JP2871435B2 - 親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリックスの製造方法 - Google Patents

親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリックスの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】本発明は低い非特異的結合を示す不活性
固体支持体に関し、より詳細には、ポリビニルアルコー
ルなどの架橋親水性ポリマーのコーティングを有するパ
ーフルオロカーボンポリマーベースのマトリックスに関
する。かかる親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボン
ポリマーベースの支持体を用いて製造された固体アフィ
ニティー支持体、およびそれらのアフィニティー分離へ
の使用も提供される。
【０００２】
【背景技術】バイオテクノロジーにおける実験室および
プロセス操作例えば膜およびクロマトグラフィー分離は
しばしば宿主生物の自然環境に類似する条件下に行われ
なければならない。イオン強度、pHおよび温度はしばし
ば生体内（in-vivo）領域に類似するように選択され
る。生体分子の安定性を確実に最大のものとするため
に、プロセスおよび実験室の装置の露出表面は極めて極
性または親水性にして核酸および酵素を含むタンパク質
などの生体分子の不活性化および／または吸着を回避す
るようにすべきである。露出表面への吸着は、そのプロ
セスが不可逆性であり得るおよび／または生物学的活性
のロスを招き得ることから極めて望ましくない。
【０００３】湿潤剤例えば界面活性剤および水と混和し
得る有機溶媒は典型的には吸着を低下させるが、その効
果は一般的に一時的であり、特にその表面が空気に晒さ
れている場合にはそうである。さらに、溶液中にこれら
の剤が存在すると、発泡を招いたり、またタンパク質の
三次構造を乱すことにより生物学的活性にマイナスの影
響を与えることがある。
【０００４】疎水性吸着を避けるために、多くの実務家
は膜またはクロマトグラフィープロセスのための支持体
として親水性材料を選択する。この理由から、セルロー
ス、アクリルアミド、ポリエチレンイミンおよびアガロ
ースなどの材料が広く用いられている。これらの天然に
親水性である物質は望ましい低レベルの疎水性特性を有
しているものの他の面で欠陥がある。例えばこれらの親
水性物質の多くは水性溶液中に低いが有限の溶解度を示
す。このことは一般的に大量の水性液を利用する大抵の
生物学的プロセス操作における懸念である。かかる可溶
化は支持体マトリックスの物理的分解を招き、さらに支
持体マトリックスから遊離した異物により目的生成物を
汚染する可能性を生じる。治療剤中に汚染物質が存在す
ることは、発熱の原因になり得たりあるいは患者に予期
せざる免疫応答をひき起こすことがあることから、商業
的バイオテクノロジーにおける大きな懸念である。
【０００５】さらに、多くの親水性材料は限られた熱お
よび化学安定性も示すため、滅菌および内毒素除去のた
めの手順へのそれらの使用を妨げる。これに対し、最良
の熱的、生物学的および化学的抵抗性を有するマトリッ
クスは疎水性となる傾向がある。疎水性材料の典型例に
はポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、耐火ア
ルミナおよびガラスが含まれる。これらの材料は一般に
良好な熱および化学安定性を有するが、それらの表面へ
の生体分子の望ましくない吸着および非特異的結合が起
きるためにバイオテクノロジー操作への有用性は限られ
たものとなる。
【０００６】アフィニティー分離は一般に、リガンドま
たはバインダーで誘導体化された固体担体の使用を必要
とすると考えられている。アフィニティークロマトグラ
フィーは周知であり、そして例えば C. R. Lowe 著「An
Introduction to AffinityChromatography」, North h
olland Publishing Company, アムステルダム, ニュー
ヨーク, 1978，に総括されている。アフィニティークロ
マトグラフィーに適した支持体材料のリストは長大であ
り、ここで総括することはしない（リストの一部につい
ては Lowe，1978を参照されたい）。
【０００７】フルオロカーボンボリマーは吸着によりリ
ガンドが結合した担体として用いられている〔１９７４
年１０月２２日に Fishman に付与された米国特許第３,
８４３,４４３号；Rijsk Univ. (Groningen）により出
願されたＷＯ ８６０３ ８４０ Ａ；および Siergiej,
Dissertation Abstracts, It. B., 44巻, 153(198
3)〕。Sskagani ら〔１９８３年７月２０日に公開され
たＥＰ ０,０１１,５０４〕は、電着を用いてリガンド
をフルオロポリマーイオン交換膜に結合させることを開
示している。
【０００８】１９８９年１２月５日に Eveleigh に付与
された米国特許第４,８８５,２５０号は、パーフルオロ
カーボン−置換リガンドまたはバインダーをその表面に
結合させた不活性パーフルオロカーボンポリマー担体に
基づく固体支持体を開示している。１９９０年９月４日
に Eveleigh に付与された米国特許第４,９５４,４４４
号は、リガンドまたはリガンドのためのバインダーを高
度にフッ素化されたイソシアネート基を通してその表面
に結合した不活性パーフルオロカーボンポリマー担体に
基づく固体支持体を開示している。
【０００９】Hato ら（１９８６年１０月２３日に付与
された米国特許第４,６１９,８９７号）は、パーフルオ
ロアルキル界面活性剤を所定の深さまで浸透させること
により片側を親水性にしたフッ素樹脂膜への酵素固定を
開示している。このようにして得られた非対称官能性膜
を次いで酵素およびグルタルアルデヒドなどの架橋剤で
処理して酵素固定を完成させる。
【００１０】Zhujun et al., Analyt. Chem. vol 61, p
p. 202〜205 (1989）はグルタルアルデヒドを用いた光
ファイバー上の固定化ポリビニルアルコールの架橋を開
示している。Murakami (１９８９年２月８日に公開され
た特開昭６４−３８,４４８号）は、フルオロプラスチ
ックポリマーの細孔を親水性ポリマーで含浸させ次にそ
の親水性ポリマーを紫外線照射により架橋する方法を開
示している。
【００１１】Mcreath et al., J. of Chromatography,
597, pp. 189〜196, (1992）はトリアジン系色素である
カラーインデックスリアクティブブルー４で予め誘導体
化されたポリビニルアルコールに基づくポリマーフルオ
ロ界面活性剤と共に飽和パーフルオロカーボン油を均質
化することにより生成させた液状パーフルオロカーボン
乳濁液を開示している。非特異的結合が低く、そして膜
およびクロマトグラフィー分離など様々なバイオテクノ
ロジー操作に用いることができる湿潤性、親水性、不活
性固体パーフルオロカーボンポリマーベースの支持体が
必要とされている。
【００１２】
【発明の概要】従来技術の問題点の多くは本発明の支持
体マトリックスにより解決される。湿潤性親水性ポリマ
ー被覆パーフルオロカーボンをベースとするポリマーマ
トリックスを用いることの最大の長所は、そのパーフル
オロカーボンポリマー担体が不活性さおよび剛性を有し
ながら同時に、リガンドやリガンドのためのバインダー
など生物学的に興味ある物質の吸着および非特異的結合
を最小に抑える親水性表面を与えることに関係してい
る。すなわち、本発明の支持体マトリックスは、様々な
バイオテクノロジー操作および装置例えば支持体または
分離膜、アフィニティークロマトグラフィー支持体、イ
オン交換分離および酵素または細胞性支持体などに用い
るのに適している。さらにまた、本発明の架橋親水性ポ
リマー被覆パーフルオロカーボンポリマーをベースとす
るマトリックスは生物学的分子の非特異的結合を最小に
抑えるべく単独使用することができ、あるいは生物学的
に活性な分子または他の生物学的に興味ある分子、例え
ばリガンドまたはリガンドのためのバインダーなどに共
有結合的に結合するように活性化させることができる。
【００１３】
【００１４】本発明は、 （ａ）化学的に不活性な固体パーフルオロカーボンポリ
マー担体であって、該ポリマーがポリ（テトラフルオロ
エチレン）、ポリ（ビニルフルオライド）およびポリ
（ビニリデンジフルオライド）よりなる群から選択され
たものであるもの； （ｂ）前記担体上の架橋親水性ポリマーコーティングで
あって、該ポリマーが分子量１，０００〜２０，０００
のポリ（ビニルアルコール）であるもの； （ｃ）前記親水性ポリマーの表面に結合したリガンドま
たはリガンドのためのバインダーであって、該リガンド
が抗原、ハプテン、核酸、酵素基質、ビタミンおよび染
料よりなる群から選択されたものであるもの； より成るリガンドまたはリガンドのためのバインダーを
結合した固体アフィニティー支持体に関する。
【００１５】
【００１６】さらにまた本発明は、 （ａ）分子量１，０００〜２０，０００のポリ（ビニル
アルコール）よりなる親水性ポリマーを、ポリ（テトラ
フルオロエチレン）、ポリ（ビニルフルオライド）およ
びポリ（ビニリデンジフルオライド）よりなる群から選
択された固体パーフルオロカーボンポリマー担体の表面
に吸着させ； （ｂ）前記親水性ポリマーを二官能性架橋剤を用いて架
橋し； （ｃ）架橋親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボンベ
ースの表面を活性化してその表面へのリガンドまたはリ
ガンドのためのバインダーの結合が可能となるように
し；そして （ｄ）リガンドまたはリガンドのためのバインダーをそ
の活性化された親水性ポリマーの表面に結合させる段階
より成る結合したリガンドまたはリガンドのためのバイ
ンダーを含有する固体支持体の製造方法に関する。
【００１７】本発明のもう一つの観点は、 （Ａ）（ａ）分子量１，０００〜２０，０００のポリ
（ビニルアルコール）よりなる親水性ポリマーを、ポリ
（テトラフルオロエチレン）、ポリ（ビニルフルオライ
ド）およびポリ（ビニリデンジフルオライド）よりなる
群から選択された固体パーフルオロカーボンポリマー担
体の表面に吸着させ； （ｂ）前記親水性ポリマーを二官能性架橋剤を用いて架
橋し； （ｃ）架橋親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボンベ
ースの表面を活性化してその表面へのリガンドまたはリ
ガンドのためのバインダーの結合が可能となるように
し；そして （ｄ）リガンドまたはリガンドのためのバインダーをそ
の活性化された親水性ポリマーの表面に結合させる ことにより固体アフィニティー支持体を形成し；そして （Ｂ）前記固体アフィニティー支持体を用いて混合物か
ら前記担体に結合したリガンドまたはバインダーに対し
相補的なバインダーまたはバインダーのためのリガンド
を捕獲する段階より成るバイオアフィニティー分離方法
に関する。
【００１８】さらに本発明は、 （ａ）化学的に不活性な固体パーフルオロカーボンポリ
マー担体であって、該ポリマーがポリ（テトラフルオロ
エチレン）、ポリ（ビニルフルオライド）およびポリ
（ビニリデンジフルオライド）よりなる群から選択され
たものであるもの； （ｂ）前記担体上の架橋親水性ポリマーコーティングで
あって、該ポリマーが分子量１，０００〜２０，０００
のポリ（ビニルアルコール）であるもの；および （ｃ）前記親水性ポリマーの表面に結合した酵素より成
る固定化酵素固体アフィニティー支持体に関する。
【００１９】
【発明の詳述】本発明は、親水性ポリマー例えばポリビ
ニルアルコールをパーフルオロカーボンポリマーベース
の担体上に被覆または吸着し、次いで二官能性架橋剤を
用いて架橋した場合、生成親水性コーティングは、様々
なバイオテクノロジー応用例、例えば膜使用バイオアフ
ィニティー分離およびアフィニティークロマトグラフィ
ー分離などに典型的に用いられる様々な洗浄段階および
その他の操作に耐え得る安定マトリックスを提供するの
に十分な強度であるという驚くべきかつ予想外の知見に
基づいている。本発明のマトリックスおよび支持体は水
性環境中で安定であり、また生物学的検体中のタンパク
質、核酸およびその他の成分の表面への非特異的結合は
低い。
【００２０】パーフルオロカーボンとはフッ素原子をそ
の構造中に可能な限り最大のあるいは比較的大きな割合
で含有する分子を意味する。パーフルオロカーボンポリ
マーは不活性であることが知られている。本発明の固体
アフィニティーマトリックスおよび支持体に用いること
のできるパーフルオロカーボンポリマーとしては例えば
様々なTeflonR フルオロカーボンポリマー、ポリテトラ
フルオロエチレン、ポリビニルフルオライドおよびポリ
ビニリデンジフルオライドなどが挙げられる。(TeflonR
は E. I. du Pont de Nemours and Company 社の登録
商標である）。
【００２１】親水性ポリマーとは、パーフルオロカーボ
ンポリマー担体上の架橋親水性ポリマーコーティングが
バイオテクノロジー処理段階例えばアフィニティーおよ
び膜分離に用いられる様々な洗浄段階に典型的に用いら
れる様々な操作および操作条件に耐えるのに十分な強度
および化学的安定性を有するようにポリマー分子を隣接
類似分子を架橋（分子間架橋）するのに十分な多重度の
水酸基を有している、荷電されていない親水性、水溶性
非環式ポリマーを意味する。好ましくは、親水性ポリマ
ーは、１ポリマー単位あたり６個毎の炭素原子に対して
架橋に利用できる少なくとも一つの水酸基例えば第一級
または第二級水酸基を有する。さらに、親水性ポリマー
は好ましくは、リガンドまたはリガンドのためのバイン
ダーへの結合に利用できる少なくとも一つの部位例えば
末端水酸基を有する。好ましくは、親水性ポリマーは１
ポリマー単位あたり３個又はそれより少ない炭素原子に
対して一つの水酸基を有する直鎖状親水性ポリマーであ
る。約８，０００〜約１５，０００の分子量を有するポ
リビニルアルコールが特に好ましい。親水性ポリマーと
して有用でないポリマーにはアガロース、デキストラ
ン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミンおよ
びスターチが含まれる。親水性ポリマーに用いることの
できる分子量範囲は１０００から水に不溶性となるとこ
ろ、一般に約２０，０００までである。
【００２２】ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、本発
明のマトリックスおよび支持体の製造に用いられるパー
フルオロカーボンポリマー担体に対するコーティングと
して使用できる好ましい親水性ポリマーである。ポリビ
ニルアルコールは −〔ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）〕ｎ− （式中、ｎは反復ポリマー単位数である）で示される反
復ポリマー構造に基づく。
【００２３】二官能性架橋剤とは、親水性ポリマーの水
酸基と共有結合的に結合して親水性ポリマー分子の分子
間架橋を行うことができる部位を有する化合物を意味す
る。例えば、水酸基と反応できる部位には、−ＣＯＣ
ｌ、ＣＯＢｒ、−ＮＣＯおよびＣＨＯが包含される。二
官能性とは架橋剤上に親水性ポリマーの水酸基と反応で
きる二つの部位が存在することを意味する。ホモ二官能
性架橋剤の場合、架橋剤上の親水性ポリマーのヒドロキ
シル基と反応できる二つの部位は同じである。水酸基と
反応できるかかる架橋剤は周知である（例えば１９７８
年７月１８日に Rubinstein らに付与された米国特許第
４,１０１,３８０号を参照されたい。その開示を引用に
より本明細書の記載に含める）。ＰＶＡをそれ自身に架
橋するのに使用できる適切な架橋剤にはジアルデヒド例
えばグルタルアルデヒド、およびジイソシアネート例え
ばトルエンジイソシアネートなどが包含される。ホモ二
官能性架橋剤が好ましく、またジアルデヒドはＰＶＡに
対する好ましい架橋剤である。
【００２４】本発明の親水性ポリマー被覆パーフルオロ
カーボンベースのポリマーマトリックスはリガンドまた
はリガンドのためのバインダーを表面に結合した固体ア
フィニティー支持体の製造に用いることができ、またか
かる支持体はアフィニティー分離を行うのに有用であ
る。リガンドとは抗原、ハプテン、核酸、酵素基質、ビ
タミン、色素または酵素エフェクターおよびインヒビタ
ーを含む他の小有機分子を意味し、またバインダーと
は、抗体、酵素、核酸、結合性タンパク質、結合性タン
パク質の合成擬似物質例えばポリリジンおよびポリエチ
レンイミン類あるいは特異結合、酵素／基質等の相互作
用が可能なその他の生体分子を意味する。
【００２５】本発明の親水性ポリマー被覆パーフルオロ
カーボンポリマーベースのマトリックスの製造方法は、
親水性ポリマーをパーフルオロカーボンポリマー担体の
表面に吸着または被覆することより成る。好ましくは、
パーフルオロカーボン担体をまず、水と混和し得る有機
溶媒例えばアセトンまたはテトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）で湿潤させる。これは１９９２年１０月２７日に付
与された米国特許第５，１５８，８８０号に記載されて
いる。親水性ポリマー例えばポリビニルアルコールを次
に前記担体を被覆するのに十分な量で担体と混合し、そ
して調節された時間、温度およびｐＨ条件下に吸着を進
行させる。次に架橋剤を添加して親水性ポリマーを同様
の分子と架橋させる。好ましくは、ジアルデヒド例えば
テレフタルデヒドを用いて好ましい親水性ポリマーであ
るポリビニルアルコールを架橋する。一般に架橋反応は
調節された時間、温度およびｐＨ条件下に進行させる。
架橋剤の使用およびそれらの使用に適した反応条件は当
該技術分野において周知である（例えば１９７８年７月
１８日にＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎらに付与された米国特許
第４，１０１，３８０号を参照されたい。その開示を引
用により本発明の記載に含める）。
【００２６】固体アフィニティー支持体は、活性化後の
表面がリガンドまたはリガンドのためのバインダーを共
有結合的に結合できるように、マトリックスの親水性表
面を調節された時間、温度およびpH条件下に活性化する
ことによって形成することができる。かかる活性化方法
は当該技術分野において周知である。かかる活性化方法
の例が Stewart, D. J., Immobilization of Triazine
Dyes On Inert Hydrophobic Supports For Affinity Ch
romatography, Thesis for the degree of Doctor of P
hilosophy, University of Cambridge, Kings College
(1989）（その開示を引用により本明細書の記載に含め
る）に記載されている。活性化により、リガンドまたは
リガンドのためのバインダー上のいずれかの部位例えば
タンパク質の−ＮＨ2または−ＣＯＯＨを親水性ポリマ
ーコーティングの水酸基、好ましくは末端水酸基を介し
て共有結合的に結合させることができる。好ましい親水
性ポリマーであるＰＶＡを用いる場合、ＰＶＡはシアヌ
ル酸クロライドの添加により活性化させることができ
る。
【００２７】活性化の後、リガンドまたはリガンドのた
めのバインダーを固体親水性ポリマー被覆パーフルオロ
カーボンベースのポリマーマトリックスに結合して、共
有結合的結合により固体アフィニティー支持体を形成す
る。リガンドまたはリガンドのためのバインダーを適切
に活性化された支持体に共有結合的に結合させるための
手段、およびかかる共有結合的結合を至適化するための
手段は当該技術分野において知られている。例えばリガ
ンドを共有結合的に結合させるための様々な方法が Ste
wart, D. J., Immobilization of Triazine Dyes On In
ert Hydrophobic Supports For Affinity Chromatograp
hy, thesis for the degree of Doctorof Philosophy,
University of Cambridge, Kings College (1989）（そ
の開示を引用により本明細書の記載に含める）記載され
ている。
【００２８】本発明の固体親水性被覆パーフルオロカー
ボンポリマーベースのマトリックスは広範な様々な応用
分野に用いることができる。例えばマトリックスは、パ
ーフルオロカーボンベースポリマー電子回路ボード用の
基体として用いることができる。パーフルオロカーボン
ベースのポリマーは親水性ポリマー例えばＰＶＡで被覆
することができ、そして様々な伝導性材料例えば金属を
その表面に沈着させるように処理することができる。一
応用例においては、ホトレジストで予め処理されそして
紫外光に晒されたパーフルオロカーボンポリマーベース
の支持体上にＰＶＡを吸着させることができ、それによ
って所望の電気系路を規定する。そのＰＶＡ被覆パーフ
ルオロカーボンマトリックスは溶解硝酸銀の溶液（硝酸
銀は希アンモニアの添加により溶解させることができ
る）に浸漬し、そして銀が支持体に沈着するまで数滴の
還元剤例えばホルムアルデヒドを添加することができ
る。さらに、本発明のマトリックスは、湿潤性ポリマー
フィルムまたは粉末として様々な応用に用いることがで
きる。さらに本発明のマトリックスは有色色素適用のた
めの基体としてあるいは上にプリントできる基体として
用いることもできる。
【００２９】本発明の支持体はイムノアッセイにも用い
ることができる。そのようなアッセイの一つは定性的酵
素連結免疫収着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、その
場合色は濾紙表面またはその他の表面上で視覚的に検出
することができる。色以外の検出可能なシグナルも用い
ることができる。
【００３０】もう一つの応用例は、親水性ポリマー被覆
固体パーフルオロカーボンベースのポリマーマトリック
ス上に酵素を固定することによる固定化酵素系例えば酵
素電極などの構築と用途である。この応用例において酵
素は、電気化学的ガスセンサーのパーフルオロカーボン
膜に結合させることができる。酵素は、電気化学的にモ
ニターすることができる生成物を生産しまたは同時反応
成分を消費する反応を触媒するように選択される。電気
化学的シグナルは被検体濃度の尺度となる。この応用例
では、酵素はバインダーとして働き、そして標的被検体
はリガンドとして働く。
【００３１】
【実施例】
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のフルオロポリマー粒
子への吸着 １００ｇのパーフルオロカーボンポリマー粒子（６〜８
ｍ2／ｇ、平均粒度７０ミクロン、デラウエア州ウイル
ミントンの E. I. du Pont de Nemours and Company 社
より入手）を５００mlのテトラヒドロフラン中で一夜撹
拌し、次いで焼結ガラス（等級２）フィルター上、５０
０mlのアセトン中で洗浄した。残留アセトンを、粒子が
依然としてアセトンで湿潤しかつ空気には晒されないよ
うにして、重力下に排液した。得られた半透明材料を
０.７mMポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（分子量１４,
０００、１００％加水分解）（Aldrich Co., Gillingha
m,Dorset, 英国）の水性撹拌溶液に添加し、そしてその
ＰＶＡを２０℃で５時間吸着させた後５０mlの７０mM水
性テレフタルデヒド(Aldrich, Gillingham, Dorset，英
国）を添加した。その混合物を２０mlの５Ｍ ＨＣｌの
添加により酸性化し、そして４時間の架橋処理後、その
材料を沈殿させそして上清を傾瀉除去した。得られた架
橋ポリビニルアルコール被覆パーフルオロカーボンポリ
マーマトリックスを焼結ガラスフィルター上で、２リッ
トルの水、２リットルの６０℃の熱水、および２リット
ルの蒸留水で順次洗浄した。
【００３２】支持体に吸着したＰＶＡ量はＺｗｉｃｋ，
Ｍ．Ｍ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｍ．Ｓｃｉ．，９，
ｐ．２３９３（１９６５）（その開示を引用により本明
細書の開示に含める）に記載された特異的ＰＶＡアッセ
イを用いた上清の差分析により測定した。それは１ｇの
パーフルオロカーボンポリマー担体あたり約２０ｍｇの
ＰＶＡであることがわかった。
【００３３】架橋ＰＶＡ被覆パーフルオロカーボンポリ
マーベースのマトリックスの活性化と活性化方法の至適
化 パーフルオロカーボンポリマー担体１ｇあたり２０ｍｇ
のＰＶＡを有し、そして前述の如く製造された０．５ｇ
の架橋ＰＶＡ被覆パーフルオロカーボンポリマーベース
のマトリックスの試料を０．０、０．１、０．５、１．
０、２．０、３．０、４．０および５．０Ｍの一連の水
性水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液に１時間インキュ
ベートした。得られた材料を次に焼結ガラスフィルター
を用いて濾過しそしてアセトン中の２０ｍＭシアヌル酸
クロライド（Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａ
ｍ，Ｄｏｒｓｅｔ，英国）５ｍｌに２０℃で１０分間添
加した。得られた活性化された材料を空気への曝露を避
けながらアセトン、アセトン／水（５０：５０ｖ／ｖ）
および水で順次洗浄した後、カップリングされた反応性
基を評価した。活性化度（μｍＣｌ−／ｇ（活性化材
料））は、０．１ｇの反応性材料を３ｍｌの０．１Ｍ
ＮａＯＨ中、２０℃で１時間加水分解しそして遊離クロ
ライドイオンをＶｏｇｅｌ，Ａ．Ｉ．，Ｔｅｘｔｂｏｏ
ｋ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｎｏｒｇａｎ
ｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９７８，Ｌｏｎｇｍａｎ
Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．７５４（その開示を引用に
より本明細書の記載に含める）に記載された方法を用い
てアッセイすることにより測定した。活性化の結果、Ｐ
ＶＡの一部の第二級水酸基がシアヌル酸クロライドと結
合した。
【００３４】図１は、予備洗浄におけるＮａＯＨ濃度を
１Ｍとすることが反応性シアヌル酸クロライド基をマト
リックスに導入するのに至適であることを示すグラフで
ある。アルカリ濃度がそれより高いと、より強力な塩基
がカップリングしたシアヌル酸クロライドを加水分解し
てしまうかまたはＰＶＡコーティングの架橋をさらに進
めてしまうために、活性化材料の反応性が低下した。逆
に、より低い濃度のＮａＯＨを用いると、吸着剤上のシ
アヌル酸クロライドの加水分解が低下し、そのために可
能性としての非特異的吸着部位の導入が最小に抑えられ
た。
【００３５】２０ｍｇ（ＰＶＡ）／ｇ（パーフルオロカ
ーボンポリマー担体）を有しそして前述の如く製造され
た５ｇの架橋ＰＶＡ被覆パーフルオロカーボンポリマー
ベースのマトリックスを５０ｍｌの１Ｍ水性水酸化ナト
リウム（ＮａＯＨ）中で１時間インキュベートした。次
に、得られた材料を焼結ガラスフィルターを用いて濾過
しそしてその材料の０．５ｇ試料をアセトン中に０．０
〜０．１Ｍシアヌル酸クロライドを含有する一連の５ｍ
ｌの水性溶液に２０℃で１０分間添加した。シアヌル酸
の使用濃度は図２でグラフにより示す。得られる活性化
された材料を、空気への曝露を避けながら、アセトン、
アセトン／水（５０：５０ｖ／ｖ）および水で順次洗浄
した後カップリングした反応性基数を評価した。活性化
度（μｍＣｌ−／ｇ（活性化材料））は前述の如く測定
した。
【００３６】図２は、１Ｍ ＮａＯＨを至適予備洗浄条
件として用いながらシアヌル酸クロライド濃度を高める
ことの材料の反応性に及ぼす効果を示すグラフである。
活性化度は、約７０μｍＣｌ-／ｇで準プラトーになる
まで直線的に増加したところ、このことは支持体の反応
性レベルを容易に調節し得ることを実証している。１０
mM濃度のシアヌル酸クロライドは、２０μｍＣｌ-／ｇ
（材料）を含有する支持体を生成した。前述の条件下で
は、活性化反応は極めて速やかで、アルカリ性支持体を
シアヌル酸クロライドに添加してから数分内に活性化は
最大となる。
【００３７】図３は、様々な条件下における活性化材料
の安定性を示すグラフである。前述の如く製造された２
０μｍＣｌ-／ｇ（活性化材料）の反応性材料１ｇを三
つの異なる条件、すなわち０.１Ｍ ＮａＯＨ中、０.１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７.０）中、および０.１
Ｍ酢酸中に２０℃で貯蔵した。カップリングされた反応
性基は０.１Ｍ ＮａＯＨ中でただちに加水分解されたが
０.１Ｍ酢酸および０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH
７.０）中では１週間までそれらの反応性の少なくとも
半分を保持した。前述の如く製造された活性化材料の試
料を１０％（ｖ／ｖ）酢酸中で凍結乾燥した後４℃で保
存したところ、３ケ月間保存後も反応性の明白なロスは
みられなかった（前述の手順を用いて測定）。
【００３８】ＨＳＡ、ＩｇＧおよびコンカナバリンＡを
表面に結合したアフィニティー支持体の製造 タンパク質測定アッセイ 前述の如く製造されそして２０μmolＣｌ-／ｇ（活性化
材料）を含有する活性化材料または０.２ｇの加水分解
された材料を０.１Ｍホスフェート緩衝液（pH７.０）中
のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Cohn Fraction V, S
igma Co. 社，Poole, Dorset）（４mg／２ml）に添加し
た。１時間後にカップリング反応を止め、そして固定化
されたＨＳＡの量を分光光度測定的に差により測定し
た。
【００３９】タンパク質の量は、タンパク質溶液の適切
な連続希釈液(２０μｌ）に PierceCoomassie タンパク
質アッセイ試薬（１.０ml）（Pierce社, Luton, Beds,
英国）を添加して測定した。混合しそして室温で１０分
間放置した後、５９５nmでの吸光度を測定した。ヒト血
清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒト免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）（ＰＭＬＳ（Porton Down, Wiltshire, 英国）より
寄贈）およびコンカナバリンＡ（ConＡ）についての標
準曲線を作成した。原液中のタンパク質濃度は、Ａ２８
０nm １％（ｗ／ｖ）をＨＳＡ、ＩｇＧおよびConＡにつ
いてそれぞれ５.８、１４.７（Nakamura, K., Hashimot
o, T., Kato, Y., Shimuran, K. および Kasai, K. -
I., J. Chromatogr., 510 (1990) 101.）および１.１
（Borchert, A., Larsson, P.-O. および Mosbach, K.,
J. Chromatogr., vol. 244, 1982,p. 49.）と推定して
２８０nmでの吸光度によりまず測定した。またＡ２７５
nm１％（ｗ／ｖ）はプロティンＡについては１.６５で
あった（Langone, J. J., Adv. Immunol., vol. 32, 19
82, 157）。
【００４０】図４は、様々なpH値におけるヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ）の活性化支持体へのカップリングを示
すグラフである。ＨＳＡの固定化はpH５で最大（８mg／
ｇ）となる一方、それより高いpH値では、多分、ＨＳＡ
の溶解度が高くなるために、あるいは反応性シアヌル酸
クロライド基が加溶媒分解されるために、固定化される
タンパク質は減少する。前述の如く製造されたが０.１
Ｍエタノールアミンを用いてpH９.０、２０℃で一夜加
水分解されたシアヌル酸クロライド活性化材料である対
照材料に対しては固定化されるタンパク質は顕著に減少
し、また本明細書中にすでに記載した如く製造された架
橋ＰＶＡ被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマ
トリックスに対しては一段と低下した。
【００４１】図５は、ＩｇＧを４〜１１のpH値でカップ
リングした場合の同様の試験の結果を示すグラフであ
る。ＨＳＡのカップリングについて既述したのと同じカ
ップリング条件を用いた。５〜８のpH範囲において１０
mg（ＩｇＧ）／ｇ（材料）という広い至適容量が得られ
た。しかしながらより高いpH値におけるＩｇＧの固定化
には、特にＨＳＡと比較すると、多分、加溶媒分解に先
立ち反応性支持体との相互作用を促進するタンパク質溶
解度の減少が関係した。ＨＳＡについて前述したのと同
じ条件下にエタノールアミンを用いて加水分解するとカ
ップリングされるＩｇＧ量は減少したが、本明細書中に
既述された如く製造されたＰＶＡ被覆パーフルオロカー
ボンポリマーベースのマトリックスに対するタンパク質
吸着についてみられる極めて低いレベルまでの減少では
なかった。
【００４２】図６は、pH５.０および２０℃では添加ア
ルブミンの約６０％が５〜１０分内に活性化支持体にカ
ップリングされ２時間後に固定化が最大となることを示
すグラフである。０.２ｇ量の活性化材料を０.１Ｍアセ
テート緩衝液（pH５.０）中のＨＳＡ（４mg／２ml）試
料に別々に添加した。時間間隔をおいてカップリングを
止め、そして固定化または結合ＨＳＡ量を上清のアッセ
イにより測定した。シアヌル酸クロライド基の高い反応
性は、水性媒質中および生理学的pHでの支持体に対する
生化学物質の速かな固定化を助長する。
【００４３】図７は、ＨＳＡ、ＩｇＧおよびコンカナバ
リンＡはすべて類似した等温線（ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を
示し（濃度が漸増する２ｍｌ溶液を０．１Ｍアセテート
緩衝液（ｐＨ５．０）中で２時間シアヌル酸クロライド
活性化材料（０．２ｇ、２０μｍｏｌＣｌ−／ｇ）と共
にインキュベートした）、約８〜１０ｍｇ／ｇ（活性材
料）の至適カップリング、および比較的低いタンパク質
濃度でさえ約８０％のカップリング収率を与えることを
示すグラフである。それらタンパク質のすべてを、タン
パク質吸着に特徴的な数値である約１．４ｍｇ／ｍ２の
表面被覆率で固定化した（例えばＡｎｄｒａｄｅ，Ｊ．
Ｄ．およびＨｌａｄｙ，Ｖ．，Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓ
ｃｉ．，ｖｏｌ．７９，１９８６，１２参照）。この観
察は、カップリングされたタンパク質が表面に密に充填
された単層を形成することを示唆しているが、一般に、
アフィニティー分子を結合する際に伴う可能性としての
立体障害を緩和するために高密度充填は避けるべきであ
る。この、最大量のタンパク質固定の達成は効率的アフ
ィニティー吸着剤の生産にはつながらないこともあり、
その場合、至適タンパク質表面密度を実験的に決定する
必要があり得る。
【００４４】コンカナバリンＡ固体アフィニティー支持
体での西洋ワサビペルオキシダーゼのクロマトグラフィ
ー分離 下記の如く製造された固体アフィニティー支持体を適切
な緩和液中で平衡させ、５ml／分の流速で Pharmacia
ＨＲ ５／１０カラムに充填し、そしてＰ５００ポン
プ、ＬＣＣ ５００プラスコントローラー、ＵＶ−Ｉシ
ングルパス（path）モニターおよびＬＫＢ ２２１２ He
lirac フラクションコレクターより成る Pharmacia Ｆ
ＰＬＣ系と共に用いた。
【００４５】コンカナバリンＡ（レクチン）を活性化材
料にカップリングし、そしてそれらの西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）精製能をテストした。コンカナバ
リンＡアフィニティー支持体は、０．０５Ｍアセテー
ト、０．５ＭＮａＣｌ）１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ
ＭｎＣｌ２、ｐＨ５．１（カップリング緩衝液）中で、
α−メチル−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ社，Ｐ
ｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，英国）の存在下にレクチンを
２時間カップリングすることにより製造した。使用する
前にその材料をカップリング緩衝液で洗浄し、そして
０．１Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０中、４℃で４８
時間撹拌した。
【００４６】コンカナバリンＡアフィニティー支持体
は、０.０５Ｍアセテート、０.５ＭＮａＣｌ、１mM Ｃ
ａＣｌ2、１mM ＭｎＣｌ2、pH５.１中でα−メチル−Ｄ
−グルコピラノシドの存在下にレクチンを２時間カップ
リングすることにより合成した。使用する前にその材料
をカップリング緩衝液で洗浄し、そして０.１Ｍエタノ
ールアミン、pH９.０中で４℃で４８時間撹拌した。
【００４７】粗製西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）（Ｓｉｇｍａ社，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，英
国）調製物をコンカナバリンＡアフィニティー支持体に
適用し、そして未結合タンパク質を洗浄除去した後、吸
着ＨＲＰを競合グルコピラノシドを用いて特異的に溶出
させた。２．２の溶出フラクションのＲＺ比（４０５ｎ
ｍでの吸光度／２８０ｎｍでの吸光度）は、８０％総括
回収率をもって、粗製材料の純度の５．６倍に相当し
た。
【００４８】図８に関し、使用されたカラムは、０．５
×１０ｃｍであって、３．６ｍｇ（コンカナバリンＡ）
／ｇ（支持体）および７０μｍパーフルオロカーボンポ
リマー担体を含有した。カラム条件は次のとおりであっ
た：移動相０．０５Ｍアセテート、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、（ＦＳＡ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒ
ｏｕｇｈ，Ｌｅｉｃｓ，英国）、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、
ｐＨ５．１；流速：１ｍｌ／分；試料は１分時点で１ｍ
ｌの粗製ＨＲＰ（５ｍｇ／ｍｌ）を注入した；溶出緩衝
液：移動相（３ｍｌ）中の２５ｍＭアルファーメチル−
Ｄ−グルコピラノシドは５分時点で注入した；フラクシ
ョン（１ｍｌ）を２８０ｎｍおよび４０５ｎｍでアッセ
イした。
【００４９】プロティンＡ固体アフィニティー支持体で
のヒトＩｇＧのクロマトグラフィー分離 前述のカップリング法を用いてプロティンＡ（黄色ブド
ウ球菌（Staphylococcus aureus）コワン（Cowan）株の
細胞壁から精製、Sigma Co. 社, Poole, Dorset，英
国）を４.６μmolＣｌ-／ｇ（活性化マトリックス）を
有するシアヌル酸クロライド活性化パーフルオロカーボ
ンポリマーベースの活性化マトリックスにカップリング
した。過剰の反応性基をエタノールアミンで不活性化し
た後、（theNational Blood Transfusion Center (英国
Nottingham）において既知の供血者から入手した）血
漿をゲルに適用してＩｇＧを精製した（図９Ａ）。０.
１Ｍクエン酸塩（pH３.０）で溶出されたフラクション
は０.９mgのＩｇＧを含有し、他の支持体と等価なキャ
パシティーを示した（例えば Fuglistaller, J. Immuno
l.Meth., vol. 124, 1989, p. 171参照）。ＩｇＧの純
製試料を適用した場合も、アフィニティー８０％のアフ
ィニティー吸着タンパク質回収率で同様のキャパシティ
ーを示した。
【００５０】図９に関し、使用したカラムは０．５×１
０ｃｍであり、０．７ｍｇ（プロティンＡ）／ｇ（支持
体）および７０μｍパーフルオロカーボンポリマー担体
を含有した。カラム条件は次のとおりであった：移動相
０．１ＭＮａ２ＨＰＯ４緩衝液ｐＨ８．０；流速：２ｍ
ｌ／分；試料は１分時点で１ｍｌのヒト血漿を注入し
た；溶出緩衝液：０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ３．０）
（３ｍｌ）を６分時点で注入した；（２ｍｌ）フラクシ
ョンを２８０ｎｍでアッセイした。
【００５１】本発明の新しい特徴および本発明それ自体
は、その構成および操作方法の両方に関し、発明の詳細
な説明を添付図面と伴せ読むとき最良に理解されよう。
添付図面中同じ符号は同じ部分を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】シアヌル酸クロライドを架橋ポリビニルアルコ
ール被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリ
ックスに導入する際の予備洗浄におけるＮａＯＨの効果
を示すグラフである。
【図２】架橋ポリビニルアルコール被覆パーフルオロカ
ーボンポリマーベースのマトリックスの活性化に対する
シアヌル酸クロライド濃度の効果を示すグラフである。
【図３】三つの異なる条件すなわち０.１Ｍ ＮａＯＨ
（丸）、０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７.０）
（三角）および０.１Ｍ酢酸（四角）中の活性化架橋ポ
リビニルアルコール被覆パーフルオロカーボンポリマー
ベースの材料の保存効果を示すグラフである。
【図４】活性化架橋ポリビニルアルコール被覆パーフル
オロカーボンポリマーベースの材料の表面へのヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）の結合に対するpHの効果を示すグ
ラフである。図示されているのは次のとおりである：活
性化支持体（円）、０.１Ｍエタノールアミンで加水分
解された活性化支持体（三角）、および架橋ポリビニル
アルコール被覆パーフルオロカーボンポリマーベースの
マトリックス（ダイヤ）。
【図５】活性化架橋ポリビニルアルコール被覆パーフル
オロカーボンポリマーベースの材料の表面へのヒトＩｇ
Ｇの結合に対するpHの効果を示すグラフである。図示さ
れているのは次のとおりである：活性化支持体（円）、
０.１Ｍエタノールアミンで加水分解された活性化支持
体（三角）、および架橋ポリビニルアルコール被覆パー
フルオロカーボンポリマーベースのマトリックス（ダイ
ヤ）。
【図６】活性化架橋ポリビニルアルコール被覆パーフル
オロカーボンポリマーベースの材料の表面へのＨＳＡの
結合についての経時変化を示すグラフである。
【図７】ＨＳＡ（丸）、ＩｇＧ（三角）およびコンカナ
バリンＡ（四角）を活性化架橋ポリビニルアルコール被
覆パーフルオロカーボンポリマーベースの材料にカップ
リングするための等温線を示すグラフである。
【図８】コンカナバリンＡ固体アフィニティー支持体を
用いた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の精製を
示すグラフである。
【図９】プロティンＡ固体アフィニティー支持体を用い
たヒト血漿からのＩｇＧの精製を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 クリストフアー・ロビン・ロウ イギリス国シー・ビー10 ２ピー・ダブ リユー．サフランウオールデン．ヘンプ ステツド．ザライムズ（番地なし) (72)発明者 イーアン・ピツトフイールド イギリス国ドーセツト．フオレストロー ド18 (72)発明者 ダンカン・ロス・パービス イギリス国ケンブリツジシヤー州フロー ビシヤークロウス22 (56)参考文献 特開 昭62−166887（ＪＰ，Ａ) 実開 昭56−175100（ＪＰ，Ｕ) Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，510 （1990），ｐ．177−187 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 30/48 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （１）ポリ（テトラフルオロエチレ
    ン）、ポリ（ビニルフルオライド）およびポリ（ビニリ
    デンジフルオライド）よりなる群から選択された化学的
    に不活性なパーフルオロカーボンポリマーの多孔性粒子
    を水混和性有機溶媒に分散させて該多孔性粒子の表面を
    濡らす工程、 （２）工程１で得られた分散液中の水混和性溶媒から表
    面が水混和性溶媒で濡れた多孔性パーフルオロカーボン
    ポリマーを分離する工程、 （３）工程２で得られた該混和性溶媒で濡れたパーフル
    オロカーボンポリマー粒子を分子量１，０００〜２０，
    ０００のポリ（ビニルアルコール）の水溶液に分散させ
    て分散液を形成させる工程、 （４）工程３で得られた分散液をホモ二官能性架橋剤と
    混合してフルオロカーボンポリマーの表面に吸着したポ
    リ（ビニルアルコール）を架橋させる工程、 （５）工程４で得られた分散液から、架橋したポリ（ビ
    ニルアルコール）で被覆された粒子を分離する工程、 （６）架橋ポリ（ビニルアルコール）の表面の水酸基を
    活性化させてその表面へのリガンドまたはリガンドのた
    めのバインダーの共有結合が可能となるようにする工程
    および （７）リガンドまたはリガンドのためのバインダーをポ
    リ（ビニルアルコール）の表面の活性化された水酸基と
    共有結合させる工程の連続工程からなる吸着用粒子の製
    造方法。
  2. 【請求項２】 水混和性有機溶媒がアセトンまたはテト
    ラヒドロフランである請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ホモ二官能性架橋剤が−ＣＯＣｌ、−Ｃ
    ＯＢｒ、−ＮＣＯおよび−ＣＨＯからなる群から選択さ
    れた共有結合を形成し得る基を含有するものである請求
    項１記載の方法。
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