JPS6225981A - タン白ｇおよび／又はその断片の製造法 - Google Patents

タン白ｇおよび／又はその断片の製造法

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JPS6225981A
JPS6225981A JP61102941A JP10294186A JPS6225981A JP S6225981 A JPS6225981 A JP S6225981A JP 61102941 A JP61102941 A JP 61102941A JP 10294186 A JP10294186 A JP 10294186A JP S6225981 A JPS6225981 A JP S6225981A
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dna
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microorganism
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ゴーラン　クロンバール
グンナー　リンダール
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ETSUKUSUKORIMU KEIBII
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はいわゆるハイブリド−ＤＮＡ−技術に関し、特
にこの技術による免疫グロブリンＧ（ＩａＧ）の結合能
を有するタン白Ｇおよび／又はこれらの断片の製造法に
関する。
タン白Ｇに関するさらに詳細な情報に対しては、Ｊ、　
ｌｍ５ｕｎｏ１．　１３３．９６９．１９８４およびス
工−デン特許出願第８３０３５７８−２号明細書（１９
８３年６月２２日出願）が引用される。
背景技術 タン白Ｇの製造に対し今日まで使用された方法は上記刊
行物に記載されたものであり、タン自分解酵素の助けに
よりストレプトコッカス菌の表面からタン白を遊離させ
、その後タン白を単離することに基づく。
この方法には重大な欠点がある。例えば、タン白Ｇ分子
の一部のみが細菌表面から遊離するに過ぎず、たとえこ
の部分は明確にＩＯＧを結合できるとしても、分子全体
を単離することは当然有利であろう。さらに、この方法
は出発物質としてストレプトコッカスに限定される。そ
してこれらは病原性であり、大規模に培養することは困
難であることに留意すべきで、他の出発物質による操作
方法を見出すことが望ましい。
近代のいわゆるＤＮＡ−工業技術（ハイブリド−ＤＮＡ
−技術）の出現を慶賀するが、新しい、一層すぐれた方
法が特に魅力的性質を有するタン白の製造に対し開かれ
た。この技術はタン白をコードする遺伝情報を１つの細
胞から他の細胞にいわゆるベクターの助けにより転写す
ることで出発し、その結果このタン白を製造できるよう
になる。
このような方法はタン白Ａ（ストレプトコッカス・アウ
レウスの細胞壁タン白）の製造から既知であり、それぞ
れ２つのスエーデン特許出願第８２０４８１０−９号お
よび第８２０４８１１−７号明細書および２つのヨーロ
ッパ特許出願第０１０７５０９号および第０１２４３７
４号明細書に記載される。
タン白Ａに比較して、タン白Ｇは、特に血液から抗源−
抗体複合体を除去するために成る種の自己免疫病に関連
する体外血液処理の治療剤としての実質的利点を有する
。例えばタン白ＧはすべてのＩａＧ−サブクラスに結合
するが、タン白ＡはヒトＩｇＧ３結合能に欠ける。さら
に、タン白ＧはＩＯＡおよびＩＧＭを結合しないのでタ
ン白Ａより一層選択的ＦＣ−を受容体である。
従って、公知のハイブリド−ＤＮＡ−技術の助けにより
タン白Ｇおよび／又はＩｇＧ結合能に関する限りタン白
Ｇと実質的に同じ性質を有するタン白Ｇの断片の製造法
を供することが本発明の目的である。
この目的および他の目的は特許請求の範囲に特定され、
以下に詳細に記載される方法による本発明に従って達成
された。
本発明の開示 本発明によれば、微生物に発現することができるタン白
をコードするＤＮＡ配列を導入したベクターを含むハイ
ブリド−ＤＮＡ−分子が製造される。このハイブリド−
ＤＮＡ−分子はＤＮＡ−配列がタン白Ｇおよび／又はＩ
ｇＧ結合能に関する限り実質的にタン白Ｇと同じ性質を
有するタン白Ｇの断片をコードすることに特徴がある。
本発明によれば、微生物に発現することができるタン白
をコードするＤＮＡ−配列を導入したベクターを含むハ
イブリド−ＤＮＡ−分子により形質転換させた微生物も
製造される。この微生物はＤＮＡ配列がタン白Ｇおよび
／又はＩＧＧ結合能に関する限りタン白Ｇと実質的に同
じ性質を有するタン白Ｇの断片をコードすることに特徴
がある。
さらに、本発明によれば、タン白Ｇおよび／又はＩｇＧ
結合能に関する限すタン白Ｇと実質的に同じ性質を有す
るタン白Ｇの断片の製造法が供される。この方法は微生
物に発現することができるタン白をコードするＤＮＡ−
配列を導入したベクターを含むハイブリド−ＤＮＡ−分
子を微生物に組みこむことを含み、またこのＤＮＡ−配
列はタン白Ｇおよび／又はＩｇＧ結合能に関する限りタ
ン白Ｇと実質的に同じ性質を有するタン白Ｇの断片をコ
ードすることに特徴がある。
本発明によれば、ストレプトコッカス細菌、例えばグル
ープＡ、ＣおよびＧストレプトコッカス、好ましくはグ
ループＣおよび／又はグループＧストレプトコッカスに
属する細菌から単離したＤＮＡ−分子から得たＤＮＡ−
断片を使用する。
これに関連して、単離したＤＮＡ−分子を切断して適当
な大きさのＤＮＡ−断片にする公知の制限−〇　− 酵素の適用を含む常法技術を使用する。本発明により使
用できるＤＮＡ−断片の大きさは変化することができる
が、特に使用するベクターのタイプに依存する。
このようなタン白ＧをコードするＤＮＡ−断片のクロー
ン化に使用することができるベクターの例は細菌プラス
ミド（例えば大腸菌由来のプラスミド）、ファージ−Ｄ
ＮＡ　（例えばファージ−ラムダ又はＥＭＢＬ３やａｔ
ｌ　１のようなラムダの誘導体）、プラスミドとファー
ジ−ＤＮＡの組み合せから得たベクター、酵母プラスミ
ドなどを含む。ベクターの特別の選択は使用する微生物
（宿主）を予想して行なわれ、当業者により容易に行な
うことができる。
本発明に従ってハイブリド−ＤＮＡ−分子を得るために
使用するベクターにタン白ＧをコードするＤＮＡ断片を
導入する方法はこの分野では常法で、いわゆる連結酵素
を使用して行なう。
適当な宿主微生物、すなわち本発明に従ってハイブリド
−ＤＮＡ−分子により形質転換され、その結果タン白Ｇ
および／又はタン白Ｇの断片を製造できるようになる微
生物はダラム陰性菌（好ましくは大腸菌）、ダラム陽性
菌、酵母細胞、植物細胞などを含む。
数例は本発明を実施する態様を単に例示するためのもの
で、いずれにしても限定するものと見做してはならない
。
出発材料としてグループＧストレプトコッカス菌株（Ｇ
１４３）をタン白Ｇ高含量の理由で選択した。
Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ　　（Ｔ　−Ｈ）培地にＧ１４
８１１１菌カルチヤーを３７℃で一夜生育させた。３．
０ｄのカルチャーを２２５ｄのＴ−Ｈに添加し、３時間
３７℃で培養した。１３．６ｄの１０％システィンおよ
び１１．２５ｄの０．４％Ｄ　Ｉ−−スレオニンを添加
した。１時間３７℃で培養後１２５ｄの１５％グリシン
を添加した。さらに４５分３７℃で培養後、細胞を０．
２Ｍ　　Ｎａ０ＡＣ中で３回洗滌し、２５％グルコース
および１ＱｍＨのＥＤＴＡを含むｐＨ８，０の０．１Ｍ
トリス−ＨＣ１緩衝液１０ｄに再懸濁させた。２．０Ｉ
＋ｌｌ！のＴＥ緩衝液（０，０１ＭトＩＪスーＨＣｊ！
、ｐＨ７，４，１，ＱｍＨのＥＤＴＡを含む）に溶解し
た２０９のりゾチームを添加した。次に１時間３７℃で
培養を行ない、そこにＴＥ緩衝液に溶解した１、１ａｅ
の１０％ＳＤＳを添加した。ＤＨ７，４の０．０１Ｍト
リス−）ＩＯＡに２０１ｒ＃ｇ／Ｉｄの濃度で溶解し、
２時間３７℃で自己消化させた５００μｌのプロテイナ
ーゼＫ（メルク、ダルムスタット、西独）を添加した。
−夜室温で培養後４０ｄのＴＥ緩衝液および５ｄの３Ｍ
　　Ｎａ０ＡＣ，ａｔｌ７．４を添加した。次に１５０
ｍの無水アルコールを添加し、そこで溶液を一２０℃で
一夜培養した。３０分２０００ＸＧで遠心分離後上澄を
デカントした。ベレットを８０．％アルコールで２回洗
滌し、窒素ガス下で蒸発し、４ＩｄのＴＥ−緩衝液に溶
解した。５００μｌの牛膵臓からのＲＮアーゼ−Ａ（シ
グマ、米国ミズーリ州）、使用前に８−　〇　− ０℃に加熱した０、１５Ｍ　　ＮａＣｊ！中の２Ｒｇ／
ｄを添加した。２時間３７℃で培養後２００μｌのプロ
テイナーゼＫ（上記参照）を添加した。さらに室温で一
夜培養後溶液を室温で２回フエーノル抽出し、ＴＥ−緩
衝液に対し３回透析した。３Ｍ　　Ｎａ０Ｃを０．３Ｍ
１度まで添加し、そこで３容の無水アルコールを添加し
た。−２０℃で一夜培養後遠心分離を２０００ＸＧで３
０分行なった。ベレットは８０％アルコールで２回洗滌
し、窒素ガス下で蒸発した。次にベレットは２５！ｄの
ＴＥ−緩衝液に溶解した。２５ｇの塩化セシウム（ＢＲ
Ｌ、ベセスダ、米国）および１１ｔ１の臭化エチジウム
（５■＃り　　（シグマ、米国ミズーリ州）を添加した
。１３８．０００ｘＧで２０時間遠心分１Ｌ臭化エチジ
ウムにより紫外光で可視化させたＤＮＡ−バンドを除去
した。無水アルコールにより２回抽出を行ない、次いで
ＴＥ−緩衝液に対し底部相を透析し、そこでＮａ０ＡＣ
を０．３Ｍまで添加した。次いで無水アルコールにより
アルコール沈澱させ、８０％アルコールで２回洗滌した
。ペレットは蒸溜水に溶解した。
ファージラムダの誘導体は制限酵素により断片化した精
製ストレプトコッカス−ＤＮＡのベクターとして使用し
た。
この誘導体ＥＭＢＬ３は市販されており（Ｐｒ０１１１
ｅ（ｌａ　ｅ＋ｏｔｅｃ、米国ライスコンシン）、そし
てファージ−ＤＮＡおよび異種ＤＮＡの調製法、制限酵
素による切断法、ＤＮＡ−断片の結合方法（連結）は゛
、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１７０．８２７．１９
８３に詳細に記載されている。この公知方法によれば、
１０〜２５ｋｂの大きさのストレプトコッカス−ＤＮＡ
−断片（１％アガロース中でゲル電気泳動により測定）
はＥＭＢＬ　　３−ＤＮＡに組みこみ、ラムダ−ストレ
プトコッカス−ハイブリド−ＤＮＡ−分子は感染させる
ことができる無きすのファージラムダをマークするタン
白殻に含ませた。どのように行なうかの記載はプロメガ
　バイオテックス　カタログ（表題プロメガ　バイオチ
ック、モレキュラ　バイオロジカルズ）に記載される。
最終結果はラムダ−ＤＮＡ−分子を含むファージラムダ
であり、そこに各種火きさのストレプトコッカス−ＤＮ
Ａ断片を組みこんだものである。
調整したラムダ−ストレプトコッカス−ハイブリド−Ｄ
ＮＡ−分子の宿主細胞として２種の大腸菌株ＮＭ５３８
およびＮＭ５３９を選択した。これらの菌株はＥＭＢＬ
　　３−ファージにより感染させることができ、Ｊ、　
Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、　１７０．８２７．１９８３に詳
細に記載される。これらの菌株はプロメガ　バイオチッ
クから得た。各菌株の菌コロニーはマルトースを含む２
０−のＬｂ−培地（１０ｇＮａＣｆ！、１（ｌディフコ
　トリプトン、５ｇディフコ酵母エキス、５Ｍ　　Ｎａ
ＯＨにより＋１１１７．４に調整）に−夜接種した。１
００μｌのファージ溶液（上記２参照）を２００μｌの
ＮＭ５３８およびＮＭ５３９１菌と混合した。その後３
７℃３０分培養した。両方の管に１１０ＩｒのＭｇＣｌ
２および０．７％アガロースを含む３ｒｄのＬＢマルト
ース培地を添加した。この溶液（６０℃）をＬＢプレー
ト上に注ぎ（１，５％寒天を含むＬＢ培地から調製）、
アガロースが固化した蒔に、薄いアガロース層を形成す
る。プレートは３７℃で一夜培養した。
細菌が感染を受けない場合、細胞の均一なマットがプレ
ートを被覆するが、感染孔の場合には、いわゆる斑点が
細胞マットに形成される。これらの斑点はファージによ
り溶解される感染大腸菌により形成され、離れて存在す
る細胞およびファージおよび流出する他の細胞内物質を
含む。
このプレート上に５００〜２０００個の斑点／プレート
が見られた。タン白Ｇをコードするストレプトコッカス
−ＤＮＡを含むＥＭＢＬ　　３−ファージを仮定し、そ
してこのＤＮＡは複製され、かつ大腸菌に発現すること
ができると仮定して、タン白Ｇの生産は感染細菌で行な
うことができ、細菌がファージ感染により破裂し、これ
らの内容物を遊離する場合相当する斑点にタン白Ｇを見
出すことができる。
ＥＭＢＬ　　３−ＤＮＡ−分子に組みこまれたストレプ
トコッカス−ＤＮＡ−断片は約２０ｋｂの大きさで、ス
トレプトコッカス　ゲノムは数千ｋｂに達することに留
意して、統計的に少数の斑点のみがタン白Ｇを含むにす
ぎない。
４、タン白Ｇを含む斑点の確認 この斑点にタン白Ｇを見出すために、分子の１００結合
能を使用した。ニトロセルロースフィルター（ＢＡ８５
メンブランフィルタ−１Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５ｃｈ
ｕｅｌｌ　、西独ダツセル）を室温で１０分間斑点を有
するプレートの上部に置いた。
次にプレートからタン白、ファージその他の物質をフィ
ルターに吸収させる。タン白を結合するフィルターの継
続能力を阻止するために、フィルターは特別のいわゆる
阻止緩衝液（３１，Ｌｄ　　５Ｍ　　ＮａＣｊ！、１０
．０ｄ！　　ＩＭトＩＪスＨＣＪ！、ｐ１１７．４．５
０ｄツイーン２０、蒸溜水１ｊ！に添加および０．２５
ｇのゼラチン）に入れた。緩衝液は１０分毎に４回換え
（各回１００ｓｄ！緩衝液）、そこでフィルターは２０
０μｌのパーオキシダーゼ−標識化ウサギＩ　ａＧ　（
ＤＡＫＯ−Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ社、デンマ
ークンを含む１００ｄの阻止緩衝液に入れ、室温で３０
分間振盪テーブル上で処理した。タン白Ｇがフィルター
により吸着される場合、パーオキシダーゼ−標識化Ｉｇ
Ｇ−抗体はフィルターに結合する。フィルターは再度阻
止緩衝液により４回洗滌し、次に新鮮な着色溶液（４〆
　１％　３−アミノ−９−エチルカルバゾール １）８５．１＋１０μＩ　Ｈ２Ｏ２）に入れ、そこでフ
ィルターに結合したパーオキシダーゼ−標識化ＩｇＧ−
抗体がキラキラ輝く赤色点として出現する。試験下のフ
ィルター上に総数で約６．０００の斑点に相当する総計
２６の赤色で輝くピンの頭用したフィルターを使用し、
そこで他のものと同じ方法で処理した。タン白Ｇを適用
した場所にキラキラ輝く赤色点が現れ、フィルターの残
部は白色であった。
次に初めのプレートからフィルター上の１０個のもつと
も強い赤色点をパスツール　ピペットで採取した。この
物質は１０個の管に洗滌して入れ、それぞれは１−のＳ
Ｍ−緩衝液（２０ｍＨ　　ｌ−リス−ＨＣｊ！、ｐＨ８
．０、０．ＩＭ　　ＮａＣｊ！，１０ｍＨｔＶＩＱｃｊ
！２および０．１％ゼラチン）を含み、再びＮＭ５３８
およびＮＭ５３９１［１菌に感染させるために使用した
。全体の手順を反復した。しかし、この場合１０個のプ
レートのうち８個で斑点の〉５０％が赤色、すなわちタ
ン白Ｇを含んでいた。新しい斑点を採取し、全体の手順
をさらに２回反復し、その後３個のプレート上に見出さ
れた赤色点は斑点の総数に相当した。従ってその結果と
してすべてがタン白ー〇ー遺伝子を含むファージから成
るＥＭＢＬ　　３−ファージ標品を得た。
これらの標品の１つ（ラムダＰＧ４Ｂと命名）はＡＴＣ
Ｃに４０１７６番として１９８５年３月２９日に寄託し
た。
５、ストレプトコッカス−ＤＮＡおよびＥＭＢＬン白Ｇ
の生産 上記に従って製造され、精製されたタン白Ｇ−遺伝子を
含むＥＭＢＬ　　３−ファージはＮＭ　　５３８および
ＮＭ５３９細菌を感染させるために使用した。ＮＨ５３
８のコロニーおよびＮＭ　　５３９のコロニーは１０ｍ
Ｈ　　ＭａＣｘ２を含む１００ｄＬＢマルトース培地を
各々が含む２個のビーカーにそれぞれ添加した。ざらに
タン白Ｇ−遺伝子を含む１００μｌのＥＭＢＬ　　３−
ファージを２個のビーカーのそれぞれに添加した。ビー
カーは３７℃で振盪しながら８時間インキニーベートし
た。細菌および細菌残渣は遠心分離したく１００００ｘ
Ｇ，２０分）。上澄液はパーオキシダーゼ−標識化抗体
の助けで、標準として純粋タン白Ｇによりタン白Ｇにつ
いて分析した。上澄液中に５〜ｉｏｎｏのタン白Ｇ／ｄ
を検知した。このタン白Ｇはプローブとして放射性標識
化ＩｇＧを使用するウェスタン　プロット方法により分
析し、分子量は約６０，０００で測定した。
２０ｋｂの大きさのタン白ＧーＤＮＡー断片を含むＥＭ
ＢＬ　　３−ＤＮＡは分解斑点から単離した。
異種ＤＮＡを全く含まないＥＭＢＬ　　３−ＤＮＡは制
限酵素ＥｃｏＲ　Ｉ　（ＥｃｏＲ　１部位を欠く）によ
り切断できない。他方２０ｋｂの大きさの断片はこの酵
素により切断できる可能性があった。
ＥｃｏＲ　Ｉがタン白Ｇ−遺伝子の外側を切断する場合
、タン白Ｇ−遺伝子を含む一層小さいＤＮＡ−断片を単
離することができる。ＥＣＯＲ　Ｉ−処理ＤＮＡ−物質
はその後ラムダ　ファージｇｔ１１からのＤＮＡと連結
した。連結およびその後の無きずのファージ粒子の構築
はＥＭＢＬ３に対する上記と同じ方法で行なった。その
後、大腸菌株Ｙ１　０９０　（ＡＴＣＣ）　、は同様に
ＥＭＢＬ３に対し記載した方法に従ってこれらのラムダ
ｇｔ１１ーファージを感染させた。プレートの分析にお
いて、すべての斑点がタン白Ｇを含むことが分った。プ
レートからラムダｑｔ１１ファージは常法で精製した。
ファージ−ＤＮＡは単離し、ファージ−ＤＮＡと連結し
たストレプトコッカス−ＤＮＡは再度ＥＣＯＲＩにより
切断した。電気泳動による分析はタン白Ｇ−１伝子を含
むこのＤＮＡ−断片が４，４ｋｂの大きさであることを
示した。ハイブリド−ＤＮＡ−分子はラムダＱｔ１１−
ＤＮＡから構築し、この４．４ｋｂの大きさのＤＮＡ断
片は別の大腸菌株（Ｙ１０８９、ＡＴＣＣ）を感染させ
るために使用した。この菌株は安定な溶原菌が得られた
場合大腸菌ゲノムにハイブリド−ＤＮＡ−分子を組みこ
むことを可能にする。
要約すると、本発明に従ってタン白Ｇ−遺伝子をバクテ
リオファージ−ＤＮＡに組みこみ、組みたてたハイブリ
ド−ＤＮＡ−分子を大腸菌に感染させ、結果としてタン
白Ｇを生産することができると云うことができる。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）微生物に発現させることができるタン白をコード
    するＤＮＡ配列を導入するベクターを含むハイブリド−
    ＤＮＡ−分子であつて、このＤＮＡ−配列はタン白Ｇお
    よび／又は、ＩｇＧへの結合能に関する限りタン白Ｇと
    実質的に同じ性質を有するタン白Ｇの断片をコードする
    ことを特徴とする、上記ハイブリド−ＤＮＡ−分子。
  2. （２）ＤＮＡ−配列はストレプトコッカスに由来する、
    特許請求の範囲第１項記載のハイブリド−ＤＮＡ−分子
    。
  3. （３）特許請求の範囲第１項又は第２項記載のハイブリ
    ド−ＤＮＡ−分子により形質転換することを特徴とする
    、微生物。
  4. （４）グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母細胞およ
    び植物細胞から選択する、特許請求の範囲第３項記載の
    微生物。
  5. （５）大腸菌株である、特許請求の範囲第３項又は第４
    項記載の微生物。
  6. （６）特許請求の範囲第３項から第５項のいずれか１項
    に記載の形質転換微生物の製造法において、この微生物
    を公知方法により特許請求の範囲第１項又は第２項記載
    のハイブリド−ＤＮＡ−分子で形質転換させることを特
    徴とする、上記方法。
  7. （７）タン白Ｇおよび／又はＩｇＧへの結合能に関する
    限りタン白Ｇと実質的に同じ性質を有するタン白Ｇの断
    片の製造法において、特許請求の範囲第３項から第５項
    のいずれか１項に記載の形質転換微生物を適当な培地で
    培養し、生成するタン白Ｇを単離することを特徴とする
    、上記方法。
JP61102941A 1985-05-03 1986-05-02 タン白ｇおよび／又はその断片の製造法 Pending JPS6225981A (ja)

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