SE451596B - Forfarande for utvinning av protein g - Google Patents

Description

15 20 25 30 “så -.- 451 596 En mer selektiv metod innebär däremot den förra, som enligt nämnda USA-patent kan användas i stafylokockbakterier. Däremot har denna samband med metod oss veter- ligen varken använts eller beskrivits i streptokockbakterier. samband med Tvärtom borde den ha bedömts som helt utsiktslös med ledning av de resultat som för när- varande âr kända rörande Fc-receptorers protein-natur och dessa ytstrukturers känslighet för proteolytisk behand- ling. I regel erhålles nämligen en total nedbrytning av proteinerna till aminosyror och peptider och all biologisk aktivitet förloras.

Stick i stäv mot sådana tidigare rön har det enligt uppfinningen helt överraskande visat sig att den förra metoden också kan utnyttjas i samband med streptokock- baterier, och speciellt har det visat sig att metoden är särskilt användbar för utvinning av Fc-receptor typ III (i det följande benämnd protein G) från sådana bakterier. we Fc-receptorer såsom protein A och protein G har värdefulla egenskaper, exempelvis förmåga att binda till Fc-delen hos immunoglobuliner, och kan med fördel utnyttjas såväl i terapeutiska som i analytiska samman- hang. En sådan synnerligen värdefull tillämpning utgör extrakorporeal behandling av blod i samband med vissa autoimmuna sjukdomar, där Fc-receptorn skulle kunna användas som ett medel för att avlägsna s.k. immunkomplex från blodet. I jämförelse med protein A har emellertid protein G en rad fördelar som gör protein G vida över- lägset. Exempelvis har det visat sig att protein G kan i binda till samtliga IgG-subklasser, medan protein A däremot inte kan binda till human IgG 3. Vidare saknar protein G förmåga att binda IgA och IgM, varigenom protein G således i viss mening är en mer selektiv Fc-receptor jämfört med protein A som även binder till dessa immuno- globulinklssser. 10 15 20 25 30 35 451 596 Av det ovanstående framgår således att det för närvarande, såvitt vi känner till, icke finns någon enkel tillgänglig metod för utvinning av Fc-receptorer från streptokockbakterier, i synnerhet protein G, och att det uppenbarligen föreligger ett stort behov av att finna en sådan metod för utvinning av i synnerhet denna värdefulla Fc-receptor.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt uppfinningen åstadkommas sålunda ett för- farande för utvinning av Fc-receptorn protein G från streptokockbskterier, vilket förfarande innefattar enzy- matisk solubilisering och eventuell efterföljande iso- lering av det solubiliserade proteinet. Förfarandet kännetecknas därav, att solubiliseringen åstadkommas med användning av ett proteolytiskt enzym, vilket utgöres av papain, trypsin eller pepsin. M Det proteolytiaka enzymet väljes alltså enligt uppfinningen bland papain, trypsin och pepsin. Före- trädesvis utnyttjas papain.

Såsom redan nämnts, kan den utvunna Fc-receptorn från streptokockbakterierna binda till samtliga IgG-klasser.

Försök har visat att Fc-receptorn (protein G) även binder albumin, som är ett värdefullt protein i blodplasma. Detta innebär att en konkurrenssituation mellan IgG och albumin till de bindande ytorna på protein G således kan före- komma, när protein G används i samband med en extra- korporeal behandling av blod för att avlägsna immun- komplex, såsom tidigare nämnts.

Enligt uppfinningen har det emellertid visat sig att ett i ännu högre grad selektivt protein G, dvs ett protein G som bara binder IgG men däremot inte albumin, kan erhållas från streptokockbakterier, om dessa bakterier före solubiliseringen utsätts för en enzymatisk förbe- handling. 10 15 20 25 30 451 596 För denna enzymatiska förbehandling används enligt uppfinningen företrädesvis proteolytiska enzymer, av vilka trypsin och pepsin utgör de för närvarande mest föredragna exemplen.

Det solubiliserade cellväggsproteinet kan isoleras och utvinnas exempelvis på det sätt som beskrivs i den europeiska patentansökan Publ.nr. 0 046 915. I korthet går denna metod ut pâ att det solubiliserade proteinet, eventuellt efter föregående bortfiltrering av större föroreningar, bringas i kontakt med en på en löslig bärare immobiliserad ligand med affinitet för proteinet för att bilda ett komplex, som sedan renas från eventuellt när- varande mindre föroreningar och därefter spräckes för frigöring av proteinet. Det frigjorda proteinet separeras och utvinnes sedan genom filtrering. För närmare infor- mation om denna kända reningsmetod hänvisas till nämnda europeiska patentpublikation. n* En i och för sig snarlik reningsmetod, som också kan användas enligt uppfinningen, beskrivs i svenska patent- ansökan nr 8302638-5.

Enligt uppfinningen används enzymerna företrädesvis i form av en suspension, varvid föredragna enzymsuspensioner innehåller mellan 50 och 250, företrädesvis 75-150n g, enzym per ml av en 102 bakteriesuspension.

Uppfinningen kommer att belysas närmare i det följ- ande med hjälp av icke-begränsande praktiska utförings- exempel.

Exempel 1 ' É Enzynatisk solubilisering Human grupp G streptokockbakterier, G 148, odlade i Todd/Hewitt-buljong, suspenderades (102 suspension) i 0,01 H trís-HCI, pH 8,0. IOOH 1 0,4 M L-cystein och l0u I papain av varierande koncentration i samma buffert till- 10 15 20 25 30 35 451 596 sattes per ml bakteriesuspension. ßlandningen inkuberades i 1 h vid 37°C, och jodacetamid tillsattes till en slutlig koncentration av 6 mM.

Isolering Den så erhållna bakteriesuspensionen centrifugerades (2.000 3) i 30 min, varefter supernatanten ultracentri- fugersdes (50.000 g), frystes omedelbart vid -80°C och användes som utgångsmsterisl för isolering av proteinet genom sekventiell användning av jonbyteskromatografering på DEAE-cellulosagel, gelfiltrering på Sephadexk G-100 (dextrsn tvärbunden med epiklorhydriu) och sffinitets- kromatografering med användning av IgG kopplat till Sepharosea 48 (agaros).

Annlyst Vid analys på SDS-PAGE vandrade det så isolerde proteinet såsom ett homogent band, och vid sgarosgel- elektrofores syntes endast ett band i (alfa)1-regionen, vilket tyder på hög grad av renhet.

SDS-PAGE i skivor och i stavar (märkt protein G) gav båda en genomsnittlig molekylvikt av 30.500. Behandling av proteinet med 2-merksptoetanol påverkade inte resultatet.

Exemgel 2 Enzynntisk förbehnndling 0,5 mg pepsin per ml 102 bakteriesuspension (strep- tokockbakterier av samme slag som ovan) sammanfördes i 0,1 M scetatbuffert, pH 4,0, och blandningen inkubersdes i 30 min vid 37°C. Tester enligt kända metoder på de åter- stående bakteriekropparna visade att dessa helt saknade förmåga att binds albumin, medan däremot den IgG-bindande förmågan kvarstod intakt.

Bnzynntisk solmbilisering De så pepsinbehandlade bakterierna tvättsdes i 0,1 H mf:- -. - ......a__.. _ 451 596 51154101» PH 8,0, och späddes till en 102 suspension i denna buffert. Därefter genomfördes den enzymatíska f_\ .v 451 596 solubilíseríngen med papain på samma sätt som ovan för utvinning av ett protein G med selektiv IgG-bindande förmåga. 5 INDUSTRIELL ANVÄNDBARHET Förfarande enligt uppfinningen kan användas för utvinning av cellväggsproteiner, i synnerhet Fc-receptorer från streptokockbakterier, och är speciellt användbar för utvinning av Fc-receptor typ III (protein G) från atrepto- 10 kockbakterier. v*

Claims (7)

10 15 20 25 451 596 PATENTKRAV

1. Förfarande för utvinning av protein G från strep- tokockbakterier, vilket förfarande innefattar enzymatiak solubilisering med eventuell efterföljande isolering av det solubiliserade proteinet, k ä n n e t e c k n a t därav, att solubiliseringen åstadkommas med användning av ett proteolytiakt enzym, vilket utgöres av papain, trypsin eller pepsin.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t eic k n a t därav, att streptokockbakterierna förbehandlas med ett enzym före den enzymatiska solubiliseringen.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att förbehandlingen genomförea med an- vändning av ett proteolytiskt enzym.

4. förfarande enligt krav 2 eller 3, k ä n n e - t e c k n a t därav, att det proteolytiska enzymet för , förbehandlingen väljea bland trypsin och pepsin.

5. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att det solubilißerade proteinet isoleras genom affinitetskromatografi med användning av en ligand med affinitet för proteinet.

6. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att enzymerna för den enzymatiska solubilíseringen användes i form av en sus- pension.

7. Förfarande enligt krav 6, k ä n n e t e c k - n a t därav, att enzymerna används i en mängd av mellan 50 och 250 pg, förträdesvis 75-150p g, enzym per ml 10% cellauspension. p . [el