou bacteriana)) e contaminantes biológicos (por exemplo, contaminantes virais e bacterianos) e podem ser formulados em um agente farmacêutico sem quaisquer etapas de purificação substancial e/ou descontaminação adicionais.
[00127] O termo "sistema de cromatografia com múltiplas colunas"
ou "MCCS" significa um sistema de um total de duas ou mais colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas interconectadas ou comutadas. Um exemplo não limitativo de um sistema de cromatogra- fia com múltiplas colunas é um sistema de cromatografia contracorren- te periódica (PCC) que inclui um total de duas ou mais colunas croma- tográficas e/ou membranas cromatográficas interconectadas ou comu- tadas. Exemplos adicionais de sistemas de cromatografia de múltiplas colunas são descritos no presente documento e são conhecidos na técnica.
[00128] O termo "substancialmente isenta" significa uma composi- ção (por exemplo, um meio de cultura líquido) que é pelo menos ou cerca de 90 % isenta (por exemplo, pelo menos ou cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou pelo menos ou cerca de 99 % isenta ou cerca de 100 % isenta) de uma substância especificada (por exemplo, uma cé- lula de mamífero ou uma proteína, ácido nucléico, carboidrato ou lipí- dio contaminante proveniente de uma célula de mamífero).
[00129] O termo "célula de mamífero" significa qualquer célula de ou derivada de qualquer mamífero (por exemplo, um ser humano, um hamster, um camundongo, um macaco verde, um rato, um porco, uma vaca ou um coelho). Por exemplo, uma célula de mamífero pode ser uma célula imortalizada. Em algumas modalidades, a célula de mamí- fero é uma célula diferenciada. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula indiferenciada. Exemplos não limitativos de cé- lulas de mamíferos são descritos no presente documento. Exemplos adicionais de células de mamíferos são conhecidos na técnica.
[00130] O termo "cultura" ou "cultura de células" significa a manu- tenção ou proliferação de uma célula de mamífero sob um conjunto controlado de condições físicas.
[00131] O termo "cultura de células de mamífero" significa um meio de cultura líquido que inclui uma pluralidade de células de mamíferos que é mantida ou proliferada sob um conjunto controlado de condições físicas.
[00132] O termo "meio de cultura líquido" significa um fluido que inclui nutrientes suficientes para permitir que uma célula (por exemplo, uma célula de mamífero) cresça ou prolifere in vitro. Por exemplo, um meio de cultura líquido pode incluir um ou mais dos seguintes: amino- ácidos (por exemplo, 20 aminoácidos), uma purina (por exemplo, hi- poxantina), uma pirimidina (por exemplo, timidina), colina, inositol, tia- mina, ácido fólico, biotina, cálcio, niacinamida, piridoxina, riboflavina, timidina, cianocobalamina, piruvato, ácido lipoico, magnésio, glicose, sódio, potássio, ferro, cobre, zinco e bicarbonato de sódio. Em algu- mas modalidades, um meio de cultura líquido pode incluir soro prove- niente de um mamífero. Em algumas modalidades, um meio de cultura líquido não inclui soro ou outro extrato proveniente de um mamífero (um meio de cultura líquido definido). Em algumas modalidades, um meio de cultura líquido pode incluir vestígios de metais, um hormônio de crescimento de mamífero e/ou um fator de crescimento de mamiífe- ro. Outro exemplo de meio de cultura líquido é o meio mínimo (por exemplo, um meio que inclui apenas sais inorgânicos, uma fonte de carbono e água). Exemplos não limitativos de meio de cultura líquido são descritos no presente documento. Exemplos adicionais de meio de cultura líquido são conhecidos na técnica e estão comercialmente dis- poníveis. Um meio de cultura líquido pode incluir qualquer densidade de células de mamíferos. Por exemplo, conforme usado no presente documento, um volume de meio de cultura líquido removido de um biorreator pode ser substancialmente isento de células de mamífero.
[00133] O termo "meio de cultura líquido isento de componentes derivados de animal" significa um meio de cultura líquido que não in- clui quaisquer componentes (por exemplo, proteínas ou soro) deriva- dos de um mamífero.
[00134] O termo "meio de cultura líquido isento de soro" significa um meio de cultura líquido que não inclui um soro de mamífero.
[00135] O termo "meio de cultura líquido que contém soro" significa um meio de cultura líquido que inclui um soro de mamífero.
[00136] O termo "meio de cultura líquido quimicamente definido" é um termo da técnica e significa um meio de cultura líquido no qual to- dos os componentes químicos são conhecidos. Por exemplo, um meio de cultura líquido quimicamente definido não inclui soro fetal bovino, albumina sérica bovina ou albumina sérica humana, visto que estas preparações incluem, tipicamente, uma mistura complexa de albumi- nas e lipídios.
[00137] O termo "meio de cultura líquido isento de proteína" signifi- ca um meio de cultura líquido que não inclui qualquer proteína (por exemplo, qualquer proteína detectável).
[00138] O termo "imunoglobulina" significa um polipeptídeo que in- clui uma sequência de aminoácidos de pelo menos 15 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 amino- ácidos) de uma proteína de imunoglobulina (por exemplo, uma se- quência de domínio variável, uma sequência estrutural e/ou uma se- quência de domínio constante). A imunoglobulina pode, por exemplo, incluir pelo menos 15 aminoácidos de uma cadeia leve de imunoglobu- lina, por exemplo, pelo menos 15 aminoácidos de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A imunoglobulina pode ser um anticorpo isolado (por exemplo, uma IgG, IgE, 1gD, IgA ou IgM), por exemplo, uma sub- classe de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). A imunoglobu- lina pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento F(ab'), ou um fragmento scFv. A imunoglobulina também pode ser um anticorpo biespecífico ou um anticorpo triespecí- fico ou um anticorpo dimérico, trimérico ou multimérico ou um diacor- po, um Affibody& ou um Nanobody&. A imunoglobulina também pode ser uma proteína manipulada que inclui pelo menos um domínio de imunoglobulina (por exemplo, uma proteína de fusão). Exemplos não limitativos de imunoglobulinas são descritos no presente documento e exemplos adicionais de imunoglobulinas são conhecidos na técnica.
[00139] O termo "fragmento de proteína" ou "fragmento de polipep- tídeo" significa uma porção de uma sequência polipeptídica que possui pelo menos ou cerca de 4 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 5 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 6 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 7 aminoácidos ácidos, pelo menos ou cerca de 8 aminoáci- dos, pelo menos ou cerca de 9 aminoácidos, pelo menos ou cerca de aminoácidos, pelo menos ou cerca de 11 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 12 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 13 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 14 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 15 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 16 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 17 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 18 aminoácidos, pelo menos ou cerca de 19 aminoácidos ou pelo menos pelo menos ou cerca de 20 aminoácidos de comprimento ou mais de 20 aminoáci- dos de comprimento. Um fragmento de proteína recombinante pode ser produzido usando qualquer um dos processos descritos no presen- te documento.
[00140] O termo "proteína manipulada" significa um polipeptídeo que não é naturalmente codificado por um ácido nucleico endógeno presente dentro de um organismo (por exemplo, um mamífero). Exem- plos de proteínas manipuladas incluem enzimas (por exemplo, com uma ou mais substituições, eliminações, inserções ou adições de ami- noácidos que resultam em um aumento na estabilidade e/ou atividade catalítica da enzima manipulada), proteínas de fusão, anticorpos (por exemplo, anticorpos divalentes, anticorpos trivalentes ou um diacorpo) e proteínas de ligação a antígeno que incluem pelo menos uma se- quência de andaime recombinante.
[00141] O termo "proteína secretada" ou "proteína recombinante secretada" significa uma proteína (por exemplo, uma proteína recom- binante) que incluía originalmente pelo menos uma sequência de sinal de secreção quando é traduzida dentro de uma célula de mamífero e através, pelo menos em parte, de clivagem enzimática da sequência de sinal de secreção na célula de mamífero, é secretada pelo menos parcialmente no espaço extracelular (por exemplo, um meio de cultura líquido). Aqueles versados na técnica reconhecerão que uma proteína "secretada" não precisa se dissociar totalmente da célula para ser considerada uma proteína secretada.
[00142] O termo "biorreator de perfusão" significa um biorreator que inclui uma pluralidade de células (por exemplo, células de mamíferos) em um primeiro meio de cultura líquido, em que a cultura das células presentes no biorreator inclui a remoção periódica ou contínua do pri- meiro meio de cultura líquido e ao mesmo tempo ou logo após a adi- ção de substancialmente o mesmo volume de um segundo meio de cultura líquido ao biorreator. Em alguns exemplos, há uma variação incremental (por exemplo, aumento ou diminuição) no volume do pri- meiro meio de cultura líquido removido e adicionado ao longo de perí- odos incrementais (por exemplo, um período de cerca de 24 horas, um período entre cerca de 1 minuto e cerca de 24 horas ou um período de mais de 24 horas) durante o período de cultura (por exemplo, a taxa de realimentação do meio de cultura em uma base diária). A fração de meio removida e substituída a cada dia pode variar dependendo das células que estão sendo cultivadas em particular, a densidade de cul- tura inicial e a densidade celular em um determinado momento. "RV" ou "volume de reator" significa o volume do meio de cultura presente no início do processo de cultura (por exemplo, o volume total do meio de cultura presente após a cultura).
[00143] O termo "biorreator de alimentação descontínua" é um ter-
mo da técnica e significa um biorreator que inclui uma pluralidade de células (por exemplo, células de mamíferos) em um primeiro meio de cultura líquido, em que a cultura das células presentes no biorreator inclui a adição periódica ou contínua de um segundo meio de cultura líquido ao primeiro meio de cultura líquido sem remoção substancial ou significativa do primeiro meio de cultura líquido ou segundo meio de cultura líquido da cultura de células. O segundo meio de cultura líquido pode ser igual ao primeiro meio de cultura líquido. Em alguns exem- plos de cultura de alimentação descontínua, o segundo meio de cultu- ra líquido é uma forma concentrada do primeiro meio de cultura líqui- do. Em alguns exemplos de cultura de alimentação descontínua, o se- gundo meio de cultura líquido é adicionado como um pó seco.
[00144] O termo "meio de cultura líquido clarificado" significa um meio de cultura líquido obtido a partir de uma cultura de células bacte- rianas ou de levedura que é substancialmente isento (por exemplo, pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % ou 99 % isen- to) de células de bactérias ou levedura.
[00145] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados no presente documento possuem o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. São descritos no presen- te documento métodos e materiais para uso na presente invenção; ou- tros métodos e materiais adequados conhecidos na técnica também podem ser usados. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, sequências, entradas em banco de da- dos e outras referências mencionadas no presente documento são in- corporados a título de referência na íntegra. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá.
[00146] Outras características e vantagens da invenção serão evi-
dentes a partir da descrição detalhada e figuras a seguir e reivindica- ções.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00147] A Figura 1 é um gráfico que mostra a capacidade de liga- ção percentual (comparado com a resina cromatográfica não irradiada carregada com o mesmo material) de MabSelect'V SuRe"'“Y (resina cromatográfica de Proteína A) em múltiplos ciclos de cromatografia após irradiação de 40-49 kGy na presença de um dos seguintes tam- pões: (i) ascorbato de sódio a 25 mM, metionina a 25 mM, histidina a mM e manitol a 25 mM em tampão de fosfato de sódio a 50 mM ("SMM'H"); (ii) álcool benzílico a 2 % v/v ("BA a 2 %"); e (iii) ascorbato de sódio a 25 mM, metionina a 25 mM, histidina a 25 mM, manitol a 25 mM e álcool benzílico a 2 % v/v em tampão de fosfato de sódio a 50 MM ("SMM'H + BA a 2 %"”).
[00148] A Figura2 é um gráfico que mostra a capacidade de liga- ção percentual (comparado com a resina cromatográfica não irradiada carregada com o mesmo material) da resina cromatográfica Capto Ad- here em vários ciclos de cromatografia após irradiação de 28-34 kGy ou 40-49 kGy (conforme descrito no Exemplo 2) na presença de um dos seguintes tampões: (i) ascorbato de sódio a 25 mM, metionina a 25 mM, histidina a 25 mM e manitol a 25 mM em tampão de fosfato de sódio a 50 mM ("SMM'H"); ou (ii) ascorbato de sódio a 25 mM, metio- nina a 25 mM, histidina a 25 mM, manitol a 25 mM e álcool benzílico a 2% vlv em tampão de fosfato de sódio a 50 MM ("SMM'H + BA a 2 %").
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00149] São fornecidos no presente documento métodos para redu- ção da biocarga de uma resina cromatográfica que incluem expor um recipiente que inclui uma composição que inclui (i) uma resina croma- tográfica e (ii) um líquido que inclui pelo menos um (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) álcool a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do recipiente e da resina cromatográfica, em que o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade sufici- ente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina croma- tográfica após/quando de exposição à dose de irradiação gama. Tam- bém são fornecidas colunas cromatográficas com biocarga reduzida que contêm uma resina cromatográfica com biocarga reduzida prepa- rada por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente do- cumento, composições que incluem (i) uma resina cromatográfica e (ii) um líquido que inclui pelo menos um (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) álcool, métodos para realizar cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando pelo menos uma destas colunas cromato- gráficas com biocarga reduzida e processos integrados, fechados ou substancialmente fechados e processos contínuos para a produção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada que inclui o uso de pelo menos um destas colunas cromatográficas com biocarga reduzida. Aspectos não limitativos destes métodos e proces- sos são descritos abaixo. Conforme será reconhecido na técnica, os vários aspectos descritos abaixo podem ser usados em qualquer com- binação, sem limitação.
Composições Que Contêm Resina cromatográfica e Pelo Menos um Álcool
[00150] São fornecidas no presente documento composições que incluem (i) uma resina cromatográfica (por exemplo, qualquer uma das resinas cromatográficas descritas no presente documento ou conheci- das na técnica) e (ii) um líquido que inclui pelo menos um (por exem- plo, dois, três, quatro ou cinco) álcool (por exemplo, qualquer um dos álcoois exemplificativos descritos no presente documento ou conheci- dos na técnica), em que o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica quando de tratamento com uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga da composição. Por exemplo, a resina cromatográfica pode ser pelo menos uma de uma resina cromatográfica de troca aniônica, uma resina cromatográfi- ca de troca catiônica, uma resina cromatográfica de afinidade ou pseu- doafinidade, uma resina cromatográfica de interação hidrofóbica e uma resina cromatográfica de exclusão por tamanho ou qualquer combina- ção das mesmas. Em alguns exemplos, a resina cromatográfica é uma resina que inclui uma proteína ou ligante peptídico (por exemplo, uma resina cromatográfica de afinidade com uma proteína ou ligante peptí- dico, por exemplo, uma resina cromatográfica de proteína A ou proteí- na G).
[00151] A composição, por exemplo, pode ser uma suspensão de resina cromatográfica sedimentada. Em alguns exemplos, a composi- ção pode ser uma mistura sólida molhada ou úmida. Em alguns exem- plos, a composição é uma resina cromatográfica empacotada no líqui- do.
[00152] Em alguns exemplos de qualquer uma das composições, o pelo menos um (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) álcool pode ser selecionado a partir do grupo de: álcool benzílico, ciclo-hexanol, álcool isobutílico, 2-metil-2-butanol, metanol, etanol, propan-2-ol, pro- pan-1-ol, butan-1-ol, pentan-1-ol, hexadecan-1-ol, 2-fenil etanol, sec- fenil etanol, 3-fenil-1- propanol, 1-fenil-1-propanol, 2-fenil-1-propanol, 2-fenil-2-propanol, 1-fenil-2-butanol, 2-fenil-1-butanol, 3-fenil-1-butanol, 4-fenil-2-butanol, dl-1-fenil-2-pentanol, 5-fenil-1-pentanol e 4-fenil-1- butanol. Em alguns exemplos, o pelo menos um álcool pode ser álcool benzílico.
[00153] Em alguns exemplos de qualquer uma das composições, a concentração da soma total de um ou mais álcoois no líquido ou na composição é cerca de 0,01 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 0,01 % vlv a cerca de 19 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 18 % v/v,
cerca de 0,01 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 13 % v/v, cer- ca de 0,01 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 4,5 % vv, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 0,01 % vv a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 1,6 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 1,4 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 1,2 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 1,0 % v/v, cerca de 0,01 % vv a cerca de 0,8 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 0,6 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 0,4 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 0,2 % v/v, cerca de 0,01 % v/v a cerca de 0,1 % v/v, cerca de 0,01 % vv a cerca de 0,05 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 15 % v/v, cer- ca de 0,05 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 13 % vv, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 6 % vlv, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 3,0 %
vlv, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 0,05 % vv a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 1,6 % vlv, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 1,4 % v/v, cerca de 0,05 % vv a cerca de 1,2 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 1,0 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 0,8 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 0,6 % vlv, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 0,4 % v/v, cerca de 0,05 % vv a cerca de 0,2 % v/v, cerca de 0,05 % v/v a cerca de 0,1 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 17 % vv, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 0,1 % vv a cerca de 15 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 0,1 % víva cerca de 8 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 0,1 % vv a cerca de 6 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 4,0 % vlv, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cer- ca de 3,0 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 0,1 % vlv a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 1,6 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 1,4 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 1,2 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 1,0 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 0,8 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 0,6 % vlv, cerca de 0,1 % v/v a cerca de 0,4 % v/v, cerca de 0,1 % v/v a cer- ca de 0,2 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 0,2 % vv a cerca de 19 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 9 % vv, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 0,2 % vv a cerca de 7 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 0,2 % vv a cerca de 5 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cer- ca de 0,2 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 3,5 % vv, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 0,2 % vv a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 1,8 % vlv, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 1,6 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cer- ca de 1,4 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 1,2 % v/v, cerca de 0,2 % vlv a cerca de 1,0 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 0,8 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 0,6 % v/v, cerca de 0,2 % v/v a cerca de 0,4 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 0,4 % vv a cerca de 19 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 14 % vv, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 7 % vlv, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cer- ca de 5 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cer- ca de 0,4 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 2,5 % vv, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 0,4 % vv a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 1,6 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 1,4 % vlv, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 1,2 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cer-
ca de 1,0 % v/v, cerca de 0,4 % v/v a cerca de 0,8 % v/v, cerca de 0,4 % vlv a cerca de 0,6 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 18 % vv, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 11 % vv, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 0,6 % vv a cerca de 7 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 4,5 % vlv, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cer- ca de 3,5 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 0,6 % vlv a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 1,8 % vv, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 1,6 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 1,4 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 1,2 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 1,0 % v/v, cerca de 0,6 % v/v a cerca de 0,8 % vlv, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 14 % vlv, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 5 % vilv, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 0,8 % vv a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 2,5 %
vlv, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cer- ca de 2,0 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 0,8 % vlv a cerca de 1,6 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 1,4 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 1,2 % v/v, cerca de 0,8 % v/v a cerca de 1,0 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 1,0 % vív a cerca de 19 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 14 % vv, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 1,0 % vv a cerca de 12 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 7 % vlv, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cer- ca de 5 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cer- ca de 1,0 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 2,5 % vv, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 1,0 % vv a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 1,6 % v/v, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 1,4 % vlv, cerca de 1,0 % v/v a cerca de 1,2 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cer- ca de 20 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 1,2 % vv a cerca de 18 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 17 % vv, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de % vv, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 1,2 % vv a cerca de 13 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 8 % vlv, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cer- ca de 6 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cer-
ca de 1,2 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 3,0 % vv, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 1,2 % vv a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 1,6 % vlv, cerca de 1,2 % v/v a cerca de 1,4 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cer- ca de 20 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 1,4 % vv a cerca de 18 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 17 % vv, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de % vv, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 1,4 % vv a cerca de 13 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 8 % vlv, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cer- ca de 6 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cer- ca de 1,4 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 3,0 % vv, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 1,4 % vv a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 1,4 % v/v a cerca de 1,6 % vlv, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 14 % vlv, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 5 % vv, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 1,6 % vv a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de
1,6 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 2,5 % vlv, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cer- ca de 2,0 % v/v, cerca de 1,6 % v/v a cerca de 1,8 % v/v, cerca de 1,8 % vv a cerca de 20 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 17 % vv, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 1,8 % vv a cerca de 15 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 1,8 % víva cerca de 8 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 1,8 % vv a cerca de 6 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 4,0 % vlv, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cer- ca de 3,0 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 1,8 % vlv a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 1,8 % v/v a cerca de 2,0 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 12 % vv, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 2,0 % vv a cerca de 8 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 2,0 % v/v a cerca de 2,2 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de
18 % vv, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 2,2 % vv a cerca de 16 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 2,2 % vlv a cerca de 14 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 11 % vv, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 2,2 % vv a cerca de 9 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 2,2 % vv a cerca de 7 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 4,5 % vlv, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cer- ca de 3,5 % v/v, cerca de 2,2 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 2,2 % vlv a cerca de 2,5 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 18 % vv, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 2,5 % vv a cerca de 16 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 11 % vv, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 2,5 % vv a cerca de 9 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 2,5 % vv a cerca de 7 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 4,5 % vlv, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cer- ca de 3,5 % v/v, cerca de 2,5 % v/v a cerca de 3,0 % v/v, cerca de 3,0 % vv a cerca de 20 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 17 % vv, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 3,0 % víva cerca de 8 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 3,0
% vv a cerca de 6 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 4,0 % vlv, cerca de 3,0 % v/v a cerca de 3,5 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cer- ca de 20 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 3,5 % vv a cerca de 18 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 17 % vv, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de % vv, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 8 % vlv, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cer- ca de 6 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 3,5 % v/v a cerca de 4,0 % v/v, cer- ca de 4,0 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 19 % vlv, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 4,0 % vv a cerca de 17 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 12 % vv, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 4,0 % vv a cerca de 8 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 4,0 % v/v a cerca de 4,5 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de % vv, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 13 % vv, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 8 % v/v,
cerca de 4,5 % v/v a cerca de 7 % v/v, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 6 % vlv, cerca de 4,5 % v/v a cerca de 5 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 5% víva cerca de 18 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 11 % vlv, cerca de 5 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 5% vv a cerca de 7 % v/v, cerca de 5 % v/v a cerca de 6 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 17 % vlv, cerca de 6 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 15 % vlv, cerca de 6 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 6 % víva cerca de 11 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 6 % v/v a cerca de 8 % v/v, cerca de 6 % vv a cerca de 7 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 16 % vlv, cerca de 7 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 7 % viva cerca de 12 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 7 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 7 % vlv a cerca de 8 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 20 % v/v, cer- ca de 8 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 18 % vlv, cerca de 8 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 8 % viva cerca de 14 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 8 % v/v a cerca de 9 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 19 % vlv, cerca de 9 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 9 % viva cerca de 15 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 9 % v/v a cerca de 10 % v/v, cerca de 10 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 10 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 10 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 10 % víva cerca de 17 % v/v, cerca de 10 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 10 % vv a cerca de 15 % v/v, cerca de 10 % v/v a cerca de 14 % v/v, cer- ca de 10 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 10 % v/v a cerca de 12 % vlv, cerca de 10 % v/v a cerca de 11 % v/v, cerca de 11 % v/v a cer- ca de 20 % v/v, cerca de 11 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 11 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 11 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 11 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 11 % v/v a cerca de 15% vlv, cerca de 11 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 11 % v/v a cerca de 13 % v/v, cerca de 11 % v/v a cerca de 12 % v/v, cerca de 12 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 12 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 12 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 12 % v/v a cerca de 17 % vlv, cerca de 12 % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 12 % v/v a cerca de % vv, cerca de 12 % v/v a cerca de 14 % v/v, cerca de 12 % víva cerca de 13 % v/v, cerca de 13 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 13 % vv a cerca de 19 % v/v, cerca de 13 % v/v a cerca de 18 % v/v, cer- ca de 13 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 13 % v/v a cerca de 16 % vlv, cerca de 13 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 13 % v/v a cer- ca de 14 % v/v, cerca de 14 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 14 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 14 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 14 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 14 % v/v a cerca de 16 % vlv, cerca de 14 % v/v a cerca de 15 % v/v, cerca de 15 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 15 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 15 % v/v a cerca de 18 % v/v, cerca de 15 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de % v/v a cerca de 16 % v/v, cerca de 16 % v/v a cerca de 20 % v/v, cerca de 16 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 16 % v/v a cerca de 18 % vv, cerca de 16 % v/v a cerca de 17 % v/v, cerca de 17 % viva cerca de 20 % v/v, cerca de 17 % v/v a cerca de 19 % v/v, cerca de 17 % vv a cerca de 18 % v/v, cerca de 18 % v/v a cerca de 20 % v/v, cer- ca de 18 % v/v a cerca de 19 % v/v ou cerca de 19 % v/v a cerca de 20 % Viv.
[00154] Em alguns exemplos de qualquer uma das composições descritas no presente documento, o líquido pode incluir ainda pelo menos um (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) agente antioxi- dante e/ou quelante. Em alguns exemplos de qualquer uma das com- posições descritas no presente documento, o líquido pode ainda incluir pelo menos um (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) agente antio- xidante e/ou quelante em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação do resina cromatográfica após exposi- ção à dose de irradiação gama.
[00155] Em alguns exemplos de qualquer uma das composições descritas no presente documento, o líquido pode incluir pelo menos um (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) agente antioxidante sele- cionado a partir do grupo de: glutationa reduzida, tiorredoxina reduzi- da, cisteína reduzida, um carotenoide, melatonina, licopeno, tocoferol, ubiquinona reduzida, ascorbato, bilirrubina, ácido úrico, ácido lipoico, um flavonoide, um ácido fenolpropanoide, lidocaína, naringenina, fule- reno, glicose, manitol, 4-hidróxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxila e di- metilmetoxicromanol. Em alguns exemplos de qualquer uma das com- posições descritas no presente documento, o líquido pode incluir pelo menos um (por exemplo, dois, três ou quatro) antioxidante selecionado a partir do grupo de: manitol, ascorbato de sódio, histidina e metionina.
[00156] Em alguns exemplos de qualquer uma das composições descritas no presente documento, o líquido pode conter pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou quatro) de metionina (ou, alternati- vamente, cisteína ou glutationa), ascorbato de sódio, histidina e mani- tol.
Em alguns exemplos de qualquer uma das composições descritas no presente documento, o líquido pode conter metionina (ou, alternati- vamente, cisteína ou glutationa), ascorbato de sódio, histidina e mani- tol.
Em alguns exemplos de qualquer uma das composições descritas no presente documento, o líquido pode incluir: (i) manitol entre 75 mM e cerca de 125 mM (por exemplo, entre 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 85 mM e cerca de 115 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM ou entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM); (ii) metionina (ou, alternativamente, cisteína ou glutationa) entre 75 mM e cerca de 125 mM (por exemplo, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 MM, entre cerca de 85 mM e cerca de 115 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM ou entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM); (iii) ascorbato de sódio entre 75 mM e cerca de 125 mM (por exemplo, en- tre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 85 mM e cerca de 115 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM ou entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM); (iv) histidina entre 75 mM e cerca de 125 mM (por exemplo, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, en- tre cerca de 85 mM e cerca de 115 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM ou entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM); (v) metioni- na (ou, alternativamente, cisteína ou glutationa) entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM (por exemplo, entre cerca de 35 mM e cerca de 65 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 60 mM ou entre cerca de 45 mM e cerca de 55 mM) e histidina entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM (por exemplo, entre cerca de 35 mM e cerca de 65 mM, entre cer- ca de 40 mM e cerca de 60 mM ou entre cerca de 45 mM e cerca de 55 mM); (vi) metionina (ou, alternativamente, cisteína ou glutationa)
entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM (por exemplo, entre cerca de mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 40 mM ou entre cerca de 25 mM e cerca de 35 mM), histidina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM (por exemplo, entre cerca de 15 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 40 mM ou entre cerca de 25 mM e cerca de 35 mM) e ascorbato de sódio entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM (por exemplo, entre cerca de 15 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 40 mM ou entre cerca de 25 mM e cerca de 35 mM); ou (vii) ascorbato de sódio entre cerca de 5 MM a cerca de 45 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM ou entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM), metionina (ou, alternativamente, cisteína ou glutationa) entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de mM ou entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM), manitol entre cer- ca de 5 mM e cerca de 45 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM ou entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM) e histidina entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM ou entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM). Em alguns exemplos de qualquer uma das composições descritas no presente documento, o líquido pode ser uma solução tamponada (por exemplo, uma solução tamponada de fosfato, por exemplo, uma solução tamponada de fosfato de sódio, tal como fosfato de sódio a 50 mM, pH de 6,0).
[00157] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções descritas no presente documento, o líquido pode incluir ainda pe- lo menos um (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) quelante (por exemplo, pelo menos um quelante selecionado a partir do grupo de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido 2,3-dimercapto-1-propa-
nossulfônico sódico (DMPS), ácido dimercaptossuccínico (DMSA), me- talotionina e desferroxamina).
[00158] Também é fornecido no presente documento um recipiente (por exemplo, recipiente de armazenamento, por exemplo, um recipi- ente de plástico ou uma coluna cromatográfica) que inclui uma compo- sição (por exemplo, qualquer uma das composições exemplificativas descritas no presente documento) que inclui (i) uma resina cromato- gráfica (por exemplo, qualquer uma das resinas cromatográficas des- critas no presente documento ou conhecidas na técnica) e (ii) um lí- quido que inclui pelo menos um álcool (por exemplo, qualquer um dos álcoois exemplificativos descritos no presente documento ou conheci- dos na técnica), em que o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após tratamento com uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga da composição. Por exemplo, o recipiente (por exemplo, recipiente de armazenamento, por exemplo, um recipiente de plástico ou uma coluna cromatográfica) po- de ter um volume interno, por exemplo, de pelo menos cerca de 1 mL, mL, pelo menos cerca de 10 mL, pelo menos cerca de 20 mL, pelo menos cerca de 30 mL, pelo menos cerca de 40 mL, pelo menos cerca de 50 mL, pelo menos cerca de 60 mL, pelo menos cerca de 70 mL, pelo menos cerca de 80 mL, pelo menos cerca de 90 mL, pelo menos cerca de 100 mL, pelo menos cerca de 110 mL, pelo menos cerca de 120 mL, pelo menos cerca de 130 mL, pelo menos cerca de 140 mL, pelo menos cerca de 150 mL, pelo menos cerca de 160 mL, pelo me- nos cerca de 170 mL, pelo menos cerca de 180 mL, pelo menos cerca de 190 mL, pelo menos cerca de 200 mL, pelo menos cerca de 210 mL, pelo menos cerca de 220 mL, pelo menos cerca de 230 mL, pelo menos cerca de 240 mL, pelo menos cerca de 250 mL, pelo menos 300 mL, pelo menos 350 mL, pelo menos 400 mL ou pelo menos 500 mL. Por exemplo, um recipiente pode ter um volume interno, por exemplo, de entre cerca de 1 mL e cerca de 500 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 50 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 500 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 400 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 350 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 300 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 250 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 200 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 150 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 100 mL ou entre cerca de 5 mL e cerca de 50 mL. Em alguns exemplos, a resina cromatográfica no recipiente é uma suspensão de resina cromatográfi- ca sedimentada no líquido. Em alguns exemplos, o recipiente inclui uma resina cromatográfica empacotada (por exemplo, empacotada no líquido).
[00159] Em qualquer uma das composições fornecidas no presente documento, o líquido pode conter ainda pelo menos um (por exemplo, 2,3,4,5,6,7,8, 9 ou 10) agente antioxidante e/ou pelo menos um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) quelante. Qualquer um dos agentes antioxidantes que podem ser incluídos em qualquer uma das composições fornecidas no presente documento pode ter a capacida- de de extinguir uma ou mais das seguintes espécies reativas de oxi- gênio e/ou nitrogênio: radical hidroxila, radical carbonato, ânion supe- róxido, radical peroxila, peroxinitrito, dióxido de nitrogênio e óxido nítri- co. Exemplos não limitativos de agentes antioxidantes que podem ser incluídos em qualquer uma das composições fornecidas no presente documento incluem: glutationa reduzida, tiorredoxina reduzida, cisteína reduzida, um carotenoide, melatonina, licopeno, tocoferol, ubiquinona reduzida, ascorbato, bilirrubina, ácido úrico, ácido lipoico, um flavonoi- de, um ácido fenolpropanoide, lidocaína, naringenina, fulereno, glico- se, manitol, 4-hidróxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxila e dimetilmetoxi- cromanol. Exemplos não limitativos adicionais de agentes antioxidan- tes incluem enzimas antioxidantes (por exemplo, superóxido dismu-
tase, glutationa peroxidase, glutationa redutase, catalase e tiorredoxi- na redutase). Exemplos adicionais de agentes antioxidantes que po- dem ser incluídos em qualquer uma das composições fornecidas no presente documento incluem manitol, ascorbato de sódio, metionina e histidina. Outros exemplos de agentes antioxidantes incluem cisteína, taurina, mercaptopropionilglicina, N-acetilcisteína, óleo de alho, sulfeto de dialila, ácido di-hidrolipoico e trissulfeto de dialila. Algumas modali- dades que incluem uma enzima antioxidante como um agente antioxi- dante podem incluir ainda um ou mais substratos para a enzima. Um agente antioxidante pode ser identificado usando uma série de méto- dos conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, spin trapping, co- rantes sensíveis a redox e ensaios de quimioluminescência.
[00160] Qualquer um dos quelantes que podem ser incluídos em qualquer uma das composições fornecidas no presente documento podem ter a capacidade de se ligar a um metal ativo redox (por exem- plo, Cu?** e Fe?*) com alta afinidade (por exemplo, cerca ou menos de 1 UM, cerca de ou menos de 800 nM, cerca ou menos de 700 nM, cer- ca ou menos de 600 nM, cerca ou menos de 500 nM, cerca ou menos de 400 nM, cerca ou menos de 300 nM, cerca ou menos de 250 nM, cerca de ou menos de 200 nM, cerca ou menos de 150 nM, cerca ou menos de 100 nM, cerca ou menos de 80 nM, cerca ou menos de 60 NM, cerca ou menos de 40 nM, cerca ou menos de 20 nM ou cerca de ou menos de 1 nm). Exemplos não limitativos de quelante(s) que po- de(m) ser incluído(s) em qualquer uma das composições fornecidas no presente documento incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido 2,3-dimercapto-1-propanossulfônico sódico (DMPS), ácido di- mercaptossuccínico (DMSA), metalotionina e desferroxamina.
[00161] A concentração de cada um dos quelantes e/ou antioxidan- tes que podem ser incluídos em qualquer uma das composições for- necidas no presente documento pode ser entre cerca de 0,1 mM e cerca de 150 mM (por exemplo, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 100 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 80 mM, en- tre cerca de 0,1 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 30 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 25 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 20 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 10 mM, entre cerca de 0,1 mM e cerca de 5,0 mM, entre cer- ca de 0,5 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 0,5 mM e cerca de 100 mM, entre cerca de 0,5 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 0,5 mM e cerca de 25 mM, entre cerca de 0,5 mM e cerca de 15 mM, en- tre cerca de 0,5 mM e cerca de 10 mM, entre cerca de 0,5 mM e cerca de 5 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 100 mM, en- tre cerca de 1 mM e cerca de 80 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 30 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 25 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 100 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 80 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 30 MM, entre cerca de 5 mM e cerca de 25 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 1 mM e cerca de 100 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 80 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 30 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 100 mM,
entre cerca de 20 mM e cerca de 80 mM, entre cerca de 20 mM e cer- ca de 60 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 100 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 80 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 150 mM, en- tre cerca de 40 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 100 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 90 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 80 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 70 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 50 mM e cer- ca de 150 mM, entre cerca de 50 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 50 mM e cerca de 100 mM, entre cerca de 50 mM e cerca de 80 MM, entre cerca de 50 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 80 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 80 mM e cerca de 125 mM, entre cerca de 80 mM e cerca de 100 mM, entre cerca de 100 mM e cerca de 150 mM ou entre cerca de 100 mM e cerca de 125 mM).
[00162] Em alguns exemplos, as composições fornecidas no pre- sente documento podem conter um ou mais de manitol a 5 mM a cerca de 150 mM (por exemplo, manitol entre cerca de 10 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 50 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 60 mM e cerca de 140 mM, entre cerca de 70 mM e cerca de 130 mM, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM, entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 35 MM, entre cerca de 10 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM ou entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM); metioni- na (ou, alternativamente, cisteína ou glutationa) a 5 mM a cerca de 150 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 150 mM, en- tre cerca de 20 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 50 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 60 mM e cerca de 140 mM, entre cerca de 70 mM e cerca de 130 mM, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM, entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM, entre cerca de 35 mM e cerca de 65 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 45 mM e cerca de 55 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 25 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM ou entre cerca de 20 mM e cerca de 25 mM); ascorbato de sódio a 5 MM a 150 mM (por exemplo, ascorbato de sódio entre cerca de 10 mM e cerca de 150 MM, entre cerca de 20 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 50 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 60 mM e cerca de 140 mM, entre cerca de 70 mM e cerca de 130 mM, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM, entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 25 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 25 mM); e histidina a 5 MM a cerca de 150 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 50 mM e cerca de 150 mM, entre cerca de 60 mM e cerca de 140 mM, entre cerca de 70 mM e cerca de 130 mM, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM, entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM, entre cerca de 35 mM e cerca de 65 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 60 mM, entre cerca de 45 mM e cerca de 55 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 50 mM, entre cerca de 25 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM ou entre cerca de 20 mM e cerca de 25 mM).
[00163] Exemplos não limitativos de qualquer uma das composi- ções podem conter (i) manitol entre cerca de 75 mM e cerca de 125 mM (por exemplo, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 85 mM e cerca de 115 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM ou entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM) (por exemplo, em uma solução tamponada, por exemplo, um tampão de fosfato, tal como fosfato de sódio a 50 mM, pH de 6,0); (ii) metionina (ou, alterna- tivamente, cisteína ou glutationa) entre cerca de 75 mM e cerca de 125 mM (por exemplo, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 85 mM e cerca de 115 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM ou entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM) (por exemplo, em uma solução tamponada, por exemplo, um tampão de fosfato, tal como fosfato de sódio a 50 mM, pH de 6,0); (iii) ascorbato de sódio entre cerca de 75 mM e cerca de 125 mM (por exemplo, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 85 mM e cerca de 115
MM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM ou entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM) (por exemplo, em uma solução tamponada, por exemplo, um tampão de fosfato, tal como fosfato de sódio a 50 mM, pH de 6,0); (iv) histidina entre cerca de 75 mM e cerca de 125 mM (por exemplo, entre cerca de 80 mM e cerca de 120 mM, entre cerca de 85 mM e cerca de 115 mM, entre cerca de 90 mM e cerca de 110 mM ou entre cerca de 95 mM e cerca de 105 mM) (por exemplo, em uma solução tamponada, por exemplo, um tampão de fosfato, tal como fosfato de sódio a 50 mM, pH de 6,0); (v) metionina (ou, alterna- tivamente, cisteína ou glutationa) entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM (por exemplo, entre cerca de 35 mM e cerca de 65 mM, entre cer- ca de 40 mM e cerca de 60 mM ou entre cerca de 45 mM e cerca de 55 mM) e histidina entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM (por exemplo, entre cerca de 35 mM e cerca de 65 mM, entre cerca de 40 mM e cerca de 60 mM ou entre cerca de 45 mM e cerca de 55 mM) (por exemplo, em uma solução tamponada, por exemplo, um tampão de fosfato, tal como fosfato de sódio a 50 mM, pH de 6,0); (vi) metioni- na (ou, alternativamente, cisteína ou glutationa) entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM (por exemplo, entre cerca de 15 mM e cerca de 45 MM, entre cerca de 20 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 25 mM a cerca de 35 mM ou entre cerca de 30 mM e cerca de 35 mM), histidina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM (por exemplo, entre cerca de mM e cerca de 45 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 25 mM a cerca de 35 mM ou entre cerca de 30 mM e cerca de 35 mM) e ascorbato de sódio entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM (por exemplo, entre cerca de 15 mM e cerca de 45 mM, en- tre cerca de 20 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 25 mM a cerca de 35 mM ou entre cerca de 30 mM a cerca de 35 mM) (por exemplo, em uma solução tamponada, por exemplo, um tampão de fosfato, tal como fosfato de sódio a 50 MM, pH de 6,0); ou (vii) ascorbato de sódio entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM (por exemplo, entre cerca de mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM ou entre cerca de 23 mM e cerca de 27 mM), metionina (ou, alternativamente, cisteína ou glutatio- na) entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM ou entre cerca de 23 mM e cerca de 27 mM), manitol entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM ou entre cerca de 23 mM e cerca de 27 mM) e histidina entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM (por exemplo, entre cerca de 10 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 15 mM e cerca de 35 mM, entre cerca de 20 mM e cerca de 30 mM ou entre cerca de 23 mM e cerca de 27 mM) (por exemplo, em uma solução tamponada, por exemplo, um tampão de fosfato, tal como fosfato de sódio a 50 mM, pH de 6,0).
[00164] Doses não limitativas de irradiação gama suficientes para reduzir a biocarga de qualquer uma das composições fornecidas no presente documento são descritas abaixo. Doses adicionais de irradia- ção gama suficientes para reduzir a biocarga de qualquer uma das composições fornecidas no presente documento são conhecidas na técnica. Por exemplo, qualquer uma das composições descritas no presente documento pode ser tratada com irradiação gama em qual- quer uma das doses, em qualquer uma das taxas de irradiação gama e/ou em qualquer uma das temperaturas para realizar a irradiação gama descrita no presente documento (em qualquer combinação). À biocarga de uma composição pode ser determinada, por exemplo, ao pegar uma amostra da composição que conteria contaminante(s) bio- lógico(s) autorreplicante(s) presente(s) na composição, por exemplo, através do coleta do estômago, ultrassom, agitação, mistura de vórti-
ce, lavagem, mistura ou coleta de esfregaço e qualificar ou quantificar o nível de contaminante(s) biológico(s) autorreplicante(s) presente(s) na amostra (por exemplo, colocando a amostra em um meio de cres- cimento que permitiria ao contaminante biológico se autorreplicar, por exemplo, colocar a amostra em uma placa de Petri ou passar a amos- tra através de uma membrana).
[00165] A quantidade do pelo menos um álcool, o pelo menos um agente antioxidante e/ou o pelo menos um quelante suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após tratamento com uma dose de irradiação gama suficiente para re- duzir a biocarga da composição pode ser determinada, por exemplo, usando métodos descritos nos Exemplos. Por exemplo, o nível de re- dução na capacidade de ligação de uma resina cromatográfica tratada com irradiação gama na presença de uma quantidade de pelo menos um álcool (e opcionalmente, ainda na presença de pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante) pode ser comparado com o nível de redução na capacidade de ligação da resina cromatográfica tratada com a mesma dose de irradiação gama na ausência de pelo menos um álcool (e opcionalmente, pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante), onde uma diminuição no nível de redução na capacidade de ligação da resina cromatográfica irradiada com irradiação gama na presença do pelo menos um álcool (e opcionalmente, ainda na pre- sença de pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante) compara- do com a resina cromatográfica irradiada com irradiação gama na au- sência de pelo menos um álcool (e opcionalmente, pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante), indica que o pelo menos um álcool (e, opcionalmente, o agente antioxidante agente e/ou quelante) estava presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da ca- pacidade de ligação da resina cromatográfica após tratamento com irradiação gama. Métodos exemplificativos para determinar a capaci-
dade de ligação de uma resina cromatográfica são descritos nos Exemplos. Exemplos adicionais de métodos para determinar a capaci- dade de ligação de uma resina cromatográfica são conhecidos na téc- nica. Métodos de Redução da Biocarga de Uma Resina cromatográfica
[00166] São fornecidos no presente documento métodos de redu- ção da biocarga de uma resina cromatográfica. Estes métodos incluem uma etapa de expor um recipiente que inclui uma composição que compreende (i) uma resina cromatográfica e (ii) um líquido que inclui pelo menos um álcool (por exemplo, qualquer uma das composições exemplificativas que inclui uma resina cromatográfica e um líquido que inclui pelo menos um álcool descrito no presente documento) a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do recipien- te e da resina cromatográfica, onde o pelo menos um álcool está pre- sente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capaci- dade de ligação da resina cromatográfica após (ou quando de) exposi- ção à dose de irradiação gama.
[00167] Também são fornecidos métodos de redução da biocarga de uma resina cromatográfica que incluem expor um recipiente que inclui uma composição que compreende (i) uma resina cromatográfica e (ii) um líquido que inclui pelo menos um álcool em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da croma- tografia resina após/quando de exposição à irradiação gama (por exemplo, qualquer uma das composições que inclui uma resina croma- tográfica e um líquido que inclui pelo menos um álcool descrito no pre- sente documento) à irradiação gama em uma taxa de entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 6 kGy/hora (por exemplo, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 5,5 kKGy/hora, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 5,0 kGy/hora, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 4,5 kGy/hora, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 4,0 kGy/hora, entre cerca de
0,1 kGy/hora a cerca de 3,5 kGy/hora, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 3,0 kGy/hora, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 2,5 kGy/hora, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 2,0 kGy/hora, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 1,5 kGy/hora, entre cerca de 0,1 kGy/hora a cerca de 1,0 kKGy/hora, entre cerca de 0,5 kKGy/hora a cerca de 6 kGy/hora, entre cerca de 0,5 kGy/hora a cerca de 5,5 kGy/hora, entre cerca de 0,5 kGy/hora a cerca de 5,0 kGy/hora, entre cerca de 0,5 kGy/hora a cerca de 4,5 kGy/hora, entre cerca de 0,5 kKGy/hora a cerca de 4,0 kGy/hora, entre cerca de 0,5 kGy/hora a cerca de 3,5 kGy/hora, entre cerca de 0,5 kGy/hora a cerca de 3,0 kGy/hora, entre cerca de 0,5 kGy/hora a cerca de 2,5 kGy/hora, entre cerca de 0,5 kGy/hora a cerca de 2,0 kGy/hora) e/ou em uma temperatura entre cerca de 4 ºC a cerca de 25 ºC (por exemplo, entre cerca de 4 ºC a cerca de 20 ºC, entre cerca de 4 ºC a cerca de 15 ºC, entre cerca de 4 ºC a cerca de 10 ºC, entre cerca de 10 ºC a cerca de 25 ºC, entre cer- ca de 10 ºC a cerca de 20 ºC, entre cerca de 10 ºC a cerca de 15 ºC ou entre cerca de 15 ºC a cerca de 25ºC) para uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do recipiente e da resina cro- matográfica.
[00168] Algumas modalidades de qualquer um destes métodos po- dem incluir, antes e/ou após a etapa de exposição, o armazenamento do recipiente ou da composição que inclui a resina cromatográfica e o líquido que inclui o pelo menos um álcool (por exemplo, qualquer um dos recipientes ou qualquer uma das composições que inclui a resina cromatográfica e o líquido que inclui pelo menos um álcool descrito no presente documento) durante um período de cerca de 1 hora a cerca de 1 ano, cerca de 1 hora a cerca de 11 meses, cerca de 1 hora a cer- ca de 10 meses, cerca de 1 hora a cerca de 9 meses, cerca de 1 hora a cerca de 8 meses, cerca de 1 hora a cerca de 7 meses, cerca de 1 hora a cerca de 6 meses, cerca de 1 hora a cerca de 5 meses, cerca de 1 hora a cerca de 4 meses, cerca de 1 hora a cerca de 3 meses, cerca de 1 hora a cerca de 2 meses, cerca de 1 hora a cerca de 1 mês, cerca de 1 hora a cerca de 2 semanas, cerca de 1 hora a cerca de 1 semana, cerca de 1 hora a cerca de 5 dias, cerca de 1 hora a cerca de 2 dias, cerca de 1 hora a cerca de 1 dia, cerca de 1 hora a cerca de 12 horas, cerca de 1 hora a cerca de 6 horas, cerca de 6 ho- ras a cerca de 1 ano, cerca de 6 horas a cerca de 11 meses, cerca de 6 horas a cerca de 10 meses, cerca de 6 horas a cerca de 9 meses, cerca de 6 horas a cerca de 8 meses, cerca de 6 horas a cerca de 7 meses, cerca de 6 horas a cerca de 6 meses, cerca de 6 horas a cerca de 5 meses, cerca de 6 horas a cerca de 4 meses, cerca de 6 horas a cerca de 3 meses, cerca de 6 horas a cerca de 2 meses, cerca de 6 horas a cerca de 1 mês, cerca de 6 horas a cerca de 2 semanas, cerca de 6 horas a cerca de | semana, cerca de 6 horas a cerca de 5 dias, cerca de 6 horas a cerca de 2 dias, cerca de 6 horas a cerca de 1 dia, cerca de 6 horas a cerca de 12 horas, cerca de 12 horas a cerca de 1 ano, cerca de 12 horas a cerca de 11 meses, cerca de 12 horas a cer- ca de 10 meses, cerca de 12 horas a cerca de 9 meses, cerca de 12 horas a cerca de 8 meses, cerca de 12 horas a cerca de 7 meses, cer- ca de 12 horas a cerca de 6 meses, cerca de 12 horas a cerca de 5 meses, cerca de 12 horas a cerca de 4 meses, cerca de 12 horas a cerca de 3 meses, cerca de 12 horas a cerca de 2 meses, cerca de 12 horas a cerca de 1 mês, cerca de 12 horas a cerca de 2 semanas, cer- ca de 12 horas a cerca de | semana, cerca de 12 horas a cerca de 5 dias, cerca de 12 horas a cerca de 2 dias, cerca de 12 horas a cerca de 1 dia, cerca de 1 dia a cerca de 1 ano, cerca de 1 dia a cerca de 11 meses, cerca de 1 dia a cerca de 10 meses, cerca de 1 dia a cerca de 9 meses, cerca de 1 dia a cerca de 8 meses, cerca de 1 dia a cerca de 7 meses, cerca de 1 dia a cerca de 6 meses, cerca de 1 dia a cerca de meses, cerca de 1 dia a cerca de 4 meses, cerca de 1 dia a cerca de
3 meses, cerca de 1 dia a cerca de 2 meses, cerca de 1 dia a cerca de 1 mês, cerca de 1 dia a cerca de 2 semanas, cerca de 1 dia a cerca de 1 semana, cerca de 1 dia a cerca de 5 dias, cerca de 1 dia a cerca de 2 dias, cerca de 2 dias a cerca de 1 ano, cerca de 2 dias a cerca de 11 meses, cerca de 2 dias a cerca de 10 meses, cerca de 2 dias a cerca de 9 meses, cerca de 2 dias a cerca de 8 meses, cerca de 2 dias a cerca de 7 meses, cerca de 2 dias a cerca de 6 meses, cerca de 2 dias a cerca de 5 meses, cerca de 2 dias a cerca de 4 meses, cerca de 2 dias a cerca de 3 meses, cerca de 2 dias a cerca de 2 meses, cerca de 2 dias a cerca de 1 mês, cerca de 2 dias a cerca de 2 semanas, cerca de 2 dias a cerca de 1 semana, cerca de 2 dias a cerca de 5 dias, cer- ca de 5 dias a cerca de 1 ano, cerca de 5 dias a cerca de 11 meses, cerca de 5 dias a cerca de 10 meses, cerca de 5 dias a cerca de 9 meses, cerca de 5 dias a cerca de 8 meses, cerca de 5 dias a cerca de 7 meses, cerca de 5 dias a cerca de 6 meses, cerca de 5 dias a cerca de 5 meses, cerca de 5 dias a cerca de 4 meses, cerca de 5 dias a cerca de 3 meses, cerca de 5 dias a cerca de 2 meses, cerca de 5 dias a cerca de 1 mês, cerca de 5 dias a cerca de 2 semanas, cerca de 5 dias a cerca de 1 semana, cerca de | semana a cerca de 1 ano, cerca de 1 semana a cerca de 11 meses, cerca de | semana a cerca de 10 meses, cerca de | semana a cerca de 9 meses, cerca de | semana a cerca de 8 meses, cerca de | semana a cerca de 7 meses, cerca de 1 semana a cerca de 6 meses, cerca de | semana a cerca de 5 meses, cerca de 1 semana a cerca de 4 meses, cerca de | semana a cerca de 3 meses, cerca de | semana a cerca de 2 meses, cerca de | semana a cerca de 1 mês, cerca de | semana a cerca de 2 semanas, cerca de 2 semanas a cerca de 1 ano, cerca de 2 semanas a cerca de 11 me- ses, cerca de 2 semanas a cerca de 10 meses, cerca de 2 semanas a cerca de 9 meses, cerca de 2 semanas a cerca de 8 meses, cerca de 2 semanas a cerca de 7 meses, cerca de 2 semanas a cerca de 6 me-
ses, cerca de 2 semanas a cerca de 5 meses, cerca de 2 semanas a cerca de 4 meses, cerca de 2 semanas a cerca de 3 meses, cerca de 2 semanas a cerca de 2 meses, cerca de 2 semanas a cerca de 1 mês, cerca de 1 mês a cerca de 1 ano, cerca de 1 mês a cerca de 11 meses, cerca de 1 mês a cerca de 10 meses, cerca de 1 mês a cerca de 9 meses, cerca de 1 mês a cerca de 8 meses, cerca de 1 mês a cerca de 7 meses, cerca de 1 mês a cerca de 6 meses, cerca de 1 mês a cerca de 5 meses, cerca de 1 mês a cerca de 4 meses, cerca de 1 mês a cerca de 3 meses, cerca de 1 mês a cerca de 2 meses, cerca de 2 meses a cerca de 1 ano, cerca de 2 meses a cerca de 11 meses, cerca de 2 meses a cerca de 10 meses, cerca de 2 meses a cerca de 9 meses, cerca de 2 meses a cerca de 8 meses, cerca de 2 meses a cerca de 7 meses, cerca de 2 meses a cerca de 6 meses, cerca de 2 meses a cerca de 5 meses, cerca de 2 meses a cerca de 4 meses, cerca de 2 meses a cerca de 3 meses, cerca de 3 meses a cerca de 1 ano, cerca de 3 meses a cerca de 11 meses, cerca de 3 meses a cerca de 10 meses, cerca de 3 meses a cerca de 9 meses, cerca de 3 meses a cerca de 8 meses, cerca de 3 meses a cerca de 7 meses, cerca de 3 meses a cerca de 6 meses, cerca de 3 meses a cerca de 5 meses, cerca de 3 meses a cerca de 4 meses, cerca de 4 meses a cerca de 1 ano, cerca de 4 meses a cerca de 11 meses, cerca de 4 meses a cerca de 10 meses, cerca de 4 meses a cerca de 9 me- ses, cerca de 4 meses a cerca de 8 meses, cerca de 4 meses a cerca de 7 meses, cerca de 4 meses a cerca de 6 meses, cerca de 4 meses a cerca de 5 meses, cerca de 5 meses a cerca de 1 ano, cerca de 5 meses a cerca de 11 meses, cerca de 5 meses a cerca de 10 meses, cerca de 5 meses a cerca de 9 meses, cerca de 5 meses a cerca de 8 meses, cerca de 5 meses a cerca de 7 meses, cerca de 5 meses a cerca de 6 meses, cerca de 6 meses a cerca de 1 ano, cerca de 6 me- ses a cerca de 11 meses, cerca de 6 meses a cerca de 10 meses, cer-
ca de 6 meses a cerca de 9 meses, cerca de 6 meses a cerca de 8 meses, cerca de 6 meses a cerca de 7 meses, cerca de 7 meses a cerca de 1 ano, cerca de 7 meses a cerca de 11 meses, cerca de 7 meses a cerca de 10 meses, cerca de 7 meses a cerca de 9 meses, cerca de 7 meses a cerca de 8 meses, cerca de 8 meses a cerca de 1 ano, cerca de 8 meses a cerca de 11 meses, cerca de 8 meses a cerca de 10 meses, cerca de 8 meses a cerca de 9 meses, cerca de 9 me- ses a cerca de 1 ano, cerca de 9 meses a cerca de 11 meses, cerca de 9 meses a cerca de 10 meses, cerca de 10 meses a cerca de 1 ano, cerca de 10 meses a cerca de 11 meses ou cerca de 11 meses a cerca de 1 ano, por exemplo, em uma temperatura de cerca de 4ºC a cerca de 40ºC, cerca de 4ºC a cerca de 35ºC, cerca de 4ºC a cerca de 30ºC, cerca de 4ºC a cerca de 28ºC, cerca de 4ºC a cerca de 26ºC, cerca de 4ºC a cerca de 24ºC, cerca de 4ºC a cerca de 22ºC, cerca de 4ºC a cerca de 20ºC, cerca de 4ºC a cerca de 18ºC, cerca de 4ºC a cerca de 16ºC, cerca de 4ºC a cerca de 14ºC, cerca de 4ºC a cerca de 12ºC, cerca de 4ºC a cerca de 10ºC, cerca de 4ºC a cerca de 8ºC, cerca de 4ºC a cerca de 6ºC, cerca de 6ºC a cerca de 40ºC, cerca de 6º'C a cerca de 35ºC, cerca de 6ºC a cerca de 30ºC, cerca de 6ºC a cerca de 28ºC, cerca de 6ºC a cerca de 26ºC, cerca de 6ºC a cerca de 24ºC, cerca de 6ºC a cerca de 22ºC, cerca de 6ºC a cerca de 20ºC, cerca de 6ºC a cerca de 18ºC, cerca de 6ºC a cerca de 16ºC, cerca de 6ºC a cerca de 14ºC, cerca de 6ºC a cerca de 12ºC, cerca de 6ºC a cerca de 10ºC, cerca de 6ºC a cerca de 8ºC, cerca de 8ºC a cerca de 40ºC, cerca de 8ºC a cerca de 35ºC, cerca de 8ºC a cerca de 30ºC, cerca de 8ºC a cerca de 28ºC, cerca de 8ºC a cerca de 26ºC, cerca de 8ºC a cerca de 24ºC, cerca de 8ºC a cerca de 22ºC, cerca de 8ºC a cerca de 20ºC, cerca de 8ºC a cerca de 18ºC, cerca de 8ºC a cerca de 16ºC, cerca de 8ºC a cerca de 14ºC, cerca de 8ºC a cerca de 12ºC, cerca de 8ºC a cerca de 10ºC, cerca de 10ºC a cerca de 40ºC, cerca de 10ºC a cerca de 35ºC, cerca de 10ºC a cerca de 30ºC, cerca de 10ºC a cerca de 28ºC, cerca de 10ºC a cerca de 26ºC, cerca de 10ºC a cerca de 24ºC, cerca de 10ºC a cerca de 22ºC, cerca de 10ºC a cerca de 20ºC, cerca de 10ºC a cerca de 18ºC, cerca de 10ºC a cerca de 16ºC, cerca de 10ºC a cerca de 14ºC, cerca de 10ºC a cerca de 12ºC, cerca de 12ºC a cerca de 40ºC, cerca de 12ºC a cerca de 35ºC, cerca de 12ºC a cerca de 30ºC, cerca de 12ºC a cerca de 28ºC, cerca de 12ºC a cer- ca de 26ºC, cerca de 12ºC a cerca de 24ºC, cerca de 12ºC a cerca de 22ºC, cerca de 12ºC a cerca de 20ºC, cerca de 12ºC a cerca de 18ºC, cerca de 12ºC a cerca de 16ºC, cerca de 12ºC a cerca de 14ºC, cerca de 14ºC a cerca de 40ºC, cerca de 14ºC a cerca de 35ºC, cerca de 14ºC a cerca de 30ºC, cerca de 14ºC a cerca de 28ºC, cerca de 14ºC a cerca de 26ºC, cerca de 14ºC a cerca de 24ºC, cerca de 14ºC a cer- ca de 22ºC, cerca de 14ºC a cerca de 20ºC, cerca de 14ºC a cerca de 18ºC, cerca de 14ºC a cerca de 16ºC, cerca de 16ºC a cerca de 40ºC, cerca de 16ºC a cerca de 35ºC, cerca de 16ºC a cerca de 30ºC, cerca de 16ºC a cerca de 28ºC, cerca de 16ºC a cerca de 26ºC, cerca de 16ºC a cerca de 24ºC, cerca de 16ºC a cerca de 22ºC, cerca de 16ºC a cerca de 20ºC, cerca de 16ºC a cerca de 18ºC, cerca de 18ºC a cer- ca de 40ºC, cerca de 18ºC a cerca de 35ºC, cerca de 18ºC a cerca de 30ºC, cerca de 18ºC a cerca de 28ºC, cerca de 18ºC a cerca de 26ºC, cerca de 18ºC a cerca de 24ºC, cerca de 18ºC a cerca de 22ºC, cerca de 18ºC a cerca de 20ºC, cerca de 20ºC a cerca de 40ºC, cerca de 20ºC a cerca de 35ºC, cerca de 20ºC a cerca de 30ºC, cerca de 20ºC a cerca de 28ºC, cerca de 20ºC a cerca de 26ºC, cerca de 20ºC a cer- ca de 24ºC, cerca de 20ºC a cerca de 22ºC, cerca de 22ºC a cerca de 40ºC, cerca de 22ºC a cerca de 35ºC, cerca de 22ºC a cerca de 30ºC, cerca de 22ºC a cerca de 28ºC, cerca de 22ºC a cerca de 26ºC, cerca de 22ºC a cerca de 24ºC, cerca de 24ºC a cerca de 40ºC, cerca de 24ºC a cerca de 35ºC, cerca de 24ºC a cerca de 30ºC, cerca de 24ºC a cerca de 28ºC, cerca de 24ºC a cerca de 26ºC, cerca de 26ºC a cer- ca de 40ºC, cerca de 26ºC a cerca de 35ºC, cerca de 26ºC a cerca de 30ºC, cerca de 26ºC a cerca de 28ºC, cerca de 28ºC a cerca de 40ºC, cerca de 28ºC a cerca de 35ºC, cerca de 28ºC a cerca de 30ºC, cerca de 30ºC a cerca de 40ºC, cerca de 30ºC a cerca de 35ºC ou cerca de 35ºC a cerca de 40ºC.
[00169] Nos métodos descritos neste parágrafo, o nível de capaci- dade de ligação da resina cromatográfica tratada com irradiação gama produzida por meio destes métodos é maior do que o nível de capaci- dade de ligação de uma resina cromatográfica tratada com irradiação gama irradiada com uma ou ambas em uma taxa de mais de 6,1 kGy/hora e/ou em uma temperatura maior do que 25ºC.
[00170] Uma resina cromatográfica pode ser exposta à irradiação gama usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um isóto- po tal como Cobalto-60 ou Césio-137 pode ser usado como fonte de raios gama. A resina cromatográfica pode ser exposta à irradiação gama em uma temperatura de cerca de entre cerca de -25ºC e cerca de 0ºC, inclusive, ou entre cerca de 0ºC e cerca de 25ºC, inclusive. À resina cromatográfica pode ser exposta a uma dose de irradiação ga- ma de entre cerca de 0,1 kGy a cerca de 100 kGy, entre cerca de 1 kGy a cerca de 100 kGy, entre cerca de 1 kGy a cerca de 90 kGy, en- tre cerca de 1 kGy a cerca de 80 kGy, entre cerca de 1 kGy a cerca de 70 kGy, entre cerca de 1 kGy a cerca de 65 kGy, entre cerca de 5 kGy a cerca de 65 kGy, entre cerca de 10 kGy a cerca de 60 kGy, entre cerca de 10 kGy a cerca de 55 kGy, entre cerca de 10 kGy a cerca de 50 kGy, entre cerca de 10 kGy a cerca de 45 kGy, entre cerca de 10 kGy a cerca de 40 kGy, entre cerca de 10 kGy a cerca de 35 kGy, en- tre cerca de 10 kGy a cerca de 30 kGy, entre cerca de 15 kGy a cerca de 50 kGy, entre cerca de 15 kKGy a cerca de 45 kGy, entre cerca de 15 kGy a cerca de 40 kGy, entre cerca de 15 kGy a cerca de 35 kGy, en-
tre cerca de 20 kGy a cerca de 30 kGy ou entre cerca de 23 kGy a cerca de 27 kGy. A resina cromatográfica pode ser exposta à irradia- ção gama em uma dose suficiente para resultar em um nível de garan- tia de esterilidade da resina cromatográfica de cerca de ou menos de 1 x 10, cerca de ou menos de 1 x 10”, cerca de ou menos de 10 x 10º, cerca de ou menos de 1 x 10* ou cerca de ou menos de 1 x 10? ou entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 10?, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1x 108, entre 1 x 10 e cerca de 1 x 107, entre cerca de 1 x 107 e cer- ca de 1 x 10?, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 107 º cerca de 1 x 108, entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 10!?, entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º ou entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º.
[00171] Uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a bio- carga de uma resina cromatográfica pode ser determinada usando mé- todos conhecidos na técnica. Por exemplo, o nível de biocarga de uma resina cromatográfica tratada com uma dose de irradiação gama pode ser comparado com o nível de biocarga de uma resina cromatográfica não tratada (por exemplo, controle, não tratada com irradiação gama) e uma diminuição no nível de biocarga na resina cromatográfica trata- da com irradiação gama comparado com a resina cromatográfica não tratada indica que a dose de irradiação gama é suficiente para reduzir a biocarga de uma resina cromatográfica. Métodos exemplificativos para determinar o nível de biocarga em uma composição (por exem- plo, uma resina cromatográfica) são descritos no presente documento. Métodos adicionais para determinar o nível de biocarga em uma com- posição (por exemplo, uma resina cromatográfica) são conhecidos na técnica.
[00172] A resina cromatográfica em qualquer um destes métodos pode ser uma resina cromatográfica de troca aniônica, uma resina cromatográfica de troca catiônica, uma resina cromatográfica de ex- clusão por tamanho, uma resina cromatográfica de interação hidrofóbi- ca ou uma resina cromatográfica de afinidade ou qualquer combinação das mesmas. Exemplos não limitativos de uma resina cromatográfica de afinidade podem incluir uma proteína ou ligante peptídico (por exemplo, entre cerca de 5 aminoácidos a cerca de 100 aminoácidos, entre cerca de 5 aminoácidos a cerca de 90 aminoácidos, entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 80 aminoácidos ácidos, entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 70 aminoácidos, entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 60 aminoácidos, entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 50 aminoácidos, entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 40 aminoá- cidos, entre cerca de 5 aminoácidos ácidos e cerca de 30 aminoáci- dos, entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 25 aminoácidos ou entre cerca de 5 aminoácidos e cerca de 20 aminoácidos), um substrato de pequena molécula ou cofator enzimático, um aptâmero, um inibidor (por exemplo, inibidor competitivo de proteína) ou um metal. Em algu- mas modalidades, a resina cromatográfica de afinidade inclui um ligan- te de proteína (por exemplo, proteína A). Exemplos adicionais de resi- na cromatográfica de afinidade incluem um ligante de cofator, um li- gante de substrato, um ligante de metal, um ligante de produto ou um ligante de aptâmero. Em alguns exemplos, a resina cromatográfica é uma resina cromatográfica biomodal (por exemplo, resina cromatográ- fica de troca aniônica e resina cromatográfica de interação hidrofóbi- ca). A resina cromatográfica pode ser uma resina cromatográfica de troca aniônica (por exemplo, uma resina cromatográfica de troca aniô- nica que inclui grupos N-benzil-N-metil-etanolamina).
[00173] O recipiente que inclui uma resina cromatográfica pode ser um recipiente de plástico (por exemplo, um tubo cilíndrico, uma caixa selada ou lacrada ou um saco selado). Exemplos não limitativos de recipientes usados nestes métodos incluem um recipiente de armaze- namento ou uma coluna cromatográfica. Por exemplo, a composição que inclui (i) a resina cromatográfica e (ii) o líquido que inclui pelo me- nos um álcool (por exemplo, qualquer uma das composições exempli- ficativas descritas no presente documento) pode estar presente em um recipiente selado (por exemplo, uma suspensão em um recipiente se- lado ou uma resina cromatográfica empacotada em um recipiente se- lado (por exemplo, coluna cromatográfica)). Um recipiente usado nos métodos descritos no presente documento pode ser uma coluna cro- matográfica descartável. Em algumas modalidades, o recipiente usado nos métodos descritos no presente documento é uma coluna cromato- gráfica descartável colocada em uma embalagem de blíster. O recipi- ente (por exemplo, recipiente de armazenamento ou coluna cromato- gráfica) pode ter um volume total interno de entre cerca de 1 mL a cer- ca de 1 L (por exemplo, entre cerca de 1 mL e cerca de 900 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 800 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 700 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 600 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 500 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 450 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 400 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 350 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 300 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 250 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 200 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 150 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 100 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 75 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 50 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 1 mL e cer- ca de 30 mL ou entre cerca de 1 mL e cerca de 20 mL).
[00174] A composição que contém (i) uma resina cromatográfica e (ii) um líquido que inclui o pelo menos um álcool (por exemplo, qual- quer uma das composições exemplificativas descritas no presente do-
cumento) incluída no recipiente pode estar presente como uma mistura sólida molhada ou úmida. Por exemplo, o recipiente pode incluir uma suspensão de uma resina cromatográfica sedimentada no líquido. Em algumas modalidades, o recipiente pode incluir uma resina cromato- gráfica empacotada. Por exemplo, o recipiente que inclui a composi- ção que inclui (i) a resina cromatográfica e (ii) um líquido que inclui o pelo menos um álcool (por exemplo, qualquer uma das composições descritas no presente documento) é uma coluna cromatográfica empa- cotada (por exemplo, onde a resina é empacotada no líquido que inclui o pelo menos um álcool). Algumas modalidades incluem, antes da ex- posição, o descarte da composição que contém (i) a resina cromato- gráfica e (ii) o líquido que inclui o pelo menos um álcool (por exemplo, qualquer uma das composições descritas no presente documento) no recipiente.
[00175] Qualquer um dos álcoois, agentes antioxidantes e/ou que- lantes descritos no presente documento podem ser usados em qual- quer combinação, usando qualquer combinação das concentrações exemplificativas descritas no presente documento. Por exemplo, o lí- quido pode incluir pelo menos um álcool selecionado a partir do grupo de: álcool benzílico, ciclo-hexanol, álcool isobutílico, 2-metil-2-butanol, metanol, etanol, propan-2-ol, propan-1-ol, butano-1-ol, pentan-1-ol, he- xadecan-1-ol, 2-fenil etanol, sec-fenil etanol, 3-fenil-1-propanol, 1-fenil- 1-propanol, 2-fenil-1-propanol, 2-fenil-2-propanol, 1-fenil-2-butanol, 2- fenil-1-butanol, 3-fenil-1-butanol, 4-fenil-2-butanol, dl-1-fenil-2-penta- nol, 5-fenil-1-pentanol e 4-fenil-1-butanol. Em alguns exemplos, o lí- quido pode incluir ainda pelo menos um agente antioxidante (por exemplo, pelo menos um agente antioxidante selecionado a partir do grupo de glutationa reduzida, tiorredoxina reduzida, cisteína reduzida, um carotenoide, melatonina, licopeno, tocoferol, ubiquinona reduzida, ascorbato, bilirrubina, ácido úrico, ácido lipoico, um flavonoide, um áci-
do fenolpropanoide, lidocaína, naringenina, fulereno, glicose, manitol, 4-hidróxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxila e dimetilmetoxicromanol) e/ou pelo menos um quelante (por exemplo, pelo menos um quelante selecionado a partir do grupo de EDTA, DMPS, DMSA, metalotionina e desferroxamina).
[00176] Métodos exemplificativos para determinar/identificar a(s) quantidade(s) do pelo menos um álcool, o pelo menos um agente anti- oxidante e/ou o pelo menos um quelante suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica quando de tratamento com uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga da composição são descritos no presente documento. Méto- dos adicionais para determinar/identificar a(s) quantidade(s) do pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica quando de tratamento com uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga da composição são conhecidos na técnica.
[00177] Também é fornecida no presente documento uma resina cromatográfica com biocarga reduzida produzida por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento (por exemplo, uma resina cromatográfica com biocarga reduzida fornecida em um recipi- ente de armazenamento, por exemplo, um recipiente de armazena- mento selado). A resina cromatográfica com biocarga reduzida gerada usando qualquer um dos métodos descritos no presente documento pode ter um nível de garantia de esterilidade de cerca de ou menos de 1x 10%, cerca de ou menos de 1 x 10”, cerca de ou menos de 10 x 10 8 cerca de ou menos de 1 x 10? ou cerca de ou menos de 1 x 10? ou entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 10?, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 108, entre 1 x 10º e cerca de 1 x 107, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10?, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 107º, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 102, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º ou entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º. Uma resina cromatográfica com biocarga reduzida produzida por meio de qualquer um dos métodos descritos no presen- te documento pode ter uma capacidade de ligação que é de pelo me- nos 74 % (por exemplo, pelo menos 76 %, pelo menos 78 %, pelo me- nos 80 %, pelo menos 82 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %) ou entre cerca de 74 % e 95 %, entre cerca de 74 % e cerca de 95 %, entre cerca de 76 % e cerca de 95 %, pelo menos cerca de 78 % e cerca de 95 %, entre cerca de 80 % e cerca de 95 % ou entre cerca de 74 % e cerca de 90 %, entre cerca de 76 % e cerca de 90 %, entre cerca de 78 % e cerca de 90 % ou entre cerca de 80 % e cerca de 90 % da capacidade de ligação da mesma resina cromatográfica que não foi tratada para reduzir sua biocarga (por exemplo, não foi tratada com irradiação ga- ma), quando a mesma proteína é usada para testar a capacidade de ligação de ambas as resinas cromatográficas produzidas por meio dos métodos descritos no presente documento e a resina cromatográfica não tratada de controle.
Métodos de Produção de Uma Coluna cromatográfica Empacota- da com Biocarga Reduzida
[00178] Também são fornecidos no presente documento métodos para produzir uma coluna cromatográfica empacotada que inclui o for- necimento de uma resina cromatográfica com biocarga reduzida pro-
duzida por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento e empacotar a resina cromatográfica em uma coluna com biocarga reduzida em um ambiente asséptico ou com biocarga reduzi- da. Em algumas modalidades, uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida pode ser produzida ao expor uma coluna que inclui uma resina cromatográfica empacotada e um líquido que inclui pelo menos um álcool (por exemplo, qualquer um dos líquidos exem- plificativos descritos no presente documento, por exemplo, que inclui opcionalmente ainda pelo menos um antioxidante e/ou quelante) a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga da co- luna e da resina cromatográfica empacotada, onde o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica empacotada quando de exposição à dose de irradiação gama.
[00179] Também são fornecidas colunas cromatográficas empaco- tadas com biocarga reduzida produzidas por meio dos métodos descri- tos no presente documento. Qualquer uma das colunas cromatográfi- cas empacotadas com biocarga reduzida produzida por meio dos mé- todos descritos no presente documento pode ter um nível de garantia de esterilidade de cerca de ou menos de 1 x 10, cerca de ou menos de 1 x 107, cerca de ou menos de 10 x 108, cerca de ou menos de 1 x ou cerca de ou menos de 1 x 10? ou entre cerca de 1 x 10% e cerca de 1 x 10?, entre cerca de 1 x 10º º cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 107º, entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 10º, entre 1 x 108 e cerca de 1 x 107, entre cerca de 1 x 107 º cerca de 1 x 10?, entre cer- ca de 1 x 107 º cerca de 1 x 10), entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 107º, entre cerca de 1 x 107 e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10 7 e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10?, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º ou entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 10º. Qualquer uma das colunas cromatográficas empacotadas com biocarga reduzi- da produzida por meio dos métodos descritos no presente documento pode conter pelo menos uma resina cromatográfica selecionada a par- tir do grupo de: resina cromatográfica de troca aniônica, resina croma- tográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade (por exemplo, qualquer uma das resinas cromatográficas descritas no pre- sente documento ou conhecidas na técnica), resina cromatográfica de interação hidrofílica e resina cromatográfica de exclusão por tamanho. Por exemplo, qualquer uma das colunas cromatográficas com biocarga reduzida descritas no presente documento pode incluir uma resina cromatográfica de afinidade que inclui um ligante de proteína (por exemplo, proteína A). Uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida no presente documento descrita pode incluir uma resina cromatográfica de troca aniônica (por exemplo, uma resina cromatográfica de troca aniônica que inclui grupos N-benzil-N-metil- etanolamina). Métodos para Realizar Cromatografia com Biocarga Reduzida
[00180] Os métodos descritos no presente documento incluem o uso de uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida fornecida no presente documento e os processos descritos no presen- te documento incluem o uso de um ou dois MCCSs que incluem pelo menos uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida fornecida no presente documento. A resina cromatográfica com irradi- ação gama pode ser qualquer tipo de resina descrito no presente do- cumento (ou qualquer tipo de resina cromatográfica conhecido na téc- nica).
[00181] A coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzi- da pode ser preparada usando qualquer um dos métodos descritos no presente documento. Por exemplo, a coluna cromatográfica empaco-
tada com biocarga reduzida pode ser produzida ao empacotar uma coluna cromatográfica com uma composição que inclui (uma) resina(s) de cromatografia e um líquido que inclui pelo menos um álcool (por exemplo, qualquer uma das composições descritas no presente docu- mento) e expor a coluna empacotada à irradiação gama (por exemplo, usando qualquer uma das exposições e condições descritas no pre- sente documento). Em outros exemplos, a coluna cromatográfica em- pacotada com biocarga reduzida pode ser produzida ao expor um re- cipiente que inclui uma resina cromatográfica e um líquido que inclui pelo menos um álcool (por exemplo, qualquer um dos líquidos exem- plificativos descritos no presente documento, por exemplo, que inclui opcionalmente ainda pelo menos um agente antioxidante e/ou pelo menos um quelante) a uma dose de irradiação gama e empacotar uma coluna cromatográfica com a resina cromatográfica com biocarga re- duzida resultante.
Em tais métodos, a resina cromatográfica (presente no recipiente durante exposição à irradiação gama) pode estar presen- te como uma suspensão no recipiente e a coluna cromatográfica é empacotada em uma cobertura com biocarga reduzida.
Em outros mé- todos, a resina cromatográfica presente no recipiente com o líquido que inclui pelo menos álcool (por exemplo, qualquer um dos líquidos descritos no presente documento, por exemplo, que inclui opcional- mente ainda pelo menos um agente antioxidante e/ou pelo menos um quelante) pode ser exposta à irradiação gama como uma mistura sóli- da molhada ou úmida no recipiente e uma suspensão da resina croma- tográfica com biocarga reduzida resultante pode ser preparada usando um tampão com biocarga reduzida (por exemplo, preparada em uma cobertura com biocarga reduzida) e a suspensão resultante usada pa- ra empacotar uma coluna cromatográfica em uma cobertura com bio- carga reduzida.
Em alguns destes exemplos, a coluna cromatográfica, antes de empacotamento, pode ser tratada para reduzir a biocarga
(por exemplo, autoclavada, com irradiação gama ou exposição a óxido de etileno).
[00182] A coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzi- da usada em qualquer um dos métodos descritos no presente docu- mento pode ter um nível de garantia de esterilidade (SAL) de entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10?, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 102, entre 1 x 10º e cerca de 1 x 10), entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º ou entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10, inclusive. Tampões com Biocarga Reduzida
[00183] Os métodos e processos descritos no presente documento podem ser realizados usando um ou mais tampões com biocarga re- duzida. Conforme será reconhecido na técnica, um tampão com bio- carga reduzida pode ser qualquer tipo de tampão usado em um ciclo de cromatografia (por exemplo, um tampão usado em qualquer uma das etapas de um ciclo de cromatografia ou em qualquer uma das operações unitárias descritas no presente documento). Métodos exem- plificativos para reduzir a biocarga de um tampão incluem filtração (fil- tração com tamanho de poro de 0,2 um), autoclavagem e irradiação gama. Métodos adicionais para reduzir a biocarga de um tampão são conhecidos na técnica. Um tampão com biocarga reduzida pode ter um nível de garantia de esterilidade de entre cerca de 1 x 10º º cerca de 1 x 102, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 102, entre 1 x 105 e cerca de 1 x 10, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10º e cerca de 1 x 10º, entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1x 10º ou entre cerca de 1 x 10 e cerca de 1 x 10, inclusive. Proteínas Terapêuticas Recombinantes
[00184] Uma proteína recombinante conforme descrita no presente documento pode ser uma proteína terapêutica recombinante. Exem-
plos não limitativos de proteínas terapêuticas recombinantes que po- dem ser produzidas por meio dos métodos fornecidos no presente do- cumento incluem imunoglobulinas (incluindo imunoglobulinas de ca- deia leve e pesada, anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, qualquer um dos fragmentos de anticorpos descritos no pre- sente documento), enzimas (por exemplo, uma galactosidase (por exemplo, uma alfa-galactosidase), Myozyme& ou CerezymeO), proteí- nas (por exemplo, eritropoietina humana, fator de necrose tumoral (TNF) ou um interferon alfa ou beta) ou proteínas imunogênicas ou an- tigênicas ou fragmentos de proteínas (por exemplo, proteínas para uso em uma vacina). A proteína terapêutica recombinante pode ser um po- lipeptídeo de ligação a antígeno manipulado que inclui pelo menos um esqueleto de proteína recombinante multifuncional (consulte, por exemplo, as proteínas de ligação a antígeno recombinante descritas em Gebauer et al., Current Opin.
Chem.
Biol. 13: 245-255, 2009; e Pu- blicação de Pedido de Patente US Nº 2012/0164066 (incorporado ao presente documento a título de referência na íntegra)). Exemplos não limitativos de proteínas terapêuticas recombinantes que são anticorpos incluem: panitumumabe, omalizumabe, abeagovomabe, abeciximabe, actoxumabe, adalimumabe, adecatumumabe, afelimomabe, afutuzu- mabe, alacizumabe, alacizumabe, alemtuzumabe, alirocumabe, altu- momabe, amatuximabe, anatumomabe, apolizumabe, atinumabe, toci- lizumabe, basilizimabe, bectumomabe, belimumabe, bevacizumabe, biciromabe, canakinumabe, cetuximabe, daclizumabe, densumabe, eculizumabe, edrecolomabe, efalizumabe, efungumabe, ertumaxoma- be, etaracizumabe, golimumabe, infliximabe, natalizumabe, palivizu- mabe, panitumumabe, pertuzumabe, ranibizumabe, rituximabe, tocili- zumabe e trastuzumabe.
Exemplos adicionais de anticorpos terapêuti- cos recombinantes que podem ser produzidos por meio dos métodos descritos no presente documento são conhecidos na técnica.
Exem-
plos não limitativos adicionais de proteínas terapêuticas recombinantes que podem ser produzidas/purificadas por meio dos presentes méto- dos incluem: glucosidase alfa, laronidase, abatacepte, galsulfase, lu- tropina alfa, fator anti-hemofílico, agalsidase beta, interferon beta-1a, darbepoetina alfa, tenecteplase, etanercepte, fator de coagulação IX, hormônio estimulante de folículo, interferon beta-1a, imiglucerase, dor- nase alfa, epoetina alfa e alteplase.
[00185] Uma proteína terapêutica recombinante secretada solúvel pode ser recuperada do meio de cultura líquido (por exemplo, um pri- meiro e/ou segundo meio de cultura líquido) ao remover ou separar fisicamente o meio de cultura líquido das células (por exemplo, células de mamíferos). Uma variedade de diferentes métodos para remover meio de cultura líquido de células (por exemplo, células de mamíferos) são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, centrifugação, filtra- ção, pipetagem e/ou aspiração. A proteína terapêutica recombinante secretada pode, então, ser recuperada e posteriormente purificada do meio de cultura líquido usando uma variedade de técnicas bioquími- cas, incluindo vários tipos de cromatografia (por exemplo, cromatogra- fia de afinidade, cromatografia com peneiras moleculares, cromatogra- fia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica ou cromatografia de interação hidrofóbica ou qualquer combinação dos mesmos) e/ou filtração (por exemplo, filtração por corte de peso molecular). Ciclo de Cromatografia
[00186] Conforme é bem conhecido na técnica, as etapas em um ciclo de cromatografia podem diferir dependendo da resina cromato- gráfica, dos tampões usados para realizar cada etapa do ciclo e das características biofísicas da proteína recombinante alvo (por exemplo, proteína terapêutica recombinante) Por exemplo, uma coluna croma- tográfica de afinidade pode incluir as etapas de carregar uma coluna cromatográfica de afinidade com um fluido que inclui a proteína re-
combinante alvo, lavar a coluna para remover material biológico inde- sejado (por exemplo, proteínas e/ou pequenas moléculas contaminan- tes), eluir a proteína recombinante alvo ligada à coluna e reequilibrar a coluna. Um ciclo de cromatografia usando uma coluna cromatográfica de troca catiônica e/ou aniônica, em que a proteína recombinante alvo se liga à resina cromatográfica na etapa de carregamento, pode incluir as etapas de carregar a coluna com um fluido que inclui a proteína al- vo, lavar a coluna para remover material biológico indesejado, eluir a proteína recombinante alvo ligada à coluna e reequilibrar a coluna. Em outros exemplos, um ciclo de cromatografia que usa uma coluna cro- matográfica de troca catiônica e/ou aniônica, onde o material biológico indesejado se liga à resina cromatográfica durante a etapa de carre- gamento, enquanto que a proteína recombinante alvo não, pode incluir as etapas de carregar a coluna com um fluido que inclui a proteína al- vo, coletar a proteína recombinante alvo no fluxo passante e reequili- brar a coluna. Conforme é bem conhecido na técnica, qualquer uma das etapas individuais em um ciclo de cromatografia pode incluir um único tampão ou múltiplos tampões (por exemplo, dois ou mais tam- pões) e uma ou mais de qualquer uma das etapas individuais em um ciclo de cromatografia pode incluir um gradiente de tampão. Qualquer combinação de vários aspectos bem conhecidos de um único ciclo de cromatografia pode ser usada nestes métodos em qualquer combina- ção, por exemplo, resina(s) de cromatografia diferente(s), vazão(ões), tampão(ões), volume(s) de vazio da coluna, volume(s) do leito da co- luna, volume(s) de tampão usado em cada etapa, volume(s) de fluido, incluindo a proteína alvo e o número e tipos de tampão(ões) usados em cada etapa.
Métodos para Realizar Cromatografia em Coluna com Biocarga Reduzida
[00187] São fornecidos no presente documento métodos para reali-
zar cromatografia com biocarga reduzida. Estes métodos incluem for- necer uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida produzida usando qualquer um dos métodos descritos no presente do- cumento e realizar uma cromatografia em coluna usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida. A coluna croma- tográfica empacotada com biocarga reduzida pode incluir pelo menos uma de qualquer uma das resinas cromatográficas descritas no pre- sente documento, em qualquer combinação. Por exemplo, a resina cromatográfica presente na coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida pode ser uma resina de afinidade que inclui um |i- gante de proteína (por exemplo, proteína A) ou pode incluir uma resina cromatográfica de troca aniônica. A coluna cromatográfica empacota- da com biocarga reduzida pode ter qualquer um dos volumes internos exemplificativos descritos no presente documento. A coluna cromato- gráfica empacotada com biocarga reduzida pode ter qualquer formato (por exemplo, um formato cilíndrico, um formato quase cilíndrico ou um formato elipsoidal) descrita no presente documento ou conhecida na técnica. A cromatografia em coluna realizada nestes métodos pode ser usada para purificar ou isolar uma proteína recombinante (por exem- plo, qualquer uma das proteínas terapêuticas recombinantes descritas no presente documento ou conhecidas na técnica). Em alguns exem- plos, a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida faz parte de um sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS), por exemplo, pode ser parte de um sistema de cromatografia contra- corrente periódica (PCCS).
[00188] A cromatografia em coluna realizada pode incluir pelo me- nos um ciclo de cromatografia descrito no presente documento ou co- nhecido na técnica. Por exemplo, o pelo menos um ciclo de cromato- grafia pode incluir as etapas de: capturar a proteína recombinante ao expor a resina cromatográfica a um líquido que inclui uma proteína re-
combinante; lavar a resina cromatográfica ao expor a resina cromato- gráfica a um tampão de lavagem, eluir a proteína recombinante ao ex- por a resina cromatográfica a um tampão de eluição; e regenerar a re- sina cromatográfica ao expor a resina cromatográfica a um tampão de regeneração. Em alguns exemplos, o líquido que inclui a proteína re- combinante é um meio de cultura líquido (por exemplo, um meio de cultura líquido coletado de uma perfusão ou cultura descontínua) ou um meio de cultura líquido diluído (por exemplo, um meio de cultura diluído em tampão).
[00189] A cromatografia em coluna pode ser realizada usando um sistema fechado e integrado (por exemplo, qualquer um dos sistemas fechados e integrados exemplificativos descritos no presente docu- mento ou conhecidos na técnica). Por exemplo, a cromatografia em coluna pode ser realizada usando um sistema fechado e integrado, onde o tampão é tampão com biocarga reduzida. Conforme é bem co- nhecido na técnica, o tampão com biocarga reduzida pode ser produ- zido usando uma variedade de diferentes métodos (por exemplo, pre- parado por meio de filtração, autoclavagem ou tratamento térmico).
[00190] A cromatografia em coluna pode incluir dois ou mais (por exemplo, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, 45 ou mais, 50 ou mais, 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais, 95 ou mais ou 100 ou mais) ciclos de cromatografia. Em alguns exem- plos, a cromatografia em coluna é realizada continuamente ao longo de um período de pelo menos 3 dias (por exemplo, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 13 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 16 dias, pelo menos 17 dias, pelo menos 18 dias, pelo menos 19 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 21 dias, pelo menos 22 dias, pelo menos 23 dias, pelo menos 24 dias, pelo menos 25 dias, pelo menos 30 dias, pelo menos 35 dias, pelo menos 40 dias, pelo menos 45 dias, pelo menos 50 dias, pelo menos 55 dias, pelo menos 60 dias, pelo menos 65 dias, pelo menos 70 dias, pelo menos 75 dias, pelo menos 80 dias, pelo menos 85 dias, pelo menos 90 dias, pelo menos 95 dias ou pelo menos 100 dias).
[00191] Em algumas modalidades, a resina cromatográfica na colu- na cromatográfica empacotada com biocarga reduzida possui uma ca- pacidade de ligação percentual entre cerca de 75 % a cerca de 100 % (por exemplo, entre cerca de 76 % e cerca de 98 %, entre cerca de 76 % e cerca de 96 %, entre cerca de 76 % e cerca de 94 %, entre cerca de 76 % e cerca de 92 %, entre cerca de 76 % e cerca de 90 %, entre cerca de 78 % e cerca de 100 %, entre cerca de 78 % e cerca de 98 %, entre cerca de 78 % e cerca de 96 %, entre cerca de 78 % e cerca de 94 %, entre cerca de 78 % e cerca de 92 %, entre cerca de 78 % e cerca de 90 %, entre cerca de 80 % e cerca de 100 %, entre cerca de 80 % e cerca de 98 %, entre cerca de 80 % e cerca de 96 %, entre cerca de 80 % e cerca de 94 %, entre cerca de 80 % e cerca de 92 %, entre cerca de 80 % e cerca de 90 %, entre cerca de 82 % e cerca de 100 %, entre cerca de 82 % e cerca de 98 %, entre cerca de 82 % e cerca de 96 %, entre cerca de 82 % e cerca de 94 %, entre cerca de 82 % e cerca de 92 %, entre cerca de 82 % e cerca de 90 %, entre cerca de 84 % e cerca de 100 %, entre cerca de 84 % e cerca de 98 %, entre cerca de 84 % e cerca de 96 %, entre cerca de 84 % e cerca de 94 %, entre cerca de 84 % e cerca de 92 %, entre cerca de 84 % e cerca de 90 %, entre cerca de 86 % e cerca de 100 %, entre cerca de 86 % e cerca de 98 %, entre cerca de 86 % e cerca de 96 %, entre cerca de 86 % e cerca de 94 %, entre cerca de 86 % e cerca de 92 %,
entre cerca de 88 % e cerca de 100 %, entre cerca de 88 % e cerca de 98 %, entre cerca de 88 % e cerca de 96 %, entre cerca de 88 % e cerca de 94 %, entre cerca de 90 % e cerca de 100 %, entre cerca de 90 % e cerca de 98 %, entre cerca de 90 % e cerca de 96 %, entre cerca de 92 % e cerca de 100 % ou entre cerca de 92 % e cerca de 98 %) comparado com a mesma resina não tratada com irradiação gama (quando a mesma proteína é usada para testar a capacidade de liga- ção de ambas as resinas) (por exemplo, avaliado imediatamente após exposição à irradiação gama). Processos Integrados, Fechados ou Substancialmente Fechados e Contínuos Para a Produção de uma Proteína Recombinante
[00192] São fornecidos no presente documento processos integra- dos, fechados ou substancialmente fechados e contínuos para a pro- dução de uma proteína recombinante purificada (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante). Estes processos incluem fornecer um meio de cultura líquido que inclui uma proteína recombinante (por exemplo, uma proteína terapêutica recombinante) que é substancial- mente isento de células.
[00193] — Alguns processos incluem alimentar continuamente o meio de cultura líquido em um sistema de cromatografia com múltiplas colu- nas (MCCS) que inclui pelo menos uma coluna cromatográfica empa- cotada com biocarga reduzida fornecida no presente documento, onde estes processos usam um tampão com biocarga reduzida, são inte- grados e executados continuamente desde o meio de cultura líquido até um eluato proveniente do MCCS que é a proteína recombinante purificada (por exemplo, uma substância medicamentosa de proteína terapêutica).
[00194] — Alguns processos incluem alimentar continuamente o meio de cultura líquido em um primeiro MCCS (MCCS1), capturar a proteína recombinante a partir do meio de cultura líquido usando o MCCS1,
produzir um eluato proveniente do MCCS1 que inclui a proteína re- combinante e alimentar continuamente o eluato a um segundo MCCS (MCCS?2) e alimentar continuamente a proteína recombinante proveni- ente do eluato ao MCCS2 e, subsequentemente, eluir a proteína re- combinante para, deste modo, produzir a proteína recombinante purifi- cada, onde pelo menos uma coluna no MCCS1 e/ou no MCCS?2 é uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida fornecida no presente documento, os processos usam um tampão com biocarga reduzida, são integrados e funcionam continuamente desde o meio de cultura líquido até a proteína recombinante purificada.
[00195] Em alguns exemplos, cada uma das colunas cromatográfi- cas usadas no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 é uma coluna cromato- gráfica empacotada com biocarga reduzida no presente documento fornecida. Algumas modalidades incluem ainda uma etapa de formular a proteína recombinante purificada em uma composição farmacêutica.
[00196] Os processos descritos no presente documento permitem a produção contínua e eficiente, em termos de tempo, de uma proteína recombinante purificada a partir de um meio de cultura líquido que in- clui a proteína recombinante. Por exemplo, o tempo decorrido entre a alimentação de um meio de cultura líquido que inclui uma proteína te- rapêutica no MCCS ou MCCS1 e a eluição da proteína recombinante a partir do MCCS ou MCCS?, respectivamente, pode ser, por exemplo, entre cerca de 4 horas e cerca de 48 horas, inclusive, por exemplo, entre cerca de 4 horas e cerca de 40 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 35 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 30 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 28 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 26 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 24 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 22 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 20 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 18 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 16 horas, entre cerca de 4 horas e cerca de 14 horas,
entre cerca de 4 horas e cerca de 12 horas, entre cerca de 6 horas e cerca de 12 horas, entre cerca de 8 horas e cerca de 12 horas, entre cerca de 6 horas e cerca de 20 horas, entre cerca de 6 horas e cerca de 18 horas, entre cerca de 6 horas e cerca de 14 horas, entre cerca de 8 horas e cerca de 16 horas, entre cerca de 8 horas e cerca de 14 horas, entre cerca de 8 horas e cerca de 12 horas, entre cerca de 10 horas e 20 horas, entre cerca de 10 horas e 18 horas, entre cerca de horas e 16 horas, entre cerca de 10 horas e 14 horas, entre cerca de 12 horas e cerca de 14 horas, entre cerca de 10 horas e cerca de 40 horas, entre cerca de 10 horas e cerca de 35 horas, entre cerca de 10 horas e cerca de 30 horas, entre cerca de 10 horas e cerca de 25 horas, entre cerca de 15 horas e cerca de 40 horas, entre cerca de 15 horas e cerca de 35 horas, entre cerca de 15 horas e cerca de 30 ho- ras, entre cerca de 20 horas e cerca de 40 horas, entre cerca de 20 horas e cerca de 35 horas ou entre cerca de 20 horas e cerca de 30 horas, inclusive.
Em outros exemplos, o tempo decorrido entre a ali- mentação do meio de cultura líquido que inclui a proteína recombinan- te no MCCS ou MCCS1 e eluição da proteína recombinante a partir do MCCS ou MCCS?, respectivamente, é, por exemplo, mais de cerca de 4 horas e menos de cerca de 40 horas, inclusive, por exemplo, mais de cerca de 4 horas e menos de cerca de 39 horas, cerca de 38 horas, cerca de 37 horas, cerca de 36 horas, cerca de 35 horas, cerca de 34 horas, cerca de 33 horas, cerca de 32 horas, cerca de 31 horas, cerca de 30 horas, cerca de 29 horas, cerca de 28 horas, cerca de 27 horas, cerca de 26 horas, cerca de 25 horas, cerca de 24 horas, cerca de 23 horas, cerca de 22 horas, cerca de 21 horas, cerca de 20 horas, cerca de 19 horas, cerca de 18 horas, cerca de 17 horas, cerca de 16 horas, cerca de 15 horas, cerca de 14 horas, cerca de 13 horas, cerca de 12 horas, cerca de 11 horas, cerca de 10 horas, cerca de 9 horas, cerca de 8 horas, cerca de 7 horas, cerca de 6 horas, cerca de 5 horas ou cerca de 4,5 horas, inclusive.
[00197] Aspectos não limitativos dos MCCSs que podem ser usa- dos em qualquer um destes processos (MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) são descritos nos Pedidos de Patente Provisórios Norte-Americanos Nº de série 61/775.060 e 61/856.390 (cada um incorporado ao presen- te documento a título de referência).
[00198] Alguns processos exemplificativos não usam uma etapa de retenção (por exemplo, não usam um reservatório (por exemplo, tan- que de fragmentação) (break tank) em todo o processo. Outros podem usar um máximo de 1, 2, 3, 4 ou 5 reservatório(s) (por exemplo, tan- que(s) de fragmentação) em todo o processo. Qualquer um dos pro- cessos descritos no presente documento pode usar um máximo de 1, 2, 3, 4 ou 5 reservatório(s) (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) em todo o processo, em que cada tanque de fragmentação contém apenas uma proteína recombinante durante um período de tempo to- tal, por exemplo, de entre cerca de 5 minutos e menos de cerca de 6 horas, inclusive, por exemplo, entre cerca de 5 minutos e cerca de 5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas, cerca de 1 hora ou cerca de 30 minutos, inclusive.
[00199] — Alguns processos usam um, dois, três, quatro, cinco ou seis reservatório(s) (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) e podem ter uma capacidade que está, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 300 mL, inclusive, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 280 mL, cerca de 260 mL, cerca de 240 mL, cerca de 220 mL, cerca de 200 mL, cerca de 180 mL, cerca de 160 mL, cerca de 140 mL, cerca de 120 mL, cer- ca de 100 mL, cerca de 80 mL, cerca de 60 mL, cerca de 40 mL, cerca de 20 mL ou cerca de 10 mL (inclusive). Qualquer reservatório (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) usado (em qualquer um dos processos descritos no presente documento) para reter fluido antes de ser alimentado ao MCCS ou MCCS1 pode ter uma capacidade que está, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100 %, inclusive, por exem- plo, entre 1 mL e cerca de 90 %, cerca de 80 %, cerca de 70 %, cerca de 60 %, cerca de 50 %, cerca de 40 %, cerca de 30 %, cerca de 20 %, cerca de 10 % ou cerca de 5 %, inclusive, do volume de carrega- mento da primeira coluna do MCCS ou MCCS1. (Um) reservatório(s) (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) pode(m) ser usado(s) para reter o eluato proveniente do MCCS1 antes de entrar no MCCS?2 e po- de(m) ter uma capacidade que está, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100 %, inclusive, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 90 %, cerca de 80 %, cerca de 70 %, cerca de 60 %, cerca de 50 %, cerca de 40 %, cerca de 30 %, cerca de 20 %, cerca de 10 % ou cerca de 5 %, in- clusive, do carregamento volume da primeira coluna do MCCS2.
[00200] Vários aspectos adicionais destes processos são descritos em detalhes abaixo e podem ser usados em qualquer combinação nos processos fornecidos no presente documento, sem limitação. Aspectos exemplificativos dos processos fornecidos são descritos abaixo; no entanto, aqueles versados na técnica reconhecerão que etapas adici- onais podem ser adicionadas aos processos descritos no presente do- cumento e outros materiais podem ser usados para realizar qualquer uma das etapas dos processos descritos no presente documento. Meio de Cultura Líquido
[00201] O meio de cultura líquido que inclui uma proteína recombi- nante (por exemplo, proteína terapêutica recombinante) que é subs- tancialmente isento de células pode ser derivado de qualquer fonte. Por exemplo, o meio de cultura líquido pode ser obtido a partir de uma cultura de células recombinantes (por exemplo, uma cultura de células recombinantes de bactérias, leveduras ou mamíferos). O meio de cul- tura líquido pode ser obtido a partir de uma cultura de células alimen- tada de modo descontínuo (por exemplo, células de mamífero) (por exemplo, um biorreator de alimentação descontínua que inclui uma cultura de células de mamíferos que secretam a proteína recombinan- te) ou uma cultura de célula de perfusão (por exemplo, célula de ma- mífero) (por exemplo, um biorreator de perfusão que inclui uma cultura de células de mamíferos que secretam a proteína recombinante). O meio de cultura líquido também pode ser um meio de cultura líquido clarificado a partir de uma cultura de células bacterianas ou de levedu- ra que secretam a proteína recombinante.
[00202] O meio de cultura líquido obtido a partir de uma cultura de células recombinantes pode ser filtrado ou clarificado para se obter um meio de cultura líquido que é substancialmente isento de células e/ou vírus. Métodos para filtrar ou clarificar um meio de cultura líquido a fim de remover células são conhecidos na técnica (por exemplo, filtração em um filtro de 0,2 um e filtração usando um sistema de Fluxo Tan- gencial Alternado (ATFTY)). As células recombinantes também podem ser removidas do meio de cultura líquido usando centrifugação e re- mover o sobrenadante que é o meio de cultura líquido substancialmen- te isento de células ou permitir que as células se acomodem no fundo gravitacional de um recipiente (por exemplo, biorreator) que inclui o líquido meio de cultura e remover o meio de cultura líquido (o meio de cultura líquido que é substancialmente isento de células) que está dis- tante das células recombinantes sedimentadas.
[00203] O meio de cultura líquido pode ser obtido a partir de uma cultura de células recombinantes (por exemplo, células recombinantes de bactérias, leveduras ou mamífero) que produz qualquer uma das proteínas recombinantes (por exemplo, proteínas terapêuticas recom- binantes) descritas no presente documento ou conhecidas na técnica. Alguns exemplos de qualquer um dos processos descritos no presente documento pode incluir ainda uma etapa de cultura de células recom- binantes (por exemplo, células recombinantes de bactérias, leveduras ou mamífero) que produzem a proteína recombinante (por exemplo,
proteína terapêutica recombinante).
[00204] O meio de cultura líquido pode ser qualquer um dos tipos de meio de cultura líquido descritos no presente documento ou conhe- cidos na técnica. Por exemplo, o meio de cultura líquido pode ser sele- cionado a partir do grupo de: um meio de cultura líquido isento de componentes de origem animal, um meio de cultura líquido isento de soro, um meio de cultura líquido que contém soro, um meio de cultura líquido quimicamente definido e um meio de cultura líquido isento de proteínas. Em qualquer um dos processos descritos no presente do- cumento, um meio de cultura líquido obtido a partir de uma cultura po- de ser diluído mediante a adição de um segundo fluido (por exemplo, um tampão) antes de ser alimentado ao MCCS ou MCCS1.
[00205] O meio de cultura líquido que inclui uma proteína recombi- nante que é substancialmente isenta de células pode ser armazenado (por exemplo, em uma temperatura abaixo de cerca de 15ºC (por exemplo, abaixo de cerca de 10ºC, abaixo de cerca de 4ºC, abaixo de cerca de 0ºC, abaixo de cerca de -20ºC, abaixo de cerca de -50ºC, abaixo de cerca de -70ºC ou abaixo de cerca de -80ºC) durante pelo menos 1 dia (por exemplo, pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 20 dias ou pelo menos cerca de 30 dias) antes de alimentar o meio de cultura líquido ao MCCS ou MCCS1. Al- ternativamente, em alguns exemplos, o meio de cultura líquido é ali- mentado ao MCCS ou MCCS1 diretamente a partir de um biorreator (por exemplo, alimentado ao MCCS ou MCCS1 diretamente a partir do biorreator após uma etapa de filtração ou clarificação). Sistemas de Cromatografia Com Múltiplas Colunas
[00206] Os processos descritos no presente documento incluem o uso de um MCCS ou dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) sistemas de cromatografia com múltiplas colunas
(MCCSs) (por exemplo, um MCCS1 e MCCS2). Um MCCS pode incluir duas ou mais colunas cromatográficas, duas ou mais membranas cromatográficas ou uma combinação de pelo menos uma coluna cro- matográfica e pelo menos uma membrana cromatográfica.
Em exem- plos não limitativos, um MCCS (por exemplo, MCCS, MCCS1 e/ou MCCS?2 em qualquer um dos processos no presente documento) pode incluir quatro colunas cromatográficas, três colunas cromatográficas e uma membrana cromatográfica, três colunas cromatográficas, duas colunas cromatográficas, duas colunas cromatográficas membranas e duas colunas cromatográficas e uma membrana cromatográfica.
Exemplos adicionais de combinações de colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas podem ser considerados para uso em um MCCS (por exemplo, MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos no presente documento) por aqueles versa- dos na técnica, sem limitação.
As colunas cromatográficas e/ou mem- branas cromatográficas individuais presentes em um MCCS podem ser idênticas (por exemplo, ter o mesmo formato, volume, resina, me- canismo de captura e operação unitária) ou podem ser diferentes (por exemplo, ter um ou mais de um formato, volume, resina, mecanismo de captura e/ou operação da unidade diferentes). A(s) coluna(s) de cromatografia e/ou membrana(s) cromatográfica(s) individual(is) pre- sente(s) em um MCCS (por exemplo, MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos no presente documento) podem realizar a mesma operação unitária (por exemplo, a operação unitária de captura, purificação ou refino) ou diferentes operações unitárias (por exemplo, diferentes operações unitárias selecionadas, por exem- plo, a partir do grupo de captura, purificação, refino , inativação de ví- rus, ajuste da concentração iônica e/ou pH de um fluido que inclui a proteína recombinante e filtração). Por exemplo, em exemplos dos processos descritos no presente documento, pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 realiza a operação unitária de captura da proteína recombinante.
[00207] As uma ou mais colunas cromatográficas que podem estar presentes em um MCCS (por exemplo, presentes no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) podem ter um volume de resina, por exemplo, de entre cerca de 1 mL e cerca de 2 mL, cerca de 5 mL, cerca de 10 mL, cerca de 15 mL, cerca de 20 mL, cerca de 25 mL, cerca de 30 mL, cerca de mL, cerca de 40 mL, cerca de 45 mL, cerca de 50 mL, cerca de 55 mL, cerca de 60 mL, cerca de 65 mL, cerca de 70 mL, cerca de 75 mL, cerca de 80 mL, cerca de 85 mL, cerca de 90 mL, cerca de 95 mL ou cerca de 100 mL, inclusive. As uma ou mais colunas cromatográficas que podem estar presentes em um MCCS (por exemplo, presentes no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) podem ter um volume de resina de en- tre cerca de 2 mL a cerca de 100 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 90 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 80 mL, entre cerca de 2mL e cerca de 70 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 50 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 50 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 45 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 45 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 40 mL, entre cerca de 5 mL e cer- ca de 40 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 35 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 35 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 30 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 25 mL, entre cerca de 5 mL e cerca de 25 mL, entre cerca de 15 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 60 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 50 mL e entre cerca de 15 mL e cerca de 50 mL. As uma ou mais colunas cromatográficas em um MCCS (por exemplo, no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) usadas em qualquer um dos proces- sos descritos no presente documento podem ter substancialmente o mesmo volume de resina ou podem ter diferentes volumes de resina. A vazão usada para a uma ou mais colunas cromatográficas em um
MCCS (por exemplo, no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) pode estar, por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto ou entre cer- ca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto).
[00208] As uma ou mais colunas cromatográficas em um MCCS (por exemplo, MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) podem ter substancial- mente o mesmo formato ou podem ter formatos substancialmente dife- rentes. Por exemplo, as uma ou mais colunas cromatográficas em um MCCS (por exemplo, no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) podem ter substancialmente o formato de um cilindro circular ou podem ter subs- tancialmente o mesmo formato de um cilindro oval.
[00209] As uma ou mais membranas cromatográficas que podem estar presentes em um MCCS (por exemplo, presentes no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) podem ter um volume de leito, por exemplo, de entre cerca de 1 mL a cerca de 500 mL (por exemplo, entre cerca de 1 mL a cerca de 475 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 450 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 425 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 400 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 375 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 350 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 325 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 300 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 275 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 250 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 225 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 200 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 175 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 150 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 125 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 100 mL, entre cerca de 2 mL a cerca de 100 mL, entre cerca de 5 mL a cerca de 100 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 80 mL, entre cerca de 2 mL a cerca de 80 mL, entre cerca de 5 mL a cerca de 80 mL, en- tre cerca de 1 mL a cerca de 60 mL, entre sobre 2 mL a cerca de 60 mL, entre cerca de 5 mL a cerca de 60 mL, entre cerca de 1 mL a cer- ca de 40 mL, entre cerca de 2 mL a cerca de 40 mL, entre cerca de 5 mL a cerca de 40 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 30 mL, entre cerca de 2 mL a cerca de 30 mL, entre cerca de 5 mL a cerca de 30 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 25 mL, entre cerca de 2 mL e cer- ca de 25 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 20 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 20 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 15 mL, entre cerca de 2 mL e cerca de 15 mL, entre cerca de 1 mL e cerca de 10 mL ou entre cerca de 2 mL e cerca de 10 mL).
[00210] Um ou mais (por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezes- sete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três ou vinte e quatro) diferentes tipos de tampão com biocarga reduzida po- dem ser empregados durante o uso do MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos no presente documento. Conforme é conhecido na técnica, o um ou mais tipos de tampão com biocarga reduzida usados no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS?2 nos pro- cessos descritos no presente documento dependerão da resina pre- sente na(s) coluna(s) cromatográfica e/ou membrana(s) cromatográfi- ca(s) do MCCS, MCCS1 e/ou MCCS?, as propriedades biofísicas da pro- teína recombinante e a operação unitária (por exemplo, qualquer uma das operações unitárias exemplificativas descritas no presente documen- to) realizada pela(s) coluna(s) de cromatografia e/ou membrana(s) cromatográfica(s) específicas do MCCS, MCCS1 e/ou MCCS?2. O vo- lume e o tipo de tampão empregado durante o uso do MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos no presente documento também podem ser determinados por aqueles versados na técnica (por exemplo, discutido em mais detalhes abaixo). Por exem- plo, o volume e o(s) tipo(s) de tampão empregado(s) durante o uso do MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 em qualquer um dos processos descritos no presente documento podem ser escolhidos a fim de otimizar um ou mais dos seguintes na proteína recombinante purificada (por exemplo, produto medicamentoso de proteína recombinante): o rendimento glo- bal da proteína recombinante, a atividade da proteína recombinante, o nível de pureza da proteína recombinante e a remoção de contaminan- tes biológicos de um fluido que inclui a proteína recombinante (por exemplo, meio de cultura líquido) (por exemplo, ausência de vírus ati- vos, micobactérias, leveduras, bactérias ou células de mamíferos).
[00211] O MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 pode ser um sistema de cromatografia contracorrente periódica (PCCS). Um PCCS pode, por exemplo, incluir duas ou mais colunas cromatográficas (por exemplo, três colunas ou quatro colunas) que são trocadas a fim de permitir a eluição contínua da proteína recombinante das duas ou mais colunas cromatográficas. Um PCCS pode incluir duas ou mais colunas croma- tográficas, duas ou mais membranas cromatográficas ou pelo menos uma coluna cromatográfica e pelo menos uma membrana cromatográ- fica. Uma operação da coluna (ciclo) geralmente consiste nas etapas de carregamento, lavagem, eluição e regeneração. Nos PCCSs, várias colunas são usadas para executar as mesmas etapas distinta e conti- nuamente de maneira cíclica. Uma vez que as colunas são operadas em série, o fluxo e a lavagem de uma coluna são capturados por outra coluna. Esta característica exclusiva dos PCCSs permite o carrega- mento da resina próximo de sua capacidade de ligação estática, em vez da capacidade de ligação dinâmica, conforme é típico durante a cromatografia contínua. Como um resultado da ciclagem e eluição contínuas, o fluido que entra em um PCCS é processado continua- mente e o eluato, o qual inclui a proteína recombinante, é produzido continuamente.
[00212] A estratégia de troca de coluna é empregada para avançar de uma etapa a outra em um ciclo no PCCS. Exemplos de troca de coluna que podem ser usados em um PCCS são descritos no Pedido de Patente Provisório Norte-Americano Números de Série 61/775.060 e 61/856.390. Por exemplo, um método de troca de coluna pode em- pregar duas operações de troca automatizadas por coluna: a primeira das quais está relacionada à descoberta inicial do produto, enquanto que a segunda coincide com a saturação da coluna. A determinação de quando as operações de troca de coluna devem ocorrer pode ser determinada ao monitorar a concentração de proteína recombinante (por exemplo, monitoramento realizado através de monitoramento por UV) no eluato de cada coluna cromatográfica presente em um PCCS. Por exemplo, a troca de coluna pode ser determinada através de qual- quer ferramenta PAT capaz de medição em linha da concentração de proteína recombinante com controle de feedback. A ferramenta PAT é capaz de medir em linha em tempo real a concentração de proteína recombinante com controle de feedback. Conforme é conhecido na técnica, as trocas de coluna também podem ser planejadas com base no tempo ou na quantidade de fluido (por exemplo, tampão) que pas- sou através de uma ou mais colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS?2.
[00213] EmPCCSs,o tempo de residência (RT) da proteína recom- binante em cada coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfi- ca presente no PCCS pode ser diminuído sem aumentar o tamanho da coluna/membrana, uma vez que o produto da primeira coluna/mem- brana pode ser capturado em outra coluna/membrana no PCCS. Um sistema de processo contínuo pode ser concebido para processar meio de cultura líquido em qualquer taxa de perfusão (D) ao variar o volume da coluna/membrana (V) e o RT usando a equação de: V= D *
RT.
[00214] As uma ou mais operações unitárias que podem ser reali- zadas pelo MCCS ou pelo MCC1 e/ou MCCS2 usados nos processos presentemente descritos incluem, por exemplo, capturar a proteína recombinante, inativar vírus presentes em um fluido que inclui a prote- Ína recombinante, purificar a proteína recombinante, refinar a proteína recombinante, reter um fluido que inclui a proteína recombinante (por exemplo, usando qualquer um dos tanques de fragmentação exempli- ficativos descritos no presente documento), filtrar ou remover material em partículas e/ou células de um fluido que inclui a proteína recombi- nante e ajustar a concentração iônica e/ou pH de um fluido que inclui a proteína recombinante.
[00215] Em algumas modalidades, o MCCS ou o MCCS1 inclui pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica que realiza a operação unitária de captura da proteína recombinante. À operação unitária de captura pode ser realizada usando pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou resina cromatográfica, por exemplo, usando um mecanismo de captura. Exemplos não limitativos de meca- nismos de captura incluem um mecanismo de captura por ligação à proteína A, um mecanismo de captura por ligação a anticorpo ou frag- mento de anticorpo, um mecanismo de captura por ligação a substrato, um mecanismo de captura por ligação a aptâmero, um mecanismo de captura por ligação a um marcador (por exemplo, um mecanismo de captura com base em marcador poli-His) e um mecanismo de captura por ligação a cofator. A captura também pode ser realizada usando uma resina que pode ser empregada para realizar cromatografia de troca catiônica ou troca aniônica, cromatografia com peneiras molecu- lares ou cromatografia de interação hidrofóbica. Resinas não limitati- vas que podem ser usadas para capturar uma proteína recombinante são descritas no presente documento. Exemplos adicionais de resinas que podem ser usadas para capturar uma proteína recombinante são conhecidos na técnica.
[00216] A operação unitária de inativação de vírus presentes em um fluido que inclui a proteína recombinante pode ser realizada usando um MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 (por exemplo, que incluem, por exemplo, uma coluna cromatográfica, uma membrana cromatográfica ou um tanque de retenção que é capaz de incubar um fluido que inclui a proteína recombinante em um pH entre cerca de 3,0 a 5,0 (por exemplo, entre cerca de 3,5 a cerca de 4,5, entre cerca de 3,5 a cerca de 4,25, entre cerca de 3,5 a cerca de 4,0, entre cerca de 3,5 a cerca de 3,8 ou cerca de 3,75) durante um período de pelo menos 30 minu- tos (por exemplo, um período de entre cerca de 30 minutos a 1,5 ho- ras, um período de cerca de 30 minutos a 1,25 horas, um período de cerca de 0,75 horas a 1,25 horas ou um período de cerca de 1 hora)).
[00217] A operação unitária de purificação de uma proteína recom- binante pode ser realizada usando um ou mais MCCSs (por exemplo, um MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) que incluem, por exemplo, uma co- luna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resi- na, por exemplo, que usa um sistema de captura. Exemplos não limita- tivos de mecanismos de captura incluem um mecanismo de captura por ligação à proteína A, um mecanismo de captura por ligação a anti- corpo ou fragmento de anticorpo, um mecanismo de captura por liga- ção a substrato, um mecanismo de captura por ligação a aptâmero, um mecanismo de captura por ligação a marcador (por exemplo, um mecanismo de captura com base em marcador poli-His) e um meca- nismo de captura por ligação a cofator. A purificação também pode ser realizada usando uma resina que pode ser empregada para realizar cromatografia de troca catiônica ou troca aniônica, cromatografia com peneiras moleculares ou cromatografia de interação hidrofóbica. Resi- nas não limitativas que podem ser usadas para purificar uma proteína recombinante são descritas no presente documento. Exemplos adicio- nais de resinas que podem ser usadas para purificar uma proteína re- combinante são conhecidos na técnica.
[00218] A operação unitária de refinar uma proteína recombinante pode ser realizada usando um ou mais MCCSs (por exemplo, um MCCS, MCCS1 e/ou MCCS) que incluem, por exemplo, uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina, por exemplo, que pode ser usada para realizar troca catiônica, troca aniônica, cromatografia com peneiras moleculares ou cromatografia de interação hidrofóbica. Resinas não limitativas que podem ser usadas para refinar uma proteína recombinante são descritas no presente do- cumento. Exemplos adicionais de resinas que podem ser usadas para refinar uma proteína recombinante são conhecidos na técnica.
[00219] A operação unitária de reter um fluido que inclui a proteína recombinante pode ser realizada usando um MCCS (por exemplo, um MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) que inclui pelo menos um reservatório (por exemplo, um tanque de fragmentação) ou um máximo de 1, 2,3, 4 ou 5 reservatórios (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) no MCCS ou no MCCS1 e MCCS2 combinados. Por exemplo, o(s) reser- vatório(s) (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) que pode(m) ser usado(s) para alcançar esta operação unitária podem ter, cada um, um volume entre cerca de 1 mL a cerca de 1 L (por exemplo, entre cerca de 1 mL a cerca de 800 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 600 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 500 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 400 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 350 mL, entre cerca de 1 mL a cerca de 300 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 250 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 200 mL, entre cerca de 10 mL e cerca de 150 mL ou entre cerca de 10 mL a cerca de 100 mL). O(s) reservató- rio(s) (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) usado(s) nos proces- sos descritos no presente documento pode(m) ter uma capacidade que está, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 300 mL, inclusive, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 280 mL, cerca de 260 mL, cerca de 240 mL, cerca de 220 mL, cerca de 200 mL, cerca de 180 mL, cerca de 160 mL, cerca de 140 mL, cerca de 120 mL, cerca de 100 mL, cer- ca de 80 mL, cerca de 60 mL, cerca de 40 mL, cerca de 20 mL ou cer- ca de 10 mL, inclusive. Qualquer um dos reservatórios (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) usado (em qualquer um dos processos descritos no presente documento) para reter fluido antes de entrar no MCCS ou MCCS1 pode ter uma capacidade que está, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100 %, inclusive, entre cerca de 1 mL e cerca de 90 %, cerca de 80 %, cerca de 70 %, cerca de 60 %, cerca de 50 %, cerca de 40 %, cerca de 30 %, cerca de 20 %, cerca de 10 % ou cerca de 5 %, inclusive, do volume de carregamento da primeira colu- na do MCCS ou MCCS1. Qualquer um dos reservatórios (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) usados para reter um eluato do MCCS1 (incluindo a proteína recombinante) antes de entrar no MCCS2 pode ter uma capacidade que está, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100 %, inclusive, por exemplo, entre cerca de 1 mL e cerca de 90 %, cerca de 80 %, cerca de 70 %, cerca de 60 %, cerca de 50 %, cerca de 40 %, cerca de 30 %, cerca de 20 %, cerca de 10 % ou cerca de 5 %, in- clusive, do volume de carregamento da primeira coluna do MCCS?2.
[00220] O(s) reservatório(s) (por exemplo, tanque(s) de fragmenta- ção) pode(m), cada um, reter o fluido que inclui a proteína recombinan- te durante pelo menos 10 minutos (por exemplo, pelo menos 20 minu- tos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas ou pelo menos 6 horas). Em outros exemplos, o(s) reservatório(s) (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) con- tém/contêm apenas uma proteína recombinante durante um período de tempo total, por exemplo, de entre cerca de 5 minutos e menos de cerca de 6 horas, inclusive, por exemplo, entre cerca de 5 minutos e cerca de 5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 ho- ras, cerca de 1 hora ou cerca de 30 minutos, inclusive. O(s) reservató- rio(s) (por exemplo, tanque(s) de fragmentação) pode(m) ser usado(s) para reter e refrigerar (por exemplo, em uma temperatura de menos de 25ºC, menos de 15ºC ou menos de 10ºC), o fluido que inclui a proteí- na recombinante. O reservatório pode ter qualquer formato, incluindo um cilindro circular, um cilindro oval ou um saco vedado e não per- meável aproximadamente retangular.
[00221] As operações unitárias de filtrar um fluido que inclui a prote- íÍna recombinante podem ser realizadas usando um MCCS (por exem- plo, o MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) que inclui, por exemplo, um filtro ou uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina de peneira molecular. Conforme é conhecido na técnica, uma grande variedade de filtros submicrônicos (por exemplo, um filtro com um tamanho de poros menor do que 1 um, menor do que 0,5 um, menor do que 0,3 um, cerca de 0,2 um, menor do que 0,2 um, menor do que 100 nm, menor do que 80 nm, menor do que 60 nm, menor do que 40 nm, menor do que 20 nm ou menor do que 10 nm) estão dis- poníveis na técnica, os quais são capazes de remover qualquer mate- rial precipitado e/ou células (por exemplo, precipitado, proteína não dobrada; proteínas de células hospedeiras precipitadas e indesejadas; lipídios precipitados; bactérias; células de levedura; células fúngicas; micobactérias; e/ou células de mamíferos). Filtros com um tamanho de poros de cerca de 0,2 um ou menos de 0,2 um são conhecidos por remover eficazmente bactérias do fluido, incluindo a proteína recombi- nante. Conforme é conhecido na técnica, uma coluna cromatográfica ou uma membrana cromatográfica que inclui uma resina de peneira molecular também pode ser usada em um MCCS (por exemplo, o MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2) para realizar a operação unitária de fil- trar um fluido que inclui uma proteína recombinante.
[00222] As operações unitárias de ajuste da concentração iônica e/ou pH de um fluido que inclui a proteína recombinante podem ser realizadas usando um MCCS (por exemplo, um MCCS, um MCCS1 e/ou um MCCS2) que inclui e usa um reservatório de ajuste de tampão (por exemplo, um reservatório de ajuste de tampão em linha) que adi- ciona uma nova solução tampão a um fluido que inclui a proteína re- combinante (por exemplo, entre as colunas dentro do MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 ou após a última coluna em um penúltimo MCCS (por exemplo, o MCCS1) e antes que o fluido que inclui a proteína recom- binante seja alimentado na primeira coluna do próximo MCCS (por exemplo, o MCCS2)). Conforme pode ser reconhecido na técnica, o reservatório de ajuste de tampão em linha pode ser de qualquer tama- nho (por exemplo, maior que 100 mL) e pode incluir qualquer solução tamponada (por exemplo, uma solução tamponada que possui um ou mais de: um aumento ou diminuição pH comparado com o fluido que inclui a proteína recombinante, uma concentração iônica aumentada ou diminuída (por exemplo, sal) comparado com o fluido que inclui a proteína recombinante e/ou uma concentração aumentada ou diminuí- da de um agente que compete com a proteína recombinante pela liga- ção à resina presente em pelo menos uma coluna cromatográfica ou pelo menos uma membrana cromatográfica em um MCCS (por exem- plo, o MCCS, MCCS1 e/ou MCCS?2)).
[00223] O MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 pode executar duas ou mais operações unitárias. Por exemplo, o MCCS, MCCS1 e/ou MCCS?2 podem, cada um, realizar pelo menos as seguintes operações unitárias: capturar a proteína recombinante e inativar vírus presentes no fluido que inclui a proteína recombinante; capturar a proteína re- combinante, inativar vírus presentes no fluido que inclui a proteína re- combinante e ajustar a concentração iônica e/ou pH de um líquido que inclui a proteína recombinante; purificar a proteína recombinante e re-
finar a proteína recombinante; purificar a proteína recombinante, refi- nar a proteína recombinante e filtrar um fluido que inclui a proteína re- combinante ou remover precipitados e/ou matéria em partículas de um fluido que inclui a proteína recombinante; e purificar a proteína recom- binante, refinar a proteína recombinante, filtrar um fluido que inclui a proteína recombinante ou remover precipitados e/ou partículas de um fluido que inclui a proteína recombinante e ajustar a concentração iôni- ca e/ou pH de um líquido que inclui a proteína recombinante. Captura da Proteína Recombinante
[00224] Os presentes processos incluem uma etapa de captura da proteína recombinante usando um MCCS ou MCCS1. Conforme será reconhecido na técnica, o meio de cultura líquido que inclui a proteína recombinante pode ser continuamente alimentado no MCCS ou MCCS1 usando uma variedade de meios diferentes. Por exemplo, o meio de cultura líquido pode ser bombeado ativamente para o MCCS ou MCCS1 ou o meio de cultura líquido pode ser alimentado para o MCCS ou MCCS1 usando a força gravitacional. O meio de cultura lí- quido pode ser armazenado em um reservatório (por exemplo, um tanque de contenção) antes de ser alimentado no MCCS ou MCCS1 ou o meio de cultura líquido pode ser bombeado ativamente de um biorreator que inclui uma cultura de células (por exemplo, células de mamíferos que secretam a proteína recombinante no meio de cultura) para o MCCS ou MCCS1.
[00225] O meio de cultura líquido pode ser alimentado (carregado) no MCCS ou MCCS1 em uma vazão de entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O meio de cultura líquido que inclui a proteína recombi- nante pode ser derivado de qualquer uma das fontes exemplificativas descritas no presente documento ou conhecidas na técnica.
[00226] Alguns exemplos incluem ainda a etapa opcional de filtrar o meio de cultura líquido antes de ser alimentado no MCCS ou MCCS1. Qualquer um dos meios exemplificativos para filtrar um meio de cultura líquido ou um fluido que inclui a proteína recombinante descrita no presente documento ou qualquer meio de filtração conhecido na técni- ca pode ser usado para filtrar o meio de cultura líquido que inclui a pro- teína recombinante antes de ser alimentado no MCCS ou MCCS1.
[00227] — Nos processos descritos no presente documento, a captura da proteína recombinante do meio de cultura líquido é realizada usan- do o MCCS ou MCCS1. Conforme será reconhecido na técnica, a fim de obter a captura da proteína recombinante, pelo menos uma coluna cromatográfica ou pelo menos uma membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 deve incluir uma resina que usa um mecanismo de captura (por exemplo, qualquer um dos mecanismos de captura exemplificativos descritos no presente documento) ou inclui uma resi- na capaz de realizar a cromatografia de troca catiônica, troca aniônica, com peneiras moleculares ou de interação hidrofóbica. Por exemplo, se a proteína recombinante for um anticorpo ou um fragmento de anti- corpo, o sistema de captura pode ser um mecanismo de captura por ligação à proteína A ou um mecanismo de captura por ligação a antí- geno (onde o antígeno de captura é especificamente reconhecido pelo anticorpo recombinante ou fragmento de anticorpo). Se a proteína re- combinante for uma enzima, o mecanismo de captura pode usar um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente à en- zima para capturar a enzima recombinante, um substrato enzimático para capturar a enzima recombinante, um cofator enzimático para cap- turar a enzima recombinante ou, se a enzima recombinante incluir um marcador, uma proteína, quelato de metal ou anticorpo (ou fragmento de anticorpo) que se liga especificamente ao marcador presente na enzima recombinante. Resinas não limitativas que podem ser usadas para capturar uma proteína recombinante são descritas no presente documento e resinas adicionais que podem ser usadas para capturar uma proteína recombinante são conhecidas na técnica. Um exemplo não limitativo de resina que usa um mecanismo de captura por ligação à proteína A é a resina Mab Select SuRe"Y (GE Healthcare, Piscata- way, NJ), JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203 (Sunnyvale, CA) e Kaneka KanCap A (Osaka, Japão).
[00228] Tamanhos e formatos não limitativos exemplificativos da(s) coluna(s) cromatográfica(s) ou membrana(s) cromatográfica(s) presen- te(s) no MCCS ou MCCS1 que pode(m) ser usada(s) para capturar a proteína recombinante são descritos no presente documento. O meio de cultura líquido alimentado (carregado) no MCCS ou MCCS1 pode incluir, por exemplo, entre cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de proteína recombinante (por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 90 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 80 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 70 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 60 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 40 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL a cerca de mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL ou entre cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 10 proteína recombinante mg/mL). O tempo médio necessário para a proteína recombinante se ligar à resi- na usada para realizar a operação unitária de captura pode estar, por exemplo, entre cerca de 5 segundos a cerca de 10 minutos (por exemplo, entre cerca de 10 segundos a cerca de 8 minutos, entre cer- ca de 10 segundos a cerca de 7 minutos, entre cerca de 10 segundos a cerca de 6 minutos, entre cerca de 10 segundos a cerca de 5 minu- tos, entre cerca de 30 segundos a cerca de 5 minutos, entre cerca de 1 minuto a cerca de 5 minutos, entre cerca de 10 segundos a cerca de 4 minutos, entre cerca de 30 segundos a cerca de 4 minutos ou entre cerca de 1 minuto a cerca de 4 minutos).
[00229] Conforme será reconhecido na técnica, a fim de capturar a proteína recombinante usando a(s) coluna(s) cromatográfica(s) ou membrana(s) cromatográfica(s) presente(s) no MCCS ou MCCS1, de- ve-se realizar as etapas cromatográficas sequenciais de carregamen- to, lavagem, eluição e regeneração da(s) coluna(s) cromatográfica(s) ou membrana(s) cromatográfica(s) presente(s) no MCCS ou MCCS1. Qualquer um dos exemplos de vazão, volumes de tampão e/ou com- primentos de tempo alocados para cada etapa cromatográfica sequen- cial descrita no presente documento pode ser usada em uma ou mais destas diferentes etapas cromatográficas sequenciais (por exemplo, uma ou mais das etapas cromatográficas sequenciais de carregamen- to, lavagem, eluição e regeneração da(s) coluna(s) cromatográfica(s) ou membrana(s) cromatográfica(s) presente(s) no MCCS ou MCCS1 que são usados para capturar a proteína recombinante). Vazões, vo- lumes de tampão e/ou comprimentos de tempo não limitativos aloca- dos para cada etapa cromatográfica sequencial que pode ser usada para a(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou membrana(s) cromatográfi- ca(s) no MCCS ou MCCS1 (por exemplo, um PCCS ou PCCS1) são fornecidos abaixo. Além disso, tampões exemplificativos que podem ser usados no MCCS e/ou MCCS1 são descritos abaixo.
[00230] O MCCS ou MCCS1 que inclui pelo menos uma coluna cromatográfica e/ou membrana cromatográfica que inclui uma resina que pode realizar a operação unitária de captura (por exemplo, qual- quer uma das resinas exemplificativas que podem ser usadas para captura descritas no presente documento) podem ser carregados com o meio de cultura líquido que inclui uma proteína recombinante usando qualquer uma das vazões de carregamento (taxas de alimentação) descritas acima. Em alguns exemplos, uma única coluna cromatográfi- ca ou uma única membrana cromatográfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura é carregada, por exemplo, entre cerca de 10 minutos a cerca de 90 minutos (por exem- plo, entre cerca de 15 minutos e cerca de 90 minutos, entre cerca de minutos e 80 minutos, entre cerca de 30 minutos e 80 minutos, en- tre cerca de 40 minutos e cerca de 80 minutos, entre cerca de 50 mi- nutos e cerca de 80 minutos e entre cerca de 60 minutos e 80 minu- tos). Em alguns exemplos em que o MCCS ou MCCS1 inclui pelo me- nos duas colunas cromatográficas que incluem uma resina que é ca- paz de realizar a operação unitária de captura em série, o tempo ne- cessário para carregar duas das colunas cromatográficas em série es- tá, por exemplo, entre cerca de 50 minutos a cerca de 180 minutos (por exemplo, entre cerca de 60 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 70 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 80 minu- tos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 90 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 100 minutos e cerca de 180 minutos, entre cerca de 110 minutos e 150 minutos e entre cerca de 125 minutos e cerca de 145 minutos).
[00231] Após o carregamento da proteína recombinante em pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura, a pelo menos uma coluna cromatográfi- ca ou membrana cromatográfica é lavada com pelo menos um tampão de lavagem. Conforme será reconhecido na técnica, o pelo menos um
(por exemplo, dois, três ou quatro) tampão de lavagem se destina a eluir todas ou a maioria das proteínas que não a proteína recombinan- te da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromato- gráfica, ao mesmo tempo em que não interfere na interação da proteí- na recombinante com a resina.
[00232] O tampão de lavagem pode ser passado através de pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica em uma vazão de cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume de tampão de lavagem usado (por exemplo, volume total combinado de tampão de lavagem usado quando mais de um tampão de lavagem é usado) pode ser, por exemplo, entre cerca de 1X o volume da coluna (CV) a cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV a cerca de 14X CV, cerca de 1X CV a cerca de 13X CV, cerca de 1X CV a cerca de 12X CV, cerca de 1X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2X CV a cerca de 11X CV, cerca de 3X CV a cerca de 11X CV, cerca de 4X CV a cerca de 11X CV, cerca de 5X CV a cerca de 11X CV ou cerca de 5X CV a cerca de 10X CV). O tempo total da lavagem pode ser, por exemplo, entre cerca de 2 minutos a cerca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 2 minutos a cerca de 2,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 2,0 horas, entre cerca de 5 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cer- ca de 10 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 10 minutos a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 20 minutos a cerca de 1,25 horas ou entre cerca de 30 minutos a cerca de 1 hora).
[00233] Após a lavagem da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 que inclui uma re- sina que é capaz de realizar a operação unitária de captura, a proteína recombinante é eluída da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica ao passar um tampão de eluição através da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica no MCCS ou MCCS1 que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura.
O tampão de eluição pode ser passado através da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cro- matográfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura em uma vazão de cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto ou entre cer- ca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume do tampão de eluição usado para eluir a proteína recombinante de cada uma da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de purificação pode ser, por exemplo, entre cerca de 1X o volume de co- luna (CV) a cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV a cerca de 14X CV, cerca de 1X CV a cerca de 13X CV, cerca de 1X CV a cerca de 12X CV, cerca de 1X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2X CV a cerca de 11X CV, cerca de 3X CV a cerca de 11X CV, cerca de 4X CV a cerca de 11X CV, cerca de 5X CV a cerca de 11X CV ou cer- ca de 5X CV a cerca de 10X CV). O tempo total de eluição pode estar,
por exemplo, entre cerca de 2 minutos a cerca de 3 horas (por exem- plo, entre cerca de 2 minutos a cerca de 2,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 2,0 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1 hora, entre cerca de 2 minutos e cerca de 40 minutos, entre cerca de 10 minutos e cerca de 40 minutos ou entre cerca de 20 minutos e cerca de 40 minutos). Exemplos não limitativos de tampões de eluição que podem ser usa- dos nestes métodos dependerão do mecanismo de captura e/ou da proteína recombinante. Por exemplo, um tampão de eluição pode in- cluir uma concentração diferente de sal (por exemplo, concentração aumentada de sal), um pH diferente (por exemplo, uma concentração aumentada ou diminuída de sal) ou uma molécula que competirá com a proteína recombinante pela ligação à resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura. Exemplos de tais tampões de eluição para cada mecanismo de captura exemplificativo descrito no presente documento são bem conhecidos na técnica.
[00234] Após a eluição da proteína recombinante da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica no MCCS ou no MCCS1 que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura e antes que o próximo volume de meio de cultura líquido possa ser carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica, a pelo menos uma coluna cromatográfi- ca ou membrana cromatográfica deve ser equilibrada usando um tam- pão de regeneração. O tampão de regeneração pode ser passado através da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cro- matográfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura em uma vazão, por exemplo, de entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 5,0 mL/minuto a cerca de 15,0 mL/minuto ou entre cer- ca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume do tampão de regeneração usado para equilibrar a pelo menos uma coluna cro- matográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitária de captura pode ser, por exem- plo, entre cerca de 1X o volume de coluna (CV) a cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV a cerca de 14X CV, cerca de 1X CV a cerca de 13X CV, cerca de 1X CV a cerca de 12X CV, cerca de 1X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2X CV a cerca de 11X CV, cerca de 3X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2X CV a cerca de 5X CV, cer- ca de 4X CV a cerca de 11X CV, cerca de 5X CV a cerca de 11X CV ou cerca de 5X CV a cerca de 10X CV).
[00235] Em alguns dos processos descritos no presente documen- to, o MCCS ou MCCS1 inclui um reservatório que contém um fluido que inclui a proteína recombinante em baixo pH (por exemplo, um pH abaixo de 4,6, abaixo de 4,4, abaixo de 4,2, abaixo de 4,0, abaixo de 3,8, abaixo de 3,6, abaixo 3,4, abaixo de 3,2 ou abaixo de 3,0), por exemplo, durante cerca de 1 minuto a 1,5 horas (por exemplo, cerca de 1 hora) e inativa os vírus presentes em um fluido que inclui a prote- Ína recombinante. Um exemplo de reservatório que pode ser usado para realizar a operação unitária de inativação de vírus é um frasco de agitação (por exemplo, frasco de agitação de 500 mL, por exemplo, um frasco de agitação de 500 mL com uma placa de agitação progra-
mada) que é capaz de conter um fluido que inclui uma proteína re- combinante, por exemplo, durante cerca de 1 minuto a 1,5 horas, por exemplo, antes do fluido que inclui a proteína recombinante ser ali- mentado no MCCS?2. O reservatório que é usado para realizar a ope- ração unitária de inativação de vírus pode ser um frasco de agitação de 500 mL com uma placa de agitação programada (por exemplo, uma placa de agitação programada para misturar (por exemplo, misturar periodicamente) o fluido dentro do reservatório, por exemplo, a cada 4 horas). Outro exemplo de um reservatório que pode ser usado para realizar a operação unitária de inativação de vírus é um saco plástico (por exemplo, saco plástico de 500 mL) que é capaz de conter um flui- do que inclui uma proteína recombinante, por exemplo, durante cerca de 1 minuto a 1,5 horas, por exemplo, antes que o fluido que inclui a proteína recombinante seja alimentado no MCCS2. Em alguns exem- plos, o fluido que inclui a proteína recombinante já pode ter um pH bai- xo (por exemplo, um pH abaixo de 4,6, abaixo de 4,4, abaixo de 4,2, abaixo de 4,0, abaixo de 3,8, abaixo de 3,6, abaixo de 3,4, abaixo de 3,2 ou abaixo de 3,0) quando é alimentado no reservatório que é usa- do para realizar a operação unitária de inativação viral. Conforme será reconhecido por aqueles versados na técnica, uma variedade de ou- tros meios podem ser usados para realizar a operação unitária de ina- tivação de vírus. Por exemplo, a irradiação UV de um fluido que inclui a proteína recombinante também pode ser usada para realizar a ope- ração unitária de inativação de vírus. Exemplos não limitativos de re- servatórios que podem ser usados para realizar a operação unitária de inativação de vírus presentes em um fluido que inclui a proteína re- combinante são descritos no presente documento.
[00236] OMCCS ou MCCS1 pode incluir um PCCS que inclui qua- tro colunas cromatográficas, onde pelo menos três das quatro colunas cromatográficas executam a operação unitária de captura da proteína recombinante do meio de cultura líquido (por exemplo, usando um MCCS que inclui qualquer uma das pelo menos uma coluna cromato- gráfica que inclui uma resina que é capaz de realizar a operação unitá- ria de captura (por exemplo, qualquer uma daquelas descritas no pre- sente documento)). Nestes exemplos, a quarta coluna do PCC pode realizar a operação unitária de inativação de vírus em um fluido que inclui a proteína recombinante (por exemplo, qualquer uma das colu- nas exemplificativas descritas no presente documento que podem ser usadas para obter inativação viral de um fluido que inclui a proteína recombinante).
[00237] Em alguns exemplos, um fluido que inclui a proteína re- combinante é continuamente eluído do MCCS1 (por exemplo, PCCS1) e é continuamente alimentado ao MCCS2 (por exemplo, PCCS2). À porcentagem da proteína recombinante recuperada no eluato proveni- ente do MCCS ou MCCS1 (por exemplo, PCCS ou PCCS1) pode ser, por exemplo, pelo menos 70 %, pelo menos 72 %, pelo menos 74 %, pelo menos 76 %, pelo menos 78 %, pelo menos 80 %, pelo menos 82 %, pelo menos 84 %, pelo menos 86 %, pelo menos 88 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92 %, pelo menos 94 %, pelo menos 96 % ou pelo menos 98 %). O eluato proveniente do MCCS1 (por exemplo, PCCS1) pode ser alimentado ao MCCS2 (por exemplo, PCCS2) usando uma variedade de meios conhecidos na técnica (por exemplo, tubulação). O eluato proveniente do MCCS1 (por exemplo, PCCS1) pode ser alimen- tado ao MCCS2 (por exemplo, PCCS2) em uma vazão, por exemplo, de entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exem- plo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cer- ca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto,
entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 5,0 mL/minuto a cerca de 15,0 mL/minuto, entre cerca de 15 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto).
[00238] Alguns processos descritos no presente documento podem incluir ainda uma etapa de ajuste da concentração iônica e/ou pH do eluato proveniente do MCCS1 (por exemplo, PCCS1) antes de ser alimentado ao MCCS2 (por exemplo, PCCS2). Conforme descrito no presente documento, a concentração iônica e/ou pH do eluato prove- niente do MCCS1 (por exemplo, PCCS1) pode ser ajustado (antes de ser alimentado ao MCCS2) mediante a adição de um tampão ao eluato (por exemplo, através do uso de um reservatório de tampão de ajuste em linha). O tampão pode ser adicionado ao eluato proveniente do MCCS1 em uma vazão, por exemplo, de entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 12,5 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 10,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 8,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 6 mL/minuto, en- tre cerca de 0,1 mL/minuto a 4 mL/minuto ou entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 5 mL/minuto).
[00239] Os processos descritos no presente documento podem in- cluir ainda uma etapa de retenção ou armazenamento (e opcionalmen- te também de refrigeração) do eluato proveniente do MCCS1 antes de alimentar o eluato proveniente do MCCS1 ao MCCS?2. Conforme des- crito no presente documento, esta etapa de retenção ou armazena- mento pode ser realizada usando qualquer um dos reservatórios (por exemplo, tanques de contenção) descritos no presente documento.
[00240] Os processos descritos no presente documento também podem incluir uma etapa de filtrar o eluato proveniente do MCCS1 an-
tes que o eluato seja alimentado ao MCCS2. Qualquer um dos filtros ou métodos exemplificativos para filtração descritos no presente do- cumento pode ser usado para filtrar o eluato proveniente do MCCS1 antes que o eluato seja alimentado ao MCCS?2. Refino e Purificação da Proteína Recombinante
[00241] O MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 podem ser usados para realizar a operação unitária de purificação e refino da proteína recom- binante. Por exemplo, o MCCS2 pode ser usado para realizar a opera- ção de purificação e refino da proteína recombinante e o eluato prove- niente do MCCS2 é uma substância medicamentosa de proteína. O MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 pode incluir pelo menos uma (por exem- plo, duas, três ou quatro) coluna cromatográfica ou membrana croma- tográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de puri- ficação de uma proteína recombinante e pelo menos uma (por exem- plo, duas, três ou quatro) coluna cromatográfica ou membrana croma- tográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refi- no da proteína recombinante.
[00242] A pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode incluir uma resina que usa um mecanismo de captura (por exemplo, qualquer um dos meca- nismos de captura descritos no presente documento ou conhecidos na técnica) ou uma resina que pode ser usada para realizar cromatografia de troca aniônica, troca catiônica, com peneiras moleculares ou de in- teração hidrofóbica. A pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a opera- ção unitária de refino da proteína recombinante pode incluir uma resi- na que pode ser usada para realizar cromatografia de troca aniônica, troca catiônica, com peneiras moleculares ou de interação hidrofóbica (por exemplo, qualquer uma das resinas exemplificativas para realizar cromatografia de troca aniônica, troca catiônica, com peneiras molecu- lares ou de interação hidrofóbica descritas no presente documento ou conhecidas na técnica).
[00243] O tamanho, o formato e o volume da pelo menos uma colu- na cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombi- nante e/ou o tamanho e o formato da pelo menos uma membrana cromatográfica que pode ser usado para executar a operação unitária de refino da proteína recombinante pode qualquer combinação dos tamanhos, formatos e volumes exemplificativos de colunas cromato- gráficas ou membranas cromatográficas descritas no presente docu- mento. Conforme será reconhecido por aqueles versados na técnica, a etapa de purificação ou refino de uma proteína recombinante pode, por exemplo, incluir as etapas de carregamento, lavagem, eluição e equilí- brio de pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana croma- tográfica usada para realizar a operação unitária de purificação ou re- fino da proteína recombinante. Tipicamente, o tampão de eluição que sai de uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação inclui a proteína re- combinante. Tipicamente, o tampão de carregamento e/ou lavagem que sai de uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de refino inclui a proteína re- combinante.
[00244] — Por exemplo, o tamanho da pelo menos uma coluna croma- tográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para reali- zar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode ter um volume, por exemplo, de entre cerca de 2,0 mL a cerca de 200 mL (por exemplo, entre cerca de 2,0 mL a cerca de 180 mL, entre cer- ca de 2,0 mL a cerca de 160 mL, entre cerca de 2,0 mL a cerca de 140 mL, entre cerca de 2,0 mL a cerca de 120 mL, entre cerca de 2,0 mL a cerca de 100 mL, entre cerca de 2,0 mL a cerca de 80 mL, entre cerca de 2,0 mL a cerca de 60 mL, entre cerca de 2,0 mL a cerca de 40 mL, entre cerca de 5,0 mL a cerca de 40 mL, entre cerca de 2,0 mL a cerca de 30 mL, entre cerca de 5,0 mL a cerca de 30 mL ou entre cerca de 2,0 mL a cerca de 25 mL). A vazão do fluido que inclui a proteína re- combinante à medida que é carregado em pelo menos uma coluna cromatográfica ou pelo menos uma cromatografia que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombi- nante pode estar, por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 12,5 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 10,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 8,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 6 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a 4 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 3 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 2 mL/minuto ou cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 4 mL/minuto). A concentração da proteína recombinante no fluido carregado em pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode estar, por exemplo, entre cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de proteína recombinante (por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 90 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 80 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 70 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL mL a cerca de 60 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 40 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 15 m g/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL ou entre cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 10 mg/mL de proteína recombinante). A resina em pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação pode ser uma resina que pode ser usada para realizar a cromatografia de troca aniônica ou troca catiônica. A resina em pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que é usada para realizar a operação unitária de purificação pode ser uma resina de troca catiônica (por exemplo, resina Capto-S, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).
[00245] Após o carregamento da proteína recombinante em pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da pro- teína recombinante, a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica é lavada com pelo menos um tampão de lavagem. Conforme será reconhecido na técnica, o pelo menos um (por exemplo, dois, três ou quatro) tampão de lavagem se destina a eluir todas as proteínas que não a proteína recombinante da pelo me- nos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica, ao mesmo tempo em que não interfere na interação da proteína recombi- nante com a resina ou, de outra forma, eluição da proteína recombi- nante.
[00246] O tampão de lavagem pode ser passado através da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica em uma vazão de cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto ou entre cer- ca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume de tampão de lavagem usado (por exemplo, volume total combinado de tampão de lavagem usado quando mais de um tampão de lavagem é usado) pode estar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume de coluna (CV) a cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV a cerca de 14X CV, cerca de 1X CV a cerca de 13X CV, cerca de 1X CV a cerca de 12X CV, cerca de 1X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2X CV a cerca de 11X CV, cerca de 3X CV a cerca de 11X CV, cerca de 4X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2,5X CV a cerca de 5,0X CV, cerca de 5X CV a cerca de 11X CV ou cerca de 5X CV a cerca de 10X CV). O tem- po total da lavagem pode ser, por exemplo, entre cerca de 2 minutos a cerca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 2 minutos a cerca de 2,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 2,0 horas, entre cerca de 5 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 10 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 10 minutos a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 20 minutos a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 30 minutos a cerca de 1 hora, entre cerca de 2 minutos e 10 minutos, entre cerca de 2 minutos e 15 minutos ou entre cerca de 2 minutos e 30 minutos).
[00247] Após a lavagem da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante, a proteína recombinante é eluída da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cro- matográfica ao passar um tampão de eluição através da pelo menos um coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante. O tampão de eluição pode ser passado através da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína re- combinante em uma vazão de cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto,
entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume do tampão de elui- ção usado para eluir a proteína recombinante de cada uma da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da pro- teína recombinante pode estar, por exemplo, entre cerca de 1X o vo- lume de coluna (CV) a cerca de 25X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV a cerca de 20X CV, entre cerca de 15X CV e cerca de 25X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 14X CV, cerca de 1X CV a cerca de 13X CV, cerca de 1X CV a cerca de 12X CV, cerca de 1X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2X CV a cerca de 11X CV, cerca de 3X CV a cerca de 11X CV, cerca de 4X CV a cerca de 11X CV, cerca de 5X CV a cerca de 11X CV ou cerca de 5X CV a cerca de 10X CV). O tempo total de eluição pode ser, por exemplo, entre cerca de 2 minutos a cer- ca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 2 minutos a cerca de 2,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 2,0 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1 hora, entre cerca de 2 minutos e cerca de 40 minutos, entre cerca de minutos e cerca de 40 minutos, entre cerca de 20 minutos e cerca de 40 minutos ou entre cerca de 30 minutos e 1,0 hora). Exemplos não limitativos de tampões de eluição que podem ser usados nestes méto- dos dependerão da resina e/ou das propriedades biofísicas da proteí- na recombinante.
Por exemplo, um tampão de eluição pode incluir uma concentração diferente de sal (por exemplo, concentração au- mentada de sal), um pH diferente (por exemplo, uma concentração aumentada ou diminuída de sal) ou uma molécula que competirá com a proteína recombinante pela ligação à resina. Exemplos de tais tam- pões de eluição para cada um dos mecanismos de captura exemplifi- cativos descritos no presente documento são bem conhecidos na téc- nica.
[00248] Após a eluição da proteína recombinante da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante e antes que o próximo volume de fluido que inclui uma proteína recom- binante possa ser carregado em pelo menos uma coluna cromatográfi- ca ou membrana cromatográfica, a pelo menos uma coluna cromato- gráfica ou membrana cromatográfica deve ser equilibrada usando um tampão de regeneração. O tampão de regeneração pode ser passado através da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cro- matográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante em uma vazão, por exemplo, de entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto e cerca de 6,0 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 5,0 mg/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto, entre cerca de 5,0 mL/minuto a cerca de 15,0 mL/minuto ou entre cer- ca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume de tampão de regeneração usado para equilibrar a pelo menos uma coluna cro- matográfica ou membrana cromatográfica que inclui uma resina que pode ser usada para realizar a operação unitária de purificação da pro- teína recombinante pode estar, por exemplo, entre cerca de 1X o vo- lume de coluna (CV) a cerca de 15X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV a cerca de 14X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 13X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 12X CV, entre cerca de 1X CV a cer- ca de 11X CV, entre cerca de 2X CV a cerca de 11X CV, entre cerca de 3X CV a cerca de 11X CV, entre cerca de 2X CV a cerca de 5X CV, entre cerca de 2,5X CV a cerca de 7,5X CV, entre cerca de 4X CV a cerca de 11X CV, entre cerca de 5X CV a cerca de 11X CV ou entre cerca de 5X CV a cerca de 10X CV). A concentração de proteína re- combinante no eluato de pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica usada para realizar a operação unitária de purificação da proteína recombinante pode estar, por exemplo, entre cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de proteína recombinante (por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 90 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 80 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 70 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 60 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 40 mg/mL, entre cerca de 2,5 mg/mL e cerca de 7,5 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL ou entre cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 10 mg/mL de proteína recombinante).
[00249] A pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino da proteína recombinante pode incluir uma resina que pode ser usada para realizar cromatografia de troca catiônica, troca aniônica ou com peneiras moleculares. Conforme será reconhecido na técnica,
o refino de uma proteína recombinante usando a pelo menos uma co- luna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para executar a operação unitária de refino da proteína recombinante pode incluir, por exemplo, as etapas de carregamento, rastreamento e regeneração da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária para refinar a proteína recombinante. Por exemplo, quando as etapas de carregamento, rastreamento e regeneração são usadas para reali- zar o refino, a proteína recombinante não se liga à resina na pelo me- nos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que é usada para realizar a operação unitária de refino da proteína recombi- nante e a proteína recombinante é eluída da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica nas etapas de carrega- mento e rastreamento e a etapa de regeneração é usada para remover quaisquer impurezas de pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica antes que fluido adicional que inclui a prote- Ína recombinante possa ser carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica. Vazões e volumes de tampão exemplificativos a serem usados em cada uma das etapas de carregamento, rastreamento e regeneração são descritos abaixo.
[00250] O tamanho, o formato e o volume da pelo menos uma colu- na cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino da proteína recombinante e/ou o tamanho e o formato da pelo menos uma membrana cromato- gráfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino da proteína recombinante pode qualquer combinação dos tamanhos, formatos e volumes exemplificativos de colunas cromatográficas ou membranas cromatográficas descritas no presente documento. Por exemplo, o tamanho da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a opera-
ção unitária de refino da proteína recombinante pode ter um volume, por exemplo, de entre cerca de 0,5 mL a cerca de 200 mL (por exem- plo, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 180 mL, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 160 mL, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 140 mL, entre cer- ca de 0,5 mL a cerca de 120 mL, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 100 mL, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 80 mL, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 60 mL, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 40 mL, entre cerca de 5,0 mL a cerca de 40 mL, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 30 mL, entre cerca de 5,0 mL a cerca de 30 mL, entre cerca de 0,5 mL a cerca de 25 mL, entre cerca de 0,2 mL a cerca de 10 mL ou entre cerca de 0,2 mL a cerca de 5 mL). A vazão do fluido que inclui a proteína re- combinante quando ele é carregado na pelo menos uma coluna cro- matográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino da proteína recombinante pode estar, por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 25 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 12,5 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 10,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 8,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 6 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a 4 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 3 mL/minuto, entre cerca de 2 mL/minuto e cerca de 6 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 2 mL/minuto ou cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 4 mL/minuto). O volume total de fluido que inclui uma proteína re- combinante carregada na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a opera- ção unitária de refino da proteína recombinante pode estar, por exem- plo, entre cerca de 1,0 mL a cerca de 250 mL (por exemplo, entre cer- ca de 1,0 mL a cerca de 225 mL, entre cerca de 1,0 mL a cerca de 200 mL, entre cerca de 1,0 mL a cerca de 175 mL, entre cerca de 1,0mL a cerca de 150 mL, entre cerca de 100 mL a cerca de 125 mL, entre cer-
ca de 100 mL a cerca de 150 mL, entre cerca de 1,0 mL a cerca de 150 mL, entre cerca de 1,0 mL a cerca de 125 mL, entre cerca de 1,0 mL a cerca de 100 mL, entre cerca de 1,0 mL a cerca de 75 mL, entre cerca de 1,0 mL a cerca de 50 mL ou entre cerca de 1,0 mL a cerca de mL). A resina na pelo menos uma coluna cromatográfica ou mem- brana cromatográfica usada para realizar o refino pode ser uma resina de troca aniônica ou troca catiônica. A resina na pelo menos uma co- luna cromatográfica ou membrana cromatográfica que é usada para realizar a operação unitária de refino pode ser uma resina de troca ca- tiônica (por exemplo, resina Sartobind& Q, Sartorius, Goettingen, Ale- manha).
[00251] Após a etapa de carregamento, uma etapa de rastreamento é realizada (por exemplo, um tampão de rastreamento é passado atra- vés da pelo menos uma membrana cromatográfica ou membrana cro- matográfica para coletar a proteína recombinante que não se liga substancialmente à pelo menos uma coluna cromatográfica ou mem- brana cromatográfica). Nestes exemplos, o tampão de rastreamento pode ser passado através da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica em uma vazão entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 50 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 1 mL/minuto a cerca de 40 mL/minuto, entre cerca de 1 mL/minuto a cerca de 30 mL/minuto, entre cerca de 5 mL/minuto a cerca de 45 mL/minuto, entre cerca de 10 mL/minuto a cerca de 40 mL/minuto, en- tre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume do tampão de ras-
treamento usado pode estar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume de coluna (CV) a cerca de 100X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV a cerca de 90X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 80X CV, en- tre cerca de 1X CV a cerca de 70X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 60X CV, entre cerca de 1X a cerca de 50X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 40X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 30X CV, en- tre cerca de 1X CV a cerca de 20X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 15X CV, entre cerca de 5X CV a cerca de 20X CV, entre cerca de 5X CV a cerca de 30X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 14X CV, cerca de 1X CV a cerca de 13X CV, cerca de 1X CV a cerca de 12X CV, cerca de 1X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2X CV a cerca de 11X CV, cerca de 3X CV a cerca de 11X CV, cerca de 4X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2,5X CV a cerca de 5,0X CV, cerca de 5X CV a cerca de 11X CV ou cerca de 5X CV a cerca de 10X CV). O tempo to- tal de rastreamento pode estar, por exemplo, entre cerca de 1 minuto a cerca de 3 horas (por exemplo, entre cerca de 1 minuto a cerca de 2,5 horas, entre cerca de 1 minuto a cerca de 2,0 horas, entre cerca de 1 minuto a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,5 horas, entre cerca de 1 minuto a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 2 minutos a cerca de 1,25 horas, entre cerca de 1 minuto a cerca de 5 minutos, entre cerca de 1 minuto a cerca de 10 minutos, entre cerca de 2 minutos a cerca de 4 minutos, entre cerca de 30 minutos a cerca de 1 hora, entre cerca de 2 minutos a cerca de 10 minutos, entre cerca de 2 minutos a cerca de 15 minutos ou entre cerca de 2 minutos a cer- ca de 30 minutos). A concentração combinada de proteína recombi- nante presente no eluato proveniente da coluna na etapa de carrega- mento e na etapa de rastreamento pode estar, por exemplo, entre cer- ca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de proteína recombinante (por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 90 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 80 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 70 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 60 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 40 mg/mL, entre cerca de 2,5 mg/mL e cerca de 7,5 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 30 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 15 mg/mL, entre cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL, entre cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 10 mg/mL ou entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 5 mg/mL de proteína recombinante).
[00252] Após a etapa de rastreamento e antes que o próximo volu- me de fluido que inclui a proteína recombinante possa ser carregado na pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográ- fica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino, a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica deve ser regenerada usando um tampão de regeneração. O tampão de regeneração pode ser passado através da pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino da proteína recombinante em uma vazão, por exemplo, de entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 50 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 1 mL/minuto a cerca de 40 mL/minuto, entre cerca de 1 mL/minuto a cerca de 30 mL/minuto, entre cerca de 5 mL/minuto a cerca de 45 mL/minuto, entre cerca de 10 mL/minuto a cerca de 40 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 20 mL/minuto, entre cerca de 0,2 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 10 mL/minuto, entre cerca de 0,5 mL minuto e cerca de 14 mL/minuto, entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 25,0 mL/minuto ou entre cerca de 1,0 mL/minuto e cerca de 15,0 mL/minuto). O volume do tampão de regeneração usado para regene-
rar a pelo menos uma coluna cromatográfica ou membrana cromato- gráfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino pode estar, por exemplo, entre cerca de 1X o volume de coluna (CV) a cerca de 500X CV (por exemplo, entre cerca de 1X CV a cerca de 450X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 400X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 350X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 300X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 250X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 200X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 150X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 100X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 90X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 80X CV, entre cerca de 1X CV a cerca 70X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 60X CV, entre cerca de 1X a cerca de 50X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 40X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 30X CV, entre cerca de IX CV a cerca de 20X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 15X CV, entre cer- ca de 5X CV a cerca de 20X CV, entre cerca de 5X CV a cerca de 30X CV, entre cerca de 1X CV a cerca de 14X CV, cerca de 1X CV a cerca de 13X CV, cerca de 1X CV a cerca de 12X CV, cerca de IX CV a cerca de 11X CV, cerca de 2X CV a cerca de 11X CV, cerca de 3X CV a cerca de 11X CV, cerca de 4X CV a cerca de 11X CV, cerca de 2,5X CV a cerca de 5,0X CV, cerca de 5X CV a cerca de 11X CV ou cerca de 5X CV para cerca de 10X CV).
[00253] Em outros exemplos, a uma ou mais colunas cromatográfi- cas e/ou membranas cromatográficas usadas para realizar a operação unitária de refino incluem uma resina que se liga seletivamente ou re- tém as impurezas presentes em um fluido que inclui a proteína recom- binante e, em vez de regenerar a uma ou mais colunas e/ou membra- nas, a uma ou mais colunas e/ou membranas são substituídas (por exemplo, substituídas por (uma) coluna(s) e/ou membrana(s) substan- cialmente similar(es))), uma vez que a capacidade de ligação da resina à uma ou mais colunas e/ou membranas foi alcançada ou está subs-
tancialmente próximo de ser alcançada.
[00254] Em alguns exemplos destes processos descritos no presen- te documento, o MCCS?2 inclui um PCCS que inclui três colunas cro- matográficas e uma membrana cromatográfica, por exemplo, onde as três colunas cromatográficas no PCCS realizam a operação unitária de purificação da proteína recombinante (por exemplo, usando pelo me- nos (uma) coluna(s) cromatográfica(s) que pode(m) ser usada(s) para realizar a operação unitária de purificação da proteína) e a membrana cromatográfica no PCCS realiza a operação unitária de refino da prote- Ína recombinante. Nestes exemplos, a membrana cromatográfica no PCCS que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino da proteína terapêutica pode ser qualquer uma das membranas cro- matográficas exemplificativas descritas no presente documento que podem ser usadas para realizar a operação unitária de refino da prote- Ína recombinante. Qualquer um dos métodos de troca de coluna des- critos no presente documento pode ser usado para determinar quando as três primeiras colunas cromatográficas e a membrana cromatográfi- ca no PCCS neste exemplo podem ser trocadas.
[00255] Algumas modalidades deste exemplo podem incluir ainda uma etapa de ajuste da concentração iônica e/ou pH do eluato das três colunas cromatográficas no PCCS antes do eluato ser alimentado na membrana cromatográfica no PCCS. Conforme descrito no presen- te documento, a concentração iônica e/ou pH do eluato das três colu- nas cromatográficas em PCCS pode ser ajustado (antes de ser ali- mentado na membrana cromatográfica no PCCS neste exemplo)) me- diante a adição de um tampão ao eluato proveniente das três colunas cromatográficas no PCCS (por exemplo, através do uso de um reser- vatório de ajuste de tampão em linha). O tampão pode ser adicionado ao eluato em uma vazão, por exemplo, de entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 15 mL/minuto (por exemplo, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 12,5 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 10,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 8,0 mL/minuto, entre cerca de 0,1 mL/minuto a cerca de 6 mL/minuto, en- tre cerca de 0,1 mL/minuto a 4 mL/minuto ou entre cerca de 0,5 mL/minuto a cerca de 5 mL/minuto).
[00256] Estes exemplos podem incluir ainda uma etapa de manter ou armazenar o eluato proveniente das três colunas cromatográficas no PCCS neste exemplo antes de alimentar o eluato na membrana cromatográfica (membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino da proteína recombinante). Con- forme descrito no presente documento, esta etapa de retenção ou ar- mazenamento pode ser realizada usando qualquer um dos reservató- rios (por exemplo, tanques de contenção) descritos no presente docu- mento.
[00257] Estes exemplos também podem incluir uma etapa de filtrar o eluato da membrana cromatográfica no sistema PCCS exemplificati- vo (eluato proveniente da membrana cromatográfica que pode ser usada para realizar a operação unitária de refino da proteína recombi- nante). Qualquer um dos filtros ou métodos exemplificativos para filtra- ção descritos no presente documento podem ser usados para filtrar o eluato da membrana cromatográfica neste PCCS exemplar (eluato da membrana cromatográfica que pode ser usado para realizar a opera- ção unitária de refino da proteína recombinante).
[00258] “Conforme será reconhecido por aqueles na técnica, a prote- Ína recombinante purificada pode ser periodicamente eluída do MCCS ou MCCS2 usando qualquer um dos processos descritos no presente documento. Por exemplo, qualquer um dos processos descritos no presente documento pode eluir a proteína recombinante purificada du- rante um período, por exemplo, de entre cerca de 30 segundos e cerca de 5 horas (por exemplo, entre cerca de 1 minuto e cerca de 4 horas,
entre cerca de 1 minuto e cerca de 3 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 2 horas, entre cerca de 1 minuto ou cerca de 1,5 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 1 hora ou entre cerca de 1 minuto e cer- ca de 30 minutos) a uma frequência de, por exemplo, entre cerca de 1 minuto e cerca de 6 horas (por exemplo, entre cerca de 1 minuto e cerca de 5 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 4 horas, entre cerca de 1 minuto e cerca de 3 horas, entre cerca de 1 minuto e 2 ho- ras, entre cerca de 1 minuto e 1 hora ou entre cerca de 1 minuto e 30 minutos), dependendo, por exemplo, da(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou membrana(s) cromatográfica(s) usadas no MCCS ou no MCCS1 e MCCS?2.
Métodos de Cultura
[00259] Alguns dos processos descritos no presente documento incluem ainda uma etapa de cultura de células (por exemplo, células recombinantes de mamífero) que secretam uma proteína recombinan- te em um biorreator (por exemplo, um biorreator de perfusão ou de alimentação descontínua) que inclui um meio de cultura líquido, em que um volume do meio de cultura líquido que é substancialmente isento de células (por exemplo, células de mamíferos) é contínua ou periodicamente removido do biorreator (por exemplo, biorreator de per- fusão) e alimentado no MCCS ou MCCS1. O biorreator pode ter um volume, por exemplo, de entre cerca de 1 L a cerca de 10.000 L (por exemplo, entre cerca de 1 L a cerca de 50 L, entre cerca de 50 L a cerca de 500 L, entre cerca de 500 L a cerca de 1000 L, entre 500 L, L a cerca de 5000L, entre cerca de 500 L a cerca de 10.000 L, entre cer- ca de 5000 L a cerca de 10.000 L, entre cerca de 1 L e cerca de
10.000 L, entre cerca de 1L e cerca de 8.000 L, entre cerca de 1L e cerca de 6.000 L, entre cerca de 1 L e cerca de 5.000 L, entre cerca de 100 L e cerca de 5.000 L, entre cerca de 10 L e cerca de 100 L, entre cerca de 10 L e cerca de 4.000 L, entre cerca de 10 L e cerca de 3.000
L, entre cerca de 10 L e cerca de 2.000 L ou entre cerca de 10 L e cer- ca de 1.000 L). A quantidade de meio de cultura líquido presente em um biorreator pode ser, por exemplo, entre cerca de entre cerca de 0,5 L a cerca de 5.000 L (por exemplo, entre cerca de 0,5 L a cerca de 25 L, entre cerca de 25 L a cerca de 250 L, entre cerca de 250 L a cerca de 500 L, entre 250 L a cerca de 2500 L, entre cerca de 250 L a cerca de 5.000 L, entre cerca de 2500 L a cerca de 5.000 L, entre cerca de 0,5 L e cerca de 5.000 L, entre cerca de 0,5 L e cerca de 4.000 L, en- tre cerca de 0,5 L e cerca de 3.000 L, entre cerca de 0,5 L e cerca de
2.500 L, entre cerca de 50 L e cerca de 2.500 L, entre cerca de 5L e cerca de 50 L, entre cerca de 5 L e cerca de 2.000 L, entre cerca de 5 L e cerca de 1.500 L, entre cerca de 5 L e cerca de 1.000 L ou entre cerca de 5 L e cerca de 500 L). A cultura de células pode ser realiza- da, por exemplo, usando um biorreator de alimentação descontínua ou um biorreator de perfusão. Exemplos não limitativos e diferentes as- pectos da cultura de células (por exemplo, cultura de células de mamí- feros) são descritos abaixo e podem ser usados em qualquer combi- nação.
Células
[00260] As células que são cultivadas em alguns dos processos descritos no presente documento podem ser bactérias (por exemplo, bactérias Gram negativas), leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisó, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica ou Arxula adeninivorans) ou células de mamíferos. A célula de mamífero pode ser uma célula que cresce em suspensão ou uma célula aderente. Exemplos não limitativos de células de mamíferos que podem ser cul- tivadas em qualquer um dos processos descritos no presente docu- mento incluem: células de ovário de hamster chinês (CHO) (por exem- plo, células CHO DG44 ou células CHO-K1s), Sp2.0, células de mi-
eloma (por exemplo, NS/0), células B, células de hibridoma, células T, células de rim embrionário humano (HEK) (por exemplo, HEK 293E e HEK 293F), células epiteliais de rim de macaco verde Africano (Vero) e células caninas Madin-Darby (Cocker Spaniel), células epiteliais re- nais (MDCK). Em alguns exemplos em que uma célula aderente é cul- tivada, a cultura também pode incluir uma pluralidade de microportado- res (por exemplo, microportadores que incluem um ou mais poros). Células de mamífero adicionais que podem ser cultivadas em qualquer um dos processos descritos no presente documento são conhecidas na técnica.
[00261] A célula de mamífero pode incluir um ácido nucleico re- combinante (por exemplo, um ácido nucleico integrado de forma está- vel no genoma da célula de mamífero) que codifica uma proteína re- combinante (por exemplo, uma proteína recombinante). Exemplos não limitativos de ácidos nucleicos recombinantes que codificam proteínas recombinantes exemplificativas são descritos abaixo, assim como pro- teínas recombinantes que podem ser produzidas usando os métodos descritos no presente documento. Em alguns casos, a célula de mamí- fero que é cultivada em um biorreator (por exemplo, qualquer um dos biorreatores descritos no presente documento) foi derivada de uma cultura maior.
[00262] Um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante pode ser introduzido em uma célula de mamífero usando uma ampla variedade de métodos conhecidos em biologia molecular e genética molecular. Exemplos não limitativos incluem transfecção (por exemplo, lipofecção), transdução (por exemplo, infecção por lentivírus, adenoví- rus ou retrovírus) e eletroporação. Em alguns casos, o ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante não está integrado de forma estável em um cromossomo da célula de mamífero (transfecção transi- tória) enquanto que, em outros, o ácido nucleico está integrado. Alter-
nativa ou adicionalmente, o ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante pode estar presente em um plasmídeo e/ou em um cro- mossomo artificial de mamífero (por exemplo, um cromossomo artifici- al humano). Alternativamente ou além disso, o ácido nucleico pode ser introduzido na célula usando um vetor viral (por exemplo, um vetor de lentivírus, retrovírus ou adenovírus). O ácido nucleico pode ser opera- tivamente ligado a uma sequência promotora (por exemplo, um promo- tor forte, tal como um promotor de B-actina e um promotor de CMV ou um promotor indutível). Um vetor que inclui o ácido nucleico também pode, se desejado, incluir um marcador selecionável (por exemplo, um gene que confere resistência à higromicina, puromicina ou neomicina à célula de mamífero).
[00263] Em alguns casos, a proteína recombinante é uma proteína secretada e é liberada pela célula de mamífero no meio extracelular (por exemplo, os primeiro e/ou segundo meios de cultura líquido). Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteí- na recombinante solúvel pode incluir uma sequência que codifica um peptídeo sinalizador de secreção no N ou C término da proteína re- combinante, a qual é clivada por uma enzima presente na célula de mamífero e subsequentemente liberada no meio extracelular (por exemplo, os primeiro e/ou segundo meios de cultura líquido). Meio de Cultura
[00264] Meios de cultura líquidos são conhecidos na técnica. O meio de cultura líquido (por exemplo, um primeiro e/ou segundo meio de cultura de tecido) pode ser suplementado com um soro de mamiífe- ro (por exemplo, soro fetal de bezerro e soro bovino) e/ou um hormô- nio de crescimento ou fator de crescimento (por exemplo, insulina, transferrina e fator de crescimento epidérmico). Alternativamente ou além disso, o meio de cultura líquido (por exemplo, um primeiro e/ou segundo meio de cultura líquido) pode ser um meio de cultura líquido quimicamente definido, um meio de cultura líquido isento de compo- nente derivado de animal, um meio de cultura líquido isento soro ou um meio de cultura líquido que contém soro. Exemplos não limitativos de meios de cultura líquidos quimicamente definidos, meios de cultura líquidos isentos componentes derivados de animais, meios de cultura líquidos isentos soro e meios de cultura líquidos que contêm soro es- tão comercialmente disponíveis.
[00265] Um meio de cultura líquido normalmente inclui uma fonte de energia (por exemplo, um carboidrato, tal como glicose), aminoácidos essenciais (por exemplo, o conjunto básico de vinte aminoácidos mais cisteína), vitaminas e/ou outros compostos orgânicos necessários em baixas concentrações, ácidos graxos e/ou oligoelementos. O meio de cultura líquido (por exemplo, um primeiro e/ou segundo meio de cultu- ra líquido) pode, se desejado, ser suplementado, por exemplo, com um hormônio de mamífero ou fator de crescimento (por exemplo, insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais e tampões (por exemplo, sais de cálcio, magnésio e fosfato), nucleosídeos e bases (por exemplo, adenosina, timidina e hipoxantina), proteína e hidrolisa- dos teciduais e/ou qualquer combinação destes aditivos.
[00266] Uma grande variedade de diferentes meios de cultura líqui- dos que podem ser usados para cultivar células (por exemplo, células de mamíferos) em qualquer um dos métodos descritos no presente documento são conhecidos na técnica. Componentes do meio que também podem ser úteis nos presentes processos incluem, porém sem limitações, hidrolisados quimicamente definidos (CD), por exem- plo, peptona CD, polipeptídeos CD (dois ou mais aminoácidos) e fato- res de crescimento CD. Exemplos adicionais de meio de cultura teci- dual líquido e componentes do meio são conhecidos na técnica.
[00267] Aqueles versados na técnica reconhecerão que o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido descritos no presente documento podem ser o mesmo tipo de meio ou meios diferentes. Características Adicionais de Biorreatores Exemplificativos
[00268] A superfície interna de qualquer um dos biorreatores descri- tos no presente documento pode ter pelo menos um revestimento (por exemplo, pelo menos um revestimento de gelatina, colágeno, poli-L- ornitina, poliestireno e laminina) e, conforme é conhecido na técnica, uma ou mais aberturas para a pulverização de O2, CO? e N2> no meio de cultura líquido e um mecanismo de agitação para agitar o meio de cultura líquido. O biorreator pode incubar a cultura de células em uma atmosfera umidificada controlada (por exemplo, em uma umidade aci- ma de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % ou umidade de 100 %). O biorreator também pode ser equi- pado com um dispositivo mecânico que é capaz de remover um volu- me de meio de cultura líquido do biorreator e, opcionalmente, um filtro dentro do dispositivo mecânico que remove as células do meio de cul- tura líquido durante o processo de transferência do meio de cultura líquido para fora do biorreator (por exemplo, um sistema ATF ou o sis- tema de filtração de células descrito no Pedido de Patente Provisório Norte-Americano Nº de Série 61/878.502). Temperatura
[00269] A etapa de cultura de células de mamíferos pode ser reali- zada em uma temperatura de cerca de 31ºC a cerca de 40ºC. Aqueles versados na técnica reconhecerão que a temperatura pode ser altera- da em pontos de tempo específicos durante a etapa de cultura, por exemplo, de hora em hora ou diariamente. Por exemplo, a temperatura pode ser alterada ou deslocada (por exemplo, aumentada ou diminuí- da) em cerca de um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, sete dias, oito dias, nove dias, dez dias, onze dias, doze di- as, quatorze dias, quinze dias, dezesseis dias, dezessete dias, dezoito dias, dezenove dias ou cerca de vinte dias ou mais após a semeadura inicial do biorreator com a célula (por exemplo, célula de mamífero). Por exemplo, a temperatura pode ser deslocada para cima (por exem- plo, uma variação de até ou cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou até ou cerca de 20ºC). Por exemplo, a temperatura pode ser deslocada para baixo (por exemplo, uma mudança de até ou cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou até cerca de 20ºC).
CO
[00270] A etapa de cultura no presente documento descrita pode incluir ainda expor o meio de cultura líquido no biorreator a uma at- mosfera que inclui no máximo ou cerca de 15 % de CO» (por exemplo, no máximo ou cerca de 14 % de CO», 12 % de CO», 10 % de CO», 8 % de CO, 6 % de CO», 5 % de CO», 4 % de CO>, 3 % de CO», 2 % de CO, ou no máximo ou cerca de 1 % de CO>). Biorreator de Perfusão
[00271] A etapa de cultura descrita no presente documento pode ser realizada usando um biorreator de perfusão. A cultura de uma cé- lula (por exemplo, uma célula de mamífero) em um biorreator de per- fusão inclui remover do biorreator de um primeiro volume de um pri- meiro meio de cultura líquido (por exemplo, que inclui qualquer con- centração de células de mamíferos, por exemplo, um primeiro volume de um primeiro meio de cultura líquido que é substancialmente isento de células) e adicionar ao primeiro meio de cultura líquido um segundo volume de um segundo meio de cultura líquido. A remoção e adição podem ser realizadas simultânea ou sequencialmente ou uma combi- nação de ambos. Além disso, a remoção e adição podem ser realiza-
das continuamente (por exemplo, em uma taxa que remove e substitui um volume entre 0,1 % a 800 % (por exemplo, entre 1 % e 700 %, en- tre 1 % e 600 %, entre 1 % e 500 %, entre 1 % e 400 %, entre 1% e 350 %, entre 1 % e 300 %, entre 1 % e 250 %, entre 1 % e 100 %, en- tre 100 % e 200 %, entre 5 % e 150 %, entre 10 % e 50 %, entre 15 % e 40 %, entre 8 % e 80 % ou entre 4 % e 30 %) do volume do biorrea- tor ou o primeiro volume de meio de cultura líquido ao longo de qual- quer período de tempo (por exemplo, ao longo de um período de 24 horas, ao longo de um período de tempo incremental de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas ou ao longo de um período de tempo incre- mental de mais de 24 horas)) ou periodicamente (por exemplo, uma vez a cada três dias, uma vez a cada dois dias, uma vez por dia, duas vezes por dia, três vezes por dia, quatro vezes por dia ou cinco vezes por dia) ou qualquer combinação de ambos.
Quando realizado periodi- camente, o volume que é removido ou substituído (por exemplo, den- tro de um período de cerca de 24 horas, dentro de um tempo incre- mental período de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas ou dentro de um período de tempo incremental de mais de 24 horas) pode ser, por exemplo, entre 0,1 % a 800 % (por exemplo, entre 1 % e 700 %, entre 1 % e 600 %, entre 1 % e 500 %, entre 1 % e 400 %, entre 1 % e 300 %, entre 1 % e 200 %, entre 1 % e 100 %, entre 100 % e 200 %, entre % e 150 %, entre 10 % e 50 %, entre 15 % e 40 %, entre 8 % e 80 % ou entre 4 % e 30 %) do volume do biorreator ou do volume do primei- ro meio de cultura líquido.
O primeiro volume do primeiro meio de cul- tura líquido removido e o segundo volume do segundo meio de cultura líquido adicionado pode, em alguns casos, ser mantido aproximada- mente o mesmo ao longo de cada período de 24 horas (ou, alternati- vamente, um período de tempo incremental de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas ou um período de tempo incremental superior a 24 horas) ao longo de todo ou parte do período de cultura.
Conforme é conheci-
do na técnica, a taxa na qual o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido é removido (volume/unidade de tempo) e a taxa na qual o segundo volume do segundo meio de cultura líquido é adicionado (volume/unidade de tempo) podem ser variadas. A taxa na qual o pri- meiro volume do primeiro meio de cultura líquido é removido (volu- me/unidade de tempo) e a taxa na qual o segundo volume do segundo meio de cultura líquido é adicionado (volume/unidade de tempo) po- dem ser aproximadamente as mesmas ou podem ser diferentes.
[00272] —Alternativamente, o volume removido e adicionado pode mudar (por exemplo, aumentar gradualmente) ao longo de cada perío- do de 24 horas (ou alternativamente, um período de tempo incremental de entre 1 hora e cerca de 24 horas ou um período de tempo incre- mental de mais de 24 horas) durante o período de cultura. Por exem- plo, o volume do primeiro meio de cultura líquido removido e o volume do segundo meio de cultura líquido adicionado dentro de cada período de 24 horas (ou alternativamente, um período de tempo incremental de cerca de 1 hora e acima de 24 horas ou um período de tempo incre- mental acima de 24 horas) ao longo do período de cultura pode ser aumentado (por exemplo, gradualmente ou através de incrementos escalonados) ao longo do período de cultura de um volume que está entre 0,5 % a cerca de 20 % do volume do biorreator ou o primeiro vo- lume do meio de cultura líquido a cerca de 25 % a cerca de 150 % do volume do biorreator ou o volume do primeiro meio de cultura líquido.
[00273] Aqueles versados na técnica reconhecerão que o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido podem ser o mesmo tipo de meio. Em outros casos, o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido podem ser diferentes.
[00274] O primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido pode ser removido, por exemplo, por um sistema mecânico que pode remo- ver o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido do biorreator
(por exemplo, o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido que é substancialmente isento de células do biorreator). Alternativa- mente ou além disso, o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido pode ser removido por meio de infiltração ou fluxo de gravidade do primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido através de uma membrana estéril que possui um peso molecular de corte que exclui a célula (por exemplo, célula de mamífero).
[00275] O segundo volume do segundo meio de cultura líquido po- de ser adicionado ao primeiro meio de cultura líquido de uma forma automatizada, por exemplo, através de bomba de perfusão.
[00276] Em alguns casos, remover o primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido (por exemplo, um primeiro volume do primeiro meio de cultura líquido que é substancialmente isento de células de mamíferos) e adicionar ao primeiro meio de cultura líquido um segun- do volume do segundo meio de cultura líquido não ocorre dentro de pelo menos 1 hora (por exemplo, dentro de 2 horas, dentro de 3 horas, dentro de 4 horas, dentro de 5 horas, dentro de 6 horas, dentro de 7 horas, dentro de 8 horas, dentro de 9 horas, dentro de 10 horas, den- tro de 12 horas, dentro de 14 horas, dentro de 16 horas, dentro de 18 horas, dentro de 24 horas, dentro de 36 horas, dentro de 48 horas, dentro de 72 horas, dentro de 96 horas ou após 96 horas) de cultura do biorreator com uma célula de mamífero. Biorreator de Alimentação Descontínua
[00277] A etapa de cultura descrita no presente documento pode ser realizada usando um biorreator de alimentação descontínua. A cul- tura de uma célula em um biorreator de alimentação descontínua in- clui, durante a maior parte do período de cultura, a adição (por exem- plo, adição periódica ou contínua) ao primeiro meio de cultura líquido de um segundo volume de um segundo meio de cultura líquido. A adi- ção do segundo meio de cultura líquido pode ser realizada continua-
mente (por exemplo, em uma taxa que adiciona um volume entre 0,1 % a 300 % (por exemplo, entre 1 % e 250 %, entre 1 % e 100 %, entre 100 % e 200 %, entre 5 % e 150 %, entre 10 % e 50 %, entre 15% e 40 %, entre 8 % e 80 % ou entre 4 % e 30 %) do volume do biorreator ou do volume médio do primeiro meio de cultura líquido ao longo de qualquer período de tempo (por exemplo, ao longo de um período de 24 horas, ao longo de um período de tempo incremental de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas ou ao longo de um período de tempo incre- mental de mais de 24 horas)) ou periodicamente (por exemplo, uma vez a cada três dias, uma vez a cada dois dias, uma vez por dia, duas vezes por dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia ou cinco vezes ao dia) ou qualquer combinação dos mesmos.
Quando realizado peri- odicamente, o volume que é adicionado (por exemplo, dentro de um período de cerca de 24 horas, dentro de um período de tempo incre- mental de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas ou dentro de um perío- do de tempo incremental de mais de 24 horas) pode estar, por exem- plo, entre 0,1 % a 300 % (por exemplo, entre 1 % e 200 %, entre 1% e 100 %, entre 100 % e 200 %, entre 5 % e 150 %, entre 10 % e 50 %, entre 15 % e 40 %, entre 8 % e 80 % ou entre 4 % e 30 %) do volume do biorreator ou do volume do primeiro meio de cultura líquido.
O se- gundo volume do segundo meio de cultura líquido adicionado pode, em alguns casos, ser mantido aproximadamente o mesmo ao longo de cada período de 24 horas (ou, alternativamente, um período de tempo incremental de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas ou um período de tempo incremental maior que 24 horas) durante todo ou parte do perí- odo de cultivo.
Conforme é conhecido na técnica, a taxa na qual o se- gundo volume do segundo meio de cultura líquido é adicionado (volu- me/unidade de tempo) pode ser variada ao longo de todo ou parte do período de cultura.
Por exemplo, o volume do segundo meio de cultura líquido adicionado pode mudar (por exemplo, aumentar gradualmente)
ao longo de cada período de 24 horas (ou alternativamente, um perío- do de tempo incremental de entre 1 hora e cerca de 24 horas ou um período de tempo incremental acima de 24 horas) durante o período de cultura. Por exemplo, o volume do segundo meio de cultura líquido adicionado dentro de cada período de 24 horas (ou alternativamente, um período de tempo incremental de cerca de 1 hora e acima de 24 horas ou um período de tempo incremental de mais de 24 horas) ao longo do período de cultura pode ser aumentado (por exemplo, gradu- almente ou através de incrementos escalonados) ao longo do período de cultura de um volume que está entre 0,5 % a cerca de 20 % do vo- lume do biorreator ou do volume do primeiro meio de cultura líquido a cerca de 25 % a cerca de 150 % do volume do biorreator ou o primeiro volume de meio de cultura líquido. A taxa na qual o segundo volume do segundo meio de cultura líquido é adicionado (volume/unidade de tempo) pode ser aproximadamente a mesma ao longo de todo ou par- te do período de cultura.
[00278] Aqueles versados na técnica reconhecerão que o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido podem ser o mesmo tipo de meio. Em outros casos, o primeiro meio de cultura líquido e o segundo meio de cultura líquido podem ser diferentes. O volume do segundo meio de cultura líquido pode ser adicionado ao primeiro meio de cultura líquido de uma forma automatizada, por exemplo, através de bomba de perfusão.
[00279] Em alguns casos, adicionar ao primeiro meio de cultura lí- quido um segundo volume do segundo meio de cultura líquido não ocorre dentro de pelo menos 1 hora (por exemplo, dentro de 2 horas, dentro de 3 horas, dentro de 4 horas, dentro de 5 horas, dentro de 6 horas, dentro de 7 horas, dentro de 8 horas, dentro de 9 horas, dentro de 10 horas, dentro de 12 horas, dentro de 14 horas, dentro de 16 ho- ras, dentro de 18 horas, dentro de 24 horas, dentro de 36 horas, den-
tro de 48 horas, dentro de 72 horas, dentro 96 horas ou após 96 horas) da semeadura do biorreator com uma célula de mamífero. O meio de cultura de células em culturas de alimentação descontínua é, tipica- mente, coletado no final do período de cultura e usado em qualquer um dos processos descritos no presente documento, no entanto, o meio de cultura de células em culturas de alimentação descontínua também pode ser coletado em um ou mais pontos de tempo durante o período de cultura e usado em qualquer um dos processos descritos no presente documento.
[00280] Aqueles versados na técnica reconhecerão que qualquer um dos vários parâmetros de cultura (por exemplo, recipientes, volu- mes, taxas ou frequências de substituição de volumes de cultura, fre- quências de agitação, temperaturas, meios e concentrações de CO») podem ser usados em qualquer combinação para realizar estes méto- dos. Além disso, qualquer uma das células de mamífero descritas no presente documento ou conhecidas na técnica pode ser usada para produzir uma proteína recombinante. Sistemas de Produção Biológica Exemplificativos
[00281] Exemplos de sistemas de produção biológica úteis para rea- lizar os processos descritos no presente documento e que incluem um MCCS ou um MCCS1 e MCCS?2 são descritos no Pedido de Patente Provisório Norte-Americano com os Números de Série 61/775.060 e 61/856.390 (incorporados a título de referência). Nestes sistemas exemplificativos, pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis) uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida fornecida no presente documento está presen- te no MCCS ou no MCCS1 e/ou MCCS?2. Por exemplo, todo o sistema pode incluir um total de duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoi- to, dezenove ou vinte das colunas cromatográficas empacotadas com biocarga reduzida fornecidas no presente documento. Por exemplo, o MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2 podem incluir (ou cada um pode incluir) uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez das colu- nas cromatográficas empacotadas com biocarga reduzida fornecidas no presente documento.
[00282] Por exemplo, os sistemas úteis podem incluir um MCCS1 que inclui uma entrada e um MCCS2 que inclui uma saída ou um MCCS que inclui uma entrada e uma saída. Em algumas modalidades, o MCCS1 e o MCCS?2 estão em comunicação fluídica um com o outro. Estes sistemas também podem ser configurados de modo que o fluido possa ser passado para a entrada, através do MCCS1 e MCCS? e sair do sistema de produção pela saída. Estes sistemas permitem a produ- ção contínua e eficiente em termos de tempo de uma substância me- dicamentosa terapêutica a partir de um meio de cultura líquido. Por exemplo, o tempo decorrido entre a alimentação de um fluido (por exemplo, um meio de cultura líquido) que inclui uma proteína terapêu- tica no MCCS1 e a eluição da proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa de proteína terapêutica) da saída do MCCS?2 pode estar, por exemplo, entre cerca de 4 horas e cerca de 48 horas, inclusive.
[00283] Alguns sistemas exemplificativos não incluem um tanque de contenção. Em outros, o sistema pode incluir um máximo de 1, 2,3,4 ou 5 tanques de contenção em todo o sistema (por exemplo, onde ca- da tanque de contenção contém apenas uma proteína terapêutica du- rante um período total, por exemplo, de entre cerca de 5 minutos e cerca de 6 horas, inclusive). O(s) tanque(s) de fragmentação pode(m) ter uma capacidade que está entre 1 mL e cerca de 300 mL, inclusive. Quaisquer tanques de fragmentação localizados no sistema de modo que o fluido entre no(s) tanque(s) de fragmentação antes de entrar no MCCS1 ou MCCS pode ter uma capacidade que está entre 1 mL e cerca de 100 %, inclusive, do volume de carregamento da primeira co- luna do MCCS1 ou MCCS, respectivamente. Quaisquer tanques de fragmentação localizados no sistema de modo que o fluido entre no(s) tanque(s) de fragmentação antes de entrar no MCCS?2 (e após sair do MCCS1) pode ter uma capacidade que está, por exemplo, entre 1 mL e cerca de 100 %, inclusive, do volume de carregamento da primeira coluna do MCCS?2. Estruturas e Características Exemplificativas Adicionais do Sis- tema
[00284] O MCCS ou MCCS1 pode incluir uma entrada através da qual o fluido (por exemplo, um meio de cultura líquido que é substan- cialmente isento de células) pode ser passado para o MCCS ou MCCS1, respectivamente. A entrada pode ser qualquer estrutura co- nhecida na técnica para tais finalidades. Ela pode incluir, por exemplo, uma rosca, nervura ou uma vedação que permite que um duto de flui- do seja inserido, de modo que, após inserção do duto de fluido na en- trada, o fluido entre no MCCS ou MCCS1 através da entrada sem infil- tração significativa de fluido para fora da entrada. Entradas não limita- tivas que podem ser usadas nos presentes sistemas são conhecidas e serão entendidas por aqueles versados na técnica.
[00285] —OMCCS ou MCCS1 pode incluir pelo menos duas colunas cromatográficas, pelo menos duas membranas cromatográficas ou pe- lo menos uma coluna cromatográfica e pelo menos uma membrana cromatográfica e uma entrada. O MCCS ou MCCS1 pode ser qualquer um dos MCCSs exemplificativos descritos no presente documento ou ter um ou mais de qualquer uma das características exemplificativas de um MCCS (em qualquer combinação) descritas no presente docu- mento. A(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou membrana(s) cromato- gráfica(s) presente(s) no MCCS ou MCCS1 pode(m) ter um ou mais de qualquer um dos formatos, tamanhos, volumes (volumes de leito) e/ou operação(ões) unitária(s) exemplificativos descritos no presente do- cumento.
[00286] A(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou a(s) membrana(s) cromatográfica(s) presentes no MCCS ou MCCS1 pode(m) incluir uma ou mais de qualquer uma das resinas exemplificativas descritas no presente documento ou conhecidas na técnica. Por exemplo, a resina incluída em uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membra- na(s) cromatográfica(s) presente(s) no MCCS ou MCCS1 pode ser uma resina que usa um mecanismo de captura (por exemplo, meca- nismo de captura por ligação à proteína A, mecanismo de captura por ligação à proteína G, mecanismo de captura por ligação a anticorpo ou fragmento de anticorpo, mecanismo de captura por ligação a substra- to, mecanismo de captura por ligação a cofator, mecanismo de captura por ligação a aptâmero e/ou mecanismo de captura por ligação a mar- cador). A resina incluída em uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membrana(s) cromatográfica(s) do MCCS ou MCCS1 pode ser uma resina de troca catiônica, uma resina de troca aniônica, uma resi- na de peneiras moleculares ou uma resina de interação hidrofóbica ou qualquer combinação das mesmas. Exemplos adicionais de resinas que podem ser usadas para purificar uma proteína recombinante são conhecidos na técnica e podem ser incluídos em uma ou mais das co- lunas cromatográficas e/ou membrana(s) cromatográfica(s) presentes no MCCS ou MCCS1. A(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou membra- na(s) cromatográfica(s) presentes no MCCS ou MCCS1 podem incluir as mesmas e/ou resinas diferentes (por exemplo, qualquer uma das resinas descritas no presente documento ou conhecidas na técnica para uso na purificação de proteínas recombinantes).
[00287] As duas ou mais colunas cromatográficas e/ou resina(s) cromatográfica(s) presente(s) no MCCS ou MCCS1 podem realizar uma ou mais operações unitárias (por exemplo, capturar uma proteína recombinante, purificar uma proteína recombinante, refinar uma prote- íÍna recombinante, inativar vírus, ajustar a concentração iônica e/ou pH de um fluido que inclui a proteína recombinante ou filtrar um fluido que inclui uma proteína recombinante). Em exemplos não limitativos, o MCCS ou MCCS1 pode realizar as operações unitárias de captura de uma proteína recombinante a partir de um fluido (por exemplo, um meio de cultura líquido) e inativação de vírus presentes no fluido que inclui a proteína recombinante. O MCCS ou MCCS1 pode realizar quaisquer combinações de duas ou mais operações unitárias descritas no presente documento ou conhecidas na técnica.
[00288] —A(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou membrana(s) croma- tográfica(s) presentes no MCCS ou MCCS1 podem ser conectadas ou trocadas entre si através de um mecanismo de comutação (por exem- plo, um mecanismo de comutação de coluna). O MCCS ou MCCS1 também pode incluir uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro ou cinco) bombas (por exemplo, automatizadas, por exemplo, bombas peristálticas automatizadas). Os eventos de troca de coluna podem ser desencadeados pela detecção de um nível de proteína recombinante detectado através de absorbância de UV que corresponde a um de- terminado nível de proteína recombinante no fluido que passa através do MCCS ou MCCS1 (por exemplo, a entrada e/ou eluato proveniente de uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas croma- tográficas no MCCS ou MCCS1), um volume específico de líquido (por exemplo, tampão) ou um tempo específico decorrido. A troca de colu- na geralmente significa um mecanismo pelo qual pelo menos duas co- lunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas diferentes em um MCCS ou MCCS1 (por exemplo, duas ou mais colunas cromato- gráficas e/ou membranas cromatográficas diferentes presentes no MCCS1 ou MCCS2) podem passar para uma etapa diferente (por exemplo, equilíbrio, carregamento, eluição ou lavagem) substancial-
mente ao mesmo tempo durante pelo menos parte do processo.
[00289] OMCCS ou MCCS1 pode ser um sistema de cromatografia em contracorrente periódica (PCCS). Por exemplo, o PCCS que é o MCCS ou MCCS1 (ou seja, PCCS ou PCCS1, respectivamente) pode incluir quatro colunas cromatográficas, onde as três primeiras colunas executam a operação unitária de captura de uma proteína recombinan- te de um fluido (por exemplo, um meio de cultura líquido) e a quarta coluna do PCCS realiza a operação unitária de inativação de vírus no fluido que inclui a proteína recombinante. Um PCCS que é o MCCS ou MCCS1 pode usar um mecanismo de troca de coluna. O sistema PCC pode usar um sistema ÁKTA modificado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de funcionar até, por exemplo, quatro, cinco, seis, sete ou oito colunas ou mais.
[00290] O MCCS ou MCCS1 pode ser equipado com: um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) monitores de UV, uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) válvulas, um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) medidores de pH e/ou um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, no- ve ou dez) medidores de condutividade. O MCCS ou MCCS1 também pode ser equipado com um sistema operacional que usa um software (por exemplo, software com base em Unicorn, GE Healthcare, Pisca- taway, NJ) para detectar quando uma troca de coluna deve ocorrer (por exemplo, com base na absorção de UV, volume de líquido ou tempo decorrido) e que afeta (aciona) os eventos de troca de coluna.
[00291] O MCCS ou MCCS1 pode ainda incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, do- ze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três ou vinte e quatro) reservató- rio(s) de ajuste de tampão e/ou reservatório(s) de tampão em linha.
Em outros exemplos, o MCCS ou MCCS1 pode incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) tanques de fragmentação que podem conter fluido que não pode passar facilmente em uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromatográficas no MCCS ou MCCS1. Os sistemas descritos no presente documento podem incluir um ou mais tanques de fragmentação (por exemplo, um tanque de fragmentação descrito no presente documento) no MCCS, MCCS1 e/ou MCCS2. Outros exemplos dos sistemas descritos no presente documento não incluem um tanque de fragmentação no MCCS, MCCS1 ou MCCS2 ou não incluem um tanque de fragmenta- ção em todo o sistema. Outros exemplos dos sistemas descritos no presente documento incluem um máximo de um, dois, três, quatro ou cinco tanques quebrados (por exemplo, qualquer tanque de fragmen- tação descrito no presente documento) em todo o sistema.
Segundo MCCS
[00292] O segundo MCCS (MCCS2) nos sistemas exemplificativos inclui pelo menos duas colunas cromatográficas, pelo menos duas membranas cromatográficas ou pelo menos uma coluna cromatográfi- ca e pelo menos uma membrana cromatográfica e uma saída. O MCCS?2 pode qualquer um dos MCCSs exemplificativos descritos no presente documento ou pode ter uma ou mais de qualquer uma das características exemplificativas de um MCCS (em qualquer combina- ção) descritas no presente documento. A(s) coluna(s) cromatográfi- ca(s) e/ou a(s) membrana(s) cromatográfica(s) presentes no MCCS2 podem ter um ou mais de: qualquer um dos formatos, tamanhos, vo- lumes (volumes de leito) e/ou operações unitárias descritas no presen- te documento. A(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou a(s) membrana(s) cromatográfica(s) podem incluir qualquer uma das resinas exemplifica- tivas descritas no presente documento ou conhecidas na técnica. Por exemplo, a resina incluída em uma ou mais das colunas cromatográfi-
cas e/ou membrana(s) cromatográfica(s) presentes no MCCS2 pode ser uma resina que usa um mecanismo de captura (por exemplo, me- canismo de captura por ligação à proteína A, mecanismo de captura por ligação à proteína G, mecanismo de captura por ligação a anticor- po ou fragmento de anticorpo, mecanismo de captura por ligação a substrato, mecanismo de captura por ligação a cofator, mecanismo de captura por ligação a marcador e/ou mecanismo de captura por liga- ção a aptâmero). As resinas úteis incluem, por exemplo, uma resina de troca catiônica, uma resina de troca aniônica, uma resina de peneiras moleculares e uma resina de interação hidrofóbica. Exemplos adicio- nais de resinas são conhecidos na técnica. A(s) coluna(s) cromatográ- fica(s) e/ou membrana(s) cromatográfica(s) presentes no MCCS2 po- dem incluir as mesmas e/ou diferentes resinas (por exemplo, qualquer uma das resinas descritas no presente documento ou conhecidas na técnica para uso na purificação de proteínas recombinantes).
[00293] —A(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou membrana(s) croma- tográfica(s) presentes no MCCS2 podem realizar uma ou mais opera- ções unitárias (por exemplo, qualquer uma das operações unitárias descritas no presente documento ou qualquer combinação das opera- ções unitárias descritas no presente documento). Em exemplos não limitativos, o MCCS2 pode realizar as operações unitárias de purifica- ção de uma proteína recombinante de um fluido e refino da proteína recombinante presente no fluido que inclui a proteína recombinante. Em outros exemplos não limitativos, o MCCS2 pode realizar as opera- ções unitárias de purificar uma proteína recombinante presente em um fluido, refinar uma proteína recombinante presente em um fluido e fil- trar um fluido que inclui uma proteína recombinante. Em outro exem- plo, o MCCS2 pode realizar as operações unitárias de purificar uma proteína recombinante presente em um fluido, refinar uma proteína recombinante presente em um fluido, filtrar um fluido que inclui uma proteína recombinante e ajustar a concentração iônica e/ou pH de um fluido que inclui uma proteína recombinante. O MCCS?2 pode realizar qualquer combinação de duas ou mais operações unitárias descritas no presente documento ou conhecidas na técnica.
[00294] —A(s) coluna(s) cromatográfica(s) e/ou membrana(s) croma- tográfica(s) presentes no MCCS2 podem ser conectadas ou trocadas entre si através de um mecanismo de comutação (por exemplo, um mecanismo de comutação de colunas). O MCCS2 também pode incluir uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro ou cinco) bombas (por exemplo, automatizadas, por exemplo, bombas peristálticas automati- zadas). Os eventos de troca de coluna podem ser desencadeados pe- la detecção de um nível de proteína recombinante detectado através da absorbância de UV que corresponde a um determinado nível de proteína recombinante no fluido que passa através do MCCS2 (por exemplo, a entrada e/ou eluato proveniente de uma ou mais da(s) co- luna(s) cromatográfica(s) e/ou membrana(s) cromatográfica(s) no MCCS2), um volume específico de líquido (por exemplo, tampão) ou um tempo específico decorrido.
[00295] OMCCS?2 pode ser um sistema de cromatografia contracor- rente periódica (ou seja, PCCS2). Por exemplo, o PCCS2 pode incluir três colunas que realizam a operação unitária de purificação de uma proteína recombinante de um fluido e uma membrana cromatográfica que realiza a operação unitária de refino de uma proteína recombinan- te presente em um fluido. Por exemplo, as três colunas que realizam a operação unitária de purificação de uma proteína recombinante de um fluido podem incluir, por exemplo, uma resina de troca catiônica e a membrana cromatográfica que realiza a operação unitária de refino pode incluir uma resina de troca catiônica. Um PCCS2 pode usar um mecanismo de troca de colunas. O PCCS2 pode usar um sistema ÁKTA modificado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de funcio-
nar, por exemplo, com até quatro, cinco, seis, sete ou oito colunas ou mais.
[00296] O MCCS?2 pode ser equipado com: um ou mais (por exem- plo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) monitores de UV, uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) válvulas, um ou mais (por exemplo, dois, três, qua- tro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) medidores de pH e/ou um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) medidores de condutividade. O MCCS2 também pode ser equi- pado com um sistema operacional que usa um software (por exemplo, software com base em Unicorn, GE Healthcare, Piscataway, NJ) para detectar quando um evento de troca de coluna deve ocorrer (por exemplo, com base na absorção de UV, volume de líquido ou tempo decorrido) e que afeta os eventos de troca de coluna.
[00297] O MCCS?2 pode incluir ainda um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três ou vinte e quatro) reservatório(s) de ajuste de tampão em linha e/ou reservatório(s) de tampão. Em outros exemplos, o MCCS2 pode incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) tanques de fragmentação (por exemplo, qual- quer um dos tanques de fragmentação descritos no presente docu- mento) que podem reter fluido que não pode passar prontamente para uma ou mais das colunas cromatográficas e/ou membranas cromato- gráficas no MCCS2.
[00298] O MCCS? inclui uma saída através da qual a substância medicamentosa de proteína terapêutica pode sair do sistema. A saída pode incluir, por exemplo, uma rosca, nervura ou uma vedação que permite que um conduto de fluido seja inserido ou um frasco concebi- do para conter ou armazenar a proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa de proteína terapêutica). Uma saída pode incluir uma superfície que pode ser usada para selar um frasco com biocarga reduzida ou outro recipiente de armazenamento na saída, a fim de permitir que a proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa de proteína terapêutica) flua dire- tamente para o frasco ou recipiente de armazenamento com biocarga reduzida. Saídas não limitativas que podem ser usadas nos presentes sistemas são conhecidas e serão entendidas por aqueles versados na técnica.
[00299] Os sistemas descritos no presente documento também po- dem incluir um duto de fluido que está localizado entre o MCCS1 e o MCCS?2. Qualquer um dos dutos de fluido descritos no presente do- cumento pode ser, por exemplo, um tubo que é feito, por exemplo, de polietileno, policarbonato ou plástico. O duto de fluido localizado entre o MCCS1 e o MCCS?2 pode incluir ainda um ou mais dos seguintes em qualquer combinação: um ou mais reservatórios de ajuste de tampão em linha que estão em comunicação fluídica com o duto de fluido e estão posicionados de modo que o tampão armazenado dentro do(s) reservatório(s) de ajuste de tampão em linha seja adicionado ao fluido presente no duto de fluido; um tanque de fragmentação (por exemplo, qualquer um dos tanques de fragmentação descritos no presente do- cumento) que está em comunicação fluídica com o duto de fluido e es- tá posicionado de modo que possa conter qualquer excesso de fluido presente no duto de fluido que é incapaz de alimentar prontamente o MCCS?2; e um ou mais filtros que estão localizados no duto de fluido de modo que sejam capazes de filtrar (por exemplo, remover bacté- rias) o fluido presente no duto de fluido. Qualquer um dos reservatórios de ajuste de tampão em linha pode incluir, por exemplo, um volume entre cerca de 0,5 L a 50 L de tampão (por exemplo, a uma temperatu- ra igual ou menor do que 25ºC, 15º C ou 10ºC).
[00300] Os sistemas descritos no presente documento podem inclu- ir opcionalmente um duto de fluido localizado entre a coluna cromato- gráfica final ou a membrana cromatográfica no MCCS2 e a saída. Os sistemas descritos no presente documento podem incluir ainda um ou mais filtros em conexão fluídica com o duto de fluido localizado entre a coluna cromatográfica final ou membrana cromatográfica no MCCS2 e a saída, de modo que o filtro possa remover, por exemplo, material precipitado, material em partículas ou bactérias do fluido presente no duto de fluido localizado entre a coluna cromatográfica ou membrana cromatográfica final no MCCS? e a saída.
[00301] Alguns exemplos dos sistemas fornecidos no presente do- cumento também incluem um biorreator que está em conexão fluídica com a entrada do MCCS ou MCCS1. Qualquer um dos biorreatores exemplificativos descritos no presente documento ou conhecidos na técnica pode ser usado nos presentes sistemas.
[00302] Alguns exemplos dos sistemas fornecidos no presente do- cumento também incluem um sistema de bomba. Um sistema de bom- ba pode incluir um ou mais dos seguintes: uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) bombas (por exemplo, qualquer uma das bombas descritas no presente documento ou conhecidas na técnica), um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) filtros (por exemplo, qualquer um dos filtros descritos no pre- sente documento ou conhecidos na técnica), um ou mais (por exem- plo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) detectores de UV e um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) tanques de fragmentação (por exemplo, qualquer um dos tanques de fragmen- tação descritos no presente documento). Alguns exemplos dos siste- mas fornecidos no presente documento incluem ainda um duto de flui- do localizado entre a bomba e a entrada do MCCS ou MCCS1 (por exemplo, qualquer um dos dutos de fluido exemplificativos descritos no presente documento ou conhecidos na técnica). Em alguns exemplos, este duto de fluido específico pode incluir uma ou mais (por exemplo, duas, três ou quatro) bombas (por exemplo, qualquer uma das bombas descritas no presente documento ou conhecidas na técnica) e/ou um ou mais (por exemplo, duas, três ou quatro) tanques de fragmentação (por exemplo, qualquer um dos tanques de fragmentação exemplifica- tivos descritos no presente documento), onde tais bombas e/ou tan- que(s) de fragmentação estão em conexão fluídica com o fluido pre- sente no duto de fluido.
[00303] Alguns exemplos dos sistemas descritos no presente do- cumento incluem ainda um outro duto de fluido conectado ao duto de fluido entre a bomba e a entrada, onde uma extremidade do outro duto de fluido está conectada de forma fluídica a um biorreator e a outra extremidade está conectada de forma fluídica ao duto de fluido entre a bomba e a entrada. Este outro duto de fluido pode incluir um filtro que é capaz de remover células do meio de cultura líquido removido do biorreator (por exemplo, sistema de retenção de células ATF).
[00304] Os sistemas fornecidos no presente documento permitem a produção contínua de uma proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa de proteína terapêutica). Con- forme é conhecido na técnica, os sistemas podem permitir a eluição periódica de uma proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosas de proteína terapêutica). Os sistemas descritos no presente documento também podem resultar em um ren- dimento líquido de proteína recombinante purificada (por exemplo, substância medicamentosa de proteína terapêutica) de pelo menos cerca de 5 g/dia, pelo menos cerca de 10 g/dia, pelo menos cerca de g/dia, pelo menos cerca de 20 g/dia, pelo menos cerca de 30 g/dia ou pelo menos cerca de 40 g/dia durante um período contínuo de pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cer-
ca de 15 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 30 dias, pelo menos cerca de 40 dias, pelo menos cerca de 50 dias, pelo menos cerca de 60 dias, pelo menos cerca de 70 dias, pelo menos cerca de 80 dias, pelo menos cerca de 90 dias ou pelo menos cerca de 100 dias. Métodos de Redução da Biocarga de uma Resina Cromatográfica que Inclui o Uso de uma Resina Cromatográfica Substancialmente Seca
[00305] Também são fornecidos no presente documento métodos de redução da biocarga de uma resina cromatográfica que incluem (a) expor um recipiente que compreende uma resina cromatográfica subs- tancialmente seca a uma dose de irradiação gama suficiente para re- duzir a biocarga do recipiente e da resina cromatográfica, em que a resina cromatográfica inclui um líquido que inclui pelo menos um álco- ol, onde o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após exposição à dose de irradiação gama. Algumas modalidades destes métodos incluem ainda, antes da etapa (a), secar uma resina cromatográfica para remover substancialmente o líquido (mas não todo o líquido) da resina cromatográfica. A secagem de uma resina cromatográfica pode ser realizada usando tratamento térmico (por exemplo, um forno) ou um dessecador. Métodos adicionais para secar uma resina cromatográfica são conhecidos na técnica.
[00306] Qualquer uma das condições e doses para irradiação gama descritas no presente documento pode ser usada nestes métodos. Por exemplo, a dose de irradiação gama pode estar entre cerca de 15 kGy a cerca de 45 kGy (por exemplo, entre cerca de 20 kGy a cerca de 30 kGy). Qualquer um dos recipientes, resinas cromatográficas e líquidos que incluem pelo menos um álcool descrito no presente documento podem ser usados nestes métodos. Por exemplo, o recipiente pode ser um recipiente de armazenamento ou uma coluna cromatográfica. À resina cromatográfica nestes métodos pode incluir um ligante de prote- íÍna (por exemplo, proteína A ou proteína G). Em alguns exemplos, a resina cromatográfica pode incluir uma resina cromatográfica de troca aniônica (por exemplo, uma resina cromatográfica que inclui grupos N- benzil-N-metil-etanolamina). Em alguns exemplos, a resina cromato- gráfica é covalentemente ligada a uma superfície de um artigo (por exemplo, um chip, membrana ou cassete). Em algumas modalidades, a resina cromatográfica substancialmente seca não contém uma quan- tidade significativa de um agente antioxidante ou uma quantidade sig- nificativa de um quelante. Também são fornecidas resinas cromatográ- ficas com biocarga reduzida produzidas por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento.
[00307] Em alguns exemplos, a resina cromatográfica com biocarga reduzida produzida possui um nível de garantia de esterilidade (SAL) entre cerca de 1 x 10 a cerca de 1 x 10º (por exemplo, um SAL entre cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 109). A resina cromatográfica com carga biológica reduzida produzida pode incluir pelo menos uma resina selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidro- fóbica e resina cromatográfica de exclusão por tamanho. Em alguns exemplos, a resina cromatográfica com carga biológica reduzida pro- duzida inclui uma resina cromatográfica de afinidade que compreende um ligante de proteína (por exemplo, proteína A). Em alguns exem- plos, a resina cromatográfica com carga biológica reduzida produzida inclui uma resina cromatográfica de troca aniônica (por exemplo, uma resina cromatográfica de troca aniônica que inclui grupos N-benzil-N- metil-etanolamina). Também são fornecidos métodos para produzir uma coluna cromatográfica com biocarga reduzida que inclui fornecer a resina cromatográfica com biocarga reduzida produzida por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento; e empa- cotar a resina cromatográfica em uma coluna com biocarga reduzida em um ambiente asséptico. Também são fornecidas colunas cromato- gráficas empacotadas com biocarga reduzida produzidas por meio de qualquer um dos métodos descritos no presente documento.
[00308] Também são fornecidos processos integrados, fechados e contínuos para a produção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada que incluem: (a) fornecer um meio de cultura líquido que inclui uma proteína recombinante que é substancialmente isento de células; e (b) alimentar continuamente o meio de cultura lí- quido em um sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS) que compreende pelo menos uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida produzida por meio de qualquer um dos méto- dos fornecidos no presente documento; onde o processo usa um tam- pão com biocarga reduzida, é integrado e é executado continuamente a partir do meio de cultura líquido para um eluato proveniente do MCCS que é a proteína recombinante purificada. Também são forne- cidos processos integrados, fechados e contínuos para a produção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada que incluem: (a) fornecer um meio de cultura líquido que inclui uma proteí- na recombinante que é substancialmente isento de células; (b) alimen- tar continuamente o meio de cultura líquido em um primeiro sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS1); (c) capturar a proteína recombinante no meio de cultura líquido usando o MCCS1; (d) produ- zir um eluato proveniente do MCCS1 que inclui a proteína recombinan- te e alimentar continuamente o eluato em um segundo sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS2); (e) alimentar continu- amente a proteína recombinante proveniente do eluato ao MCCS? e, subsequentemente, eluir a proteína recombinante para, deste modo,
produzir a proteína recombinante purificada, onde: o processo usa um tampão com biocarga reduzida, é integrado e corre continuamente desde o meio de cultura líquido até a proteína recombinante purificada e pelo menos uma coluna no MCCS1 e/ou MCCS2 contém uma colu- na cromatográfica empacotada com biocarga reduzida produzida por meio de qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento. Qualquer um dos aspectos exemplificativos de processos integrados, fechados e contínuos para a produção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada descritos no presente documen- to podem ser usados nestes processos.
Métodos de Produção de Membranas, Resinas, Materiais Revesti- dos, Chips e Cassetes com Biocarga Reduzida
[00309] “Também são fornecidos no presente documento métodos para a produção de uma membrana, resina, material revestido, chip ou cassete com biocarga reduzida que incluem: expor um recipiente que inclui uma composição que inclui (i) uma membrana, resina, material revestido, chip ou cassete (por exemplo, uma membrana com base em celulose, agarose ou açúcar, resina, material revestido, chip ou casse- te); e (ii) um líquido que inclui pelo menos um álcool (por exemplo e opcionalmente, pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante) a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do re- cipiente e na membrana, resina, material revestido, chip ou cassete, em que o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade su- ficiente para melhorar o dano à membrana, resina, material revestido, chip e cassete após exposição à dose de irradiação gama. Em alguns exemplos, o cassete é um cassete que contém resina (por exemplo, qualquer uma das resinas exemplificativas descritas no presente do- cumento ou conhecidas na técnica). Em algumas modalidades, a membrana, resina, material revestido, chip ou cassete inclui um ligante de proteína A ou ligante de proteína G covalentemente ligado a pelo menos uma ou parte de sua superfície. Em algumas modalidades, a composição inclui uma membrana, resina, material revestido, chip ou cassete e o líquido que inclui o pelo menos álcool (por exemplo e op- cionalmente, pelo menos um agente antioxidante e/ou pelo menos um quelante). Qualquer uma das combinações e concentrações exemplifi- cativas de álcoois, agente(s) antioxidante(s) e/ou quelante(s) descritos no presente documento pode ser usada em qualquer um destes méto- dos. Qualquer um dos líquidos exemplificativos descritos no presente documento podem ser usados em qualquer um destes métodos. Em algumas modalidades, a composição é um material úmido ou seco. Também é fornecida no presente documento uma membrana, resina, material revestido, chip ou cassete com biocarga reduzida produzido usando qualquer um dos métodos descritos no presente documento. Em alguns exemplos, o recipiente é um saco ou recipiente de armaze- namento selado.
[00310] Também são fornecidos no presente documento métodos para a produção de uma membrana, resina, material revestido, chip e cassete com biocarga reduzida que incluem: expor um recipiente que inclui uma membrana, resina, material revestido, chip ou cassete subs- tancialmente seco (por exemplo, uma membrana com base em celulo- se, agarose ou açúcar, resina, material revestido, chip ou cassete) a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do re- cipiente e na membrana, resina, material revestido, chip ou cassete. Alguns exemplos incluem ainda uma etapa de secagem da membrana, resina, materiais revestidos, chip ou cassete antes da etapa de expo- sição. Em algumas modalidades, a membrana, resina, material reves- tido, chip ou cassete inclui um ligante de proteína A ou ligante de pro- teína G covalentemente ligado à sua superfície. Em alguns exemplos, O cassete é um cassete que contém resina (por exemplo, qualquer uma das resinas exemplificativas descritas no presente documento ou conhecidas na técnica). Também é fornecida no presente documento uma membrana, resina, material revestido, chip ou cassete com bio- carga reduzida produzido usando qualquer um dos métodos descritos no presente documento.
[00311] A invenção é ainda descrita nos exemplos a seguir, os quais não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.
EXEMPLOS Exemplo 1. Efeito protetor de um álcool em uma resina cromato- gráfica de afinidade tratada com irradiação gama
[00312] Em um primeiro conjunto de experimentos, MabSelect'M SuRe"'Y” (resina cromatográfica de afinidade de proteína A) foi irradiada em três tampões diferentes em uma dose de 40-49 kGy com uma taxa de dosagem padrão: (1) ascorbato de sódio a 25 mM, metionina a 25 mM, histidina a 25 MM, manitol a 25 mM em tampão de fosfato de sódio a 50 mM (irradi- ação de 40-49 kKGy em uma taxa de dosagem de > 7,5 kGy/hora); (2) álcool benzílico a 2 % v/v (40-49 kKGy em uma taxa de dosagem de > 7,5 kGy/hora); e (3) ascorbato de sódio a 25 mM, metionina a 25 mM, histidina a 25 MM, manitol a 25 mM, álcool benzílico a 2 % em tampão de fosfato de sódio a 50 mM - em uma dose de irradiação mais alta (40-49 kGy e taxa de dose mais alta de > 7,5 kGy/hora).
[00313] Após a irradiação, as resinas cromatográficas foram empa- cotadas em colunas cromatográficas separadas e submetidas a ciclos usando uma coleta de cultura de células e um tempo de residência de seis minutos. As capacidades de ligação do produto foram registradas para resinas irradiadas e foram comparadas com a resina MabSelect"M SuRe"Y (cromatografia de proteína A) virgem (não irradiada).
[00314] Os dados mostrados para este experimento são mostrados na Figura 1.
[00315] Os dados na Figura 1 mostram que o tampão (3) fornece um efeito aditivo da combinação de ambos os tampões (1) e (2) para reter a capacidade de ligação. Neste caso, o álcool benzílico a 2 % v/v no tampão funciona como conservante e, quando combinado com o tampão (1), também oferece algumas propriedades protetoras.
[00316] A Tabela1 mostra que todos os atributos de qualidade me- didos do produto não foram muito significativamente alterados com base no uso dos tampões (1) - (3) e são similares aos valores espera- dos observados com a MabSelect"Y SuRe'Y (resina cromatográfica de proteína A) virgem (não irradiada). Tabela 1 lAtributos de qualidade ITampão Número de ciclo. Recuperação ( Y%)|HCP (ppm)ProA Residual (ppm)
RR CR LA
RR ITampão 3 ISMM'H+BA a 2 % Pe ITampão 1 ISMM'H re ITampão 2 BA a 2%
[00317] Estes dados mostram que a irradiação de uma resina cro- matográfica em um líquido que inclui um álcool (por exemplo, álcool benzílico) protege a resina contra a perda subsequente na capacidade de ligação ao longo de vários ciclos de cromatografia. Exemplo 2. Efeito protetor de um álcool sobre uma resina croma- tográfica Capto'"" Adhere tratada com irradiação gama
[00318] A irradiação gama de GE Capto!Y Adhere (resina cromato- gráfica de troca aniônica com funcionalidade multimodal) foi feita em três tampões diferentes em uma dose de 28-49 kGy com uma taxa de dosagem padrão: (A) ascorbato de sódio a 25 mM, metionina a 25 mM, histidina a 25 mM e manitol a 25 mM em tampão de fosfato de sódio a 50 mM (28-34 kGy em taxa de dosagem de 2-3 kGy/hora); (B) ascorbato de sódio a 25 mM, metionina a 25 mM, histidina a 25 MM, manitol a 25 mM em tampão de fosfato de sódio a 50 mM (40-49 kGy em uma taxa de dosagem de > 7,5 kGy/hora); e (C) ascorbato de sódio a 25 mM, metionina a 25 mM, histidina a 25 MM, manitol a 25 mM, álcool benzílico a 2 % v/v em tampão de fosfato de sódio a 50 mM (40-49 kGy em uma taxa de dosagem maior do que > 7,5 kGy/hora).
[00319] Após a irradiação, as resinas cromatográficas foram empa- cotadas em colunas cromatográficas separadas e submetidas a ciclos usando uma coleta de cultura de células e um tempo de residência de seis minutos. As capacidades de ligação do produto foram registradas para resinas irradiadas e foram comparadas com a GE Capto"Y Adhe- re (resina cromatográfica de troca aniônica com funcionalidade multi- modal) virgem (não irradiada).
[00320] Os dados deste experimento são mostrados na Figura 2. Os dados na Figura 2 mostram que nenhuma alteração apreciável na capacidade de ligação é observada quando a resina é irradiada na presença de álcool benzílico e a presença de álcool benzílico fornece o benefício de um tempo de armazenamento aumentado antes de irra- diação gama.
[00321] A Tabela 2 abaixo mostra que a irradiação da resina na presença de álcool benzílico não levou a qualquer impacto apreciável sobre outros atributos de qualidade do desempenho da resina na puri- ficação de proteínas.
Tabela 2 Atributos de qualidade ITampão Número do ciclo HCP (ug/mg) Pureza (%) |ICondição de Teste À ISMM'H baixa dose (28-34 kGy) |ICondição de Teste B ISMM'H alta dose (40-49 kGy) Condição de Teste C |SMM'H+ BA a 2 % (40-49 kGy)
OUTRAS MODALIDADES
[00322] Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido des- crita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição anterior se destina a ilustrar e não a limitar o escopo da invenção, o qual é definido pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros as- pectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivin- dicações a seguir.

Claims (102)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para reduzir a biocarga de uma resina cromato- gráfica, caracterizado pelo fato de que compreende: expor um recipiente que inclui uma composição que com- preende (i) uma resina cromatográfica e (i) um líquido que compreen- de pelo menos um álcool, a uma dose de irradiação gama suficiente para reduzir a biocarga do recipiente e da resina cromatográfica, em que o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade sufici- ente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina croma- tográfica após exposição à dose de irradiação gama.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes de exposição, colocar a composição no recipiente.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o recipiente é um recipiente de armazenamento.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o recipiente é uma coluna cromatográfica.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o recipiente é uma coluna cromatográfica empacotada.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é uma suspensão de resina cromato- gráfica sedimentada.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é uma mistura sólida úmida.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um álcool é seleci- onado a partir do grupo de: álcool benzílico, ciclo-hexanol, álcool isobutílico, 2-metil-2-butanol, metanol, etanol, propan-2-ol, propan-1-ol, butan-1-ol, pentan-1-ol, hexadecan-1-ol, 2-fenil etanol, sec-fenil etanol, 3-fenil-1-propanol, 1-fenil-1- propanol, 2-fenil-1-propanol, 2-fenil-2-
propanol, 1-fenil-2-butanol, 2-fenil-1-butanol, 3-fenil-1-butanol, 4-fenil- 2-butanol, dl-1-fenil-2-pentanol, 5-fenil-1-pentanol e 4-fenil-1-butanol.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um álcool compreende álcool benzílico.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a concentração da soma total dos um ou mais álcoois no líquido é de cerca de 0,01 % v/v a cer- ca de 10 % v/v.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o líquido compreende ain- da pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que o líquido compreende pelo menos um agente an- tioxidante e/ou quelante em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após exposi- ção à dose de irradiação gama.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, carac- terizado pelo fato de que o líquido compreende pelo menos um agente antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: glutationa reduzida, tiorredoxina reduzida, cisteína reduzida, um carotenoide, me- latonina, licopeno, tocoferol, ubiquinona reduzida, ascorbato, bilirrubi- na, ácido úrico, ácido lipoico, um flavonoide, um ácido fenolpropanoi- de, lidocaína, naringenina, fulereno, glicose, manitol, 4-hidroxi-2,2,6,6- tetrametilpiperidina-1-oxila e dimetilmetoxicromanol.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que o líquido compreende pelo menos um agente anti- oxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: manitol, as- corbato de sódio, histidina e metionina.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o líquido compreende manitol, ascorbato de sódio,
histidina e metionina.
16. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, carac- terizado pelo fato de que o líquido compreende: (i) manitol entre 75 mM e cerca de 125 mM; (ii) metionina entre 75 mM e cerca de 125 mM; (iii) ascorbato de sódio entre 75 mM e cerca de 125 mM; (iv) histidina entre 75 mM e cerca de 125 mM; (v) metionina entre 30 mM e cerca de 70 mM e histidina entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM; (vi) metionina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM, histidina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM e ascorbato de sódio entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; ou (vii) ascorbato de sódio entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, metionina entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, manitol en- tre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM e histidina entre cerca de 5 mM a cerca de 45 mM.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o líquido é uma solução tamponada.
18. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, carac- terizado pelo fato de que o líquido compreende pelo menos um que- lante selecionado a partir do grupo que consiste em: ácido etilenodia- minotetra-acético (EDTA), ácido 2,3-dimercapto-1-propanossulfônico sódico (DMPS), ácido dimercaptossuccínico (DMSA), metalotionina e desferroxamina.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a resina cromatográfica é selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidro-
fóbica e resina cromatográfica de exclusão por tamanho.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que a composição compreende resina cromatográfica de afinidade que compreende um ligante de proteína.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o ligante de proteína é a proteína A.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que a composição compreende uma resina cromato- gráfica de troca aniônica.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que a resina cromatográfica de troca aniônica compre- ende grupos N-benzil-N-metil-etanolamina.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a dose está entre cerca de kGy a cerca de 45 kGy.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que a dose está entre cerca de 20 kGy a cerca de 30 kGy.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que a dose está entre cerca de 23 kGy e cerca de 27 kGy.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a exposição é realizada em uma temperatura entre cerca de -25ºC e cerca de 0ºC, inclusive.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a exposição é realizada em uma temperatura entre cerca de 0ºC e cerca de 25ºC, inclusive.
29. Resina cromatográfica com biocarga reduzida, caracte- rizada pelo fato de que é produzida por meio do método, como defini- do na reivindicação 3.
30. Resina cromatográfica com biocarga reduzida, de acor- do com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a resina possui um nível de garantia de esterilidade (SAL) de entre cerca de 1 x a cerca de 1 x 10º.
31. Resina cromatográfica com biocarga reduzida, de acor- do com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a resina possui um nível de garantia de esterilidade (SAL) de entre cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 10º.
32. Resina cromatográfica com biocarga reduzida, de acor- do com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizada pelo fato de que a resina cromatográfica compreende pelo menos uma re- sina selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográ- fica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidro- fóbica e resina cromatográfica de exclusão por tamanho.
33. Resina cromatográfica com biocarga reduzida, de acor- do com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a resina cromatográfica compreende resina cromatográfica de afinidade que compreende um ligante de proteína.
34. Resina cromatográfica com biocarga reduzida, de acor- do com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o ligante de proteína é a proteína A.
35. Resina cromatográfica com biocarga reduzida, de acor- do com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a resina cromatográfica compreende resina cromatográfica de troca aniônica.
36. Resina cromatográfica com biocarga reduzida, de acor- do com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a resina cromatográfica de troca aniônica compreende grupos N-benzil-N-metil- etanolamina.
37. Método para produzir uma coluna cromatográfica com biocarga reduzida, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a resina cromatográfica com biocarga reduzida, como definida na reivindicação 29; e empacotar a resina cromatográfica em uma coluna com bi- ocarga reduzida em um ambiente asséptico.
38. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, caracterizada pelo fato de que é produzida por meio do método, como definido na reivindicação 37.
39. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, caracterizada pelo fato de que é produzida por meio do método, como definido na reivindicação 5.
40. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a resina na coluna empacotada possui um nível de garantia de esterili- dade (SAL) de entre cerca de 1 x 108 a cerca de 1 x 10º.
41. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a resina possui um nível de garantia de esterilidade (SAL) de entre cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 10º.
42. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, carac- terizada pelo fato de que a resina na coluna empacotada compreende pelo menos uma resina selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidrofóbica e resina cromatográfica de exclusão por tamanho.
43. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a resina compreende resina cromatográfica de afinidade ou pseudoafi- nidade que compreende um ligante de proteína.
44. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o ligante é a proteína A.
45. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que a resina compreende resina cromatográfica de troca aniônica.
46. Coluna cromatográfica empacotada com biocarga redu- zida, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a resina cromatográfica de troca aniônica compreende grupos N- benzil-N-metil-etanolamina.
47. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de (i) uma resina cromatográfica e (ii) um líquido que compreende pelo menos um álcool, em que o pelo menos um álcool está presente em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após tratamento com um dose de ir- radiação gama suficiente para reduzir a biocarga da composição.
48. Composição, de acordo com a reivindicação 47, carac- terizada pelo fato de que a composição é uma suspensão de resina cromatográfica sedimentada.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 47, carac- terizada pelo fato de que a composição é uma mistura sólida úmida.
50. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 47 a 49, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um álco- ol é selecionado a partir do grupo de: álcool benzílico, ciclo-hexanol, álcool isobutílico, 2-metil-2-butanol, metanol, etanol, propan-2-ol, pro- pan-1-ol, butan-1-ol, pentan-1-ol, hexadecan-1-ol, 2-fenil etanol, sec- fenil etanol, 3-fenil-1-propanol, 1-fenil-1- propanol, 2-fenil-1-propanol, 2-fenil-2-propanol, 1-fenil-2-butanol, 2-fenil-1-butanol, 3-fenil-1-butanol, 4-fenil-2-butanol, dl-1-fenil-2-pentanol, 5-fenil-1-pentanol e 4-fenil-1- butanol.
51. Composição, de acordo com a reivindicação 50, carac- terizada pelo fato de que o pelo menos um álcool compreende álcool benzílico.
52. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 47 a 51, caracterizada pelo fato de que a concentração da so- ma total do um ou mais álcoois no líquido é a partir de cerca de 0,01 % v/v a cerca de 10 % v/v.
53. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 47 a 52, caracterizada pelo fato de que o líquido compreende ainda pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante.
54. Composição, de acordo com a reivindicação 53, carac- terizada pelo fato de que o líquido compreende ainda pelo menos um agente antioxidante e/ou quelante em uma quantidade suficiente para melhorar a perda da capacidade de ligação da resina cromatográfica após exposição à dose de irradiação gama.
55. Composição, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizada pelo fato de que o líquido compreende pelo menos um agente antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: glutationa reduzida, tiorredoxina reduzida, cisteína reduzida, um caro- tenoide, melatonina, licopeno, tocoferol, ubiquinona reduzida, ascorba- to, bilirrubina, ácido úrico, ácido lipoico, um flavonoide, um ácido fenol- propanoide, lidocaína, naringenina, fulereno, glicose, manitol, 4-hidroxi -2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxila e dimetilmetoxicromanol.
56. Composição, de acordo com a reivindicação 55, carac- terizada pelo fato de que o líquido compreende pelo menos um agente antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: manitol, ascorbato de sódio, histidina e metionina.
57. Composição, de acordo com a reivindicação 56, carac- terizada pelo fato de que o líquido compreende manitol, ascorbato de sódio, histidina e metionina.
58. Composição, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizada pelo fato de que o líquido compreende: (i) manitol entre 75 mM e cerca de 125 mM; (ii) metionina entre 75 mM e cerca de 125 mM; (iii) ascorbato de sódio entre 75 mM e cerca de 125 mM; (iv) histidina entre 75 mM e cerca de 125 mM; (v) metionina entre 30 mM e cerca de 70 mM e histidina entre cerca de 30 mM e cerca de 70 mM; (vi) metionina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM, histidina entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM e ascorbato de sódio entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; ou (vii) ascorbato de sódio entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, metionina entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM, manitol en- tre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM e histidina entre cerca de 5 mM e cerca de 45 mM.
59. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 47 a 58, caracterizada pelo fato de que o líquido é uma solu- ção tamponada.
60. Composição, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizada pelo fato de que a composição compreende pelo menos um quelante selecionado a partir do grupo que consiste em: ácido eti- lenodiaminotetra-acético (EDTA), ácido 2,3-dimercapto-1-propanossul- fônico sódico (DMPS), ácido dimercaptossuccínico (DMSA), metalotio- nina e desferroxamina.
61. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 47 a 60, caracterizada pelo fato de que a resina cromatográfica compreende pelo menos uma resina selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromato- gráfica de troca catiônica, afinidade resina cromatográfica, resina cro- matográfica de interação hidrofóbica e resina cromatográfica de exclu-
são por tamanho.
62. Composição, de acordo com a reivindicação 61, carac- terizada pelo fato de que a resina compreende resina cromatográfica de afinidade que compreende um ligante de proteína.
63. Composição, de acordo com a reivindicação 62, carac- terizada pelo fato de que o ligante de proteína é a proteína A.
64. Método para realizar cromatografia em coluna com bio- carga reduzida, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida, como definida na reivindicação 38 ou 39; e (b) realizar cromatografia em coluna usando a coluna cro- matográfica empacotada com biocarga reduzida e tampão com biocar- ga reduzida em um sistema fechado.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 4 dias.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracteriza- do pelo fato de que a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 5 dias.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracteriza- do pelo fato de que a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 7 dias.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do pelo fato de que a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 14 dias.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracteriza-
do pelo fato de que a cromatografia em coluna com biocarga reduzida usando a coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida é realizada continuamente durante um período de pelo menos 28 dias.
70. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que a resina na coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida em (a) possui uma capacidade de ligação per- centual entre cerca de 75 % e cerca de 100 % comparado com a mesma resina não tratada com irradiação gama.
71. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteriza- do pelo fato de que a resina na coluna cromatográfica com biocarga reduzida compreende pelo menos uma resina selecionada a partir do grupo que consiste em: resina cromatográfica de troca aniônica, resina cromatográfica de troca catiônica, resina cromatográfica de afinidade, resina cromatográfica de interação hidrofóbica e resina cromatográfica de exclusão por tamanho.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracteriza- do pelo fato de que a resina compreende resina cromatográfica de afi- nidade que compreende um ligante de proteína.
73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracteriza- do pelo fato de que o ligante de proteína é a proteína A.
74. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracteriza- do pelo fato de que a resina compreende resina cromatográfica de tro- ca aniônica.
75. Processo integrado, fechado e contínuo para a produ- ção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer um meio de cultura líquido que compreende uma proteína recombinante que é substancialmente isenta de células; e (b) alimentar continuamente o meio de cultura líquido em um sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS) que com-
preende pelo menos uma coluna cromatográfica empacotada com bio- carga reduzida ,como definida na reivindicação 38 ou 39; em que o processo usa um tampão com biocarga reduzida, é integrado e é executado continuamente desde o meio de cultura lí- quido até um eluato proveniente do MCCS que é a proteína recombi- nante purificada.
76. Processo, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS executa pelo menos duas operações unitárias diferentes.
77. Processo, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que o processo inclui a troca de coluna.
78. Processo, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS realiza as operações unitárias de cap- tura da proteína recombinante e inativação de vírus.
79. Processo, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS realiza as operações unitárias de cap- tura e purificação da proteína recombinante.
80. Processo, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS compreende pelo menos duas colunas cromatográficas empacotadas com biocarga reduzida.
81. Processo, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS é um sistema de cromatografia contra- corrente periódica.
82. Processo, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS inclui uma pluralidade de colunas para cromatografia de afinidade ou pseudoafinidade, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica ou cromatografia de exclu- são por tamanho ou qualquer combinação das mesmas.
83. Processo, de acordo com a reivindicação 82, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS inclui uma coluna cromatográfica por afinidade e a cromatografia de afinidade é realizada no processo com um mecanismo de captura selecionado a partir do grupo que consiste em: mecanismo de captura por ligação à proteína A, mecanismo de captura por ligação a substrato, mecanismo de captura por ligação a anticorpo ou fragmento de anticorpo, mecanismo de captura por liga- ção a aptâmero e mecanismo de captura por ligação a cofator.
84. Processo, de acordo com a reivindicação 83, caracteri- zado pelo fato de que a cromatografia de afinidade é realizada no pro- cesso com um mecanismo de captura por ligação à proteína A e a pro- teína recombinante é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.
85. Processo integrado, fechado e contínuo para a produ- ção, com biocarga reduzida, de uma proteína recombinante purificada, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer um meio de cultura líquido que compreende uma proteína recombinante que é substancialmente isenta de células; (b) alimentar continuamente o meio de cultura líquido a um primeiro sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS1); (c) capturar a proteína recombinante no meio de cultura lí- quido usando o MCCS1; (d) produzir um eluato proveniente do MCCS1 que compre- ende a proteína recombinante e alimentar continuamente o eluato a um segundo sistema de cromatografia com múltiplas colunas (MCCS2); (e) alimentar continuamente a proteína recombinante pro- veniente do eluato ao MCCS?2 e, subsequentemente, eluir a proteína recombinante para, deste modo, produzir a proteína recombinante pu- rificada, em que: o processo usa um tampão com biocarga reduzida, é inte- grado e funciona continuamente desde o meio de cultura líquido até a proteína recombinante purificada, e pelo menos uma coluna no MCCS1 e/ou MCCS2 contém uma coluna cromatográfica empacotada com biocarga reduzida, como definida na reivindicação 38 ou 39.
86. Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS1 e/ou o MCCS2 executa pelo menos duas operações unitárias diferentes.
87. Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracteri- zado pelo fato de que o processo envolve a troca de colunas.
88. Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS1 realiza as operações unitárias de cap- tura da proteína terapêutica recombinante e inativação de vírus.
89. Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS? realiza as operações unitárias de puri- ficação e refino da proteína recombinante.
90. Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS1 e/ou MCCS2 compreende pelo menos duas colunas cromatográficas.
91. Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS1 é um primeiro sistema de cromatogra- fia contracorrente periódica (PCCS1).
92. Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracteri- zado pelo fato de que a captura é realizada usando cromatografia de afinidade, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica ou cromatografia de exclusão por tamanho ou qualquer com- binação das mesmas.
93. Processo, de acordo com a reivindicação 92, caracteri- zado pelo fato de que a cromatografia de afinidade é realizada com um mecanismo de captura selecionado a partir do grupo que consiste em: mecanismo de captura por ligação à proteína A, mecanismo de captu- ra por ligação a substrato, mecanismo de captura por ligação a anti- corpo ou fragmento de anticorpo, mecanismo de captura por ligação a aptâmero e mecanismo de captura por ligação a cofator.
94. Processo, de acordo com a reivindicação 93, caracteri- zado pelo fato de que a cromatografia de afinidade é realizada com um mecanismo de captura por ligação à proteína A e a proteína recombi- nante é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.
95. Processo, de acordo com a reivindicação 85, caracteri- zado pelo fato de que o MCCS2 é um segundo sistema de cromato- grafia contracorrente periódica (PCCS2).
96. Processo, de acordo com a reivindicação 75 ou 85, ca- racterizado pelo fato de que a proteína recombinante é uma proteína recombinante terapêutica.
97. Processo, de acordo com a reivindicação 96, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda formular a proteína recombi- nante terapêutica purificada em uma composição farmacêutica.
98. Processo, de acordo com a reivindicação 75 ou 85, ca- racterizado pelo fato de que o processo é realizado continuamente du- rante um período de pelo menos 4 dias.
99. Processo, de acordo com a reivindicação 98, caracteri- zado pelo fato de que o processo é realizado continuamente durante um período de pelo menos 5 dias.
100. Processo, de acordo com a reivindicação 99, caracte- rizado pelo fato de que o processo é realizado continuamente durante um período de pelo menos 7 dias.
101. Processo, de acordo com a reivindicação 100, caracte- rizado pelo fato de que o processo é realizado continuamente durante um período de pelo menos 14 dias.
102. Processo, de acordo com a reivindicação 101, caracte- rizado pelo fato de que o processo é realizado continuamente durante um período de pelo menos 28 dias.
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