JP6043062B2

JP6043062B2 - イオン交換クロマトグラフィー用グラフトコポリマー

Info

Publication number: JP6043062B2
Application number: JP2011520344A
Authority: JP
Inventors: グラールフス，ハイナー; ブリッチュ，ロター
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2029-07-08
Also published as: CA2732398C; CN102112191A; JP2011529508A; US20110136925A1; WO2010012358A1; US8673988B2; KR101673631B1; CN102112191B; EP2310104A1; JP2017036445A; KR20110044882A; EP2310104B1; CA2732398A1; EP2153877A1

Description

本発明は、修飾された分離材料、その調製、および液体からの荷電バイオポリマーの分離へのその使用に関する。

従来技術
イオン交換クロマトグラフィーは、おそらく医薬用タンパク質、ペプチドおよび他のバイオポリマーを精製するために最も頻繁に用いられる方法である。ほぼすべての工業的精製プロセスは、１つまたは２つ以上のイオン交換段階を含む。標的分子に対し高い結合能力を有するイオン交換樹脂は、特に関心が高い。

直線状グラフトポリマー上にイオン性基が専ら局所化し、次いでその線状グラフトポリマーが担体表面に共有結合した好適な分離材料を使用することは、特に有利である(W. Mueller, J. Chromatography 1990, 510, 133-140)。
対応する官能性モノマーを多数の異なる表面上にグラフトさせることによって得られる官能性ポリマーが、長年にわたり知られている。官能化が化学的に結合したイオン性基を伴う場合には、対応する材料は、イオン交換クロマトグラフィーに用いられることができる。

バイオポリマーの分画を意図した比較的多数のあり得るグラフトポリマー構造が、特許明細書EP 0 337 144またはUS 5,453,186中に見出される。１種より多いモノマー単位（共重合）を含むグラフトポリマーがまた、当該特許においてクレームされている。このグラフト共重合について、好適な交換体を得るために、両方のモノマーが塩基性もしくは酸性の基を含むかまたは１種のモノマーが中性であるようにモノマーを選択しなければならない。グラフト共重合のために好ましいモノマーの組み合わせおよび種類は明らかにされておらず、これは、当業者が、医薬用タンパク質、ペプチドおよび他のバイオポリマーの精製に適した分離材料を得る前に多数の実験を行わなければならないことを意味する。

EP 1 473 075 Aには、イオン交換クロマトグラフィー用の材料が記載されている。当該材料を調製するために、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、Ｎ（イソブトキシメチル）アクリルアミドおよびヒドロキシメチルメタクリレートからなるポリマー溶液を、ヒドロキシル含有担体、例えば多孔性硝酸セルロース上に吸着させる。しかし、この「吸着」は、担体材料と塗布されたコーティングとの間の化学的結合を伴わない。吸着では、水膨潤した架橋ポリマーであるヒドロゲルを、担体の孔中で重合させる。孔中における重合によってのみ、材料は、それが使用中に圧力に対し安定である(pressure-stable)ように、十分に寸法的に安定となる。少なくとも３種のモノマーが、用いるヒドロゲルを調製するために必要であり；また少なくとも５種の構成要素、即ち担体、モノマー１、モノマー２および架橋剤およびデキストランが、実際の分離材料を調製するために必要である。

次に、Kobayashi et al. [Journal of Chromatography, vol. 958,No. 1-2, 109 - 119, (2002)]には、イソプロピルアクリルアミドおよびアクリル酸を含むポリマーをシリカまたはシリカゲル上にグラフトさせることによって得られるクロマトグラフィー材料が記載されている。このグラフトの目的は、非荷電モノマーを導入することによって疎水特性を生じさせることにある。ポリマーの無機シリカへの結合は、脂肪族水酸基が担体表面上に存在せず、シリカが加水分解に対して安定であるという事実によって、より困難になる。

US 2004/203149 A1には、担体材料およびゲルからなるクロマトグラフィー材料が記載されている。担体により担持された多孔性の架橋ゲルが、得られる。またEP 1 473 075 Aに述べられているように、ヒドロゲルは担体の孔中で重合し、使用中圧力に対し安定な、十分に寸法的に安定な材料を与える。担体への共有結合は起こらないが、代わりにヒドロゲルは、担体と絡み合っている。疎水性担体材料が、好ましくは用いられる。またKobayashiによって述べられているように、すべての場合における所望の分離材料の調製には、架橋剤が必要であり、それは、材料の適用において結合挙動に対して顕著な影響を有する。さらに、好ましく用いられるアクリルアミドは、加水分解に対して十分に安定でない。

目的
したがって、本発明の目的は、タンパク質および他のバイオポリマーを高い能力で結合し、分取用途に工業規模で用いることができる、イオン性基を有する担体材料を調製することにある。
この担体材料は、ｐＨ≧１３にて分離材料の精製（purification）または再生を可能にするために、担体の必須の特性を維持した状態で、加水分解に対して安定であり、特にアルカリに対して安定であるべきである。

発明の主題
本発明は、無機または有機担体材料を含む分離材料であって、少なくとも２種のモノマー単位から構成されるポリマーが担体材料に結合しており、ここで少なくとも２種の異なる繰り返し単位が分離材料中に出現し、同時にこれらの単位の１種が電荷を有し、これらの単位の少なくとも１種が中性の基を有することを特徴とする、前記分離材料に関する。

実験により、中性コモノマーとしてのＮ−アルコキシアルキルアクリルアミドで誘導体化された担体材料が、荷電生体分子、特に荷電バイオポリマーを分離するための分離材料として適することが示された。Ｎ−アルコキシアルキルアクリルアミドとのグラフト共重合のために、表面上の低い電荷密度を好適に利用することが達成される。

したがって、本目的はまた、多孔性粒子または他の成形品のヒドロキシル含有表面上に対応するグラフトコポリマーを処理することによって達成される。反応によってこれらの表面に結合したグラフトポリマーは、本発明において２種または３種以上の繰り返し単位から構成され、ここでこれらの単位の少なくとも１種は電荷を有し、少なくとも１種の単位は中性基に結合しており、したがってこれらのグラフトポリマーは、荷電物質にイオン相互作用によって結合することができる。

したがって、本発明はさらに、荷電物質、特にバイオポリマーをイオン相互作用によって結合することのできる分離材料に関する。これらの担体材料を調製するために、２種または３種以上の繰り返されたモノマー単位から構成されており、ここでこれらの単位の少なくとも１種が電荷を有し、これらの単位の少なくとも１種が中性基と結合したグラフトポリマーを、多孔性粒子または他の成形品のヒドロキシル含有表面に化学反応によって結合させることができる。

本発明は特に、架橋合成ポリマーまたは架橋アガロースもしくはデキストランを有する対応する分離材料、あるいは有機コーティングを有する無機の担体をベース担体として含む複合材料に関する。

その表面にコポリマーが共有結合した、対応するヒドロキシル含有ベース担体をベースとするイオン交換クロマトグラフィー用のこの種類の分離材料は、以下の事実によって区別される。
ａ）ベース担体が、脂肪族水酸基を含み、
ｂ）コポリマーが、担体に共有結合し、
ｃ）コポリマーが、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、
ｄ）モノマー単位が、直線状に結合し、

ｅ）コポリマーが、スルホン酸もしくはカルボン酸の形態で、またはアミンもしくはアンモニウム基の形態で電荷を有し、さらにアルキルおよび／またはアルキレン基ならびに任意にアミド基を含むが、アリール基を含まない、
あるいは、
スルホン酸もしくはカルボン酸の形態で、またはアミンもしくはアンモニウム基の形態で負電荷を有し、さらにアルキルおよび／またはアルキレン基を含むが、アリール基を含まない、
少なくとも１種のモノマー単位を有し、

ｆ）コポリマーが、一般式（１）

式中
Ｒ^１は、水素を示し、
Ｒ^２は、水素またはメチルを示し、
Ｒ^３およびＹは、互いに独立して、
水素、４個までのＣ原子を有する直鎖状アルキル、メトキシプロピル、エトキシエチルまたはメトキシエチルを示す、
で表される少なくとも１種の非荷電モノマー単位を有し、

ｇ）１種より多い、電荷を有するモノマーが存在する場合には、同一の電荷を有するモノマー単位のみが組み合わされ、
ｈ）電荷を有するモノマー単位対電荷を有しないモノマー単位の比率が、１：９９〜９０：１０の範囲内にある。

本発明は、好ましくはまた、その表面にコポリマーが共有結合したヒドロキシル含有ベース担体をベースとするイオン交換クロマトグラフィー用の対応する分離材料であって、
ａ）ベース担体は、脂肪族水酸基を含み、
ｂ）コポリマーは、担体に共有結合し、
ｃ）コポリマーは、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、
ｄ）モノマー単位は、直線状に結合し、

ｅ）コポリマーは、一般式（１）で表され、式中
Ｒ^１は、水素を示し、
Ｙは、水素を示し、
Ｒ^３は、Ｒ^４−ＳＯ_３Ｍ、Ｒ^４−ＣＯＯ、Ｒ^４−ＮＲ^９Ｒ^１０またはＲ^４−ＮＲ^９Ｒ^１０Ｒ^１１Ｘを示し、
ここで、
Ｒ^４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
Ｒ^９、Ｒ^１０およびＲ^１１は、互いに独立して水素、メチル、エチル、プロピル、フェニルまたはベンジルを示し、
Ｍは、水素、Ｎａ、ＫまたはＮＨ_４を示し、
Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはメチルスルフェートを示す、
電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を有し、

あるいは、コポリマーは、一般式（２）

式中、
Ｒ^７は、水素を示し、
Ｒ^８は、メチルを示し、
Ｚは、水素、Ｎａ、ＫまたはＮＨ_４を示す、
で表される少なくとも１種のモノマー単位を有する
ことを特徴とする、前記分離材料に関する。

好ましくは、本発明の分離材料であって、
ｆ）結合したコポリマーが、一般式（１）

式中、
Ｒ^１は、水素を示し、
Ｒ^２は、水素またはメチルを示し、
Ｒ^３は、メチル、エチル、プロピル、メトキシプロピル、メトキシエチルを示し、ここで
Ｙは、水素を示し、または、
Ｒ^３は、メチルもしくはエチルを示し、ここで
Ｙは、メチルを示す、
で表される少なくとも１種の非荷電モノマー単位を有する
ことを特徴とする、前記分離材料である。

本発明の分離材料の特に好ましい変形は、以下の事実によって区別される。ｃ）コポリマーが、少なくとも２種の異なるモノマー単位から構成され、
ｅ）コポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、カルボキシメチルアクリルアミド；カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルメタクリルアミド、アクリル酸およびメタクリル酸の群から選択される、負電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を有し、
ならびに
ｆ）コポリマーが、ジメチルアクリルアミド、エトキシエチルアクリルアミド、メトキシエチルアクリルアミドおよびメトキシプロピルアクリルアミドの群から選択される少なくとも１種の非荷電モノマー単位を含む。

本発明に基づき記載される分離材料の他の好ましい態様は、以下の事実によって区別される。
ｃ）コポリマーが、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、
ｅ）コポリマーが、塩化２−（アクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウム、塩化３−（アクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウム、２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、塩化２−（メタクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウムおよび塩化３−（アクリロイル−アミノプロピル）トリメチルアンモニウムの群から選択される、正電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を有し、
ならびに
ｆ）コポリマーは、ジメチルアクリルアミド、エトキシエチルアクリルアミド、メトキシエチルアクリルアミドおよびメトキシプロピルアクリルアミドの群から選択される、少なくとも１種の非荷電モノマー単位を含む。

本発明はさらに、本発明の分離材料、好ましくは多孔性粒子または他の成形品のヒドロキシル含有表面上のグラフトコポリマーの調製方法であって、グラフトポリマーを、２種または３種以上の繰り返しモノマー単位から構成し、ここでこれらの単位の少なくとも１種が電荷を有し、これらの単位の少なくとも１種が、化学反応によってヒドロキシル含有表面に結合した非荷電基を有し、荷電物質、特にバイオポリマーをイオン相互作用によって結合することができる材料を得ることを特徴とする、前記方法に関する。

発明の詳細な説明
担体表面にイオン交換基として結合した柔軟なグラフトポリマー（「触手（tentacle）」）を用いることは、知られている。したがって、商業的に入手できるカチオン交換体Fractogel（登録商標）EMD SO₃ ^-（M）中のグラフトポリマーは、スルホン酸基を有する１種の繰り返し単位のみから構成される。

特許明細書EP 0 337 144またはUS 5,453,186には、イオン交換体の合成において好ましいモノマーの組み合わせに関する情報が示されていない。例にはまた、イオン交換体を直接生じる１種のモノマーでのグラフト重合が記載されているに過ぎない。

特に、官能化アクリルアミドおよびアクリル酸のグラフトが、それらから生成されたポリマーがアルカリ性条件下で加水分解に対して安定であるため、調査されてきた。さらに、ポリ（アクリルアミド）は、水溶液中でのより良好な膨潤性(swellability)およびしたがってそれらの親水性のために利用するのに有利な水素結合を形成することができる。

本発明の分離材料を調製するために、親水性クロマトグラフィー担体、例えばFractogel TSK HW65（M）または商業的に入手できるToyopearl HW-65（S）を用いることができる。これらの担体は、グラフトコポリマーで修飾される。

本発明の材料を調製するために、他のクロマトグラフィー担体もまた用いることができる。しかし、用いる材料が、グラフト重合反応に利用しやすい反応性基、好ましくはＯＨ基を有することが好ましい。したがって、好適な担体材料はまた、例えば有機ポリマーからなり得る。

このような有機ポリマーは、多糖類、例えばアガロース、デキストラン、デンプン、セルロースなど、または合成ポリマー、例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、親水的に置換されたポリ（アルキルアリルエーテル）、親水的に置換されたポリ（アルキルビニルエーテル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ｎ−ビニル尿素）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（スチレン）および対応するモノマーのコポリマーであり得る。

これらの有機ポリマーは、好ましくはまた架橋した親水性ネットワークの形態で用いられることができる。これらの架橋した親水性ポリマーはまた、好ましくは他の疎水性ポリマーと同様に親水化(hydrophilised)形態で用いられることのできるスチレンおよびジビニルベンゼンを含むものを包含する。

あるいは、無機材料、例えばシリカ、酸化ジルコニウム、二酸化チタン、酸化アルミニウムなどを、担体として用いることができる。同様に、複合材料を、好適な担体材料として用いることができる。即ち、例えば、本発明の分離材料は、表面、例えば、本発明の方法で誘導体化される無機粒子または成形材料、を誘導体化することにより、得られることができる。その例としては、磁化可能な粒子の、または磁化可能な磁心の共重合によってそれら自体が磁化され得る粒子である。

しかし、本発明の材料は長期の使用期間にわたってｐＨ≧１３におけるアルカリ性での精製または再生に耐えなければならないため、好ましくは、加水分解に対して安定であるかまたはかろうじて加水分解することができるに過ぎない親水性担体材料を用いる。担体は、低分子量の配位子をすでに担持していてもよい。配位子は、１種または２種以上の荷電基、疎水性基または水素結合を形成することができる基を担持していてもよい。好ましくは、グラフトポリマーと同一の電荷を有する配位子である。

担体材料はまた、粒径が２〜１０００μｍであり得る、不規則な形状であるかまたは球状の粒子からなっていてもよい。好ましくは、３〜３００μｍの粒径である。
担体材料は、特に無孔の、または好ましくは多孔性の粒子状であり得る。孔の大きさは、２〜３００ｎｍであり得る。好ましくは、５〜２００ｎｍの孔の大きさである。
同様に、担体材料はまた、膜、繊維、中空繊維、コーティングまたはモノリシック成形材料状であり得る。モノリシック成形材料は、三次元物体、例えば円筒形状である。

好ましいグラフト重合には、少なくとも１種の正または負に荷電したモノマーを用いる。複数種の荷電モノマーを用いる場合には、本発明に基づき改善された特性を有する分離材料を得るために、同一の電荷を有するモノマーのみを混合できる。陰性基を有するモノマーは、例えばスルホン酸基またはカルボキシル基を有することができる。

スルホン酸基を有する好適なモノマーは、例えば、式（２）で表され、式中Ｚ＝Ｒ^４−ＳＯ_３Ｍであり、ここでＲ^７およびＲ^８が、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチル、カルボキシルまたはカルボキシメチルの意味を有することができ、またここでＲ^４が、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであることのできる、アクリレートである。

Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍは、モノマーが水溶性であるように選択される。
例として、スルホアルキルアクリレート、例えば３−スルホプロピルアクリレートまたは２−スルホエチルアクリレート、およびスルホアルキルメタクリレート、例えば３−スルホプロピルメタクリレートまたは２−スルホエチルメタクリレートが挙げられる。

好ましくは、一般式（１）

式中、Ｒ^３＝Ｒ^４−ＳＯ_３Ｍであり、ここでＲ^１、Ｒ^２およびＹは、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキルの意味を有することができ、好ましくは水素またはメチルであることができる、
で表されるアクリルアミドを用いる。Ｒ^１およびＲ^２は、同様に、互いに独立してカルボキシルまたはカルボキシメチルであることができる。

Ｒ^３はまた、Ｒ^４−ＳＯ_３Ｍであることができ、ここで、Ｒ^４は、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであることができる。

Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍは、モノマーが水溶性であるように選択される。
本明細書中で例として挙げることのできる好適なアクリルアミドは、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）および２−アクリルアミドエタンスルホン酸である。

カルボキシル基を有する好適なモノマーはまた、例えば一般式（２）

式中、Ｚ＝Ｒ^５−ＣＯＯＭであり、ここでＲ^１およびＲ^２は、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチル、カルボキシルまたはカルボキシメチルの意味を有することができ、またここで、Ｒ^５は、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであることができる、
で表されるアクリレートであることができる。

Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍは、モノマーが水溶性であるように選択される。

例として、カルボキシアルキルアクリレート、例えばカルボキシエチルアクリレートおよびカルボキシアルキルメタクリレートが挙げられる。好ましくは、式（１）で表され、式中Ｒ^３＝Ｒ^５−ＣＯＯＭであり、ここでＲ^１、Ｒ^２およびＹが、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、Ｒ^１およびＲ^２が同様に、互いに独立してカルボキシルまたはカルボキシメチルであることのできる、アクリルアミドを用いる。

Ｒ^３はまた、Ｒ^５−ＣＯＯＭであることができ、またここで、Ｒ^５は、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであることができる。
Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍは、モノマーが水溶性であるように選択される。

特に好ましくは、一般式（２）で表され、式中Ｚ＝Ｍであり、ここでＲ^７およびＲ^８が、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチル、カルボキシルまたはカルボキシメチルの意味を有することができる不飽和カルボン酸を用いる。Ｍは、水素原子または金属カチオン、例えばナトリウムもしくはカリウム、またはアンモニウムカチオンである。Ｍは、モノマーが水溶性であるように選択される。例として、マレイン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸またはフマル酸を挙げることができる。これらの中でも、特に好ましくは、式（２）で表され、式中Ｚ＝Ｍであり、ここでＲ^７が水素を示し、Ｒ^８が水素または３個までのＣ原子を有するアルキルを示すモノマーである。このために、例として、アクリル酸およびメタクリル酸を挙げることができる。

陽性基を有するモノマーは、例えば第一、第二もしくは第三アミノ基を有することができるか、または第四級アンモニウム塩であることができる。アミノ基を有する好適なモノマーは、例えば式（２）で表され、式中Ｚ＝Ｒ^４−ＮＲ^９Ｒ^１０であり、ここでＲ^７およびＲ^８が、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有することができ、またここでＲ^４が、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであることができ、またここでＲ^９およびＲ^１０が、互いに独立して水素、アルキル、フェニルまたはアルキルフェニル、例えばメチル、エチルまたはベンジルの意味を有する、アクリレートである。

例として、アミノアルキルアクリレート、例えば２−（ジエチルアミノエチル）アクリレート、２−（ジメチルアミノエチル）アクリレートまたは２−（ジメチルアミノプロピル）アクリレート、およびアミノアルキルメタクリレート、例えば２−（ジエチルアミノエチル）メタクリレート、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリレートまたは３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリレートが挙げられる。

好ましくは、式（１）で表され、式中Ｒ^３＝Ｒ^４−Ｒ^４−ＮＲ^９Ｒ^１０であり、ここでＲ^１、Ｒ^２およびＹが、互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、またここでＲ^４が、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであることができ、またここで、Ｒ^９およびＲ^１０が、互いに独立して水素、アルキル、フェニルまたはアルキルフェニル、例えばメチル、エチルまたはベンジルの意味を有する、アクリルアミドを用いる。

本明細書中で例として挙げることのできる好適なアクリルアミドは、２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミドまたは３−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミドであり、本明細書中で例として挙げることができる好適なメタクリルアミドは、２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミドまたは３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミドである。

第四級アンモニウム塩である好適なモノマーは、例えば一般式（２）で表され、式中ＺがＲ^４−ＮＲ^９Ｒ^１０Ｒ^１１Ｘの意味を有し、またここでＲ^７およびＲ^８が互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有することができ、またここでＲ^４が、１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであり得、またここでＲ^９、Ｒ^１０およびＲ^１１が、互いに独立して水素、アルキル、フェニルまたはアルキルフェニル、例えばメチル、エチルまたはベンジルの意味を有する、アクリレートである。

Ｘはアニオンであり、モノマーが水溶性であるように選択され、例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物またはメチルスルフェートであることができる。例として、アクリルオキシアルキルアンモニウム塩、例えば塩化［２−（アクリルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムおよびメタクリルオキシアルキルアンモニウム塩、例えば塩化［２−（メタクリルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムが挙げられる。

好ましくは、一般式（１）で表され、式中Ｒ^３＝Ｒ^４−ＮＲ^９Ｒ^１０Ｒ^１１Ｘであり、ここでＲ^１、Ｒ^２およびＹが互いに独立して水素または６個までのＣ原子を有するアルキル、好ましくは水素またはメチルの意味を有し、またここでＲ^４が１〜８個のＣ原子を有する直鎖状アルキレン基、例えばメチレン、エチレン、プロピレンもしくはヘキシレン、または１〜８個のＣ原子を有する分枝状アルキレン基、例えばイソプロピレンもしくはイソブチレンであることができ、またここでＲ^９、Ｒ^１０およびＲ^１１が、互いに独立して水素、アルキル、フェニルまたはアルキルフェニル、例えばメチル、エチルまたはベンジルの意味を有するアクリルアミドを用いる。

Ｘはアニオンであり、モノマーが水溶性であるように選択され、例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物またはメチルスルフェートであることができる。本明細書中で例として挙げることのできる好適なアクリルアミドは、塩化２−（アクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウムおよび塩化３−（アクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウムである。本明細書中で例として挙げることのできる好適なメタクリルアミドは、塩化２−（メタクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウムおよび塩化３−（メタクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウムである。

他の構成成分として、好ましくは親水性である、少なくとも１種の非荷電モノマーが、必要である。この目的に適する中性のモノマーは、例えば低級アルキルアクリレート、例えばメチルアクリレート、低級アルキルメタクリレート、例えばメチルメタクリレートである。好ましくは、一般式１で表され、式中Ｙ＝Ｒ^６であり、ここでＲ^１およびＲ^２が、互いに独立して水素またはメチルであり、またここでＲ^３およびＲ^６が、互いに独立して水素または４個までのＣ原子を有するアルキルを示す、アクリルアミドを用いる。

したがって、Ｒ^３および／またはＲ^６は、水素または低級アルキルを示す。後者は、本明細書中で好ましくはメチル、エチル、ブチル、イソプロピル、３−ブチルまたはイソブチルの意味、およびさらに４個までのＣ原子を有するアルコキシアルキル、例えばメトキシエチルまたはエトキシエチルの意味を有する。本明細書中で、例としてアクリルアミド（ＡＡｍ）、ジメチルアクリルアミド、エトキシエチルアクリルアミド、メタクリルアミド、メトキシエチルアクリルアミドおよびメトキシプロピルアクリルアミドを挙げることができる。好ましくは、Ｎ置換アミドである。その理由は、それらがエステルおよび非置換アミドよりも加水分解に対して安定であるからである。

現実のポリマーを、種々の方法で調製することができる。「上にグラフトする(grafting onto)」場合において、ポリマー鎖を、先ずモノマーから形成し、第２の段階において表面に結合させなければならない。「からグラフトする(grafting from)」場合において、重合反応を、表面上で開始し、グラフトポリマーを、個々のモノマーから直接構成する。担体材料の表面に結合するのを可能にする他の重合方法もまた、用いることができる。

好ましくは、第２の方法であり、特に好ましくは、分離しなければならない数種のみの副産物、例えば非共有結合したポリマーが生成する変法である。制御されたフリーラジカル重合、例えば原子移動フリーラジカル重合（ＡＴＲＰ）の方法を用いたプロセスは、特に興味深く思われる。本明細書中において、開始剤基は、最初の段階において担体表面に所望の密度で共有結合する。開始剤基は、例えば、２−ブロモ−２−メチルプロピオン酸エステルにおけるようにエステル官能を介して結合したハロゲン化物であることができる。

グラフト重合は、第２の段階において銅（Ｉ）塩の存在下で行なわれる。好ましい１段階グラフト重合反応は、ヒドロキシル含有担体に対して、担体が活性化されることを必要とせずに、セリウム（ＩＶ）によって開始することができる。この反応は、通常は希薄な鉱酸中で行われる。このグラフト重合を行うために、酸は、水溶液中、通常、１〜０．００００１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１〜０．００１ｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度で用いられる。極めて特に好ましくは、希硝酸を用い、それは、０．１〜０．００１ｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度で用いられる。

グラフトに関する実験的系について、好ましくは、官能化されたアクリルアミドおよびアクリル酸を用いることであった。その理由は、それから生成したポリマーが、アルカリ性条件下で加水分解に対して安定であるからである。好適な担体材料が、以下の表中に挙げたモノマーとグラフト重合された場合には、本発明に係る改善された特性を有するグラフト重合によって誘導体化された分離材料が得られることが見出された。

２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）
２−アクリルアミドエタンスルホン酸
アクリル酸

塩化２−（アクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウム
２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド
ジメチルアクリルアミド
メトキシエチルアクリルアミド

例として、以下の担体に結合したグラフトコポリマーを、好適な担体、例えばFractogel TSK HW65（M）または（S）上に、２種のモノマーの組み合わせによって調製し、カチオン交換体としてのそれらの特性、特にそれらの結合能力に関して調査する：
ポリ（ＡＭＰＳ、ジメチルアクリルアミド）、
ポリ（ＡＭＰＳ、メトキシエチルアクリルアミド）。

有利な特性を有するグラフトポリマーを得るために、荷電モノマーおよび非荷電モノマーを、好ましくは、荷電した構成成分の比率がモノマーの合計量に対して１〜９０ｍｏｌ％となる互いの比率で加え、好ましくは、モノマーの合計量を基準として３〜７０ｍｏｌ％の範囲内の比率である。本発明の分離材料を調製するために、モノマーを、通常担体材料に過剰に加える。０．０５〜１００ｍｏｌの全モノマーを、１リットルの沈殿した(sedimented)ポリマー材料あたり用い、好ましくは０．０５〜２５ｍｏｌ／ｌを用いる。

荷電、および非荷電アクリルアミドを混合物としてグラフト重合することができ、用いるモノマー濃度に対応する取込比率が得られる（表１）ことが見出された。

本発明に基づいて荷電非荷電モノマーから調製したグラフトポリマーは、その中に存在するそれぞれのイオン化可能な基のｐＨ値に対応して、および水環境の現状のｐＨに依存して、水性媒体中で幾分強くイオン化された形態にあり、カルボキシレートもしくはスルホン酸基またはプロトン化された第二もしくは第三アミノ基または第四級アンモニウム基の形態にある。

したがって、本発明の材料は、特にイオン交換クロマトグラフィーにおける使用に適する。非荷電モノマー単位により、グラフトポリマーに対する２種の電荷間の平均の分離が１つの荷電モノマー単位のみからなるグラフトポリマーにおける分離よりも大きいことが保証される。グラフトポリマーはすべて表面に結合しているため、それらはその上に、中性の基が存在するために、１つの荷電モノマー単位のみからなるヒドロゲルよりも低い電荷密度を対応して有するヒドロゲルを形成する。

カチオン交換体を評価するために、先ず、リゾチームおよびポリクローナルヒトＩｇＧ（Gammanorm）の静的結合能力を、ｐＨ５〜７の範囲において調査する。当該結合能力は、塩濃度を約１ＭのＮａＣｌに増大させることによるタンパク質の溶出後に、測定される。

動的結合能力を、カラム中に充填されたカチオン交換体が２分または８分の接触時間にてタンパク質で荷電するように、種々の流量にて測定する。このために、荷電を、ｐＨ５．０にて２５ｍＭのリン酸ナトリウムおよび２５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む緩衝液に溶解したＩｇＧ（Gammanorm）を用いて、１０％のブレイクスルーまで行う。溶出を、結合緩衝液のｐＨにおいて、塩濃度を約１ＭのＮａＣｌまで増大させることによって行う。結合能力を、溶離液中のタンパク質濃度（２８０ｎＭ）から算出する。対応する実験の結果を、表２に示す。

驚くべきことに、より少ない非荷電モノマーがグラフト重合のために供されるにも関わらず、遜色ない静的結合能力を達成することができことが見出された。したがって、０７ＰＰ２２１に用いるＡＭＰＳの量の６６％のみが０８ＰＰ０６３に用られているけれども、０８ＰＰ０６３と称され、ＡＭＰＳおよびジメチルアクリルアミドを含む製品は、製品０７ＰＰ２２１と比較してリゾチームおよびＩｇＧについてのより高い静的結合能力を尚有する。。

驚くべきことに、さらに、グラフトコポリマーを含む本発明の分離材料は、比較のゲルよりも顕著に高い動的結合能力を達成することが見出された。これは、特に、大きい分子、例えばＩｇＧの結合へ、および荷電する間における高い流量（短い接触時間）に適用される。例えば、荷電モノマー単位対中性モノマー単位のモル比が約１：０．９であり、ＡＭＰＳおよびメトキシエチルアクリルアミドを含む（例を参照）グラフトコポリマー０７ＳＷ２６１は、ｐＨ５．０および２分の接触時間にて、商業的に入手できるFractogel（登録商標）EMD SO₃ Mよりも３０％高い結合能力を達成する。

担体表面より上方の空間における負電荷の新規な配列により、特に、比較的大きく荷電した分子がより容易にヒドロゲル中に拡散するのが可能になる。したがって、ＩｇＧは、結合が調査されたｐＨ５．０において、負電荷より多くの正電荷を有する（ｐＨ＜ｐＩ）。おそらく、負電荷を有するグラフトポリマーのＩｇＧに対するより低い反発相互作用が、発生する。したがって、多孔質担体に対する本発明のグラフトにより、大きい分子が担体の外面から内部の孔系中により迅速に輸送され、それにもかかわらずイオン交換クロマトグラフィーのために十分強力に結合するのが可能になる。

本発明の材料をまた、分離エフェクターが付与されたポリマーとして表すことができる。それらを、マトリックスから分離する目的での１種もしくは２種以上の標的構成成分の選択的、部分的に選択的もしくは非選択的な結合もしくは吸着のために、または二次的な構成成分をマトリックスから分離する目的での１種もしくは２種以上の二次的な構成成分の選択的、部分的に選択的もしくは非選択的な結合もしくは吸着のためのみならず、物質混合物の１種もしくは２種以上の構成要素の結合もしくは吸着のない単に分子の大きさに基づいたサイズ排除クロマトグラフィーによる分離、天然源からのバイオポリマーの単離、濃縮および／または除去、組換え型(recombinant)の源からのバイオポリマーの単離、濃縮および／または除去、不死化細胞株およびその培養上清からのバイオポリマーの単離、濃縮および／または除去、Ｂ細胞株およびその派生体、リンパ細胞およびハイブリドーマ細胞系ならびにそれらの培養上清からのバイオポリマーの単離、濃縮および／または除去、タンパク質およびペプチドの単離、濃縮および／または除去、酵素の単離、濃縮および／または除去、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに天然に存在するもしくは組換え型の抗体断片の単離、濃縮および／または除去、リン酸化ペプチド／タンパク質および核酸の単離、濃縮および／または除去、食品添加物の単離、濃縮および／または除去、単糖類および多糖類の単離、濃縮および／または除去、グリコシル化タンパク質の単離、濃縮および／または除去、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの単離、濃縮および／または除去、プラスミドＤＮＡの単離、濃縮および／または除去、ＲＮＡの単離、濃縮および／または除去、ウイルスの単離、濃縮および／または除去、宿主細胞タンパク質の単離、濃縮および／または除去、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの単離、濃縮および／または除去、リポソームの単離、濃縮および／または除去、血液および乳汁からの産物の単離、濃縮および／または除去、低分子量の薬剤活性化合物（ＡＰＩ：原薬（active pharmaceutical ingredient））の単離、濃縮および／または除去、ＡＰＩのＡＰＩ薬剤担体（例えばＡＰＩ／リポソーム付加体またはＡＰＩ／ナノ粒子付加体）からの分離、鏡像異性体の単離、濃縮および／または除去のためにも用いることができる。

バイオポリマーは主に、しかし限定されずに、液体源、例えば体液、例えば血液、血清、唾液または尿、器官抽出物、乳汁、乳清、植物抽出物、細胞抽出物、細胞培養物、発酵ブロス、動物抽出物中から生じるまたはその中に存在する。抗体は、例えば齧歯動物の哺乳動物細胞またはハイブリドーマ細胞から生じることができる。

標的分子を含む試料を、液体に溶解し、それを本発明の材料と接触させて標的分子を、試料からの少なくとも１種または２種以上の他の物質から分離する。接触時間は、通常３０秒〜２４時間の範囲内にある。液体を、本発明による分離材料を含むクロマトグラフィーカラムに通すことによって液体クロマトグラフィーの原理に基づいて作業することが、有利である。液体は、単にその重力によってカラムに通すか、またはポンプによって送り込み通すことができる。

代替の方法はバッチクロマトグラフィーであり、ここで標的の分子またはバイオポリマーが分離材料に結合することができることが必要である限りは、分離材料を液体と、撹拌するかまたは振盪することによって混合する。分離されるべき液体を、例えば分離材料を含む懸濁液中に導入し、ここで分離材料がその高い密度および／または磁心のために所望される分離に適切となるように選択されることによってクロマトグラフ流動層(chromatographic fluidised bed)の原理に基づいて作業することが、同様にできる。

標的分子は通常、本発明の材料に結合する。分離材料をその後、好ましくはその中で標的分子が分離材料と接触される液体と同一のイオン強度および同一のｐＨを有する洗浄緩衝液で洗浄することができる。洗浄緩衝液は、分離材料に結合しないすべての物質を除去する。他の好適な緩衝液でのさらなる洗浄段階を、標的分子を脱着させずに続けてもよい。結合した標的分子の脱着を、溶離剤中のイオン強度を増大させることによって、または溶離剤中のｐＨを変化させることによって行う。したがって標的分子を、精製され、濃縮された状態で溶離剤中に得ることができる。標的分子は通常、脱着後に７０％〜９９％、好ましくは８５％〜９９％、特に好ましくは９０％〜９９％の純度を有する。

しかし、標的分子が液体中に残留するが、他の付随する物質が分離材料に結合することもまた、可能である。その後、標的分子を、カラム溶出液を収集することによってスルーフロー(through-flow)で直接得る。当業者が特定のバイオポリマーを分離材料に結合させるために、条件、特にｐＨおよび／または伝導性をいかにして適応させなければならないか、または精製作業で標的分子を結合させないことが有利であるか否かは、当業者に知られている。

本発明の分離材料を、バイオポリマーについての精製操作(work-up)プロセスの最初のクロマトグラフィー精製段階（捕獲段階）において用いることができる。捕獲段階を他の分離材料を用いて行う場合には、それを、残留する不純物を除去するために捕獲段階の後のクロマトグラフィー精製段階の１つにおいて用いることができる。

本明細書によって、当業者が本発明を包括的に適用することが可能になる。したがって、さらなる説明がなくても、当業者が上記の記載を最も広い範囲において利用することができることが推測される。

何かが不明瞭である場合には、引用した刊行物および特許文献を参照しなければならないことは言うまでもない。したがって、これらの文献は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
より良好に理解するために、および本発明を説明するために、本発明の保護の範囲内にある例を、以下に示す。これらの例はまた、可能な変法を例示する役割を果たす。

さらに、より高い値が示したパーセント範囲から生じ得る場合であっても、示した例およびまた明細書の残りの両方において、組成物中に存在する構成成分量は常に、全体としての組成物を基準として１００重量％または１００ｍｏｌ％まで加えられるに過ぎず、これを超過し得ないことは、当業者にはいうまでもない。したがって、他に示さない限り、％データは、重量％またはｍｏｌ％であり、ただし比率は例外であり、それを容積データにおいて示す。
例および明細書、ならびに特許請求の範囲において示す温度は、常に℃である。

例
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および２−メトキシエチルアクリルアミドを含むグラフトコポリマーの調製の手順（バッチ０７ＳＷ２６１）
３０ｍｌの脱イオン水中の４．２ｇのメトキシエチルアミンを、パドル攪拌機を備えたガラス反応装置中で０〜５℃に冷却する。６．６ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を、滴下漏斗を介して計量して加え、４．８ｇの塩化アクリロイルを、第２の滴下漏斗から激しく撹拌しながら０〜５℃の内部温度にて計量して加える。添加が完了した際に、溶液を、５℃にてさらに３０分間撹拌し、６５％硝酸を用いてｐＨ６に調整し、脱イオン水で１８０ｍｌの合計容積とする。

懸濁液を、この溶液、７８ｇのフィルター湿潤(filter-moist)Fractogel TSK HW65（M）（希鉱酸および脱イオン水で洗浄した）ならびに１６．４ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）および９．９ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を３０ｍｌの脱イオン水中に含む溶液から調製する。ｐＨを、３２％水酸化ナトリウム溶液および６５％硝酸を用いて６に調整する。

１．６ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および０．４ｇの６５％硝酸を４０ｍｌの脱イオン水中に含む開始剤溶液を、先ず滴下漏斗中に圧力を平衡にして導入する。装置全体を、窒素での繰り返しの（３回）排気および減圧によって不活性とする。その後、懸濁液を、装置中で４０℃に加温する。

開始剤溶液を、不活性化された懸濁液に４０℃の内部温度にて撹拌しながら加える。窒素の穏やかな流れの下で、懸濁液を４０℃にて１８時間撹拌する。次に、反応溶液を、ガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して吸引により濾別し、ゲルを、以下のようにフリット上で各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で洗浄する：
３回脱イオン水
８回１Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
３回脱イオン水
２回１ＭＮａＯＨ
３回脱イオン水

ゲルを、２００ｍｌの脱イオン水に懸濁させ、２５％塩酸を用いてｐＨ７に調整する。保存を、２０％エタノール中で室温にて行う。

２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびジメチルアクリルアミドを含むグラフトコポリマーの調製（バッチ０７ＰＰ２２１）
懸濁液を、７８ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65（M）（希鉱酸および脱イオン水で洗浄した）ならびに５．１ｇのジメチルアクリルアミド、１６．７ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および１０．４ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を９７ｍｌの脱イオン水中に含む溶液から、パドル攪拌機を備えたガラス製反応装置中で調製する。ｐＨを、３２％水酸化ナトリウム溶液および６５％硝酸を用いて６に調整し、混合物を、脱イオン水で２００ｍｌの合計容積とする。

１．６ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および０．４ｇの６５％硝酸を１５ｍｌの脱イオン水中に含む開始剤溶液を、先ず滴下漏斗中に圧力を平衡にして導入する。装置全体を、窒素での繰り返しの（３回）排気および減圧によって不活性とする。その後、懸濁液を、装置中で４０℃に加温する。

開始剤溶液を、不活性化された懸濁液に４０℃の内部温度にて撹拌しながら加える。窒素の穏やかな流れの下で、懸濁液を４０℃にて２２時間撹拌する。次に、反応溶液を、ガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して吸引により濾別し、ゲルを、以下のようにフリット上で各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で洗浄する：
７回脱イオン水
１０回１Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
５回脱イオン水
２回１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
３回脱イオン水
１回５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７
２回脱イオン水
生成物を、２０％エタノール中に室温にて保存する。

２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびジメチルアクリルアミドを含むグラフトコポリマーの調製（バッチ０８ＰＰ０６３）
懸濁液を、１００ｇのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65（S）（希鉱酸および脱イオン水で洗浄した）ならびに８．０ｇのジメチルアクリルアミド、１１．１ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および６．９ｇの３２％水酸化ナトリウム溶液を６０ｍｌの脱イオン水中に含む溶液から、パドル攪拌機を備えたガラス製反応装置中で調製する。ｐＨを、３２％水酸化ナトリウム溶液および６５％硝酸を用いて６．２に調整し、混合物を、脱イオン水で１９０ｍｌの合計容積とする。

１．６ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および０．４ｇの６５％硝酸を２５ｍｌの脱イオン水中に含む開始剤溶液を、先ず滴下漏斗中に圧力を平衡にして導入する。装置全体を、窒素での繰り返しの（３回）排気および減圧によって不活性とする。その後、懸濁液を、装置中で４０℃に加温する。

開始剤溶液を、不活性化された懸濁液に４０℃の内部温度にて撹拌しながら加える。窒素の穏やかな流れの下で、懸濁液を４０℃にて２２時間撹拌する。次に、反応溶液を、ガラスフィルターフリット（Ｐ２）を通して吸引により濾別し、ゲルを、以下のようにフリット上で各々の場合において１００ｍｌの洗浄溶液で洗浄する：
７回脱イオン水
１０回１Ｍ硫酸、０．２Ｍアスコルビン酸
５回脱イオン水
２回１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
３回脱イオン水
１回５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０
２回脱イオン水
２回２０％エタノール／１５０ｍＭＮａＣｌ
生成物を、２０％エタノール中に室温にて保存する。

グラフトポリマーの化学的組成の測定
官能基を、ポリアクリルアミド鎖であるグラフトポリマーから、酸加水分解によって切断することができる。官能基を、アミンとして遊離させる。第一アミンを、オルト−フタルアルデヒドおよびメルカプトエタノールで誘導体化した後に、ＨＰＬＣによって定量的に分析することができる。較正のために、市販のアミンまたは、グラフトポリマーと同様にその後加水分解しなければならない合成において用いたモノマーを用いる。

１０００μｌの５Ｍ塩酸を、１０ｍｇの乾燥ゲルに加え、混合物を超音波浴中で処理し、その後１ｍｌの圧力容器中で１２５℃にて１０時間加熱する。
室温に冷却した後、圧力容器を開放する。約２００μｌの上清をピペットで採取して除去し、５分間遠心分離する（８０００ｒｐｍ）。

４０μｌの透明な上清を、１７６μｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて中和し、３２５μｌの０．５Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５および１１９μｌのアセトニトリル／水８：２（Ｖ／Ｖ）を加え、混合する。１００ｍｇのオルト−フタルアルデヒド、９ｍｌのメタノール、１ｍｌの０．５Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５および１００μｌのメルカプトエタノールから調製した１００μｌのＯＰＡ試薬を加え、混合物を激しく振盪する。２分の反応時間の後、試料を、ＨＰＬＣによって分析する（ＵＶ検出３３０ｎｍ）。

表１：用いたモノマーの量と比較した、０７ＳＷ２６１のグラフトポリマーの分析（ＡＭＰＳおよびエタノールアミンを用いた較正）。

静的ＩｇＧ結合能力の測定（マイクロタイタープレートフォーマット）
すべてのゲル懸濁液を、水中の２０％エタノールを用いて、５０％のゲル沈殿物容積(gel sediment volume)に調整する。フィルタープレートを、結合緩衝液および各々の場合において２０μｌの均質化したゲル懸濁液で満たす。次に、フィルタープレートを、真空ステーションにおいて吸引する。

深いウェルのプレートを、結合緩衝液で満たし、タンパク質原液（水中のポリクローナルヒトＩｇＧ、Gammanorm, Octapharmaまたはリゾチーム）を加え、濃度が１ｍｌあたり９．３ｍｇのｐＩｇＧまたは１ｍｌあたり１２．５ｍｇのリゾチームであるように混合する。

２００μｌのタンパク質溶液を、フィルタープレート中のゲルに加え、１５分間シェーカー中で振盪する。フィルタープレートを、真空ステーション中で吸引する。各々の回における１００μｌの結合緩衝液での洗浄および吸引を、２回行う。各々の場合において、２００μｌの溶離緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７）を次に、フィルタープレートに加え、振盪を５分間行う。上清を、真空ステーション中でＵＶプレート中に吸引し、プレートを、光度計において２８０ｎｍにて測定する。

１ｍｌのゲル沈殿物容積あたりの、溶離液から計算したＩｇＧ結合能力（ＩｇＧＳＢＣ）を、表２に列挙する。用いた結合緩衝液は、ｐＩｇＧについて２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５およびリゾチームについて２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ７である。

動的ＩｇＧ結合能力の測定
１ｍｌの容量を有するカラムを充填した（１９ｍｍの床深さ(bed depth)および２０％の圧縮を有するProteo-Cartカラム）。カラムに、１０％のブレイクスルーまで緩衝液Ａ中に１ｇ／ｌの含有量を有するＩｇＧ溶液（ポリクローナルヒトＩｇＧ、Gammanorm, Octapharmaから調製した）を投入する。流量を、カラムに対する接触時間が２分または８分となるように選択する。緩衝液Ａで洗浄した後、カラムを、緩衝液Ｂで溶出する。
緩衝液Ａ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０
緩衝液Ｂ：２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０

ポリクローナルヒトＩｇＧの動的結合能力（ＤＢＣ）を、タンパク質の溶離液中の光度的に（２８０ｎｍ）測定した量から計算し、１ｍｌの充填ゲルあたりで示す（表２）。

表２：１ｍｌの沈殿または充填ゲルあたりの１ｍｇのタンパク質中のｐＨ５．０におけるポリクローナルヒトＩｇＧ(Gammanorm)の静的および動的結合能力（ＳＢＣおよびＤＢＣ）。

Claims

架橋合成ポリマーまたは架橋アガロースもしくは架橋デキストランを担体材料として含み、その表面にコポリマーが共有結合されたイオン交換クロマトグラフィー用分離材料、
あるいは有機コーティングを有する無機担体を担体材料として含み、その表面にコポリマーが共有結合されたイオン交換クロマトグラフィー用分離材料であって、
ａ）担体材料が、水酸基を含み、
ｂ）コポリマーが、担体材料に共有結合し、
ｃ）コポリマーが、少なくとも２種の異なるモノマー単位を含み、
ｄ）モノマー単位が、直線状に結合し、
ｅ）コポリマーが、スルホン酸、カルボン酸の形態で、またはアミンもしくはアンモニウム基の形態で電荷を有し、アルキルおよび／またはアルキレン基ならびに任意にアミド基を含むがアリール基を含まない、少なくとも１種のモノマー単位を有し、
ｆ）コポリマーが、ジメチルアクリルアミド、エトキシエチルアクリルアミド、メトキシエチルアクリルアミドおよびメトキシプロピルアクリルアミドの群から選択される少なくとも１種の非荷電モノマー単位を含み、
ｇ）1種より多い、電荷を有するモノマーが存在する場合には、同一の電荷を有するモノマー単位のみが組み合わされ、
ｈ）電荷を有するモノマー単位対電荷を有しないモノマー単位の比率が、１：９９〜９０：１０の範囲内にある
ことを特徴とする、前記分離材料。
ｅ）コポリマーが、一般式（１’）

で表され、式中
Ｒ^１’は、水素を示し、
Ｒ^２’は、水素を示し、
Ｙ^’は、水素を示し、
Ｒ^３’は、Ｒ^４−ＳＯ_３Ｍ、Ｒ^４−ＣＯＯ、Ｒ^４−ＮＲ^９Ｒ^１０またはＲ^４−ＮＲ^９Ｒ^１０Ｒ^１１Ｘを示し、
ここで、
Ｒ^４は、２〜４個のＣ原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
Ｒ^９、Ｒ^１０およびＲ^１１は、互いに独立して水素、メチル、エチルまたはプロピルを示し、
Ｍは、水素、Ｎａ、ＫまたはＮＨ_４を示し、
Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたはメチルスルフェートを示す、
電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を有し、
あるいは、コポリマーが、一般式（２）

式中、
Ｒ^７は、水素を示し、
Ｒ^８は、メチルを示し、
Ｚは、水素、Ｎａ、ＫまたはＮＨ_４を示す、
で表される少なくとも１種のモノマー単位を有する
ことを特徴とする、請求項１に記載のイオン交換クロマトグラフィー用分離材料。
ｅ）コポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、カルボキシメチルアクリルアミド；カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルメタクリルアミド、アクリル酸およびメタクリル酸の群から選択される、負電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を有することを特徴とする、請求項１に記載の分離材料。
ｅ）コポリマーが、塩化２−（アクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウム、塩化３−（アクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウム、２−（ジエチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジエチルアミノエチル）メタクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）アクリルアミド、２−（ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）アクリルアミド、３−（ジエチルアミノプロピル）メタクリルアミド、塩化２−（メタクリロイルアミノエチル）トリメチルアンモニウムおよび塩化３−（アクリロイルアミノプロピル）トリメチルアンモニウムの群から選択される、正電荷を有する少なくとも１種のモノマー単位を有することを特徴とする、請求項１に記載の分離材料。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材料のヒドロキシル含有表面上のグラフトコポリマーの調製方法であって、グラフトポリマーを、２種または３種以上の繰り返しモノマー単位から構成し、ここでこれらの単位の少なくとも１種が電荷を有し、これらの単位の少なくとも１種が、化学反応によってヒドロキシル含有表面に結合したモノもしくはジアルキルおよび／またはアルコキシエチルもしくはアルコキシプロピル置換アミド基を有する非荷電基を有し、荷電物質をイオン相互作用によって結合することができる材料を得ることを特徴とする、前記方法。