JPS59501852A - 鳥類の成長ホルモン - Google Patents

鳥類の成長ホルモン

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JPS59501852A
JPS59501852A JP83503097A JP50309783A JPS59501852A JP S59501852 A JPS59501852 A JP S59501852A JP 83503097 A JP83503097 A JP 83503097A JP 50309783 A JP50309783 A JP 50309783A JP S59501852 A JPS59501852 A JP S59501852A
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ス−ザ・ロウレンス・エム
ブ−ン・ト−マス・シイ
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アムジエン
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    • C07K2319/02Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 r鳥類の成長ホルモンj これは、1982年9月16日に提出した先の申請中の出願N。
、418,846の一部継続である。
■ ここで述べようとする発明は概して遺伝子操作に関するものである。詳しくは、 鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質を1つ以上持ったポリペプチドが 化度可能になった遺伝子組換え技術の応用についてである。
A、這猛ヱ探作 遺伝物質は、広義には、「細胞やウィルスの成分の構築をプログラムしておいて 、それを導き出したり、細胞やウィルスの反応を引き出したりする化学物質」と 定義される。デオキシリボ核酸(DNA)として知られている長鎖のポリマーは 、リボ核酸によってプログラムされるある種のウィルスを除き、全ての生きた細 胞やウィルスの遺伝をつかさどる物質である。DNAポリマーの中に繰り返され る単位は、 4種類のヌクレオチドである。各ヌクレオチドは、リン酸基につな がるデオキシリボ核酸(糖)と結合しているプリン塩基(アデニンまたはグアニ ン)がピリミジン塩基(チミンまたはシトシン)を含む。線状重合体の構造の中 で、ヌクレオナトとうしの結合は、一方の5−リン酸基がもう一方の3”−水酸 基に結合することによっている。実際に機能しているDNAは、ヌクレオチドの つらなった単鎖(デオキシリボヌクレオチドとして知られている)どうし連結し た安定な二重鎖の構造で存在している。この連結はプリン・ピリミジン塩基間の 水素結合によるものである。〔すなわち、アデニン(A)とチミン(T)。
あるいはグアニン(G)とシトシン(C)という「相補的1組合せが存在する。
〕慣例として、ヌクレオチドは、その成分であるプリン塩基またはピリミジン塩 基の名によって表わされ、二重鎖DNA中のヌクレオチドの相補的組合せ(すな わち、A−T、(、−C)は「塩基対」と呼ばれる。リボ核酸は、アデニン、グ アニン。
シトシンそしてチミンの代わりにウラシル(U)を含み、リポースとリン酸基に 結合している。
ごく端的に述べると、DNAの機能のプログラミングは、一般に、特異性を有し たDNAヌクレオチドシークエンス(遺伝子)が比較的不安定なメツセンジャー RN A (mRNA)に「転写」されるという過程を通じて働く。mRNAは 順番に、アミノ酸から構造。
調節、触媒などに関する蛋白質が形成される際の鋳型として使われる。このmR NAの「転移」の過程は小さなRNA鎖(tRNA)の作用を含んでいる。つま り、 tRNAは個々のアミノ酸を運搬し、 mRNAに沿って並ばせ、これに 特異的なアミノ酸配列でポリペプチドを形成させるのである。mRNへの伝達内 容(メツセージ)はi DNAに由来し、 LRNA供給のためのちととなる情 報であり、しいては、ポリペプチド「表現Jの際、20種のアミノ酸から1種を 選び与える基礎的情報となる。こうしたmRNAのメソセージは3連の「暗号( コドン)」で書かれている。すなわち、シーフェンスの1グループは3つのヌク レオチド塩基である。ある意味で、 1つの蛋白の合成は、遺伝子のヌクレオチ ド配列によって供給される。プログラムされていた遺伝のメツセージを「表現誹 する最終的な形である。
普通、DNAポリマー中の遺伝子よりも「プロモーター」シーフェンスが「先に 立ちJ 、 mRNAへの転写の開始部位を備えている。
rレギュレーター(調節遺伝子)」シーフェンスも1通常、与えられたDNAポ リマー中の遺伝子から「上流側」にある(すなわち、先行している)が、転写の 開始の頻度(率)を決定する蛋白質と結合している。「プロモーター/レギュレ ゛−ター」もしくは「コントロールJ DNAンークエンスとしてひとまとめに した時。
機能しているDNA中の選択された遺伝子(つまり一連の遺伝子)に先立つこれ らのシーフェンスは、遺伝子の転写(そして最終的な表現)を起こすかどうかを 決定するのに協同で作用する。DNAポリマー中の遺伝子のあとに来て、 mR NAへの転写の終了を合図するDNA配列は、転写の「ターミネータ−Jシー、 フェンスと呼ぶ。
最近のほぼ千年にわたる微生物利用の考え方は、有意義な物質を、生物(それ自 身のDNA中には請求め名物質に関する遺伝情報を本来もっていないもの)を使 って、工業的、薬学に生産するという試みを提供してきた。この工程は、簡単に は次の通りである。生成物質の構造を規定する遺伝子を「供与体(ドナー)」の 生物から単離するか、あるいは化学的に合成する。そして、その遺伝子を別の生 物−ひんばんに自己複製している単細胞の微生物−に安定した状態で誘導する。
ひとたび以上のことがなされると。
「形質転換jされた宿主細胞で、遺伝子表現のための生ける工場がめる産物を作 る働きをする。
1組換えDNAJの方法論に関しては、特許をとったり論文になっている技術が 豊富にある。それは1選ばれた宿主生物を形質転換する際に用いるための遺伝物 質の単離1合成、精製、増幅。
に関するものである。たとえば5コウエン等の米国特許No、4,237.22 4は単細胞の原核生物の形質転換に関するものであり、その生物は1選ばれた外 因性DNAシークエンスを含む「雑種(ハイブリ、ド)Jのウィルスもしくは環 状のプラスミドのDNAを持つ。
コラエン等の特許の手順は、まず酵素によって切断されたウィルスのDNAか環 状のプラスミドのDNAにより、形質転換のための中間伝導体(ベクター)を生 産すること、その結果、線状DNA鎖を形成することからはじまる。選ばれた異 種の(「外因性」またはr異物のましったJ)DNA鎖もまた。類似の酵素を使 用することにより、直線型にす゛る。 ウィルスもしくはプラスミドの線状のD NAを異種のDNAとともに、修復過程を触媒する制限酵素の存在下でインキュ ベートする。その結果、ハイブリッドのベクターがつくられ、ウィルスや環状の DNAプラスミド中に「つなぎ換えられた」異種のDNAを含むことになる。
ハイブリッドのベクターと共生できる単細胞の宿主生物は形質転換により宿主の 細胞集団の中で、異種のDNAを大量に複製することになる。いくつかの例にお いては請求められる結果は、単に異種であるDNA増量であり、とれる「産生物 質lはDNAである。が、多くの場合には、さらに形質転換の最終目標は、異種 のDNAが宿主細胞により表現されること、すなわち、異種DNAによってコー ドされた商業的に価値のある蛋白質やポリペプチドが単離しうるほど大量に合成 されるという形をとることである。
たとえば、米国特許No、4,269,731 (シャイン) 、 4,273 ,875 (?ニス) 、 4,293,652 (コラエン)も参照するとわ かる。
DNAベクターへの「つなぎ換え(タブライジング)」に適用する特異的DNA シークエンスはさまざまな技術によって開発されている。その開発内容は、計画 された宿主に対する「ドナー」の「異種性」の程度、および宿主において表現さ れるはずのポリペプチドの大きさに強く依存している。極端に単純化する危険を あえておかせば、三つの原理による方法がおこなわれうると言える。即ち、 ( 1)ドナーのDNAから二重鎖D N Aシーフェンスをそのまま「単離J、( 2)興味あるポリペプチドに対する暗号を備えたDNAシークエンスを化学的に 合成、 (3)ドナー細胞から単離したmRN八をr逆転写」してガラス器内で 二重鎖DNAシークエンスを合成。最後に述べた方法ではmRNAの「相補的J DNAの形成を含み、一般にrCDNA J法と呼ばれている。
コラエン等の特許で述べられたような手法の成功は、大部分「制限リボヌクレア ーゼ」という酵素の重宝な有用性によるものである。この制限酵素は、細胞融合 していないDNAベクターと。
たとえば真核細胞のDNA鎖(興味の対象である異種シーフェンスを含んでいる )との両方のある部位が特異的に分断されるのを促進する。この分断は、直線状 のDNA二重二重で相補的単鎖の「末端Jを形成するのに用いられる方法で、さ らに加えられる「結紮」酵素の作用ともあわせて異種DNAがベクターへ「とり こまれる」可能性を非常に増大する。このような制限エンドヌクレアーゼ酵素の 大多数は現在市販されている。〔例えばメリーラント州ケイザースハーグのヘゼ スダ・リサーチ・ラボラトリーズ。
インコーボレイティソド(Bethesda Re5earch Labora tories、 Inc、)の”81 /’82カタログjに出ているrBRL 制限エンドヌクレアーゼ一覧表Jを見よ。〕ハイブリッド生成の検証は、クロマ トグラフィーによって行われた。例えば、ハイブリッドのプラスミドとハンプリ ッドでないものとは分子量をもとに区別がつけられる。もう一つの有用な検証法 は、放射性DNAのハイブリッド形成を用いるものである。
形質転換した宿主である微生物において、外因性遺伝子の表現が成功するかどう かは、適当なプロモーター/レギュレーター領域を持っている。形質転換ベクタ ーへの遺伝子導入に、大部分がかっている。この遺伝子導入は遺伝子のmRNA への転写を保証し。
mRNAのメツセージが蛋白質に翻訳されるのを保証する他の信号を確保する( たとえば、リポゾーム結合部位)。構造遺伝子の「元来のJプロモーター/レギ ュレーター領域がドナー細胞に存在している可能性はあるが、それが新しい宿主 における遺伝子表現を高レベルにならないよう制御するというケースは、あまり ない。
従って、DNAベクターに挿入される遺伝子は、新しい転写や転移(宿主にとっ ては、挿入以前からDNAシークエンスを調節してきた。順応している転写や転 移)に適応せねばならない。あるいは、ベクターDNA中に存在している転写や 転移の信号のコントロールを受ける部位から挿入されねばならない。
B、B るボ1ペプチドとしての ホルモン一般に「成長ホルモンjとか「ソマ トトロピン」といった言葉は2種々のを椎動物の下垂体前葉から分泌されるホル モンとしての活性を持つポリペプチドを指して使われる。成長ホルモンの働きと は、概して、あらゆる動物において骨の発達速度を調節し。
体重を増やすことである。下垂体の形態異常、その結果、生じる成長ホルモン産 生の異常は、巨人症や小人症といった成長の異常をともなう。
ヒトの治療や畜産を目的として、@乳動物の成長ホルモンを単離したり、その特 性を検討したりするために、有意義な研究がなされてきた。最も精力的に研究さ れた成長ホルモンの1つは、ウシの成長ホルモン(bGH)である。b’GHの 完全な191のアミノ酸配列が決定された際、この配列に対応するcDNADN AシーフェンスH)と前駆体のポリペプチドをコードしている)を決定するめに 組換え法が用いられた。前駆体ポリペプチドは、「誘導信号」となる26個のア ミノ酸配列を含み、これは、ホルモンが循環する前に細胞内で切りはずされる。
例えば、ミラー等2丈−% (Miller、 et al、、 J、Biol 、Chem、) 、 255 、第7521−7523頁(1980)参照〕。
同様に、ラットの成長ホルモン(rGH)をコードする構造遺伝子が、クローン 形成・増幅・配列を行なうcDNA方法で、決定された〔シーハーグ等、 Ii iL(Seeburg、 etal、、 Nature ) 270.第485 −494頁(197’7)参照〕。
シーハーグ等のcDNAの仕事以前には自然すなわち「天然jのラット成長ホル モンの正確な全てのアミノ酸配列は決定されていなかった。クローンを形成した cDNA中のヌクレオチドの分析にもとずいて、 mRNA中の塩基配列が導か れた。これから順次、rGHのポリペプチド中のアミノ酸配列が決定した。厳密 に言えば、rGHのポリペプチドのアミノ酸配列のr決定」は、より正確には「 予言jと呼ばれるであろう。というのは、この「決定」の過程に・・は、単離さ れた天然の成長ホルモンにおいてなされたアミノ酸配列決定を含まないからであ る。予言の正確さを決定的にする証拠(mRNAが細胞内起源であること、予言 された配列が、天然のホルモンまたは類似物質の部分的な氷解により決定したア ミノ酸配列に似ていること)を考える時、この予言は、科学的に決定された事実 という面を持つ。
こういった状況では、予言されたポリペプチドの配列と、先に不完全ながら決定 された天然の物質の配列とが一致しているという完璧な「証明」は1通常7次の ような知見によってなされる。
すなわち、cDNAの微生物における表現により産生されたポリペプチドが、天 然の物質と同一の生化学的かつ免疫学的性質を有しているという知見である。
鳥類の成長ホルモンの研究は比較的少ない。その物質の特性(分子量、アミノ酸 配列)についても、結果はほとんど知られていない。
四種の鳥類にワトリ、アヒル、ハト シチメンチョウ)の下垂体から単離した成 長ホルモンを、先・二こ哺乳類の成長ホルモンを分析した時に成功した生物学的 検定法および免疫化学的な技術により調へた(7フー7−等、J、11分り8汀 (Farmer、 et al、、 J。
Endoctin) 、95.第1560−1565頁(1974) ) 、成 長ホルモンについて行われたアミノ酸配列の分析により、最初にアヒルとハトの 成長ホルモンのN末端アミノ酸4残基が、 NO3−Phe−Pro−Ala− Metであることが明らかになった。ニワトリやシチメンチョウでは少しも配列 を確立することができなかった。しかしながら、免疫化学試験の結果は、鳥類と 哺乳類の成長ホルモンどうしの間には、かなりの関連性を示した。〔パーヘイ等 、J−ヱ1分Δ1(llarvey、 et al、、 J、Enclocri n、 ) 、73.第321−329頁(1977) )。
ニワトリ、シチメンチョウ、ハト、アヒルの成長ホルモンにおいて、アミノ酸の 構造(水解で決定したもの)や生物学的・免疫学的活性が非常によく類似してい ることは2種々の鳥類で成長ホルモンのアミノ酸配列の相違が非常に少ないらし いという類イ舅性を示唆する。かくして、「ニワトリの成長ホルモンjについて の文献を参照する時、大抵、これは、ある物質を構造上あるいは化学的に別の鳥 類の物質と区別するよりはむしろ、特異な種由来の物質であることを調べて指摘 するという状況にある。
さらに、鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質に関する最近の研究は以 下のことを示している。幼若なトリは成長ホルモンが血漿中で高濃度であること が、その速い成長率に、少なくとも部分的にしろ関与している。幼若なニワトリ での成長ホルモンの分泌は非常に不安定で、ストレスの強い刺激によって影響さ れることがわかっている。正常では幼若なニワトリでは高濃度の成長ホルモンが 循環している。成長ホルモンの分泌はストレスの間、増えることが予想されたが 、麻酔、寒冷刺激、感染、他のある種のホルモンによって低下する。幼若なニワ トリの成長ホルモンの血従中濃度はまだ1代謝−や栄養の因子によっても影響を 受ける。栄養欠損の状態では、成長ホルモンは代謝の上で役割を果たし、エネル ギーが脂質へ流れるのを減らす。また、シチメンチョウとニワトリの両方におい て産卵の初期に成長ホルモンの循環液中濃度が上昇するのも注目に値する。メス トリでは、黄身を持つ卵を産むことが代謝径路に変動をおこすのだが、成長ホル モンは。
これを緩和する方向に働くのだと考えられる9スケインズ等、まbM (Sca nes、et al、、Life 5ciences ) 、28 、第289 5−2902頁(1981)。このようにして、単離精製した鳥類の成長ホルモ ンは、商業的にも意義のある可能性を持っている。つまり、商品としての家禽の 生産物に関連して、牧畜でいろいろな応用ができる。
現在−5鳥類の成長ホルモンの単離は、鳥類の下垂体か、もしくは循環している 血漿かのいずれかからの抽出物を精製することにより行われる。どちらの手順を 用いても、不純物のまじったポリ−ペプチド物質がごく少量とれるだけである。
飼育されているニワトリからの特に単離可能な成長ホルモンを含め、鳥類の成長 ホルモンは今までは完全にはアミノ酸配列がわかっていなかった。そして、たと え、アミノ酸配列が全て決定されても、200近いアミノ酸からなるポリペプチ ドを完璧な形で化学合成するのは、現在用いられている有効な方法では非常に高 いコストで極端な低収量しか得られないであろう。
かくして、鳥類の成長ホルモンの化学的、生物学的性質についてのいくつかの情 報がしられている一方、役に立つ良質な鳥類の成長ホルモンを純粋な標本として 採取する何らかの技術はずっと備わっていなかった。さらに、相補的DNAの技 術は、鳥類の成長ホルモンには応用されなかった。
固棗象枢翌 今回の発明によって、相補的DNAの技術が、鳥類の成長ホルモンの生化学的・ 免疫学的性質を有するポリペプチド物質を微生物を使って量産するために初めて 導入された。
この技術の成果は、まず、ニワトリやシチメンチョウの下垂体細胞から単離した mRNAから生ずる鳥類の成長ホルモンのガラス器内合成、ヌクレオチド配列の 決定、構造遺伝子の微生物での増幅を含んでいた。また、ハイブリッドDNAベ クターの開発も含まれており、そのベクター中では、ニワトリの細胞起源の成長 ホルモンの構造遺伝子は、形質転換された微生物宿主細胞によってめるポリペプ チドを直接表現させるように、プロモーター/レギュレーターDNA配列と協力 して作用する。
今回の発明は、ある1つの面では9次に掲げるアミノ酸配列(N末端から開始) の全部あるいは一部を含有することが特性となっているポリペプチドを提供する 。
10 Thr Phe Pro 八la Met Pro Leu Ser Asn  Leu Phe Ala Asn Ala0 Val Leu Arg Ala ’Gln His Leu Hls Leu  Leu Ala Ala Glu Thr040 Tyr Lys Glu Phe Glu Arg Thr Tyr TleP ro Glu Asp Gln Arg0 Tyr Thr Asn Lys Asn Ser Gln Aha^Ia P h、e Cys Tyr Ser Glu070 Thr Ice Pro Ala Pro Thr Gay Lys Asp  Asp Aha Gin Gln Lys0 Ser Asp Met Glu Leu Leu Arg Phe Ser  Leu Val Leu Ice Gin0 Ser Trp Leu4hr Pro Val Gin Tyr Leu S er Lys Val Phe Thrloo 110 Asn Asn Leu Val Phe Gly Thr Ser Asp  Arg Vai Phe Glu L、ys20 Leu I、ys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gin  Ala Leu Met Arg Glu130 140 Leu i;+u Asp Arg Ser Pro Arg Gly Pro  Gin Leu Leu Arg Pr。
50 Thr Tyr Asp Lys Phe Asp lie 旧s Leu A rg Asn Glu Asp Alal60 Leu Leu’ Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser  Cys Phe Lys Lys Asp170 180 Leu His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys  Val Met Lys Cys Arg190 191 Arg Phe Gly Glu Ser Asn Cys Thr Ile  。
上に掲げたシーフェンスが特異的なポリペプチドは、鳥類の成長ホルモンから得 られたフラグメントのシーフェンスに一致している。(Met ” 、 des −Thr ’ )の形は9M合的拮抗を利用した定量法で、鳥類の成長ホルモン のはっきりした生化学的・免疫学的特性を保有している。競合的拮抗を利用した 定量法では、 抗−ヒツジ成長ホルモン抗体との間に抗原−抗体複合体を形成し ようとして、鳥類の成長ホルモンとヒツジ成長ホルモンとが選択的に競合するの である。このようにして、それが鳥類の成長ホルモンであり、特にニワトリ由来 の天然のものであることが確かめられる。
この発明のもう1つの面によれば1次のアミノ酸配列(N末端から開始)の全部 あるいは一部を含有することが特性となっているポリペプチドを提供する。
10 Thr PhePro Thr Met Pro Leu Serへsn Le u Phe Thr Asn Ala0 Vai LeUArg Ala Gin His Leu His Leu L eu Ala Ala Glu Thr040 Tyr Lys Glu Phe Glu Arg Thr Tyr Ile  Pro Glu Asp Gln Arg0 Tyr Thr Asn Lys Asn Ser Gin Aha Ala  Phe Cys Tyr Ser Glu070 Thr Ile Pro Aha Pro Thr Gly Lys Asp  Asp Ala Gln Gln Lys80 Ser Asp Met Glu Leu Leu Ar’g Phe Ser  Leu Val Leu Ice Gin0 Ser Trp Leu Thr Pro Met Gin Tyr Leu  Ser Lys Val Phe Thrloo 110 Asn Asn Leu Vat Phe Gly Thr Ser Asp  Arg Val Phe Glu Lys20 Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ice Gin  Ala Leu Met Arg Glu130 140 Leu Glu Asp Arg Ser Pro 八rg Gly Pro  Gln、Leu Leu Arg Pr。
50 Thr Tyr Asp Arg Phe Asp Ile His Leu  Arg Ser Glu Asp Ala60 Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser  Cys Phe Lys Lys Asp170 180 Leu His Lys Vat Glu Thr Tyr Leu Lys  Val Met Lys Cys Arg190 191 八rg Phe Gly Glu Ser Asn Cys Asn Ile  0上に掲げたシーフェンスもまた。鳥類の成長ホルモンの部分的に確立されたデ ータに一致し、これはシチメンチョウ由来の天然の成長ホルモンを与えるアミノ 酸配列である。
ニワトリやシチメンチョウに由来するタイプの鳥類の成長ホルモンを与える上述 したアミノ酸配列は、N末端側の最初のメチオニン残基をもって選ばれた宿主の 微生物によって直接に表現されることが可能である。すなわち、成熟したポリペ プチドの(Met1〕アナログとして、あるいは1選択的分割によって単離され うる融合蛋白の一部分として表現されることができる。また、それらのシーフェ ンスは、下に掲げる約25個のアミノ酸からなる「先行」領域とともに直接表現 される。この「先行」領域は、鳥類にニワトリとシチメンチョウ)の下垂体細胞 で合成された先行領域と全く同一であり、成長ホルモンとして循環体液中に入っ ていく前に成熟したポリペプチドから切り離されることが明らかになっている。
2O NH5−Met Ala Pro Gly Ser Trp Phe Ser  Pro Leu Leu Ile AlaVal Val Thr Leu G ay Leu Pro Gin Glu Aha Ala Ala−(熟成ポリ ペプチド序列(シーフェンス)〕 病気治療中や飼育中の家禽、特にニワトリやシチメンチョウ、。
あるいは他の動物に有効な治療薬や成長促進剤を製造する際にこの発明によって 供給されたポリペプチドが適用されうるであろう。
また、このポリペプチドは、大量の純粋な鳥類の成長ホルモン物質を供給し、鳥 類の代謝に関する新しい知見を得るのに役立つ。
たとえば、この技術によって製造され、単離精製されたポリペプチドは、容易に 大量生産できるので、鳥類の成長ホルモンに対する特異的な抗体を作り出すため の抗原や刺激物質として使用可能であり、しいては免疫学的測定法に非常に役立 つ。
ポリペプチドは、遺伝子組換え技術により量産される。その方法とは1選ばれた 宿主細胞−好んで用いられるのは、 E、CO旦や酵母のような微生物である− をポリペプチドまたはポリペプチドアナログをコードしている特異的DNAシー クエンスを有するハイブリッドのウィルスかプラスミドのDNAベクターによっ て形質転換する。そしてポリペプチドは、このDNAシークエンスを転写、転移 して合成される。従って、別の面からみると、今、述べている発明は1次のよう な、単離精製された連続した二重鎖DNAシークエンスを提供するのである。す なわち9選ばれた宿主の微生物内で、鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫学的 特性を1つ以上備えたポリペプチドの合成を指示できるDNAシークエンスであ る。この発明の2種のDNAシークエンスを図示するが。
次のようなヌクレオチド塩基をその先端の鎖に含んでいる。
5+−ACCTTCCCT GCCATG CCCCTCTCCAACCTG  TTT GCCAACGCT GTG CTG AGG GCT CAG CA CCTCCACCTCCTG GCT GCCGAGACA T^丁 八AA  GAG TTCGAA CGCACCTAT ATT CCG GAG GAC CAGACCTACACCAACAAA AACTCCCAG GCT GCG  TTT TGT TACTCAGAA ACCATCCCA GCT CCC ACG GGG AAG GAT GAC’GCCCAG CAGAAG TC A GACATG GAG CTG CTT CGG TTT TC’A CT G GTT CTCATCCAG TCCTGG CTCACCCCCGTG  CAA TACCTA AGCAA[、GTG TTCACG AACAACT TG GTT TTT GGCACCTCA GACAGA GTG TTT  GAGAAA CT^ ^AG GACCTG GAA GAA GGG AT CCAA GCCCTG ATG AGGGAG CTG GAG GACCG CAGCCCG CGG GGCCCG CAG CTCCTCAGACCCA CCTACGACAAG TTCGACATCCACCTG CGCAACGA G GACGCCCTG CTG AAG AACTlICGGCCTG CT G TCCTGCTTCAAG AAGGAT CTG CACAAG GTG  GAG ACCTACCTG AAG GTG ATG AAG TGCCG G CGCTTCGGA GAG AGCAACTGCACCATC−3’。
および 5′−ACCTTCCCT ACCATG CCCCTCTCCAACCTG  TTCACCAACGCT GTG CTG AGG GCT CAG CAC CTCCACCTCCTG GCT GCT GAGACA TACAAA G AG TTCl、AA CGCACCTAT ATTCCG GへG GACC AGへGG TACACCAACAAA ’AACTCCCAG GCT GC A TTT TGT TACTCAGAA ACCATCCCA GCT CC CACA GGG AAG GAT GAT GCCCAG GAGAAA T CG GACATG GAG CTG CTT CGG TTT TCA CT G GTT CTCATCCAG TCCTGG CTG ACCCCCATG  CAA TACCTA AGCAAG GTG TTCTCA AACへへT  TTG GTT TTCGGCACCTCA GACAGA GTG TTT  GAGAAA CTA AAG GACCTG GAA GAA GGG A TCCAA GCCCTG ATG AGGGAG TTG GAG GAT  CGCAGCCCG CGG GGCCCG CAG CTCCTCAGACC CACCTACGACAGG TTCGACATCCACCTG CGCAGC GAG GACGCCCTG CTG AAG AACTACGGCTTG C TG TCCTGCTTC^^G AAGGACCTG CACAAA GTG  GAG ACCTACCTG AAG GTG IHG AAG TGCCG G CGCTTCGGG GAG AGCAACTGCAACATC−3’。
鳥類の成長ホルモンであるポリペプチドに特異的なりNAシークエンスを上に掲 げたが、これは、アミノ酸先行シークエンスー鳥類の下垂体細胞中で形成される 「前駆物質(プリカーサ−)jのポリペプチドの中に明らかに存在しているもの −をコードしているDNA ンークエンス、及び5゛と3”の転移されないシー フェンス。
またはそのいずれか一方といっしょにベクター中へ挿入される。
蛋白質をコードしているDNAシークエンスの5゛か3″かどちらかの側にある これら転移されないシーフェンスは1選ばれたベクターへの挿入を促進するユニ ークなエンドヌクレアーゼ酵素の制限部位を供給するために使われる。たとえば 2次の5゛の転移されないDNAシークエンスの一部または全部と先行シーフェ ンスは。
前とこ掲げた鳥類の成長ホルモンのうち、一方の開始アミノ酸を規定するコドン のために5”に使われる。
5’ −ACCTGGATGAAAGGAGGAAACGTTCAACACCT GAGCAACTCTCCCGGCAGGA−25−20 Met 軛、: Pro Gly Ser Trp Phe Ser Pre  Leu Leu 11e Ala ValATG GCT CCA GGCTC G TGG TTT TCT CCT CTCCTCATCGCT GTG−1 0−1 Val Thr Leu Gly Leu Pro Gln Glu Ala  Ala AlaGTCACG CTG GGA CTG CCG CAG GA A GCT GCT GCC−3’0同様に、転写の終止コドン1つ以上、もし くは「自然発生」している3゛の転移されないDNA配列の一部か全部が、カル ボキシ末端(Ile”’)のアミノ酸を規定するコドンのために3゛に使われ上 記の特異的なりNAシークエンスは、それがcDNA起源であるために、 (す なわち、ニワトリの成長ホルモンのmRNA 、シチメンチョウの成長ホルモン のmRNAそれぞれについて相補性を示すDNAを開発したために)鳥類の細胞 で、成長ホルモンを高レベルに表現するのに特に適したD N Aの3連のコド ンを包含している。
細菌やイーストのような微生物において5ポリペプチドが表現されることになっ ている時5次のようなことが、望ましいと言える。
つまり、シーフェンスの一部または全部が、計画されている宿主によって転移さ れるのにふされしいコドンへと並びかえた塩基配列に置き換えられることである 。かくして、この発明品は、先の特異的シーフェンスかあるいは同一のアミノ酸 配列によってポリペプチドを特徴づけている3連のコドンを含むヌクレオチド塩 基のシーフェンスのどちらか一方を含有している。
従って、この発明の特殊な面は、以下に述べるようなりNAシ二クりンスの貯蔵 を行っているということである。1つには、鳥類の成長ホルモンの生化学的・免 疫学的性質を示しているポリペプチドをコードするDNAシークエンスであると いうこと、もう一つには、二mmのコドン使用法の両方、またはいずれか一方に 全体的にあるいは部分的に従って配列されたヌクレオチドを含有しているシーフ ェンスであるということで、 2種類のコドンとは鳥類の細胞に内因性のもの、 および宿主にはむしろ好ましい、つまり「究極的な」微生物での表現の材料とな るべく書かれたものである。発明品のこういった混成された。つまり、「ハイブ リッドJの1シークエンスは、 cDNAから誘導された重複したニワトリの成 長ホルモンのヌクレオチドシーフェンスを含む。その配列では、はぼ32の開始 コドン(ポリペプチドをコードしている領域の5゛末端で始まる)が、下に掲げ る9作られたDNA配列に入れ変わっている。
Xbal OThr 0 0 0 5’CTAG AGA ATG ACCTTT CCA GCT ATG CC T f;ゴG TCT AAT CTG3’ TCT TACTGG AAA  GGT CGA TACGGA GACAGA TTA GACTTT GCA  AACGCT GTT CTG CGT GCA CAG C’AT CTG  CAT CTG CTGAAA CGT TTG CGA CAA GACG CA CGT GTCGTA GACGTA GACGACGCCGCT GA A ACT TAT AAA GAA TT 3’この典型的な混成シーフェン スは1作られた部位(後に例示)を含んでいて、微生物において発明品(生産し ようとするポリペプチド)を表現する際、それを特に有用にしている様々な特徴 を備えていることがわかる。作られた部位は、開始コドンのメチオニンを特 徴 づける塩基のコドン(塩基対ナンバー8−−10)、細菌内で主通状態で表現さ れる塩基コドン;そして、ハイブリッドの形質転換ベクターを形成する際に容易 に役立つ制限リボヌクレアーゼの使用を促進する塩基(XbaI r粘着末端」 )があげられる。
発明品のDNAシークエンスを全て製造する(要は、宿主の好むコドンのみを含 んでいる配列を作る)ことも、アルドン等の申請中の米国特許出願の合成法によ れば可能である。〔出願番号375.494 (1982年5月 6日)、 4 83,451 (1983年4月15日)〕好適な実施例では3発明品のDNA シークエンスを、微生物に形質転換をおこさせる次の如きベクターに挿入する。
すなわちL並旦、プラスミドpBR322から得られ、自己複製を行っていて1 取り出し可能なプラスミドのようなベクターである。プラスミドは。
E、Co旦に−12のような適当な宿主の微生物に形質転換をおこさせるために 使用する。 形質転換のベクターは、鳥類の成長ホルモンの持つ生化学的・免疫 学的性質の1つ以上を有しているポリペプチドの合成を指令できるDNAシーク エンスを含有していることに加え、さらに、ポリペプチドをコードしている領域 に対して天然のあるいは合成の転写にかかわるプロモーター/レギュレーターD NAシーフェンスをも含む。
従って、この発明に含まれるのは、鳥類の成長ホルモンのポリペプチド物質を作 るための2次の過程からなる新しい方法である。
(1)選ばれた微生物を、形質転換ベクターによって形質転換させる。ベクター は、鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質を1つ以」二有しているポリ ペプチドを微生物内で合成させる指令をもつDNAシークエンスを含んでいる。
(2)適当な栄養状態で、微生物を形質転換の状態にしていく。(3)上述の微 生物から、その中で前述のDNAシークエンスを表現した産生物を単離する。
cGII−T21 と呼ばれるDNAヘククーばこの発明の実用に適しており、 細菌の細胞を確実に形質転換し1発明゛また方法に従って容易に単離できる大量 のポリペプチドを細菌内で表現するが、これは、メリーランド州ロックビルのア メリカン・タイプ・カルチャー′コレクション(American Type  Cu1ture Co11ection (A、T、C。
C9))に供託されてきた。プラスミドのベクターは、 A、T、C,C,供託 番号39182をつけられたE、Co旦、 C600細胞を収集した中に保存さ れている。
今回の発明のさらに異なる面や利点それがら好ましい具体化の実例については1 次に述べる詳細な記載の中で考え、明らかにしたい。
祥1じi1述 この発明のおかげで、ニワトリに由来した鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫 学的性質を存する高分子量のポリペプチドが。
生きた鳥類の下垂体組織以外の細胞で、単離できるほど大量に生産されてきた。
これらの結果は、相補的DNAを用いる一連の操作によって得られた。そめ操作 は、以下に述べるものからなる。すなわち、なかんずく、ニワトリの下垂体組織 からメンセンジャーRNAを単離すること;単離されたRNAから鳥類の成長ホ ルモンを生成するmRNA0形奪選び出すこと; mRNAがら逆転写によって cDNAを合成すること; cDNAの配列を決定し、それに対応する鳥類の成 長ホルモンのアミノ酸配列を決定すること;先に示した。細菌細胞で遺伝子を表 現させるためのベクター、つまり、 A、T、C,C。
番号39182に保存されているcGH−’T21を作ること、このベクターは cDNAのレプリカを含むものである;ベクターで細胞の形質転換を起こし請求 めるポリペプチドを確実に表現すること;そして。
形質転換細胞からの産生物を検証することである。
また、この発明品を作る時、複雑なのは請求めるポリペプチドをコードするE、 Cs+i選択コドンを含め5人工的に作ったDNAを幾分か含有しているDNA シークエンスー実例を示し1代わりとなるDNAシークエンスーを開発すること である;っまり請求めるポリペプチドを微生物において高レベルに表現させられ る1代わりの表現ベクターの開発である。それに、シチメンチョウの下垂体組織 で行なわれ、そして、シチメンチョウ起源の鳥類成長ホルモンをコードするcD NAO単離に帰着する一連の操作の開発も複雑である。
以下に述べる例は、ニワトリの下垂体からメツセンジャーRNAを単離する法を 示す。
凱」 ニワトリの下垂体をHE後−年経過しためんどりから抽出し、ただちに液体窒素 中で凍結した。約0.4gのニワトリ下垂体(およそ40−50+[lilの下 垂体)をguanidinium thiocyanate法を用いて抽出し、 完全なRNAの定量的単離に供した。〔チャーブウィン等。
% (Chirgwin、et al、+影」准す月」u) + 18.第52 94−5299頁(1979) )。
簡単には、チャーブウィン等の方法は1強力な変性剤であるguanidini um thiocyanateの原液中でニワトリの下垂体をホモジナイズする 操作を含む。ホモジナイズしたものを遠心分離し微粒子の物質を沈渣とする。上 清には酢酸を添加し、インキュベートして核酸を沈降させる。それから物質を遠 心し、得られたペレットを塩酸グアニジン液中に再び懸濁させる。このRNAを 酢酸・エタノール混合液中で再度沈澱させ、インキュベートし、遠心分離する。
最後の塩酸グアニジン液からの再沈殿の後、再沈殿した物質を再び遠心し、得た ペレットを室温でエタノール中に分散させる。遠心の後、エタノールを窒素流に よりペレットと分離し、RNAを無菌水に溶解する。RNAを酢酸すl・リウム (pH7,0>とエタノールの添加により再沈殿させる。RNAを遠心によって エタノール懸屓液から沈降させ、さらにエタノールでペレットを洗浄し、窒素で 乾燥させて、再び無菌水に溶解する。
無菌水に溶解させた最終的な溶液は、ニワトリ下垂体からRNA全部の純粋な抽 出物を含む。全てのRNAの溶液からメツセンジャーRN^のみを得るため、  RNA溶液をoligodeoxy−thymidylate (oligo  (dT) ) (Collaborative Re5earch、Inc、  )を含むカラムを通過させる。poly−adenylated (poly− A+)尾部が特徴的なメツセンジャーRNAはカラムに吸着する一方、リボゾー ムRN^は流出液中に排出される。この操作の後、16μgのpoly ade nylatedmessengerRNA (poly−A+mRNA )が単 離される。
次の例では7例1で単離したメツセンジャーIRJAがらcDNAのクローンを 構築することについて述べる。
例( 例1で単離したpoly−A+メソセンジ+−RNAを、 cDNAの合成〔オ カヤマ等2分工皇ヨり泪惣注r字(Okayama、et al、+’Mo1e cular&cellular Biolo ) 、2.第161−170頁( 1982)の方法による〕に使用する前に水酸化メチル水銀(Alpha Ve ntron )で前処置し2最終的な濃度は5mMにして室温で5分間反応させ た。水酸化メチル水銀で処置すると、メソセンジャーRNAどうし及び翻訳を阻 害する混入物質の分子との間の相互作用がなくなる。〔ベイバー等、J (Pa yvar、 et al、、 J、Biol Chem、 ) 。
地本第7636−7642頁(1979)参照〕。
簡約して述べれば、オヵヤマの方法は1次のような段階を含んでいる。すなわち 、まず、ヘクターのプライマーをプラスミドの組換え遺伝子pBR322−5V 40 (図単位0.71−0.86)がらKpnr (Bethesda研究所 )エンドヌクレアーゼの作用により作る。このエンドヌクし・アーゼは環状のプ ラスミドを1ケ所で切断する。DNAを抽出した後 deoxythymidi lai、e (Ijτ)残基を区エンドヌクレアーゼで生成させたプラスミドの 末端に子ウシ胸腺Lermina+ de−oxynucleotidyl t ransfsraseを使って付は加える。こうして両末端にpoly−Tを持 ったD〜へを□al (Bethesda Re5earch Labs)エン ドヌクレアーゼで消化して片方のpoly−’T残基をはずす。結局、 pBR 322DNA複製に由来し、一端にpoly−T残基を有する大きなりNAフラ グメントができる。これを、アガロースゲル電気泳動およびOligodeox yadenylate (Oligo dA) 〕セルロースカラム(Coll aborative Re5earchInc、)濾過による吸着・溶出によっ て精製する。
01igodeoxyguanylate、 (Oligo (dG) )残基 を末端に持つリンカ−DNAは、ハ旦エンドヌクレアーゼ(AM Gen)を使 ってpBR322−3V 40 (図単位0.19−0.32) (Berg) を分解することにより得られる。この酵素は、環状のプラスミドを限られた2ケ 所で切断し。
それによって大きなりNAフラグメントと小さなりNAフラグメントを生成する 。それから、この2つのフラグメントの両端に、 deoxyguanylat e残基からなる鎖をterminal deoxynucleotidyl t ransferassを使って付加する。そして、抽出し沈殿として採取したD N八をHindl[I endo−nuclease (Bethesda R e5earch Labs)により分解する。これは、小さいフラグメントの限 られた部位のみを切断し、異なった大きさの2つのフラグメントを作る。最後に 最小のoligo (dG)を末端に持つリンカ−をアガロースゲル電気泳動に より精製する。
cDNAを合成するためにまず行なう処置は、水酸化メチル水iνで処理したm RNAを逆転写の反応系に添加することである。この反応系は、2−merca pto ethanol、Tris、塩化マグネシウム、”P−α−dCTP  (New England Nuclear 3 、 reverse tra nscript、ase (LifeScience、 Inc、) + およ びベクタのプライマーから成る。この反応で、プラスミドヘクターDNメ\は、 最初のc D N A鎖の合成のためのプライマーとして機能す乙。ρC為、− 虻メノセンジャーR\S、Δ、とpoly−dT−tailecl、フタ−i〕 さ、・Aとを1′ニールすると、 iRj!Aンークエンスを逆転写するための 基質が生成する。
cDNAの末端に相補尾部を生成するため、 cDNAは−・フタ−のプライマ ーであるDNAのもう一方の末端と結びつくことができる。
それによって、第2のDNA鎖を合成するための鋳型を準備する。
逆転写反応によってできた二重鎖のプラスミド−cDNA−mRNAを。
”P−α−dCTPとterminal deoxynucleotidyl  transferaseの入った混合物中に加える。この段階でoligo ( dC)尾部がヘクタープライマーであるc−DNAハイブリッドの3”末端に付 加される。そして、 oligo (dC)付加反応で得られたペレットをHi ndI[l□エンドヌクレアーゼの含まれる反応系へ添加する。このBindl IIエンドヌダレアーゼによる消化は、ヘクタープライマーDNAの末端近くに ある唯一のHindllI制限部位でDNAを分割することによって、そて消化 の間その全量を維持する。
oligo−(dC) −tailed cDNA : mRNAプラスミドを 分解した匣lエンドヌクレアーゼをoligo (dG> −talred H nker DNAの含んだ混合物中でインキュベートする。E、co旦 1ig ase (New England Biology Labs)を添加すると Bindll[による相補末端を介しリンカ−とヘククーDNA117)共有結 合によって環が形成される。非共有結合の塩基対はリンカ−のoligo (d G) tailとcDNAのolig。
(dC) tailとを介してcDNA : mRNA二重鎖を形成している。
最終的に二重鎖組換えの中に入るメツセンジャーRNAのストランドは次の酵素 を用いる反応によってDNAに置き換わる。すなわち。
E、coli R二:aseH(PCBioct+ emical Co、)  、E、coliDNA Iigase、 E、□coli DNA po1y+ IIerasa−1+そして4種のdeoxynucleoside trip hosphatase (Sigma )を用−いるのである。RNaseHは RNA鎖に切れ目を入れる。一方、 Pot /Iと四種のdeoxynucl eoside tripl+osphataseはRNAセグメントを切れ目の 転移によって置換する。堕1i DNA ligaseは新しく合成されたDN ADNAフラグメントを合わせて、連続した1本の第二のcDNA鎖とする。修 複合成において、リンカ−DNAのoligo (dG) tailは、塩基対 になってC)ないdeoxyribosylcytidine (dC)配列い ずれもの複写のためにプライマーとしで動き、 cDNA領域ヘストラントを延 長していく。
このようにして、 mRNAの全長、あるいはほぼ全長が逆転写され。
選択的に二重のcDNAに転換される。それから、cDNAを増幅するため、イ ンキュベーションによって、宿主微生物jcoli K−12系HB101 に 転移させる。
次に掲げる例では、ニワトリ種の鳥類成長ホルモンをコードしている(に、!下 ’CGHJ )クローンの単離を示す。その方法は1次のようなcDNA塩基配 列を含むpBR322−5V40の組換えを雑種形成することによるものである 。つまり、 cDNADNAシーフェンスを転移された試験用のものでウシ成長 ホルモンとラット成長ホルモンを、それぞれコードしているDNAフラグメント を含んでいる。
孤」 ニワトリ成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質を1つ以上もっているポリペプ チドを合成することをコートしているクローンを形成したい。そのためには、ニ ワトリの下垂体から単離した複雑なmRN^は、 cDNA挿入を含む適当数の 組換えクローンのスクリーニングを要する。
ハナハン等、遺伝子(Hanahan 、 et al、、 Gen5) 、  10+63−67 <1980)の方法に従って、 cDNA挿入のある組換え を含んだ縄菌を。
寒天プレート上に置いたニトロセルロースフうルター(jo、Iボア)の上に広 げる。それからそのプレートをインキュヘートニで小さなコロニーを形成させる 。コじ7二−は別のニトロセルロースフィルターに複製する。そのレプリカをは っきりしたコロニーができるまでインキュベートする。フィルター上の細菌は、 水酸化ナトリウム(0,5M)をほんのわずか浸したワットマン3MM紙の上で 溶解する。吸い取った後、この過程を、水酸化ナトリウム+ tris(IM)  、およびtris (0,5M)−塩化す上リウム(1,5M)を用いて。
再度繰り返す。フィルターがほとんど乾いたら、それらを、核酸の雑種形成の前 に、真空のオーブンにて2時間80°Cで焼く。〔ワール等(WahLet a l、 ) 、ハ易、並、第3683−3687頁(1979) 。
およびマニアティス等1.!!!lJ!(; Maniatis、 et al 、j Ce旦) 、 81゜第163−182頁(1976) )。
得られた組換えクローンは、以下のように雑種形成される。pBR322−bG H15(ウシ成長ホルモンの遺伝子を含んでいるプラスミド)から取った。放射 能標識済の490塩基対を持つPvu IIフラグメントとの間に雑種形成を行 うか、それともpRGH−1〔シーハーグ等、d (Seeberg、et a l、 Nature ) +270.第486頁(1977) )というラット 成長ホルモンの遺伝子を含むプラスミドから取った、放射能標識済の816塩基 対を持つフラグメントとの間に雑種形成形成を行うかのいずれかにする。これら のウシまたはラットの成長ホルモンのDNAシークエンスを含んでいるプラスミ ドのフラグメントは、それぞれニワトリ下垂体のcDNA挿入を有する組換え遺 伝子と雑種形成する時、均一なニワトリ成長ホルモンのDNAンークエンスを示 す。試験用のフラグメントは、数ケ所で組換えられているcDNA乃ニワトリ成 長ホルモンの塩基配列と調和して、一連のシーフェンスになる。cGH配列を含 むクローンは。
オーミラジオグラフィー(こよって、八つ検出された。これによって、もとのフ ィルクー上にあった細菌のコロニーと同定され9選択されて、cGHを含む6組 換え遺伝子の複製をさらに増やした。
各々のクローンシ;制限エンドヌクレアーゼRsal (New Englan dBiology Labs) 、 ECORII (Bethesda Re 5earch Labs) + そしてTagl (Bethesda Re5 earch Labs)によって分解され、類似の制限エンドヌクレアーゼのパ ターンが明らかになった。CCl2という一つのクローンをランダムに選び出し 、さらに特性を調べたり塩基配列分析に供した。
次の例は、cGHをコードしているクローンの塩基配列を分析することによって そのクローンの特性をしらべたものである。
孤」 例3の手順で得られた組換えcGHDIIAの塩基配列は、サンザー等のdid eoxy法にて行った(Sanger、et al、、PNAS、 74. p p5463−5467 (1977) )。
二重鎖のcDNAクローンから得た単鎖のDNAの鋳型を供するために、クロー ニングのヘクターとして、単鎖のDNAのファージM−13を用いた。サンザー 等の方法では、ト13の持っcGH蛋白をコードしているDNA単鎖の塩基配列 を明らかにし、それは、単一のBamHI認識部位を持ったcGHコード領域を 含んでぃ九;さらに、その配列が25のアミノ酸からなる先行領域をコードして いるであろうと推定されるcG、Hコード領域までの5′側にある約75の塩基 配列;3″と5゛の移転されない領域もあった。この配列を下の表Iに、対応す るアミノ酸移転とともに示す。
、表」− 5’ −ACCTGGATGAAAGGAGGAAACGTTCAAGCAAC ACCTGAGCAACTCTCCCGGCA −25’ −2Q Met Ala Pro GIy、Ser Trp Phe Ser Pro  LeuGGA ATG GCT CCA GGCTCG TGG TTT TC T C[、T CTC10 Leu Ice Ala Val Val Thr Leu Gly Leu  Pro GlnCTCATCGCT GTG GTCACG CTG GGA  CTG CCG CAGGlu Ala Ala Aha Thr Phe P ro”Aha Met Pro LeuGAA GCT GCT GCCACC TTCCCT GCCATG CCCCTC0 Ser Asn Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu  Arg AhaTCCAACCTG TTT GCCAACGCT GTG C TG AGG GCT0 Gin His Leu His Leu Leu Ala Ala Glu  Thr TyrCAG、CACCTCCACCTCCTG GCT GCCGA G ACA TAT304゜ Lys Glu Phe Gl、u Arg Thr Tyr Ile Pro  Glu AspAAA GAG TTCGAA CGCACCTAT ATT  CCG GAG GAC0 Gln Arg Tyr Thr Asn Lys Asn 5rer Gln  Ala AhaCAG AGG TACACCAACAAA AACTCCC AG GCT GCG0 Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro 八la  Pro ThrTTT TGT TAに TCA GAA ACCATCCCA  Gcr CCCACG70 Gly Lys Asp Asp Ala Gln Gln Lys Ser  Asp MetGGG AAG GAT GACGCCCAG CAG AAG  TCA GACATG0 Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Val Leu  Ile GinGAG CTG CTT CGG TTT 丁CA CTG G TT CTCACT CAG0 Ser Trp Leu Thr Pro val Gin Tyr Leu  Ser LysTCCTGG CTCACCCCCGTG CAA TACCT A AGCAA’G00 Val Phe Thr Asn Asn Leu Val Phe Gly  Thr 5erGTG TTCACG AACAACTTG GTT TTT  GGCACCTCA10 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp  Leu GluGACAGA GTG TTT GAG AAA CTA AA G GACCTG GAA20 Glu Gly Ile Gin Ala しeu ?Iet Arg Gju  Laa GluGAA GGG ATCCAA GCCCTG ATG AG G GAG CTG GAGBamH+ 30 Asp Arg Ser Pro Arg Gly Pro Gin Leu  Leu ArgGACCGCAGCCCG CGG GGCCCG CAG C TCCTCAGA140 150 Pro Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Ice His  Leu ArgCCCACCTACGACAAG TTCGACATCCACC TG CGC60 Asn Glu Asp AIs Leu Leu Lys Asn Tyr  Gly LeuAACGAG GACGCCCTG CTG AAG AACT ACGGCCTG70 Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu旧s Ly s ValCTG TCCTGCTTCAAG AAG GAT CTG CA CAAG GTG80 Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys  Arg ArgGAG ACCTACCTG AAG GTG ATG AAG  TGCCGG CGC90 Phe Gly Glu Ser Asn Cys Thr lie 0PTT CGGA GAG AGCAACTGCACCATCTGA GGCCCTGτ 3位り二 GCCTGCGCCATGG−3’ 上の塩基配列では、微生物の宿主内で直接cGHを確実に表現するということは 容易には受け入れられない。cGHをコードしている領域がそんなふうに確実に 表現されるためには、開始コドンATGを用意しておかねばならない。また、塩 基配列は、適当なプロモーター/レギュレーターDNA配列のコントロールのも とで、転写ベクターに1ケ所で挿入されねばならない。次の例5は2表現ヘクタ ーの構築に関するものである。
次の例では、プラスミド表現ベクターの一つ、A、T、C,C,39182細胞 内に貯えられるcGH−721の構築について述べる。
桝1 pBR322によって誘導された表現プラスミド(Pint−γ−tx B4) を用いたが、これはトリプトファンプロモーター(旦L)の配列と 5hine  / De1garno配列(この後ろに、別のポリペプチドをコードする構造 遺伝子がある)へのXba 1部位3′を含む。外来のポリペプチドをのぞき1 例4で示した塩基配列から7部分的に領域を削除して、cGH遺伝子を挿入する 。削除されるのは、5゛例の転移されない領域、そして内因性の25のアミノ酸 からなる先頭にあるアミノ酸配列と成熟したポリペプチドの最初のスレオニン残 基をコードしている領域である。3”側の転移されない領域は一部除去され、開 始コドンのATGと1プロモ一ター配列に続く表現ベクターの展部位に挿入する 塩基を供給する工程が踏まれる。
cDNA配列の組換えやプラスミドの構築を行うのに特異的な方法は。
共同発明者のし、スーブとともに申請中の米国特許出願番号445,986 ( 1982年12月1日)に述べられている。
転写の後、クローンをスクリーニングして、袂1やBam)l Iを用いた分解 によって、完全なcGHコード領域を含んでいるものを残す。一つのあるクロー ンから得たプラスミドは、cG)l−721と名づけられ、L並置に一12系C 600(A、T、C,C,39182)に形質転換され。
その表現を分析する。
次の例ではプラスミドベクターによってE、co旦を形質転換し。
細菌細胞でめるポリペプチド(つまり、CMet :、、des−Thr ’  )cGH)の表現を確保することを示す。
皿■ cGHを表現するプラスミド、 cGIl−T21を含乙旦、coli K−1 2系C600(A、T、C,C,39182)の細胞を0,4%glucose  1m!I MgSO4、O。
bnM CaCL2+ 5mg / mj!のcasamino acidsお よび10μg/mpのthiamineを添加したM9minimal 5al ts中、37°CでO,D、(八〇〇〇)】まで振盪培養する。この時点で細胞 15mρを3−1ndo−1acrylicacid (最終濃度10μg /  ml)で処置し、37’Cで1時間振遷し続ける。それから10mffの細胞 をBeckman J−6で約4000xgで遠心してペレット状になったもの を分離する。これをTris−sucrose−lysozyme緩衝液(ゲダ ル等、且i (’Goeddal、et al、、 Nature)λ引−1第 544−548頁(1981) )さらに0.05%sodium dodec yl 5u1−fateと1mM phenylmethylsulfonyl fluorideを加えた液に再び懸濁させる。そして細胞を30分間氷上に置 いておいたe: 0.11 mlのDNase bufferと10.cogの DNasel (Worshington )で処置する。それから、上清をE ppendorfのマイクロフユヒジにて15分間12、000xgで遠心し、 上清を10%TritonX−100が25.t+6入った 試験管に静かに移 す。この試料は1例8で述べるRIAで分析するまで、氷の上で保存しておく。
次の例では、今回の発明に従って、微生物につくらせたニワトリ成長ホルモンと ニワトリの下垂体から精製した成長ホルモンが。
生化琴的に類似してることを述べる。
桝1 下垂体から精製したニワトリ成長ホルモンは、 5OS−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動(SO5−PAGE)でのjす定で、薬24 、000の分子量であ る。今回発明の微生によりつくられた成長ホルモンの分子量をプラスミドcGt l−721を持ち、”S−methionine (’S−met )で標識し たmaxicell (C5R603)の5t)S−PAGEによって定量した 6端的に言って、この方法は、C3R603(cGH−T21 ) 10 mj +をケンダル培地で培養し〔ラップ等1丈−分り生恩テ(Rupp、 et a l、、L赴1.8io1. > 、61.第25−44頁 (1971) 〕、  2 xio’ cell、/ mlの濃度まで増殖させる。これから細胞5m Aをペトリ皿にとり、1−5J/mのLVを与えた振盪台にのせる。そ乙て、3 7 °Cで1時間振盪し、その温度でcycloserinsを100μg7m l添加する6その後、さらに8−12時間振盪培養する。細 胞を遠沈で収集し 、Hershey 5altで2回洗浄する。〔ワーセル等 J 、% H,1 117゜(Worcel、et al、、J、Mo1.Biol、) 、82. 第91−105頁(1974) )m胞をHerscheyの培養液に再び懸濁 し、1時間37°Cで通気してインキュベートする。それから細胞1mnを50  mρのポリプロピL/ン試験管に移し、25 pciの”S−Met (Ne w、England Nuclear )および’ropgの3−1ndole acrylic acidとともに37°Cでもう 1時間インキュベートする 。最後に、m胞を採収し、熔解して、5OS=PAGEとオートラジオグラフィ ーによって分析する。以上の手順を行ない、はとんど全量の標識S−メチオニン がプラスミドでコードされた遺伝子の産生物に取り込まれることがわかった。〔 サンカー等(Sancar、et al、 ) 、 J、Bacteriol、 、 137 +第692頁(1979)〕。
ゲルのオートラジオグラフィー後、二本の蛋白質のバンドが検出された。一方の 蛋白質β−1actamaseは分子量30.000で、アンピシリン抵抗性で 、 PBR322の誘導するプラスミドを含んでいる全ての培養に存在している 。もう一方の蛋白質は1分子量24 、000であり、 cHGの遺伝子を持っ ているプラスミドを含む培地にのみ見られる。従って微生物でつくらせた鳥類成 長ホルモンの分子量は、ニワトリ下垂体組織から単離した天然の成長ホルモンの 分子量によく似ている。
次の例では、cGH−721によって形質転換された細胞で作られた鳥類成長ホ ルモンを用いる。競合の起こるラジオイムノアッセイについて述べる。
凱■ L並且細胞で表現されたニワトリ成長ホルモン(プラスミドCGW−721によ る形質転換にもとずく)を含有すケ九旦の細胞溶解質を競合の起こるラジオイム ノアッセイ 〔ゼソトナー等(Zettner。
et at、) 、 Cl1n、 Chea+、 20.第5−14頁(197 9) ]で分析した。
11tliJしたヒツジ成長ホルモン(oGH)を、この分析法でトレーサーと して使うために放射性ヨードで標識する。分析法は、ノーンクーおよびグリーン ランド、[(HunterとGreenwood、 [Nature) 、 1 9ム 第495−496頁(1962) )のクロラミン−T反応法の変法を用 いる。要するに、10μlの0.0釘重炭酸緩衝剤(bicarbonate  buff−er) (pH9,2)中の10μgのoGH,50μgのクロラミ 7T、および50μりの0.2M tris−HCI (pH7,2,0,00 2M ED’TAを含む)に解かした I標識ヨウ化ナトリウム(約17C’i /mg) 500 μCiを結合させ、1分間室温でインキュベートする。反応 を終了させるためにピロ亜硫酸ナトリウム(500μg)を添加し、その混合物 を、28nljの5ephadex G75カラム(前もって2%BSA添加O 9LM phosphate 5aline (pH8,0) + および0. 1%BSA添加0.1Mphosphate 5aline (pH8,0)で 洗浄したもの)にて濾過する。
25滴からなる分画を四本収集した後、10滴の分画を45−60本収集する。
放射性元素で標識した物質を含む分画を選びケシエツト等の方法で沈降テストを 行う。〔ケシエツト等、挟敢晩31 (Keshet、 etal、、 Nuc leic Ac1ds Re5earch) 9.第19−30頁(1981)  ’)この方法は、2.5 X 10’ cpm のヨウ化した。GHをlXl 0−’ 〜2X10+希釈の家兎anti−oGH抗体(0,5M Tris  HCI (pH8,9) 、 2.0%BSA、 O,i%Triton X− 100,0,1%sos混合液に溶解した卸の)とともに室温で二時間インキュ ベートする。20μlの10%W /Vホルマリンで固定した針鮮膓山に匹憇影 」且徂時を前もって、 RIA 緩衝剤で洗浄しておき、それを先のインキュベ ートした液に加える。
そして さらにこの混合物を室温で20分間1′ンキユベートする。
免疫反応シこよる沈降物は、遠心(12,000xg、 3分間)にて収集し。
放射能測定の前にRIA緩衝剤にて3回洗浄する。
この反応では、きまった量の12ゞI−標識o G Hは、限られた量のant i−oG!(抗体もしくはanti−cGH抗体と反応し+ I12’−oGH : 、anti−oGHの免疫複合体を生成する。そして、これらの免疫複合体 を」、aureusで沈降させる。結合していない゛2J−標識oGHは溶液中 に残っている。 それから、最もよく沈降反応をおこしたカラム分画を」一連と 同し手順で行う血清希釈曲線の描出に用いるが、使用するバ■屑はlXl0’〜 lXl0−’以−Lの範囲で希釈する。2,5×10” cpmの標識した。G Hを最大量の2沈降させる血清希釈度を続いて行う競合によるラジオイムノアッ セイに適用する。
この定量法では、 I X10−’〜I X 10−”gの精製oGHあるいは oGHを含む例7の細菌溶解物の10’〜10−2希釈液を、適当に希釈した  anti−oGH抗体かanti−cGH抗体とともに、室温で二時間。
プレインキュベートする。その時、 2.5 XIO”〜3.5 xlO−壬c pmの”’I−oGHを添加し、続きの反応、遠心分離そして洗浄は上述の通り 行う。
細菌熔解物であるoGHを決まった量のanti−o G H抗体またはant i−cG)l抗体に加え、適当な免疫複合体を生成させる。反応液に加えた決ま った量の標識oGHは1wA菌溶解物のoGHという競合体と先に結合していな かったあらゆるanti−oGH抗体またはanti−cGH抗体と複合体を形 成する。結局、沈降物の放射能活性の量は、試料中に存在する。GHという競合 体の量に反比例する。
かくして、このイムノアッセイは1例6の細菌溶解物が、まさに1次のようなポ リペプチドを合成できるI)NAンークエンスを含んでいることを示している。
すなわち、このポリペプチドはニワトリの成長ホルモンの生化学的性質を一つ以 上有し、また、同種aよび異1閂の成長ホルモンに対する抗体と 抗原抗体複合 体を形成する。
次に掲げる例では、ガラス器内でつくったcGH遺伝子のシーフェンスにE、c oli選択コドンが混入する部位、ヘクターに挿入するための制限部位について 述べる。
例j cGHift伝子の表現を増やそうと努力して、遺伝子の最初の3分の1をコー ド化でいる核酸配列を、 cDNAから誘導した遺伝子の約3分の1にガラス器 内で置換して合成してきた。この合成の目的は、 X baI部位である粘着末 端を誘導されたATG (Met”〕転写開始部位から一ト流側へヌクレオチド 3つ目に配列すること。
Eco R1部位を自然に持っているに上部位から上流側に配置すること(多少 は重複している)、ハト±部位という粘着末端を自然のに上部位で遺伝子を後ろ へ接合するためにつ(ることである。また、この合成は、E、co旦で表現する のに最適なコドンを使用できるため、そしてシーフェンスの最初のアミノ酸数個 に代わって、アデニンやチアミンの豊富な領域をつくるために行われる。しかし ながら、このシーフェンスには、プロリンやアラニンが多く含まれているため、 アデニン、チミンの豊富な領域を得ることは、むずかしい。これらの条件を最大 限に満足するヌクレオチド−、シーフェンスを次に示す。
5’−CTへGAGAATGT TTCCAGCTへT GCCTCTGTCT 3’−TCTT、IcA A、1GGTcGATA CGGAGACAGA八A  T C’TへG T T T G CA A A CG CT L+ T T  CT G i″GT[ICへ Cへ1つCATCTGCτT二S二: : : i A t” lJ丁TτGこr 、’; CA )S A CG !二ACG I GT(1;TへGACGATCTGCTGGCCGCTGAAACT TA TAAAGAAT T−3ゝ上に掲げたシーフェンスをプラスミF’ cGH− T2+に挿入し、そのプラスミドからXbal/nユフラグメントを切除して、 CMet −,1、aes−Thr ’ ) c’G’Hポリペプチドを微生物 で表現させるために供給するということは、注目に値するであろう。もしくMe t −’ )cGH産生物をめるならば5合成フラグメントは、メチオニンを規 定するATGコドンに隣接する。スレオニンを規定したコドンで前に述べたよう に作られる。
次の例は、もう一つの表現ヘクターを開発し、それを使用して成功した遺伝子操 作に関するものである5゜鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質を持つ ポリペプチド、特に(Met −”、 des−Thr ’ ) cGHポリペ プチドを高レベルに表現することを確保したものである。
NAヘククー」と題して申請している(1983年8月10日、C,F/モリス )プラスミドpCFl′1414の使用を含んでいる。該出願の開示内容は、本 書に引用することにより具体的に組み入れられる。
端的に言って、プラスミドpcFM414 (A、T、C,C,400T6 ) は、複製コントロール領域で温度感受性変異を含む。このヘクターを用いた形質 転換において30゛Cでの宿主細胞の培養ではプラスミドは少数複製されるよう になる。
プラスミドの複製の数は、34 °Cを越える培養温度の上昇に従1て、宿主細 胞内で50倍か、それ以上に増える。 (つまり、run aWayする)。3 7°Cでの増殖は3通常細胞にとって致死的である。しかし、1a胞が死に至る 前にプラスミドDNAを増殖転写する機械がある。 A、T、C,C,4007 6を用いたヘククー構成に含まれる特別な操作は次の通りである。プラスミドc GH−T21 (A、T、C,C,39182)を制限リボヌクレアーゼEco RI−とNcolで分解する。それによって、当初Pint −r−tXB4に 存在する旦とプロモーターを含んでいるフラグメントを切除する。Pint−γ −tXB4ば、遺伝子のうちcGHポリペプチドをコードする領域および翻訳さ れない3゛領域の2.3の塩基対に続く領域である。(表Iを見よ)プラスミド pcFM414をEcoRI と匙煩−で分解し、大きなフラグメントを単離し た。cGH−721から生成した匡吐T/Nc虹フラグメントをpcF1141 4の大きなEcoRl /Ncolフラグメントに結合させ、プラスミF’41 4 cGH−T2を得た。プラスミド’414 cGH−T2で形質転換したL 並置I7細胞が増殖するとめるポ1「ペプチドがE、co旦C600細胞のcG H−T21によって供給される収量の少なくとも約4倍生産される。
次の例は、シチメンチョウ成長ホルモンをコードするDNAを得てシーフェンス を作る方法を述べる。
促土工 もう 1つの鳥類の成長ホルモンーシチメンチョウ成長ホルモン−をコードする I)NAシークエンスを例1の手順によって作る。
但し、四つの手順のうち2点は変えねばならない。すなわち、 (牡フラグメン ト)を例3の手順で使う。
一つのクローンを選択し、さらに特性を調べ1例3の手順に従って塩基配列を分 析した。例3の手順によって得られたtG)(の相補性D N Aをサンガー等 のdedeoxy法によって分析を行った。
C5anger、 et al、、 PNAS、74. pp5463−546 7 (1977) )。
単鎖のDNAであるファーシト13をクローニングヘクターとし二重鎖のDNA クローンからとった単鎖DNAの鋳型を供給した。サンガー等の方法は、ト13 でtGH蛋白をコードしているDNA単鎖の塩基配列を明らかにした。この塩基 配列は、cGHのそれと同じくポリペプチドをコードする領域を有し、その領域 には、一つのllamHI制限部位が含まれる。その部位とは、蛋白をコードす る領域までの5゛の75の塩基対からなるシーフェンスで、おそら<25のアミ ノ酸からなる先行領域をコードしている部位、そして3゛と5゛の転移されない 領域である。ポリペプチドをコードしているD N Aシーフェンスを、それに 対応するアミノ酸シークエンスとともに、下の表Hに示す。
麦1 5’ −CCTGGATGAAAGGAGGAAACGCTCAAGC^八CA CCCGAGCACCTCTCCTGGCGGG八 2へ−25 一2OAla Pro Gly Ser Tへp Phe Ser Pro L eu LeuATG GCT CCA GGCTCG’TGG TTT TCT  CCT CTCCTC10 1ie Ala Val Val Thr Leu Gly Leu Pro  Gin GayATT GCT GTG GTCACG CTG GGA CT G CCG CAG GG八へ 八1a Aha Ala Thr Phe Pro Thr Met Pro  Leu 5erGCT GCT GCCACCTTCCCT ACCATG C CCCTC,TeCl4 Asn Leu Phe Thr Asn^la Val [、e、LI Ar g Ala Glr+AへCr、TG TTCμCCAACGCT CTG C TG AGG GCT CAG030 旧s Leu His Leu Leu Alaへla Glu Thr Ty r LysCACCTCCACCTCCTG GCT GCT GAG ACA  TACAAA0 Glu Phe f;Iu Arg Thr Tyr Ile、Pro Glu  Asp GlnGAG TTCGAA CGCACCTAT ATT CCG  GAG GACCAG0 Arg Tyr Thr Asn Lys Asn Ser Gin Ala  Aha PheへGG TAC^CCAACAAA AACTCCCAG GC T GCA TTT0 Cys ’Ty’r Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pr o Thr GlyTGT TACTCへ GAA ACCATCCCA Gに T CCCACA GGG0 Lys Asp Asp Ala Gln Gin Lys Ser Asp  Met GluAAG GAT GAT GCCCAG CAG AAA TC G GACATCGAG0 Leu Leu Arg Phe Ser Leu Val Leu Ile  Gin 5erCTG CTT CGG TTT TCA CTG GTT C TCへ丁CCAG TeCl4 Trp Leu Thr Pro Met Gln Tyr Leu Ser  Lys ValTGG CTG ACCCCCATG CAA TACCTA  AGCAAG GTG00 Phe Thr Asn Asn Leu Val Phe Gly Thr  Ser AspTTCACA AACAAT TTG GTT TTCccc  AにCTCA ’WAc11 0Ar Vai Pha Gia !、ys Leu !、ys Asp Le u Glu GluAGA GTG TTT GAG AΔA CTA 、AA rJ GACCTG GAA GAA20 Gly IIs Gln Qia Lsu Met Arg Glu Leu  Glu AspGGG へTCCAへ G Ct〕CI’ G A T G A  G G CAG TTG GAG GAT130 140 Arg Ser Pro ArgGly Pro Gln Leu Leu A rg Pr。
CGCAGCCCG CGG GGCCCG CAG CTCCTCAGA C CC50 Thr Tyr Asp Arg Phe Asp Ile His Leu  Arg SerACCTACGACAGG TTCGACATCCACCTG  CGCAGCGlu Asp Ala Leu Leu Lys Asn Ty r Gay Leu LeuGAG GACGCCCTG CTG AAG A ACTACGGCTTG CTG70 Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys  Vat GluTCCTGCTTCAAG AAG GACCTG CACAへ へ GTG GAG80 Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys Arg  Arg PheACCTACCTG AAG GTG ATG AAG TGC CGG CGCTTC90 Gly Glu Ser Asn Cys Asn Ile 0PGGG GA G AGCAACTGCAACATCTGA GGCTCTCTGTGCccc GCCATGG−3’ 上に示したシーフェンスと表■のニワトリ下垂体細胞力・ら得られたcDNへの シーフェンスを比較することにより次のようなこと力く明らかになる。すなわち 、双方のコドンのうち、多くの例で、同しアミノ酸に特異的なものが存在するこ と、および、tGHのCDNAC冗’−フェンスはc G HのcDNAンーク ソーフェンスて規定されるポリペプチドと本質的に同一のものを規定することで ある。191のアミノ酸残基のうち185の残基が同一である。tGH遺伝子に 特異的なシーフェンスの中で、4番のアミノ酸残基力<、(GH遺伝子のアラニ ンではなく、スレオニンであるの力く特徴となっている。同じく、11番の位置 でもアラニンでGよなくスレオニンであるのが特徴的である。ほかに、90番の )\リンGこ44Cわるメチオニン、144番のリジンに代わるアルギニン、1 51番のアスパラギンに代わるセリン、190番のスレオニン残基コ(’e h  ルア スパラギンも特徴となる。「先行(リーダー−シーフェンスに特異的な アミノ酸は、4番の位置でグルタミンではなく、グリシンが存在する以外は同一 である。
微生物の宿主で、tGHのc D N Aシーフェンスを直接表現させるために 、tGHをコードしている領域に開始ATGコドンを備えなくてはならない。ア ミノ末端のスレオニン残基を規定するコドンや、1当なプロモーター/レギュレ ーターDNAシーフェンスのもとで、一つの部位で形質転換のヘクターに挿入さ れるシーフェンスのために、開始ATCコドンを要するのである。表現ヘクター は1例5でcGHのために作ったものに似ており、微生物宿主でもtGHを表現 するのに使うことが可能である。
同様にtGHから得た遺伝子の最初の3会の1を置換したヌクレオチドシーフェ ンスを構築し1例9におけるように用いることが可能である。つまりシーフェン スに選択された制限エンドヌクレアーゼ酵素認定部位を備えて、 E、coli での表現に最適なコドンを使用でき、アデニン、チミンに冨んだ開始ソーフェン スを持つようにするのである。
前述した実例は、一般に、細菌によるヘクターを使って形質転換された細菌細胞 により、cGHを微生物で表現するというものである。が、一方、開発中なのだ が酵母や他の微生物での表現も期待されることが明らかであろう。蛋白質を作り 1選んだ宿主で最もよく表現されるようなコドンを含んでいるDNAシークエン スが開発の対照である。例えば、酵母の表現は、宿主細胞である酵母で蛋白質の 合成に固有な必要条件として、ヘクターの開発を含む。具体的な例では、酵母で の自律複製を可能にするDNAヘクターの使用、酵母のプロモーター/レギュレ ーター領域の使用などである。ハレンチューラ等、且然(Valenzuela 、 et al、、ハのB型肝炎の細胞表面抗原の表現について述べてもする例 である。
先に述べたように、この発明のポリペプチド産生物は畜産υこおいて商業的に有 用であると期待されている。たとえ礪畜産の過程で、家禽に、補給するえさや水 、又は、ゆっくりと溶解してし)る(あるいは、ゆっくり、成分が溶出していく )皮下注入によって与えられる活性成分といったような生成物を継続的かつ低レ ベルに投与することができる。このようなデリノ\リーシステムしよ。
特に幼若な家禽の成長期の早い頃に行う処置として好都合であろう。
この発明については、前述した考案したばかりのすぐれた技f+Rにいろいろな 改良が加えられることが期待される。
結果としては、付記した「請求の範囲Jにあられれるような限界のみが残ってい るにすぎない。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 10選ばれた宿主微生物で鳥邦の成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質をもっ たポリペプチドを合成するのを指令できるDNAシークエンス。 2、請求の範囲第1項に従ったDNAシークエンスであり、その鎖の最初に次に 掲げる塩基配列のどちらかを含有する。 5’−ACCTTCCCT GCCATG (:CCCT(: TCCAACC TGTTT G(:CAACGCT GTG CTG AGG GCT (:A G CACCTCCACCTCCTG GCT GCCGAG ACA TAT  AAA GAG TTCGAA CGCACCTAT ATT CCG GA G GACCAG 八GG TACACCAACAAA AACTCCCAG  GCT GCG TTT TGT TACTCA GAA ACCATCCCA  GCT CCCACG GGG AAG GATGACGCCCAG CAG  AAG TCA GACATG GAG CTG CTTCGG TTT T CA CTG GTT CTCATCCAG TCCTGG CTGACCCC CGTG CAA TACCTA ACCAAG、GTG TTCACGAAC AACTTG GTT TTT GGCAcCTCA GACAGA GTGT TT GAG AAA CTA AAG GACCTG GAA GAA GG G ATCC^八 GCCCTG ^TG AGG GAG CTG GAG  GACCGCAGCCCG CGG GGCCCG CAG CTCCTCAG A CCC;icc TACGACAAG TTCGACATCCACCTG  CGCAACCAG GACGCCCTG CTG 幅G AACTへCGGC CTG □:TGT CCT 1′;’−TTCAAG AへG GAT CT G CACAAG GTG GAG ACCTACCTG AへG GTG A TG AAG TGCCGG CGCTTCGGA GへGへGCAACTGC ACCATC−3’。 上の塩基配列を含有しない場合には、アミノ酸の同一シーフェンスに特異的な3 連のコドンを有する。 3、請求の範囲第1項に従ったpNAンークエンスであり、その鎖の最初に次に 掲げる塩基配列のどちらかを含有する。 5”−ACCTTCCCT ACCATG CCCCTCTCCAACCTGT TCACCAACGCT GTG CTG AGG GCT CAG CACC TCCACCTCCTG GCT GCT GAG ACA TACAAA G lへG TTCGAA CGCACCTAT ATT CCG CAG GAC CAG AGG TACACCAへCAAA AACTCCCAG GCT G CA TTT TGT TACTCA GAA ACCATCCCA GCT  CCCACA GGG へAG GATGAT GCCCAG CAG AAA  TCG GACATG GAG CTG CTTCGG TTT TCA C TG GTT CTCATCCAG TCCTGG CTGACCCCCATG  CAA TACCTへ 八GCAAG GTG TTCAC八八ACAAT  TTG GTT TTCGGCACCTCA GACAGA GTGTTT G AG AAA CTA AAG GACCTG G八八 GAA GGG AT CCAA GCCCTG ATG AGG GAG TTG GAG GAT  CGCAGCCCG CGG GGCCCG CAG CTCCTCAGA C CCACCTACGACAGG TTCGACATCCACCTG CGCAG CGAG GACGCCCTG CTG AAG AACTACGGCTTG  CTG TCCTGCTTC4八G へAG GACCTG CACAAA G TG GAG ACCTへCCTG 4八G GTG ATG AAG TGC CGG CGCTTCl’;GG GへGACCAACTGCAACATC−3 ”。 上の配列を含をしない場合には、アミノ酸の同一シーフェンスOこ特異的な3連 のコlンを有ずろ。 4、請求の範囲第2またはU rj’j に従ったDNAシークエンスであり、 さらにメチオニンに特異的なlへTGコドンを5“末端に含む。 5、請求の範囲第2または3項己こ従ったON八へNAンークエンスであり、  5゛末端にスレオニンに特W的なコ)ンを欠き、その代わりにメチオニンに特異 的なコドンを含む。 6、請求の範囲第1項に従ったD凡Aンークエンスを含有する微生物の形質転換 ヘククー。 7、請求の範囲第6項、に従った微生物の形質転換ヘククーであり、上述のシー フェンスに対して転写のプロモーター/レギュレーターD’NAシークエンス5  ’ ヲ含む。 8、請求の範囲第7項に従った微生物の形質転換ヘクターの中において、プロモ ーター/レギュレーターDNAシーフェンスがkLプロモーター/レギュレータ ー領域である。 9、請求の範囲第1項に従ったDNAシークエンスの宿主微生物での表現のポリ ペプチド生成物。 10、 A、T、C,C,No 39182に従って、L並り細胞に含有させた プラスミドcGH−721゜ 11、鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質を1つ以上持ったポリペプ チドを選ばれた宿主微生物内で合成させるのが可能であり、鳥類の下垂体細胞の 成長ホルモン遺伝子に内因体のコドンを複製した塩基コドンのシーフェンスおよ び作成した塩基コドンのシーフェンスを含むDNAシークエンス。 12、請求の範囲第11項に従ったDNAシークエンスであり1次の作成シーフ ェンスを含む。 1 2 3 5”−CTAGAGAATGT TTCCAGCTAT GCCTCTGTCT 3’−TCTTへCA AAGGTCGATA CGGAGACAGAAATC TGTTTG CAAACGCTGT TCTGCGTGCA cAGcnrc TccTTAGACAAACGTTTGCGAC八 八GACGCACGT G TCGTAGACGATCTGCTGGCCGCTGA八八CT へへATAA AG八八T Tへへ’TAGACGACCG GCGACTTTG八 へTAT TTCTTへ 八GC−5’13、請求の範囲第11また番12項に従った。宿 主微生物でのDNAソークエンスの表現のポリペプチド生成物。 14、鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質を持ち、実質的に、そのシ ーフェンス中にアミン末端から始まる次のアミノ酸を含有するポリペプチド。 10 Thr Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Asr+  Lt:u Phe0 Aia Asr+ Aha Vat Leu Ar、g Aia Gin 1l is l、e u II i s0 Lsu Leu Ala Ala Glu Thr Tyr Lys Glu  Phe Glu0 Arg Thr Tyr lie Pro Glu Asp Gin Arg  Tyr Thr0 Asn Lys Asn Ser Gln Ala Ala Phe Cys  Tyr 5erGlu Thr Ile Pro Aha Pro Thr G ly Lys Asp Asp7〇 八Ia Gln Gin Lys Ser Asp Met Glu Leu  Leu Arg0 Phe Ser Leu Val Leu Ile Gln Ser Trp  Leu Thr0 Pro Val Gln Tyr Leu Ser Lys Val Phe  Thr Asn100 110 Asn Leu Val Phe Gly Thr Ser Asp Arg  Val Phe20 Glu Lys Leu Lys、Asp Leu Glu Glu Gly  Ile G1n13〇 八Ia Leu Met Arg Glu Leu Glu Asp Arg  Ser Pr。 40 八rz Gly Pro Gln Leu Leu Arg Pro Thr  Tyr Asp50 Lys Pl+e Asp lie His Leu Arg Asn Glu  ASI)Ala60 L(4++ Lea Lls ’+s+1 T7r G!y Leu Leu  Ser Cys Phe70 !、ys 1.ys^:p Leu )Iis Lys Val Glu Th r Tyr Leu80 Lys Val Met Lys Cys Arg Arg Phe Gly  Glu Ser90 八sn Cys Thr II、e。 15、請求の範囲第14項に従ったポリペプチドにおいて、最初のスレオニン残 基がメチオニン残基に代わっている。 16、鳥類の成長ホルモンの生化学的・免疫学的性質を持ち、実質的にそのシー フェンスの中にアミノ末端から始まる次のアミノ酸を含有するポリペプチド。 1 10 Thr Phe Pro Thr Met Pro Leu Ser Asn  Leu Phe0 Thr Asn Ala Val Leu Arg Ala Gin His  Leu 旧S0 Leu Leu Aha Ala Glu Thr Tyr Lys Glu  Phe Glu0 Arg Thr Tyr lle Pro Glu 、Asp Gin Arg  Tyr Thr0 Asn Lys Asn Ser Gln Ala Ala Phe Cys  Tyr Ser0 Glu Thr lle Pro 、Ala P、ro Thr Gly Ly s Asp Asp7〇 八Ia Gin Gln Lys Ser Asp Met Glu 1.eu  Leu Arg0 Phe Ser Leu Vat Leu Ile Gln Ser Trp  Leu Thr0 Pro Met Gin Tyr Leu Ser 1.ys Val Pt+ eThr Asn100 110 Asn Leu Val PheGly Thr Ser Asp Arg V al Phe20 Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu にly  lie G1n13〇 Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu Asp Arg  Ser Pr。 Arg Gly Pro Gln Leu Leu Arg Pro Thr  Tyr Asp150 Arg Phe Asp Ile 旧s Leu Arg Ser Glu A sp Ala60 Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser  Cy、s Phe70 Lys Lys Asp Leu His Lys Val Glu Thr  Tyr Leu80 Lys Val Met Lys Cys Arg Arg Phe Gly  Glu Ser90 Asn Cys Asn Ile 。 17、請求の範囲第16項に従ったポリペプチドの中において、最初のスレオニ ン残基がメチオニン残基に代わっている。 18、次の段階を含む方法により生成した鳥類成長ホルモンのポリペプチド。 fi1選ばれた微生物を、請求の範囲第1項によりDNAシークエンスを含む形 質転換ベクターで形質転換し。 (2)段階(1)で形質転換された微生物を適当な栄養状態で増殖させ2 (3)微生物からDNAシークエンスの表現の生成物を単離する。 19、請求の範囲第15項に従った鳥類成長ホルモンにおいて、上述段階(1) で1選ばれた微生物はE、coliであり、形質転換ベクターはcGH−T21 である。
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