JP6853670B2 - 親和性クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイス - Google Patents
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Description
本発明は、クロマトグラフィー媒体、及びクロマトグラフィー媒体を含むクロマトグラフィーデバイス、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法、並びにクロマトグラフィーデバイスを使用する方法を対象とする。
親和性クロマトグラフィー媒体は、一般に、1つ又は複数の標的分子と相互作用することができる結合リガンドを有する固体支持体を含む。親和性クロマトグラフィーは、固体支持体上で展開されるリガンド、例えばビーズが、典型的に標的分子に対して選択的であるため有用である。この選択性は、良好な収率、並びに標的分子の高速かつ経済的な精製を可能にする。
黄色ブドウ球菌のプロテインA、又は免疫グロブリンに対する特異的親和性を有する組み換えプロテインAは、モノクローナル抗体(mAb)を含む免疫グロブリン(例えば、IgG)のほとんどのサブクラスに結合する、選択的親和性リガンドである。Boyle,M,D.P.and Reis,K.J.,1987,Biotechnology,5:697。一旦、樹脂などの多孔質クロマトグラフィー支持体、膜、又は他の媒体の上に固定化されると、プロテインAは、mAb又はポリクローナルIgGの精製及び商業生産に有用である。
親和性クロマトグラフィー媒体の性能は、選択性、有効物質移動、結合能、及び支持体の充填床浸透性選択性などの因子によって決定することがある。かかる性能特徴の最適化は、ベースマトリックス特性、リガンド付着に使用される化学修飾の種類、及びリガンド特性の組み合わせ及び相互作用によって決定される。
最も一般的に使用される媒体支持体は、ビーズ状アガロースなどの炭水化物のポリマーである。これらの材料は、低い非特異的タンパク質結合を呈するが、それらは軟質かつ圧縮性であり、したがって大規模での使用が制限される。シリカ系固体支持体は、アガロース又は他の種類のポリマー支持体と関連した短所の多くを被らない。
多孔質シリカに基づく親和性媒体、例えば、制御細孔ガラス(CPG)は、それらの高い能力及び好適な背圧流特徴に起因して、いくらかの商業的実用性を見出した。McCueらの2003,Journal of Chromatography A,989(1):139では、2つの異なる細孔径700Å及び1000Åの制御細孔ガラスビーズ(56〜100μm粒径)が、プロテインA親和性媒体固体支持体に使用された。彼らは、より小さい700Å細孔径材料を用いて、より大きな静的及び動的容量が達成されたことを見出し、これは、より大きな表面積及び関連した表面上の高いリガンド濃度の結果として合理化された。特に、多孔質シリカ系支持体が、狭い細孔径分布にわたって均一な細孔径を必要とすることは通説であった。例えば、Robertsら(国際公開第199009237号)は、均一な細孔径を有する(すなわち、細孔径分布が狭い範囲内に含まれ、全細孔の90%が平均から±10%の直径を有する)多孔質ガラスが、親和性支持媒体に好ましいと主張した。Copan(欧州特許第0263934号)もまた、その材料の狭い細孔径範囲を定義した。未定義の広い細孔径分布を有するシリカゲルは、一般に、親和性媒体の支持体として不十分であると考えられる。
当該技術分野において、バイオポリマーの精製及び生成のための親和性クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィー操作における生産性及びプロセス効率を増加させる必要性がある。
ここで予想外に、特定の細孔径分布及び帯域を有する多孔質無機酸化物支持体を含む、プロテインA系親和性クロマトグラフィー媒体が、特定のリンカー密度と共に、モノクローナル抗体(例えば、IgG1)に対する強化されたタンパク質A動的結合能、及び良好な選択性、すなわち望ましくにタンパク質に対する低い非特異的タンパク質結合を有することが発見された。具体的に、広い細孔径分布にわたって不均一な細孔径を有するシリカ系支持体が、より小さい粒径及び狭い細孔径分布を有する制御細孔ガラス支持体を含む既知のプロテインA親和性媒体に対して同等のプロテインA動的結合能性能を有する親和性媒体をもたらすことが見出された。有利に、本発明の親和性媒体は、クロマトグラフィーカラム内で使用されるとき、背圧と関連した問題を最小限に抑える一方で、低い非特異的タンパク質結合を有するモノクローナル抗体に高い結合能をもたらす。
したがって、本発明は、改良されたシリカ系クロマトグラフィー媒体、及びかかるクロマトグラフィー媒体を含むクロマトグラフィーデバイスを提供する。開示されたクロマトグラフィーデバイスは、従来のクロマトグラフィー操作を超える以下の利点、すなわち、ユーザによるデバイス充填工程の排除、定置洗浄(CIP)工程の排除、水酸化ナトリウム溶液を用いる定置洗浄(CIP)の排除、ユーザによる任意の検証工程の排除、及び生分解性材料を含むクロマトグラフィーデバイスの使用のうちの1つ又は2つ以上に起因して、より効率的、生産的、及び/又は環境に優しいクロマトグラフィー操作を可能にする。
例示的な一実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約600オングストローム(Å)〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均1.0超〜約3.0個のリンカー分子を含む官能化表面とを有する。
別の例示的な実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000ダルトン(D)の範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する。
別の例示的な実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約20m2/g〜約100m2/gの平均BET表面積と、少なくとも約1mL/gの平均細孔容積と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均1.0超〜約3.0個のリンカー分子を含む官能化表面と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する。
本発明は、クロマトグラフィー媒体又は支持体を作製する方法も対象とする。例示的な一方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることとを含む。別の例示的な方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることとを含む。別の例示的な方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約20m2/g〜約100m2/gの平均BET表面積と、少なくとも約1mL/gの平均細孔容積と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均1超〜約3個のリンカー分子と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質とを含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることとを含む。
本発明は、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備える、クロマトグラフィーデバイスを更に対象とする。一実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備え、クロマトグラフィー媒体が、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を含む、官能化表面とを有する。
別の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備え、クロマトグラフィー媒体が、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する。
更に別の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備え、クロマトグラフィー媒体が、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約20m2/g〜約100m2/gの平均BET表面積と、少なくとも約1mL/gの平均細孔容積と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を含む官能化表面と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する。
本発明は、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法を尚も更に対象とする。例示的な一方法では、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体のうちのいずれかをデバイス筐体に組み込むことを含む。クロマトグラフィーデバイスを作製するいくつかの方法では、この方法は、クロマトグラフィー媒体を、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料、及びいくつかの実施形態では、生分解性ポリマー材料から形成されたカラム筐体に組み込むことを含む。
本発明は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスのうちのいずれかを使用する方法を尚も更に対象とする。クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスを使用する例示的な一方法では、この方法は、本発明のクロマトグラフィー媒体及び/又はクロマトグラフィーデバイスをクロマトグラフィーシステムの操作位置内に位置付けることと、クロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーデバイスを通じて流体を処理することとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、クロマトグラフィーシステムの操作位置内にあるとき、1つ又は2つ以上の生体分子を含有する流体を、クロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーデバイスを通じて処理することを含む。例えば、流体は、タンパク質、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、開示される実施形態及び添付の特許請求の範囲の以下の詳細な説明を再検討することで明らかとなるであろう。
本発明は、添付の図面の参照しながら更に記載される。
本発明の原理の理解を促進するために、本発明の特定の実施形態の説明が続き、特定の専門用語が特定の実施形態を記載するために使用されるが、特定の専門用語の使用によって、本発明の範囲を制限するとは意図されないことが理解されるだろう。変更、更なる修正、及び考察されるそのような本発明の原理の更なる用途は、通常、本発明が関係する当業者が想到し得るものとして企図される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明白に他の意味を示す場合を除き、複数の指示物を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「1つの酸化物」に関する言及は、複数のかかる酸化物を含み、「酸化物」に関する言及は、1つ又は2つ以上の酸化物、及び当業者に既知のその同等物などを含む。
例えば、本開示の実施形態を説明する際に用いられる組成物中の成分の量、濃度、容積、プロセス温度、プロセス時間、回収率又は収率、流量、並びにそれらの同様の値及び範囲を修飾する「約」は、例えば、典型的な測定及び取り扱い手順を通じて、これらの手順における不慮のエラーを通じて、これらの方法を実行するために使用される成分の差を通じて、並びに同様の近似した考慮事項を通じて起こり得る数量の変化を指す。「約」という用語はまた、特定の初期濃度又は混合物を有する製剤の経時変化によって異なる量、並びに特定の初期濃度又は混合物を有する製剤の混合又は処理によって異なる量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかに関わらず、これらの量の同等量を含む。
本明細書で使用される場合、「生体分子」という用語は、生存生物によって生成される任意の分子を意味し、タンパク質、多糖類、脂質、及び核酸などの大分子、並びに一次代謝物、二次代謝物、及び天然生成物などの小分子が挙げられる。生体分子の例としては、細胞及び細胞残屑、抗体、タンパク質及びペプチド、DNA及びRNAなどの核酸、内毒素、ウイルス、ワクチンなどが挙げられる。生体分子の他の例としては、国際公開第2002/074791号及び米国特許第5,541,660号に列挙されるものが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「無機酸化物」は、無機成分がカチオンであり、酸化物がアニオンである、二元酸素化合物として定義される。無機材料は、金属を含み、またメタロイドも含み得る。金属は、周期表上でホウ素からポロニウムまで引かれた斜線の左側の元素を含む。メタロイド又は半金属は、この線の右側の元素を含む。無機酸化物の例としては、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア等、及びそれらの混合物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「多孔質無機粒子」は、無機材料(例えば、金属、半金属、及びそれらの合金、無機酸化物を含むセラミックなど)、並びに性質的に異種又は同種の組成物材料などの有機材料(例えば、有機ポリマー)からなる粒子を含む。例えば、異種組成物材料としては、材料の単なる混合物、層状材料、コアシェルなどが挙げられる。同種組成物材料の例としては、合金、有機−無機ポリマーハイブリッド材料などが挙げられる。粒子は、鎖、ロッド、又はラス形状を含む、様々な異なる対称、非対称、又は不規則な形状であり得る。粒子は、非晶質又は結晶質等を含む異なる構造を有し得る。粒子は、異なる組成、大きさ、形状、若しくは物理構造を含むか、又は異なる表面処理以外は同じものであり得る粒子の混合物を含み得る。より小さい粒子が凝集し、より大きい粒子を形成する場合、粒子の有孔率は粒子内又は粒子間であり得る。例示的な一実施形態では、粒子は、無機酸化物、硫化物、水酸化物、炭酸塩、ケイ酸塩、リン酸塩などの無機材料から構成されるが、好ましくは、例えばコロイド粒子を形成するための溶液重合、例えば溶融粒子を形成するための連続火炎加水分解、例えばゲル状粒子を形成するためのゲル化、沈降、噴霧、テンプレート法、ゾル−ゲルなどを含むが、これらに限定されない任意の既知のプロセスを介して形成され得る無機酸化物である。
本明細書で使用される場合、「秩序多孔質材料」という用語は、細孔径分布が、本明細書で定義されるとおり、0.5未満の相対スパンを有するように、非常に狭い細孔径分布を持つ構造秩序を有する多孔質粒子を指す。
本明細書で使用される場合、「無秩序多孔質材料」という用語は、細孔径分布が、本明細書で定義されるとおり、0.5を超える相対スパンを有するように、均一でない細孔径分布(すなわち、性質的に多様な非常に広い細孔径分布)を有する多孔質粒子を指す。
本明細書で使用される場合、「官能化表面」という用語は、粒子の外側部分上、及び/又は内部細孔の表面積上の表面積を含む、粒子表面の少なくとも一部分の湿潤性又は選択性を改変するために、少なくとも1つの官能化合物との反応によって表面修飾された無機粒子を意味する。官能化表面を使用して、結合相(共役的又はイオン的)、被覆表面(例えば、逆相C18結合された)、クラッド表面(例えば、EP6と同様に炭素クラッド)、重合表面(例えば、イオン交換)、固有表面(例えば、無機/有機ハイブリッド材料)、又は同様のものを形成することができる。例えば、無機粒子をオクタデシルトリクロロシランと反応させることは、シランを無機表面に共有結合することによって「逆相」を形成する。別の実施例では、無機粒子のアミノプロピルトリメトキシシランとの反応に続いて、アミノ基の4級化によって「アニオン交換相」を形成する。第3の実施例では、結合相は、無機粒子のアミノプロピルトリメトキシシランとの反応に続いて、酸塩化物によるアミドの形成よって形成されてもよい。他の結合相としては、ジオール、シアノ、カチオン、親和性、キラル、アミノ、C4、C8、親水性相互作用(HILIC)、疎水性相互作用(HIC)、混合モード、サイズ排除などが挙げられる。結合相又は官能化表面の一部として、リガンドを使用して、標的分子又は生体分子との特異的相互作用(例えば、結紮)、例えば米国特許第4,895,806号に記載されるものを示すことができる。
本明細書で使用される場合、「リンカー分子」又は「リンカー」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、多孔質無機粒子の表面に付着した分子を定義し、この分子は、生体分子などの他の分子の、多孔質無機粒子の表面へのリンカー分子を介した付着を可能にする。
本明細書で使用される場合、「分子量」という用語は、特定の化合物又はポリマーの単一分子のモル量を意味するものとして定義される。
本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、移動相中に溶解した混合物を、混合物中の他の分子から標的分子を分離し、それを単離させる、カラム若しくはカートリッジ又は他の容器内に収容された固定相(すなわち、クロマトグラフィー媒体)に通すプロセスを意味する。使用されるクロマトグラフィーの種類に応じて、標的分子は、固定相の上に吸着されてもよいが、望ましくない成分は、デバイスを通過するか、又は逆も同様である。「液体クロマトグラフィー」という用語は、液体が移動相として使用され、固体又は固体支持体上の液体が固定相として使用される、クロマトグラフィーの形態である。「フラッシュクロマトグラフィー」という用語は、正圧下(例えば、最大2MPa(300psi))で行われる液体クロマトグラフィーを意味する。「高性能液体クロマトグラフィー」(HPLC)という用語は、高い正圧下(例えば、最大約35MPa(5000psi))で行われる液体クロマトグラフィーを意味する。「分取クロマトグラフィー」という用語は、標的化合物又は分子の単離及び精製のためのHPLCを意味する。「高速タンパク質液体クロマトグラフィー」(FPLC)という用語は、生体分子の分離に有用なHPLCの形態である。
本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、その無機物以外の無機粒子中に存在する材料を意味する。
本明細書で使用される場合、「不規則な」という用語は、それが無機粒子に適用するとき、粒子間の粒子形状が、均一でなく(すなわち、ランダムな粒子形状)、1.0を超えるアスペクト比を有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「筐体」という用語は、クロマトグラフィーにおける使用のために固定相を保持するための導管又は容器を意味し、カートリッジ、カラム、管、デバイス、床、袋などが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「固定相」又は「クロマトグラフィー媒体」又は「クロマトグラフィー支持体」という用語は、試料混合物中の異なる成分に対して異なる親和性を示す、官能化表面(例えば、いくつかの官能基を介して無機粒子の表面に付着したリガンド)を含む材料を意味し、クロマトグラフィーにおいて、標的分子(例えば、結紮)を1つ又は2つ以上の他の分子の混合物から分離するために使用される。固定相は、有機及び無機材料、又はそれらのハイブリッドを含み、粒子、モノリス、膜、被覆などの形態であってもよい。
本明細書で使用される場合、「細孔径分布」という用語は、代表的な容積の多孔質無機粒子中の各細孔径の相対豊富度を意味する。
本明細書で使用される場合、「メジアン細孔径」(PD50)という用語は、細孔径の中間点を意味するように使用され、ここで細孔容積の50%が、中間点直径よりも小さい細孔径を有する細孔から寄与され、50%が中間点直径よりも大きい直径を有する細孔から寄与される。
本明細書で使用される場合、「細孔容積」という用語は、飽和蒸気圧で試料の細孔構造に吸着される液体の容積として定義され、吸着された液体は、液体のバルク密度と同じ密度を有すると仮定する。本発明における細孔容積の水銀測定及び多孔質無機粒子の細孔径分布は、約28MPa(4100バール)までの大気圧の圧力範囲で可能な任意の好適な水銀ポロシメータを使用して得ることができ、接触角θ=140°、及び25.2℃で485ダイン/cmの水銀表面張力を有する(かかる温度でのHg密度は13.5335g/mLである)。
本明細書で使用される場合、「相対スパン」という用語は、細孔径分布の帯域の尺度として定義される。「スパン」は、水銀ポロシメトリによって測定される、PD10細孔径(すなわち、その下に細孔容積の10%が存在する細孔径/直径)を、PD90細孔径(すなわち、その下に細孔容積の90%が存在する細孔径/直径)から差し引くことによって測定される。「相対スパン」という用語は、(PD90−PD10)/PD50の比率として定義される。
本明細書で使用される場合、「表面積」という用語は、BET表面積分析によって決定される。表面積を測定するBET方法は、J.Am.Chem.Soc.60(1938)309〜319においてBrunauer、Emmett、及びTellerにより詳細に説明されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「動的結合能」という用語は、それがクロマトグラフィー媒体に関するとき、本明細書において、未結合のタンパク質の著しい破過が起こる前に、媒体が流動条件下で結合するであろう標的タンパク質の量を示すために使用される。実際に、このクロマトグラフィー媒体は、カラム又はカートリッジに充填され、低イオン強度緩衝液中の標的タンパク質の溶液が、カラムを通り抜ける。未結合のタンパク質は、媒体上へのタンパク質の結合がその最大能力に達すると、カラムから出始める。破過曲線が生成され、同じ条件下で、タンパク質が破過し始めるまでの時間が長いほど、媒体が有する結合能が高い。
本明細書で使用される場合、「非特異的タンパク質結合」という用語は、本明細書において、非特異的相互作用に起因して、不純物タンパク質が親和性媒体上に結合することを示すように使用され、この結合は望ましくなく、プロテインAクロマトグラフィーの場合にIgGなどの所望のタンパク質の結合能を低減し、全てのタンパク質が溶出工程において溶出された後、クロマトグラフィー生成物のより多量の不純物の存在にもつながるであろう。非特異的結合の一般的原因のうちの1つは、タンパク質の、媒体(例えば、シリカ表面上の未反応の曝露したシラノール基)上の他の種類の官能基との相互作用である。
本発明は、クロマトグラフィー媒体、及びクロマトグラフィーカラムなどのクロマトグラフィーデバイスを対象とする。本発明は、クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーカラムを作製する方法、並びにクロマトグラフィーカラムを使用する方法を更に対象とする。例示的なクロマトグラフィー媒体、例示的なクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーカラムを作製する方法、並びにクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーカラムを使用する方法に関する説明が下に提供される。
図1は、本発明の例示的なクロマトグラフィーカラム100の図を提供する。図1に示されるように、例示的なクロマトグラフィーカラム100は、カラム筐体150、及びカラム筐体150内に位置付けられる媒体床空間151を備える。いくつかの実施形態では、媒体151は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均1超〜約3個のリンカー分子を含む、官能化表面とを有する。いくつかの実施形態では、媒体151は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する。いくつかの実施形態では、媒体151は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約20m2/g〜約100m2/gの平均BET表面積と、少なくとも約1mL/gの平均細孔容積と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を含む官能化表面と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する。
図1に更に示されるように、カラム筐体150は、典型的に、管状筐体部材156、第1の管状筐体部材エンドキャップ152、第2の管状筐体部材エンドキャップ153の反対側エンドキャップ152、カラム入口154、及びカラム出口155を備える。カラム100は、カラム入口154を通るスラリーの形態の多孔質無機粒子で充填されてもよく、このカラム入口は、その中に通路を有する中心ボア157、及びノズル158を備える。床空間内のスラリーの分布及び均一な充填を促進する様々なノズルを使用することができる。フィルター159はそれぞれ、エンドキャップ152、153の内面上に位置付けられ、管状部材156と作用して、床空間151を定義し、また床空間151からの粒子媒体の漏出を防止する。分布チャネル160は、第1のエンドキャップ152及び/又は第2のエンドキャップ153の面にわたって横方向に位置し、フィルター159と流体連通している。流体分布チャネル160は、液体の放射状分布を促進するように作用する。単純な形態の分布チャネル160は、第1及び/又は第2のエンドキャップ152及び153の面に少なくとも1つの円周方向及び/又は放射状の溝を備える。この溝は、それが入口154のノズル158から出る液体の円周方向及び/又は放射状の分布をもたらすように位置付けられる。カラムを使い捨てカラムとして使用するとき、典型的に0.1〜2000リットル、及び0.1〜100リットルの範囲の広範囲のカラム容量が可能であることが理解されるであろう。米国特許出願公開第2008/0017579号も参照されたい(その主題全体が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
カラム筐体150は、様々な材料から形成することができる。典型的に、カラム筐体150は、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含み、いくつかの所望の実施形態では、生分解性ポリマー材料を含む。カラム筐体150を形成するための好適なポリマー材料としては、ポリオレフィンを含む成形性のプラスチックなどの任意の合成又は半合成有機固体が挙げられるが、これらに限定されない。カラム筐体150を形成するための好適な金属材料としては、ステンレス鋼が挙げられるが、これに限定されない。
カラム筐体150は、従来の熱形成技法を使用して形成することができる。例えば、カラム筐体150の管状筐体部材156、第1の管状筐体部材エンドキャップ152、及び第2の管状筐体部材エンドキャップ153は、成形工程を介してそれぞれ独立して形成されてもよい。いくつかの実施形態では、管状筐体部材156と、(i)カラム筐体150の第1の管状筐体部材エンドキャップ152及び(ii)第2の管状筐体部材エンドキャップ153のうちの1つとは、単一成形工程を介して形成される(すなわち、エンドキャップのうちの1つは、管状筐体部材156の一端上に一体形成される)。
上述されるように、カラム筐体150内に位置付けられる媒体151は、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径を有する多孔質無機粒子を含むことができる。いくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、約800Å〜約1500Å(又はその間の、1000Å及び1300Åを含む、1.0Åの増分での任意の値(例えば、1280Å))のメジアン細孔径を有する。更にいくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、約1000Å〜約1300Å、又は1000Å〜約1300Åを含むその間の値の任意の範囲(例えば、約1080Å〜約1260Å)のメジアン細孔径を有する。
多孔質無機粒子は、典型的に、Hgポロシメトリによって測定して、少なくとも約0.9mL/g又は少なくとも1.0mL/gの細孔容積を有する。本発明の例示的な一実施形態では、多孔質無機粒子は、窒素ポロシメトリによって測定して、約1.0mL/g〜約3.0mL/gの細孔容積を有する。本発明の別の例示的な実施形態では、多孔質無機粒子は、Hgポロシメトリによって測定して、約1.0mL/g〜約2.0mL/gの細孔容積を有する。
多孔質無機粒子は、一般に全細孔容積の少なくとも40%が約600Å〜約1600Åの直径の細孔を有するように、細孔径分布を有することができる。一実施形態では、全細孔容積の約40%〜約90%が、約600Å〜約1600Åの直径の細孔を有する。
好ましい実施形態では、全細孔容積の少なくとも20%が、約1000Å〜約1600Åの直径の細孔を有する。別の実施形態では、全細孔容積の約20%〜約60%が、約1000Å〜約1600Åの直径の細孔を有する。
別の実施形態では、全細孔容積の少なくとも15%が、約1200Å〜約1500Åの直径の細孔を有する。他の実施形態では、全細孔容積の約15%〜約30%が、約1200Å〜約1500Åの直径の細孔を有する。
多孔質無機粒子は、少なくとも約0.8、又は少なくとも約0.9、又は少なくとも約1.0、又は少なくとも約1.1、又は少なくとも約1.2、又は少なくとも約1.3、又は少なくとも約1.4、又は少なくとも約1.5の細孔径分布に関して相対スパンを有することができる。いくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、少なくとも約0.8、又は少なくとも約0.9、又は少なくとも約1.0、又は少なくとも約1.1、又は少なくとも約1.2、又は少なくとも約1.3、又は少なくとも約1.4、又は少なくとも約1.5から最大約2.0まで全ての細孔径分布に関して相対スパンを有する。
多孔質無機粒子は、典型的に、約1ミクロン(μm)〜約150μmの範囲の光散乱測定によって測定される粒径を有する。多孔質無機粒子は、典型的に、少なくとも約1μm、より典型的には約120μm未満のメジアン粒径を有する。いくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、約10〜約120μm、より望ましくは約30〜約120μmの平均粒子寸法を有する。他の実施形態では、多孔質無機粒子は、約50〜約90μmの平均粒子寸法を有する。望ましい一実施形態では、多孔質無機粒子は、約70μmの平均粒子寸法を有する。
多孔質無機粒子は、典型的に、不規則な形状を有するが、任意の形状(例えば、球形、楕円形など)を有してもよい。形状に関わらず、多孔質無機粒子は、典型的に、本明細書に論じられる平均粒子寸法を有する。
多孔質無機粒子は、典型的に、例えば透過電子顕微鏡(TEM)技法を使用して測定して、少なくとも約1.0のアスペクト比を有する。本明細書で使用される場合、「アスペクト比」という用語は、(i)多孔質無機粒子の平均粒子寸法と(ii)多孔質無機粒子の平均断面粒子寸法との間の比率を説明するために使用され、この断面粒子寸法は、多孔質無機粒子の最大粒子寸法に対して実質的に垂直である。本発明のいくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、少なくとも約1.1(又は少なくとも約1.2、又は少なくとも約1.3、又は少なくとも約1.4)から最大約5.0のアスペクト比を有する。典型的に、多孔質無機粒子は、約1.0〜約1.5のアスペクト比を有する。
多孔質無機粒子は、BET窒素吸着方法(すなわち、Brunauer Emmet Teller法)によって測定して、少なくとも約10m2/g、又は少なくとも約20m2/g、又は少なくとも約25m2/g、又は少なくとも約30m2/gの表面積を有することもできる。本発明の例示的な一実施形態では、多孔質無機酸化物粒子は、約20m2/g〜約200m2/g、又は25m2/g〜約150m2/g、又は約30m2/g〜約100m2/gのBET表面積を有する。本発明の更なる例示的な実施形態では、多孔質無機酸化物粒子は、約20m2/g〜約500m2/g、又は約20m2/g〜約200m2/g、又は約20m2/g〜約100m2/gのBET表面積を有する。
多孔質無機粒子は、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない様々な無機材料を含んでもよい。望ましい一実施形態では、多孔質無機粒子は、シリカを含む。多孔質無機粒子がシリカを含む場合、粒子は、望ましくは粒子の総重量に基づいて少なくとも約93重量%のSiO2、又は少なくとも約93重量%のSiO2、少なくとも約94重量%のSiO2、少なくとも約95重量%のSiO2、少なくとも約96重量%のSiO2、少なくとも約97重量%のSiO2、又は少なくとも約98重量%のSiO2から最大100重量%のSiO2の純度を有するシリカを含む。
本発明は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を作製する方法も対象とする。例示的な一方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約600オングストローム(Å)〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンとを有し、多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることを含む。別の例示的な方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることとを含む。更に別の例示的な方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約20m2/g〜約100m2/gの平均BET表面積と、少なくとも約1mL/gの平均細孔容積と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質とを含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることとを含む。
多孔質無機粒子は、様々な多孔質無機材料から調製されてもよい。いくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、多孔質沈降無機酸化物、無機酸化物ゲル、及びヒュームド酸化物を含む。
ゲルを含む実施形態では、本粒子は、SiO2を含むゲルなどであるが、これらに限定されない多孔質無機酸化物ゲルから誘導される。ゲルは、ハイドロゲル、エアロゲル、又はキセロゲルであってもよい。ハイドロゲルは、水中で形成され、結果としてその細孔が水で充填される、アクアゲルとしても知られる。キセロゲルは、水を除去したハイドロゲルである。エアロゲルは、水が除去されたときにゲルの構造中の任意の崩壊又は変化を最小限に抑えるような方法で液体が除去されたキセロゲルの一種である。
ゲルは、当該技術分野において周知である。Illerの「The Chemistry of Silica」,p.462(1979)を参照されたい。ゲル、例えばシリカゲルの粒子は、コロイダルシリカ又は沈降シリカ粒子と区別できる。例えば、コロイドシリカは、濃密な非多孔質シリカ粒子のスラリーとして調製される。コロイドシリカ粒子は、典型的に200nm(0.2ミクロン)よりも小さい。前述のように、これらの粒子は、内部多孔性を有しない。一方で典型的な分散沈降粒子は、いくらかの内部多孔性を有する。しかしながら、場合によって、典型的に沈降した粒子中の内部多孔性は、乾燥中に水が蒸発するにつれて、水のメニスカスを後退させることによってもたらされる毛管圧下で大幅に降下する。コロイドシリカ及び沈降シリカを作製するための条件は周知である。
一方、ゲルは、一次粒子(典型的に、透過型電子顕微鏡、すなわちTEM下で測定して、約1〜約10nmのメジアン粒径を有する)の癒合を促進する条件下で調製され、比較的剛性の3次元ネットワークを形成する。ゲルの癒合は、無機酸化物、例えばシリカの分散体が、構造統合性を有する「ゲル」又は「ゲル状」塊に硬化するとき、マクロ量で呈される。
無機酸化物ゲルを調製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、シリカゲルは、アルカリ金属ケイ酸塩(例えば、ケイ酸ナトリウム)の水性溶液を、硝酸又は硫酸などの強酸と混合することによって調製され、この混合は、約30分未満でハイドロゲル、すなわちマクロゲルに固化する透明なシリカゾルを形成するために好適な撹拌条件下で行われる。その後、得られるゲルを洗浄する。ハイドロゲル中に形成される無機酸化物、すなわちSiO2の濃度は、通常、約10〜約50重量%の範囲内、好ましくは約20〜約35重量%、最も好ましくは約30〜約35重量%の範囲内であり、そのゲルのpHは約1〜約9、好ましくは1〜約4である。広範囲の混合温度を用いることができ、この範囲は、典型的に約20〜約50℃である。
新たに形成されたハイドロゲルは、単に連続的に動く水流に浸すことによって洗浄され、望ましくない塩を浸出し、約99.5重量%以上の純粋な無機酸化物を残す。
洗浄水のpH、温度、及び期間は、表面積(SA)及び細孔容積(PV)などのシリカの物理特性に影響を及ぼす。65〜90℃、pH8〜9で約15〜約36時間洗浄されたシリカゲルは、通常、約250〜約400m2/gのSAを有し、約1.4〜約1.7mL/gのPVを有するエアロゲルを形成する。pH3〜5、約50〜約65℃で約15〜約25時間洗浄したシリカゲルは、約700〜約850m2/gのSAを有し、約0.6〜約1.3mL/gのPVを有するエアロゲルを形成する。これらの測定値は、周知のN2多孔性方法によって生成される。ハイドロゲルは、ゲル中の水分が約20%未満、好ましくは約10%未満、及びより好ましくは約5重量%未満になるまで、ハイドロゲル床を通じて100〜180℃の範囲の温度で空気を吹き込むことによって乾燥させる。キセロゲルを作製するためのプロセスは、米国特許第6,565,905号及び同第5,622,743号に見出すことができる。
米国特許第4,157,920号に記載されるものなどの強化沈降シリカを使用して、本発明のクロマトグラフィー媒体を調製することもできる。その特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、強化沈降シリカは、まず、アルカリ無機ケイ酸塩を酸性にし、初期沈降物を創出することによって、調製することができる。次いで、生じた沈降物は、更なるケイ酸塩及び酸によって、強化されるか、又は「事後調整される」。ケイ酸塩及び酸の第2の添加から生じた沈降物は、最初に調製された沈降物の10〜70重量%を含む。この沈降物の強化構造は、第2の沈降の結果として、従来の沈降物よりも剛性であると考えられる。粉砕、遠心分離、及び後続の乾燥後であっても、強化ケイ酸塩は、そのネットワーク剛性及び多孔性を実質的に維持すると考えられる。これは、米国特許第5,030,286号に開示されるものなどの他の沈降シリカとは対照的である。
別の実施形態では、無機酸化物は、ヒュームドシリカを含む。ヒュームドシリカは、ドイツ特許第762723号に記載されるプロセスを使用して製造されてもよい。ヒュームドシリカの生成は、Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,Vol.A23,1993.Chapter 6にも論じられている。
一旦、多孔質粒子が形成されると、その後、それらは粉砕される。一般的な粉砕条件は、供給材料、滞留時間、インペラ速度、及び粉砕媒体粒径に応じて異なり得る。これらの条件は、約1〜約120ミクロンの範囲内の所望のサイズを得るように変えることができる。所望の粒径を得るようにこれらの条件を選択及び修正するための技法は、当業者に既知である。多孔質無機酸化物粒子を粉砕するために使用される粉砕装置は、材料を激しく粉砕し、例えば機械的作用を通じて約1〜約120ミクロンのサイズを有する粒子に低減することができる種類であるべきである。かかるミルは、この目的に特に好適なハンマーミル及びサンドミルと共に市販されている。ハンマーミルは、高速金属刃を通じて必要な機械的作用を付与し、サンドミルは、ジルコニア又はサンドビーズなどの急速撹拌媒体を通じて作用を付与し、インパクトミルを使用することもできる。インパクトミル及びハンマーミルの両方は、金属刃を用いる無機酸化物のインパクトによって粒径を低減する。本発明における使用のための他の好適な粉砕器としては、空気分級ミル(ACM)又は流体エネルギーミル(FEM)が挙げられるが、これらに限定されない。粉砕された無機酸化物粒子は、粉砕プロセス中に行われない場合、空気分級器を使用して分級されてもよい。
本発明の一実施形態では、その後、粉砕された多孔質無機粒子を約100〜約400℃で約2〜約20時間、約8〜約10のpHで熱水処理される。代替として、熱水処理は、米国特許第5,976,479号、同第4,732,887号、及び同第4,104,363号に記載されるように行われてもよい。熱水処理の条件は、粒子の細孔容積、表面積、細孔径、及び構造統合性に影響を及ぼす。
多孔質無機酸化物粒子は、所望の材料への無機酸化物粒子表面の結合を選択的に強化するように、表面修飾(すなわち、官能化)されてもよい。例えば、多孔質無機酸化物粒子は、例えば、クロマトグラフィーカラムを通じて処理される所与の流体内の1つ又は2つ以上の材料に選択的に結合するように、それに結合される1つ又は2つ以上の化学部分の形態で表面化学を更に含むことができ、本明細書では官能化表面と称される。二官能性リガンドなどの化学部分は、例えば、W.R.Grace & Co.−Conn.に帰する米国特許第7,166,213号に記載されるように、粒子表面に結合されてもよく、この主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、この固定/結合相、又はクロマトグラフィー媒体は、粒子の官能化表面の一部として活性基又はリガンドを含み、典型的にいくつかの結合を介して粒子に共有結合している。リガンドは、別の分子成分、この場合は標的生体分子との特異的な相互作用を示す任意の化学種であってもよい。既知のリガンドとしては、荷電基(スルホン酸、第4級アンモニウム、ジエチルアミノエチル、カルボキシルメチルなど)、合成染料、アルキル及びアリール化合物(ホウ酸フェニル、オクチルなど)、タンパク質、レクチン、抗体、抗原、酵素などが挙げられるが、これらに限定されない。クロマトグラフィー技法によって分離され得る化合物である結紮としては、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、抗原、レクチン、DNA、RNA、抗生物質などの様々な生体分子が挙げられる。
本発明の一実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることを含む。一実施形態では、無機酸化物粒子の表面部分は、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を提供するように、(i)多孔質無機粒子上のヒドロキシル基(例えば、シラノール基)と(ii)シランとの反応から生じる反応生成物を含む官能化表面を提供するようにシランで処理される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることを含み、少なくとも1つの反応物質は、エポキシシランを含む。例えば、図3を参照されたい。得られた官能化表面は、多孔質無機粒子上のヒドロキシル基とエポキシシランとの間の反応から生じる反応を含む。所望の一実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることを含み、少なくとも1つの反応物質は、(3−グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシランを含むエポキシシランを含む。この実施形態では、得られる官能化表面は、多孔質無機粒子上のヒドロキシル基と(3−グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む。
本発明の別の実施形態では、多孔質無機粒子の官能化表面は、ジオールを含む。この実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、ジオールを形成するように、シラン上の少なくとも1つの官能基(エポキシ環)を2つのヒドロキシル基に変換することを含むことができる。例えば、図3を参照されたい。この実施形態では、得られる官能化表面は、望ましくは、(i)ジオールと、(ii)多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む。例えば、いくつかの実施形態では、表面ジオール基は、約30〜約150μmol/gの範囲の量(又はその間の、30及び150μmol/gを含む、1.0μmol/gの増分での任意の量、又はその間の、30及び150μmol/gを含む任意の量の範囲、例えば、約32〜約45μmol/g)で多孔質無機粒子中に存在する。いくつかの実施形態では、表面ジオール基は、約50〜約100μmol/gの範囲の量で多孔質無機粒子中に存在する。
本発明の別の実施形態では、多孔質無機粒子の官能化表面は、アルデヒドを含む。この実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、本明細書で上述される方法を使用するシリカの表面上の少なくとも1つのジオール基を形成することと、少なくとも1つのジオールをアルデヒド基に変換することと、少なくとも1つのアルデヒド基を所望のタンパク質上の少なくとも1つの遊離アミノ基と反応させてイミン基を形成することと、そのイミン基をアミノ基に還元することとを含む。例えば、図3を参照されたい。
本発明の更に別の実施形態では、多孔質無機粒子の官能化表面は、該多孔質無機粒子の表面に(例えば、リンカー分子のうちの少なくともいくつかを介して)共有結合したタンパク質を含む。これらの実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、タンパク質を、アミン基を介して官能化表面に共有結合することを更に含むことができる。例えば、図3を参照されたい。得られる官能化表面は、望ましくは、(i)多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質と、(ii)多孔質無機粒子の未反応のヒドロキシル基とを含む。望ましい一実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、組み換えプロテインA(rProA)を、アミン基を介して官能化表面に共有結合することを含む。得られる官能化表面は、多孔質無機粒子の表面に共有結合した組み換えプロテインA(rProA)を含む。存在する場合、タンパク質は、典型的に、約4.0〜約16mg/mLの範囲の量で多孔質無機粒子中に存在する。望ましい一実施形態では、タンパク質は、約5.0〜約12mg/mLの範囲の量で多孔質無機粒子中に存在する。
一般に、本発明の上記クロマトグラフィー媒体は、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を含む官能化表面を有する。いくつかの実施形態では、媒体は、該多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1.1〜約2.5個のリンカー分子を含む、官能化表面を含む。他の実施形態では、媒体は、該多孔質無機粒子の1平方ナノメートル当たり平均約1.3〜約2.0個のリンカー分子を含む官能化表面を含む。
親和性カラム内で使用されるとき、いくつかの所望の実施形態では、本発明の上記クロマトグラフィー媒体は、図5Aに示されるように、約20.0ng/mL未満(又はその下の、20.0ng/mLを含み、0.1ng/mLの増分での任意の値、例えば、4.8ng/mL、又はその下の、20.0ng/mLを含む任意の範囲、例えば、0超〜約10ng/mL)の非特異的タンパク質結合レベルを有する。一実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、親和性カラム内で使用されるとき、約5.0ng/mL未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する。
いくつかの所望の実施形態では、本発明の上記のクロマトグラフィー媒体は、親和性カラム内で使用されるとき、図5Bに示されるように、少なくとも30mg/mL(又はその上の、30mg/mLを含み、0.1mg/mLの増分での任意の値、例えば、60.8mg/mL、又はその上の、30mg/mLを含む任意の範囲、例えば、約41.2〜約85.2mg/mL)の動的結合能も有する。一実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、親和性カラム内で使用されるとき、約30〜約90mg/mLの動的結合能を有する。
上述されるように、本発明は、図1〜2に示されるクロマトグラフィーカラム100などのクロマトグラフィーデバイスを更に対象とする。一実施形態では、本発明のクロマトグラフィーデバイスは、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備え、クロマトグラフィー媒体は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を含む。クロマトグラフィーデバイスのデバイス筐体は、管状筐体部材と、少なくとも1つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを備える。デバイス筐体は、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含むことができる。一実施形態では、デバイス筐体は、生分解性ポリマー材料を含む。別の実施形態では、デバイス筐体は、ステンレス鋼などの金属材料を含む。
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、充填済みの使い捨てカラムを備える。
本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、約20.0ng/mL未満の非特異的タンパク質結合レベルを有するクロマトグラフィー媒体を含む。本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、約5.0ng/mL未満の非特異的タンパク質結合レベルを有するクロマトグラフィー媒体を含む。本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、少なくとも30mg/mLの動的結合能を有するクロマトグラフィー媒体を含む。本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、約30〜約90mg/mLの動的結合能を有するクロマトグラフィー媒体を含む。
本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、親和性カラムを備える。望ましくは、クロマトグラフィー媒体が約1000cm/時の線速度で運転されるとき、クロマトグラフィーデバイスは、0.034MPa(5.0バール)のデバイス背圧を有する。
本発明のクロマトグラフィーカラム、例えば、例示的なクロマトグラフィーカラム100は、所与の適用における使用のために調整されてもよい。適用に関わらず、本発明のクロマトグラフィーカラム、例えば例示的なクロマトグラフィーカラム100は、様々なクロマトグラフィーシステムに挿入できるように寸法決定することができる。図2は、図1に示されるクロマトグラフィーカラムを備える例示的なクロマトグラフィーシステム200の図を表す。
図2に示されるように、例示的なクロマトグラフィーシステム200は、以下の構成要素、すなわち、クロマトグラフィーカラム100、溶剤溜まり201、ポンプ202、プレカラム203、注入ポート204、検出器206、レコーダー/モニター207、及び排出物回収器208を備える。図2に示されていないが、クロマトグラフィーカラム100は、クロマトグラフィーシステム、例えば例示的なクロマトグラフィーシステム200における使用に適した他のシステム構成要素と併せて使用されてもよく、他のシステム構成要素としては、複数の溶剤溜まり201、真空ポンプ、フロースプリッター、圧力ゲージ、脱気器、分画回収器などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法も対象とする。一実施形態では、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体をデバイス(例えば、カラム)筐体に組み込むことを含む。クロマトグラフィーデバイスを作製する方法は、1つ又は2つ以上の追加の工程を更に含んでもよい。好適な追加の工程としては、熱形成工程(例えば、任意の成形工程、例えば、射出成形)を介してデバイス筐体を形成することと、多孔質無機酸化物粒子を非NaOH溶液に曝露することによって、カラム筐体内に位置付けられた多孔質無機酸化物粒子を洗浄することと、1つ又は2つ以上の検証試験を介してクロマトグラフィーカラムを検証することと、洗浄、検証されたクロマトグラフィーカラムを出荷可能な容器に包装することとを含むが、これらに限定されない。
開示される方法では、熱形成工程を介してデバイス筐体を形成する工程は、管状筐体部材と、少なくとも1つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを熱形成する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、熱形成工程は、(i)第1の開端及び反対の閉端を有する管状筐体部材(すなわち、カラム筐体出口を中に有する一体形成されたエンドキャップ)と、(ii)別個かつ管状筐体部材の開端に取り付け可能な第1の管状筐体部材エンドキャップとを熱形成することを含む。他の実施形態では、熱形成工程は、(i)反対開端を有する管状筐体部材、(ii)別個かつ管状筐体部材の第1の開端に取り付け可能な第1の管状筐体部材エンドキャップ、及び(iii)別個かつ管状筐体部材の第2の開端に取り付け可能な第2の管状筐体部材を熱形成することを含み、第2の管状筐体部材エンドキャップが、第1の管状筐体部材エンドキャップの反対の管状筐体部材エンドキャップに取り付け可能である。
本発明は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスを使用する方法を対象とする。一実施形態では、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を使用する方法は、クロマトグラフィー媒体を親和性カラムに組み込む工程を含む。一実施形態では、本明細書に記載されるクロマトグラフィーデバイスを使用する方法は、クロマトグラフィーデバイスをクロマトグラフィーシステム、例えば、図2に示されるようなシステムの操作位置内に位置付ける工程を含む。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスを使用する方法は、親和性カラム又はクロマトグラフィーデバイスを通じて流体を処理することを更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスを使用する方法は、1つ又は2つ以上の生体分子を含有する流体を、親和性カラム又はクロマトグラフィーデバイスを通じて処理することを含む。例えば、流体は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体(例えば、モノクローナル抗体)、ウイルス、ワクチン、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
一実施形態では、カラム100上の分離のための1つ若しくは2つ以上の検体(標的分子)又は物質は、カラム入口154を介して添加される。出口158から出て床空間151に入る移動相は、分布チャネル160にわたって均等に分布し、フィルター159を通過した後、粒子媒体151の床を通じて均一に溶出される。移動相は、カラム出口155を通ってカラムから出る。
本発明のクロマトグラフィーデバイスを使用する開示される方法、例えば例示的なクロマトグラフィーカラム100は、有利に、クロマトグラフィーシステム(例えば、図2に示される例示的なクロマトグラフィーシステム200)内の定置洗浄工程を含まない。換言すれば、所与のクロマトグラフィーシステム、例えば図2に示される例示的なクロマトグラフィーシステム200上で、定置洗浄を有する必要なく、複数回の運転を行うことができる。代わりに、所与のクロマトグラフィーカラムが使用され、洗浄する必要があるとき、使用されるクロマトグラフィーカラムは、置換クロマトグラフィーカラムと置換され、クロマトグラフィーシステムは、定置洗浄工程と関連した遅延なしに操作し続ける。
本発明の開示されるクロマトグラフィーデバイスを使用する開示される方法は、クロマトグラフィーデバイスをユーザに提供する工程を含んでもよく、この提供工程は、充填済み及び検証済みのクロマトグラフィーカラムをユーザに提供することを含む。この工程は、ユーザが1つ又は2つ以上のカラム調製工程を行う必要性を排除し、更にユーザの時間及び処理能力の効率的使用を可能にする。
使い捨てクロマトグラフィーカラムを使用する方法は、1つ又は2つ以上の生体分子を試料から分離するために好適であり得る。任意の特定の適用に限定されないが、本発明の使い捨てクロマトグラフィーカラムを使用する方法を使用して、1つ又は2つ以上の生体分子を試料から分離することができ、この1つ又は2つ以上の生体分子は、少なくとも1つのタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、多糖類、脂質、核酸、代謝物、ウイルス、ワクチン、又は任意のそれらの組み合わせから選択される。
例示的な実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、本明細書で述べられる結合相の全てを含む様々な適用、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除などにおいて使用することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、免疫グロブリンの単離のためのプロトコルにおいて頻繁に使用される。アニオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの負電荷アミノ酸側鎖は、クロマトグラフィーマトリックスの正電荷リガンドと相互作用する。一方でカチオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの正電荷アミノ酸側鎖は、クロマトグラフィーマトリックスの負電荷リガンドと相互作用する。疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)は、記載される別の方法であり、免疫グロブリンの単離のためのプロトコルにおいて使用され、高純度の免疫グロブリンが対象である場合、HICを1つ又は2つ以上の更なる工程と組み合わせることが一般に推奨される。HICにおいて、免疫グロブリンをHICマトリックスに対して効率的に結合させるために、リオトロピック塩の移動相への添加が必要である。結合された免疫グロブリンは、リオトロピック塩の濃度を低下させることによってマトリックスからその後放出される。親和性クロマトグラフィーは、ロックキー認識の原理において、標的生体分子と生体特異的リガンドとの間の特異的相互作用に基づく。したがって、標的及びリガンドは、親和性の対、例えば抗原/抗体、酵素/受容体などを構成する。プロテインA、プロテインG、及びプロテインL親和性クロマトグラフィーなどのタンパク質系親和性リガンドは周知であり、いずれも抗体の単離及び精製のための普及した方法である。プロテインAクロマトグラフィーが、特にモノクローナル抗体に対して顕著な特異性を提供し、結果として高い純度が得られることは周知である。イオン交換、疎水性相互作用、ハイドロキシアパタイト、及び/又はゲルろ過工程と併せて使用されるとき、プロテインAに基づく方法は、多くの生物製剤会社が選択する抗体精製方法となった。例えば、国際特許公開第8400773号、及び米国特許第5,151,350号を参照されたい。
例示的な実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、混合モード又はマルチモード分離マトリックス又は媒体などの様々な適用において使用されてもよい。「マルチモード」分離媒体という用語は、結合される化合物と相互作用する、少なくとも2つの異なるが協働する部位を提供することができるマトリックスを指す。例えば、これらの部位のうちの1つは、リガンドと対象の物質との間の電荷−電荷相互作用の魅力的な種類を付与することができる。他の部位は、電子受容体−供与体相互作用並びに/又は疎水性及び/若しくは親水性相互作用を付与することができる。例えば、米国特許第7,714,112号を参照されたい。加えて、本発明の多孔質粒子は、拡張された床吸着において(例えば、米国特許第6,620,326号を参照)、精製性能を向上させるための膜の一部として(例えば、米国特許出願公開第2011/0049042号を参照)使用されてもよく、流動化床吸着を伴う適用において(例えば、米国特許出願公開第2005/0269257号を参照)、及び広い細孔材料を使用する精製又は吸着に適した任意の他の適用において使用されてもよい。
本発明は、以下の実施例によって更に説明されるが、これらはいかなる方法においても、その範囲に制限を課するものとして解釈されるものではない。反対に、様々な他の実施形態、修正、及びそれらの同等物に依ることができることは明らかに理解されるものであり、これは本明細書の説明を読めば、本発明の趣旨及び/又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、それら自体が当業者に示唆され得る。
以下の実施例は、(i)官能化表面を有するクロマトグラフィー媒体、つまりプロテインAを付着させたシリカを調製するための本発明によるプロセス、並びに(ii)カラム充填物を含む材料の評価及びカラムの使用を説明する。これらの実施例に示される本発明の一実施形態は、以下の工程、すなわち、大きな細孔シリカを(3−グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシランと結合させ、続いて硫酸加水分解を行って初期結合ジオールシラン中間物を形成すること、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化によってジオール基をアルデヒド基に変換すること、プロテインAを官能化シリカでインキュベートすること、及び最後に還元アミン化からなるプロセスによって調製されたシリカ粒子を官能化することに関する。かかるプロセスは、図3と同様に示される。
実施例において報告されるメジアン粒径は、Malvern Instruments Ltd.からASTM B822−10として入手可能なMalvern Mastersizer 2000を使用して光散乱により決定された。メジアン細孔径分布は、Micromeritics Instruments Corpから入手可能なAutopore IV 9520を使用して水銀圧入によって測定された。本明細書で言及される細孔容積は、100〜10,000Åサイズの細孔への水銀圧入を表す。BET表面積は、窒素吸収分析から得られた。
粒径(PS)は、容積分布によってメジアン粒径として定義される。PS50は、中間点粒径を表し、粒子の50%が中間点粒径よりも小さく、50%が中間点粒径よりも大きい。同様に、PS90は、粒子の90%が粒径点よりも小さく、10%がそれよりも大きい粒径点を表す。いくつかの実施例では、約70μmのメジアン粒径(PS50)を有するシリカゲルを用いた。メジアン細孔径(PD50)は、細孔容積の50%がより小さい細孔から寄与され、50%がより大きい細孔から寄与される中間点として定義される。「相対スパン」という用語は、細孔径分布の帯域の尺度を意味するものとして定義される。「スパン」は、水銀ポロシメトリによって測定される、PD10(すなわち、細孔容積の10%が存在する細孔径)をPD90細孔径(すなわち、その下に細孔容積の90%が存在する細孔径)を差し引くことによって測定される。「相対スパン」という用語は、(PD90−PD10)/PD50の比率として定義される(図4)。
シリカゲルは、以下の手順を使用して調製された。190gの19%硫酸溶液を、オーバーヘッド撹拌器を備える反応器内に置き、5℃に冷却した。別個に、263gのケイ酸ナトリウムの溶液(22.9重量%のSiO2)も5℃に冷却した。その後、ケイ酸ナトリウム溶液を、ケイ酸塩の全量を15分で添加するような速度でポンプを介して硫酸溶液に添加した。添加中、温度は5℃で維持した。添加が完了した後、反応器を室温に温め、内容物を撹拌せずにゲル化させた。ゲル化時に、ゲル塊を小片に切断し、反応中に形成された硫酸ナトリウムを除去するために水に沈めた。洗浄水を排出し、新鮮な水をゲルに添加しながら、材料中に残留する硫酸ナトリウムのレベルを定期的にチェックした。レベルが1%より下に低下したとき、ゲルを水中に懸濁し、液体のpHをpH=9.7に調整し、溶液を67℃に加熱した。この温度を20時間20分間維持した。加熱期間の最後に、ゲルをろ過によって回収し、ゲルの含水量が約5重量%未満になるまで160℃のオーブンで乾燥させた。
したがって、得られたシリカゲルは、325m2/gの窒素BET表面積及び1.24mL/gの窒素細孔容積を有した。円筒形細孔を想定し、細孔径(オングストローム)=40000×PV/SAという等式を使用すると、この材料は、上述されるような細孔径を呈した。その後、ACMを使用してゲルを所望の粒径(70ミクロン)に粉砕し、その後所望の細孔径が達成されるまで300℃のオートクレーブ内で熱水処理する。
LECO Corpから入手可能なLECO炭素分析器SC−632を使用して、炭素含有量の元素分析を行った。シリカの純度は、Shimadzu Corp.から入手可能なICPE−9000を使用し、誘導結合プラズマ(ICP)によって測定した。
本発明のシリカゲル粒子の細孔径分布は、本明細書に記載される方法によって調べた。
[0112]
動的結合能は、クロマトグラフィー媒体(100mMのNaCl溶液中でスラリー化)を0.66cm径のOmnifitカラム(Kinesis USA)に最終床高10cmまで充填することによって決定した。10mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液(pH 7.4)中の2.0mg/mLのヒトポリクローナルIgG(hIgG)溶液(Sigma Aldrich Corporationから市販)を、GE Healthcare(GEHC)からのAKTA Explorer FPLCシステムを使用して、200cm/時の線流速度でカラム上に負荷した。hIgGの破過は、UV900(GEHC)を使用し、280nmでのUV−Visシグナルによって測定し、GEHCからのUnicomソフトウェアを用いてクロマトグラムを記録してプロットした。動的能力は、未結合のIgG3フロースルー分画及びシステムホールドアップ体積に対して訂正した後、5%破過で決定した。
大きいカラム(2.2×20cm2又は20mL)を使用して、修飾された多孔質無機材料で充填されたカラムの圧力低下(背圧)を評価した。典型的に、圧力は、AKTAシステムを用いて、脱イオン化水中100mMのNaCl溶液の1000cm/時の線速度で得られた。
プロテインAリガンド相互作用に非特異的な表面タンパク質結合の量は、プロテインA誘導体化シリカを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素(HRP)(Life Technologiesから市販)に共役されたストレプトアビジンタンパク質と相互作用させることによって決定した。100μLのプロテインAシリカを、pH7.5のリン酸生理緩衝液(PBS)中83ngのストレプトアビジン−HRPと周囲温度で30分間混合した。試料をPBSで繰り返し洗浄して、残留ストレプトアビジン−HRPを溶液から除去した。ストレプトアビジン−HRPの希釈液を、標準として使用するために調製した。テトラメチルベンジジンHRP基質(TMB)(Life Technologiesから入手可能)を添加して、試料及び標準を調製し、周囲温度で4分間、混合しながらインキュベートした。1Nのリン酸の添加によって反応を停止させた。各試料中に残留するストレプトアビジン−HRPの量は、作成された標準曲線を使用する分子デバイスSpectraMax M2マイクロプレートリーダーを使用して、450nmの波長で酸化形態への基質変換を測定することによって決定した。初期結合(プロテインA結合前)材料も、記載されるものと同様の手順によって、HRPタンパク質の非特異的タンパク質結合についてチェックした。
[0115]
リンカー結合(初期結合):官能化多孔質シリカ粒子の試料は、シリカ粒子を(3−グリシドオキシプロピル)トリメトキシシラン(Sigma Aldrich Corporation又はGelest Inc.から市販)で処理することによって調製した。丸底フラスコに多孔質シリカを充填し、(3−グリシドオキシプロピル)−トリメトキシシランの量をフラスコに添加した。混合物を室温で終夜回転させた。その後、シリカを1Mの硫酸に30分間浸し、ろ過した。その後、DI水で5回洗浄し、ろ過して、70℃で終夜乾燥させた。得られる試料を、それぞれシリカ上の炭素のパーセンテージについての元素分析(LECO)に供した。リンカー分子を含む官能化表面のケイ酸は、下の式によるC%に基づいた。
プロテインAを、アルデヒドを産生するためのNalO4による表面ジオール基の酸化に続いて、表面アルデヒド基によるプロテインA鎖上の遊離アミン基のシフ塩基形成を必要とする、周知の化学反応(例えば、国際公開第19900237号)を使用して官能化シリカ粒子に固定化した(プロテインAは、Repligen Bioprocessingから商品名rSPAとして入手される組み換えプロテインAであった)。水素化ホウ素ナトリウムを添加して、シフ塩基(イミン)中間物(還元アミン化)を安定した二次アミン結合及びアルコール基に対する未反応のアルデヒドに還元した。(図3)。
固定化したプロテインAの量は、未反応のプロテインAの量を、反応に使用されるプロテインAの総量から差し引くことによって決定した。プロテインAの濃度は、分光光度計を用いてUV−Visによって280nmで測定した。
[実施例1〜8]
実施例1〜8は、異なる量の表面リンカー基、及びIgG結合能及び非特異的タンパク質結合に対するその影響を明示する(図5)。これらの実施例では、同じバッチのシリカゲルを使用し、他のプロセス条件を全て同様に保持した。シリカゲルのメジアン粒子分布(PS50)は70μmであり、シリカのメジアン細孔径(PD50)は、約1150Åであり、同じ量のプロテインAが各試料に組み込まれる。
これらの試料の結果を下の表1に記録した。
表1及び図5A、5B、及び5Cから、リンカー集団が1.8を超えると、DBCが減少し始めたことがわかる。一方、リンカー結合材料に対する非特異的タンパク質結合は、少量のリンカー分子密度を用いる場合よりもはるかに高い。
[0121]
実施例1〜8において使用される未修飾のシリカゲルをカラムに充填し、非特異的タンパク質結合を測定した。試料は、約76ng/mLの高い非特異的タンパク質結合を示した。
[0122]
メジアン細孔径及び細孔径分布の、IgG結合能に対する効果を比較するため、メジアン粒径(約70μm)のシリカゲル粒子を、上記の手順を使用して修飾した。実施例9〜12の結果を下の表2に示す。
図6は、実施例9〜12のそれぞれにおいて使用されるシリカの細孔分布を示す。表2及び図6から、70%、40%、19%それぞれの%PV1、%PV2、及び%PV3を有する官能化多孔質シリカ粒子(図10に示される)は、41mg/mLの最高結合能を付与すると結論することができる。
[0124]
メジアン粒径の、IgG結合能及びカラム背圧に及ぼす効果を比較するために、異なるメジアン粒径であるが、実施例10と同じメジアン細孔径及び分布を有するシリカゲル粒子は、上記の一般手順を使用して修飾した。実施例13〜16の結果を下の表3に示す。
上の表3に示されるように、69μmのメジアン粒径を用いる実施例15は、40mg/mLを超えるDBC、及び1000cm/時の線速度で0.028MPa(4.0バール)未満の背圧を提供した。
[0126]
異なるメジアン細孔径、細孔容積、相対スパン、細孔径分布のシリカを比較するために、市販のシリカゲル又は制御細孔ガラス粒子を、シリカを結合し、プロテインAを固定化するための上記の手順で処理した。これらのシリカの特性を表4に列挙し、結果を下の表5にまとめる。
表4では、シリカAは、現在Daiso Co.Ltd.によって製造され、商品名Daisogel(商標)SP−2000−40/60として販売されているシリカゲルである。このシリカは、40〜60μmの粒径範囲を有する。
シリカBは、現在Fuji Silysia Chemical Ltd.によって製造され、商品名Chromatorex(登録商標)MB800−40/75として販売されているシリカゲルである。このシリカは、40〜75μmの粒径範囲を有する。
シリカCは、現在Millipore Ireland Ltd.によって製造及び販売されている、制御細孔ガラス(CPG(登録商標))1000粒子である。このシリカは、約60μmの平均粒径を有する。図7は、実施例10及び比較例4の細孔径分布の差を明示する。
本発明は、限定数の実施形態を用いて説明されたが、これらの特定の実施形態は、本明細書の他の箇所で説明及び請求されるように、本発明の範囲を制限することを意図しない。更なる修正、同等物、及び変型が可能であることは、本明細書における例示的な実施形態を検討するとき、当業者には明らかとなり得る。実施例並びに残りの本明細書におけるすべての部及び割合は、別途指定がない限り、重量で示される。更に、属性の特定のセット、計測の単位、条件、物理的状態、又はパーセンテージを表すような、明細書又は請求項において引用される数字の任意の範囲は、そのような範囲内にあるいかなる数をも、そのように引用されるいかなる範囲内の、いかなる数字のサブセットも含めて、明確に言及されている場合には文字通りに含有するように、そうでない場合には含有しないように意図されている。例えば、下限RL及び上限Ruを有する数値範囲が開示されるときはいつも、その範囲内に入る任意の数Rが具体的に開示される。特に、範囲内の以下の数が具体的に開示される。R=R1+k(Ru−R1)、式中、kは、1%増分の1%〜100%の範囲の変数であり、例えば、kは、1%、2%、3%、4%、5%...50%、51%、52%...95%、96%、97%、98%、99%、又は100%である。更に、上で計算されるRの任意の2つの値によって表される任意の数値範囲も具体的に開示される。本明細書に図示及び説明されるものに加えて、本発明の任意の修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。本明細書に引用される全ての刊行物は、参照によりそれら全体が組み込まれる。
[発明の態様]
[1]
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均1超〜約3個のリンカー分子を含む、官能化表面とを有する、クロマトグラフィー媒体。
[2]
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する、クロマトグラフィー媒体。
[3]
前記タンパク質が、前記多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を介して、前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合している、2に記載のクロマトグラフィー媒体。
[4]
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約20m2/g〜約100m2/gの平均BET表面積と、少なくとも約1mL/gの平均細孔容積と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均約1超〜約3個のリンカー分子を含む官能化表面と、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約10,000〜約100,000Dの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する、クロマトグラフィー媒体。
[5]
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約0.9の細孔径分布相対スパンを有する、1〜4のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[6]
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約0.99の細孔径分布相対スパンを有する、1〜5のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[7]
前記多孔質無機粒子が、約1.0〜約1.3の細孔径分布相対スパンを有する、1〜6のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[8]
全細孔容積の少なくとも40%が、約600Å〜約1600Åの直径を有する細孔内にある、1〜7のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[9]
全細孔容積の約40%〜約90%が、約600Å〜約1600Åの直径を有する細孔内にある、8に記載のクロマトグラフィー媒体。
[10]
全細孔容積の少なくとも20%が、約1000Å〜約1600Åの範囲の直径の細孔を有する、1〜9のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[11]
全細孔容積の約20%〜約60%が、約1000Å〜約1600Åの直径の細孔を有する、10に記載のクロマトグラフィー媒体。
[12]
全細孔容積の少なくとも15%が、約1200Å〜約1500Åの範囲の直径の細孔を有する、1〜11のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[13]
全細孔容積の約15%〜約30%が、約1200Å〜約1500Åの範囲の直径の細孔を有する、12に記載のクロマトグラフィー媒体。
[14]
前記多孔質無機粒子が、約10m2/gを超える平均BET表面積を有する、1〜3及び5〜13のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[15]
前記多孔質無機粒子が、約20m2/g〜約200m2/gの平均BET表面積を有する、14に記載のクロマトグラフィー媒体。
[16]
前記多孔質無機粒子が、約25m2/g〜約100m2/gの平均BET表面積を有する、15に記載のクロマトグラフィー媒体。
[17]
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約1mL/gの平均細孔容積を有する、1〜3及び5〜15のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[18]
前記多孔質無機粒子が、約30μm〜約120μmの平均粒子寸法を有する、17に記載のクロマトグラフィー媒体。
[19]
前記多孔質無機粒子が、約50μm〜約90μmの平均粒子寸法を有する、18に記載のクロマトグラフィー媒体。
[20]
前記多孔質無機粒子が、約70μmの平均粒子寸法を有する、19に記載のクロマトグラフィー媒体。
[21]
前記多孔質無機粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含む、1〜20のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[22]
前記多孔質無機粒子が、シリカを含む、21に記載のクロマトグラフィー媒体。
[23]
前記多孔質無機粒子が、前記多孔質無機粒子の総重量に基づいて少なくとも97重量%のSiO2を有するシリカを含む、22に記載のクロマトグラフィー媒体。
[24]
前記官能化表面が、(i)前記多孔質無機粒子上のヒドロキシル基と(ii)シランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、1〜23のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[25]
前記官能化表面が、前記粒子上のヒドロキシル基とエポキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、24に記載のクロマトグラフィー媒体。
[26]
前記官能化表面が、前記粒子上のヒドロキシル基と(3−グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、25に記載のクロマトグラフィー媒体。
[27]
前記リンカー分子のそれぞれが、ジオールを含む、1に記載のクロマトグラフィー媒体。
[28]
前記官能化表面が、(i)ジオール基と、(ii)前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、1又は27に記載のクロマトグラフィー媒体。
[29]
前記ジオールが、約30〜約150μmol/gの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、27又は28に記載のクロマトグラフィー媒体。
[30]
前記ジオールが、約50〜約100μmol/gの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、27〜29のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[31]
前記リンカー分子のそれぞれが、アルデヒドを含む、1に記載のクロマトグラフィー媒体。
[32]
前記官能化表面が、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかを介して前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質を含む、1及び5〜31のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[33]
前記官能化表面が、(i)前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合した前記タンパク質と、(ii)前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、2〜32のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[34]
前記タンパク質が、プロテインAを含む、2〜26及び32又は33のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[35]
前記前記プロテンが、組み換えプロテインA(rProA)である、2〜26及び32〜34のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[36]
前記タンパク質が、約4.0〜約16mg/mLの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、2〜29及び32〜35のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[37]
前記タンパク質が、約5.0〜約12mg/mLの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、2〜26及び32〜36のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[38]
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約20.0ng/mL未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、1〜37のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[39]
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約5.0ng/mL未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、1〜38のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[40]
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、少なくとも30mg/mLの動的結合能を有する、1〜39のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[41]
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約30〜約90mg/mLの動的結合能を有する、1〜40のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[42]
1〜41のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を作製するための方法であって、
前記多孔質無機粒子を形成することと、
前記官能化表面を形成するように、前記多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることと、を含む、方法。
[43]
前記形成工程が、ゲル化、沈降、凝集、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される粒子形成プロセスを介して、多孔質無機粒子を形成することを含む、42に記載の方法。
[44]
前記形成工程が、ゲル化プロセスを介して多孔質無機粒子を形成することを含む、42又は43に記載の方法。
[45]
前記少なくとも1つの反応物質が、シランを含む、42〜44のいずれか一項に記載の方法。
[46]
前記少なくとも1つの反応物質が、エポキシシランを含む、42〜45のいずれか一項に記載の方法。
[47]
前記エポキシシランが、(3−グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシランを含む、48に記載の方法。
[48]
ジオールを形成するように、
前記シラン上の少なくとも1つの官能基をヒドロキシル基に変換することを更に含む、45〜47のいずれか一項に記載の方法。
[49]
前記官能化表面が、(i)ジオールと、(ii)前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、42〜48のいずれか一項に記載の方法。
[50]
前記ジオールが、前記多孔質無機粒子中約30〜約150μmol/gの範囲の量で前記表面上に存在する、48又は49に記載の方法。
[51]
前記ジオールが、約50〜約100μmol/gの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、48〜50のいずれか一項に記載の方法。
[52]
少なくとも1つのジオールを
アルデヒド基に変換することを更に含む、48〜51のいずれか一項に記載の方法。
[53]
少なくとも1つのアルデヒド基を所望のタンパク質上の少なくとも1つの遊離アミノ基と反応させて、イミン基を形成することと、任意選択で、前記イミン基をアミンに還元することと、を更に含む、52に記載の方法。
[54]
イミノ又はアミノ基を介して、タンパク質を前記官能化表面に共有結合することを更に含む、53に記載の方法。
[55]
前記官能化表面が、前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質を含む、42〜54のいずれか一項に記載の方法。
[56]
前記官能化表面が、(i)前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質と、(ii)前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、42〜55のいずれか一項に記載の方法。
[57]
前記官能化表面が、前記多孔質無機粒子の表面に共有結合した組み換えプロテインA(rProA)を含む、42〜56のいずれか一項に記載の方法。
[58]
前記タンパク質が、約4.0〜約16mg/mLの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、54〜57のいずれか一項に記載の方法。
[59]
前記タンパク質が、約5.0〜約12mg/mLの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、54〜58のいずれか一項に記載の方法。
[60]
クロマトグラフィーデバイスであって、
デバイス筐体と、
前記デバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体であって、1〜41のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を含む、前記クロマトグラフィー媒体と、を含む、クロマトグラフィーデバイス。
[61]
前記デバイス筐体が、管状筐体部材と、少なくとも1つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを備える、60に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[62]
前記デバイス筐体が、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含む、60又は61に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[63]
前記デバイス筐体が、生分解性ポリマー材料を含む、60〜62のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[64]
前記デバイス筐体が、金属材料を含む、60〜63のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[65]
前記デバイス筐体が、ステンレス鋼を含む、60〜62又は64のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[66]
前記クロマトグラフィーデバイスが、充填済み使い捨てカラムを含む、60〜64のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[67]
前記クロマトグラフィー媒体が、約20.0ng/mL未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、60〜66のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[68]
前記クロマトグラフィー媒体が、約5.0ng/mL未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、60〜67のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[69]
前記クロマトグラフィー媒体が、少なくとも30mg/mLの動的結合能を有する、60〜68のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[70]
前記クロマトグラフィー媒体が、約30〜約90mg/mLの動的結合能を有する、60〜69のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[71]
前記クロマトグラフィーデバイスが、親和性カラムを含む、60〜70のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[72]
前記クロマトグラフィー媒体が、約1000cm/時の線速度で運転されるとき、前記クロマトグラフィーデバイスが、0.034MPa(5.0バール)未満のデバイス背圧を有する、60〜71のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
[73]
60〜72のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイスを作製する方法であって、
1〜41のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を、前記デバイス筐体に組み込む工程を含む、方法。
[74]
熱形成工程を介して、
前記デバイス筐体を形成することを更に含む、73に記載の方法。
[75]
前記熱形成工程が、管状筐体部材と、少なくとも1つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを熱形成することを含む、74に記載の方法。
[76]
1つ又は2つ以上の検証試験によって、
前記クロマトグラフィーデバイスを検証することを更に含む、73〜75のいずれか一項に記載の方法。
[77]
1〜41のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を使用する方法であって、
前記クロマトグラフィー媒体を親和性カラムに組み込む工程を含む、方法。
[78]
60〜72のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を使用する方法であって、
前記クロマトグラフィーデバイスを、クロマトグラフィーシステムの操作位置内に位置付ける工程を含む、方法。
[79]
前記親和性カラム
又は前記クロマトグラフィーデバイスを通じて流体を処理することを更に含む、77又は78に記載の方法。
[80]
前記流体が、1つ又は2つ以上の生体分子を含む、79に記載の方法。
[81]
前記流体が、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体、ウイルス、ワクチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、79又は80に記載の方法。
[82]
前記流体が、モノクローナル抗体を含む、79〜81のいずれか一項に記載の方法。
[83]
前記方法が、前記クロマトグラフィーシステム内での定置洗浄工程を含まない、77〜82のいずれか一項に記載の方法。
[84]
前記方法が、
前記親和性カラム又は前記クロマトグラフィーデバイスをユーザに提供することを含み、前記提供工程が、充填済み及び検証済み親和性カラム又はクロマトグラフィーデバイスを前記ユーザに提供することを含む、77〜83のいずれか一項に記載の方法。
[85]
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約600Å〜約1600Åのメジアン細孔径と、少なくとも約0.75の細孔径分布相対スパンと、全細孔容積の少なくとも約20%が、約1000Å〜約1600Åの範囲の直径の細孔を有するような細孔径分布とを有する、クロマトグラフィー媒体。
[86]
前記多孔質無機粒子が、前記多孔質無機粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均1超〜約3個のリンカー分子を含む官能化表面を有する、85に記載のクロマトグラフィー媒体。
[87]
全細孔容積の少なくとも40%が、約600Å〜約1600Åの直径を有する細孔内にある、85又は86に記載のクロマトグラフィー媒体。
[88]
全細孔容積の約40%〜約90%が、約600Å〜約1600Åの直径を有する細孔内にある、85〜87のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[89]
全細孔容積の少なくとも20%〜約60%が、約1000Å〜約1600Åの範囲の直径の細孔を有する、85〜88のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[90]
全細孔容積の少なくとも15%が、約1200Å〜約1500Åの範囲の直径の細孔を有する、85〜89のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
[91]
全細孔容積の約15%〜約30%が、約1200Å〜約1500Åの範囲の直径の細孔を有する、85〜90のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
Claims (31)
- クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質シリカ粒子を含み、前記多孔質シリカ粒子が、600Å〜1600Åのメジアン細孔径と、1.0〜2.0の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質シリカ粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均で1個より多く2.5個以下のリンカー分子を含む官能化表面とを有し、
前記多孔質シリカ粒子が、1mL/g〜2.0mL/gの細孔容積と50μm〜90μmの平均粒子寸法とを有する、
クロマトグラフィー媒体。 - 前記リンカー分子のそれぞれが、ジオールを含み、かつ/又は前記官能化表面が、(i)ジオール基と、(ii)前記多孔質シリカ粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項1に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記ジオールが、前記多孔質シリカ粒子中30〜150μmol/gの範囲の量で存在する、請求項2に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記リンカー分子のそれぞれが、アルデヒドを含む、請求項1に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記官能化表面が、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかを介して前記多孔質シリカ粒子の表面に共有結合したタンパク質を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質シリカ粒子を含み、前記多孔質シリカ粒子が、600Å〜1600Åのメジアン細孔径と、1.0〜2.0の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質シリカ粒子の表面部分に共有結合している、10,000〜100,000ダルトン(D)の範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有し、
前記多孔質シリカ粒子が、1mL/g〜2.0mL/gの細孔容積と50μm〜90μmの平均粒子寸法とを有し、
前記タンパク質が、前記多孔質シリカ粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均で1個より多く2.5個以下のリンカー分子を介して、前記多孔質シリカ粒子の表面部分に共有結合している、
クロマトグラフィー媒体。 - クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質シリカ粒子を含み、前記多孔質シリカ粒子が、20m2/g〜100m2/gの平均BET表面積と、1mL/g〜2.0mL/gの細孔容積と、1.0〜2.0の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質シリカ粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均で1個より多く2.5個以下のリンカー分子を含む官能化表面と、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合した、10,000〜100,000ダルトン(D)の範囲の分子量を有するタンパク質とを有する、クロマトグラフィー媒体。 - 前記多孔質シリカ粒子が、1.0〜1.3の細孔径分布相対スパンを有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 全細孔容積の少なくとも40%が、600Å〜1600Åの直径を有する細孔内にあり、かつ/又は全細孔容積の少なくとも20%が、1000Å〜1600Åの範囲の直径の細孔を有し、かつ/又は全細孔容積の少なくとも15%が、約1200Å〜約1500Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記多孔質シリカ粒子が、10m2/g超の平均BET表面積を有する、請求項1〜6、8及び9のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記多孔質シリカ粒子が、30μm〜120μmの平均粒子寸法を有する、請求項10に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記多孔質シリカ粒子が、前記多孔質シリカ粒子の総重量に基づいて少なくとも97重量%のSiO2を有するシリカを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記官能化表面が、(i)前記多孔質シリカ粒子上のヒドロキシル基と、(ii)シラン(例えばエポキシシラン)との間の反応から生じる反応生成物を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記官能化表面が、(i)前記多孔質シリカ粒子の表面部分に共有結合した前記タンパク質と、(ii)前記多孔質シリカ粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記タンパク質がプロテインAを含み、そして前記タンパク質が、前記多孔質シリカ粒子中4.0〜16mg/mLの範囲の量で存在する、請求項5〜7、及び14のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、20.0ng/mL未満の非特異的タンパク質結合レベルを有し、かつ/又は少なくとも30mg/mL動的結合能を有する、請求項1〜15のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を作製するための方法であって、
前記多孔質シリカ粒子を形成することと、
前記多孔質シリカ粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均で1個より多く2.5個以下のリンカー分子を含む官能化表面を形成するように、前記多孔質シリカ粒子の表面部分を少なくとも1つの反応物質と反応させることと、を含む、方法。 - 前記形成工程が、ゲル化、沈降、凝集、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される粒子形成プロセスを介して、多孔質シリカ粒子を形成することを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの反応物質が、シラン(例えば、エポシシシラン)を含む、請求項17又は18に記載の方法。
- ジオールを形成するように、前記シラン上の少なくとも1つの官能基をヒドロキシル基に変換することを更に含み、前記官能化表面が、(i)ジオールと、任意に(ii)前記多孔質シリカ粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記ジオールが、前記多孔質シリカ粒子中30〜150μmol/gの範囲の量で前記表面上に存在する、請求項20に記載の方法。
- 少なくとも1つのジオールをアルデヒド基に変換することを更に含む、請求項20又は21に記載の方法。
- 前記官能化表面が、前記多孔質シリカ粒子の表面に共有結合したタンパク質を含み、任意に、前記多孔質シリカ粒子上の未反応のヒドロキシル基も含む、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
- クロマトグラフィーデバイスであって、
デバイス筐体と、
前記デバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体であって、請求項1〜16のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を含む、クロマトグラフィー媒体と、を備える、クロマトグラフィーデバイス。 - 前記デバイス筐体が、管状筐体部材と、少なくとも1つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを備える、請求項24に記載のクロマトグラフィーデバイス。
- 前記デバイス筐体が、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含む、請求項24又は25に記載のクロマトグラフィーデバイス。
- 前記クロマトグラフィーデバイスが、親和性カラムを備え、かつ/又は前記クロマトグラフィー媒体が、1000cm/時の線速度で運転されるとき、前記クロマトグラフィーデバイスが、0.034MPa(5.0バール)未満のデバイス背圧を有する、請求項24〜26のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
- クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質シリカ粒子を含み、前記多孔質シリカ粒子が、(i)600Å〜1600Åのメジアン細孔径、(ii)1.0〜2.0の細孔径分布相対スパン、(iii)1mL/g〜2.0mL/gの細孔容積、及び(iv)全細孔容積の少なくとも20%が、1000Å〜1600Åの範囲の直径の細孔を有することとなる細孔径分布と、(v)50μm〜90μmの平均粒子寸法とを有し、
前記多孔質シリカ粒子が、前記多孔質シリカ粒子の表面積の1平方ナノメートル当たり平均で1個より多く2.5個以下のリンカー分子を含む官能化表面を有する、
クロマトグラフィー媒体。 - 全細孔容積の少なくとも40%が、600Å〜1600Åの直径を有する細孔内にあり、かつ/又は全細孔容積の20%〜60%が、1000Å〜1600Åの範囲の直径の細孔を有し、かつ/又は全細孔容積の少なくとも15%が、1200Å〜1500Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項28に記載のクロマトグラフィー媒体。
- 少なくとも1つのアルデヒド基をタンパク質上の少なくとも1つの遊離アミノ基と反応させて、イミン基を形成することと、任意に、前記イミン基をアミノ基に還元することとを更に含む、請求項22に記載の方法。
- タンパク質をイミノ又はアミノ基を介して前記官能化表面に共有結合することを更に含む、請求項30に記載の方法。
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