SE451843B - Forfarande for utvinning av en forening - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 i _ 451 845 lângsträckta molekylstruktur kan slinka igenom porerna hos det använda membranet. Teoretiskt skulle detta problem kunna undvikas genom att använda ett membran med en lägre övre cut-off-gräns, men i praktiken är det svårt att åstadkomma sådana "skräddarsydda" membran, varför pro- blemet i bästa fall kan reduceras, dock utan att eli- mineras helt ocb hållet. Därtill kommer att membran, som har en sådan lägre övre cut-off-gräns inom det i det aktuella sammanhanget lämpliga intervallet, mindre än l x 106 Dalton, kräver en komplicerad tillverkningsteknik och är därför avsevärt mycket dyrare än exempelvis de mera lättillgängliga membranen med en övre out-off-gräns kring 1 x 106 nauon eller aäföver, n e: upp :in 1oo x 105 Dalton.

Ett ändamål med uppfinningen är därför att åstadkomma ett förbättrat förfarande som utnyttjar den kända tekniken med kombinerad affinitetskromatografisk rening och ultra- filtration, men som också möjliggör användningen av de ovan beskrivna billigare membranen utan risk för läckage av den använda bäraren. Ändamålet uppnås enligt uppfinningen med det för- farande aom definieras i efterföljande patentkrav ooh som kommer att beskrivas närmare i det följande.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt uppfinningen åstadkommes således ett för- farande av det inledningsvis beskrivna slaget för ut- vinning av en förening, exempelvis en peptidinnehållsnde förening. Förfarandet kännetecknas av, att bäraren utgöres av ett makromolekylärt fast material.

Ett makromolekylärt fast material enligt uppfinningen har, till skillnad från de långsträckta lösliga bärarna enligt den kända tekniken, en mera kompakt form,som genom lämplig dimensionering kan göras tillräckligt stor för att förhindra passage genom porerns hos det används membranet, va, 10 15 20 25 30 35 451 845 även om detta skulle ha en övre cut-off-gräns kring l x 165 3 Dalton eller däröver, exempelvis upp till 100 x 105 Dalton.

Exempel på lämpliga fasta makromolekylära material är enligt uppfinningen celler, agaros, stärkelse, cellulosa, chitin, gelatin, collagen och syntetiska polymerer av typen latex och akrylderivat, samt även oorganiska material, exempelvis keramiskt material, poröst kiselhaltigt material etc, Företrädesvis används det fasta materialet i form av sfäriska partiklar med tillräckligt stor diameter för att inte kunna tränga igenom porerna hos ett membran med en övre-cut-off-gräns kring 1 x 106 Dalton eller däröver, exempelvis upp till 100 x 105 Dalton. Exempel på lämpliga diametrar är över 0,1 um, såsom mellan l och 50;1m, före- 2-10 um. så avspjälkade peptidinnehållande föreningen trädeevis Den separeraa lämpligen från den bärarbundna liganden med användning av ett semipermeabelt membran, som är genom- släppligt för nämnda förening, men ogenomsläppligt för nämnda bärarbundna ligand.

'Såsom tidigare nämnts kan liganden, som skall vara bunden på det makromolekylära fasta materialet, väljas bland inhibi antikroppar, haptener, komplementfaktorer (t ex CIQ), torer, kolhydratstrukturer, antigener, cofaktorer, enzymer, nukleinsyror, konglutinin och yt- receptorer, exempelvis bakteriella, såsom protein A och protein G, beroende på vilken typ av peptidinnehållande förening, som skall utvinnas. Ett viktigt krav, som ställs på liganden, är att den skall kunna binda med biospecifik affinitet till den önskade peptidinnehållande föreningen.

Med uttrycket “bunden på det fasta makromolekylära materialet" avses vilken som helst lämplig typ av bindning, t ex fysikalisk eller kemisk bindning. Dessutom omfattas även sådana fall, där liganden är naturligt förekommande på det fasta materialet, t ex ytstrukturer hos avdödade mikrobiella celler, exempelvis jästceller. 451 843 10 15 20 25 30 35 Enligt uppfinningen avskiljes_föroreningarna från lösningen innehållande det bildade komplexet av bära- re/ligand/peptidinnehållande förening med användning av ett semipermeabelt membran,som är genomsläppligt för dessa, men ogenomsläppligt för det bildade komplexet.

Exempel på lämpliga membran för denna rening är sådana som har ett cut-off av mellan 50.000 och 100 x 106 Dalton, där den undre gränsen givetvis kan vara högre beroende på storleken av föroreningarna. Generellt gäller att, ju högre den undre cut-off-gränsen är, desto snabbare av- skiljes föroreningarna.

Enligt uppfinningen kan den peptidinnehâllande föreningen avspjälkas från det bildade komplexet på vilket som helst lämpligt sätt. Exempelvis kan detta åstadkommas genom att ändra lösningens pH, till exempel genom till- sättning av en syra, eller genom att ändra lösningens jonstyrka, till exempel genom tillsättning av en aalt- lösning. Avspjälkningen kan också åstadkommas genom tillsättning av en i fri form föreliggande ligand i tillräcklig koncentration för att konkurrera ut den bärarbundna liganden och därigenom spräcka bindningen mellan denna och den peptidinnehållande föreningen. Yalet av lämplig fri ligand bestäms i varje enskilt fall av den typ av förening, som skall utvinnas, varvid generellt gäller att den valda liganden skall kunna binda till denna förening.

Exempel på användbara sådana ligander kan vara lågmolekylärt socker, t ex mono- och diaackarider, vid rening av lektiner, och antigener eller delar därav vid rening av antikroppar. _ Lämpligen aepareras den peptidinnehâllande föreningen från den i fri form tillsatta liganden, genom användning av ett semipermeabelt membran med tillräckligt låg övre cut-off-gräns för att förhindra genomträngning av den peptidinnehållande föreningen, men med tillräckligt hög övre cut-off-gräns för att tillåta passage sv den fria 10 15 20 -25 30 451 s4s liganden eller vice versa. Ett semipermeabelt membran med en övre cut-off-gräns under 35.000 Dalton kan vara lämpligt.

Lösningen innehållande den genom avspjälkningen återbildade bäraren med bunden ligand återanvändas före- . trädesvis för kontakt med den ursprungliga lösningen innehållande den peptidinnehållande föreningen jämte föroreningar, varigenom ett väsentligen slutet kretslopp för bärsren med bunden ligand skapas. l vissa fall kan det vara lämpligt att tillsätta en buffert eller liknande för rekonditionering (pH-justering) av lösningen innehållande bäraren med bunden ligand före återsnvändningen.

Uppfinningen kommer i det följande att beskrivas närmare med hänvisning till bifogade ritning, som sche- matiskt visar en anordning för genomförande av förfarandet enligt en praktisk utföringsform.

DETALJERAD~FIGURBESKRIVRING I det visade exemplet utnyttjas ett väsentligen slutet system för den bärarbundna liganden. Systemet omfattar i tur och ordning en lämpligt utformad bland- ningskammare l, ett första membranfilter 2, ett andra membranfilter 3 och ett tredje membranfilter.4 i för-- bindelse med varandra genom ledningar 5, 6, 7 resp. 8, såsom visas i figuren.

Hembranfiltren 2, 3 och 4 utgöres företrädesvis av inom ett hölje 9, 10 resp. 11 anordnade semipermeabla hålfibrer 12, fiberhåligheter anordnade att bilda strömningskanaler för 13 resp. 14 med sina respektive axiella den bärarbundna liganden i det slutna systemet, såsom kommer att beskrivas. Dessutom innefattar membranfiltren utlopp 16, 17 resp. 18 för filtret, inklusive ämnen som kan tränga igenom porerna i bålfiberväggarns. 45 10 15 20 25 30 35 1 843 Det första membranfiltret 2 innefattar således aemipermeabla hâlfibrer 12 med den axiella fiberhåligheten i förbindelse med ledningarna 5 och 6. Dessutom innefattar memhranfiltret 2 ett utlopp 16 för bortfiltrerade föro- reningar.

Det andra membranfiltret 3 innefattar också före- H trädesvis semipermeabla hålfibrer 13 med de axiells fiberhåligheterna i förbindelse med ledningarna 6 och 7.

Dessutom innefattar membranfiltret ett utlopp 17 för den separerade peptidinnehållande föreningen.

Det tredje membranfiltret 4 innefattar företrädesvis semipermeabla hålfibrer 14 i förbindelse med ledningarna 8 och 7. Dessutom innefattar det ett utlopp 18 för bort- filtrerade salter eller liknande.

Såsom visas i figuren kan anordningen även innefatta ett fjärde membrsnfilter 19 i förbindelse med utloppet 17 hos det andra membranfiltret 3 via en ledning 20. Det fjärde membranfiltret innefattar ett hus 21 med inom huset anordnade semipermeabla hålfibrer 22 med den axiella fiberhåligheten i förbindelse med ledningen 20 och ett utlopp 23 för den renade peptidinnehàllande föreningen.

Dessutom innefattar det fjärde membranfiltret 19 ett utlopp 24 för exempelvis bortfiltrerad fri ligand, såsom beskrivs i det följande.

Slutligen innefattar anordningen en ledning 25 i förbindelse med blandningskammaren I för införing av lösning innehållande den peptidinehållande föreningen tillsammans med föroreningar, en ledning/26 i förbindelse med ledningen 6 för tillförsel av dissoeiationsmedel , t ex konkurrerande fri ligand, en syralösning eller en salt- lösning, samt en ledning 27 i förbindelse med ledningen 7 för tillförsel av exempelvis buffert för rekonditionering av den bärarbundna liganden. g Hed den visade anordningen genomföras förfarandet enligt uppfinningen_på följande sätt. 10 15 20 25 30 451 84.5 Lösningen innehållande den peptidinnehållande före- ningen jämte föroreningar införas i blsndningskammaren 1 via ledningen 25 från en icke visad källa för denna lösning. I blandningskamnaren l kontaktas lösningen med i det ovan beskrivna slutna systemet cirkulerande bärar- bunden ligand, varvid ett komplex bestående av bärarelli- gand/peptidinnehållande förening bildas. ïrin blandninga- kamuaren l pumpas lösningen innehållande det bildade konplexet jämte föroreningarna in i det första membran- filtret 2 via ledningen 5, där föroreningarna filtreras ut genom porerna i de semipermeabla hilfibrerna 12 och iavledes vis utloppet 16. Den så rensde lösningen inne- hållande det bildade konpleaet pumpas från det första membranfiltret 2 in i det andra nembranfiltret 3 via ledningen 6 tillsammans med dišsociationsmedeï ., som införea _ i ledningen 6 via ledningen 26. I det andra lenbranfiltret 3 sker en bortfiltrering av den så avspjälkade peptid- innehållande föreningen tillsammans med dissociationsmedel genom porerna i de aenipermeabla hdlfibrerna 13. Lösningen innehållande den frigjorda bärarbundna liganden pumpas från det andra menbranfiltret 3 in i det tredje membran- filtret 4 via ledningen 7 tillsammans med en buffert- lösning, som tillsätts via ledningen 27 i förbindelse med ledningen 7. Från det tredje membranfiltret 4 pumpas sedan den regenererade bärarbnndna liganden in i blandninga- kammaren l vis ledningen 8 för återanvändning. Eventuella kvarvarande rester av dissociationsmedel eller salter filtreras bort från lösningen genom porerns i de semi- perneabla hålfibrerna 14 och bortledes via utloppet 18.

Den i det andra menbranfiltret 3 frigjorda peptid- innehållande föreningen jämte eventuellt dissnoiapionsmedel nttages via utloppet 17 och införes i det fjärde membran- filtret 19 via ledningen 20 för svskiljning av nämnda dissociatiönsmedel _, som filtreras genom porerna i de 10 451 845 semipermeabla hâlfibrerna 22 och uttages genom utloppet 24. Den renade peptidinnehållande föreningen uttages genom utloppet 23.

INDUSTRIELL ANVÄNDBARHET Förfarandet enligt uppfinningen kan utnyttjas för utvinning av praktiskt taget vilken som helst typ av förening ur en lösning som även innehåller en eller flera andra föreningar av föroreningskaraktär, nen är speciellt användbara för utvinning av enzymer, lectiner, anti- kroppar, antigener och haptener i ren forn. Dessutom kan uppfinningen i sin vidaate omfattning även utnyttjas för utvinning av andra typer av föreningar än de ovan upp- räknade, inklusive laddade föreningar typ joner._ n.

Claims (10)

5 10 15 20 25 30 35 9 451 843 PATENTKRAV

1. Förfarande för utvinning av exempelvis en peptid- innehållande förening från en lösning även innehållande en 'eller flera andra föreningar av föroreningskaraktär, vilket förfarande inbegriper att bringa lösningen i kontakt med en på en bärare bunden lígand med förmåga att reagera med den peptídinnehållande föreningen under bildande av ett komplex bestående av bärare/ligand/peptidinnehållande förening, att frånskilja nämnda föroreningar med användning av ett semipermeabelt membran (12), som är genomsläppligt för dessa, men ogenomsläppligt för det bildade komplexet, och att därefter avspjälka den peptidinnehållande föreningen från det bildade komplexet samt separera nämnda förening från den bärarbundna líganden, k ä n n e t e c k n a t därav, att bäraren utgöres av ett makromolekylärt fast material. ,

2. Förfarande enligt krav 1, k ä nun e t e c k n a t därav att den avspjälkade peptidinnehållande föreningen separeras från den bärarbundna liganden med användning av ett semipermeabelt membran (13), som är genomsläppligt för den avspjälkade peptidinnehållande föreningen, men ogenom- släppligt för den bärarbundna liganden.

3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e- t e c k n a t därav, att det fasta makromolekylära materi- alet väljes bland celler, agaros, stärkelse, cellulosa, chitin, gelatín, collagen och syntetiska polymerer typ latex och akrylderivat, samt även oorganiska material, exempelvis keramiskt material, poröst kiselhaltigt material etc.

4. Förfarande enligt något av kraven l-3, k ä n n e- t e c k n a t därav, att det fast makromolekylära materi- alet användes i form av partiklar med en storlek av över 0,1 um,-exempelvis l-50 pm, förträdesvis 2-10p m. 451 843 10 15 20 25 30 10.

5. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda ligand väljea bland inhibitorer, kolhydratstrukturer, antigener,-anti- kroppar, haptener, cofaktorer, CIQ, enzymer, nukleinayror, konglutinin och ytreceptorer,-exempelvis bakteriella, såsom protein A och protein G.

6. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att den peptidinnehållande föreningen avspjälkas från det bildade komplexet genom tillaättning av en syralöaning, en saltlösning eller en i fri form föreliggande ligand med förmåga att binda till den peptidinnehållande föreningen under samtidig av- spjälkning av denna från den bärarßnndna liganden. k ä n n e t e c k - därav, att den i fri form föreliggande liganden

7. Förfarande enligt krav 6, n a t väljes bland lågmolekylärt socker, t ex mono- och di- aackarider, vid rening av lektiner, och antigener eller delar därav vid rening av antikroppar. _

8, Förfarande enligt krav 6 eller 7, k ä n'n e - t e c k n a t därav, att den peptidinnehållande före- ningen separeras från den i fri form föreliggande liganden med användning av ett aemipemeabelt membran (22),aom ir genomsläppligt för den fria liganden, men ogenomaläppligtï för den peptidinnehàllande föreningen eller vice~versa.

9. Förfarande enligt något av kraven 6-8, k ä n n e t e e k n a t därav, att den så frigjorda bärarbundna liganden återanvändea för kontakt med lös- ningen innehållande den peptidinnehållande föreningen enligt krav 1.

10. Förfarande enligt krav 9, k ä n n e t_e c k - n a t därav, att den frigjorda bärarbundna liganden rekonditioneras före återanvändningen genom tillaättning av en lämplig buffertlösning.