CS241105B2 - Methof of totally porous activated gel production - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby totálně pórovitého aktivovaného gelu. V užším se vynález týká způsobu výroby totálně pórovitého aktivovaného gelu, který zahrnuje základní hmotu (msttici) tvořenou totálně pórovitým zrsíěěnjm polymerem, zahrnujícím jako hlavní složky monoomrní jednotky vinylalkoholu a sílující monomerní jednotky, a reaktivní skupinu vázanou na uvedenou ma^rci,

V biochenii je důležitý úkolem izolovat požadovaný protein, enzym nebo jinou biolátku ze sdíií, která takovouto látku obsáhle. Vyvinuuí zlepšené metody pro izolování různých biolátek bylo již v minuuosti předmětem různých výzkumných prací.

Pro izolování požadované biolátky jsou známy různé metody· Jsou to například metody, xyuuívaaící 1, rozdílu rozpus^nno^, 2, rozdílu elektrických nábjjů, 3. rozdílů vr velikosti mooetauL a v jejich konfiguraci a 4. rozdílů vr fyzikální a chemické afinitě. Kromě těchto konvenčních metod existuje též známá metoda, která využívá biologické specifické afinity pro isolování, oddělování nebo čištění požadované biolátky·

Této metody se široce využívá, protože zajišiuje vyšší s^peci^icit^u než ostatní konvenční metodr· Zejména metoda afinitní ^γο^Ιο^Α^, při níž je jedna z látek, X^i^i^í^iSů^ujících se vzájemnou afinitou, vázána na nerozpustnou —θΙ— a druhá z těchto látek se speecficky oddělí, je velmi široce používána vzhledem ke snadné meanpplaci (viz například Ychiro Cxibata a spoo. Afinity Ώurbmetogrаph^y (AAinitní vyd. Kodansha Κ. K, Japonsko, 1976).

metodou k insolubiliztii látky mající biologickou afinitu je metoda, při níž se tato látka váže na nerozpustný aktivovaný gel tovea.cntní vazbou. Tato metoda vyžaduje aktivovaný gel, kterým je gel ícIící reOctivní skupinu vázanou ke gelu kovalentní vazbou, kterážto reaktivní skupina je schopna veeít v adiční nebo ^Ь8^^6п1 reakci s nuukeeoflní, aktivní vodík obsGaLuuící reaktivní skupinou oddělované látky, jakou je například a—noiSoipina, karboxylová stopina, hydroxylová stopina nebo thiolová skupina, k vytvoření tov—cntní vazby mezi reaktivní skupinou a nuuileoilní, aktivní vodík obsaUuuící reaktivní Skupinou.

Obecně by aktivované gely, jichž se má pouužt pro oddělování biolátek^ které využjí— voj biologické afinity meei látka—, měly mít tyto vlastnossi:

1, gely by měly obsahovat reaktivní skupiny ve vysoké konccctraci, aby se tak íoIU.o vázat na gely velké mrnožsví biolátky)

2, ' gely by měly být schopny vázat na sebe bidánu, vyzna^^cí se biologickou afinitou, aniž by způsobily ztrátu této biologické afinity;

3, gely by se prakticky nandy vyznačovat nespe-fictou adsorpcí bL^^á^ek, aby se tak na ně Boda adsorbovat pouze požadovaná látka;

^gdy by sL měl^y po^ržeX svou původní mecha^ictou ^pevnost a pórovitou sld—to, aniž by byly ovlivněny rozpouštědlem, moodfikačním činidlem, hodnotou pH a teplotou, používanými při vázání Molány na gelovou marre^c, nebo při uvedení směsi bi-štek ve styk s vázanou Molátkou za účelem připoutání Molány, vyznaauuící se biologickou fintou vůči vázané ЭДСё^с, ¹ vázan^é Molátoc, ^přičem^{ž by} tyto gely ume^oínbv^ay, a^by ostatní bidány, nemajcí biologickou afinitu 1 vázaným biolátkám, volně odtékaLy, nebo při eluování biolátky, připoutané 1 vázané taolátcc následkem afinity mezi nimi;

5. gal^y b^y měl^y být pórovito ta¹, a^by sr tyziolcgicto .Látty, jato jsou aminokyseliny, proteiny, polypcitidy a podobně, mohly dostatečně rozptylli uvvntř gclové —οΙγ!^;

6, gely by měly být Skladovatelné, aniž by po&éhaly zkáze hnitím, a

7. gely by měly mít dostatečnou mechanickou pevnost, tak, aby se neničily během aktivování gelu, tj· během vprav^ání reaktivních skupin do gelové magice a při vázání biolátky na gel·

Ainitní chruInatturuaie se často provádí na gelech vnesených do kolony· V těchto případech je třeba pooLužlviat gelů, které maaí dostatečnou mechsanickou pevnost, aby tak bylo možno nechat jimi procházet kapiO-inu velkou rycIhosSí měly být vysušeny vymrazením a podrobeny sterilizaci etylenoxidem podrobeny sterilizaci teplem nebo ozářením podle způsobu jejich

Dále by tyto gely nebo by měly být přímo pouCiií· Je žádoucí, aby chemická a fyzikální skladba gelů se během sušení vymezováním a během sterilizace neppouUHa<

dotud byly jako gely k použití pro oddělování biolátek, při němž se využívá mmei látkami, navrhovány gely získané aktivováním přírodního nerozpustného nosiAž afinity če, jako je agaroza nebo celulóza, buomkytnem· Obbvváětě se ve velké míře poujžvatí gely oⁱvozen^é o^d αgαióz^{y (}viz (1) L· Sundberg a ^J· Poratty ^J· Ciromertog rapty > 90^, str· ⁸⁷ (1974); (2) zveřejněná japonská patentová přihláška č· 2803 H1^74]. Gely tohoto druhu jsou dostupné například pod f^iemnj^m označením Sepharose (výrobek fimiy Hharmacia Fine Chee^cás, !ne·, Sv^sko) ·

Avšak gely odvozené od agarózy te vyznačují významnou nevýhodou, sppUUvaaící v tom, ie maaí nediutotující mechanickou pevnást, takže se stěny pórů v gelech při aktivování gelů, tj. při vpravování reaktivních skupin do gelové matrice, a při vázání biolátky na gely snadno bootí a kapalná směs obsta^ící biolátku, která se má ze směsi odd^lt, se nemůže vést velkou rycího stí kolonou v případě, ie se gely pei^vaa! v koloně jako náplň· Další vážnou nevýhodou gelů odvozených ad agarózy je, ie se póry gelů booítX následkem sušení vymrazováním a nelze je obnovt ani když se gely znovu disper^^í ve vodném rozpou utěcdLe, a že tyto gely nelze podrooit sterilizaci teplem nebo ozářením, protože při této sterilizaci ke zničení pórovité skladby gelů· Výše uvedená nevýhoda, že tyto gely nelze podroobt sterilizaci teplem nebo ozáření?, je rozhodnící v případě, kdy gely jsou určeny pro pOKuttí v lékařství pro mii^tě-ní periuzi krve k odstranění obsažených škodlivých látek·

Jako gelu se zlepšenou mechanickou pe^mo^í v porovnání s gely odvozenými od agarózy, jak byly výše popréty, se ve zveřejněné japonské patentové přihlášce číslo 160 300/1979 ^povídaící patentovým spisům US č· 4 246 362, 4 256 842 a 4 256 843) navrhuje pouužt polotuhého tydrooilního syntetického polymerního gelu z polyvinylového polymeru obsahnuícího volné primární tydroxylové skupiny· Gelů, popsaných ve výše uvedené japonské patentové přihlášce, je možno 'pouužt pro Ofinitní chrommtoorafii· I když tyto gely maaí vyšší mechanickou pevnost v porovnání s gely odvozenými od agarózy, je £ jejich mechanická pevnost stále ještě nedostatečné. K tomu přistupuje, že tyto polotuhé gely jsou dostatečné pcrGolté·

Stává proto stále značná potřeba aktivovaných gelů pouužtelných pro účinné rozdělování biolátek, jež využívá afinity mezi látkami, kteréžto gely by se neoznačovaly výše uvedenými nedostatky·

Vyvinuu^ aktivovaných gelů, po nichž je v odborných kruzích velká poptávka bylo věnováno mnoho úsSií· Přioom bylo zjištěno, že totálně aktivovaný gel, který zahrnuje matrici z totálně pórovitého zesítěného ^polymeru, zahrnujícího jako hlavní složky monornmení vinylalkoholové jednotky a sírující monommrní jednotky a majícího

5 2—1 speecfický povrch v rozmezí 5 x 10Haž 10 x 10^ m ^kg a reaktivní skupinu vázanou na uvedenou magici kovalentní vazbou, splňuje veškeré požadavky na gel, tak jak byly výše uvedeny·

Tento vynález ae opírá o výše uvedená zjištění.

Je proto účelem vynálezu postytnout způsob výroby aktivovaného gelu vyznačujícího se těmito vlastnostmi:

1, gel je schopen na sebe vázat biolátku vyznačující se biologickou afinitou, aniž by přitom došlo ke ztrátě této biologické afinity;

2, gel obskhuje aktivní skupiny ve vysoké konncnnracc, takže na gel je možno vázat zvýšené množsví biolátky;

3, gel se prakticky nevyznačuje nespecifickou adsorpcí biolátek, takže se na něj může specificky adsorbovat pouze požadovaná látka;

4, gel si může podržet svou původní mech «mickou pevnost a pórovitou slkLadbu, aniž by byl ovlivněn rozpouštědlem, mooifikačním činidlem, hodnotou pH a jinými jej obklopujícími podmínkami;

5, gel je pórooitý, ^t^akže íýziologické íl-átty, jako jsou aminotyysUny, prote^y, polypeptidy a podobně, se mohou v dostatečné míře rozptýlit v gelové maarici;

6, gel se může skladovat, aniž by pomáhal zkáze hnitím;

7, gel má dostatečnou mechanickou pevnost.» takže se neničí během aktivování a při vázání bioláýty na gel;

8, gel má dostatečnou mechsaickou pevnost a pórovitou skladbu, takže je možno jím vést kapalinu vysokou rycíhossí;

9, ^1 je možno sušit vymrazováním, a

10, gel je možno p^c^x^c^o^bit steeilizaci plynným etylenoxidem.

Výše uvedené účely jako# i dihií účely, znaky a výhody vynálezu budou zřejmé z dále uvedeného podrobného popisu a definice předmětu vynálezu a přihlédnutím k p^pcenn^ výkresům, z nichž obr. 1 znázorňuje graf uvádějící vztah mezi- průtokem vody p^t^lTél^e^jdící kolonou a rozdílem tlaků na vstupu a výstupu z kolony plněné gelem vyrobeným způsobem podle vynálezu (přímka A , známým polotihým polyiinyOovm gelem obsEOniuícím volné hydroxylové skupiny, který je aktivován epichlortydrnnem (přímka B) a známým epo:xyaktivovan2m agarózovým gelem (přímka C), a na obr. 2 je nakreslen graf znázornujcí vztah mezi objemem gelu a rozdílem tlaků na vstupu a výstupu z kolony plněné vzorky výše uvedených gelů.

Podrobběěi bude o zobrazených grafech pojednáno v příkladu 9.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby totálně pórovitého aktivovaného gelu, kterýžto způsob spočívá v tom, že se v suspenzi polymeruje iinyLkarboχylátoil monomer o 4 až 10 atomech uhlíku se síťujícím monomerem mma^ím alespoň dvě etylenově nenasycené dvojné vazby, vzniklý kopolymer se podrobí trjLnteateeifikačnϊ a/nebo zmUdlňovací reakci a vzniklá ^polymerová mmanim, obseauuící hydroxylové skupiny a ísčící specificty ^povícU 5 x ¹⁰^ až I⁰ x 1^0> m.kg ^, tatootu z^rže vody W_R 0^,5 až ^6,0 ^kg.^kg” , vylučovací mez molekulové UInoOnooti №.im 10J až 10 a hmoonoosní střední průměr zrn 5 až 1 000 (Um, se nechá reagovat s aktivačním činidlem, schopným tvořit kovthentní vazbu atomem kyslíku hydroxylové stopiny matrice a majícím reaktivní skupinu, kterážto aktivačním Činidlem je alespoň je^dnt látto ze sltupin^y sešívající z ep^tlogentyádinů, htLogeokyaoů a diepoxidových sloučenin obseaihUících 4 až 10 atomů Uhlíku, v tikovém pommru, že 0,3 až 3 moly reaktivní stopiny se váží na 1 kg magice, kteroužto reaktivní stopinou je lUnkční stopina schopná ustotečnOt adlčoí nebo subssituční reakci s nukkeooilní reaktivní stopinou maaící aktivní vodík v prostředí o konceeOraci vodíkových iontů 3 až 13 vyjádřenou hodnotou pH při teplotě 273 až 373 K za vzniku kovtaientní vazby mezi uvedenou reactivní stopinou a uvedenou nu^ieoHní macUvní stopinou.

Polymerace v suspenzi se při způsobu podle vynálezu provádí při takovém poměru mnnožtví monommeů, při němž se získá kopolymer maaící hodnotu poměru slujících jednotek X2 v rozmezí nerovnost 0,1 éX₂ áO,4, s výhodou 0,15 — Xg 0,3, kterýžto poměr sírujících jednotek je definován vztiheem

w.

W w₂ — x n, + — x n₂

ve kterém “2 Wi

znamená molekulovou hmoonost •vinylkarSoxylátového monommru, znamená mooetolovou hmoonost sííujícího monommeů, znamená hmoonootní mnoossví vioylkarboxylátového monomeru použitého při suspenzní po?Lym^r^í^(^c., znamená h^c^or^n^^s^i^JÍ mnoossví sírujícího monomeru použitého při suspenzní polymeeaci, znamená počet etylenově nenasycených dvojných vazeb příOomných ve vinylkarboxylátovém monomeru a znamená počet erylensaě nenasycených dvojných vazeb příommných v slujícím mon omenu.

Vinylatkohsloaé monommení jednotky v mati-ci se připraví zmýdelněním a/nebo Гг^ю&rsSerifitací aioylktrSoxylátoaých monommenOch jednotek obsažených v kopolymerů, připraveném suspenzní polymmrací aioylkarboxylá·Oového monomeru a slujícího οοποιιιο™· Čím větší je obsah vinylalkoholových monommeních jednotek v matrici, tím větší je koncentrace reaktivních stopin obsažených v gelu. Kromě toho se gel následkem obsažených hydroxylových stopin aioylatOoholovéhs monomeru stává hydrofiloím.

Výhodně se rransesterifitační a/nebo zmýelnovací reakce provádí do takového stupně, že vzniklá maarice má koncceOraci q^ vinylaiooholových monommerích jednotek alespoň ^5,0 mo^oů.^kg“', avša^k oepřesáih^cí ^ho^dnotu ^danou vzt^eem

000 (1-Х2) + 39 X₂ ve kterém

má výše uvedený význam a hodnotu v nerovnost • 0,1 ^^0,4 .

Jestliže hodnota q_QH překročí výáe uvedenou horní hranici, sníží se pevnost gelu; jesliže však hodnota q^ je menší než uvedená dolní hranice, gel ztrácí hydrofilitu. Mimochodem, hodnotu q_QH je možno stanovit tak, že se gel nechá reagovat s anhydridem kyseliny octové v pyridinovém rozpouštědle, načež se změří množství anhydridu kyseliny octové spotřebovaného na reakci s hydroxylovými skupinami a z této změřené hodnoty se vypočte koncentrace vinylalkoholových monomerních jednotek.

Například, jestliže se na reakci s 1 kg suchého gelu spotřebuje 1 mol anhydridu tyseliny octové, činí hodnota tohoto gelu к mol.kg” \

Jako šíbujícího monomeru se výhodně použije monomeru obsahujícího kyanurátový a/nebo isokyanurátový kruh.

Z hlediska kopolymerovatelnosti s vinylkarboxylátem a z hlediska mechanické pevnosti jemné pórovité skladby a chemické stability výsledné matrice je výhodné použít šíbujícího monomeru obecného vzorce

nebo

OR.

I

N^N ¹ !!. /^CV^C\

R3O or₂ ve kterém každý ze symbolů Rj, R₂ a R^ znamená nezávisle ne druhých symbolech skupinu vzorce

CH₂-CH-CH₂ nebo CH₂«C-CH₂ch₃

Výhodně se jako šíbujícího monomeru použije triallylisokyanurátu a jako vinylkarboxylátového monomeru se s výhodou použije vinylacetátu.

Aktivovaný gel, který se získá způsobem podle vynálezu, je velmi vhodný к účinnému oddělování biolátek vzhledem ke zvláštnímu chování reaktivní skupiny aktivovaného gelu v porovnání s dosavadními známými gely. Aktivovaný gel podle vynálezu je s výhodou tuhý, má vynikající mechanickou pevnost, odolnost vůči chemikáliím, vysokým i nízkým hodnotám pH, vysokým i nízkým teplotám, a je velmi účinný při specifické adsorpci biolátek. Může být sterilizován vymrazovacím sušením, tepelným zpracováním i ozářením, takže jej lze použít pro mimotělní perfúzi, například krve. Podrobnější popis výhod gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu oproti dosavadním známým gelům bude uveden v další části popisu.

Reaktivní skupina, která se má vpravit do gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu, je nutná pro uskutečnění adiční nebo substituční reakce s takovou nukleofilní reaktivní skupinou mající aktivní vodík, jako je aminoskupina, karboxylová skupina, thiolová skupina apod., jak jsou obsaženy v biolátce mající biologickou afinitu. Kromě toho má reaktivní skupina být dostatečně stálá, aby prudce nereagovala ve vlhkém stavu s vodou, avšak má být dostatečně reaktivní, aby vytvořila kovalentni vazbu s nukleofilním substituentem biolátky, aniž by blokovala biologickou afinitu biolátky.

Jako vhodnou reaktivní skupinu, která se má vpravit do gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu, je možno uvést nappíklad imdokarbonátovou skupinu, zbytek esteru kyseliny kyanaté, epoixyskupinu obes^uící 3 až 10 atomů uhlíku, karbonátovou skupinu, hromad tylovou skupinu, halogen tri мОпо^и skupinu a zbytek esteru kyseliny Ι^^αζο^^α^αmové. Z výše uvedených reaktivních skupin jsou výhodné imidokarbonátová skupina, zbytek esteru kyseliny kyanaté a ^o^sk-ipina obsEauujcí 3 až 10 atomů uh.íku.

Podle potřeby je možno vázat na gelovou mattici reaktivní skupiny jednoho druhu nebo je možno na ni vázat rejctivní skupiny různých typů.

Je výhodné, když je reaktivní skupina vpravena do gelu ve vysoké konccentaec. Gel vyrobený způsobem podle vynálezu má ^π^πΟ^ο! reaktivních skupin v rozmezí 0,3 až ³ eo0y.^kg” such^o gel^ s výtadou v rozmezí ^0,5 a^ž 3 moty.kg su^éto gelu.

K^nc^c^e^nr^i^<^i reaktivních skupin y gelu je možno stancovi obvykým. postupy. Najpíklad konccenraci zbytků esteru kyseliny kyanaté V gelu je možno stanout metodou Wilc^ta a tpo^u. ^fviž WíIc^¹ a sppK ^, Bio^em. Bio^phys. Res. ^, 84^, str. ^{7 (}19⁷⁷⁾⁾

PPi této metodě se gel nechá reagovat s činidlem pro kiш00tаtiioí andýzu, připavveiým z pyridinu, koncentrované kyseliny chlorovodíkové a kyseliny btrbituzové pPi teplotě ⁴⁰ °C. Reakční směs se z^tuje a určí se t^rbance fíLrátu ^pPi 5*75 nm, čímž se zjistí koncentrace reaktivních skupin v gelu.

Konc:irOraci epoixiskipin v gelu je možno stanoovt metodou Sundberga a spo!· [viz

L. Sundberg a ^J. Poroty J. Οιγο^^ο^. ^, 90, str. ⁸⁷ .(Γ974)] . PPi této metodě - se gel nechá reagovat s tUioэítonee sodným, Čímž se uvolní hydroxylové ionty a takto uvolněné hydroxylové ionty se titrují kyselinou.

Je rovněž známa jednoduchá metoda pro stanovení koncentrace reaktivních skupin v gelu, při níž se gel uvede ve styk s dig^^t^em; určí se eeo08tví (uliguprptiiu adsorbovaného na gelu, čímž je zjistí koncentrace reaktivních skupin [viz. R. Axen a S. Ernback, Eur. J. Biochem^ 18, str. 351 (19*71 )J. '

Matrice gelu vyrobeného způsobem podLe vynálezu sestává z totálně pórovitého zesítěného kopolymeru, zjUrnujíiíUu jako hlavní složky vinylalluholové monomm™! jednotky a sítující monoom™! jednotky, v němž se trvalé póry udržují sírující skladební jednotkou. Je výhodné, aby sí£uuící skladební jednotka mmani^ gelu pode vynálezu zahrnovat, jakožto . s^í(^u^ÍÍ^e^T^(^nom^i^i^J^í je^ot^, jedno^tk:u odvozenou od monommru m^j:^íc^í^b^o alesfion dvě etylenově nenasycené dvojné vazby, zejména jednotku odvozenou od monommi^ m^jjící^h^o alespoň dvě vⁱny^lov^é skupiny a/nebo ďHylové skipii^, které jsou chemicky stálé a snižuj nesppeifickou adsorpci biolátek na eajtici gelu.

Jako sppecfické pPíklady síluuící monoom™! jednotky v mottici aktivovtrného gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu je možno uvést jednotky odvozené od derivátů triazinu, jako je triallyHekkainurát a 0riallykkjsourrt, diakryláty nebo dieerttkyláty, jako je rtylrngLykoldieertack^,ylát a iir0llrogllkuliieertj:kylát, polyvinnyе-Ситу, jako je butandioldivimleter, iirtllrogllkoUdivioylétrr a Ο^τ^Ιοι^^^^ , a polytLlllové étery, jako je iiaLLylirenprntaerrlhurtol a ^^лоНу^з!^tn. Mohou se pouužt sam<^1tné nebo ve vzájemné s^ě^ěi. Z výše uvedených monomerů je obzvláště výhodný - triallyliskkjínurát, protože skýtá mat^id s velmi dobrou mechодiikuu pevnoost, jemnou pórovitou skladbou a chemickou stálostí. Kromě toho je rovněž možno pouuít dijllyproDpargyUytnurátu.

Jak bylo výše uvedeno, zahrnuje matrice z aktivovaného gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu jako hlavní složky vinyl alkoholové monommrní jednotky a sííující monoměrní jednotky. Avšak magice může rovněž zahrnovat jiné monommení jednotky, napPíklad vinylkarboxylátové monomeení jednotky a/nebo vinyléterové monooenií jednotky.

I

Aktivovaný gel vyrobený způsobem podle vynálezu je totálně pórovitý, takže má v suchém stavu Velký specifický povrch. Totálně pórovitou skladbou se rozumí skladba, u níž jsou jemné póry rozptýleny v prostoru mezi zrny polymeru. Obecně je organický syntetický polymer, mající zesítěnou skladbu, v rozpouštědle nabotnalý a v slichém stavu se smrští. U měkkého gelu slouží oka v sílové skladbě, vzniklé zesítěním, jako póry. Měkký gel má požadovanou velikost póru v případě, kdy je nabotnán v rozpouštědle, avšak v suchém stavu se smští, takže péry prakticky zmizí.

Když póry prakticky zmizí, je specifický.povrch polymeru představován .pouze vnější částí povrchu polymeru, což obvykle bývá méně než 1 x 10³ m^.kg”¹. Agarózový gel, obvykle používaný jako - mařice pro afinitní ctašommaograaii, je měkký gel, jehož póry ' v - suchém stavu prakticky mizí.

Je proto nutno jen udržovat v nabotnalém stavu - ve vodném rozpouštědle. Naarooi'tomu má tuhý gel skladbu, při níž se, rozptýlený v celé hmotě, střídají nepatrné prázdné prostory tvořící póry, s tuhými částmi kostry. Veeikost pórů se prakticky nemřní, al je gel v nabotnalém nebo v suchém stavu. Specifický povrch tuhého - gelu -je .obvykle větší než specifický povch měkkého gelu. .

Aktivovaný gel, vyrobený způsobem podle vynálezu, má specifický povrch v rozmezí

5 2 —1 x 10- až 10 x 10” m kg . Jsou známy různé metody pro stanovení specifického povrchu. U gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu se specifický povrch stanoví nejběžnější metodou, BET, za použití plynného dusíku.

Vzorek, který se pouužje pro stanovení specifického povrchu, má být dostatečně vysušený. Gel vyrobený způsobem podle vynálezu se vyznačuje vysolým stupněm zesilní a má pevnou pórovitou skladbu a proto, i když je ponořen ve vodě a pak vysušen,si uchovává tentýž specifický povrch jako má polymer před výte popsanými postupy, tj. před ponořením do vody a následným vysušením.

Poněvadž vtak je obtížné gel vyrobený způsobem podle vynálezu vysuutt pro stanovení specifického povrchu vzhledem k vysoké míře hydroiinnosi, je výhodné, když se gel nejprve uvede v rovnováhu s acetonem a pak za sníženého tlaku při teplotě nepřesOhiuící 60 °C.

Zádrž vody Wb aktivovaného gelu vyrobeného způsobem podle, vynálezu by měla být λ 1 .

v rozmezí od 0,5 do 6,0 kg. kg” , s výhodou od 1,0 do 5,0 kg'kg . . Hodnota Wr představuje. hrnoonootní minožtví vody, které m^:že být obsaženo v pórech gelu·, je-li gel ” v - rovnováze ' s vodou, vztažené na jednotku hmotnostního možtví gelu v suchém stavu. . Hodnota Wr může být kritéreem udávajícím mžžtví póru uvnntř gelu.

Když se hodnota Wr zvyšuje, klesá pornmrně hrnoonnotní mrnožtví oné čá:^ti gelu tvořící kostru ve vodě, tj. hmooncjstní m^ž^ví samotného gelu. Proto, jestliže je hodnota Wr přilit vysoká, snižuje se mmehanická pevnost gelu. Jestliže je hodnota Wr příliš nízká, poněvadž mnnžžtví pórů v zrnech je mmnní, snižuje se rozdělovači schopnost gelu. Je tedy z - hlediska fyzikálních vlastností gelu výhodné, aby hodnota Wr byla ve výte uvedených mmeích.

Hodnotu Wr je možno stanovit tak, že se gel, který je po dostatečně dlouhou dobu v rovnováze s destioovanou vodou, odstředí k odstranění vody lpějící na povrchu gelu, pak se gel zváží (Wj), vysuší a znovu zváží (W₂), načež se hodnota Wr vypočte podle vztahu:

*1 - ^W2

Střední průměr srn aktivovaného gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu je v rozmezí od 5 do 1 ООО Střední velikost srn se stanoví použitím komerčního přístroje, jako je Coulter Counter” (obchodní označení přístroje vyráběného firmou Cotlter

Electronica lne·, USA) nebo *HIAC PA-720* (obchodní osnaČení přístroje vyráběného firmou

Scientific Company Ihc., Ί/SA).

Jak již bylo výše uvedeno, sestává matrice aktivovaného gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu z totálně pórovitého zesítěného kopolymeru, zahrnujícího například vinylalkoholové nononemí jednotky, vinyl kar boxylátové nononemí jednotky a jednotky, odvozené od výše uvedeného sírujícího monomeru, tj· monomeru majícího alespoň dvě etylenově nenasycené dvojné vazby. Taková matrice aktivovaného gelu vyrobeného podle vynálezu má s výhodou poměru hodnotu sílujících jednotek (Xg) v rozmezí nerovnosti 0,1 ^Xg^0,4, výhodně v rozmezí 0,15 ~ Xg^ 0,3, přičemž definice poměru sírujících jednotek Xg již byla uvedena v předchozím textu·

Jak již bylo uvedeno, může matrice dále zahrnovat jiné mononerní jednotky, které nemají nepříznivý vliv na fyzikální vlastnosti aktivovaného gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu; příkladem takovýchto jiných monomerních jednotek je vinyl/terová monomerní jednotka· Tato vinyléterová monomerii jednotka může být v matrici obsažena v molárním množství až 3 S, vztaženo na celkové množství monomerních jednotek tvořících gelovou matrici·

Afinitní chromátografie se obvykle)používá к rozdělení, čištění nebo lisování molekul o vysoké molekulové hmotnosti· Proto by se gely, určené к použití pro afinitní chromátofrafii, měly vyznačovat vysokou hodnotou vylučovací meze molekulové hmotnosti Mlim, která označuje dolní hranici molekulové hmotnosti molekuly, která nemůže vniknout do pórů gelu· Látky, mající molekulovou hmotnost vyšší než je tato kritická hodnota, nemohou vniknout do pórů gelu, nýbrž procházejí přímo mezerami mezi zrny. Hodnota Mlim matrice aktivovaného gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu je v rozmezí od 10^ do 10®

Hodnotu Mlim je možno stanovit z kalibrační křivky GPC. Kalibrační křivku je možno získat vynesením dat získaných měřením vzorků, majících známou molekulovou hmotnost, do grafu, na jehož ose X je nanesena eluční kapacita kolony plněné gelem a na jehož ose X je nanesena hodnota logaritmu molekulové bmotnosti| tato kalibrační křivka zahrnuje čářu prakticky rovnoběžnou s pořadnicí a následnou čáru se záporným gradientem.

Při stanovení hodnoty Mlim se u tohoto vynálezu používá glykolu nebo dextranu jakožto referenční látky mající známou molekulovou hmotnost, a destilované vody jakožto rozpouštědla, a odečte se hodnota pořadnice v bodě, kde prodloužená čára, rovnoběžná s pořadnicí takto získané kalibrační křivky protíná prodlouženou nakloněnou čáru, a teto odečtená hodnota se označí jako hodnota Mlim.

Mimochodem, poněvadž komerčně dostupné vodorozpustné standardní polymery nají molekulovou hmotnost nižší než 2 000 000, nelze získat úplnou kalibrační křivku pro gel mající hodnotu Mlim přesahující 2 000 000. Proto nelze hodnotu Mlim takovéhoto gelu přesně stanovit, je však ji možno odhadnout podle průsečíku, v němž prodloužená kalibrační křivka, stanovená pro molekulové hmotnosti nižší než 2 000 000, protíná prodlouženou čáru rovnoběžnou 8 pořadnicí, kteréžto stanovení se provádí za týchž podnínek jako u gelu s nižší hodnotou Mlim.

Je výhodné, aby nespecifická adsorpce biolátek na matrici aktivovaného gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu byla malá, tak, aby se na gel mohla adsorbovat pouze požadovaná látka. Stupeň nespecifické adsorpce biolátek na gelovou matrici je možno stanovit tak, že se gelová matrice nejprve vnese do kolony, pak se kolonou nechá procházet roztok biolátek, Čímž se biolátky uvedou ve styk s gelovou matricí, načež se stanoví množství biolátek, které z kolony vytekly, aniž by se adsorbovaly na gelovou matrici.

Jakožto blolátky, kterých je možno použít pro výše popsaný například aminokyselinu a albumin, který je jedneu se sérových bílkovin· účel, je možno uvést

Výhodná rozmezí fyzikálních vlastností, jako jsou specifická povrch, zádrž vody W_R a průměr zrn matrice, mohou být prakticky stejná jako u aktivovaného gelu·

V dalším bude popsáno výhodné provedení způsobu podle vynálezu к výrobě aktivovaného gelu· Je samozřejmé, že způsob pro přípravu aktivovaného gelu podle vynálezu není níže popsaným postupem nikterak omezen.

Nejprve se vyrobí znna totálně pórovitého polymeru majícího trojrozměrnou zesítěnou skladbu tím, že se směs zahrnující vinylkarboxylátový monomer, sílující monomer a iniciátor polymerace, podrobí suspenzní polymeraci ve vodě. Jako vhodný sílující monomer je . možno uvést například deriváty triazinu, jako jsou již zmíněný triallyliso-kyanurát a triallyltyanurát, diakryláty nebo dimetakryláty, jako je etylenglykoldimetakrylát a dletylenglykoldimetakrylát, póly vinyl Aery, jako je butandioldlvinyle'ter, dietylenglykoldivinyleter a tetravinylglyoxal, a polyallyl/tery, jako je diallylidenpentaerythritol a tetraallyloxyetan· Je možno jich použít samotných nebo ve vzájemné směsi·

Z výěe uvedených monomerů je obzvláště výhodný triallylisokyemirát*

Vinylkarboxylátový monomer, kterého se má použít při způsobu podle vynálezu by měl obsahovat alespoň jednu vinylkarboxylátovou skupinu. Jakožto vhodný vinylkarboxylátový monomer je možno uvést například vinylacetát, vinylpropionát, diviny*. adipát a jiné vinylové karboxyláty obsahující 4 až 10 atomů uhlíku. Je možno jich použít samotných nebo ve vzájemné směsi.

Kromě výše uvedeného sílujíčího monomeru a vinylkarboxylátového /monomeru je možno přidat к vytvoření gelové matrice podle vynálezu jakýkoliv kopolymerovatelný monomer, který nemá nepříznivý vliv na fyzikální vlastnosti výsledného aktivovaného gelu podle vynálezu, jako je .«apříklad dietylenglykoletylvinylóter.

Způsob polymerace není rozhodující a gelovou matrici к vytvoření aktivovaného gelu podle vynálezu je možno vyrobit jakoukoliv z obvyklých metod, včetně polymerace v roztoku suspenzní polymerace a emulzní polymerace. Výhodnou polymeraci je.však suspenzní polymerace, protože je vhodná pro vytvoření kulových zrn. Při suspenzní palymeraci se kopolymerovatelný monomer, například vlnylkarboxylát, a sílující monomer míchají к vytvoření malých Částic v přítomnosti rozpouštědla, v němž jsou tyto monomery rozpustné a které není téměř rozpustné ve vodě, a kopolymerační reakce se provádí zahříváním. Výsledný kopolymer má trvalé póry. Jako vhodné rozpouštědlo, v kterém se monomery rozpouštějí a kterého lze použít při způsobu podle vynálezu, přičemž není téměř rozpustné ve vodě/ je možno uvést například aromatické uhlovodíky, jako je toluen a xylen., alifatické uhlovodíky, jako je heptan a oktan, estery jako jo etylacetát, n-butylacétát a n-hoxylacetát, stery, jako je dibutyle'ter, metyl i sobutyl keton a n-heptanol. Je výhodné, když se použije 20 až 300 hmotnostních dílů takovéhoto rozpouštědla na 100 hmotnostních dílů obsažených mdnomerů.

r

Pro regulování velikosti jemných pórů a rozložení velikosti jemných pórů je možno použít lineárního polymeru, jako je polyvinylacetát nebo pod·, v kombinaci s výše uvedeným rozpouštědlem. Takovéhoto lineárního poiýmeru je možno použít v množství nanejvýš 10 hmotnostních dílů na 100 hmotnostních dílů použitých monomerů. Společné použití výěe uvedeného rozpouštědla a lineárního polymeru usnadňuje tvorbu gelu majících větší průměr pórů. Příklady iniciátorů polymerace, použitého při způsobu podle vynálezu, zahrnují .ty iniciátory, jež se obvykle používají, tj. 2,2'-azobisieobutylonitrii a benzoylperoxid·

Při provádění polymerасе v suspenzi je výhodná, když se do vodné fáze přidá obvyklý stabilizátor suspenze organického polymeru. Dále je podle potřeby možno přidat do vodné fáze pufr, například fosforečnan sodný. Velikost zrn kopolymerů je možno měnit změnou druhu a množ8tví stabilizátoru suspenze, změnou rychlosti míchání a jiných reakčních podmínek při polymerací.

Zrnitý kopolymer, získaný výše popsanou polymerací v suspenzi, se pak podrobí transesterifikační a/nebo zmýdelňovací reakci. Touto transesterifikační a/nebo zmýdelnovací reakcí se esterová skupina vinylkarboxylátové monomerní jednotky, obsažené v коpolymeru, přemění v hydroxylovou skupinu. Zmýdelňovací a/nebo tr^seatsrifikační reakce se provádí к získání matrice, mající koncentraci vinylalkoholmonomerní jednotky (<10^) alespoň 5,0 molů . kg\ nepřesahující však hodnotu danou vztahem

000 (1 - X₂) < 39 X₂ kde

X₂ má výše uvedený význam a hodnotu v rozmezí nerovnosti 0,1 ^Х₂^0,4.

Stupeň přeměny esterových skupin v hydroxylové skupiny tak, aby koncentrace (ςθ_Η) vinylalkoholové monomerní jednotky mohla být v uvedeném výhodném rozmezí, je možno ovládat tím, že se předem určí vliv reakčních podmínek, například rozpouštědla, teploty a doby průběhu reakce, na přeměnu a že se reakční podmínky udržují v předem určeném rozmezí při provádění zmýdelňovací nebo/a transesterifikační reakce.

Při způsobu podle vynálezu je možno zmýdelňovací a/nebo transesterifikační reakci provádět v rozpouštědle, jako je voda, etanol, jejich ^něs apod., obsahujícím kyselinu nebo¹ alkalii jakožto katalyzátor, při teplotách v rozmezí od 5 do 55 °C, s výhodou od 10 do 50 °C, zejména pak od 15 do 45 °C. Výsledná gelová matrice se může dodatečně po proběhnutí zmýdelňovací a/nebo transesterifikační reakce vytvrdit sírujícím činidlem, jako je epichlorhydrin, butandiolglycidyléter nebo pod·

Poté se gelová matrice, obsahující hydroxylové skupiny jako následek výše popsané zmýdelňovací á/nebo transesterifikační reakce, nechá reagovat s aktivačním Činidlem za účelem navázání reaktivní skupiny na gelovou matrici, čímž se získá aktivovaný gel. Reaktivní skupina se váže na gelovou matrici kovalentní vazbou a atomem kyslíku hydroxylové skupiny, obsažené v gelové matrici.

Jako vhodné aktivační činidlo, použité při způsobu podle vynálezu, je možno uvést například halogenkyanid, bis-epoxidy se 4 až 10 atomy uhlíku, epichlorhydrin, halogentriaziny, bromacetylbromid, etylester kyseliny chlormraveněí a 1,1'-karbonyldiimidazol.

Při výhodném, výše popsaném provedení aktivační reakce při způsobu podle vynálezu se používá jako aktivačního činidla-bromkyanu. Za míchání se ve vodě suspenduje příslušné množství gelové matrice. Pak se к suspenzi přidá vodný roztok bromkyanu, přičemž se pH suspenze upraví na hodnotu 11 až 12 přidáním vodného hydroxidu sodného za míchání. Po skončení reakce se produkt zfiltruje přes skleněný filtr a promyje vodou, čímž se získá aktivovaný gel, mající skupiny kyanátového esteru nebo imidokerbonátové skupiny vázané na gelovou matrici. Prakticky stejným postupem se gelová matrice uvede ve styk s bisepoxidem nebo epichlorhydrinem v alkalických podmínkách, čímž se získá aktivovaný gel mající jako reaktivní skupiny epoxidové skupiny. Rovněž aktivační reakce, při níž se používá halogentriazinu, se provádí uvedením gelové matrice ve styk s aktivačním činidlem v alkalickém prostředí.

Takto získaný aktivovaný gel vyrobený způsobem podle vynálezu může na sebe vázat organickou látku mající reaktivní skupinu, jako je azoinoskupina, karboxylová skupina, hydroxylová skupina, thiolová skupina nebo pod·, tím, Že se tato organická látka uvede ve styk s aktivovaným gelem v pufru· Toto vázání takovéto organické látky na aktivovaný gel by se mělo provádět za takových podmínek, které nezpůsobí zničení biologické afinity organické látky.

Toto vázání se zpravidla provádí za teploty nanejvýš 100 °C při pH v rozmezí 3 až 13« Optimální podmínky při této reakci se výhodně volí podle druhu organické látky, která se má na gel vázat. Příklady zmíněné organické látky jsou antigeny, ochranná tělíska v krvi, enzymy, aminokyseliny* oligopeptidy, polypeptidy a nukleové kyseliny. Výrazem organická látka, jak se jej zde používá, se rozumí nejen jednotlivá organické látka, ale též směsi organických látek. Aktivovaného gelu, vyrobeného způsobem podle vynálezu a majícího na sobě navázanou takovouto organickou látku, se používá к oddělení nebo odstranění jiné látky, mající biologickou afinitu к vázané organické látce, tím, že se uvedou ve styk.

Gelová matrice aktivovaného gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu je zčásti charakterizována velni nízkou nespecifickou adaorpcí biolátek na matrici. Proto, když se aktivovaného gelu podle vynálezu s na něj vázanou látkou, mající biologickou afinitu, použije к oddělení nebo odstranění jiné látky, mající biologickou afinitu к vázané organické látce, ze směsi, obsahující uvedenou jinou látku, tím, že se uvedou ve styk, je nožné specificky oddělit nebo odstranit uvedenou jinou látku, která se má oddělit nebo odstranit.

Je proto aktivovaného gelu možno využít jako vhodného plnicího materiálu pro afinitní chromatografii· Nadto, aktivovaný gel vyrobený způsobem podle vynálezu obsahuje reaktivní skupiny ve vysoké koncetraci, takže na gel je možno vázat zvýšené množství látky, mající biologickou afinitu.

Aktivovaný gel vyrobený způsobem podle vynálezu je schopen si uchovat svou původní nechanickou pevnost a pórovitou skladbu, aniž by byl ovlivněn rozpouštědlem, modifikačním činidlem, hodnotou pH a teplotou, používanými při vázání biolátky na reaktivní skupinu gelové matrice, nebo při uvádění směsi obsahující biolátku do styku s vázanou biolétkou, aby tím doělo к připoutání látky, mající biologickou afinitu к vázané biolátce, na vázanou biolátku, přičemž ostatní biolátky, nemající biologickou afinitu к vázané biolátce, mohou volně odtékat, nebo při eluování biolátky, připoutané к vázané biolátce následkem afinity mezi nimi.

Aktivovaný gel vyrobený způsobem podle vynálezu je totálně pórovitý, takže látky, které se mají oddělit nebo odstranit, mohou být dostatečně rozptýleny v gelové matrici. Gel podle vynálezu proto skýtá velký povrch pro styk s látkami, čímž umožňuje výrazné zlepšení oddělovací schopnosti.

Aktivovaný gel vyrobený způsobem podle vynálezu má dostatečně vysokou mechanickou pevnost, takže nedochází к jeho poškození během aktivování gelu, tj. během vpravování reaktivních skupin do gelové matrice a během vázání biolátky na vpravené reaktivní skupiny.

Aktivovaným gelem vyrobertfm způsobem podle vynálezu, na nějž je vázána látka mající biologickou afinitu, se často plní kolona, v níž se jej používá pro oddělení nebo odstranění jiné látky, mající biologickou afinitu к vázané látce. Tento gel je dostatečně pevný, takže kapalina obsahující látku, která se má oddělit nebo odstranit může procházet kolonou pod tlakem pouze o málo vyšším než je atmosférický tlak. Proto tento aktivovaný gel umožňuje dosažení mnohem většího dělicího výkonu než běžný agarózový gel nebo polotuhý .jj’ polyvinylový gel mající primární hydroxylové skupiny.

Aktivovaný gel vyrobený způsobem podle vynálezu se vhodně používá k odstraňování specifických humooráních látek. Například je možno jej vhodně použít pro léčbu zahrnující mimootlní perfúzi, při níž se krev, vedená v mimooělním okruhu, uvádí ve styk s látkou, která se vyznačuje biologickou afinitou k látce obsažené v krvi, která' se má z krve odstranit a která se váže na reaktivní skupiny aktivovaného gelu, jímž je kolona naplněna.

Byly již konány pokusy s aplikováním шímoOtěLa;í perfúzní metody pro léčení autoimunních chorob apod. Avšak všechny takové pokusy vedly pouze k neuspokojivá výsledkům, protože nebyl k dispozici vhodný oaaterál, na nějž by se vázaly látky mající biologickou afinitu. Je naprosto nutné, aby jakýkoliv oattrrál, používaný pro perfúzi, mohl být podroben sterilizaci a aby tímto memoriálem moUa proudit kapalina vysokou rychloosí, aniž by způsobovala nežádoucí vzrůst tlaku. Byly provedeny pokusy s agarďzovými gely (například Sephaao se ”, vyráběiým fimiou Fine Chemicaas, lne., Švédsko) aktivovanými bromkyanem jakožto mate lály pro pouHtí k mimootění perfúzi.

Sterilizace vymazovacím sušením však nelze snadno pouuít u agarózových gelů. Rovněž nelze agarózové gely podrobit sterilizaci ozářením'ani teplem, jak již bylo výše uvedeno. Nadto jsou agarózové .gely měkké, takže krev jimi nemůže prouddt vysokou rychlostí, proto nejsou agarózové gely vhodné pro pooHtí k léčení, při němž se aplikuje mimooělní perfúze. Obdobně nelze vhodně použít obvyklých polotuhých polyvinylových gelů, majících primární hydroxylové skupiny pro léčení, při němž se aplikuje mimootTní perfúze, protože krev jimi nemůže prouddt vysokou rychlostí, aniž by došlo k nevhodnému zvýšení tlaku.

Aktivovaný gel vyrobený způsobem podle vynálezu se může podrobbt sterilizaci vyhlazovacím sušením, ozářením a teplem. Je pevný, takže krev jím prouddt může vysokou rychlostí“, aniž by došlo k nevhodnému zvýšení tlaku. Je třeba poznarnoeat, že aktivovaný gel vyrobený způsobem po^e vynálezu velice přispěje k pokroku při léčení aplikujícím mimootlní perfúzi, vzhledem k výše popsarým výhodám.

VynéáLez bude v nikterak neo^eez^uJí.

dalším blíže objasněn dále uvedenými příklady, které však jeho rozsah

Příklad 1

Do dvoulitrové baňky s kulovým dnem a třemi hrdly se vnese homogenní kapalná směs, sestávají ze 100 g vinylacetátu, 24,1 g triallyliзkkannwpálu(hoSaltt poměru sírujících jednotek: 0,20), 124 g etylacetátu, 124 g heptanu, 3,1 g polyvinylacetátu o polymoračním stupni 500 a 3,1 g 2,2-azoOiisisobbltУroattill, jakož i 400 ml vody, v níž jsou rozpuštěny polyvinylalkohol v hodnostním mnnožsví 1 %, dihydrát SihySro:fosforeδnanu sodného v hmoonostním oinoství 0,05 % a dodekebydrát hydrofosforečnanu dvojsodného v hmotnostním mnnožsví 1,5 %, a vzniklá směs se důkladně míchá.

Pak se směs za míchání zaJhřívá 18 hodin při teplotě 65 °C a 5 hodin při teplotě °C, přičemž probíhá suspenzní polymorace, čímž se získá zrnitý kopolymor. Takto vzniklý kopolymer se oddiltruje a promyje nejprve vodou a pak acetonem, takže se z něho odstraní nezreagované monomery a organické rozpouštědlo. ,

Zrnitý polymer se přidá k roztoku, sestávajícímu ze 2 litrů motanolu a 46,5 g hydroxidu sodného a směs se zahřívá 18 hodin při teplotě 40 °C, přičemž probíhá na kopolymeru ‘traasesteгifiktčaí reakce. Vznnklá zrna maaí střední průměr 150 ynm. Kooneenrace (qq_H) vⁱayltlkoho^lové monornmení je^sao^tky^, s^ttaovea^á vý^še podanou motedí)^ ^činí ¹3 molů.kg“' .

Hodnnta ^Wg zístondho gel^ s^tanoven^á vý^še ^po^psanou otocho^ činí ^4,4 k^g.^kg*'· Specifický povrch gelu v such^é^m stavu, stanovený metodou BET za pouHtí plynného dusíku, je ¹⁰ χ W³ m².kg”¹. _v

Takto získaným gelem se naplní kolona z nerezavějící oceli o vnitřním průměru

7.5 mm a o délce 25 cm. Touto kolonou se pak nechají procházet vodné roztoky různých dextranů o odlišných molekulových hmotnostech a různé polyetylenglykoly o odlišných molekulových hmotnostech, načež se provede eluce vodou jakožto elučním činidlem.

Zjistí se, že jak dextrany, tak polyetylenglykoly vytékají z kolony v pořadí molekulových hmotností, tj. od vyšších molekulových hmotností к nižším molekulovým hmotnostem· Vylučovací mez molekulové hmotnosti (Mlim), stanovená výše popsanou metodou, s dextranem jakožto standardem (v dalším označovaná jako dextran-Mlim) je přibližně 3 x 10⁵. Při stanovení hodnoty dextran-Mlim se použije přístrojů Hitachi Model 635A (obchodní označení přístroje, sestávajícího z lnjektoru vzorku a čerpadla a vyráběného firmou Hitachi Ltd., Japonsko) a Shodex RI Model SE-11 (obchodní označení detektoru vyráběného firmou Showadenko К. K., Japonsko).

Postupně se touto plněnou kolonou nechají při teplotě 20 °C procházet tři vodné roztoky, tj. (1) obsahující ^-globulin v hmotnostním množství 1 %, chlorid sodný v hmotnostním množství 3 x Ю² molů.m⁶ a fosforečnan sodný v hmotnostním množství —3 x 10 molů.m ^J (2) vodný roztok obsahující albumin hovězího séra v hmotnostním množ- —3 ství 1 %, chlorid sodný v hmotnostím množství 3x10 molů.m a fosforečnan sodný v hmotnostním množství 1 x 10² molů.m^ a (3) vodný roztok obsahující vaječný albumin v hmo.tnostním množství 1 %, chlorid sodný v hmotnostním množství 3 x 10 molů.m ^J a fosforečnan sodný v hmotnostním množství 1 x 10² molů.m“^.

3

Po každém průchodu roztoku se provede eluce za použití vodného roztoku 3 x 10 molu.m’^3J 2 -3 chloridu sodného a 1 x 10 molů.m ^J fosforečnanu sodného jakožto elučního Činidla. Vzorky vytékající z kolony se analyzují za použití přístroje Hitachi Multi Wave Lenghth UV Monitor (obchodní označení přístroje vyráběného firmou Hitachi Ltd., Japonsko) pro stanovení vratných množství ^-globulinu, albuminu hovězího séra a vaječného albuminu. Vratné množství každé z těchto biolátek je téměř 100 % a nespecifická adsorpce biolátek na gel jo velice malá. Všechny výše uvedené vzorky procházejí plněnou kolonou rychlostí 1 ml.min¹.

ml gelu po zmýdelnění se po důkladném promytí vodou disperguje ve 200 ml vody, přidají se 3 g bromkyanu a vzniklá směs se míchá. Přidáním vodného 2 N roztoku hydroxidu sodného se pH směsi udržuje v rozmezí 10 až 11 a reakce se nechá probíhat po dobu 8 minut. Po skončení reakce ee produkt rychle odfiltruje přes skleněný filtr, načež se promyje litry vody, Čímž se získá aktivovaný gel· Koncentrace reaktivníbh skupin aktivovaného gelu, měřená metodou Wilcheka a spol. (viz J. Kohn, M. Wilchek, Biochem. Biophys., Res. Commun·, ^4. atr. 7 (1978)), je 2 moly.kg¹ aktivovaného gelu v suchém stavu·

Příklad 2

Homogenní kapalná směs, sestávající ze 100 g vinylaeetátu, 32,3 g triallylisokyanurátu (hodnota poměru sírujících jednotek : 0,25), 100 g etylacetátu, 100 g n-heptanolu,

6.6 g póly(vinylaeetátu) o polymerečním stupni 500 a 3,3 a 2,2'-azobis-isobutyronitrilu, ae polymeruje v suspenzi postupem, popsaný· v příkladu 1· Získaná zrna se podrobí tranaeaterifikační reakcí týmž postupem, jak je popsán v příkladu 1, s tou výjimkou, že se reakce provádí v roztoku sestávajícím z 2,1 litru metanolu a 46,5 g hydroxidu sodného. Střední velikost zrn získaného gelu je 100^um, jeho hodnota je 12 molu.kg¹, hodnota W_R je 3,4 kg·kg¹ a specifický povrch v suchém stavu je 2 x 10⁴ a².kg”’.

Stejným způsobem jako v příkladu I se získaným gelem naplní kolona. Pak se kolonou nechají procházet vodné roztoky růsných dextranů lišících se molekulovou hmotností a různých polyetylenglykolů lišících se molekulovou hmotností. Jak dextrany, tak polyetylenglykoly vytékají z kolony v pořadí molekulových hmotností, tj· počínaje vyšší molekulovou hmotností к nižší molekulové hmotnosti* Hodnota dextran-Mlim činí přibližně 7 x 1θ\

Stejrým postupem, jak je popsán v příkladu 1, se nechají toutéž plněnou kolonou, jak je výše uvedena, procházet tři typy vodných roztoků, tj. vodný roztok obssjujjcí -globu Лс, vodný roztok obsa^^jcí albumin hovězího séra a vodný roztok tb8sjujíeí vaječný albumin. Vratná mnoství '/--globulinu, albuminu hovězího séra a vaječného albuminu jsou téměř 100% a nespseiifická adsorpee biolátek na gelu je velice nalá.

Gel je aktivován týmž způsobem jako v příkladu 1. Konnennrace neaktivních skupen získaného aktivovaného gelu, měřená týmž postupem jako v příkladu 1, činí 1,5 moou.kg aktivovaného gelu v suchém stavu.

Příklad 3

Když se 50 ml gelu po transeestrifikaci psané v příkladu . 2, důkladně promrje vodou, přidá se k němu roztok, sessáávjící z 50 ml 1,4-butjnCio0diglycidyléeeru, 100 mg natriímb^jrh^í^ridu a 50 ml 0 ,6 U vodného roztoku hydroxidu sodného. Výsledná směs se třepe při teplotě místnost po dobu 8 hodin, přičemž probíhá reakce. Pak se vzniklý produkt odfiltruje přes skleněný filtr a důkladně promyje vodou, čímž se získá aktivovaný gel. Koncentrace reak^v^^ skupin a^ivovanéto ^gelu, stanoven^á metodou ^undberyto a spol. ^fviz ^J. Chromatogr., 9^^0, str. ⁸⁷ (¹⁹^4^)J^, Činí 0,9 mo^ou.kg“' oživovaného ^gelu v suctám stavu.

Příklad 4

Když se 50 ml gelu po transesseerfikaci popsané v příkladu 2, důkladně promyje vodou, vnese se získaný gel do baňky. Pak se do baňky po sobě přidá 75 ml vody, 32,5 g 2 M vodného roztoku hydroxidu sodného a 7,5 ml epicUlorUydrinu. Výsledná kapalná směs se tfepe ^{2 h}odin^y při ^plotě 4⁰ °C. ^pa^k vznižý produkt od^Žruje přes stí-en^ný ^filtr a promyje důkladně vodou, čímž se získá aktivovaný gel. KonccnCrjce reaktivních skupin jživovan^o ^gel^u s^eantvec^{á t}ým^ž požupem jako v příHLadu 3 ^činí ^0,5 mol.u·^¹ aktivovaného gelu v suchém stavu.

Přík lad ml aktivovaného gelu získaného v příkladu 2 se promyj* 500 ml vodného 0,1 M roztoku UydrogrnnUUičitjnu sodného. 150 ml vodného 0,1 M roztoku Uydгo^gennUUlčitjCu sodného, obes^uícího rozpuštěných 5 g UydrtchUtrίdu L-argininu, se upraví přídavkem vodného roztoku hydroxidu sodného na pH 9,5. Vzniklý roztok se přidá k aktivovanému gelu. Pak - sé gel ^tř^^^pe 16 todin ^při ^plo^ ²⁵ °C. Získaný produkt se zfiltruje ^přes skleně^ fltir. Takto získaný adsor.bent se promývá střídavě vodou a 200 ml vodného - 1 M roztoku chloridu sodného. : . ;

Stanovení minžssví vázaného L-argini^nu se provede metodou, která ' zahrnuje, tyto - stupně: nejprve se ‘ke ka^ppaině, získané po výše zmíněné fiirraci, přidá 8-UydrtmychUnctic - á N-bromsukcinimid k vytvoření zbarvený pak se měří absorbance,kapaliny,' získané-po.'výše:' zmCněné filtraci, při 500 nm, čímž se získá koncentrace v ' ní obsaženého - L-argininu, přičemž se poouije výše zmíněného roztoku L-orgin^u ve vodném 0,1 - M - roztoku - UydrotUUiči- ' .

tanu sodného jako referenčního roztoku, načež se vypočte - mnctiSví ' příto^ého v kapaLině, získané po výše zmíněné filtraci, na základě takto zjištěné - koncentrace? Ь-огг^^^ a konečně se odečte zjištěné mn^^ví L-argininu přítomn^ého ,-v' kapalině - , získané po výěe zmíněné fiirraci, od micožsví vneseného L-argininu .

Tímto způsobem se zjistí, že se Ь-отг^^ navázal' nj - aktivovaný - gól - v * oicožsví ^1,40 moJ-u.te“¹ j^ktivovacé^uo gelu. . . .

Výše získaný gel se vnese do kolony z cerezajVtící occei o - vnitřním průměru 7,5 mm - a o délce 25 cm, čímž se vytvootílože gelu o délce 25 cm, a kolonou se pak při teplotě ²⁰ °^C ne^á procházet vodný rtz^to^c obes^uící pxufrové^- soM.

••2 —1

Bostok může procMset kolonou při tisku cejvýé*O^,5 № rycdootí UO al.c· .h .

Tato plněná kolona s· vysuší vymezováním za sníženého tlaku, načež se vloží do sterílizační nádoby. Do táto nádoby aa vnutí plynná soěs sestávající z 35 % etyTenoxidu a 65 % oxidu uth.ičitého· Pak ' os sterilizační nádoba zahřívá na teplotu 40 °C po dobu 5 hodin, načež se plynná saěs v nádobě nataražuje po dobu 1 hodiny vzduchem, čímž se získá gelem plněná kolona, která je sterilioována a vysušena. Sterilioovaný vysušený gel v koloně může nabotnst do té míry, že objem nabotnaláho gelu je téměř shodný s objemem, který gel zaujímal před sušením vyhrazováním.

Příklad 6

Hoaogeerní kapalná směs, sestávající ze 100 g vicylacetátu, 52 g triaiyyieooyyacurátu (hodnota poměru síťujících jednotek : 0,35), 100 g etyTacetátu, 100 g heptanu, 7,5 g polyvijylacetátu o polymeračním otupni 500 a 3,8 g 2,2'-aiobieieobujyrrlCitrlu, se polymeruje v suspenzi týmž způsobem jak;uvedeno v příkladu 1, s tou výjimkou, že se přidá 500 ml vody, obsíOhijící rozpuštěný polyvijylalOohol v hmotnostním imnossví 1 %, dihydrát dihydrogecfosforečnacu sodného v hmotnostním minoství 0,05 % a dodekahydrát hydrogoKtfosforečcanu dvojsodného v hmotnostním zmcožsví 1,5 %, msto 400 ml vody, oЪsahhjící rozpuštěný polyvlcylaTkohol v hmotnostním micožsví 1 %, dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného v hmotnostním mdžtví 0,05 % a dodekatydrát hydroleirfosforečnanu dvojsodného v hmotnostním mnnožtví 1,5*.

Získaná zrna se podrobí transesterifiOmoi týmž postupem jako v příkladu 1, vyjma toho, že se reakce provádí v roztoku sestávajícím ze 2,4 Utru mtwcolu a 46,5 g hydroxidu sodného.

^Zrna vzcití-Mo ^ge^Tu mojí střední ^pr^ůoěr 3⁰⁰ ^uo, hodnotu '' ^9,0 oooů.kg¹ , hodno^tu ' ^4,0 kS·⁰^*¹ a s^peci^fic0ý ^povrc^h 6 x 1⁰* m².kg v sucMm s^tavu. ^Hodncta dex^an-Mlim získ6C^ého gelu činí ^přibli^žně ⁶ x 1⁰\ .

Tento gel se aktivuje ' brookyanem stejrýo postupem jak uvedeno v příkladu 1. Kncentrace reaktivních skupin vzniklého aktivovaného gelu, měřená týmž postupem jako v příkladu 1, ^čicí ^0,5 m^ol^.kg¹ a^ivovan^o ^ge^lu v suc^m s^tavu.

H^íkli^d 7

Hornogeerní soOě, sestávající z 90 g divicyladipátu, 30 g triaiyyisooyyacurátu (hodnota poměru síťujících jednotek : 0,29), 200 g etylacetátu a 3,0 g 2,2'-azeb.siaob^t^ty^r^onit^l^ilu, se polymeruje v suspenzi postupem, popsaným v příkladu 1. Vzniklá zrna se podrobí traceeterifl.Oaci týmž postupem, jak je popsán v příkladu 1.

Slední prtoěr zrn vzcikl^o ^gelu je ¹5⁰ ', todnota ςθ_Η ^činí ¹⁰ molů.^“¹ todcota Vr je 4,0 kg«0g¹ a specifický povrch činí 4 x 10⁴ m².kg“^! v suchém stavu. Hotaota dextrac-M.im vzniklého ^gelu činí přibyté 3⁰ x Ю⁵.

Stejrýo postupem jako v příkladu 1' se kolonou naplněnou tímto gelem nechají procházet tři vodné roztoky, tj. vodný roztok obsah^ící Ύ-gTobulic, vodný roztok obsaalbumin hovězího séra a vodný roztok obsahhuící vaječný albumin. Vratné mlc0ství každé z těchto biolátek je téměř 100* a cespeeificOá adsorpce biolátek na gelu je velmi , nízká.

Stejným postupem jako v příkladu 1 se gel aktivuje brom-vOyaceo. Koncentrace reaktivních skupin získaného aktivovaného gelu,,měřená týmž způsobem jako v příkladu 1, ^činí ⁰,8 moyu.kg¹ aktivovaného gel.u v such^éo s^tavu.

Příklad 8

Homogenní kapalné směs, sestávající ze 100 g vinylaeetátu, 39,4 g dietylenglykoldivinyléteru (hodnota poměru sírujících jednotek : 0,3), 100 g etylacetátu a 3,5 g 2,2-^-azobis-isobutyronitrilu, se polymeruje v suspenzi týmž postupem, jak je popsán v příkladu 1. Vzniklá zrna se podrobí transesterifikaci stejným postupem jako v příkladu 1. Střední průměr zrn získaného gelu je ЗООДпп, hodnota činí 10,0 molů.kg¹ , hodnota W_R činí 2,0 kg.kg“¹ a specifický povrch je 4 x 10^ m².kg v suchém stavu. Hodnota dextran-Mlim gelu činí přibližně 10 x 1θ\

Kolonou, plněnou uvedeným gelem, se nechají stejným postupem jako v příkladu 1, procházet tři vodné roztoky, totiž vodný roztok obsahující -globulin, vodný roztok obsahující albumin hovězího séra a vodný roztok obsahující vaječný albumin. Vratné množství každé z těchto biolátek je téměř 100% a nespecifická adsorpce biolátek na gelu je velmi nízká.

Stejným postupem jako v příkladu 1 se gel aktivuje bromkyanem. Koncentrace reaktivních skupin vzniklého aktivovaného gelu, měřená týmž způsobem jako v příkladu 1, Činí 0,7 molu.kg¹ aktivovaného gelu v suchém stavu.

Srovnávací příklad 1 ml Sepharosy CL-4B (obchodní označení agarózy vyráběné firmou Pharmacia Fine Chemicals, lne., švédsko) se aktivuje týmž postupem jak uvedeno v příkladu 1. Vzniklý aktivovaný gel se nechá reagovat s hydrochloridem L-argininu týmž postupem, jak je popsán v příkladu 5, čímž se získá gel s vázaným L-argininem. Podle zjištění se L-arginin váže na gel v množství 1,00 molu.kg¹ gelu. Stejným postupem jako v příkladu 5,se kolona, plněná gelem s vázaným L-argininem vysuší vymrazováním za sníženého tlaku, načež se sterilizuje. Sterilizovaný vysušený gel v koloně se nechá nabotnat pouze do té míry, že objem nabotnalého gelu činí 30 % objemu, který má gel před sušením vymrazováním.

Srovnávací příklad 2

Homogenní kapalná směs, sestávající ze 100 g vinylaeetátu, 5,1 g triallylisokyanurátu (hodnota poměru sítujících jednotek : 0,05), 150 g etylacetátu, 150 g heptanu a 3,1 g 2,2'-azobisisobutyronitrilu, se polymeruje v suspenzi stejným postupem jako v příkladu 1. Vzniklá zrna se podrobí reakci a záměně esterového zbytku stejným postupem jako v příkladu 1. Střední průměr zrn získaného gelu je 100^um, hodnota je 19 molů.kg¹ hodnota W_R je 5,0 kg.kg¹ a specifický povrch je 2 x 10^ m².kg¹ v suchém stavu.

Obdobným postupem jako v příkladu 1 se gel naplní do kolon. Za týchž podmínek jako v příkladu 1 se učiní pokus, nechat projít vodné roztoky různých dextranů, lišících se molekulovou hmotností, a různých polyetylenglykolů, liSících se molekulovou hmotností, dále vodný roztok obsahující ^globulin, vodný roztok obsahující albumin hovězího séra a vodný roztok obsahující vaječný albumin, kolonou. Avšak tlaková ztráta v plněné vrstvě je tak velká, že nelze provést stanovení hodnoty dextran-Mlim ani vratných množství biolátek.

Příklad 9

Homogenní kapalná směs, sestávající ze 100 g vinylaeetátu, 41 g triallylisokyanurátu (hodnota poměru sírujících jednotek : 0,30), 70 g etylacetátu, 70 g oktanu, 7 g polyvinylacetátu o polymeračním stupni 500 a 3,5 g 2,2'-azobisisobutyronitrilu, se polymeruje v suspenzi týmž postupem, jak uvedeno v příkladu 1. Vzniklá zrna se podrobí transesterifikaci týmž postupem jako v příkladu 1. Střední průměr zrn vzniklého gelu je 70 zim, hodnota je7 molů.kg”¹ hodnota W_R Je 3,0 kg.kg”¹ a specifický povrch je 4,5.щ .kg¹ v suchém stavu. Hodnota dextran-Mlim je přibližně 3 x 10^.

Gel ae aktivujj za použití epichlorhydrinu stejným postupem jako v příkladu 4.

Koncentrace reaktivních skupin aktivovaného gelu, měřená metodou Sundberyho a spol., popsanou v příkladv. 3, činí 0,5 molu.kg¹ aktivovaného gelu v suchém stavu.

Aktivovaný gel se disperguje ve vodě jakožto disperzním prostředí a pak vnese do kolony o průměru 10 mm, opatřené skleněným filtrem a dole umístěným výpustním kohoutem.

Před vnesením gelu do kolony je výpustní kohout uzavřen. Po vnesení gelu do kolony se výpustní kohout otevře a voda, použitá jako disperzní prostředí, se nechá působením tíže odtéci, takže se gel usadí v koloně. Výška vytvořeného lože gelu je 5 cm. Pak se na vršek kolony napojí trubice vedoucí od peristaltického čerpadla a trubicí se do kolony nechá proudit čiatá voda. Na obr. 1 je znázorněn vztah mezi průtokovou rychlostí (v mlámin¹.) čisté vody a tlakovým rozdílem (v Pa) mezi vstupem do kolony a výstupem z kolony. Na obr. 2 je znázorněn vztah.mezi objemem gelu plněného do kolony a tlakovým rozdílem (v Pa) mezi vstupem do kolony a výstupem z kolony.

Vztahy, získané za použití gelů vyrobených způsobem podle vynálezu, jsou na obr? 1 a 2 znázorněny čarou označenou A. Na obr. 2 je objem gelu podle vynálezu v koloně vyjádřen poměrnou hodnotou, vztaženou na velikost objemu (100) gelového lože vytvořeného samovolným výtokem vody použité jako disperzní prostředí·

Pro porovnání se kolona výše popsaným postupem naplní aktivovaným gelem, připraveným aktivováním polotuhého polyvinylového gelu TOYOPEARL (obchodní označení gelu vyráběného firmou Toyosoda Manufacturing Co., Ltd., Japonsko), majícího průměr zrn v rozmezí od 50 do 100 um a primární hydroxylové skupiny, epichlorhydrinem týmž postupem, jak je popsán v příkladu 4. Zjišťuje se vztah mezi průtokovou rychlostí čisté vody a rozdílem tlaků na vstupu do kolony a výstupu z kolony a vztah mezi relativním objemem gelu naplněného do kolony a rozdílem tlaků na vstupu do kolony a výstupu z kolony.

Výsledky jeou znázorněny čarami Bna obr. 1 a 2. Dále se kolona výše popsaným postupem naplní agarózovým gelem aktivovaným epoxyskupinani, majícím průměr zrn y rozmezí od 60 do 120^um (s obchodním označením Epoxy^activated Sepharose 6B, který vyrábí firma Pharmacia Fine Chemicale, lne., Švédsko) a zjišluje se vztah mezi průtokovou rychlostí čisté vody a rozdílem tlaků na vstupu do kolony a výstupu z kolony jakož i vztah mezi relativním objemem gelu naplněného do kolony a rozdílem tlaku na v o tup u do kolony a výstupu z kolony·

Výsledky jsou znázorněny čarami C na obr. 1 a 2. U gelu, připraveného aktivováním polotuhého polyvinylového gelu TOYOPEARL epichlorhydrinem, je objem gelového lože vyjádřen relativní hodnotou, vztaženou na velikost objemu (100) gelového lože vytvořeného samovolným výtokem vody použité jako disperzní prostředí. U gelu Sepharose“ je objem gelového lože vyjádřen relativní hodnotou, vztaženou na velikost objemu (100) gelového lože, vytvořeného samovolnou sedimentací při uzavřeném výstupním kohoutu.

Z obr. 1 a 2 je zřejmé, že gel vyrobený způsobem podle vynálezu je velmi pevný v porovnání s běžně dostupnými gely a v případě, kdy se použije gelu vyrobeného způsobem podle vynálezu, může kapalina kolonou procházet vysokou rychlostí za nízkého tlaku oproti případům, kdy se použije běžně dostupných gelů.

Příklad 10

100 ml zrnitého pórovitého kopolymerů (střední průměr zrna 150 yum, 13 molů.kg¹, W_R 4,4 kg.kg*¹ specifický povrch 1 x ΙΟ⁴ a² •kg¹), jak se získá postupem podle příkladu 1, se důkladné promyje destilovanou vodou a suspenduje ve 100 ml destilované vody. Ke vzniklé suspenzi se za míchání mechanickým míchadlem přikape vodný 4 N roztok hydroxidu sodného к úpravě pH suspenze na 11,0 až 11,5·

Pak se k suspenzi přidá 10 g práškového bromkyanu/pH suspenze se udržuje v rozmezí 11,0 až 11,5 přikapáváním vodného 4 N roztoku hydroxidu sodného a reakce se nechá probíhat po dobu 8 mr^n^t,, čímž se získá aktivovaný gel.

Po skončení reakce se směs rychle zfiltruje přes skleněný filtr a produkt na filtru se pomyje 5 litry ledem ochlazeného vodného 0,1 M roztoku uhličitanu sodného, použitého jako piufr. Veškerý získaný produkt se pak suspenduje ve 100 ml ledem ochlazenéhb vodného 0,1 M roztoku uhličitanu sodného.

K suspenzi se pak za míchání přidá roztok 2 g IgG frakce antilátky králičího albuminu (vyráběného firmou Cappel Laboortooies, lne., Peiuinylvania, USA) ve 20 ml vodného 0,1 M roztoku uhličitanu sodného. Směs se míchá 20 hodin při teplotě 4 °C, aby se uskutečnilo navázání albuminu na aktivovaný gel. Po skončení reakce se směs zfiltruje přes skleněný filtr a důkladně promyje vodným 0,1 M roztokem fosforečnanu sodného (pH 7,5), obsahujícím 0,15 molu chloridu sodného. Množní vážené IgG frakce antilátky králičího albuminu se stanoví určením absorbance filtrátu, získaného prorváním, při 280 nm; absorbance je přibližně 1,98 g/100 ml aktivovaného gelu, což odpovídá téměř 100 %, vztaženo na použité mnnžsSví 2 g.

Vzniklý aktivovaný gel s vázanou IgG frakcí antilátky králičího albuminu se použije k izolování albuminu z králičího séra. Za tím účelem se gelem naplní kolona z nerezavějící oceli o vnitřním průměru 2,5 cm a o délce 20 cm; gel se důkladně promyje vodným 0,01 M roztokem fosforečnanu sodného obsahujícím 0,15 molu chloridu sodného.

Pak se kolonou nechá ^p^oJ^:^í0 ²⁰⁰ ml kýll.čího s^éra ^i^otovou r^hlos^ ¹⁰ cm h~'. Gel se důkladně promyje výše uvedeným . roztokem fosforečnanu sodného, který se nechá projít kolonou, načež se uLuuJu pufroiým roztokem obsahujícím kyselinu chlorovodíkovou a 0,1 molu glycinu.

Vyytkaaící kapalina se rychle zneuuralizuje 1 M glyenoov^fa pufrem o pH 11,5· Získaná směs se dial^yzuje přes noc při teplotě 4 °C za použití 0,01 M roztoku fosforečnanu sodného obsahujícím 0,15 molu chloridu sodného, načež se měří absorbance při 280 nm, stanoví se obsah proteinů metodou Lowryho a spol. a konečně se provede elektrolýza za pouužtí akrylamidu pro identifikaci 215 mg králičího albuminu o králičího albuminu a stanoví se jeho množství. Získá se čistotě 98 %.

Je vskutku překvapivé, že získaný albumin obsahuje pouze mmlé m^ožs^ nečistot přesto, že se králičí sérum, obsahhjící iadu .složek, podrobí přímému rozděleni k izolování králičího albuminu. Posléze se gel v koloně promyje a eluuje vodným 8 M roztokem močoviny. Ve vytéke^ící kapalině již nelze nalézt žádné stopy proteinových složek.

Příklad

250 ml zrniWho porovi^to topolymeru (st^^ř^e^^dn^í průměr zrn : 150^/im)^, q°^{y 13}

W_R 4^,4 kg.kg“¹ speci^fický ^povrc^{h 1} χ ¹⁰⁴ m^.kg¹^ př^ipraven^ého postupem z př^lačlu 1 se důkladně promyje des^^vanou vodou a ponoří přes noc do 500 ml dimeeylsulfoxidu. Směs se zfiltruje pod vakuem přes skleněný filtr a suspenduje v 500 ml dimeeylsulfčxidového roztoku obsahujícího 198 ml (2,5 moouJepichlorhydřinu. K suspenzi se za míchání přikape během 2 hodin 45 ml roztoku hydroxidu sodného o hmoonnotní koncennraci 50 %.

Vznnklá směs se míchá 4 hodiny při teplotě v rozmez-30 až 35 °C, čímž se získá gel aktivovaný epoxidovými skupinami. Po skončení reakce se směs rychle zfiltruje přes . skleněný filtr a pak promyje nejprve 700 ml dimeeyysulfoxidu, poté 700 ml acetonu a konečně 3 litry destilované vody.

Z takto získaného gelu, aktivovaného epoxidovými skupinami, se obvyklým postupem (viz například příručku Affinity Cluromiaograplhy, od M. Yarnmzaki, S. leh i i a K. Iwai, vydanou nakladatelstvím Kodansha Κ. K, Japonsko, 1975) připraví gel s vázaným králi či albuminem pro izolování ant.Hátky králičího albuminu.

Za tím účelem se 10 ml gelu, aktivovaného epoxidovými skupinami, suspemluje v 10 ml vodného 0,1 M roztoku mičittnu sodného. Ke vzniklé suspenzi se přidají 2 ml vodného 0,1 M roztoku uh-ičitanu sodného, obsahujícího 30 mg králičího albuminu. Reakce se nechá probíhat 1 hodinu za občasného míchání při teplotě místnooti, čímž se králičí albumin naváže na gel. Po skončení reakce se směs zfiltruje přes skleněný filtr a důkladně pro^je vodným 0,01 M roztokem fosforečnanu sodného (pH 7,5) ^ваНи^^т 0,15 molu chloridu sodného. Minoesví vázaného králičího albuminu se stanoví v podstatě týmž postupem jako v příkladu 10; činí přibližně 28 mg.

Vzniklý aktivovaný gel s vázaným králičím albuminem se vnese do kolony z nerezavějící oceei a poožije k izolování an Hátky králi čího albuminu ze séra obsaam Jícího anmlátku králičího albuminu, v poddtatě týmž postupem jako v příkladu 10. Izolovanou anUlátlrau je IgG bílkovina o vysoké čistotě, mmaící vysekou aktivitu.

Claims (7)

1. Způsob výroby totálně pórovitého aktivovaného gelu, vyznnčuujcí se tím, že se v suspenzi polymoruje vinylkarboxylétový monomer o 4 až 10 atomech uhlíku se sí^ujcdi monomerem mstícím alespoň dvě etylenově nenasycené dvojné vazby, vzniklý kopolymer se podrobí ztmdeeňovací a/nebo transesseeifikační reakci a vzniklá kopolymerová matrice,

3 5 2 1 obesauujcí hydroxylové skupiny a oaaící tpprefieiý povrch 5 x 10^J až 10 x 10' m .kg , hodnotu zádr^že vody ^0,5 a^ž 6,0 ^kg.kg”', vylu^vací mez mole^kulov^é ^im ¹⁰^ a^ž

1°⁸ a hm^noortní středí průměr zrn ⁵ a^ž 1 ⁰⁰⁰ ^um, se nectá reagovat s ^tiva^ío ^činidlem schopným tvooit k^^g^a-ei^l^t^zí vazbu s atomem kyslíku hydroxylové skupiny oatriee a oaa^jcí reaktivní skupiny ^erýmHo aktivataím dnidloo je alespoň jetoa ^tta ze skupiny testálvaíeí z rpiUa1ogrnUfdeinů, Ut1ogrniy’knů a d^poz^^ých sloučenin ^Βα^ύ!cích 4 až 10 atomů uhLíku, v takovém.poměru, že 0,3 až 3 moly reaktivní skupiny se váží na 1 kg oatriee, kteroužto reaktivní skupinou je funkční skupina schopná žtlkιtečntt adiční nebo tubbtltžční reakci s nužieeOflní reaktivní skupinou - oa^cí aktivní vodík v prostředí o konc obraci vodíkových iontů 3 až 13 vyjádřenou hodnotou pH při teplotě 273 až 373 K za vzniku kovalentní vazby mmzi uvedenou reaktivní skupinou a uvedenou ^«^1^ reaktivní skupinou.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačuje! se tím, že se suspenzní polymerace provádí při takovém poměru množní monoiBmrů, při němž se získá kopolymer oaaící poměr sírujících jednotek Xg v rozmezí nerovnasi 0,1 — Xg ^0,4, s výhodou 0,15 — Xg — 0,3, kterýžto poměr síI^ícíc¹ je^ot^ je ^^novta vztahem x

ve kterém «1 *2 ^{W1 W2 n}1 ⁿ2 znamená molekulovou hmoonost vinylkarboxylétového eonomeгu, znamená molekulovou hmoonost sírujícího eonoшeru, ' znamená hmoonnotní mnnoBtví vinylkarboxylátového monomeru použitého při suspmnzní po^mme^!, znamená hmoonnotní mtooství sílujíc:ího monomm^ použitého při suspenzní polymeraci, znamená počet etylenově nenasycených dvojných vazeb přítomných ve vinylkarboxylátovém monomm™, a znamená počet etylenově nenasycených dvojných vazeb přítomných v sí^u^comi monomm™.

Zzůsd p odle t oóu 2 , vy znánu čučí s e t trn, ž e t e z mýdelnovací р//пЬо t raanesterireakce provádí do takového stupně, že vzniklá eaUrice má Οο^ο^^οΙ ςθ_Η vinyl^w uvSu⁰ nepřesahuuí^ todnotu

3.

fiOaUní aL.totoL.ových eonolern^ach jekote⁰ aLespoň ^5,0 m^^o^ů.^kg' danou vztahem

1 000 (1 - x₂)

44 + 39 X2 ve kterém ^X2 má výše uvedený význam a hodnotu v nerovnosti 0_r1 — X2 — 0,4.

4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyz^av^ící se tím, že se použije sítujícího monomm^ obsahuJícího kyanurátový a/nebo isokyanurátový kruh.

5. Způsob ného vzorce podle bodu 4, vyznačující se tím, že se použije sírujícího monomeru obecnebo

OR.

II ¹ n*^C'n ¹ !L

R3O 0«2 ve kterém každý ze symbolů R , R2 a Rj znamená nezávisle na druhých symmolech skupinu vzorce

CH2=CH-CH2 nebo

CH2=C-CH2Ί

CH3

6. Způsob podle bodu 5, vyznačující se tím, tr i allyi iooky a nurátu.

že jako sílujíchho monommru se použije

7. Způsob podle bodu 1, cyznaUužící se tím, se použije vinylacetátu.

Že jako viaylkarboxylátového monomeru