JPH01145071A - リポ蛋白を除去した血漿の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液中の有害成分の除去方法、さらに詳しく
は、血液あるいは血漿、血清中からリポ蛋白、特に低密
度リポ蛋白（ＬＤＬ　）を選択的に吸着除去する方法に
関する。

（従来の技術と課題） 血液中に存在するリポ蛋白のうちＬＤＬはコレステロー
ルを多く含み、動脈硬化の原因となることが知られてい
る。とりわけ家族性高脂血症等の高コレステロール症で
は正常値の数倍のＬＤＬ値を示し、冠動脈の硬化等をひ
きおこす。この治療のため、血中ＬＤＬの低下を目的と
して食事療法、プロブコール、コレスチラミン等の薬物
療法が行なわれているが効果に限度があり、副作用も懸
念されている。特に家族性高脂血症に対しては患者の血
漿を分離した後、正常血漿あるいはアルブミン等を成分
とする補液と交換する、いわゆる血漿交換療法が現在の
ところほぼ唯一の効墨的な治療法である。しかしながら
周知のごとく血漿交換療法は、１）高価な新鮮血漿ある
いは血漿製剤を用いる必要がある、２）肝炎ビールス等
の感染のおそれがある、３）有害成分のみでなく有用成
分も同時に除去してしまう等の欠点を有する。これらの
欠点を解消する目的で膜による有害成分の除去が試みら
れているが、選択性の点で満足できるものはいまだ得ら
れていない。また同じ目的で抗原、抗体等を固定した、
いわゆる免疫吸着体を用いる試みがなされており、これ
は選択性の点ではほぼ満足できるものの、用いる抗原、
抗体の入手が困難かつ高価であるという致命的な欠点を
有する。

さらには有害成分に親和性を有する化合物（いわゆるリ
ガンド）を固定した、いわゆるアフィニティークロマト
グラフの原理による吸着体も試みられている。これに用
いるリガンドは比較的安価で、選択性も比較的よく好都
合であるが、担体にアガロースに代表されるソフトゲル
を用いているため、カラムに充填した場合に十分な流量
を得るのが困難であった。すなわち近年発達した体外循
環回路を用いた血液、血漿かん流療法（いわゆるプラズ
マフエレーシス等）にこれらの吸着体を用いようとすれ
ば、高流量を得るためにカラム形状に特別の工夫を要し
、またしばしば詰りを生ずるため予備のカラムを用意し
ておく必要があるなど問題点が多く、安定して治療を行
なえる状況には到っていない。吸着体の流れ特性を向上
させるためには機械強度の大きい担体を用いればよいの
は明白であるが、これらの担体を用いるとアガロース等
のソフトゲルに比べて吸着能力が低下することが知られ
ている。

一方、硫酸化多糖等のポリアニオン化合物がリポ蛋白と
親和性を持ち、金属イオンの共存下で沈殿を形成するこ
とが知られており〔例えばＭ、１３ｕｒｎｓｔｅｉｎ　
ａｎｄ　Ｈｏｒｔ、５ｃｈｏｌｎｉｃｋ、　Ａｄｖ、　
１ｎＬｉｐｉａ　、　Ｒｅ３．、且、６７（１９７３）
）、臨床分析等に用いられている。しかしながらこの方
法で患者の血中からＬＤＬを除去しようとすれば、処理
しようとする血漿に対し少くとも０．０５％のポリアニ
オン化合物および００２Ｍ以上の金属イオンを添加しな
ければならず、また生じた沈殿を遠心分離等の方法で分
離する必要が生じ、操作が煩雑で危険性が高く、事実上
適用不可能であった。

（課題解決のための手段） 本発明者らは鋭意研究の結果、特定のポーラスポリマー
ハードゲルを用い、これにリポ蛋白に親和性を有するポ
リアニオン化合物を固定することにより、安価で流れ特
性がよく、かつソフトゲルを担体に用いた場合に比し吸
着能力が低下しない、除去能力に優れたリポ蛋白吸着体
を得、本発明に到達した。

すなわち本発明は、球状蛋白質の排除限界分子量が１０
０万、以上１億以下のポーラスポリマーハードゲルにリ
ポ蛋白に親和性を有するポリアニオン化合物を固定して
なるリポ蛋白吸着体をカラムに充填し、血液から分離し
た血漿を該カラムに通すことを特徴とする血液からのリ
ポ蛋白除去方法を要旨とする。

以下詳細に本発明を説明する。

本発明に用いるに適した担体は、１）耐圧性であること
、２）比較的大きな径の細孔を有することが必要であり
、ポリマーハードゲルは本発明に最も適した担体である
。

ここでいうハードゲルとは、デキストラン、アガロース
、アクリルアミド等のソフトゲルに比べ溶媒による膨潤
が少なく、また圧力により変形しにくいゲルのことをい
う。ハードゲルとソフトゲルは次の方法により区別する
ことができる。すなわち後記参考例に示したごとくゲル
を円筒状カラムに均一に充填し、水性液体を流した際の
圧力損失と流量の関係が、ハードゲルではほぼ直線とな
るのに対し、ソフトゲルでは圧力がある点を越えるとゲ
ルが変形し圧密化して流量が増加しなくなる。本発明で
は後記参考例に示したカラムを用いた場合、少くとも０
．３　ｋｔＪ／ｃ７Ｊまで上記直線関係のあるものをハ
ードゲルと称する。

次に要求される性質は比較的大きな径の細孔を有するこ
とである。すなわちＬＤＬは分子量が少くとも１００万
以上といわれる巨大分子であり、これを吸着除去するた
めにはＬＤＬが細孔内に侵入できることが必要である。

次にＬＤＬが細孔内に侵入できても、細孔内に侵入する
確率がある程度大きくなければ吸着体としての性能は低
い、すなわち移動相と固定相（細孔内）間の分配比（固
定相の濃度／移動相の濃度）が大きいほど好ましいと考
えられる。従って細孔径が大きい程有利と思われる。

細孔径の測定法には種々あり、水銀圧入法が最もよく用
いられているが、ポリマーハードゲルの場合には適用で
きないことがある。したがって細孔径の目安として排除
限界分子量を用いるのが適当である。排除限界分子量と
は放置（例えば波多賢博行、花卉俊彦著、実験高速液体
クロマトグラフ、化学同人）等に述べられているごとく
、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入で
きない（排除される）分子のうち最も小さい分子量をも
つものの分子量をいう。現象的には、排除限界分子琶以
上の分子は移動相体積Ｖｏ近傍に溶出されることから、
種々の分子量の化合物を用いて溶出体積との関係を調べ
れば排除限界分子量を求めることができる。排除限界分
子量は対象とする化合物の種類により異なることが知ら
れており、一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエチ
レングリコール等についてよく調べられているが、リボ
蛋白についてはほとんど調べられていない。従って最も
類似している球状蛋白質（ビールスを含む）を用いて得
られた値を用いるのが適当である。

排除限界の異なる種々の担体を用いて検討した結果、予
想に反し排除限界分子量がＬＤＬの分子量より小さい１
００万程度のものでもある程度のＬＤＬ吸着能を示し、
また細孔径の大きいもの程能力が大きいわけではなく、
むしろＬＤＬ以外の蛋白が除去されることから最適な細
孔径の範囲が存在することが明らかになった。すなわち
１００万未満の排除限界分子量を持つ担体を用いた場合
はＬＤＬの除去量は小さく実用に耐えないが、排除限界
分子量が１００万乃至数百万とＬＤＬの分子量に近い担
体でも、ある程度実用に供しうる吸着体が得られる。一
方排除限界分子量とＬＤＬの吸着量、およびＬＤＬ以外
の蛋白質の吸着（いわゆる非特異吸着）との関係を調べ
ると、排除限界分子量が大きくなるにつれＬＤＬの吸着
量が増加するが、この増加は排除限界が１０００万を超
えると頭打ちとなり、一方ＬＤＬ以外の蛋白、例えばＩ
ＧＧ、ＩＧＭ等の吸着が目立つようになることがわかっ
た。さらに排除限界分子量が１億をこえるとリガンドの
固定化量が減少して結果的に・　ＬＤＬの吸着量が減り
、非特異吸着が無視できなくなる。従って本発明に用い
る担体の好ましい排除限界分子量は１００万以上１億以
下であり、最も好ましくは３００万以上７０００万以下
である。

次に担体の多孔構造については表面多孔性よりも全多孔
性が好ましく、空孔容積が２０％以上であることが好ま
しい。担体の形状は、粒状、繊維状、膜状、ホローファ
イバー状等任意の形状を選ぶことができる。粒子状の担
体を用いる場合、その粒子径は１μ以上５０００μ以下
であるのが望ましい。

さらに担体表面には固定化反応に用い得る官能基あるい
は容易に活性化し得る官能基が存在していると好都合で
ある。これらの官能基の代表例としては、アミ７基、カ
ルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、酸無水物
基、サクシニルイミド基、塩素基、アルデヒド基、アミ
ド基、エポキシ基等があげられる。

本発明に適したポリマーハードゲルの代表例としては、
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、架橋ポリビニル
アルコール、架橋ポリアクリレート、架橋されたビニル
エーテル−無水マレイン酸共重合体、架橋されたスチレ
ン−無水マレイン酸共重合体、架橋ポリアミド等の合成
高分子の硬質多孔体、およびこれらの表面に多糖類、合
成高分子等をコーティングしたもの等があげられるが、
これらに限定されるわけではない。これらのポリマーハ
ードゲルは単独で用いてもよいし２種類以上混合して用
いてもよい。

本発明に用いるに適したリポ蛋白に親和性を有するポリ
アニオン化合物の代表例としては、ヘパリン、デキスト
ラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫
酸、ヘパラン酸、ケラタン硫酸、ヘパリチン硫酸、キシ
ラン硫酸、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸
、キトサン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギ
ン酸硫酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カ
ラゲニン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラ
ミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メペサル
フエート等の硫酸化多糖、リンタングステン酸、ポリ硫
酸化アネトール、ポリビニルアルコール硫酸、ポリリン
酸等があげられる。最も好ましい例としては、ヘパリン
、デキストラン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸があげら
れる。

リポ蛋白に親和性を有する化合物（リガンド）を担体に
固定する方法としては既知の種々の方法を用いることが
できる。すなわち物理的吸着法、イオン結合性、共有結
合法等である。本発明による吸着体を治療に用いるには
、滅菌時あるいは治療中にリガンドが脱離しないことが
重要であるので結合の強固な共有結合法が望ましく、イ
オン結合法を用いるにしてもリガンドを共有結合的に架
橋しておくことが望ましい。また必要によりスペーサー
を担体とリガンドの間に導入してもよい。

リガンドの固定化量については、リガンドの性状、活性
により異なるが、有意のリポ蛋白吸着量を得るにはカラ
ム体積１　ｙｔｔｔあたり０．０２ｍ１以上が好ましく
、また経済性を考慮すると１００ｑ以下が望ましい。さ
らに好ましくはカラム体積１＋＋／あたり０．５ｑ以上
２０り以下である。

本発明による吸着体を治療に用いるには種々の方法があ
る。最も簡便な方法としては患者の血液を体外に導出し
て血液バッグ等に貯め、これに本発明の吸着体（粒子）
を混合してＬＤＬを除去した後、フィルターを通して吸
着体（粒子）を除去し血液を患者に戻す方法がある。こ
の方法は複雑な装置を必要としないが、１回の処理量が
少なく治療に時間を要し、操作が煩雑になるという難点
を有する。別の方法は、吸着体をカラムに充填し、体外
循環回路に組み込みオンラインで吸着除去を行なうもの
である。処理方法には全血を直接がん流する方法と、血
液から血漿を分離した後、血漿をカラムに通す方法があ
る。本発明による吸着体は、いずれの方法にも用いるこ
とができるが、前述のごとくオンライン処理に最も適し
ている。

本発明による吸着体を用いてＬＤＬを除去する際、処理
しようとする血液、あるいは血漿に多価金属イオンを添
加することにより除去効率、選択性を向上させることが
可能である。この目的に用いる多価金属イオンとしては
、カルシウム、マグネシウム、バリウム、ストロンチウ
ム等のアルカ’）　土類金Ｒイオン、アルミニウム等の
■属元素イオン、マンガン等の■属元素イオン、コバル
ト等の■属元素イオン等があげられる。

（実施例） 以下実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

参考例 両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円
筒カラム（内径９朋、カラム長１５（ｌｌｆｆ）に、ソ
フトゲルとしてアガロースゲル（Ｂｉｏｒａｄ社製Ｂｉ
ｏｇｅｌ　　Ａ　５　ｍ、粒径５０〜１００メツシユ）
、ポリマーハードゲルとして東洋曹達工業（燭製トヨパ
ールＨＷ６５（粒径５０〜１００μｍ）を、それぞれ均
一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、
流量と圧力損失の関係を求めた。結果を図１に示す。そ
れによるとポリマーハードゲルが圧力の増加にほぼ比例
して流量が増加するのに対し、アガロースゲルは圧密化
をひきおこし圧力を増加させても流量が増加しないこと
を示している。

実施例１ 架橋アクリレートゲル（全多孔性のハードゲル）である
トヨパールＨＷ５５（球状蛋白質の排除限界分子量（以
下、蛋白質の排除限界と略称する〕７００．０００．粒
径５０〜１００μｍ〕、同ＨＷ６０（蛋白質の排除限界
１．０００．　ＯＯＯ、粒径５０〜１００μｍ）、同Ｈ
Ｗ６５（蛋白質の排除限界５、ロｏｏ、ｏｏｏ、粒径５
０〜１００μｍ）、同ＨＷ７５（蛋白質の排除限界ｓｏ
、ｏｏｏ、ｏｏｏ、粒径５０〜１００μｍ）各１０ｍ１
に飽和ＮａＯＨ水ｍ　Ｈ６Ｍｌ、エピクロルヒドリン１
５ｍ１を加え撹拌しなから５０°Ｃで２時間反応しエポ
キシ化ゲルを得た。このゲルに濃アンモニア水２０ｍ／
を加え５０°Ｃで２時間撹拌しアミノ基を導入した。

次にヘパリン２００　ＭＦ！を１０ｔｔｔｔの水に溶解
しｐＨ４，５に調整した後、これに３　ｍｌの上記アミ
ノ基含有ゲルを加えた。これに１−エチル−３−（ジメ
チルアミノプロピル）−カルボジイミド２００〜をｐＨ
を４．５に保ちながら添加し４°Ｃで２４時間振とうし
た。反応終了後、２モル食塩溶液、０．５モル食塩溶液
、水で洗浄しヘパリン固定化ゲルを得た。固定化された
ヘパリンの量はそれぞれ２．２　ｑ／　ｍｌ、１．８〜
／肩ｌ、１．４〜／　ｔｔｔｌ、０８ｍダ／屑ｔであっ
た。

実施例２ ヘパリンをコンドロイチンポリ硫酸にかえた他は実施例
１と同じ方法でコンドロイチンポリ硫酸固定化トヨパー
ルゲルＨＷ６５を得た。固定化量は１．２４／肩ｔであ
った。

実施例３ 実施例１〜２で合成した吸着体各ｉ　ｍｌを試験管にと
り、これに人血漿３ｒｉ？１ａＣ１２０，０２Ｍ含有）
を加えて撹拌し、２０°Ｃで１５分間静置後、上澄みの
コレステロール濃度およびＬＤＬ　（β−リポ蛋白）量
を測定した。結果を表１に示す。

表−１から分かる通り、本発明に使用する吸着体を用い
た場合、リポ蛋白の吸着が良好であり、従って上澄みの
コレステロール濃度およびＬＤＬ（β−リポ蛋白）が比
較例より減少している。

（以下余白）

【図面の簡単な説明】

図１は、参考例の各種ゲルを用いて流速と圧力損失の関
係を調べたグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）球状蛋白質の排除限界分子量が１００万以上１億
   以下のポーラスポリマーハードゲルにリポ蛋白に親和性
   を有するポリアニオン化合物を固定してなるリポ蛋白吸
   着体をカラムに充填し、血液から分離した血漿を該カラ
   ムに通すことを特徴とする血液からのリポ蛋白除去方法
   。
2. （２）ポーラスポリマーハードゲルが合成高分子からな
   る特許請求の範囲第１項記載のリポ蛋白除去方法。
3. （３）ポリアニオン化合物が硫酸化多糖である特許請求
   の範囲第１項記載のリポ蛋白除去方法。
4. （４）硫酸化多糖が、ヘパリン、デキストラン硫酸およ
   びコンドロイチンポリ硫酸から選ばれる少なくとも１種
   である特許請求の範囲第３項記載のリポ蛋白除去方法。
5. （５）ポリアニオン化合物の固定化量がカラム体積１ｍ
   ｌあたり０．０２ｍｇ以上１００ｍｇ以下である特許請
   求の範囲第１項記載のリポ蛋白除去方法。