JP5420531B2 - カチオン交換クロマトグラフィーのためのグラフトコポリマー - Google Patents
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Description
クロマトグラフィーは、タンパク質を単離するための最も好適な方法の1つである。モノクローナル抗体を、例えばプロテインAリガンドを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。細胞培養上清からリガンドへの結合は、pHおよび塩濃度を適合させずに可能である。しかし、これらの吸着剤は、これらの高い費用のために、およびリガンドの流出(bleeding-out)のために、限られた範囲で用いられるに過ぎない。
US 5,652,348 (Burton et al.)には、非イオン化リガンドを用いる、イオン化リガンドの疎水性修飾により得られるクロマトグラフィー樹脂およびこれらの使用が開示されている。ここでの結合は、疎水性相互作用を支持する条件の下で生じる。脱着は異なるpHにて行われ、これは、樹脂が親水性となり、電荷を得、結合したタンパク質(同一の電荷の)が反発されることを意味する。
EP 1 094 899には、カチオン交換体を用いて生体分子、特にタンパク質を除去する方法であって、結合を>15mS/cmにて行い、溶出を比較的高いイオン強度にて行うことを特徴とする、前記方法が開示されている。カチオン交換リガンドは、ここでは、第2の官能基およびスペーサーを介して支持マトリックスに結合している。
US 6,852,230およびEP 1 345 694には、ペプチド構造を有する帯電した生体分子の結合および除去のためにイオン交換体を用いることが記載およびクレームされており、ここで、脱着段階の後に、塩を含まない、または塩が減少した溶液が存在し、したがって脱塩は同時に開始する。
US 7,144,743には、アニオン性基により置換されているクロマトグラフィーのための多環式リガンドが記載されている。
このように、カチオン交換体を修飾するための多くの方法は、特許文献および雑誌文献から知られている。混合モードで作動するリガンドを含む吸着剤を調製するための種々の方法もまた、知られている。しかし、細胞培養上清からタンパク質、特に抗体を結合するのに適する商業的に入手できる吸着剤は少数に過ぎない。
同一の会社によって市販されている他の製品の場合において、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(HCIC)を用いる。この製品を用いて、約32mg/mlまでのポリクローナルヒトIgGを結合することができる。
したがって、本発明の目的は、細胞培養上清からのタンパク質についての、特にまた抗体についての改善された結合能を有し、調製の用途のために産業的規模で用いるのに適する分離材料を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、分離材料の特性を顕著に変化させずにpH≧13にて精製または再生を促進する、アルカリに安定な分離材料を提供することにある。
本発明の目的は、共有結合したコポリマーにより、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料の表面を誘導体化することにより調製することができる、新規な分離材料を提供することにより達成され、ここでコポリマーは、少なくとも2種の異なるモノマー単位から構成されるグラフトポリマーであり、またここでこれらのモノマー単位の少なくとも1種は、負の電荷を有する官能基を含み、これらのモノマー単位の少なくとも1種は、コポリマーに、負電荷に加えて疎水性特性を付与する疎水性基を含む。分離材料の表面に結合したグラフトポリマーの特性は、負に荷電した基として少なくとも1つのカルボキシルおよび/またはスルホン酸基を含み、さらに合計で最大8個のC原子を有するエステルまたはアミド基ならびにアルキルおよび/またはアルキレン基を含むが、アリール基を含まない、少なくとも1種のモノマー単位を用いて、これを調製することができることである。他の変形態様は、これがスルホン酸またはカルボン酸の形態で負の電荷を有し、さらにアルキルおよび/またはアルキレン基を含むがアリール基を含まない。
R1、R2およびYは、互いに独立してHもしくはCH3を示し、
R3は、R4−SO3MもしくはR4−COOMを示し、
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキレンを示し、
Mは、H、Na、KもしくはNH4を示す、
R7およびR8は、互いに独立してHもしくはCH3を示し、または
R7は、Z=MかつR8=Hである場合にはCOOMを示し、
Zは、M、R4−COOMもしくはR4−SO3Mを示し、ここで
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキレンを示し、
Mは、H、Na、KもしくはNH4を示す、
で表される、負の電荷を有する少なくとも1種の水溶性モノマー単位、
あるいは各々の場合において少なくとも1種の一般式(1)で表されるモノマー単位および一般式(2)で表されるモノマー単位、
R1は、HまたはCOOMを示し、
R2は、HまたはCH3を示し、
YおよびR3は、18個までのC原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、ここでYおよびR3は一緒に、少なくとも6個のC原子を有し、
あるいは、
および
R3は、6〜18個のC原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキルを示し、
あるいは、
Yは、Hを示し、
および
R3は、アリールまたはR6−アリールを示し、
あるいは、
および
R3は、R4−CONHXを示し、
Xは、6〜18個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリールまたはR6−アリールを示し
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し
R6は、1〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、ここでメチレン基は、Oにより置き換えられていてもよく、COOMにより置換されていてもよく、
また
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される疎水性基を含む少なくとも1種の他のモノマー単位、
式中、
R7は、Hを示し、
R8は、HまたはCH3を示し、
Zは、4〜18個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、R6−アリールまたはR4−CONHXを示し、
Xは、6〜8個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、R6−アリールを示し、
また
R6は、1〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示す、
で表される疎水性基を含む対応するモノマー単位を用いて行い、
ここで、負の電荷を有するモノマー単位対疎水性基を含むモノマー単位のモル比は、99:1〜10:90の範囲である。
Yは、R5−COOMを示し、
R1およびR2は、互いに独立して、
H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、カルボキシル、カルボキシメチルを示し、
R3は、H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、Yを示し、
R5は、8個までのC原子を有し、任意にアルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換されている直鎖状または分枝状アルキレン、または/および
10個までのC原子を有し、任意にアルキル、アルコキシまたはカルボキシル基により単置換または多置換されているアリーレンを示し、
および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示し、
Zは、MまたはYを示す、
で表される少なくとも1種の水溶性モノマー単位を用いて、調製することができる。
Yは、R4−SO3Mを示し、
また
R1およびR2は、互いに独立して、H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、
R3は、H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、
R4は、メチレン、エチレン、プロピレン、ヘキシレン、イソプロピレン、イソブチレンまたはフェニレンを示す、
少なくとも1種の水溶性モノマー単位を用いて、調製することができる。
Yは、R5−COOMを示し、
ここで同時に、
R1およびR2は、互いに独立して、
H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、
R3は、H、1〜6個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、
R4は、メチレン、エチレン、ヘキシレン、プロピレン、イソプロピレン、イソブチレンまたはフェニレンを示す。
R1は、Hを示し、
R2は、HまたはCH3を示し、
Yは、Hを示し、
および
R3は、アリールまたはR6−アリールを示し、
あるいは、
Yは、HまたはCH3を示し、
および
R3は、R4−CONHXを示し、ここで
Xは、アリールまたはR6−アリールを示し、
R4は、メチレン、エチレン、プロピレンを示し、
R6は、1〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、ここでメチレン基は、−O−により置き換えられていてもよく、COOMにより置換されていてもよく、
および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、疎水性基を含む少なくとも1種のモノマー単位を含むコポリマーを含む、このタイプの分離材料である。
R1は、Hを示し、
R2は、HまたはCH3を示し、
Yは、Hを示し、
および
R3は、フェニル、ベンジル、フェニルエチルまたはフェノキシエチルを示し、
あるいは、
Yは、HまたはCH3を示し、
および
R3は、R4−CONHXを示し、ここで
Xは、フェニル、ベンジルまたはフェニルエチルを示し、
および
R4は、メチレン、エチレン、プロピレン、アクリロイルフェニルグリシンまたはアクリロイルフェニルアラニンを示す、
で表される疎水性基を含む少なくとも1種のモノマー単位を含む、このタイプの分離材料である。
R1およびR2は、互いに独立して、
H、6個までのC原子を有する非分枝状または分枝状アルキルを示し、
R3および/またはR6は、互いに独立して、
H、非分枝状または分枝状アルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキルを示し、
ここでアルキル基は、オキソ基を有していてもよく、
ここでアルキルおよび/またはアリール基は、アルコキシ、フェノキシ、シアノ、カルボキシル、アセトキシまたはアセトアミノ基により単置換または多置換されていてもよく、
またここで、R3およびR6は一緒に、少なくとも6個のC原子を有する、
一般式(1)で表される少なくとも1種のモノマー単位を用いて、調製することができる。
R3、R6は、互いに独立して、H、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、2−、3−または4−オキサペンチル、2−、3−、4−または5−オキサヘキシル、2−、3−、4−、5−または6−オキサヘプチル、3−ブトキシプロピル、イソプロピル、3−ブチル、イソブチル、2−メチルブチル、イソペンチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、2−オキサ−3−メチルブチル、2−メチル−3−オキサヘキシル、2−フェニル−2−オキソエチル、フェノキシエチル、フェニル、ベンジル、フェニルエチルおよびフェニルプロピルを示し、
またここで、R3およびR6が一緒に少なくとも6個のC原子を有する、
で表される少なくとも1種のモノマー単位を用いて、調製することができる。
R1、R2は、互いに独立してHまたはメチルを示し、
R3、R6は、互いに独立してH、アルキル、アルコキシアルキルを示し、各々は4個までのC原子を有する、で表される、少なくとも1種の中性モノマー単位を用いて調製された、このタイプの分離材料である。
式中Y=R6であり、ここで、
R1、R2は、互いに独立してHまたはメチルを示し、
R3、R6は、互いに独立してH、メチル、エチル、ブチル、イソプロピル、3−ブチル、イソブチル、メトキシエチルまたはエトキシエチルを示す、で表される、少なくとも1種の中性モノマー単位を含む分離材料である。
a)一般式(1)
R1、R2およびYは、互いに独立して、HまたはCH3を示し、
R3は、R4−COOMを示し、
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、カルボキシル基を含む少なくとも1種のモノマー
R7およびR8は、互いに独立して、HまたはCH3を示し、あるいは、
R7は、Z=MかつR8=Hである場合にはCOOMを示し、
Zは、MまたはR4−COOMのいずれかを示し、ここで
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、カルボキシル基を含むモノマーを、任意に水溶性モノマーと共に、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上にグラフト重合させ、
b)その後グラフト重合させたカルボキシル基のいくつかを、アミンとのカップリングによりアミド基に変換する
ことを特徴とする。
a)一般式(1)
R1、R2およびYは、互いに独立してHまたはCH3を示し、
R3は、R4−COOMを示し、
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
R7およびR8は、互いに独立してHまたはCH3を示し、あるいは、
R7は、Z=MかつR8=Hである場合にはCOOMを示し、
Zは、MまたはR4−COOMを示し、
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、カルボキシル基を含む少なくとも1種のモノマーを、
任意に他の水溶性モノマーと共に、負に帯電した基の比率がモノマーの合計量に対して1〜100mol%となるように水に溶解し、
c)鉱酸に溶解したセリウム(IV)塩を、得られた懸濁液に加え、0〜5の範囲のpHおよび0.00001〜5mol/l、好ましくは0.001〜0.1mol/lのセリウム(IV)濃度を生じさせ、また
d)反応混合物を、0.5〜72時間以内でグラフト重合させ、
e)アミンまたはアミン混合物を、グラフト重合したカルボキシル基のカップリングによる修飾のために用い、
g)アニリン、ベンジルアミン、4−フルオロベンジルアミン、4−メトキシベンジルアミン、ナフチルメチルアミン、フェナシルアミン、フェニルエチルアミン、フェノキシエチルアミン、トリプタミンまたはチラミンの群からの、6〜18個のC原子を有するアルキル、アリールまたはアリールアルキルアミンを、遊離アミンとして、または塩酸塩として、カップリングのために用いる
ことからなる。
a)親水性モノマーを水に溶解し、これを任意に、負に荷電した基の比率がモノマーの合計量に対して1〜100mol%であるような比率で、他のモノマーと混合し、
b)沈降したポリマー材料1リットル当たり0.05〜100molの全モノマーを、用いるように得られた溶液を支持材料と混合し、
c)鉱酸に溶解したセリウム(IV)塩を得られた懸濁液に加え、0〜5の範囲のpHにさせ、
d)0.5〜72時間以内で反応混合物をグラフト重合させる
ことにより行う。
溶液中の
a)イオン強度を増加させ、および/または
b)pHを変更することにより、
および/または
c)吸着緩衝液とは異なる極性を有する好適な溶離液により、
脱着させることにより、行うことができる。
または、
b)2段階方法において、先ず好適な親水性単位によるグラフティングを行い、続いてグラフトポリマー上でのポリマー類似反応により、疎水性基を導入する。
支持材料は、特に、非孔質であるかまたは好ましくは多孔質粒子の形態であってもよい。孔の大きさは、2〜300nmであり得る。好ましいのは、5〜200nmの孔の大きさである。
支持材料は、同様に、また膜、繊維、中空繊維、コーティングまたはモノリシック成形品の形態であってもよい。モノリシック成形品は、例えば円筒形の形態での三次元物体である。
アニオン性基を含むモノマー4および疎水性モノマー5を、親水性支持表面1上に直接混合物としてグラフトし、アニオン性および疎水性基を含む化学的に修飾された表面3を得ることができる。モノマー4がカルボキシル基を含む場合には、親水性アニオン性表面2を先ず形成し、その後、例えばカップリング試薬としてアリールアルキルアミンおよびカルボジイミドを用いた疎水性修飾により、3に変換することができる。モノマー4は親水性モノマーの混合物であり得、モノマー5は疎水性モノマーと中性モノマーとの混合物であり得る。
ベンジルアクリルアミドとのポリ(AMPS、ArAAm)
ベンジルアクリルアミド、アクリロイルフェニルアラニンとのポリ(AA、ArAAm)
ベンジルアクリルアミドとのポリ(AMPS、ArAAm、AAm)
ベンジルアクリルアミドとのポリ(AA、ArAAm、AAm)
カルボキシプロピルアクリルアミドおよびベンジルアクリルアミドとのポリ(CAAAm、ArAAm)
ブチルアクリルアミドとのポリ(AMPS、AlkylAAm)
ミドを、スルホン酸基を含むモノマー、例えばAMPSと共重合させることができるが、誘導体化された支持材料は、既知の分離材料、例えば純粋なAMPSから製造されたグラフトポリマーのものの領域において免疫グロブリン(IgG)に対する結合能のみを示すことが、見出された。
あるいは一般式(2)
で表される、カルボキシル基を含む水溶性モノマーが、特に好ましい。
不明な点がある場合には、引用した刊行物および特許文献を参照しなければならないことは、言うまでもない。したがって、これらの文献は、本記載の開示内容の一部と見なされる。
例および記載ならびに特許請求の範囲中に示す温度は、常に℃である。
例1:
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびベンジルアクリルアミドからグラフトコポリマーを調製するための手順(バッチ05SW136)
手順:
70gのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65(M)(希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した)、32.3gのベンジルアクリルアミドを250mlのジオキサンに溶解した溶液および41.5gの2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸の溶液および25gの32%水酸化ナトリウム溶液を50mlの脱イオン水に溶解した溶液の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で475mlとし、32%水酸化ナトリウム溶液または65%硝酸を用いてpH4に調整する。
8×0.5M硫酸、0.2Mアスコルビン酸
3×脱イオン水
2×1M水酸化ナトリウム溶液
4×脱イオン水
5×アセトン
5×水
アクリル酸およびベンジルアクリルアミドからグラフトコポリマーを調製するための手順(バッチ06SW297)
手順:
77.9gのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65(M)(希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した)、1.34gのベンジルアクリルアミドを14.5mlのジオキサンに溶解した溶液および18.0gのアクリル酸を50mlの脱イオン水に溶解した溶液の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、32%水酸化ナトリウム溶液を用いてpH4に調整し、脱イオン水で375mlとする。
9.6gの硝酸アンモニウムセリウム(IV)および1.2gの65%硝酸を25mlの脱イオン水中に含む開始溶液を、最初に、圧力を平衡にした第2の滴下漏斗中に導入する。装置全体を、繰り返し(3回)排気および窒素での減圧により不活性にする。その後、装置中の懸濁液を、55℃に加温する。
2×0.5M硫酸/0.2Mアスコルビン酸−アセトン1:1(V/V)
8×0.5M硫酸、0.2Mアスコルビン酸
3×脱イオン水
2×1M水酸化ナトリウム溶液
2×1M水酸化ナトリウム溶液
5×脱イオン水
ゲルを、200mlの脱イオン水に懸濁させ、25%塩酸を用いてpH7に調整する。ゲルを、20%エタノール中で室温にて保存する。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸、アクリル酸およびベンジルアクリルアミドからグラフトコポリマーを調製するための手順(バッチ06SW085)
手順:
69gのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65(M)(希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した)、32.2gのベンジルアクリルアミドを250mlのジオキサンに溶解した溶液、25.9gの2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ならびに15.6gの32%水酸化ナトリウム溶液を50mlの脱イオン水に溶解した溶液および9.0gのアクリル酸の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で475mlとし、32%水酸化ナトリウム溶液または65%硝酸を用いてpH4に調整する。
8×0.5M硫酸、0.2Mアスコルビン酸
3×脱イオン水
2×1M水酸化ナトリウム溶液
2×1M水酸化ナトリウム溶液
4×脱イオン水
5×0.5M硫酸、0.2Mアスコルビン酸
5×脱イオン水
ゲルを、200mlの脱イオン水に懸濁させ、25%塩酸を用いてpH 7に調整する。ゲルを、20%エタノール中で室温にて保存する。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸からグラフトコポリマーを調製するための手順(バッチ05PP131)
手順:
140gのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65(M)(希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した)および33.6gの32%水酸化ナトリウム溶液を120mlの脱イオン水に溶解した溶液、46.6gの2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(氷冷しながら添加)および16.2gのアクリル酸の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で400mlとし、65%硝酸を用いてpH3に調整する。
7×脱イオン水
8×1M硫酸、0.2Mアスコルビン酸
5×脱イオン水
3×1M水酸化ナトリウム溶液
3×脱イオン水
1×50mMリン酸塩緩衝液、pH7.0
2×脱イオン水
2×20%エタノール/150mM塩化ナトリウム
ゲルを、20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸からグラフトコポリマーを調製するための手順(バッチ06PP066)
手順:
210gのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65(M)(希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した)および56.1gの32%水酸化ナトリウム溶液を150mlの脱イオン水に溶解した溶液、77.7gの2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(氷冷しながら添加)および27.0gのアクリル酸の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で660mlとし、65%硝酸を用いてpH3に調整する。
7×脱イオン水
8×0.5M硫酸、0.2Mアスコルビン酸
5×脱イオン水
2×1M水酸化ナトリウム溶液
2×1M水酸化ナトリウム溶液
3×脱イオン水
1×50mMリン酸緩衝液、pH7.0
2×脱イオン水
2×20%エタノール/150mM塩化ナトリウム
ゲルを、20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸からグラフトコポリマーを調製するための手順(バッチ06PP189)
手順。2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸からのグラフトコポリマー(バッチ06PP066)の調製についての手順を参照。2×0.5M硫酸、0.2Mアスコルビン酸を用いたさらなる洗浄段階のみを、加えた。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順(バッチ06PP262)
手順:
Fractogel上の2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含む40mlの沈降したグラフトコポリマー(バッチ06PP189)を、各々の回40mlの水で8回洗浄し、ガラスフィルターフリット上で吸引により濾過する。
懸濁液を攪拌し、この間pHを、6%水酸化ナトリウム溶液を加えることによりpH4.7に保持する。3時間後、さらに0.8gのEDCを加える。pHを、6%水酸化ナトリウム溶液を加えることによりpH4.7にさらに保持し、最低1時間モニタリングする。
10×脱イオン水
3×1M塩化ナトリウム溶液
5×50mMリン酸緩衝液、pH7.0
2×20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液
ゲルを、20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングするための手順(バッチ06PP345)
手順。2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順(バッチ06PP262)を参照。0.6gのN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)を、各々の場合において加える。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングするための手順(バッチ06PP346)
手順。2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順(バッチ06PP262)を参照。1.0gのN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)を、各々の場合において加える。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸および4−アクリルアミド酪酸からグラフトコポリマーを調製するための手順(バッチ06SW055)
手順:
70gのフィルター湿潤Fractogel TSK HW65(M)(希薄な鉱酸および脱イオン水で洗浄した)および16.8gの32%水酸化ナトリウム溶液を75mlの脱イオン水に溶解した溶液、13.3gの2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(氷冷しながら添加)および17.7gの4−アクリルアミド酪酸の懸濁液を、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で調製する。懸濁液を、脱イオン水で200mlとし、65%硝酸を用いてpH3に調整する。
5×0.5M硫酸、0.2Mアスコルビン酸
3×脱イオン水
4×1M水酸化ナトリウム溶液
5×脱イオン水
1×50mMリン酸緩衝液、pH7.0
3×脱イオン水
2×20%エタノール/150mM塩化ナトリウム
ゲルを、20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
4−アクリルアミド酪酸からグラフトポリマーを調製するための手順(バッチ05PP116)
手順:
25.0gの32%水酸化ナトリウム溶液を、20.6gの4−アミノ酪酸を200mlの脱イオン水に溶解した溶液に、0〜5℃にて、パドル攪拌機を有するガラス反応装置中で加える。18.2gの塩化アクリロイルおよび25.0gの32%水酸化ナトリウム溶液を、同時に2つの滴下漏斗から激しく攪拌しながら0〜5℃にて加える。次に、混合物を、室温にてさらに45分間攪拌する。モノマー溶液を、65%硝酸を用いてpH2に酸性化する。
5×脱イオン水
8×0.5M硫酸、0.2Mアスコルビン酸
3×脱イオン水
2×1M水酸化ナトリウム溶液
2×脱イオン水
ゲルを、200mlの脱イオン水に懸濁させ、25%塩酸を用いてpH7に調整する。ゲルを、20%エタノール中で室温にて保存する。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトコポリマーにアミン類をカップリングさせるための手順
手順:
Fractogel上の2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含む20mlの沈降したグラフトコポリマー(バッチ06PP066または05PP131)を、各々の回20mlの水で8回洗浄し、ガラスフィルターフリット上で吸引により濾過する。
EDC溶液:2.4gのN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)を、4.8mlの脱イオン水に溶解する。
フィルター湿潤ゲルを、密封可能なビーカー中でアミン溶液に懸濁させる。次に、1.2mlのEDC溶液を加え、懸濁液を室温にて振盪する。3時間後、さらに1.2mlのEDC溶液を加え、混合物をさらに17時間振盪する。
(所望により5×DMF)
5×脱イオン水
3×1M水酸化ナトリウム溶液/エタノール2:8(V/V)
2×1M水酸化ナトリウム溶液/エタノール2:8
3×脱イオン水
1×50mMリン酸緩衝液、pH7.0
2×脱イオン水
2×20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液
ゲルを、20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸および4−アクリルアミド酪酸を含むグラフトコポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順(バッチ06SW058)
手順:
Fractogel上の2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸および4−アクリルアミド酪酸を含む20mlの沈降したグラフトコポリマー(バッチ06SW055)を、各々の回20mlの水で5回、および各々の回20mlの0.1Mの2−モルホリノエタンスルホン酸溶液(MES緩衝液)、pH4.7で5回洗浄し、ガラスフィルターフリット上で吸引により濾過する。
フィルター湿潤ゲルを、密封可能なビーカー中でベンジルアミン溶液に懸濁させる。0.4gのN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)を加え、懸濁液を、室温にて振盪する。3時間後、さらに0.4gのEDCを加え、混合物をさらに17時間振盪する。
10×脱イオン水
3×1M塩化ナトリウム溶液
5×50mMリン酸緩衝液、pH7.0
2×脱イオン水
2×20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液
ゲルを、20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液中で室温にて保存する。
4−アクリルアミド酪酸を含むグラフトポリマーにベンジルアミンをカップリングさせるための手順(バッチ05PP117/05PP118)
手順:
Fractogel上の4−アクリルアミド酪酸を含む20mlの沈降したグラフトポリマー(バッチ05PP116)を、各々の回20mlの水で5回、および各々の回20mlの0.1M 3−モルホリノプロパンスルホン酸溶液(MPS緩衝液)、pH4.7で5回洗浄し、ガラスフィルターフリット上で吸引により濾過する。
フィルター湿潤ゲルを、密封可能なビーカー中でアミン溶液に懸濁させる。0.4gのN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)を加え、懸濁液を、室温にて振盪する。3時間後、さらに0.4gのEDCを加え、混合物をさらに17時間振盪する。
フィルター湿潤ゲルを、密封可能なビーカー中でアミン溶液に懸濁させる。0.07gのN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)を加え、懸濁液を、室温にて振盪する。3時間後、さらに0.07gのEDCを加え、混合物をさらに17時間振盪する。
10×脱イオン水
3×1M塩化ナトリウム溶液
5×50mMリン酸緩衝液、pH7.0
ゲルを、20%エタノール/150mM塩化ナトリウム溶液中に室温にて保存する。
静的IgG結合能(マイクロタイタープレート形式)の決定
すべてのゲル懸濁液を、20%エタノール水を用いて、50%のゲル沈降容積に調整した。フィルタープレートを、結合緩衝液で、および各々の場合において20μlの均質化したゲル懸濁液で満たす。次に、フィルタープレートを、真空ステーション上で吸引により濾過する。
深いウェルのプレートを、結合緩衝液で満たし、IgG原液(ポリクローナルヒトIgG、Gammanorm, Octapharma)を加え、成分を混合する。
例12からの分離材料の結合能を、表2に示す。
グラフトポリマーの化学的組成の決定
官能基をポリアクリルアミド鎖であるグラフトポリマーから、酸性加水分解により切断して除去することができる。官能基は、アミンとして遊離し、これを、オルトフタルジアルデヒドおよびメルカプトエタノールにより誘導体化した後に、HPLCにより定量的に分析することができる。校正のために、市販のアミンを用いるか、またはモノマーを合成において用い、これを次に、グラフトポリマーと同様に加水分解しなければならない。
室温に冷却した後、圧力容器を開放し、約200μlの上清をピペットで除去し、5分間遠心分離する(8000rpm)。
結果を表3に列挙する。
動的IgG結合能の決定
カラムに、1mlの内容物を充填した。19mmの床の深さおよび20%の圧縮を有するProteo-Cartカラムならびに13mmの床の深さおよび10%の圧縮を有するSuperformanceカラム。当該カラムに、緩衝液A(ポリクローナルヒトIgG、Gammanorm, Octapharmaから調製した)中で、1g/lの内容物を有するIgG溶液を10%破過まで流した。ここでの流速を、カラム中の接触時間が4分であるように選択した。緩衝液Aで洗浄した後に、カラムを緩衝液Bで溶出させた。
緩衝液B:25mMのリン酸塩、1Mの塩化ナトリウム、pH6.5
または
緩衝液A’:25mMのリン酸塩、150mMの塩化ナトリウム、pH5.5
緩衝液B’:25mMのリン酸塩、1Mの塩化ナトリウム、pH5.5
または
緩衝液A’’:25mMのリン酸塩、150mMの塩化ナトリウム、pH5.5
緩衝液B’’:50mMのTRIS緩衝液、2Mの塩化ナトリウム、pH9.0
結果を表3に列挙する。
モノクローナル抗体を用いた結合実験
1mlの容量のProteo-Cartカラム(Merck KgaA)に、例7に従って調製した分離材料(06PP343)を充填し(17%圧縮)、25mMのリン酸塩、150mMの塩化ナトリウム、pH5.5で平衡にする(約12mS/cm)。20mgのキメラモノクローナル抗体(Clinical Cancer Research 1995, 1, 1311- 1318に記載されている、25mMのリン酸塩、150mMの塩化ナトリウム、pH5.5に溶解した)を含む試料を、0.2ml/分の流速にてカラムに適用する。溶出を、25mMのリン酸塩、1Mの塩化ナトリウムを含む溶液で、pH5.5にて行う。その後の溶出後の抗体の回収は、行った実験において98%であった。
クロマトグラムを図3に示す。
サイズ排除クロマトグラフィー
これらの粘性の範囲により図2に図示する、種々の分子量を有するプルランの分配係数Kdを、3種の塩濃度(0、0.1および1.0Mの塩化ナトリウム)にて、アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびアクリル酸を含むグラフトポリマーについて、ベンジルアミンのカップリングの前(Fractogel SO3/COO)および後(Fractogel SO3/COO/ベンジル)に、無勾配実験(isocratic experiment)により、実験的に決定した。
Claims (16)
- 表面にコポリマーが共有結合した、ヒドロキシル含有ベース支持体をベースとするイオン交換クロマトグラフィーのための分離材料であって、
a)ベース支持体が、脂肪族ヒドロキシル基を含み、
b)共有結合したコポリマーが、末端モノマー単位を介して支持体に結合しており、
c)コポリマーが、少なくとも2種の異なるモノマー単位を含み、
d)モノマー単位が、線状に結合しており、
e)コポリマーが、
スルホン酸またはカルボン酸の形態で負電荷を有し、さらにエステルまたはアミド基および合計で最大8個のC原子のアルキルおよび/またはアルキレン基を含むがアリール基を含まない、あるいは
スルホン酸またはカルボン酸の形態で負電荷を有し、さらにアルキルおよび/またはアルキレン基を含むがアリール基を含まない
少なくとも1種のモノマー単位を含み、
f)コポリマーが、疎水性基として、4〜18個のC原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキルまたは対応するアリール基を有し、かつエステルまたはアミド基を含む、少なくとも1種のモノマー単位を含み、また
g)負電荷を有するモノマー単位対疎水性基を含むモノマー単位の比率が、99:1〜10:90の範囲である
ことを特徴とする、前記分離材料。 - a)ベース支持体が、脂肪族ヒドロキシル基を含み、
b)共有結合したコポリマーが、末端モノマー単位を介して支持体に結合しており、
c)コポリマーが、少なくとも2種の異なるモノマー単位を含み、
d)モノマー単位が、線状に結合しており、
e)コポリマーが、一般式(1)
R1、R2およびYは、互いに独立してHもしくはCH3を示し、
R3は、R4−SO3MもしくはR4−COOMを示し、
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキレンを示し、
Mは、H、Na、KもしくはNH4を示す、
あるいは、一般式(2)
R7およびR8は、互いに独立してHもしくはCH3を示し、または
R7は、Z=MかつR8=Hである場合にはCOOMを示し、
Zは、M、R4−COOMもしくはR4−SO3Mを示し、ここで
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキレンを示し、
Mは、H、Na、KもしくはNH4を示す、
で表される、負の電荷を有する少なくとも1種のモノマー単位、あるいは、
各々の場合において少なくとも1種の一般式(1)で表されるモノマー単位および一般式(2)で表されるモノマー単位を含み、および
f)コポリマーが、疎水性特性をコポリマーに付与し、一般式(1)、
式中、
R1は、HまたはCOOMを示し、
R2は、HまたはCH3を示し、
YおよびR3は、18個までのC原子を有する直鎖状または分枝状アルキルを示し、ここでYおよびR3は一緒に、少なくとも6個のC原子を有し、
あるいは、
Yは、Hを示し、
および
R3は、6〜18個のC原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキルを示し、
あるいは、
Yは、Hを示し、
および
R3は、アリールまたはR6−アリールを示し、
あるいは、
Yは、HまたはCH3を示し、
および
R3は、R4−CONHXを示し、
Xは、6〜18個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリールまたはR6−アリールを示し
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し
R6は、1〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、ここでメチレン基は、Oにより置き換えられていてもよく、COOMにより置換されていてもよく、
および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、疎水性基を含む少なくとも1種のモノマー単位、あるいは、一般式(2)、
式中、
R7は、Hを示し、
R8は、HまたはCH3を示し、
Zは、4〜18個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、R6−アリールまたはR4−CONHXを示し、
Xは、6〜8個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキル、アリール、R6−アリールを示し、
および
R6は、1〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示す、
で表される対応するモノマー単位を含み、
g)負の電荷を有するモノマー単位対疎水性基を含むモノマー単位のモル比が、99:1〜10:90の範囲である
ことを特徴とする、請求項1に記載の分離材料。 - c)コポリマーが、少なくとも2種の異なるモノマー単位を含み、
e)コポリマーが、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸、2−アクリルアミドエタンスルホン酸、カルボキシメチルアクリルアミド、カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルメタクリルアミド、マレイン酸、アクリル酸およびメタクリル酸系からの、負の電荷を有する少なくとも1種のモノマー単位を含み、
f)コポリマーが、一般式(1)
R1は、Hを示し、
R2は、HまたはCH3を示し、
Yは、Hを示し、
および
R3は、アリールまたはR6−アリールを示し、
あるいは、
Yは、HまたはCH3を示し、
および
R3は、R4−CONHXを示し、ここで
Xは、アリールまたはR6−アリールを示し、
R4は、メチレン、エチレン、プロピレンを示し、
R6は、1〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、ここでメチレン基は、Oにより置き換えられてもよく、COOMにより置換されてもよく、
および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、疎水性基を含む少なくとも1種のモノマー単位を含む
ことを特徴とする、請求項1または2に記載の分離材料。 - c)コポリマーが、少なくとも2種の異なるモノマー単位を含み、
e)コポリマーが、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸、2−アクリルアミドエタンスルホン酸、カルボキシメチルアクリルアミド、カルボキシエチルアクリルアミド、カルボキシプロピルアクリルアミド、カルボキシメチルメタクリルアミド、カルボキシエチルメタクリルアミド、カルボキシプロピルメタクリルアミド、マレイン酸、アクリル酸およびメタクリル酸系からの、負の電荷を有する少なくとも1種のモノマー単位を含み、
f)コポリマーが、一般式(1)
R1は、Hを示し、
R2は、HまたはCH3を示し、
Yは、Hを示し、
および
R3は、フェニル、ベンジル、フェニルエチルまたはフェノキシエチルを示し、
あるいは、
Yは、HまたはCH3を示し、
および
R3は、R4−CONHXを示し、ここで
Xは、フェニル、ベンジルまたはフェニルエチルを示し、
また
R4は、メチレン、エチレン、プロピレン、アクリロイルフェニルグリシンまたはアクリロイルフェニルアラニンを示す、
で表される、疎水性基を含む少なくとも1種のモノマー単位を含む
ことを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の分離材料。 - a)コポリマーが、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸または/および2−アクリルアミドエタンスルホン酸を、負電荷を有するモノマー単位として含み、
b)負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位の比率が、70:30〜30:70の範囲である
ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の分離材料。 - a)コポリマーが、アクリル酸または/およびメタクリル酸を、負電荷を有するモノマー単位として含み、
b)負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位のモル比が、95:5〜70:30の範囲であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の分離材料。 - a)コポリマーが、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸および2−アクリルアミドエタンスルホン酸系からのモノマーを、負電荷を有するモノマー単位として含み、
b)アクリル酸およびメタクリル酸系からのモノマー、および
b)負電荷を有するモノマー単位対疎水性のフェニル、ベンジルまたはフェニルエチル基を含むモノマー単位のモル比が、95:5〜30:70の範囲である、ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の分離材料。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の分離材料の製造方法であって、負電荷を有する官能基を含む少なくとも1種のモノマー単位を、疎水性基を含む少なくとも1種のモノマー単位と、および任意に親水性特性を有する中性のモノマーと、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上に、1段階または多段階反応においてグラフト重合させることを特徴とする、前記方法。
- 負電荷を有する官能基を含む少なくとも1種のモノマー単位を、疎水性基を含む少なくとも1種のモノマー単位と共に、および任意に親水性特性を有する中性のモノマーと共に、アセトン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン系からの共溶媒を加えて、セリウム(IV)イオンの存在下で、希酸に溶解し、ヒドロキシル含有ベース支持体上にグラフト重合させることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- a)一般式(1)
R1、R2およびYは、互いに独立して、HまたはCH3を示し、
R3は、R4−COOMを示し、
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、カルボキシル基を含む少なくとも1種のモノマー
および/または一般式(2)
R7およびR8は、互いに独立して、HまたはCH3を示し、あるいは、
R7は、Z=MかつR8=Hである場合にはCOOMを示し、
Zは、MまたはR4−COOMのいずれかを示し、ここで
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、カルボキシル基を含むモノマーを、任意に水溶性モノマーと共に、ヒドロキシル含有無機、有機または複合支持材料上にグラフト重合させ、
b)その後グラフト重合させたカルボキシル基のいくつかを、アミンをカップリングさせることによりアミド基に変換する
ことを特徴とする、請求項8または9に記載の分離材料の製造方法。 - a)一般式(1)
R1、R2およびYは、互いに独立してHまたはCH3を示し、
R3は、R4−COOMを示し、
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、および
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
および/または一般式(2)
R7およびR8は、互いに独立してHまたはCH3を示し、あるいは、
R7は、Z=MかつR8=Hである場合にはCOOMを示し、
Zは、MまたはR4−COOMを示し、
R4は、2〜4個のC原子を有する直鎖状または分枝状アルキレンを示し、
また
Mは、H、Na、KまたはNH4を示す、
で表される、カルボキシル基を含む少なくとも1種のモノマーを、
任意に他の水溶性モノマーと共に、負に帯電した基の比率がモノマーの合計量に対して1〜100mol%となるように水に溶解し、
b)得られた溶液を、沈降した支持材料1リットル当たり0.05〜100molの全モノマーを用いるように、支持材料と混合し、
c)鉱酸に溶解したセリウム(IV)塩を、得られた懸濁液に加え、0〜5の範囲のpHおよび0.00001〜5mol/lのセリウム(IV)濃度を生じさせ、また
d)反応混合物を、0.5〜72時間以内でグラフト重合させ、
e)アミンまたはアミン混合物を、グラフト重合したカルボキシル基のカップリングによる修飾のために用い、
f)用いるアミンの合計量は、支持体に結合するカルボキシル基に対して0.01〜100:1のモル比であり、これを支持体に結合する帯電した基に対して0.01:1〜20:1のモル比で用いるカップリング試薬の存在下でアミド基に変換し、
g)アニリン、ベンジルアミン、4−フルオロベンジルアミン、4−メトキシベンジルアミン、ナフチルメチルアミン、フェナシルアミン、フェニルエチルアミン、フェノキシエチルアミン、トリプタミンまたはチラミンの群からの、6〜18個のC原子を有するアルキル、アリールまたはアリールアルキルアミンを、遊離アミンとして、または塩酸塩として、カップリングのために用いる
ことを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の分離材料を製造するための請求項10に記載の方法。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の分離材料を含む、クロマトグラフィーカラム。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の分離材料のクロマトグラフィーカラムにおける使用。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の分離材料のバイオポリマーを液体媒体から除去するための使用。
- バイオポリマーを、1〜20mS/cmの電解伝導度および4より大きいpHを有する水性液体に溶解することを特徴とする、請求項13に記載の使用。
- イオン性基および任意に疎水性基との相互作用により分離材料に結合したバイオポリマーを、
溶液中の
a)イオン強度を増加させ、および/または
b)pHを変更し、
および/または
c)吸着緩衝液のものとは異なる極性を有する溶離液を用いることにより
脱着させることを特徴とする、請求項13〜15のいずれかに記載の使用。
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