JPH0720982B2 - 成長ホルモン様物質の改良精製法 - Google Patents
成長ホルモン様物質の改良精製法Info
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- JPH0720982B2 JPH0720982B2 JP61080976A JP8097686A JPH0720982B2 JP H0720982 B2 JPH0720982 B2 JP H0720982B2 JP 61080976 A JP61080976 A JP 61080976A JP 8097686 A JP8097686 A JP 8097686A JP H0720982 B2 JPH0720982 B2 JP H0720982B2
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Description
【発明の詳細な説明】 タンパクは、構造上の安定性に依存してその特異的機能
を働かせる生体高分子である。溶媒組成、pH、温度およ
び塩濃度における小さな変化が、しばしばタンパク構造
における重大な、時折不可逆的な変化を生じさせること
があるので、クロマトグラフィーによるタンパク精製
は、原則として非特異的で変性作用が最小である樹脂を
使用して行なわれてきた。従来このような樹脂は非常に
親水性であり、しばしば80％以上の水分含有率を有して
いる。これらの親水的性質のために、得られるクロマト
グラフィー用樹脂粒子は、適度な反圧下でも非常につぶ
れやすい。また、これらの親水性樹脂を有機溶媒で効果
的に洗浄することができないため、非特異的吸着を全て
排除することは困難である。従って作業者は、不均質な
天然供給源から得られるタンパクの処理精製の初期工程
で問題に直面することになる。より望ましい担体は、そ
の親水的性質のために、粘性の、スラッジ含有天然産物
混合物の迅速処理には不適当である。その結果、かなり
の追加経費をかけて初期精製にクロマトグラフィー以外
の方法を使用することが必要であった。
を働かせる生体高分子である。溶媒組成、pH、温度およ
び塩濃度における小さな変化が、しばしばタンパク構造
における重大な、時折不可逆的な変化を生じさせること
があるので、クロマトグラフィーによるタンパク精製
は、原則として非特異的で変性作用が最小である樹脂を
使用して行なわれてきた。従来このような樹脂は非常に
親水性であり、しばしば80％以上の水分含有率を有して
いる。これらの親水的性質のために、得られるクロマト
グラフィー用樹脂粒子は、適度な反圧下でも非常につぶ
れやすい。また、これらの親水性樹脂を有機溶媒で効果
的に洗浄することができないため、非特異的吸着を全て
排除することは困難である。従って作業者は、不均質な
天然供給源から得られるタンパクの処理精製の初期工程
で問題に直面することになる。より望ましい担体は、そ
の親水的性質のために、粘性の、スラッジ含有天然産物
混合物の迅速処理には不適当である。その結果、かなり
の追加経費をかけて初期精製にクロマトグラフィー以外
の方法を使用することが必要であった。
アンバーライト XAD樹脂類は、高分子マクロ網（目）
状吸着剤であり、ローム・アンド・ハース・カンパニー
（Rohm and Haas Company）によって市販品として生産
されている。これらの樹脂は、重合体の疎水性表面に対
する親和力の違いによって化合物が分離されるように設
計されている。XAD型樹脂は（１）粒子サイズが大きく
（20〜50メッシュ）、（２）非常に疎水的であるため、
構造的に類似しているペプチドおよびタンパクの複合生
物学的混合物のクロマトグラフィーにこれらの樹脂を実
際に使用することは驚くべきことであった。実際、タン
パク精製におけるこれらの担体の作業パラメータを詳述
している報告はない。しかしながらXAD型樹脂の上記２
特性のために、驚くべきことに、これらの樹脂は、構造
上異なっていたり構造上類似している両タンパクを含有
している非常に不純な、スラッジ含有混合物の初期精製
工程に非常に効果的である。XAD型樹脂は粒子サイズが
大きく不均一であるので、緩慢で等しくない相互作用の
力学のために、実質上そのクロマトグラフィーの性能を
低下させるであろうと予想するのが正しい。従って、タ
ンパクおよびポリペプチドの精製に、このような樹脂を
使用することは避けられてきた。しかしながら、本発明
者らは、成長ホルモン様物質を含有している非常に不純
な、スラッジ含有の物質に対して予め限定された条件下
で使用される場合は、この見かけ上の欠陥が、予想に反
して精製目的に好都合であることを見い出した。
状吸着剤であり、ローム・アンド・ハース・カンパニー
（Rohm and Haas Company）によって市販品として生産
されている。これらの樹脂は、重合体の疎水性表面に対
する親和力の違いによって化合物が分離されるように設
計されている。XAD型樹脂は（１）粒子サイズが大きく
（20〜50メッシュ）、（２）非常に疎水的であるため、
構造的に類似しているペプチドおよびタンパクの複合生
物学的混合物のクロマトグラフィーにこれらの樹脂を実
際に使用することは驚くべきことであった。実際、タン
パク精製におけるこれらの担体の作業パラメータを詳述
している報告はない。しかしながらXAD型樹脂の上記２
特性のために、驚くべきことに、これらの樹脂は、構造
上異なっていたり構造上類似している両タンパクを含有
している非常に不純な、スラッジ含有混合物の初期精製
工程に非常に効果的である。XAD型樹脂は粒子サイズが
大きく不均一であるので、緩慢で等しくない相互作用の
力学のために、実質上そのクロマトグラフィーの性能を
低下させるであろうと予想するのが正しい。従って、タ
ンパクおよびポリペプチドの精製に、このような樹脂を
使用することは避けられてきた。しかしながら、本発明
者らは、成長ホルモン様物質を含有している非常に不純
な、スラッジ含有の物質に対して予め限定された条件下
で使用される場合は、この見かけ上の欠陥が、予想に反
して精製目的に好都合であることを見い出した。
更に、このような成長ホルモン様物質の精製において付
加される実用上の意義は、XAD型樹脂は（１）低価格で
容易に入手でき、（２）１−13のpH範囲で十分に安定で
あり、（３）水性洗浄剤および有機溶媒を使用してカラ
ム内再生が容易であることである。
加される実用上の意義は、XAD型樹脂は（１）低価格で
容易に入手でき、（２）１−13のpH範囲で十分に安定で
あり、（３）水性洗浄剤および有機溶媒を使用してカラ
ム内再生が容易であることである。
文献には、最も一般的な方法以外にはタンパクおよびポ
リペプチドの精製におけるXAD型樹脂の使用は報告され
ていない。ピエトルジク（Pietrzyk,D.J.）およびスト
ドラ（Stodola,J.D.）、アナリティカル・ケミストリー
（Anal.Chem.）、53、1822−1828（1981）は、合成ジペ
プチドに利用するために、XAD−４即ちポリスチレン−
ジビニルベンゼンのコポリマーを分析的に調べた最初の
研究者であった。５残基の大きさの合成ペプチドについ
ての後続の研究［ピエトルジク（Pietrzyk,D.J.）、カ
ーヒル（Cahill.W.J.）およびストドラ（Stodola,J.
D.）ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー
（J.Liquid Chrom.）5、443−461［1982）］は、初め
て、粉砕して著しく小さな粒子にしておいたXAD−４樹
脂を用いてかなり効果的な処理精製を行なうことができ
ることを示した。従ってこれらの研究は、マクロポーラ
スな疎水性樹脂による小ペプチドのクロマトグラフィー
を呈示したものであるが、粒子サイズの大きな担体を使
用して、実質上より大きく、非常に多くの複合タンパク
の混合物を、非常に不純な混合物から効果的に分離し得
るかどうかという疑問に答えるものではなかった。
リペプチドの精製におけるXAD型樹脂の使用は報告され
ていない。ピエトルジク（Pietrzyk,D.J.）およびスト
ドラ（Stodola,J.D.）、アナリティカル・ケミストリー
（Anal.Chem.）、53、1822−1828（1981）は、合成ジペ
プチドに利用するために、XAD−４即ちポリスチレン−
ジビニルベンゼンのコポリマーを分析的に調べた最初の
研究者であった。５残基の大きさの合成ペプチドについ
ての後続の研究［ピエトルジク（Pietrzyk,D.J.）、カ
ーヒル（Cahill.W.J.）およびストドラ（Stodola,J.
D.）ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー
（J.Liquid Chrom.）5、443−461［1982）］は、初め
て、粉砕して著しく小さな粒子にしておいたXAD−４樹
脂を用いてかなり効果的な処理精製を行なうことができ
ることを示した。従ってこれらの研究は、マクロポーラ
スな疎水性樹脂による小ペプチドのクロマトグラフィー
を呈示したものであるが、粒子サイズの大きな担体を使
用して、実質上より大きく、非常に多くの複合タンパク
の混合物を、非常に不純な混合物から効果的に分離し得
るかどうかという疑問に答えるものではなかった。
非常に不純な供給源から得たタンパクの精製の困難さ
は、組換えDNA技術の出現およびそれを利用したペプチ
ドとタンパクの商業ベースでの生産において特に明白に
なってきた。組換えDNA法により、商業用として適切な
産物を発現させる場合も、出発酵ブロス中並びに、その
後の化学的処理および／またはその他の処理で生成する
混合物中に含まれている不純物から、組換えDNA−起源
の産物を単離することが必要である。このように、新し
い、商業規模のタンパク精製技術の必要性はきわめて重
要な問題となってきた。
は、組換えDNA技術の出現およびそれを利用したペプチ
ドとタンパクの商業ベースでの生産において特に明白に
なってきた。組換えDNA法により、商業用として適切な
産物を発現させる場合も、出発酵ブロス中並びに、その
後の化学的処理および／またはその他の処理で生成する
混合物中に含まれている不純物から、組換えDNA−起源
の産物を単離することが必要である。このように、新し
い、商業規模のタンパク精製技術の必要性はきわめて重
要な問題となってきた。
組換えDNA−起源のタンパクの精製をよりいっそう困難
にしている要素は、システイン残基を有する多数のタン
パクの存在にある。多くの場合、システイン含有タンパ
クの組換え発現後、、システイニルスルフヒドリルは、
タンパク精製の開始前に通常Ｓ−スルホネートに変換さ
れることによって可逆的に保護される。この変換および
／またはその他の処理は、必然的に望ましくないスラッ
ジ様不純物を更に生成することになり、非常に粘性の変
性剤が存在するため、先ずこれら所望のタンパクを分離
しなければならない。
にしている要素は、システイン残基を有する多数のタン
パクの存在にある。多くの場合、システイン含有タンパ
クの組換え発現後、、システイニルスルフヒドリルは、
タンパク精製の開始前に通常Ｓ−スルホネートに変換さ
れることによって可逆的に保護される。この変換および
／またはその他の処理は、必然的に望ましくないスラッ
ジ様不純物を更に生成することになり、非常に粘性の変
性剤が存在するため、先ずこれら所望のタンパクを分離
しなければならない。
このような種類の処理を商業的に適合するように行なう
には、所望の生成物をわずかしかまたは全く損失せず
に、生成物（この生成物が最終産物であるか途中の産物
であるかにかかわらず）から、スラッジ、塩、有機溶媒
および他の不純物を除去することができるような方法を
見い出すことが必要である。
には、所望の生成物をわずかしかまたは全く損失せず
に、生成物（この生成物が最終産物であるか途中の産物
であるかにかかわらず）から、スラッジ、塩、有機溶媒
および他の不純物を除去することができるような方法を
見い出すことが必要である。
本発明者らは、組換えDNA法によって得られた非常に不
純な原料から、成長ホルモン様物質の純度を高めるため
の非常に有利な方法を見い出した。この方法とは、不純
な原料をマクロポーラスアクリレートエステルコポリマ
ー樹脂製担体による逆相精製にかけることである。
純な原料から、成長ホルモン様物質の純度を高めるため
の非常に有利な方法を見い出した。この方法とは、不純
な原料をマクロポーラスアクリレートエステルコポリマ
ー樹脂製担体による逆相精製にかけることである。
本発明は、成長ホルモン様物質を含有している不純な混
合物から不純物を分離し、該成長ホルモン様物質を実質
上完全に回収する方法であって、 （１）該混合物を約７〜約９のpHで逆相マクロポーラス
アクリレートエステルコポリマー樹脂製担体に吸着さ
せ、 （２）アセトン、アセトニトリルおよびアセトンとアセ
トニトリルの組み合わせからなる群より選択される有機
希釈剤を約20容量％〜約80容量％含有しているpH約７〜
約９の水性溶出剤を使用して、該成長ホルモン様物質を
担体から溶出することからなる方法を提供するものであ
る。
合物から不純物を分離し、該成長ホルモン様物質を実質
上完全に回収する方法であって、 （１）該混合物を約７〜約９のpHで逆相マクロポーラス
アクリレートエステルコポリマー樹脂製担体に吸着さ
せ、 （２）アセトン、アセトニトリルおよびアセトンとアセ
トニトリルの組み合わせからなる群より選択される有機
希釈剤を約20容量％〜約80容量％含有しているpH約７〜
約９の水性溶出剤を使用して、該成長ホルモン様物質を
担体から溶出することからなる方法を提供するものであ
る。
上記の様に本発明の方法は、成長ホルモン様物質を含有
している非常に不純な混合物の精製を目的とするもので
ある。「成長ホルモン様物質」という用語は、（１）例
えばヒト、ウシまたはブタのような全ての種類の成長ホ
ルモン自体、（２）還元された（−SH）成長ホルモン、
および成長ホルモン、Ｓ−スルホネート等のＳ−保護成
長ホルモンのような成長ホルモンの前駆体、（３）例え
ばヒト成長ホルモンの20K変異体、メチオニルヒト成長
ホルモンのような、成長ホルモンアミノ酸配列を長くお
よび／または短くするように修飾されている構造のよう
な、成長ホルモンの変異体またはその前駆体および
（４）例えば成長ホルモンアミノ酸配列が１またはそれ
以上のアミノ酸残基の置換によって修飾されている構造
のような成長ホルモンの類似体およびその前駆体を意味
する。
している非常に不純な混合物の精製を目的とするもので
ある。「成長ホルモン様物質」という用語は、（１）例
えばヒト、ウシまたはブタのような全ての種類の成長ホ
ルモン自体、（２）還元された（−SH）成長ホルモン、
および成長ホルモン、Ｓ−スルホネート等のＳ−保護成
長ホルモンのような成長ホルモンの前駆体、（３）例え
ばヒト成長ホルモンの20K変異体、メチオニルヒト成長
ホルモンのような、成長ホルモンアミノ酸配列を長くお
よび／または短くするように修飾されている構造のよう
な、成長ホルモンの変異体またはその前駆体および
（４）例えば成長ホルモンアミノ酸配列が１またはそれ
以上のアミノ酸残基の置換によって修飾されている構造
のような成長ホルモンの類似体およびその前駆体を意味
する。
本発明の方法は、クロマトグラフィー用担体としてマク
ロポーラスアクリレートエステルコポリマー樹脂を使用
することを包含する。このようなコポリマー樹脂製吸着
剤は当業者に周知のものである。本発明の目的に非常に
適切な２種の担体は、ローム・アンド・ハース・カンパ
ニーから入手することができ、XAD−７およびXAD−８の
名称を有している。２種の内、XAD−８が本発明の目的
にとって特に好ましい。
ロポーラスアクリレートエステルコポリマー樹脂を使用
することを包含する。このようなコポリマー樹脂製吸着
剤は当業者に周知のものである。本発明の目的に非常に
適切な２種の担体は、ローム・アンド・ハース・カンパ
ニーから入手することができ、XAD−７およびXAD−８の
名称を有している。２種の内、XAD−８が本発明の目的
にとって特に好ましい。
本発明の方法は、３つのクロマトグラフィー工程または
段階に分けることができる。しかしながら、これらの内
２工程だけが必要である。このように、本方法は吸着お
よび吸着工程を含まなければならず、中間の洗浄工程を
含むことができ、含むことが好ましい。更に本方法は、
バッチ式またはカラム方式のいずれによって行なっても
よいが、精製効率のためにはカラム条件下で本方法を行
なうのがはるかに好ましい。本発明の方法は、バッチ式
またはカラム方式のいずれで行なわれる場合でも、その
成功への基礎となり、本発明の基本を構成する特定の条
件は変わらない。
段階に分けることができる。しかしながら、これらの内
２工程だけが必要である。このように、本方法は吸着お
よび吸着工程を含まなければならず、中間の洗浄工程を
含むことができ、含むことが好ましい。更に本方法は、
バッチ式またはカラム方式のいずれによって行なっても
よいが、精製効率のためにはカラム条件下で本方法を行
なうのがはるかに好ましい。本発明の方法は、バッチ式
またはカラム方式のいずれで行なわれる場合でも、その
成功への基礎となり、本発明の基本を構成する特定の条
件は変わらない。
本発明の吸着工程に使用される成長ホルモン様物質を含
有している複合混合物は通常、組換えDNA法による発現
の結果得られ、１またはそれ以上の中間の変換および／
または処理工程を含むことがある。通常、その少なくと
も１部のアミノ酸配列が成長ホルモン、その変異体また
はその類似体のアミノ酸配列に対応しているアミノ酸配
列を含有している生成物が発現される。その１部分だけ
が成長ホルモン様物質に対応している場合、発現産物は
通常、その長い鎖の発現産物から化学的または酵素的に
成長ホルモン様物質が生成されるように、選択的切断部
位を含有するように設計されている。発酵および切断の
結果得られる不純な混合物は、広範なペプチド類並びに
スラッジ、その他の物質およびそれらに比較してごく少
量の成長ホルモン様物質を含んでいるであろう。
有している複合混合物は通常、組換えDNA法による発現
の結果得られ、１またはそれ以上の中間の変換および／
または処理工程を含むことがある。通常、その少なくと
も１部のアミノ酸配列が成長ホルモン、その変異体また
はその類似体のアミノ酸配列に対応しているアミノ酸配
列を含有している生成物が発現される。その１部分だけ
が成長ホルモン様物質に対応している場合、発現産物は
通常、その長い鎖の発現産物から化学的または酵素的に
成長ホルモン様物質が生成されるように、選択的切断部
位を含有するように設計されている。発酵および切断の
結果得られる不純な混合物は、広範なペプチド類並びに
スラッジ、その他の物質およびそれらに比較してごく少
量の成長ホルモン様物質を含んでいるであろう。
この混合物を既知の条件下、多量の尿素（通常約7M）の
存在下で処理して、起こりがちであるペプチドの凝集を
最小限にすることができる。この様にして得られる、適
当な濃度の有機溶媒を含んだ、伝導性の高い、スラッジ
含有の尿素を含む混合物が、本発明の方法に従ってバッ
チ式またはカラム式でマクロポーラスアクリレートエス
テルコポリマーに吸着させる典型的な原料（「不純な混
合物」）に相当する。
存在下で処理して、起こりがちであるペプチドの凝集を
最小限にすることができる。この様にして得られる、適
当な濃度の有機溶媒を含んだ、伝導性の高い、スラッジ
含有の尿素を含む混合物が、本発明の方法に従ってバッ
チ式またはカラム式でマクロポーラスアクリレートエス
テルコポリマーに吸着させる典型的な原料（「不純な混
合物」）に相当する。
上記のような物質を吸着させる場合、スラッジ含有の尿
素を含む混合物のpHを約７〜約９の範囲、好ましくは約
８〜約９、最も好ましくは約8.5に調節し、得られる溶
液をマクロポーラスアクリレートエステルコポリマー樹
脂に接触させる。
素を含む混合物のpHを約７〜約９の範囲、好ましくは約
８〜約９、最も好ましくは約8.5に調節し、得られる溶
液をマクロポーラスアクリレートエステルコポリマー樹
脂に接触させる。
吸着工程の終了後、特にカラム式で行われた場合、約10
％〜約15％のアセトンおよび／またはアセトニトリルを
含有し、約７〜約９、好ましくは約8.5のpHの水性緩衝
液で樹脂を洗浄するのが好ましい。広範な緩衝剤のいず
れを使用してもよく、例えばトリス、エチレンジアミン
等が包含される。好ましい緩衝剤はトリスである。この
水性緩衝液による洗浄の前に、通常7M尿素、pH8.5の50m
Mトリスを使用する尿素洗浄を行なうのが好ましい。樹
脂への吸着または洗浄（この工程が含まれていれば）が
終了した後、成長ホルモン様物質は、実質上完全にスラ
ッジを含まないで樹脂から溶出され、実質上純度および
濃度が高められる。実質上完全な回収とは、出発不純混
合物中に存在している成長ホルモン様物質の約30％〜約
100％の回収を意味する。吸着された成長ホルモン様物
質の実際の溶離のために必要な条件は、前記のpH範囲お
よび溶離剤の組成である。pHは約７〜約９、好ましくは
約８〜約９の範囲になければならない。水性溶離剤は容
量基準で約20％〜約80％のアセトン、アセトニトリルま
たはこの２種の組み合わせ物を含有していなければなら
ない。溶出が一定濃度で行なわれる場合は、溶離剤中の
アセトンまたはアセトニトリルの量は約40％〜約50％と
なり、濃度こう配溶出が採用される場合は約20％〜約50
％の範囲以上になることが好ましい。
％〜約15％のアセトンおよび／またはアセトニトリルを
含有し、約７〜約９、好ましくは約8.5のpHの水性緩衝
液で樹脂を洗浄するのが好ましい。広範な緩衝剤のいず
れを使用してもよく、例えばトリス、エチレンジアミン
等が包含される。好ましい緩衝剤はトリスである。この
水性緩衝液による洗浄の前に、通常7M尿素、pH8.5の50m
Mトリスを使用する尿素洗浄を行なうのが好ましい。樹
脂への吸着または洗浄（この工程が含まれていれば）が
終了した後、成長ホルモン様物質は、実質上完全にスラ
ッジを含まないで樹脂から溶出され、実質上純度および
濃度が高められる。実質上完全な回収とは、出発不純混
合物中に存在している成長ホルモン様物質の約30％〜約
100％の回収を意味する。吸着された成長ホルモン様物
質の実際の溶離のために必要な条件は、前記のpH範囲お
よび溶離剤の組成である。pHは約７〜約９、好ましくは
約８〜約９の範囲になければならない。水性溶離剤は容
量基準で約20％〜約80％のアセトン、アセトニトリルま
たはこの２種の組み合わせ物を含有していなければなら
ない。溶出が一定濃度で行なわれる場合は、溶離剤中の
アセトンまたはアセトニトリルの量は約40％〜約50％と
なり、濃度こう配溶出が採用される場合は約20％〜約50
％の範囲以上になることが好ましい。
本発明の全工程は、例えば約４℃〜約30℃のような広範
な温度で行なうことができる。しかしながら本方法は、
約４℃〜約８℃の範囲の温度で行なわれるのが好まし
い。
な温度で行なうことができる。しかしながら本方法は、
約４℃〜約８℃の範囲の温度で行なわれるのが好まし
い。
本発明の方法によって溶出液として得られる水性−有機
溶液は、不純物質であるスラッジ、尿素、塩を含んでお
らず、マクロポーラスアクリレートエステルコポリマー
樹脂にかけられた最初の混合物より実質上純度が高い成
長ホルモン様物質を含有する。得られた成長ホルモン様
物質は、常法によって溶出液から回収してもよいし、溶
液自体を、この物質をさらに処理するのに使用してもよ
い。
溶液は、不純物質であるスラッジ、尿素、塩を含んでお
らず、マクロポーラスアクリレートエステルコポリマー
樹脂にかけられた最初の混合物より実質上純度が高い成
長ホルモン様物質を含有する。得られた成長ホルモン様
物質は、常法によって溶出液から回収してもよいし、溶
液自体を、この物質をさらに処理するのに使用してもよ
い。
溶出液中の成長ホルモン様物質からタンパク不純物を分
離するための、非常に有用であり、かつ全く予想し得な
かった１つの方法は、不純物の選択的沈澱である。本発
明者らは、成長ホルモン様物質および約20％〜約40％の
アセトニトリルを含有している溶出液のpHを約5.0〜約
6.5、好ましくは約5.2〜約5.6の範囲に下げることによ
って、その溶出液からある種のタンパク不純物を選択的
に沈澱させ得ることを見い出した。沈澱した不純物は、
遠心または過のいずれかによって除去する。溶出液中
の総タンパクの約半分が沈澱中に見出されるが、この中
には約５％の成長ホルモン様物質が存在するだけであ
る。このようにして、沈澱を除去した後の上澄み液中の
成長ホルモン様物質の比活性は、約２倍に高められてい
る。
離するための、非常に有用であり、かつ全く予想し得な
かった１つの方法は、不純物の選択的沈澱である。本発
明者らは、成長ホルモン様物質および約20％〜約40％の
アセトニトリルを含有している溶出液のpHを約5.0〜約
6.5、好ましくは約5.2〜約5.6の範囲に下げることによ
って、その溶出液からある種のタンパク不純物を選択的
に沈澱させ得ることを見い出した。沈澱した不純物は、
遠心または過のいずれかによって除去する。溶出液中
の総タンパクの約半分が沈澱中に見出されるが、この中
には約５％の成長ホルモン様物質が存在するだけであ
る。このようにして、沈澱を除去した後の上澄み液中の
成長ホルモン様物質の比活性は、約２倍に高められてい
る。
実施例１ メチオニルヒト成長ホルモンの精製組換えDN
A技術によって生成されたメチオニルヒト成長ホルモン
を含有している大腸菌（Esherichia coli）細胞を、細
胞ブロス全体を高速遠心することによって、湿った細胞
ペーストとして得た。冷却した、7Mの尿素を入れた50mM
トリス緩衝液（pH8.5）9l中に、細胞ペースト1Kgを分散
させた。トルエン（10ml）およびトリトンＸ−100（10m
l）を加えた。pHを8.5に調節した後、尿素−トリス緩衝
液で容量を10lに調節した。この懸濁液を、50％出力の
テクマー（Tekmar）組織ホモジナイザーを使用して５℃
で48時間攪拌した。細胞の溶解および破壊を助けるため
に、抽出の初めの数時間の間に数回、各々約10分の短時
間、ホモジナイザーの調節を約90％出力に高めた。
A技術によって生成されたメチオニルヒト成長ホルモン
を含有している大腸菌（Esherichia coli）細胞を、細
胞ブロス全体を高速遠心することによって、湿った細胞
ペーストとして得た。冷却した、7Mの尿素を入れた50mM
トリス緩衝液（pH8.5）9l中に、細胞ペースト1Kgを分散
させた。トルエン（10ml）およびトリトンＸ−100（10m
l）を加えた。pHを8.5に調節した後、尿素−トリス緩衝
液で容量を10lに調節した。この懸濁液を、50％出力の
テクマー（Tekmar）組織ホモジナイザーを使用して５℃
で48時間攪拌した。細胞の溶解および破壊を助けるため
に、抽出の初めの数時間の間に数回、各々約10分の短時
間、ホモジナイザーの調節を約90％出力に高めた。
XAD−８を１（５×52cm）カラムに充填し、10％のア
セトニトリルの、7M尿素、50mMトリス緩衝液（pH8.5）
で平衡化した。カラムに注入する溶液は、上記の細胞抽
出液4850mlからなるものであった。この抽出液は、総タ
ンパク86.8g中にメチオニルヒト成長ホルモン1.15gを含
有していた（比活性1.32％）。抽出液をカラムの上部に
13ml/分の一定流速で注入した。カラムからの溶出液
が、大部分の非吸着タンパクがカラムから洗い出された
ことを示すOD280nm＝0.12になるまで、10％アセトニト
リルの、7M尿素、50mMトリス緩衝液（pH8.5）でカラム
を洗浄した。この工程にはカラム容量の約3.3倍、即ち3
300mlの洗液が必要であり、これによってカラムから細
胞および細胞残渣が効果的に除去された。尿素を除去す
るために、洗液を10％のアセトニトリルの、50nMトリス
（pH8.5）に換えた。この工程には、アゾスティックス
（Azostix）試験紙を使用して尿素に対する陰性の試験
結果が得られるまで、カラム容量の約２倍、即ち2000ml
の洗液が必要であった。
セトニトリルの、7M尿素、50mMトリス緩衝液（pH8.5）
で平衡化した。カラムに注入する溶液は、上記の細胞抽
出液4850mlからなるものであった。この抽出液は、総タ
ンパク86.8g中にメチオニルヒト成長ホルモン1.15gを含
有していた（比活性1.32％）。抽出液をカラムの上部に
13ml/分の一定流速で注入した。カラムからの溶出液
が、大部分の非吸着タンパクがカラムから洗い出された
ことを示すOD280nm＝0.12になるまで、10％アセトニト
リルの、7M尿素、50mMトリス緩衝液（pH8.5）でカラム
を洗浄した。この工程にはカラム容量の約3.3倍、即ち3
300mlの洗液が必要であり、これによってカラムから細
胞および細胞残渣が効果的に除去された。尿素を除去す
るために、洗液を10％のアセトニトリルの、50nMトリス
（pH8.5）に換えた。この工程には、アゾスティックス
（Azostix）試験紙を使用して尿素に対する陰性の試験
結果が得られるまで、カラム容量の約２倍、即ち2000ml
の洗液が必要であった。
40容量％のアセトニトリルを入れた50mMトリス緩衝液
（pH8.5）を使用し、10ml/分の一定流速でメチオニル成
長ホルモンをカラムから溶出した。溶出液のフラクショ
ンを２分間隔（〜20mlフラクション）で集めた。カラム
からのメチオニル成長ホルモンの溶出を、分析用逆相HP
LCでモニターした。フラクション25〜60は有意な量のメ
チオニル成長ホルモンを示したので、合して（720ml）
検定した。合した液は、総タンパク2088mg中にメチオニ
ルヒト成長ホルモン741mgを含有していた。粗抽出液か
らのメチオニル成長ホルモンの回収率は64％であり、タ
ンパクに基づく比活性は35％であり、これは粗抽出液、
即ち細胞リゼイトから27倍の精製を表わしている。放射
免疫検定およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって、XAD−８溶出液中に成長ホルモンが含有され
ていることを確認した。
（pH8.5）を使用し、10ml/分の一定流速でメチオニル成
長ホルモンをカラムから溶出した。溶出液のフラクショ
ンを２分間隔（〜20mlフラクション）で集めた。カラム
からのメチオニル成長ホルモンの溶出を、分析用逆相HP
LCでモニターした。フラクション25〜60は有意な量のメ
チオニル成長ホルモンを示したので、合して（720ml）
検定した。合した液は、総タンパク2088mg中にメチオニ
ルヒト成長ホルモン741mgを含有していた。粗抽出液か
らのメチオニル成長ホルモンの回収率は64％であり、タ
ンパクに基づく比活性は35％であり、これは粗抽出液、
即ち細胞リゼイトから27倍の精製を表わしている。放射
免疫検定およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって、XAD−８溶出液中に成長ホルモンが含有され
ていることを確認した。
実施例２ メチオニル成長ホルモンの20K変異体の精製 組換えDNAによって発現されたメチオニルヒト成長ホル
モンの20K変異体を含有している大腸菌（E.coli）細胞
を遠心して、湿った細胞ペーストを得た。細胞ペースト
587gを、0.25M塩化ナトリウム、0.001MEDTA（pH9.4）の
6Mグアニジンヒドロクロリド溶液4700ml中に分散した。
組織ホモジナイザーを使用して細胞のスラリーをホモジ
ナイズし、0.1％トリトンＸ−100を加え、この混合物を
64時間攪拌した。
モンの20K変異体を含有している大腸菌（E.coli）細胞
を遠心して、湿った細胞ペーストを得た。細胞ペースト
587gを、0.25M塩化ナトリウム、0.001MEDTA（pH9.4）の
6Mグアニジンヒドロクロリド溶液4700ml中に分散した。
組織ホモジナイザーを使用して細胞のスラリーをホモジ
ナイズし、0.1％トリトンＸ−100を加え、この混合物を
64時間攪拌した。
抽出液をアセトニトリルで10％v/vにし、10％のアセト
ニトリルの50mMトリス（pH8.5）で平衡化したXAD−８の
１カラム（５×50cm）上にポンプで注入した。カラム
溶出液が透明かつ無色になるまで、7.5M尿素、50mMトリ
ス（pH8.5）、10％アセトニトリルの溶液約2.5lでカラ
ムを洗浄した。次いで、10％アセトニトリルの50mMトリ
ス（pH8.5）約3lでカラムを一夜洗浄した。
ニトリルの50mMトリス（pH8.5）で平衡化したXAD−８の
１カラム（５×50cm）上にポンプで注入した。カラム
溶出液が透明かつ無色になるまで、7.5M尿素、50mMトリ
ス（pH8.5）、10％アセトニトリルの溶液約2.5lでカラ
ムを洗浄した。次いで、10％アセトニトリルの50mMトリ
ス（pH8.5）約3lでカラムを一夜洗浄した。
50mMトリス（pH8.5）中に20％〜80％のアセトニトリル
を含有している濃度こう配を使用して、カラムを溶出し
た。流速は12ml/分であり、フラクションは２分間隔
（〜24ml/フラクション）で集められた。迅速タンパク
液体クロマトグラフィー（FPLC）によって、20Kメチオ
ニルヒト成長ホルモンについてフラクションを検定し、
成長ホルモンを含有しているフラクション（フラクショ
ン25〜65）を合して検定した。合した液は、総タンパク
3.61g中に20K変異体1.78gを含有していた。タンパクに
基づく20K変異体の比活性は49％であった。
を含有している濃度こう配を使用して、カラムを溶出し
た。流速は12ml/分であり、フラクションは２分間隔
（〜24ml/フラクション）で集められた。迅速タンパク
液体クロマトグラフィー（FPLC）によって、20Kメチオ
ニルヒト成長ホルモンについてフラクションを検定し、
成長ホルモンを含有しているフラクション（フラクショ
ン25〜65）を合して検定した。合した液は、総タンパク
3.61g中に20K変異体1.78gを含有していた。タンパクに
基づく20K変異体の比活性は49％であった。
実施例３ pH約5.5における不純物の直接沈澱による、X
AD溶出液からのメチオニルヒト成長ホルモンの精製 メチオニルヒト成長ホルモンを含有しているXAD−８溶
出液50mlに、攪拌下で氷酢酸（〜0.2ml）を徐々に加え
た。溶出液は約30％のアセトニトリルを含んでいた。羊
毛状の白色沈澱が生成した後、この懸濁液を５℃で約1.
5時間放置した。遠心して沈澱を分離し、水酸化アンモ
ニウムでpHを8.0に調節することによって蒸留水10mlに
溶解した。沈澱から得た溶液および上澄み液のフラクシ
ョンを検定した。結果を以下の表に示す。
AD溶出液からのメチオニルヒト成長ホルモンの精製 メチオニルヒト成長ホルモンを含有しているXAD−８溶
出液50mlに、攪拌下で氷酢酸（〜0.2ml）を徐々に加え
た。溶出液は約30％のアセトニトリルを含んでいた。羊
毛状の白色沈澱が生成した後、この懸濁液を５℃で約1.
5時間放置した。遠心して沈澱を分離し、水酸化アンモ
ニウムでpHを8.0に調節することによって蒸留水10mlに
溶解した。沈澱から得た溶液および上澄み液のフラクシ
ョンを検定した。結果を以下の表に示す。
操作損失および検定法固有の誤差のために、合計は100
％になっていない。
％になっていない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/74 7055−2Ｊ
Claims (11)
- 【請求項１】成長ホルモン様物質を含有している不純な
混合物から不純物を分離するための方法であって、 （１）該混合物を約７〜約９のpHで逆相マクロポーラス
アクリレートエステルコポリマー樹脂製担体に吸着さ
せ、 （２）アセトン、アセトニトリルおよびアセトンとアセ
トニトリルの組み合わせからなる群より選択される有機
希釈剤を約20容量％〜約80容量％含有しているpH約７〜
約９の水性溶出剤を使用して、該成長ホルモン様物質を
担体から溶出することからなる方法。 - 【請求項２】成長ホルモン様物質が、ヒト成長ホルモン
のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有している第１項
に記載の方法。 - 【請求項３】成長ホルモン様物質が、ウシ成長ホルモン
のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有している第１項
に記載の方法。 - 【請求項４】成長ホルモン様物質が、ヒト成長ホルモン
の20K変異体のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し
ている第１項に記載の方法。 - 【請求項５】成長ホルモン様物質が、成長ホルモンの前
駆体である第１項に記載の方法。 - 【請求項６】マクロポーラスアクリレートエステルコポ
リマー製担体がXAD−７またはXAD−８である第１項〜第
５項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】マクロポーラスアクリレートエステルコポ
リマー製担体がXAD−８である第６項に記載の方法。 - 【請求項８】成長ホルモン様物質を含有している不純な
混合物を、約８〜約９のpHでマクロポーラスアクリレー
トエステルコポリマー製担体に吸着させる第７項に記載
の方法。 - 【請求項９】成長ホルモン様物質を、約８〜約９のpHの
水性溶出剤を使用して担体から溶出する第８項に記載の
方法。 - 【請求項１０】約20容量％〜約40容量％のアセトニトリ
ルを含有している水性溶出剤を使用し、該担体から該成
長ホルモン様物質を溶出することによって得られる溶出
液のpHを約5.0〜約6.5の範囲に下げ、沈澱した不純物を
溶出液から除去して、純度の高まった成長ホルモン様物
質を含有している溶液を得る第１項〜第９項のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項１１】溶出液のpHを約5.2〜約5.6の範囲に下げ
る第10項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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