JPS6037996A - 精製されたプロテインg - Google Patents
精製されたプロテインgInfo
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- JPS6037996A JPS6037996A JP59128398A JP12839884A JPS6037996A JP S6037996 A JPS6037996 A JP S6037996A JP 59128398 A JP59128398 A JP 59128398A JP 12839884 A JP12839884 A JP 12839884A JP S6037996 A JPS6037996 A JP S6037996A
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- protein
- enzyme
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- streptococci
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
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- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、連鎖状球菌より細胞壁蛋白を回収する方法に
関するものであり、酵素による可溶化とその後おそらく
は可溶化蛋白を単離することより成る。
関するものであり、酵素による可溶化とその後おそらく
は可溶化蛋白を単離することより成る。
特に本発明は上記細菌からJ’c IJセプターを回収
するための上記の方法と同様の方法に関する。
するための上記の方法と同様の方法に関する。
発明の背景
細菌のFc IJセプターとそれを回収する方法は公知
であり文献に記載されている。
であり文献に記載されている。
たとえば米国特許明細省第3850798号には、トリ
プシンという酵素を用いる酵素的可溶化によって、ブド
ウ状球菌よりFc IJセプターであるプロティンAを
回収する方法が記載されている。
プシンという酵素を用いる酵素的可溶化によって、ブド
ウ状球菌よりFc IJセプターであるプロティンAを
回収する方法が記載されている。
又A群連鎖状球菌のFc反応性蛋白の可溶化に、ファツ
ゾ(fag )より訪導した細胞壁分解酵素を用いる類
似の方法も示唆されている。
ゾ(fag )より訪導した細胞壁分解酵素を用いる類
似の方法も示唆されている。
この後者の方法は、細胞壁中の長い糖の高分子および架
橋するペプチドブリッジを分解することにより、この構
造に結合した全ての物質の可溶化が可能になるという原
理のひとつの例である。細胞壁の残りは可溶化した分子
上に残る。又可溶化と同時に連鎖状球菌の全ての可溶性
の細胞内物質は得られる液体中に放出されるためこの液
は非常に複雑である。
橋するペプチドブリッジを分解することにより、この構
造に結合した全ての物質の可溶化が可能になるという原
理のひとつの例である。細胞壁の残りは可溶化した分子
上に残る。又可溶化と同時に連鎖状球菌の全ての可溶性
の細胞内物質は得られる液体中に放出されるためこの液
は非常に複雑である。
前記の米国特許においてブドウ状球菌に使用されるとい
う前者の方法は、もつと選択性の高い方法である。しか
し本発明者の知るかぎりでは、この方法は連鎖状球菌に
関連して使用されたことも記載されたこともない。逆に
Fcリセプターの蛋白の性質とこれらの表面構造の蛋白
分解酵素に対する感受性に関し知られている事実を考え
るさ、この方法は役に立たないと見なされてきた。ふつ
うは蛋白が完全に分解されてアミノ酸になり、全ての生
物活性が失なわれてしまう。
う前者の方法は、もつと選択性の高い方法である。しか
し本発明者の知るかぎりでは、この方法は連鎖状球菌に
関連して使用されたことも記載されたこともない。逆に
Fcリセプターの蛋白の性質とこれらの表面構造の蛋白
分解酵素に対する感受性に関し知られている事実を考え
るさ、この方法は役に立たないと見なされてきた。ふつ
うは蛋白が完全に分解されてアミノ酸になり、全ての生
物活性が失なわれてしまう。
このような経験に対し、本発明によると前者の方法が連
鎖状球菌にも使用が可能であり、この方法が連鎖状球菌
のノ+′Cリセプター第1型(以下プロティンGと記載
する)の回収に特に有用であることが明らかIこなった
。
鎖状球菌にも使用が可能であり、この方法が連鎖状球菌
のノ+′Cリセプター第1型(以下プロティンGと記載
する)の回収に特に有用であることが明らかIこなった
。
プロティンAやプロティンGなどのJrcリセプターは
免疫グロブリンのJ”c部分に結合できるという有用な
特徴を有しており、治療や分析面への使用に有効である
。その有効な応用例のひとつはいくつかの自己免疫疾患
に関する血液の体外処理であり、そこではFCリセプタ
ーは血液からいわゆる免疫複合体を除去するのlこ使用
できる。しかしプロティンGはプロティンAに比較して
いくつかの利点を有しており、プロティンAよりはるか
にすぐれている。たとえばプロティンAはヒトのIgG
3に結合できないが、プロティン()はffgGの全て
のサブクラスに結合できる。さらにプロティンGはIg
AやIgMに;i結成しないためくこれらの免疫グロブ
リンにも結合するプロティンAに比較してより選択性の
高いFc IJセゾターということができる。
免疫グロブリンのJ”c部分に結合できるという有用な
特徴を有しており、治療や分析面への使用に有効である
。その有効な応用例のひとつはいくつかの自己免疫疾患
に関する血液の体外処理であり、そこではFCリセプタ
ーは血液からいわゆる免疫複合体を除去するのlこ使用
できる。しかしプロティンGはプロティンAに比較して
いくつかの利点を有しており、プロティンAよりはるか
にすぐれている。たとえばプロティンAはヒトのIgG
3に結合できないが、プロティン()はffgGの全て
のサブクラスに結合できる。さらにプロティンGはIg
AやIgMに;i結成しないためくこれらの免疫グロブ
リンにも結合するプロティンAに比較してより選択性の
高いFc IJセゾターということができる。
本発明者の知る限りにおいては、連鎖状球菌からFcリ
セプターを回収する簡便な方法がないため、そのような
方法を見つけるべき必要性は大きいと考えられる。
セプターを回収する簡便な方法がないため、そのような
方法を見つけるべき必要性は大きいと考えられる。
発明の記述
本発明によれば、連鎖状球菌から細胞壁蛋白を回収する
方法が与えられ、その方法は酵素的可溶化きおそらくは
その後の可溶化蛋白の単離より成る。この方法は蛋白分
解酵素を使用して可溶化を行なうことを特徴とする。
方法が与えられ、その方法は酵素的可溶化きおそらくは
その後の可溶化蛋白の単離より成る。この方法は蛋白分
解酵素を使用して可溶化を行なうことを特徴とする。
本発明による蛋白分解酵素はパパイン、トリプシン、ペ
プシンの中から選ばれ、パパインが最も好ましい。
プシンの中から選ばれ、パパインが最も好ましい。
前記した通り、連鎖状球菌より回収したこのFcリセプ
ターはIgGの全てのせプクラスに結合することができ
る。実験によるとこのFcリセプタ−(プロティンG)
は、血液蛋白中のひとつの有効な蛋白であるアルジミン
にも結合することが分った。これは、前記したように免
疫複合体を除去するだめの血液の体外処理にプロティン
(1を使用した場合、プロティンGの結合表面に対1.
IgG 、:アルブミンの間で競合が起きるこきを意
味している。
ターはIgGの全てのせプクラスに結合することができ
る。実験によるとこのFcリセプタ−(プロティンG)
は、血液蛋白中のひとつの有効な蛋白であるアルジミン
にも結合することが分った。これは、前記したように免
疫複合体を除去するだめの血液の体外処理にプロティン
(1を使用した場合、プロティンGの結合表面に対1.
IgG 、:アルブミンの間で競合が起きるこきを意
味している。
本発明によれば、連鎖状球菌を可溶化に先立ち酵素によ
る前処理を行なうと、さらに選択性の高いプロティンG
(すなわちIgGのみに結合しアルジミンに結合しない
プロティンG)が得られることが分った。
る前処理を行なうと、さらに選択性の高いプロティンG
(すなわちIgGのみに結合しアルジミンに結合しない
プロティンG)が得られることが分った。
本発明によれば、この酵素による前処理に蛋白分解酵素
が使用され、トリプシンとペプシンが現在のところ最も
好韮しい蛋白分解酵素である。
が使用され、トリプシンとペプシンが現在のところ最も
好韮しい蛋白分解酵素である。
この可溶化した細胞壁蛋白は、ヨーロッパ特許公報第0
046915号に記載の方法により単離し回収すること
ができる。つまりこの公知の方法では、可溶化した蛋白
をおそらく大きな不純物を濾過した後で、可溶性の担体
に固定化したこの蛋白に対する親和性を有するリガンド
と接触させて複合体を形成させ、次におそらくこの複合
体から濾過により小さな不純物を除き、次にこの蛋白を
放出させる。次にこの放出された蛋白を濾過により分離
回収する(この方法の詳細については前記のヨーロッパ
の特許公報を参照。)。
046915号に記載の方法により単離し回収すること
ができる。つまりこの公知の方法では、可溶化した蛋白
をおそらく大きな不純物を濾過した後で、可溶性の担体
に固定化したこの蛋白に対する親和性を有するリガンド
と接触させて複合体を形成させ、次におそらくこの複合
体から濾過により小さな不純物を除き、次にこの蛋白を
放出させる。次にこの放出された蛋白を濾過により分離
回収する(この方法の詳細については前記のヨーロッパ
の特許公報を参照。)。
スウェーデンの特許出願第8302638−5号にも、
本発明に使用可能な同様の方法が記載されている。
本発明に使用可能な同様の方法が記載されている。
本発明によれば、酵素は浮遊液の形で用いるのが奸才し
く、この場合酵素浮遊液の好丈しい濃度は、10%の細
菌浮遊液1m1jこつき50−250μ、p、、好才し
くは75−15.0μIである。
く、この場合酵素浮遊液の好丈しい濃度は、10%の細
菌浮遊液1m1jこつき50−250μ、p、、好才し
くは75−15.0μIである。
以下の例において本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
はこれらに限定されるものではない。
例 1
酵素による可溶化
ヒ)G8¥連鎖状球菌G148をトッド/ヒユーイツト
ブロース(Todd / Hewitt−broth
)中で培養し、0.01Mトリス−HCムpH8,0に
浮遊させた(10%浮遊液)。この浮遊液1Mにつき、
同じ緩衝液中のQ、4 M L−システィン100μl
と種々の濃度のパパインを10μl加え、この混合液を
37°Cで1時間反応させた。ヨードアセトアミドを最
終濃度がt5 mMになるように加えた。
ブロース(Todd / Hewitt−broth
)中で培養し、0.01Mトリス−HCムpH8,0に
浮遊させた(10%浮遊液)。この浮遊液1Mにつき、
同じ緩衝液中のQ、4 M L−システィン100μl
と種々の濃度のパパインを10μl加え、この混合液を
37°Cで1時間反応させた。ヨードアセトアミドを最
終濃度がt5 mMになるように加えた。
単離
こうして得られた細菌の浮遊液を30分間遠心分離(2
000,IL、次に上澄液を超遠心分離<500001
)し、ただちに−80℃で凍結した。これを出発物質と
してDEAE−セルロースデルでイオン交換クロマトグ
ラフィーを、セファデックスG100でゲル濾過を、そ
してセファロース4B結合IgGでアフイニテイクロマ
トグラフイーを連続して行ない蛋白を単離した。
000,IL、次に上澄液を超遠心分離<500001
)し、ただちに−80℃で凍結した。これを出発物質と
してDEAE−セルロースデルでイオン交換クロマトグ
ラフィーを、セファデックスG100でゲル濾過を、そ
してセファロース4B結合IgGでアフイニテイクロマ
トグラフイーを連続して行ない蛋白を単離した。
分析
単離した蛋白は5DS−PAGEの分析で均一のバンド
として泳動し、アガロースデル電気泳動ではアルファ1
領域に単一のパンrが観察され、非常tこ純度が高いこ
とが証明された0 ディスク及びロッドのSDs−pAGg (プロティン
Gを標識)/こおいて見かけの分子量30500が得ら
れた。この蛋白を2−メルカプトエタノールで処理して
も結果に影響はなかった。
として泳動し、アガロースデル電気泳動ではアルファ1
領域に単一のパンrが観察され、非常tこ純度が高いこ
とが証明された0 ディスク及びロッドのSDs−pAGg (プロティン
Gを標識)/こおいて見かけの分子量30500が得ら
れた。この蛋白を2−メルカプトエタノールで処理して
も結果に影響はなかった。
例 2
酵素による前処理
10%の細菌の浮遊液(前記と同じ連鎖状球菌)1ml
につき0.5m9のペプシンを0.1Mの酢酸緩衝液、
pH4,0、に加えこの混合液を378Cで60分間反
応させた。残っている細菌について公知の方法で試験し
た結果、アルブミンに結合する能力は全く消失し、工g
Gに結合する能力は影響を受けなかった。
につき0.5m9のペプシンを0.1Mの酢酸緩衝液、
pH4,0、に加えこの混合液を378Cで60分間反
応させた。残っている細菌について公知の方法で試験し
た結果、アルブミンに結合する能力は全く消失し、工g
Gに結合する能力は影響を受けなかった。
酵素による可溶化
ペプシンで処理した細菌を0.1MIJスーHCムPH
8,0、で洗浄し、この同じ緩衝液で10%浮遊液にな
るように希釈した。次に前記の方法と同じ方法でパパイ
ンによる酵素的可溶化を行なって、IgCilこ選択的
に結合する能力を有するプロティンGを回収した。
8,0、で洗浄し、この同じ緩衝液で10%浮遊液にな
るように希釈した。次に前記の方法と同じ方法でパパイ
ンによる酵素的可溶化を行なって、IgCilこ選択的
に結合する能力を有するプロティンGを回収した。
工業的応用
本発明による方法は連鎖状球菌の細胞壁蛋白(特にFC
Cリグノー)を回収するのに使用可能であり、特に連鎖
状球菌のFc IJセプター第■型(プロティンG)の
回収に有効である。
Cリグノー)を回収するのに使用可能であり、特に連鎖
状球菌のFc IJセプター第■型(プロティンG)の
回収に有効である。
代理人 浅 村 晧
Claims (7)
- (1)酵素により可溶化し、次に単離することより成る
、連鎖状球菌から細胞壁蛋白を回収する方法において、
蛋白分解酵素を使用してこの細胞壁蛋白を可溶化するこ
とを特徴とする、上記方法。 - (2) 蛋白分解酵素はパパイン、トリノシン、ペプシ
ンから選ばれ、好ましくはパパインであることを特徴と
する特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (3)酵素による可溶化の前に連鎖状球菌を酵素で前処
理することを特徴とする特許請求の範囲第1項又は第2
項記載の方法。 - (4)蛋白分解酵素を使用して前処理を行なうことを特
徴とする特許請求の範囲第6項記載の方法。 - (5) 前処理のための蛋白分解酵素はトリノシンとペ
プシンから選ぶことを特徴とする特許請求の範囲第6項
又は第4項記載の方法。 - (6) 可溶化した蛋白を、この蛋白に対する観相性を
有するリガンドを使用してアフィニティクロマトグラフ
ィーにより単離することを特徴とする特許請求の範囲第
1項から第5項までのいずれか1項に記載の方法。 - (7)酵素的可溶化に使用する酵素は浮遊液の状態で使
用することを特徴とする特許請求の範M第1項75)ら
第6項までのいずれか1項に記載の方法。 (8i10%の細胞浮遊液1Mにつき、50−250μ
p、好ましくは75−150 pg (1)酵素を使用
するこさを特徴とする特許請求の範囲第7項記載の方法
。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8303578A SE451596B (sv) | 1983-06-22 | 1983-06-22 | Forfarande for utvinning av protein g |
SE8303578-2 | 1983-06-22 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6037996A true JPS6037996A (ja) | 1985-02-27 |
JPH0662676B2 JPH0662676B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=20351719
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59128398A Expired - Lifetime JPH0662676B2 (ja) | 1983-06-22 | 1984-06-21 | 精製されたプロテインg |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4948874A (ja) |
EP (1) | EP0131142A3 (ja) |
JP (1) | JPH0662676B2 (ja) |
SE (1) | SE451596B (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US4931675A (en) * | 1986-03-05 | 1990-06-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Semiconductor sense amplifier |
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