JPH0144725B2 - - Google Patents
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Description
本発明は全多孔質活性化ゲルに関する。更に詳
しくは、ビニルアルコール単位を主構成成分とす
る架橋共重合体と活性基とから構成される全多孔
質活性化ゲルに関する。 生化学の領域で、蛋白質や酵素その他の生体物
質を、それを含む混合物から分離することは重要
な課題の一つであり、過去多大の努力がはらわれ
てきた。 生体物質を分離する方法としては、現在多くの
方法が用いられている。たとえば(i)溶解度差を利
用する方法(ii)電荷の差を利用する方法(iii)分子の大
きさ、あるいは形状の差を利用する方法、(iv)化学
的または物理的親和力の差を利用する方法などが
あげられる。また生物学的に特異的親和性を利用
して分離、製精、除去する方法は、選択性が高
く、汎用されている。特にアフイニテイを示す物
質の一方を不溶性マトリツクスに固定化して他方
を選択的に分離するアフイニテイクロマトグラフ
イーは操作性の点から広く普及している（千畑一
郎、土佐哲也、松尾雄志共著“アフイニテイクロ
マトグラフイー”講談社参照）。 生物学的親和性を示す物質を不溶化するには、
共有結合により活性化ゲルに固定化する方法が、
もつとも好ましい。生物学的親和性を示す物質を
共有結合により不溶化するには、アミノ基、カル
ボキシル基、水酸基、チオール基等の活性水素を
持つ求核反応基と付加および／または置換反応に
より共有結合を生ずる活性基が共有結合によりゲ
ルに固定化された、いわゆる活性化ゲルが必要で
ある。 活性化されたゲルは(i)生物学的親和性を示す物
質を、その生物学的親和性を失なわずに結合でき
ること(ii)生物学的親和性を示す物質を高密度に結
合できるように、活性基の密度が高いこと(iii)生物
学的親和性を示す物質を結合した場合に、目的と
する物質のみを選択的に吸着するように、マトリ
ツクスの非特異吸着が少ないこと(iv)生物学的親和
性を示す物質(A)を結合する場合やＡを結合したゲ
ルに該物質と親和性を示す物質(B)を含む液を接触
させてＢをゲルに吸着させる時、また必要に応じ
てＢを溶出する際の溶媒、変性剤、PHの変化、温
度に耐えられること、(v)多孔質で生理活性物質な
どがゲルのマトリツクス中に十分拡散できること
(vi)保存中に腐敗しないこと(vii)物理的な力に対して
抵抗性があり、活性化、固定化等の操作中に破壊
されないことなどの特性が望まれる。またアフイ
ニテイクロマトグラフイーはゲルをカラムに充填
しておこなうことがしばしばおこなわれる。その
場合には液体を高流速で流せるように、十分な機
械的強度が要求される。 また、場合によつては、凍結乾燥してエチレン
オキサイド滅菌、熱滅菌や放射線滅菌をおこなう
必要が生じるので、これらの滅菌によつてゲルの
化学構造が破壊されないことがのぞましい。 従来、かかる目的に対して、アガロース、セル
ロース等の天然の不溶性担体をブロムシアンで活
性化したものが多く用いられてきた。特に、アガ
ロースが広く用いられてきた（たとえば商品名セ
フアローズ、フアルマシア社、スウエーデン）。
しかし、アガロースは以下のような欠点を有す
る。 すなわち、先ず、アガロースは強度が不十分な
為に操作上の制約が多い。たとえば、活性化、固
定化等の操作中に破壊されたり、カラムに充填し
た場合に、分離すべき物質を含む液体を高流速で
流すことができない等の欠点を有する。 更に、活性化ゲルは、ある場合には滅菌を必要
とする。たとえば、生体中の物質を除去するため
に体液の体外循環をするのに用いる場合には、滅
菌をしなくてはならない。その場合、凍結乾燥し
てエチレンオキサイドによる滅菌法がよく用いら
れるが、アガロースは凍結乾燥によつて細孔が破
壊され、再び水性溶媒に分散しても元に戻らない
ため、凍結乾燥滅菌法は好ましくなく、同様に熱
滅菌も細孔を破壊するのでアガロースに対しては
用いることができない。又放射線滅菌は担体を汚
染しないので一般には特に好ましいが、アガロー
スは放射線照射でその骨格が破壊されるため用い
ることができる。 そこで従来の活性化ゲルの欠点を克服した活性
化ゲルを開発すべく鋭意研究の結果、ビニルアル
コール単位を主構成成分とし比表面積が５〜1000
m2／ｇの全多孔質架橋共重合体からなるマトリツ
クスおよび該マトリツクスに共有結合した活性基
から構成される全多孔質活性化ゲルの開発に成功
し、本発明に至つた。 すなわち、本発明に従えば、ビニルアルコール
単位、炭素数４〜５のカルボン酸ビニルエステル
単位並びに下記式（）および／又は（）で表
わされる単量体 （ただしR1、R2、およびR3は、それぞれ独立に、
CH2＝CH−CH2−、CH≡Ｃ−CH2−および
しくは、ビニルアルコール単位を主構成成分とす
る架橋共重合体と活性基とから構成される全多孔
質活性化ゲルに関する。 生化学の領域で、蛋白質や酵素その他の生体物
質を、それを含む混合物から分離することは重要
な課題の一つであり、過去多大の努力がはらわれ
てきた。 生体物質を分離する方法としては、現在多くの
方法が用いられている。たとえば(i)溶解度差を利
用する方法(ii)電荷の差を利用する方法(iii)分子の大
きさ、あるいは形状の差を利用する方法、(iv)化学
的または物理的親和力の差を利用する方法などが
あげられる。また生物学的に特異的親和性を利用
して分離、製精、除去する方法は、選択性が高
く、汎用されている。特にアフイニテイを示す物
質の一方を不溶性マトリツクスに固定化して他方
を選択的に分離するアフイニテイクロマトグラフ
イーは操作性の点から広く普及している（千畑一
郎、土佐哲也、松尾雄志共著“アフイニテイクロ
マトグラフイー”講談社参照）。 生物学的親和性を示す物質を不溶化するには、
共有結合により活性化ゲルに固定化する方法が、
もつとも好ましい。生物学的親和性を示す物質を
共有結合により不溶化するには、アミノ基、カル
ボキシル基、水酸基、チオール基等の活性水素を
持つ求核反応基と付加および／または置換反応に
より共有結合を生ずる活性基が共有結合によりゲ
ルに固定化された、いわゆる活性化ゲルが必要で
ある。 活性化されたゲルは(i)生物学的親和性を示す物
質を、その生物学的親和性を失なわずに結合でき
ること(ii)生物学的親和性を示す物質を高密度に結
合できるように、活性基の密度が高いこと(iii)生物
学的親和性を示す物質を結合した場合に、目的と
する物質のみを選択的に吸着するように、マトリ
ツクスの非特異吸着が少ないこと(iv)生物学的親和
性を示す物質(A)を結合する場合やＡを結合したゲ
ルに該物質と親和性を示す物質(B)を含む液を接触
させてＢをゲルに吸着させる時、また必要に応じ
てＢを溶出する際の溶媒、変性剤、PHの変化、温
度に耐えられること、(v)多孔質で生理活性物質な
どがゲルのマトリツクス中に十分拡散できること
(vi)保存中に腐敗しないこと(vii)物理的な力に対して
抵抗性があり、活性化、固定化等の操作中に破壊
されないことなどの特性が望まれる。またアフイ
ニテイクロマトグラフイーはゲルをカラムに充填
しておこなうことがしばしばおこなわれる。その
場合には液体を高流速で流せるように、十分な機
械的強度が要求される。 また、場合によつては、凍結乾燥してエチレン
オキサイド滅菌、熱滅菌や放射線滅菌をおこなう
必要が生じるので、これらの滅菌によつてゲルの
化学構造が破壊されないことがのぞましい。 従来、かかる目的に対して、アガロース、セル
ロース等の天然の不溶性担体をブロムシアンで活
性化したものが多く用いられてきた。特に、アガ
ロースが広く用いられてきた（たとえば商品名セ
フアローズ、フアルマシア社、スウエーデン）。
しかし、アガロースは以下のような欠点を有す
る。 すなわち、先ず、アガロースは強度が不十分な
為に操作上の制約が多い。たとえば、活性化、固
定化等の操作中に破壊されたり、カラムに充填し
た場合に、分離すべき物質を含む液体を高流速で
流すことができない等の欠点を有する。 更に、活性化ゲルは、ある場合には滅菌を必要
とする。たとえば、生体中の物質を除去するため
に体液の体外循環をするのに用いる場合には、滅
菌をしなくてはならない。その場合、凍結乾燥し
てエチレンオキサイドによる滅菌法がよく用いら
れるが、アガロースは凍結乾燥によつて細孔が破
壊され、再び水性溶媒に分散しても元に戻らない
ため、凍結乾燥滅菌法は好ましくなく、同様に熱
滅菌も細孔を破壊するのでアガロースに対しては
用いることができない。又放射線滅菌は担体を汚
染しないので一般には特に好ましいが、アガロー
スは放射線照射でその骨格が破壊されるため用い
ることができる。 そこで従来の活性化ゲルの欠点を克服した活性
化ゲルを開発すべく鋭意研究の結果、ビニルアル
コール単位を主構成成分とし比表面積が５〜1000
m2／ｇの全多孔質架橋共重合体からなるマトリツ
クスおよび該マトリツクスに共有結合した活性基
から構成される全多孔質活性化ゲルの開発に成功
し、本発明に至つた。 すなわち、本発明に従えば、ビニルアルコール
単位、炭素数４〜５のカルボン酸ビニルエステル
単位並びに下記式（）および／又は（）で表
わされる単量体 （ただしR1、R2、およびR3は、それぞれ独立に、
CH2＝CH−CH2−、CH≡Ｃ−CH2−および
【式】を示す）
より誘導される架橋単位よりなり、下記式
Ｘ＝W2／M2×n2／W1／M1×n1＋W2／M2×n2
（ただし
M1；カルボン酸ビニルエステルの分子量
M2；架橋性単量体の分子量
W1；重合に用いたカルボン酸ビニルエステルの
重量 W2；重合に用いた架橋性単量体の重量 n1；カルボン酸ビニルエステルが有するビニル基
の数 n2；架橋性単量体が有するエチレン性二重結合の
数＝３） で表される架橋度×（架橋単位の割合）が0.1≦Ｘ
≦0.4の範囲にあり、ビニルアルコール単位の量
（qOH）が5.0meq／ｇ〜17.0meq／ｇの範囲にあ
るマトリツクス及び該マトリツクスのビニルアル
コール単位の水酸基の酸素原子を介して共有結合
したイミドカーボネート基、シアネートエステル
基およびエポキシ基の少なくとも一種300〜
3000μmol／ｇより構成され、かつ下記の(A)〜(D)
の物性を有する蛋白質の分離用全多孔質活性化ゲ
ルが提供される。 (A) 比表面積（SA）５〜100m2／ｇ (B) 保水量（WR）0.5〜6.0ｇ／ｇ (C) 平均粒径（DW）５〜1000μｍ (D) マトリツクスの排除限界分子量103〜108 活性基は、生物学的親和性を有する物質のアミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等の活
性水素を有する求核反応基と置換および／または
付加反応しうることが必要であり、且つ湿潤状態
で水と激しく反応しない安定性と、求核置換基を
有する生物物質の生理活性をそこなわずに反応し
て共有結合しうる活性とを同時に必要としてい
る。前記イミドカーボネート基、シアネートエス
テル基及び／又はエポキシ基の活性基の密度は乾
燥ゲル１ｇあたり300〜3000μmol、好ましくは
500〜3000μmolである。 活性基の密度はたとえばシアネートエステル基
を有する活性化ゲルの場合は、Wilchekらの方法
（Biochem.Biophys.Res Commun.、84、７
（1978）参照）で測定することができる。ピリジ
ン、濃塩酸およびバルビツール酸より調製した定
量用試薬と活性化ゲルを40℃で反応させ、反応溶
液を濾過し、575nｍにおける濾液の吸光度を測
定することによつて、活性基の量を知ることがで
きる。またエポキシ基を活性基として有するゲル
の場合は、活性化されたゲルをチオ硫酸ソーダと
反応させ遊離した水酸イオンを酸で滴定して測定
することができる（L.Sunbdery、J.Porath、J.
Chromatogr.、90、87（1974）参照）。また簡便な
方法としては活性化ゲルとオリゴペプチドを接触
させ、結合したオリゴペプチドの量から求める方
法がある（R.Axen、S.Ernback、Eur.J.
Biochem.、18、351（1971）参照）。 本発明の活性化ゲルのマトリツクスはビニルア
ルコール単位を主構成成分とする全多孔質共重合
体であり、架橋単位によつてパーマネントポアが
維持される。架橋単位は化学的に安定でありかつ
生体物質の非特異吸着が少ないポリビニル又はポ
リアリルモノマー単位がのぞましい。たとえば、
トリアリルイソシアヌレート、トリアリルシアヌ
レーナ等トリアジン環を有する架橋性単量体類、
エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレ
ングリコールジメタクリレート等のジ（メタ）ア
クリレート類、ブタンジオールジビニルエーテ
ル、ジエチレングリコールジビニルエーテル、テ
トラビニルグリオキザール等のポリビニルエーテ
ル類、ジアリリデンペンタエリスリツト、テトラ
アリロキシエタンのようなポリアリルエーテル類
があるが強度、微細孔構造、化学的安定性等の面
よりトリアリルイソシアヌレート単位が特に好ま
しい。本発明の活性化ゲルのマトリツクスは本発
明の活性化ゲルの特性を妨害しない単位を含んで
いてもかまわない。そのような単位としてはたと
えばカルボン酸ビニルエステル単位、ビニルエー
テル単位等があげられる。 本発明の活性化ゲルの保水量（以下WRという）
は0.5〜６ｇ／ｇの範囲にあるのが適当であり、
好ましくは1.0〜5.0ｇ／ｇの範囲である。WRとは
ゲルを水と平衡した時のゲルが粒子内に含みうる
水の量をゲル乾燥重量あたりの値として表示した
ものである。つまりWRはゲル内の孔量の目安に
なる。WRが大きくなると、水中においてゲル単
位体積あたりの骨格を形成する部分、つまりゲル
そのものの重量が相対的に低下する。そのため
WRが大きすぎると水中においてゲルの機械的強
度が低下するWRが小さすぎると、分離に有効な
孔量が少なくなるので分離能力が低下する。した
がつてWRが適当な範囲にあるのが好ましい。WR
は蒸留水と十分平衡にしたゲルを遠心分離器にか
けてゲル表面に付着している水を除去した後、そ
の重量（W1）を測定し、さらにそのゲルを乾燥
して乾燥後の重量（W2）を求め次式によつて求
めることができる。 WR＝W1−W2／W2 本発明の活性化ゲルは全多孔質であるため、乾
燥状態で大きい比表面積を有する。ここで、全多
孔質とは粒子の内部までポアが分布している構造
をいう。一般に架橋構造を持つ有機合成高分子
は、その高分子と親和性のある溶媒中で膨潤し乾
燥すると収縮する。膨潤時に溶媒が満たされてい
るポアが架橋の網目のみで維持されている軟質ゲ
ルの場合は、乾燥すると網目がつぶれてしまい、
ポアはほとんど消失する。この場合の比表面積は
ほとんど粒子の外側だけの値になるため一般に１
m2／ｇ以下の低い値を示す。たとえば従来アフイ
ニテイクロマトグラフイー用担体として用いられ
ているアガロースは軟質ゲルであるため、乾燥に
よつてポアが消失してしまうため、通常は水性溶
媒に膨潤させてある。一方ポアがしつかりした構
造を持つ硬質ゲルの場合は、乾燥した場合ポアは
多少収縮するものの膨潤時の状態をほとんど維持
する、つまりパーマネントポアを有する。したが
つて比表面積は軟質ゲルの値より高い値を示す。
本発明の活性化ゲルは通常５〜1000m2／ｇの比表
面積を有する。比表面積の測定法はいろいろある
が本発明では最も一般的な窒素ガスによるBET
法で求めた。また比表面積測定に用いるサンプル
は十分乾燥しておかねばならない。本発明のゲル
は親水性が大で乾燥しにくいので、水にぬれたゲ
ルをアセトンと平衡にした後60℃以下で減圧乾燥
するのがよい。 アフイニテイクロマトグラフイーは一般に分子
量の大きな分子の分離、精製、除去に用いられる
のでMlimはできるだけ大きい方がよい。 本発明のゲルにおいてはMlimは103〜108の範
囲にある。Mlimはゲルのポア内へ浸透できない
分子の分子量の下限を表す値である。Mlimは
GPCの検量線から求められる。検量線はゲルを
充填したカラムについて横軸に溶出容量、縦軸に
分子量の対数を目盛つたグラフに分子量既知のサ
ンプルの測定データをプロツトして得られ、縦軸
にほとんど平衡な線と、それに続く負の勾配をも
つた線からなる。 本発明におけるMlimは、分子量既知の標準物
質としてポリエチレングリコールまたはデキスト
ランを用い、蒸留水を溶媒として求めた検量線の
縦軸に平行な線の延長と、傾斜した線の延長が交
わる点の縦軸の値として表わされる。なお、通常
市販されている水溶性標準高分子は分子量200万
以下のものしかないので、Mlimが200万以上の
ゲルについては完全な検量線を求めることができ
ない。したがつてこのようなゲルのMlimは正確
には求められないが、分子量200万までの検量線
の延長と、同様な条件で測定したMlimの低いゲ
ルの縦軸に平行な線の延長との交点より推定す
る。 本発明の活性化ゲルの平均粒径は特に制限はな
いが５〜1000μｍの範囲にあるのがよい。粒径は
コールターカウンター（米国コールターエレクト
ロニクス社）やハイアツク（米国パシフイツクサ
イエンスフイツクカンパニー）などの粒径測定器
を用いて測定することができる。 以下に本発明の活性化ゲルの合成法の１例をの
べる。 本発明の活性化ゲルは架橋単位によつてパーマ
ネントポアが維持された、ビニルアルコール単位
を主構成成分とする全多孔質共重合体の水酸基に
活性化試薬を用いて活性基を結合することによつ
てうることができる。架橋単位としては化学的に
安定でありかつ生体物質の非特異吸着が少ないポ
リビニル又はポリアリルモノマー単位がのぞまし
い。たとえばトリアリルイソシアヌレート、トリ
アリルシアヌレート等トリアジン環を有する架橋
性単量体類、エチレングリコールジメタクリレー
ト、ジエチレングリコールジメタクリレート等の
ジ（メタ）アクリレート類、ブタンジオールジビ
ニルエーテル、ジエチレングリコールジビニルエ
ーテル、テトラビニルグリオキザール等のポリビ
ニルエーテル類、ジアリリデンペンタエリスリツ
ト、テトラアリロキシエタンのようなポリアリル
エーテル類があるが、強度、微細孔構造、化学的
安定性の面よりトリアリルイソシアヌレート単位
が特に好ましい。本発明のゲルのマトリツクスは
本発明の活性化ゲルの特性を妨害しない単位を含
んでいてもかまわない。そのような単位としては
たとえばカルボン酸ビニルエステル単位、ビニル
エーテル単位等があげられる。 前述の如く、本発明の活性化ゲルのマトリツク
スは、例えばビニルアルコール単位、カルボン酸
ビニルエステル単位、および２つ以上のエチレン
性二重結合および／またはアセチレン性三重合結
合を有する架橋単位よりなり、下記式で定義され
る架橋度（X1）は0.1≦Ｘ≦0.4の範囲にあるのが
好ましく、更に好ましくは0.1≦Ｘ≦0.3である。 X1＝n2c／ａ＋n1b＋n2c …(1) 但し ａ；ビニルアルコール単位のモル数 ｂ；カルボン酸ビニルエステル単位のモル数 ｃ；架橋単位のモル数 n1；カルボン酸ビニルエステル単位が有するビニ
ル基の数 n2；架橋単位が有するエチレン性二重結合およ
び／またはアセチレン性三重結合の数 本発明の活性化ゲルの活性基の密度はマトリツ
クスのビニルアルコール単位の数が多いほど高く
なりうる。又ビニルアルコール単位の数が多いほ
ど親水性が増すのでこの面からもビニルアルコー
ル単位が多い方がのぞましい。しかしながら多す
ぎるとマトリツクスの強度が減少する。本発明の
活性化ゲルのマトリツクスにおいてはマトリツク
ス単位重量あたりのビニルアルコール単位の数
（qOH）は前記した通り5.0〜17.0meq／ｇである。 qOHはゲルをピリジン溶媒中で無水酢酸と反応
させて、水酸基と反応して消費した無水酢酸の量
又はゲルの重量変化を測定し、これから求めるこ
とができる。乾燥ゲル１ｇが１ｍmolの無水酢酸
と反応したときのqOHが1meq／ｇである。 本発明の活性化ゲルのマトリツクスは生体物質
の非特異吸着が少ないことがのぞましい。マトリ
ツクスにおける生体物質の非特異吸着の程度はマ
トリツクスを例えばカラムに充填しカラムに生体
物質を含有する水性溶液を流すことによつてマト
リツクスと接触させ、マトリツクスに吸着されず
に流出した生体物質の量より知ることができる。
ここに用いられる生体物質としてはたとえば、ア
ミノ酸や血清タンパクの一つであるアルブミン等
があげられる。 本発明の活性化ゲルのマトリツクスは、前述の
活性化ゲルと同様に保水量（WR）は0.5〜６ｇ／
ｇの範囲にあるのが適当であり、好ましくは1.0
〜５ｇ／ｇの範囲である。また比表面積は５〜
1000m2／ｇを有する。 更にMlimは103〜108の範囲にある。WR比表面
積、Mlimの測定は活性化ゲルの場合と同様の方
法でおこなうことができる。本発明の活性化ゲル
のマトリツクスの平均粒径は特に制限はないが５
〜1000μｍの範囲にあるのがよい。 本発明の活性ゲルは、上記のような特性を有す
るマトリツクスのビニルアルコール単位の水酸基
に活性化試薬を用いて活性基を結合することによ
つてうることができる。 活性化試薬としてはハロゲン化シアン、ビスエ
ポキシド、エピクロルヒドリン、をあげることが
できる。活性化試薬としてあげたハロゲン化シア
ンのうちブロムシアンによる活性化はたとえば次
の方法でおこなうことができる。適当量の本発明
のマトリツクスを水に懸濁し、撹拌しながらカセ
イソーダで水性懸濁液のPHを11〜12にする。次い
でPHを11〜12に維持しつつブロムシアン水溶液を
添加する。反応後はガラスフイルター等を用いて
濾過をおこない、次いで水で洗浄することによつ
て活性基としてシアネートエステル又はイミドカ
ーボネート基を有する活性化ゲルを得ることがで
きる。同様にアルカリ条件下ビスエポキシドまた
はエピクロルヒドリンと接触させることにより活
性基としてエポキシ基を有するゲルを得ることが
できる。ハロゲン化トリアジンによる活性化もア
ルカリ条件下ゲルとハロゲン化トリアジンを接触
させることによりおこなうことができる。 活性化ゲルは緩衝液中でアミノ基、カルボキシ
ル基、水酸基、チオール基を有する有機化合物と
接触させることにより、当該有機化合物をゲルに
固定できる。固定化は有機化合物がそれ自身が有
している生物学的親和性を失なわないような条件
でおこなわれなければならない。一般的には100
℃以下、PH３〜13の範囲でおこなわれるが、固定
化する有機化合物の種類によつて最適な条件が選
択される。ここで用いられる有機化合物として
は、たとえば抗原、抗体、酵素、アミノ酸、オリ
ゴペプチドポリペプチドおよび核酸等をあげるこ
とができる。生物学的親和性を示す有機化合物を
固定化した本発明の活性化ゲルは、分離、精製、
除去すべき物質を含む液体と接触させることによ
り、その物質を分離、精製、除去できる。 以下に本発明の活性化ゲルのマトリツクスの製
造法の１例をのべる。 本発明の活性化ゲルのマトリツクスはカルボン
酸ビニルエステルとたとえば下記式（）、（）
で示されるトリアジン環を有する化合物、エチレ
ングリコールジメタクリレート、ジエチレングリ
コールジメタクリレート等のジ（メタ）アクリレ
ート類、ブタンジオールジビニルエーテル、ジエ
チレングリコールジビニルエーテル、テトラビニ
ルグリオキザール特のポリビニルエーテル類、ジ
アリリデンペンタエリスリツト、テトラアリロキ
シエタンのようなポリアリルエーテル類から選ば
れた架橋性単量体を共重合して該共重合体をエス
テル交換又はケン化することによつてうることが
できるが、カルボン酸ビニルエステルとの共重合
性および形成されたマトリツクスの強度、微細孔
構造、化学的安定性の面からトリアリルイソシア
ヌレートが最も好ましい。 （ただしR1、R2およびR3は、それぞれ独立に、
CH2＝CH−CH2−、CH≡Ｃ−CH2−および
重量 W2；重合に用いた架橋性単量体の重量 n1；カルボン酸ビニルエステルが有するビニル基
の数 n2；架橋性単量体が有するエチレン性二重結合の
数＝３） で表される架橋度×（架橋単位の割合）が0.1≦Ｘ
≦0.4の範囲にあり、ビニルアルコール単位の量
（qOH）が5.0meq／ｇ〜17.0meq／ｇの範囲にあ
るマトリツクス及び該マトリツクスのビニルアル
コール単位の水酸基の酸素原子を介して共有結合
したイミドカーボネート基、シアネートエステル
基およびエポキシ基の少なくとも一種300〜
3000μmol／ｇより構成され、かつ下記の(A)〜(D)
の物性を有する蛋白質の分離用全多孔質活性化ゲ
ルが提供される。 (A) 比表面積（SA）５〜100m2／ｇ (B) 保水量（WR）0.5〜6.0ｇ／ｇ (C) 平均粒径（DW）５〜1000μｍ (D) マトリツクスの排除限界分子量103〜108 活性基は、生物学的親和性を有する物質のアミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等の活
性水素を有する求核反応基と置換および／または
付加反応しうることが必要であり、且つ湿潤状態
で水と激しく反応しない安定性と、求核置換基を
有する生物物質の生理活性をそこなわずに反応し
て共有結合しうる活性とを同時に必要としてい
る。前記イミドカーボネート基、シアネートエス
テル基及び／又はエポキシ基の活性基の密度は乾
燥ゲル１ｇあたり300〜3000μmol、好ましくは
500〜3000μmolである。 活性基の密度はたとえばシアネートエステル基
を有する活性化ゲルの場合は、Wilchekらの方法
（Biochem.Biophys.Res Commun.、84、７
（1978）参照）で測定することができる。ピリジ
ン、濃塩酸およびバルビツール酸より調製した定
量用試薬と活性化ゲルを40℃で反応させ、反応溶
液を濾過し、575nｍにおける濾液の吸光度を測
定することによつて、活性基の量を知ることがで
きる。またエポキシ基を活性基として有するゲル
の場合は、活性化されたゲルをチオ硫酸ソーダと
反応させ遊離した水酸イオンを酸で滴定して測定
することができる（L.Sunbdery、J.Porath、J.
Chromatogr.、90、87（1974）参照）。また簡便な
方法としては活性化ゲルとオリゴペプチドを接触
させ、結合したオリゴペプチドの量から求める方
法がある（R.Axen、S.Ernback、Eur.J.
Biochem.、18、351（1971）参照）。 本発明の活性化ゲルのマトリツクスはビニルア
ルコール単位を主構成成分とする全多孔質共重合
体であり、架橋単位によつてパーマネントポアが
維持される。架橋単位は化学的に安定でありかつ
生体物質の非特異吸着が少ないポリビニル又はポ
リアリルモノマー単位がのぞましい。たとえば、
トリアリルイソシアヌレート、トリアリルシアヌ
レーナ等トリアジン環を有する架橋性単量体類、
エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレ
ングリコールジメタクリレート等のジ（メタ）ア
クリレート類、ブタンジオールジビニルエーテ
ル、ジエチレングリコールジビニルエーテル、テ
トラビニルグリオキザール等のポリビニルエーテ
ル類、ジアリリデンペンタエリスリツト、テトラ
アリロキシエタンのようなポリアリルエーテル類
があるが強度、微細孔構造、化学的安定性等の面
よりトリアリルイソシアヌレート単位が特に好ま
しい。本発明の活性化ゲルのマトリツクスは本発
明の活性化ゲルの特性を妨害しない単位を含んで
いてもかまわない。そのような単位としてはたと
えばカルボン酸ビニルエステル単位、ビニルエー
テル単位等があげられる。 本発明の活性化ゲルの保水量（以下WRという）
は0.5〜６ｇ／ｇの範囲にあるのが適当であり、
好ましくは1.0〜5.0ｇ／ｇの範囲である。WRとは
ゲルを水と平衡した時のゲルが粒子内に含みうる
水の量をゲル乾燥重量あたりの値として表示した
ものである。つまりWRはゲル内の孔量の目安に
なる。WRが大きくなると、水中においてゲル単
位体積あたりの骨格を形成する部分、つまりゲル
そのものの重量が相対的に低下する。そのため
WRが大きすぎると水中においてゲルの機械的強
度が低下するWRが小さすぎると、分離に有効な
孔量が少なくなるので分離能力が低下する。した
がつてWRが適当な範囲にあるのが好ましい。WR
は蒸留水と十分平衡にしたゲルを遠心分離器にか
けてゲル表面に付着している水を除去した後、そ
の重量（W1）を測定し、さらにそのゲルを乾燥
して乾燥後の重量（W2）を求め次式によつて求
めることができる。 WR＝W1−W2／W2 本発明の活性化ゲルは全多孔質であるため、乾
燥状態で大きい比表面積を有する。ここで、全多
孔質とは粒子の内部までポアが分布している構造
をいう。一般に架橋構造を持つ有機合成高分子
は、その高分子と親和性のある溶媒中で膨潤し乾
燥すると収縮する。膨潤時に溶媒が満たされてい
るポアが架橋の網目のみで維持されている軟質ゲ
ルの場合は、乾燥すると網目がつぶれてしまい、
ポアはほとんど消失する。この場合の比表面積は
ほとんど粒子の外側だけの値になるため一般に１
m2／ｇ以下の低い値を示す。たとえば従来アフイ
ニテイクロマトグラフイー用担体として用いられ
ているアガロースは軟質ゲルであるため、乾燥に
よつてポアが消失してしまうため、通常は水性溶
媒に膨潤させてある。一方ポアがしつかりした構
造を持つ硬質ゲルの場合は、乾燥した場合ポアは
多少収縮するものの膨潤時の状態をほとんど維持
する、つまりパーマネントポアを有する。したが
つて比表面積は軟質ゲルの値より高い値を示す。
本発明の活性化ゲルは通常５〜1000m2／ｇの比表
面積を有する。比表面積の測定法はいろいろある
が本発明では最も一般的な窒素ガスによるBET
法で求めた。また比表面積測定に用いるサンプル
は十分乾燥しておかねばならない。本発明のゲル
は親水性が大で乾燥しにくいので、水にぬれたゲ
ルをアセトンと平衡にした後60℃以下で減圧乾燥
するのがよい。 アフイニテイクロマトグラフイーは一般に分子
量の大きな分子の分離、精製、除去に用いられる
のでMlimはできるだけ大きい方がよい。 本発明のゲルにおいてはMlimは103〜108の範
囲にある。Mlimはゲルのポア内へ浸透できない
分子の分子量の下限を表す値である。Mlimは
GPCの検量線から求められる。検量線はゲルを
充填したカラムについて横軸に溶出容量、縦軸に
分子量の対数を目盛つたグラフに分子量既知のサ
ンプルの測定データをプロツトして得られ、縦軸
にほとんど平衡な線と、それに続く負の勾配をも
つた線からなる。 本発明におけるMlimは、分子量既知の標準物
質としてポリエチレングリコールまたはデキスト
ランを用い、蒸留水を溶媒として求めた検量線の
縦軸に平行な線の延長と、傾斜した線の延長が交
わる点の縦軸の値として表わされる。なお、通常
市販されている水溶性標準高分子は分子量200万
以下のものしかないので、Mlimが200万以上の
ゲルについては完全な検量線を求めることができ
ない。したがつてこのようなゲルのMlimは正確
には求められないが、分子量200万までの検量線
の延長と、同様な条件で測定したMlimの低いゲ
ルの縦軸に平行な線の延長との交点より推定す
る。 本発明の活性化ゲルの平均粒径は特に制限はな
いが５〜1000μｍの範囲にあるのがよい。粒径は
コールターカウンター（米国コールターエレクト
ロニクス社）やハイアツク（米国パシフイツクサ
イエンスフイツクカンパニー）などの粒径測定器
を用いて測定することができる。 以下に本発明の活性化ゲルの合成法の１例をの
べる。 本発明の活性化ゲルは架橋単位によつてパーマ
ネントポアが維持された、ビニルアルコール単位
を主構成成分とする全多孔質共重合体の水酸基に
活性化試薬を用いて活性基を結合することによつ
てうることができる。架橋単位としては化学的に
安定でありかつ生体物質の非特異吸着が少ないポ
リビニル又はポリアリルモノマー単位がのぞまし
い。たとえばトリアリルイソシアヌレート、トリ
アリルシアヌレート等トリアジン環を有する架橋
性単量体類、エチレングリコールジメタクリレー
ト、ジエチレングリコールジメタクリレート等の
ジ（メタ）アクリレート類、ブタンジオールジビ
ニルエーテル、ジエチレングリコールジビニルエ
ーテル、テトラビニルグリオキザール等のポリビ
ニルエーテル類、ジアリリデンペンタエリスリツ
ト、テトラアリロキシエタンのようなポリアリル
エーテル類があるが、強度、微細孔構造、化学的
安定性の面よりトリアリルイソシアヌレート単位
が特に好ましい。本発明のゲルのマトリツクスは
本発明の活性化ゲルの特性を妨害しない単位を含
んでいてもかまわない。そのような単位としては
たとえばカルボン酸ビニルエステル単位、ビニル
エーテル単位等があげられる。 前述の如く、本発明の活性化ゲルのマトリツク
スは、例えばビニルアルコール単位、カルボン酸
ビニルエステル単位、および２つ以上のエチレン
性二重結合および／またはアセチレン性三重合結
合を有する架橋単位よりなり、下記式で定義され
る架橋度（X1）は0.1≦Ｘ≦0.4の範囲にあるのが
好ましく、更に好ましくは0.1≦Ｘ≦0.3である。 X1＝n2c／ａ＋n1b＋n2c …(1) 但し ａ；ビニルアルコール単位のモル数 ｂ；カルボン酸ビニルエステル単位のモル数 ｃ；架橋単位のモル数 n1；カルボン酸ビニルエステル単位が有するビニ
ル基の数 n2；架橋単位が有するエチレン性二重結合およ
び／またはアセチレン性三重結合の数 本発明の活性化ゲルの活性基の密度はマトリツ
クスのビニルアルコール単位の数が多いほど高く
なりうる。又ビニルアルコール単位の数が多いほ
ど親水性が増すのでこの面からもビニルアルコー
ル単位が多い方がのぞましい。しかしながら多す
ぎるとマトリツクスの強度が減少する。本発明の
活性化ゲルのマトリツクスにおいてはマトリツク
ス単位重量あたりのビニルアルコール単位の数
（qOH）は前記した通り5.0〜17.0meq／ｇである。 qOHはゲルをピリジン溶媒中で無水酢酸と反応
させて、水酸基と反応して消費した無水酢酸の量
又はゲルの重量変化を測定し、これから求めるこ
とができる。乾燥ゲル１ｇが１ｍmolの無水酢酸
と反応したときのqOHが1meq／ｇである。 本発明の活性化ゲルのマトリツクスは生体物質
の非特異吸着が少ないことがのぞましい。マトリ
ツクスにおける生体物質の非特異吸着の程度はマ
トリツクスを例えばカラムに充填しカラムに生体
物質を含有する水性溶液を流すことによつてマト
リツクスと接触させ、マトリツクスに吸着されず
に流出した生体物質の量より知ることができる。
ここに用いられる生体物質としてはたとえば、ア
ミノ酸や血清タンパクの一つであるアルブミン等
があげられる。 本発明の活性化ゲルのマトリツクスは、前述の
活性化ゲルと同様に保水量（WR）は0.5〜６ｇ／
ｇの範囲にあるのが適当であり、好ましくは1.0
〜５ｇ／ｇの範囲である。また比表面積は５〜
1000m2／ｇを有する。 更にMlimは103〜108の範囲にある。WR比表面
積、Mlimの測定は活性化ゲルの場合と同様の方
法でおこなうことができる。本発明の活性化ゲル
のマトリツクスの平均粒径は特に制限はないが５
〜1000μｍの範囲にあるのがよい。 本発明の活性ゲルは、上記のような特性を有す
るマトリツクスのビニルアルコール単位の水酸基
に活性化試薬を用いて活性基を結合することによ
つてうることができる。 活性化試薬としてはハロゲン化シアン、ビスエ
ポキシド、エピクロルヒドリン、をあげることが
できる。活性化試薬としてあげたハロゲン化シア
ンのうちブロムシアンによる活性化はたとえば次
の方法でおこなうことができる。適当量の本発明
のマトリツクスを水に懸濁し、撹拌しながらカセ
イソーダで水性懸濁液のPHを11〜12にする。次い
でPHを11〜12に維持しつつブロムシアン水溶液を
添加する。反応後はガラスフイルター等を用いて
濾過をおこない、次いで水で洗浄することによつ
て活性基としてシアネートエステル又はイミドカ
ーボネート基を有する活性化ゲルを得ることがで
きる。同様にアルカリ条件下ビスエポキシドまた
はエピクロルヒドリンと接触させることにより活
性基としてエポキシ基を有するゲルを得ることが
できる。ハロゲン化トリアジンによる活性化もア
ルカリ条件下ゲルとハロゲン化トリアジンを接触
させることによりおこなうことができる。 活性化ゲルは緩衝液中でアミノ基、カルボキシ
ル基、水酸基、チオール基を有する有機化合物と
接触させることにより、当該有機化合物をゲルに
固定できる。固定化は有機化合物がそれ自身が有
している生物学的親和性を失なわないような条件
でおこなわれなければならない。一般的には100
℃以下、PH３〜13の範囲でおこなわれるが、固定
化する有機化合物の種類によつて最適な条件が選
択される。ここで用いられる有機化合物として
は、たとえば抗原、抗体、酵素、アミノ酸、オリ
ゴペプチドポリペプチドおよび核酸等をあげるこ
とができる。生物学的親和性を示す有機化合物を
固定化した本発明の活性化ゲルは、分離、精製、
除去すべき物質を含む液体と接触させることによ
り、その物質を分離、精製、除去できる。 以下に本発明の活性化ゲルのマトリツクスの製
造法の１例をのべる。 本発明の活性化ゲルのマトリツクスはカルボン
酸ビニルエステルとたとえば下記式（）、（）
で示されるトリアジン環を有する化合物、エチレ
ングリコールジメタクリレート、ジエチレングリ
コールジメタクリレート等のジ（メタ）アクリレ
ート類、ブタンジオールジビニルエーテル、ジエ
チレングリコールジビニルエーテル、テトラビニ
ルグリオキザール特のポリビニルエーテル類、ジ
アリリデンペンタエリスリツト、テトラアリロキ
シエタンのようなポリアリルエーテル類から選ば
れた架橋性単量体を共重合して該共重合体をエス
テル交換又はケン化することによつてうることが
できるが、カルボン酸ビニルエステルとの共重合
性および形成されたマトリツクスの強度、微細孔
構造、化学的安定性の面からトリアリルイソシア
ヌレートが最も好ましい。 （ただしR1、R2およびR3は、それぞれ独立に、
CH2＝CH−CH2−、CH≡Ｃ−CH2−および
【式】を示す）
本発明のカルボン酸ビニルエステルとは重合可
能なカルボン酸ビニルエステル基を一つ以上有す
る化合物のことでたとえば、酢酸ビニル、プロピ
オン酸ビニル等をあげることができる。 更に、本発明の活性化ゲルの特性に影響を与え
ない重合性単量体、たとえばジエチレングリコー
ルエチルビニルエーテル等を添加してもかまわな
い。 本発明に用いるゲルは溶液重合、懸濁重合、エ
マルジヨン重合等でうることができるが、本発明
に用いるゲルは球状が好ましいので懸濁重合が好
ましい。懸濁重合は例えばカルボン酸ビニルエス
テルと架橋性単量体を、これらの単量体を溶解す
る水が溶解しにくい溶媒の共存下に撹拌して小滴
となし、重合することによつておこなわれる。単
量体を溶解するが水に溶解しにくい有機溶媒を単
量体に加えることにより、得られる共重合体にパ
ーマネントポアを形成させる。単量体を溶解する
が水に溶解しにくい有機溶媒とは具体的にはトル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素、ヘプタン、
オクタン等の脂肪族炭化水素、酢酸エチル、酢酸
ｎ−ブチル、酢酸ｎ−ヘキシル等のエステル化合
物、ジブチルエーテル等のエーテル類あるいはメ
チルイソブチルケトン、ｎ−ヘプタノール等のこ
とである。有機有媒は単量体100重量部に対して
20〜300重量部の範囲で用いるのが好ましい。 共重合体の孔径あるいは孔径分布を制御するた
めに単量体混合物に溶解する線状重合体を前記溶
媒と併用してもよい。線状重合体としてはたとえ
ばポリ酢酸ビニル等を挙げることができる。線状
重合体は単量体100重量部に対して10重量部以下
で用いられる。かかる線状重合体を前記有機溶媒
と併用することによつて、より孔径の大きいゲル
を得るのが容易になる。重合に際して用いられる
開始剤は通常のラジカル重合開始剤でよく、たと
えば２，2′−アゾビスイソブチロニトリルや、過
酸化ベンゾイル等を用いることができる。懸濁重
合を行なう際には、水相にはポリビニールアルコ
ール、メチルセルロース等の通常用いられる有機
高分子系の懸濁安定剤を加えるのが良く、必要に
より、リン酸ナトリウム等のPH緩衝剤を使用して
もよい。懸濁安定剤の種類、量あるいは撹拌速度
を変ることによつて、重合によつて得られる粒状
共重合体の粒径をかえることができる。 重合によつて得られた粒状重合体は次にエステ
ル交換又はケン化をおこなう。 エステル交換および／またはケン化反応はビニ
ルアルコール単位の量すなわちqOHが5.0〜
17.0meq／ｇとなるように行なう。 エステル交換および／またはケン化反応は反応
条件すなわち、溶媒、反応温度、時間等の反応率
におよぼす影響を調べておいて、反応率が前述の
範囲に入るように反応条件を選べばよいが、本発
明においてはエステル交換反応又はケン化反応
は、水やアルコールまたはその混合液を溶媒とし
て、酸又はアルカリを用いて行なわれる。反応の
温度は〜55℃が好ましく、10〜50℃が更に好まし
く、15〜45℃が特に好ましい。 エステル交換またはケン化によつて得られたゲ
ルはたとえばエピクロルヒドリン、ブタンジオー
ルジグリシジルエーテル等で後架橋することもで
きる。 本発明に用いられるマトリツクスは生理活性物
質の非特異吸着が非常に少ないため、活性化して
生物化学的親和性を示す物質を結合して、分離、
精製、除去すべき物質を含む液体と接触させた場
合、目的とする物質以外の物質を非特異的に吸着
することが少なく、アフイニテイクロマトグラフ
イー用ゲルの前駆体として適している。又、活性
化した場合、活性基の密度が高いので生物学的親
和性を示す物質を高密度に結合できる。 本発明の活性化ゲルは生物学的親和性を示す物
質(A)を結合する場合や、Ａを結合したゲルに、該
物質と親和性を示す物質(B)を含む液を接触させて
Ｂをゲルに吸着させる時、また必要に応じてＢを
吸着した物質を溶出する際の変性剤、PHの変化、
温度の変化に耐えることができる。又多孔質であ
るので、分離、精製、除去すべき物質がマトリツ
クス中に十分に拡散できるため、接触面積が大き
く、分離能が大きい。更に物理的な力に対して抵
抗性があり、活性化や生物学的親和性を示す物質
を固定化する等の操作中に破壊されることが著る
しく少ない。更に本発明の活性化ゲルは生物学的
親和性を示す物質を固定してカラムに充填して用
いられることが多い。その際このゲルは十分硬い
ので分離すべき物質を含む液体を常圧よりごくわ
ずか高い圧力で液すことができるので、従来のア
ガロースゲルに比べて著るしく分離能率が向上す
る。 以上のような特性から、本発明の活性化ゲルを
用いれば生体物質の分離、精製、除去が容易にで
きるため、生化学分野における寄与が著るしく大
きい。 更に本発明の活性化ゲルは、体液中の特定成分
を除去するのに用いるのに好適である。たとえば
血液を体外に導びき、固定化された生物学的親和
性を示す物質と接触させて治療する、いわゆる体
外循環法に用いることができる。これまで自己免
疫疾患等の治療に体外循環法が試みられている
が、生物学的親和性を示す物質を固定化するため
の担体に適当なものが無かつた。体外循環法に用
いる場合には特に滅菌ができることおよび高流速
で体液を流せることが重要であるが、従来このよ
うな目的に用いられたアガロースゲル（たとえば
商品名セフアローズ、フアルマシア社、スウエー
デン）をブロムシアンで活性化したものは、前述
のように凍結乾燥滅菌が容易にはおこなえず、放
射線滅菌も熱滅菌もおこなえない。又ゲルが軟質
で体液を高流速で流せないために不満足な結果し
か得られていない。又市販の一級水酸基を有する
半硬質ポリビニール系ゲルも低圧下で液体を高流
速で流せないので不満足な結果しか得られていな
い。本発明の活性化ゲルは前述のような要求を満
たしているので、体外循環法による治療法の発展
に対する寄与が大である。 以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
はいうまでもない。 実施例 １ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト24.1ｇ（X2＝0.20）、酢酸エチル124ｇ、ヘプタ
ン124ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度500）3.1ｇお
よび２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.1gr
よりなる均一混合液と、ポリビニルアルコール１
重量％、リン酸二水素ナトリウム二水和物0.05重
量％およびリン酸水素二ナトリウム十二水和物
1.5重量％を溶解した水1200mlとを3000mlの三つ
口フラスコに入れ、十分撹拌したのち65℃で18時
間、さらに75℃で５時間加熱撹拌して懸濁重合を
おこない、粒状共重合体を得た。過水洗、つい
でアセトン抽出後、カセイソーダ46.5grおよびメ
タノール２よりなる溶液中で40℃で18時間、共
重合体のエステル交換反応をおこなつた。得られ
た粒子の平均粒径は150μｍであつた。前記方法
で水酸基密度（qOH）を求めたところ13meq／ｇ、
であつた。 またゲルの保水量は4.4gr／ｇ乾燥ゲルで、比
表面積は10m2／ｇであつた。このゲルを内径7.5
mm、長さ25cmのステンレス製カラムに充填して、
種々の分子量を持つデキストランやポリエチレン
グリコールの１水溶液を測定したところ、それぞ
れ分子量の大きい順に溶出された。デキストラン
の排除限界分子量は約３×105であつた。分析に
はサンプルインジエクターとポンプはHITACHI
Model635A（日立製作所）を、検出器はShodex
RI SE−11（昭和電工）を用いた。また0.3M塩化
ナトリウムおよび0.1Mリン酸ナトリウムを含む
水溶液を溶媒として、紫外線吸収検出器
〔HITACHI MULTI WAVELENGTH UV
MONITOR（日立製作所）〕を用いてγ−グロブ
リン、牛血清アルブミン、卵白アルブミンそれぞ
れの１％溶液を流したところ、ほとんど100％の
回収率で回収され、ゲルの非特異吸着は非常に少
なかつた。サンプルの測定はすべて流速１ml／
minで実施した。 つぎにエステル交換され、水で十分に洗浄され
たゲル50c.c.を200mlの水に懸濁し３ｇの臭化シア
ンを加え撹拌する。2N水酸化ナトリウム水溶液
を用いてPHを10〜11に保ち８分間反応させた。反
応終了後はすみやかにガラスフイルターで過
し、ついで水２で洗浄して活性化ゲルを得た。
この活性化ゲルの活性基の密度をWilcheckらの
方法（J.Kohn、M.Wilcheck、Biochem.
Biophys、Res Commun.、84、７（1978）参照）
で測定したところ乾燥ゲル１ｇあたり2000μmol
であつた。 実施例 ２ 酢酸ビニル100gr、トリアリルイソシアヌレー
ト32.3gr（X2＝0.25）、酢酸エチル100ｇ、ｎ−ヘ
プタノール100gr、ポリ酢酸ビニル（重合度500）
6.6ｇおよび、２，2′−アゾビスイソブチロニト
リル3.3ｇよりなる均一混合液を実施例１と同様
に懸濁重合し、得られた粒子のエステル交換反応
をおこなつた。エステル交換はメタノール2.1
を用いた以外は実施例１と同じ条件で行なつた。
得られたゲルの物性は平均粒径100μｍ、qOH＝
12meq／ｇ、WR＝3.4ｇ／ｇおよび比表面積は20
m2／ｇであつた。実施例１と同様にカラムに充填
し、ポリエチレングリコールおよびデキストラン
を測定したところ、それぞれ分子量の大きい順に
溶出することが確認され、Mlinは７×105であつ
た。実施例１と同様にγグロブリン、牛血清アル
ブミン、卵白アルブミンを含む溶液を流したとこ
ろ、ほとんど100％の回収率で回収され、ゲルの
非特異的吸着は非常に少なかつた。つぎにこのゲ
ルを実施例１と同様にブロムシアンで活性化した
ところ、活性の密度は乾燥ゲル１ｇあたり
1500μmolであつた。 実施例 ３ 実施例２でエステル交換して得られたゲル50c.c.
をよく水で洗浄したのち、50mlの１，４−ブタン
ジオールジグリシジルエーテルと100mgの水素化
硼素ナトリウムを含む0.6Mカセインソーダ水溶
液50mlを加え、室温で８時間振盪反応させた。つ
いでグラスフイルターで過し、よく水で洗浄し
て活性化ゲルを得た。このゲルの活性基の密度を
Sundberyらの方法（J.Chromatogr.、90、87
（1974）参照）で測定したところ乾燥ゲル１ｇあ
たり900μmolであつた。 実施例 ４ 実施例２でエステル交換して得られたゲル50c.c.
をよく水で洗浄してフラスコに入れ75mlの水、
32.5ｇの2Mカセイソーダ、7.5mlのエピクロロヒ
ドリンを順次加える。混合液を40℃で２時間振盪
後、グラスフイルターで過し、水でよく洗浄し
て活性化ゲルを得た。実施例３と同様に
Sundberyらの方法で測定したところ、乾燥ゲル
１ｇあたり500μmolであつた。 実施例 ５ 実施例２で得られた活性化ゲル50c.c.を0.1M炭
酸水素ナトリウム500mlで洗浄する。Ｌ−アルギ
ニン塩酸塩５ｇを0.1M炭酸水素ナトリウム水溶
液に溶解し、カセイソーダ水溶液を用いてPHを
9.5に調節し活性化ゲルに加える。ついでこれを
25℃で16時間振盪し、ついでガラスフイルターを
用いて、過する。得られた吸着体を1M塩化ナ
トリウム200mlおよび水で交互に洗浄する。活性
化ゲルに固定化されたＬ−アルギニンは活然化ゲ
ル１c.c.あたり0.24ｍmolであつた。Ｌ−アルギニ
ンの固定化量は固定化反応後の上清に８−ヒドロ
キシキノリンとＮ−ブロモスクシイミドを加えて
発色させ、500nｍの吸光度から上記の方法で得
られたＬ−アルギニン溶液を標準として上清中の
濃度を測定し、上清中の量を知り、仕込み量から
さしひくことによつて算出した。この固定化ゲル
をカラムに充填して、水および緩衝用塩を含む水
溶液を５Kg／cm2以下の圧力で140mlcm-2hr-1の流
速で流すことができた。またこの固定化ゲル充填
カラムを真空凍結乾燥しついで滅菌バツグに封入
し35％エチレンオキサイドガスで40℃、５時間処
理し、空気置換を１時間おこなつて、滅菌、乾燥
された固定化カラムをうることができた。滅菌乾
燥されたカラム内の固定化ゲルは再膨潤によつ
て、凍結乾燥前とほぼ同じ容積まで回復した。 実施例 ６ 酢酸ビニル100gr、トリアリルイソシアヌレー
ト52gr（X2＝0.35）、酢酸エチル100gr、ヘプタン
100gr、ポリ酢酸ビニル（重合度500）7.5ｇおよ
び２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.8grよ
りなる均一混合物を懸濁重合し、得られた粒子の
エステル交換反応をおこなつた。エステル交換は
メタノール2.4を用いた以外は実施例１と同じ
条件で行なつた。得られたゲルの平均粒径は
300μｍ、qOH＝9.0meq／ｇ、WR＝4.0ｇ／ｇおよ
び比表面積は60m2／ｇであつた。このゲルのデキ
ストランMlimは６×105であつた。実施例１と同
様の方法でブロムシアンを用いて活性化したとこ
ろ、活性基の密度は乾燥ゲル１ｇあたり500μmol
であつた。 実施例 ７ アジピン酸ジビニル90gr、トリアリルイソシア
ヌレート30gr・（X2＝0.29）酢酸エチル200grおよ
び２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.0grよ
りなる同一混合液を実施例１と同様の方法で懸濁
重合をおこない、得られた粒子のエステル交換を
おこなつた。得られた粒子の平均粒径は150μｍ、
qOH＝10meq／ｇ、WR＝4.0gr／ｇおよび比表面積
は40m2／ｇであつた。このゲルのデキストラン
Mlimは30×105であつた。 実施例１と同様にγグロブリン、牛血清アルブ
ミン、卵白アルブミンを含む溶液を流したとこ
ろ、ほとんど100％の回収率で回収されゲルの非
特異吸着は非常に少なかつた。 つぎにこのゲルを実施例１と同様にブロムシア
ンを用いて活性化したところ、活性基の密度は乾
燥ゲル１ｇあたり800μmolであつた。 実施例 ８ 酢酸ビニル100gr、ジエチレングリコールジビ
ニルエーテル39.4gr（Ｘ＝0.3）、酢酸エチル100gr
および２，2′−アゾビスイソブチロニトリル
3.4grよりなる均一混合液を実施例１と同様に懸
濁重合し、得られた粒子のエステル交換反応をお
こなつた。得られたゲルの物性は平均粒子径
300μｍ、qOH＝10.0meq／ｇ、WR＝2.0ｇ／ｇおよ
び比表面積は40m2／ｇであつた。このゲルのデキ
ストランMlimは10×105であつた。実施例１と同
様にγグロブリン、牛血清アルブミン、卵白アル
ブミンを含む溶液を液としたところ、ほとんど
100％の回収率で回収され、ゲルの非特異吸着は
少なかつた。つぎにこのゲルを実施例１と同様に
ブロムシアンで活性化したところ活性基の密度は
700μmol／ｇであつた。 比較例 １ アガロース樹脂である市販のセフアローズCL
−4B（フアルマシアフアインケミカル社製）50c.c.
を実施例１の方法で活性化し、次いで実施例５の
方法でＬ−アルギニン塩酸塩と反応させ、Ｌ−ア
ルギニン固定化ゲルを得た。固定化されたＬ−ア
ルギニンは固定化ゲル１c.c.あたり0.25ｍmolであ
つた。この固定化ゲルをカラムに充填して水およ
び緩衝用の塩を含む水溶液を流したところ30mlcm
-2hr-1以下の流速でしか流せなかつた。またこの
固定化ゲル充填カラムを実施例５と同様の方法で
真空、乾燥滅菌した。滅菌乾燥されたカラム内の
固定化ゲルは再膨潤によつて、凍結乾燥前の容積
の30％の容積までしか回復しなかつた。 比較例 ２ 酢酸ビニル100gr、トリアリルイソシアヌレー
ト5.1gr（X2＝0.05）、酢酸エチル150gr、ヘプタン
150grおよび２，2′−アゾビスイソブチロニトリ
ル3.1grよりなる均一混合液を実施例１と同様に
懸濁重合し、得られた粒子のエステル交換反応を
おこなつた。エステル交換はメタノール1.5を
用いた以外は実施例１と同様の方法で行なつた。
ゲルの物性は、比表面積２m2／ｇ、平均粒子径
100μｍ、qOH＝19meq／ｇおよびWR＝5.0ｇ／ｇで
あつた。このゲルを実施例１と同様にカラムに充
填し、同様のクロマト条件で分析を試みたとこ
ろ、カラムの圧力損失が大きく測定できなかつ
た。 実施例 ９ 酢酸ビニル100gr、トリアリルイソシアヌレー
ト41gr（X2＝0.30）、酢酸エチル70gr、オクタン
70gr、ポリ酢酸ビニル（重合度500）7grおよび
２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.5grより
なる均一混合物を実施例１と同様の方法で懸濁重
合し、得られたゲルのエステル交換反応を行なつ
た。 得られたゲルの平均粒径は70μｍ、qOH＝
7meq／ｇ WR＝3.0ｇ／ｇおよび比表面積は45
m2／ｇであつた。このゲルのデキストランMlim
はは３×105であつた。このゲルを実施例４と同
様にエピクロルヒドリンで活性化した。実施例３
と同様にSundberyらの方法で測定したところ、
乾燥ゲル１ｇあたり500μmlであつた。 次にこの活性化ゲルを水に懸濁し、底にガラス
フイルターと出口栓をそなえた直径10mmのガラス
カラムに導入した。ゲル導入時は出口栓は閉じて
おいた。ついで出口栓を開き、溶媒である水を自
然流下させてゲルを沈降させた。ゲルベツドの高
さは５cmであつた。ついでカラムの上部にペリス
タリツクポツプからの管を接続し、純水をカラム
内に流した。その時のカラム入口とカラム出口の
間の差圧と流量との関係を第１図に、差圧と体積
の関係を第２図に示す。なお体積は水を自然流下
させた時の体積を100として示してある。 比較のため、市販の一級水酸基を有する半硬質
ビニルゲル（粒径50〜100μｍ）をエピクロルヒ
ドリンで活性化したゲルおよび市販のエポキシ活
性化アガロースゲル（粒径60〜140μｍ）につい
ても同様にガラスカラムに充填し、差圧と流量、
差圧と体積の関係を調べた。得られた結果を第１
図及び第２図に示す。市販の一級水酸基を有する
半硬質ビニルゲルは実施例９の活性化ゲルと同様
に水を流下させつつ自然沈降させた時の値を100
として表示してあり、エポキシ活性化アガロース
ゲルはカラムの出口栓を閉じた状態で自然沈降さ
せた時の体積を100として示してある。 第１図及び第２図の結果より本発明のゲルが市
販のゲルに比べて著るしく硬く、低圧下で高流速
で液を流せることがわかる。 実施例 10 実施例１で得られた樹脂100mlを良く水洗した
後100mlの蒸留水に懸濁された。メカニカルスタ
ーラーで撹拌を行ないながら、4N水酸化ナトリ
ウム水溶液を滴下し、PHを11.0〜11.5に合せた。
次いで10ｇの臭化シアン粉体を加え、4N水酸化
ナトリウムを滴下してPHを11.0〜11.5に８分間保
ち、活性化反応を行ない、反応終了後すみやかに
氷冷した0.1M炭酸緩衝液5000mlで洗浄し、吸引
過した後、氷冷した0.1M炭酸緩衝液100mlに再
度懸濁させ撹拌を行ないながら、0.1M炭酸緩衝
液20mlに２ｇの市販のAnti−Rabbit Albumin
（Goat）のIgG分画〔Cappel Laboratories、Inc
（PA.USA）製〕を溶解した溶液を上記懸濁液に
加えた。４℃で20時間撹拌を行ない反応させた。
反応後0.15M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.5）で充分洗浄を行ない、Anti−
Rabbit Albumin IgG結合樹脂を得た。この際結
合したanti−Rabbit Albumin IgGの量は、水洗
溶液の吸光度測定（280nｍ）から約1.98ｇ／100
ml樹脂であつた。 このようにして得られたAnti−Rabbit
Albumin IgG結合樹脂を用いてウサギ血清より
アルブミンを精製する試みを行つた。該樹脂を
2.5cm直径×20cm高さのカラムに充填し、0.15M
塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液で十分
洗浄した後、200mlのウサギ血清を流速10cm／hr
で供給した。続いて上記洗浄用緩衝液で充分洗浄
を行なつた時、0.1Mグリシン塩酸緩衝液（PH
3.0）を溶離を行なつた。溶離液はただちにPH
11.5Mグリシン緩衝液を加え、PHを中性にした。
得られた溶離液は、４℃で0.15M塩化ナトリウム
を含む0.01Mリン酸緩衝液で一夜透析後280nｍの
吸光度測定、Lowry氏らの方法による蛋白質定
量、アクリルアミドを用いるデイスク電気泳動を
行ない、含有されるウサギアルブミンの定量及び
定性試験を行なつた。 得られたウサギアルブミンは215mgであり、純
度98％であつた。多成分からなる血清から直接精
製を行なつたにもかかわらず、アルブミン以外の
不純成分は極微量であつた。尚カラムは十分洗浄
後、8M尿素を流し、更に溶出したが、溶出液中
に蛋白成分等は見出せなかつ。 実施例 11 実施例１で得られた樹脂250mlを良く水洗した
後吸引過し、500mlのジメチルスルホキシド
（DMSO）に浸漬し一夜放置した。次に吸引過
を行ない、198ml（2.5モル）のエピクロルヒドリ
ンの入つた500mlのジメチルスルホキシド溶液中
に懸濁した。撹拌を行ないながら50％水酸化ナト
リウム水溶液を45mlを２時間かけて滴下し、次い
で30〜35℃の温度で４時間撹拌を行ない反応し
た。反応終了後700mlのジメチルスルホキシド、
700mlのアセトン３の蒸留水で順次洗浄し、エ
ポキシ活性化樹脂を得た。該活性化樹脂を用い、
公知の方法（山崎誠、石井信一、岩井浩一編等、
“アフイニテイ−クロマトグラフイー”参照）に
従い、抗ウサギアルブミン抗体精製用のウサギア
ルブミン結合樹脂を作成した。 0.1M炭酸緩衝液10mlに該活性化樹脂10mlを懸
濁し、さらに30mgのウサギアルブミンを0.1M炭
酸緩衝液２mlに溶解した溶液を加えた。室温で１
週間、時々撹拌をしながら反応させた。反応終了
後、ガラスフイルターを用い0.15M塩化ナトリウ
ムを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分に
洗浄し、ウサギアルブミン28mgの結合した樹脂を
得た。このようにして得られた樹脂をカラムに充
填し、実施例10と同様な方法で抗ウサギアルブミ
ン山羊血清を用い抗ウサギアルブミン抗体の精製
を行なつた。精製された抗体は高い力価を示す高
純度IgG蛋白であつた。
能なカルボン酸ビニルエステル基を一つ以上有す
る化合物のことでたとえば、酢酸ビニル、プロピ
オン酸ビニル等をあげることができる。 更に、本発明の活性化ゲルの特性に影響を与え
ない重合性単量体、たとえばジエチレングリコー
ルエチルビニルエーテル等を添加してもかまわな
い。 本発明に用いるゲルは溶液重合、懸濁重合、エ
マルジヨン重合等でうることができるが、本発明
に用いるゲルは球状が好ましいので懸濁重合が好
ましい。懸濁重合は例えばカルボン酸ビニルエス
テルと架橋性単量体を、これらの単量体を溶解す
る水が溶解しにくい溶媒の共存下に撹拌して小滴
となし、重合することによつておこなわれる。単
量体を溶解するが水に溶解しにくい有機溶媒を単
量体に加えることにより、得られる共重合体にパ
ーマネントポアを形成させる。単量体を溶解する
が水に溶解しにくい有機溶媒とは具体的にはトル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素、ヘプタン、
オクタン等の脂肪族炭化水素、酢酸エチル、酢酸
ｎ−ブチル、酢酸ｎ−ヘキシル等のエステル化合
物、ジブチルエーテル等のエーテル類あるいはメ
チルイソブチルケトン、ｎ−ヘプタノール等のこ
とである。有機有媒は単量体100重量部に対して
20〜300重量部の範囲で用いるのが好ましい。 共重合体の孔径あるいは孔径分布を制御するた
めに単量体混合物に溶解する線状重合体を前記溶
媒と併用してもよい。線状重合体としてはたとえ
ばポリ酢酸ビニル等を挙げることができる。線状
重合体は単量体100重量部に対して10重量部以下
で用いられる。かかる線状重合体を前記有機溶媒
と併用することによつて、より孔径の大きいゲル
を得るのが容易になる。重合に際して用いられる
開始剤は通常のラジカル重合開始剤でよく、たと
えば２，2′−アゾビスイソブチロニトリルや、過
酸化ベンゾイル等を用いることができる。懸濁重
合を行なう際には、水相にはポリビニールアルコ
ール、メチルセルロース等の通常用いられる有機
高分子系の懸濁安定剤を加えるのが良く、必要に
より、リン酸ナトリウム等のPH緩衝剤を使用して
もよい。懸濁安定剤の種類、量あるいは撹拌速度
を変ることによつて、重合によつて得られる粒状
共重合体の粒径をかえることができる。 重合によつて得られた粒状重合体は次にエステ
ル交換又はケン化をおこなう。 エステル交換および／またはケン化反応はビニ
ルアルコール単位の量すなわちqOHが5.0〜
17.0meq／ｇとなるように行なう。 エステル交換および／またはケン化反応は反応
条件すなわち、溶媒、反応温度、時間等の反応率
におよぼす影響を調べておいて、反応率が前述の
範囲に入るように反応条件を選べばよいが、本発
明においてはエステル交換反応又はケン化反応
は、水やアルコールまたはその混合液を溶媒とし
て、酸又はアルカリを用いて行なわれる。反応の
温度は〜55℃が好ましく、10〜50℃が更に好まし
く、15〜45℃が特に好ましい。 エステル交換またはケン化によつて得られたゲ
ルはたとえばエピクロルヒドリン、ブタンジオー
ルジグリシジルエーテル等で後架橋することもで
きる。 本発明に用いられるマトリツクスは生理活性物
質の非特異吸着が非常に少ないため、活性化して
生物化学的親和性を示す物質を結合して、分離、
精製、除去すべき物質を含む液体と接触させた場
合、目的とする物質以外の物質を非特異的に吸着
することが少なく、アフイニテイクロマトグラフ
イー用ゲルの前駆体として適している。又、活性
化した場合、活性基の密度が高いので生物学的親
和性を示す物質を高密度に結合できる。 本発明の活性化ゲルは生物学的親和性を示す物
質(A)を結合する場合や、Ａを結合したゲルに、該
物質と親和性を示す物質(B)を含む液を接触させて
Ｂをゲルに吸着させる時、また必要に応じてＢを
吸着した物質を溶出する際の変性剤、PHの変化、
温度の変化に耐えることができる。又多孔質であ
るので、分離、精製、除去すべき物質がマトリツ
クス中に十分に拡散できるため、接触面積が大き
く、分離能が大きい。更に物理的な力に対して抵
抗性があり、活性化や生物学的親和性を示す物質
を固定化する等の操作中に破壊されることが著る
しく少ない。更に本発明の活性化ゲルは生物学的
親和性を示す物質を固定してカラムに充填して用
いられることが多い。その際このゲルは十分硬い
ので分離すべき物質を含む液体を常圧よりごくわ
ずか高い圧力で液すことができるので、従来のア
ガロースゲルに比べて著るしく分離能率が向上す
る。 以上のような特性から、本発明の活性化ゲルを
用いれば生体物質の分離、精製、除去が容易にで
きるため、生化学分野における寄与が著るしく大
きい。 更に本発明の活性化ゲルは、体液中の特定成分
を除去するのに用いるのに好適である。たとえば
血液を体外に導びき、固定化された生物学的親和
性を示す物質と接触させて治療する、いわゆる体
外循環法に用いることができる。これまで自己免
疫疾患等の治療に体外循環法が試みられている
が、生物学的親和性を示す物質を固定化するため
の担体に適当なものが無かつた。体外循環法に用
いる場合には特に滅菌ができることおよび高流速
で体液を流せることが重要であるが、従来このよ
うな目的に用いられたアガロースゲル（たとえば
商品名セフアローズ、フアルマシア社、スウエー
デン）をブロムシアンで活性化したものは、前述
のように凍結乾燥滅菌が容易にはおこなえず、放
射線滅菌も熱滅菌もおこなえない。又ゲルが軟質
で体液を高流速で流せないために不満足な結果し
か得られていない。又市販の一級水酸基を有する
半硬質ポリビニール系ゲルも低圧下で液体を高流
速で流せないので不満足な結果しか得られていな
い。本発明の活性化ゲルは前述のような要求を満
たしているので、体外循環法による治療法の発展
に対する寄与が大である。 以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
はいうまでもない。 実施例 １ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト24.1ｇ（X2＝0.20）、酢酸エチル124ｇ、ヘプタ
ン124ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度500）3.1ｇお
よび２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.1gr
よりなる均一混合液と、ポリビニルアルコール１
重量％、リン酸二水素ナトリウム二水和物0.05重
量％およびリン酸水素二ナトリウム十二水和物
1.5重量％を溶解した水1200mlとを3000mlの三つ
口フラスコに入れ、十分撹拌したのち65℃で18時
間、さらに75℃で５時間加熱撹拌して懸濁重合を
おこない、粒状共重合体を得た。過水洗、つい
でアセトン抽出後、カセイソーダ46.5grおよびメ
タノール２よりなる溶液中で40℃で18時間、共
重合体のエステル交換反応をおこなつた。得られ
た粒子の平均粒径は150μｍであつた。前記方法
で水酸基密度（qOH）を求めたところ13meq／ｇ、
であつた。 またゲルの保水量は4.4gr／ｇ乾燥ゲルで、比
表面積は10m2／ｇであつた。このゲルを内径7.5
mm、長さ25cmのステンレス製カラムに充填して、
種々の分子量を持つデキストランやポリエチレン
グリコールの１水溶液を測定したところ、それぞ
れ分子量の大きい順に溶出された。デキストラン
の排除限界分子量は約３×105であつた。分析に
はサンプルインジエクターとポンプはHITACHI
Model635A（日立製作所）を、検出器はShodex
RI SE−11（昭和電工）を用いた。また0.3M塩化
ナトリウムおよび0.1Mリン酸ナトリウムを含む
水溶液を溶媒として、紫外線吸収検出器
〔HITACHI MULTI WAVELENGTH UV
MONITOR（日立製作所）〕を用いてγ−グロブ
リン、牛血清アルブミン、卵白アルブミンそれぞ
れの１％溶液を流したところ、ほとんど100％の
回収率で回収され、ゲルの非特異吸着は非常に少
なかつた。サンプルの測定はすべて流速１ml／
minで実施した。 つぎにエステル交換され、水で十分に洗浄され
たゲル50c.c.を200mlの水に懸濁し３ｇの臭化シア
ンを加え撹拌する。2N水酸化ナトリウム水溶液
を用いてPHを10〜11に保ち８分間反応させた。反
応終了後はすみやかにガラスフイルターで過
し、ついで水２で洗浄して活性化ゲルを得た。
この活性化ゲルの活性基の密度をWilcheckらの
方法（J.Kohn、M.Wilcheck、Biochem.
Biophys、Res Commun.、84、７（1978）参照）
で測定したところ乾燥ゲル１ｇあたり2000μmol
であつた。 実施例 ２ 酢酸ビニル100gr、トリアリルイソシアヌレー
ト32.3gr（X2＝0.25）、酢酸エチル100ｇ、ｎ−ヘ
プタノール100gr、ポリ酢酸ビニル（重合度500）
6.6ｇおよび、２，2′−アゾビスイソブチロニト
リル3.3ｇよりなる均一混合液を実施例１と同様
に懸濁重合し、得られた粒子のエステル交換反応
をおこなつた。エステル交換はメタノール2.1
を用いた以外は実施例１と同じ条件で行なつた。
得られたゲルの物性は平均粒径100μｍ、qOH＝
12meq／ｇ、WR＝3.4ｇ／ｇおよび比表面積は20
m2／ｇであつた。実施例１と同様にカラムに充填
し、ポリエチレングリコールおよびデキストラン
を測定したところ、それぞれ分子量の大きい順に
溶出することが確認され、Mlinは７×105であつ
た。実施例１と同様にγグロブリン、牛血清アル
ブミン、卵白アルブミンを含む溶液を流したとこ
ろ、ほとんど100％の回収率で回収され、ゲルの
非特異的吸着は非常に少なかつた。つぎにこのゲ
ルを実施例１と同様にブロムシアンで活性化した
ところ、活性の密度は乾燥ゲル１ｇあたり
1500μmolであつた。 実施例 ３ 実施例２でエステル交換して得られたゲル50c.c.
をよく水で洗浄したのち、50mlの１，４−ブタン
ジオールジグリシジルエーテルと100mgの水素化
硼素ナトリウムを含む0.6Mカセインソーダ水溶
液50mlを加え、室温で８時間振盪反応させた。つ
いでグラスフイルターで過し、よく水で洗浄し
て活性化ゲルを得た。このゲルの活性基の密度を
Sundberyらの方法（J.Chromatogr.、90、87
（1974）参照）で測定したところ乾燥ゲル１ｇあ
たり900μmolであつた。 実施例 ４ 実施例２でエステル交換して得られたゲル50c.c.
をよく水で洗浄してフラスコに入れ75mlの水、
32.5ｇの2Mカセイソーダ、7.5mlのエピクロロヒ
ドリンを順次加える。混合液を40℃で２時間振盪
後、グラスフイルターで過し、水でよく洗浄し
て活性化ゲルを得た。実施例３と同様に
Sundberyらの方法で測定したところ、乾燥ゲル
１ｇあたり500μmolであつた。 実施例 ５ 実施例２で得られた活性化ゲル50c.c.を0.1M炭
酸水素ナトリウム500mlで洗浄する。Ｌ−アルギ
ニン塩酸塩５ｇを0.1M炭酸水素ナトリウム水溶
液に溶解し、カセイソーダ水溶液を用いてPHを
9.5に調節し活性化ゲルに加える。ついでこれを
25℃で16時間振盪し、ついでガラスフイルターを
用いて、過する。得られた吸着体を1M塩化ナ
トリウム200mlおよび水で交互に洗浄する。活性
化ゲルに固定化されたＬ−アルギニンは活然化ゲ
ル１c.c.あたり0.24ｍmolであつた。Ｌ−アルギニ
ンの固定化量は固定化反応後の上清に８−ヒドロ
キシキノリンとＮ−ブロモスクシイミドを加えて
発色させ、500nｍの吸光度から上記の方法で得
られたＬ−アルギニン溶液を標準として上清中の
濃度を測定し、上清中の量を知り、仕込み量から
さしひくことによつて算出した。この固定化ゲル
をカラムに充填して、水および緩衝用塩を含む水
溶液を５Kg／cm2以下の圧力で140mlcm-2hr-1の流
速で流すことができた。またこの固定化ゲル充填
カラムを真空凍結乾燥しついで滅菌バツグに封入
し35％エチレンオキサイドガスで40℃、５時間処
理し、空気置換を１時間おこなつて、滅菌、乾燥
された固定化カラムをうることができた。滅菌乾
燥されたカラム内の固定化ゲルは再膨潤によつ
て、凍結乾燥前とほぼ同じ容積まで回復した。 実施例 ６ 酢酸ビニル100gr、トリアリルイソシアヌレー
ト52gr（X2＝0.35）、酢酸エチル100gr、ヘプタン
100gr、ポリ酢酸ビニル（重合度500）7.5ｇおよ
び２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.8grよ
りなる均一混合物を懸濁重合し、得られた粒子の
エステル交換反応をおこなつた。エステル交換は
メタノール2.4を用いた以外は実施例１と同じ
条件で行なつた。得られたゲルの平均粒径は
300μｍ、qOH＝9.0meq／ｇ、WR＝4.0ｇ／ｇおよ
び比表面積は60m2／ｇであつた。このゲルのデキ
ストランMlimは６×105であつた。実施例１と同
様の方法でブロムシアンを用いて活性化したとこ
ろ、活性基の密度は乾燥ゲル１ｇあたり500μmol
であつた。 実施例 ７ アジピン酸ジビニル90gr、トリアリルイソシア
ヌレート30gr・（X2＝0.29）酢酸エチル200grおよ
び２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.0grよ
りなる同一混合液を実施例１と同様の方法で懸濁
重合をおこない、得られた粒子のエステル交換を
おこなつた。得られた粒子の平均粒径は150μｍ、
qOH＝10meq／ｇ、WR＝4.0gr／ｇおよび比表面積
は40m2／ｇであつた。このゲルのデキストラン
Mlimは30×105であつた。 実施例１と同様にγグロブリン、牛血清アルブ
ミン、卵白アルブミンを含む溶液を流したとこ
ろ、ほとんど100％の回収率で回収されゲルの非
特異吸着は非常に少なかつた。 つぎにこのゲルを実施例１と同様にブロムシア
ンを用いて活性化したところ、活性基の密度は乾
燥ゲル１ｇあたり800μmolであつた。 実施例 ８ 酢酸ビニル100gr、ジエチレングリコールジビ
ニルエーテル39.4gr（Ｘ＝0.3）、酢酸エチル100gr
および２，2′−アゾビスイソブチロニトリル
3.4grよりなる均一混合液を実施例１と同様に懸
濁重合し、得られた粒子のエステル交換反応をお
こなつた。得られたゲルの物性は平均粒子径
300μｍ、qOH＝10.0meq／ｇ、WR＝2.0ｇ／ｇおよ
び比表面積は40m2／ｇであつた。このゲルのデキ
ストランMlimは10×105であつた。実施例１と同
様にγグロブリン、牛血清アルブミン、卵白アル
ブミンを含む溶液を液としたところ、ほとんど
100％の回収率で回収され、ゲルの非特異吸着は
少なかつた。つぎにこのゲルを実施例１と同様に
ブロムシアンで活性化したところ活性基の密度は
700μmol／ｇであつた。 比較例 １ アガロース樹脂である市販のセフアローズCL
−4B（フアルマシアフアインケミカル社製）50c.c.
を実施例１の方法で活性化し、次いで実施例５の
方法でＬ−アルギニン塩酸塩と反応させ、Ｌ−ア
ルギニン固定化ゲルを得た。固定化されたＬ−ア
ルギニンは固定化ゲル１c.c.あたり0.25ｍmolであ
つた。この固定化ゲルをカラムに充填して水およ
び緩衝用の塩を含む水溶液を流したところ30mlcm
-2hr-1以下の流速でしか流せなかつた。またこの
固定化ゲル充填カラムを実施例５と同様の方法で
真空、乾燥滅菌した。滅菌乾燥されたカラム内の
固定化ゲルは再膨潤によつて、凍結乾燥前の容積
の30％の容積までしか回復しなかつた。 比較例 ２ 酢酸ビニル100gr、トリアリルイソシアヌレー
ト5.1gr（X2＝0.05）、酢酸エチル150gr、ヘプタン
150grおよび２，2′−アゾビスイソブチロニトリ
ル3.1grよりなる均一混合液を実施例１と同様に
懸濁重合し、得られた粒子のエステル交換反応を
おこなつた。エステル交換はメタノール1.5を
用いた以外は実施例１と同様の方法で行なつた。
ゲルの物性は、比表面積２m2／ｇ、平均粒子径
100μｍ、qOH＝19meq／ｇおよびWR＝5.0ｇ／ｇで
あつた。このゲルを実施例１と同様にカラムに充
填し、同様のクロマト条件で分析を試みたとこ
ろ、カラムの圧力損失が大きく測定できなかつ
た。 実施例 ９ 酢酸ビニル100gr、トリアリルイソシアヌレー
ト41gr（X2＝0.30）、酢酸エチル70gr、オクタン
70gr、ポリ酢酸ビニル（重合度500）7grおよび
２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.5grより
なる均一混合物を実施例１と同様の方法で懸濁重
合し、得られたゲルのエステル交換反応を行なつ
た。 得られたゲルの平均粒径は70μｍ、qOH＝
7meq／ｇ WR＝3.0ｇ／ｇおよび比表面積は45
m2／ｇであつた。このゲルのデキストランMlim
はは３×105であつた。このゲルを実施例４と同
様にエピクロルヒドリンで活性化した。実施例３
と同様にSundberyらの方法で測定したところ、
乾燥ゲル１ｇあたり500μmlであつた。 次にこの活性化ゲルを水に懸濁し、底にガラス
フイルターと出口栓をそなえた直径10mmのガラス
カラムに導入した。ゲル導入時は出口栓は閉じて
おいた。ついで出口栓を開き、溶媒である水を自
然流下させてゲルを沈降させた。ゲルベツドの高
さは５cmであつた。ついでカラムの上部にペリス
タリツクポツプからの管を接続し、純水をカラム
内に流した。その時のカラム入口とカラム出口の
間の差圧と流量との関係を第１図に、差圧と体積
の関係を第２図に示す。なお体積は水を自然流下
させた時の体積を100として示してある。 比較のため、市販の一級水酸基を有する半硬質
ビニルゲル（粒径50〜100μｍ）をエピクロルヒ
ドリンで活性化したゲルおよび市販のエポキシ活
性化アガロースゲル（粒径60〜140μｍ）につい
ても同様にガラスカラムに充填し、差圧と流量、
差圧と体積の関係を調べた。得られた結果を第１
図及び第２図に示す。市販の一級水酸基を有する
半硬質ビニルゲルは実施例９の活性化ゲルと同様
に水を流下させつつ自然沈降させた時の値を100
として表示してあり、エポキシ活性化アガロース
ゲルはカラムの出口栓を閉じた状態で自然沈降さ
せた時の体積を100として示してある。 第１図及び第２図の結果より本発明のゲルが市
販のゲルに比べて著るしく硬く、低圧下で高流速
で液を流せることがわかる。 実施例 10 実施例１で得られた樹脂100mlを良く水洗した
後100mlの蒸留水に懸濁された。メカニカルスタ
ーラーで撹拌を行ないながら、4N水酸化ナトリ
ウム水溶液を滴下し、PHを11.0〜11.5に合せた。
次いで10ｇの臭化シアン粉体を加え、4N水酸化
ナトリウムを滴下してPHを11.0〜11.5に８分間保
ち、活性化反応を行ない、反応終了後すみやかに
氷冷した0.1M炭酸緩衝液5000mlで洗浄し、吸引
過した後、氷冷した0.1M炭酸緩衝液100mlに再
度懸濁させ撹拌を行ないながら、0.1M炭酸緩衝
液20mlに２ｇの市販のAnti−Rabbit Albumin
（Goat）のIgG分画〔Cappel Laboratories、Inc
（PA.USA）製〕を溶解した溶液を上記懸濁液に
加えた。４℃で20時間撹拌を行ない反応させた。
反応後0.15M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.5）で充分洗浄を行ない、Anti−
Rabbit Albumin IgG結合樹脂を得た。この際結
合したanti−Rabbit Albumin IgGの量は、水洗
溶液の吸光度測定（280nｍ）から約1.98ｇ／100
ml樹脂であつた。 このようにして得られたAnti−Rabbit
Albumin IgG結合樹脂を用いてウサギ血清より
アルブミンを精製する試みを行つた。該樹脂を
2.5cm直径×20cm高さのカラムに充填し、0.15M
塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液で十分
洗浄した後、200mlのウサギ血清を流速10cm／hr
で供給した。続いて上記洗浄用緩衝液で充分洗浄
を行なつた時、0.1Mグリシン塩酸緩衝液（PH
3.0）を溶離を行なつた。溶離液はただちにPH
11.5Mグリシン緩衝液を加え、PHを中性にした。
得られた溶離液は、４℃で0.15M塩化ナトリウム
を含む0.01Mリン酸緩衝液で一夜透析後280nｍの
吸光度測定、Lowry氏らの方法による蛋白質定
量、アクリルアミドを用いるデイスク電気泳動を
行ない、含有されるウサギアルブミンの定量及び
定性試験を行なつた。 得られたウサギアルブミンは215mgであり、純
度98％であつた。多成分からなる血清から直接精
製を行なつたにもかかわらず、アルブミン以外の
不純成分は極微量であつた。尚カラムは十分洗浄
後、8M尿素を流し、更に溶出したが、溶出液中
に蛋白成分等は見出せなかつ。 実施例 11 実施例１で得られた樹脂250mlを良く水洗した
後吸引過し、500mlのジメチルスルホキシド
（DMSO）に浸漬し一夜放置した。次に吸引過
を行ない、198ml（2.5モル）のエピクロルヒドリ
ンの入つた500mlのジメチルスルホキシド溶液中
に懸濁した。撹拌を行ないながら50％水酸化ナト
リウム水溶液を45mlを２時間かけて滴下し、次い
で30〜35℃の温度で４時間撹拌を行ない反応し
た。反応終了後700mlのジメチルスルホキシド、
700mlのアセトン３の蒸留水で順次洗浄し、エ
ポキシ活性化樹脂を得た。該活性化樹脂を用い、
公知の方法（山崎誠、石井信一、岩井浩一編等、
“アフイニテイ−クロマトグラフイー”参照）に
従い、抗ウサギアルブミン抗体精製用のウサギア
ルブミン結合樹脂を作成した。 0.1M炭酸緩衝液10mlに該活性化樹脂10mlを懸
濁し、さらに30mgのウサギアルブミンを0.1M炭
酸緩衝液２mlに溶解した溶液を加えた。室温で１
週間、時々撹拌をしながら反応させた。反応終了
後、ガラスフイルターを用い0.15M塩化ナトリウ
ムを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分に
洗浄し、ウサギアルブミン28mgの結合した樹脂を
得た。このようにして得られた樹脂をカラムに充
填し、実施例10と同様な方法で抗ウサギアルブミ
ン山羊血清を用い抗ウサギアルブミン抗体の精製
を行なつた。精製された抗体は高い力価を示す高
純度IgG蛋白であつた。
第１図は実施例９における差圧と流量の関係を
示したグラフ図である。 Ａ；実施例９における本発明の活性化ゲル、
Ｂ；市販の１級水酸基を有する半硬質ビニルゲル
をエピクロルヒドリンで活性化したゲル、Ｃ；市
販のエポキシ活性化アガロースゲル、 第２図は実施例９における差圧と体積の関係を
示したグラフ図である。なお、体積はカラムの出
口栓を開けて水を自然流下させて自然沈降させた
時の値を100として示してある。ただしエポキシ
活性化アガロースゲルの場合はカラム出口栓を閉
じた状態でゲルを自然沈降させた時の値を100と
して示してある。
示したグラフ図である。 Ａ；実施例９における本発明の活性化ゲル、
Ｂ；市販の１級水酸基を有する半硬質ビニルゲル
をエピクロルヒドリンで活性化したゲル、Ｃ；市
販のエポキシ活性化アガロースゲル、 第２図は実施例９における差圧と体積の関係を
示したグラフ図である。なお、体積はカラムの出
口栓を開けて水を自然流下させて自然沈降させた
時の値を100として示してある。ただしエポキシ
活性化アガロースゲルの場合はカラム出口栓を閉
じた状態でゲルを自然沈降させた時の値を100と
して示してある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ビニルアルコール単位、全炭素数が４〜５の
カルボン酸ビニルエステル単位並びに下記式
（）及び／又は（）で表される単量体 （ただしR1、R2およびR3は、それぞれ独立に、
CH2＝CH−CH2−、CH≡Ｃ−CH2−および
【式】を示す） より誘導される架橋単位よりなり、下記式 Ｘ＝W2／M2×n2／W1／M1×n1＋W2／M2×n2 ただし M1；カルボン酸ビニルエステルの分子量 M2；架橋性単量体の分子量 W1；重合に用いたカルボン酸ビニルエステルの
重量 W2；重合に用いた架橋性単量体の重量 n1；カルボン酸ビニルエステルが有するビニル基
の数 n2；架橋性単量体が有するエチレン性二重結合の
数＝３） で表される架橋度×（架橋単位の割合）が0.1≦Ｘ
≦0.4の範囲にあり、ビニルアルコール単位の量
（qOH）が5.0meq／ｇ〜17.0meq／ｇの範囲にある
マトリツクス及び該マトリツクスのビニルアルコ
ール単位の水酸基の酸素原子を介して共有結合し
たイミドカーボネート基、シアネートエステル基
およびエポキシ基の少なくとも一種300〜
3000μmol／ｇより構成され、かつ下記の(A)〜(D)
の物性を有することを特徴とする蛋白質の分離全
多孔質活性化ゲル。 (A) 比表面積（SA）５〜1000m2／ｇ (B) 保水量（WR）0.5〜6.0ｇ／ｇ (C) 平均粒径（DW）５〜1000μｍ (D) マトリツクスの排除限界分子量103〜108
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|---|---|---|---|
| JP56073387A JPS57190003A (en) | 1981-05-18 | 1981-05-18 | Wholly porous activated gel |
| CA000402172A CA1194644A (en) | 1981-05-18 | 1982-05-03 | Totally porous activated gel |
| US06/374,369 US4452918A (en) | 1981-05-18 | 1982-05-03 | Totally porous activated gel |
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| JP56073387A JPS57190003A (en) | 1981-05-18 | 1981-05-18 | Wholly porous activated gel |
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