KR100229420B1 - 대장균에서 발현된 닭 성장 호르몬의 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 재조합된 대장균에서 발현된 닭 성장 호르몬을 정제하는데 있어서, (가) 닭 성장 호르몬이 발현된, 대장균을 분쇄하여 불용성의 닭 성장호르몬 굴절체를 분리하고 ; (나) 분리된 불용성 굴절체를 계면활성제 및 에틸렌디아민테트라 아세트산이 함유된 용액으로 세척한 다음 다시 100 내지 500mM 염화나트륨 또는 증류수로 세척하고 ; (다) 불용성 굴절체를 수산화나트륨을 사용하여 pH 11.5 내지 13.0에서 용해시킨 후 ; (라) 원심분리 및 한 외여과법에 의해 용해되지 않은 침전물을 제거하고 ; (마) 음이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피하여서 닭 성장 호르몬을 정제함으로써, 닭 성장 호르몬을 저렴한 비용으로 고순도 및 고수율로 대량 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
Description
제 1도는 닭 성장 호르몬의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
제 2도는 닭 성장 호르몬이 발현된 대장균 추출액을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영도(SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이며,
제 3도는 정제된 닭 성장 호르몬을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과이다.
본 발명은 유전공학적인 방법으로 유전자 재조합된 대장균(E. coli)에서 발현된 닭 성장 호르몬을 정제하는 방법에 관한 것이다.
닭 성장 호르몬은 닭의 뇌하수체 전엽에서 분비되는 폴리펩티드 호르몬의 일종으로서 191개의 아미노산으로 구성되고 제 1도에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 분자량이 약 23.5 킬로달톤(kD) 정도이다(B. Houston et al., J. Endocr, 116, 35-41(1988).
유전자 재조합 기술의 개발 및 이용은 천연에서는 극미량밖에 얻을 수 없는 천연 단백질을 대량으로 생산할 수 있게 함으로써, 동물 성장 호르몬등을 의약품으로서 뿐만 아니라 식품 또는 사료첨가제로서도 이용 가능한 정도의 경제적인 가격으로 얻을 수 있게 해주었으며(Seeburg et al., DNA2(1), 37-45(1983)), 이와 아울러 재조합 기술에 의해 생산된 단백질을 고순도로 대량 정제하기 위한 기술이 꾸준히 개발되어 왔다.
특히, 대장균에서 발현된 닭 성장 호르몬은 불용성의 굴절체(inclusion body)를 형성하므로 다른 불순 수용성 단백질과의 분리가 용이하며 적당한 세척액등에 대해서 안정하여 정제 공정을 간단히 할 수 있고 대장균에서 유래되는 엔도톡신(endotoxin)등의 제거를 용이하게 할 수 있는 장점이 있기 때문에 대장균을 발현숙주로 사용하는 방법이 닭 성장 호르몬을 대량 생산 및 정제하는데 자주 사용되어 왔다.
그런데, 이런 류의 단백질 굴절체를 정제하기 위해서는 적당한 방법에 의하여 단백질 굴절체를 용해시켜야 하며, 그러한 용해방법으로는 요소(Urea), 구아니딘 염(guanidineㆍHCI) 또는 소디움 도데실 설페이트(SDS)등의 용해제를 사용하는 방법등이 알려져 왔다. 그러나, 용해제로서 요소나 구아니딘 염을 사용하는 방법은 지금까지 가장 널리 알려진 방법이기는 하지만 정제비용이 과다하게 소요되어 실용적이지 못하고, SDS 를 사용하는 경우는 정제 비용은 비교적 저렴한 편이나 정제후 SDS의 완전한 제거가 곤란하여 활성을 갖는 순수한 단백질만을 분리하는데 많은 제약을 받게 되므로 정제공정이 복잡해지는 단점이 있다. 더우기 이들 용해제 사용에 의한 방법은 사용된 용해제가 단백질등을 변성시키기 때문에 구조적으로 활성이 없거나 활성을 저하시키므로 별도의 활성화 단계가 필요한 등, 순수한 형태의 활성을 갖는 닭 성장 호르몬을 정제하는데 제약이 많았다.
그 밖에 알려진 닭 성장 호르몬의 정제 방법으로서 단일항체(monoclonal antibody)를 이용한 친화성 크로마토그래피 방법(B. Houston et al., J. Endocr, 125, 207-215(1990))과 양이온 교환 수지와 음이온 교환 수지를 함께 이용하는 방법(L. M. Souza et al., J. Exp. zology 232 465-474(1984))이 알려져 있다.
그러나 단일 항체를 이용하는 방법은 단일 항체의 생산 비용이 높을 뿐 아니라 대량으로 정제하는 방법으로는 부적합하고, Souza 등이 이용한 방법은 이온 교환 크로마토그래피 단계를 2번 행하는 방법으로 값이 저렴하거나 간단한 방법이 아니며, 대장균을 숙주로 했을 때에 숙주 유래 발열 물질등의 제거에 많은 어려움이 있었다.
본 발명자들은 상기 선행기술들의 문제점을 해결하여 정제수율을 높이고자 연구를 거듭한 결과, 알칼리를 사용하여 굴절체를 용해시키는 방법이 매우 효과가 있음을 알게 되어 본 발명의 정제방법을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 대장균에서 발현된 닭성장 호르몬을 효율적으로 정제하는 방법을 제공하는 것으로, 닭성장 호르몬이 발현된 대장균을 분쇄하여 불용성 굴절체를 분리한 후 비이온성 계면활성제 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 함유된 완충용액으로 세척하고 다시 염화나트륨 또는 증류수로 재차 세척하여 각종 불순물들을 제거하고, 이어서 분리된 불용성 굴절체를 알칼리 pH 에서 용해시킨 다음 용해된 상등액을 한외여과하여 닭 성장 호르몬 부분을 회수한 후 이를 음이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피함을 특징으로 하는 일련의 정제 공정을 거침으로써 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, 배양된 대장균을 수확하여 통상적인 방법에 따라 대장균의 세포막을 분쇄힌다. 예컨대 세포 분쇄용 완충용액에 라이소자임(lysozymr)을 첨가형 초음파 분쇄기 등의 통상의 세포 분쇄기를 사용하여 분쇄할 수 있다.
분쇄가 끝나면 닭 성장 호르몬 굴절체가 함유된 침전층을 회수하고 이를 계면활성제와 EDTA의 혼합액이 함유된 완충용액(pH 7.2)으로 1차 세척하고 이를 다시 염화나트륨(NaCl)용액이 함유된 완충용액(pH 7.2) 또는 증류수로 재차 세척함으로써 잔류 세포막과 비단백 분순물, 불순 단백질 등을 제거한다. 이 단계에서 사용되는 계면활성제는 트리톤 엑스-100(Triton X-100)으로서 0.1 내지 1%의 농도로 사용하는 것이 적당하고 염화나트륨은 100~500mM의 것을 사용한다.
세척이 끝난 닭성장 호르몬 굴절체를 증류수에 현탁시키고 교반하면서 수산화나트륨 수용액을 서서히 가하여 pH를 11.5 내지 13.0, 특히 바람직하게는 11.8 내지 12.3의 범위로 조절한다. 이 pH 범위를 그대로 유지하면서 약 1.5 내지 3시간 정도 교반한 수 , 원심분리하여 불용성 분순물을 제거한다.
상등액을 회수하여 한외여과막으로 여과한 후 여액을 모아 농축하고 pH를 다시 8.5 내지 10.5, 바람직하게는 9.0 내지 9.5의 범위로 조절한 다음 음이온 교환수지에 흡착시키고 70~150mM 염화나트륨이 함유된 완충용액으로 용출시키면 순도 95% 이상, 엔도톡신 10 유니트(EU)/mg 이하인 고순도의 닭 성장 호르몬이 얻어진다. 이때 한외 여과막은 분자량 10만 또는 30만 이하의 분자량을 통과시키는 것이 사용되며, 음이온 교환 수지는 디에틸아미노에틸(DEAE)을 작용기로 하는 것을 사용한다.
이와 같은 본 발명이 적용될 수 있는 닭 성장 호르몬을 발현시키는 대장균은 어떤 것이어도 좋으며, 본 발명의 하기 실험에서는 본 출원인((주)럭키)에 의해 부다페스트 조약하의 국제기탁 기관인 한국미생물보존센터에 1991년 6월 26일 기탁번호 KCCM-10005로 기탁된 바 있는 대장균 W3110(ptrp-CST)를 사용하였다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1] 대장균에서 닭 성장 호르몬 굴절체의 회수
발효후 수확한 대장균(KCCM-10005) 1kg 을 완충용액 (50mM 트리스, 50mM EDTA, pH 7.4) 4ℓ에 투입하고 폴리트론(Lightnin 사, 모델 TS1515)으로 3 분간 교반하여 균질한 상태로 만든 후, 초음파 분쇄기(Ultra sonicator : Cole-Pamer 사 , 모델 4710)으로 3 분간 처리하고, 라이소자임(달걀흰자 라이소자임)을 0.4g 첨가하여 농도가 0.1g/ℓ가 되도록 한 다음, 37℃ 에서 30분간 교반하였다.
여기에, 20% 트리톤 엑스-100 200㎖ 를 넣고 폴리트론(polytron)으로 약 5분간 격렬하게 교반한 다음 원심분리기(Backman 사, 모델 JM-21)로 30분간 원심분리하여 상등액은 버리고 침전층을 회수하였다. 이를 100mM 염화나트륨, 10mM 트리스가 함유된 완충용액(pH 7.2) 2ℓ로 세척한 후 다시 원심분리하여 침전물을 회수하여서 닭 성장 호르몬 굴절체를 얻었다.
[실시예 2] 닭 성장 호르몬 굴절체의 용해
상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 닭 성장호르몬 굴절체를 8ℓ의 증류수에 현탁시키고 1N 수산화나트륨 용액을 소량씩 가하여 pH가 약 12.3 정도가 되게하였다. 3시간 교반시켜 준 다음, 이를 원심 분리기로 원심분리하여 불용성 불순물을 제거하였다.
[실시예 3] 한외 여과 및 음이온 교환 수지컬럼에 의한 닭 성장 호르몬의 정제
상기 실시예 2에서 얻어진 용해된 상등액을 한외 여과하여 분자량 30 만 이하의 여액 40ℓ을 회수하고 이를 20ℓ로 농축한 후에 pH를 9.0으로 조절하였다. 이 닭 성장 호르몬이 함유된 농축액을 10mM 글리신 완충용액(pH 9.0)으로 평형시킨 DEAE-세파로즈(sepharose) 컬럼에 약 10ℓ/시간의 유속으로 흡착시키고 컬럼의 5배 부피의 10mM 글리신 완충용액(pH 9.0)으로 세척한 수 90mM 의 염화나트륨이 함유된 글리신 완충 용액으로 용출(pH 9.0)시키고 이를 농축하여 약 3.6g 의 닭 성장 호르몬을 얻었다. 이때 정제된 닭 성장호르몬은 93%의 순수한 단량체를 갖으며 순도가 99.7%이고 엔도톡신은 닭 성장 호르몬 1mg당 10유니트 이하였다.
상기 실시예에서 닭 성장 호르몬이 발현된 대장균의 전체 추출액과 최종적으로 얻어진 정제된 닭 성장호르몬을 SDS-PAGE 한 결과를 제 2도에 나타내었다.
제 2도에서, A는 표준 분자량 표식 단백질이고, B는 닭 성장 호르몬이 발현되지 않은 대장균의 총 단백질이고, C는 닭 성장 호르몬이 발현된 대장균의 총 단백질이며, D 는 정제된 닭 성장 호르몬으로서, 닭 성장호르몬은 약 23.5 키로달톤 정도에서 뚜렷한 밴드를 보였다.
제 3도는 상기 실시예에서 정제된 닭 성장 호르몬을 고성능 액체 크로마토그래피한 결과로 순도가 99.7%의 매우 높은 수치를 나타내었다.
Claims (4)
- 유전자 제조합된 대장균에서 발현된 닭 성장호르몬을 정제하는 방법에 있어서,(가) 닭 성장 호르몬이 발현된 대장균을 분쇄하여 불용성의 닭성장 호르몬 굴절체를 분리하고 ;(나) 분리된 불용성 굴절체를 계면활성제 및 에틸랜디아민테트라 아세트산이 함유된 용액으로 세척한 다음 농도 100 내지 500mM의 염화나트륨 또는 증류수로 세척하고 ;(다) 불용성 굴절체에 수산화나트륨을 첨가하여 pH 11.5 내지 13.0에서 용해시킨 후 ;(라) 원심분리 및 한외여과법에 의해 용해되지 않은 침전물을 제거하고 ;(마) 음이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 (나) 단계의 계면활성제가 0.01 내지 1% 농노의 트리톤 엑스-100(Triton X-100)인 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 (라) 단계의 한외여과는 분자량 30만 이하의 물질만을 통과시키는 한외여과막을 사용하는 것인 방법.
- 제 1항에 있어서,상기 (마) 단계의 음이온 교환 수지 컬럼 크로마토그래피는 pH 8.5 내지 pH 10.5에서 실시하며, 음이온 교환 수지가 디에틸아미노에틸을 작용기로 하고, 용출제로서 70 내지 150mM 의 염화나트륨 용액을 사용하는 것인 방법.
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