JPH02501976A - ピキア・パストリスからの分泌による動物リゾチームｃの生産とその結果生ずる組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ピキア・バストリスからの分泌による動物リゾチームＣの生産とその結果生ずる 組成物 発明の背景 本発明は、組換え体ＤＮＡ技術を用いて動物リゾチームＣを生産するための微生 物学的な過程に関連しており、さらに詳細には、ピキア・バストリス酵母細胞に おいて、該細胞内の前駆型リゾチームを発現する事を可能とする遺伝子および、 前駆型リゾチーム発現するための、該細胞の形質転換に用いられるＤＮＡ、なら びに、この形質転換された細胞の培養および二次培養を含む、該細胞を培養する ことによる、動物リゾチームＣの生産に関連している。

リゾチームは、直接的には細菌細胞を溶解する能力の結果として抗菌作用を発揮 し、間接的には、多形核白血球および大食細胞の食作用活性に対して刺激効果を 生起できる結果として、抗菌作用を発揮する塩基性酵素である。（ジョレス（Ｊ ｏｌ　１ｅｓ）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６３．１６５（ １９８４））。リゾチームは、ヒトやその他のを椎動物、また、植物、細菌、フ ァージに加え、無を椎動物の多数の組織よび分泌物中に存在している。細菌の感 染に対し、生体を守る主要な機能を発揮する際に、１，４−β−アセチルムラミ ダーゼとしても知られているりゾチームは、細菌細胞壁の構成成分である細菌の ペプチドグリカン、すなわち、短い交差結合したペプチドに結合したアミノ糖か らなる多糖の中の、Ｎ−アセチルムラミン酸のＣ−１および、Ｎ−アセチルグル コサミンのＣ−４の間のグリコジル結合を切断する。グラム陰性細菌は、単層あ るいは２層のペプチドグリカンを含むが、一方、グラム陽性細菌は、非常に複雑 な多層のペプチドグリカンを含んだ細胞壁を有している。上述の切断がなされた 結果、このような全ての細菌は溶菌し、そのために死に至る。いくつかのりゾチ ームは、チキン中の１．４−β−アセチルグリコサミン結合の無作為な加水分解 に相当する、多少の明確なキチナーゼ活性をも示し、その結果、生体を多数のキ チンに覆われた病原体から保護する付加的な能力を有している。リゾチームの僅 かなエステラーゼ活性もまた報告されている。

その溶菌活性のため、リゾチームはそれ自身あるいはイオン、補体、抗体、ビタ ミンおよび、その他の酵素をキレートする事により、ある微生物の生育を阻害す るラクトトランスフェリンや、抗菌剤としてのテトラサイタリン、バシトラシン などの種々の抗生物質、また、チーズ、ソーセージ、海産物などの食物の防腐剤 、チーズの熟成剤などのその他の構成要素と組み合わせたり、また様々なその他 の応用法においても用いられている。

リゾチームは、種々の抗原に対する抗体の亜炭を間接的に刺激する能力も有して いるため、そのような酵素も、感染に対する抵抗性の増強に用いられるだろう。

Ｃあるいは「ニワトリ」型リゾチームは、成熟した分泌型のものでは、１２９− １３０アミノ酸を含んでいる。これら１２９−１３０アミノ酸のうち、４０アミ ノ酸は異なる種間で不変であることが見いだされている。リゾチームＣの触媒活 性に寄与し、リゾチーム活性に必須なりゾチームＣのいくつかあるカルボキシル 基のうちの２個にワトリ卵白リゾチームのアミノ酸のＧｌｕ−３５およびＡｓｐ −５２に相当する）は、全てのＣ型リゾチームの同様な位置に存在している。基 質の結合相互関係に関与するにワトリ卵白リゾチームのＡｓｐ−１０１に相当す る）第３のカルボキシル基は、はとんどのＣ型リゾチームに存在する。全てのＣ 型リゾチームの８個の遊離システィン残基は不変である。システィンによって形 成されるジスルフィド結合は、酵素の２次および３次構造の形成と維持において 重要な役剖を果たしている。その３次構造と、ｍＲＮＡの翻訳の際に、この構造 を形成するための折り畳みが起こる過程は、全てのりゾチームＣで密接に類似し ていると考えられている。成熟型リゾチームＣに対する完全な一次構造は、次の ものから得られている＝（１）メントリ、ウズラ、七面鳥、ホロホロチョウ、ア ヒル、キジ、チャカル力、ニワトリ卵白：（２）ヒト乳汁および尿、（３）ガ、 （４）ヒヒ、ラット、ウシ胃；（５）Ｔ２およびＴ４ファージ、成熟型ヒト乳汁 リゾチームＣをコードするＤＮＡ配列が知られている。欧州特許第０１８１６４ ３号および第０２２２３６６号明細書を参照のこと。

その他の主要な型、すなわちｇあるいは「ガチョウ」型の成熟型リゾチームの完 全なアミノ酸配列は３例しか決定されていない、これには、エムデンガチョウ、 無為およびダチョウ卵白由来のりゾチームｇ配列が含まれている。

Ｃおよびｇ型のリゾチームは、その活性部位の一部として酸性アミノ酸を有して いるが、この２つの型の間にいくつかの相違が存在している０ｇ型リゾチームは 、その成熟型で約１８５アミノ酸を含み、Ｎ−アセチルグルコサミンポリマーに 対し低い活性を示し、Ｃ型のりゾチームと免疫的に交差反応しない。ｇ型のリゾ チームは、分子内に対となったアミノ酸（すなわち、配列中で隣接した位置に同 じアミノ酸が存在した状態）が普通では見られないほど高率に存在しており、ｇ 型分子内の４つの遊離システィン残基の全ては、分子のＮ−末端側半分に位置し ている。Ｃ型リゾチームは、ペプチド置換型あるいは非置換型ペプチドグリカン に対し同等に活性であり、キチン多糖に対しても同様に活性である０ｇ型リゾチ ームは、直線型のいペプチドグリカンに対しＣ型酵素と同様な活性を持っている が、キチン多糖に対しては作用しない、さらに、加水分解と糖転移反応を行なう ことが可能なＣ型リゾチームとは対照的に、ｇ型酵素は加水分解酵素としてしか 作用しない。

その構造的、触媒的および免疫的基準に基づいてＣ型およびｇ型とは異なるその 他の型のりゾチームの存在も報告されている。

前腸発酵を行い、その消化系においてリゾチームを利用する多数の哺乳動物種が 知られている。ボス・タウラス種の家畜牛およびアルティオダクティラ目（Ａｒ ｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）　（すなわち、反拐訪物）に属するその他の反拐咀噌補 乳類は、瘤胃（前腸）に住み、せルロースおよびその他の食物要素を消化する微 生物との共生関係を進歩させてきた。そうした哺乳動物は、腸粘液中に通常では みられないほど高いレベルのリゾチームを有している。この消化様式のために、 多数の微生物が皺胃（胃）の基部（全部）に入り、そこでリゾチームが内粘膜に よって分泌され、微生物がリゾチームによって消化されることによって攻勢動物 は微生物中の栄養素を利用することができる。これまでなされできた代謝バラン スの研究により、反栃動物は溶菌した細菌をエネルギーと生育のための炭素、窒 素およびリン源として利用していることが示唆されている。

家畜牛の皺胃に存在する３つの型のリゾチームは、皺胃粘液から抽出される全タ ンパク質の約１０％を構成している。これら３種の、対立遺伝子由来ではないリ ゾチームは、Ｃ型に属しくＣ１，Ｃ２およびＣ３と呼ばれる）、抗原性およびア ミノ酸組成に関して互いに密接な関連をもっている。

ジョレス、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、ｊ５４．１１６１？（１９８４）は、 ウシ胃において３種のリゾチームのなかで最も多い、成熟型ウシリゾチームＣ２ の完全な１２９アミノ酸配列を以下のように決定した＝に−Ｖ−Ｆ−Ｅ−Ｒ−Ｃ −Ｅ−Ｌ−Ａ−Ｒ−Ｔ−Ｌ−Ｋ４−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｇ−Ｙ−Ｋ−Ｇ−Ｖ−Ｓ− Ｌ−Ａ−Ｎ−Ｗ−Ｌ−Ｃ−Ｌ−Ｔ−に−Ｗ−Ｅ−３−５−Ｙ−Ｎ−Ｔ−に−Ａ− Ｔ−Ｎ−Ｙ−Ｎ−Ｐ−Ｓ−５−Ｅ−５−丁一〇−Ｙ−Ｇ−１−家畜牛の皺胃に存 在する３つのリゾチームＣは、（１）ウシ皺胃中に存在するりゾチームＣの酵素 活性に対する最適ｐｔ＋は約５であるが、他のりゾチームＣでは７であり、（２ ）ウシ皺胃に存在するリゾチームＣは、他のりゾチームＣに比べ皺胃などの酸性 環境でより安定で、また、皺胃に存在するペプシンなどのタンパク質分解酵素に 対して、より抵抗性が高いなどの点から、他のリゾチームＣとは異なっている。

シグナル配列によって仲介される培地中への分泌による異種タンパク質の生産は 、種々のコウジカビ種、サツカロミセス・セレビシェおよび様々な型の哺乳動物 細胞を含む、多数の生物について記載されている。これらの種では、本来（つま り属内）および哺乳類のシグナル配列により、ある異種タンパク質の生育培地中 への分泌が指示され得ることが示されている。しかし、これらの各々の宿主系に は種々の短所がある。

例えば、コウジカビ属の株は、多量の内因性タンパク質を生育培地中に分泌する ため、目的の異種タンパク質産物の精製の複雑さと高価さが明らかに増大する。

Ｓ、セレビシェからの分泌による異種タンパク質生産の生産性は、少しでも分泌 され得るタンパク質に関しては、厳しく制約されると考えられる。１１を乳細胞 宿主に関する主な短所は、そのような宿主系を維持し、大規模にそうした宿主を 培養することが困難であることと、多額の費用がかかることである。

異種宿主で発現され、分泌されるいくつかのポリペプチドは、天然に存在するそ の対応物と比較して生物活性を全く示さないか、あるいは低下した活性を示すこ とがある。この様な生物活性の低下は、このポリペプチドが、分泌過程において 活性を減少させるような分解あるいは切断および、適当な折り畳みやジスルフィ ド結合を形成せずには宿主系の分泌装置に入り、移行することが出来ないことな どを含む多数の因子の結果であろう。

酵母は、生物学的に活性型の異種タンパク質の大規模生産に関しては、他の宿主 系に比べ確かな利点を与えるものである。

酵母は、一般に細菌よりも高い細胞密度まで生育させることが出来る。特に好ま しい酵母は、Ｐ、バストリスであるｅｃＩ資化性酵母であるピキア・バストリス は、当業者に知られたものである。このような酵母は、生物学的に活性な形で、 相当量培養培地中に分泌され得る、こういった異種タンパク質の大規模生産のた めの宿主系として特に好ましいものであることがわかっている。Ｐ、バストリス は、連続的な工業規模の発酵処理に容易に適合し、それにより、この酵母は性質 が明らかで安価な発酵培地中で高細胞濃度に生育する。Ｐ、バストリスを用いた 場合、生産レベルは、通常、振盪フラスコ培養から大型発酵装置による培養へ規 模が拡大される。安価で、発熱物質及び毒素の潜在的な発生源となり得る性質の 不明な内容物を含まない、単純な培地をこの酵母に対して用いることが可能であ る。さらに、酸化的リン酸化などの多数の酵母の決定的な機能は細胞内小器管中 で行なわれるため、原核細胞宿主における場合と同様に、そのような機能は、異 質なポリペプチドの生産によって起こり得る宿主細胞に対する有害な作用に直接 さらされないのである。

また、酵母は真核生物であるため、真核生物のタンパク質が正しく折り畳まれる ためには、その細胞内環境と原核生物よりも適している傾向がある。加えて、酵 母、とりわけＰ、バストリスの培養は、他のほとんどの宿主系に比べ容易である 。メタノール中で培養しているＰ、バストリスの汚染は、他の宿主型の培養の汚 染に比べ容易に防ぐことができ、そのため、異種ポリペプチド産物の信頼性と安 全性が向上する。

酵母が培養培地中の目的のタンパク質を分泌すると、細胞構成物からのそのタン パク質の分離が容易となり、したがってその精製が容易となる。

Ｐ、バストリスは、培地への分泌が起こる異種タンパク質の生産のためには特に 好ましい宿主系であるが、特定の型のタンパク質、例えばリゾチームＣタンパク 質がこの酵母によって生物学的に活性な型で分泌されるか、あるいはもし分泌さ れたとしても、どの程度の分泌効率かなどということは予想できない。

しかし、ひとたび特定のタンパク質が酵母から効率的に分泌されることがわかれ ば、配列および三次構造が類僚したその他のタンパク質も分泌されるだろう。

Ｐ、バストリスよりも相当広く研究されている酵母であるＳ。

セレビシェの場合でさえも、タンパク質の分泌系はよく理解されないままである 。生物学的に活性な型の成熟タンパク質の培地への分泌には、発現の際に、その 成熟タンパク質がそのアミノ末端だ付加された「シグナル配列」　（または、「 シグナルペプチド」とも呼ばれる）を持つことが必要とされる。このシグナル配 列は、いまだ詳細は明かとなっていないがタンパク質を細胞の分泌装置に導入す る役割を持ち、翻訳の過程で切断されて成熟したタンパク質が生ずる。

主発里■！ｈ 本発明は、Ｐ、バストリス細胞を培養することにより、大量の生物学的に活性で 容易に精製できる動物のリゾチームＣを生産する、新規でかつ驚くべき予期し得 ない効果的方法を提供し、これには、該細胞中で前駆型の動物リゾチームＣ（す なわち、成熟型タンパク質のＮ−末端に付加された天然に存在するシグナル配列 を持つ動物リゾチームＣ）を発現する遺伝子が、該細胞中で翻訳されるような条 件のもとに含まれている。

本発明にしたがい、高いレベルの動物リゾチームＣがＰ、バストリスから培地中 へ効率的に分泌される。さらに、形質転換したＰ、バストリスの培養を振盪フラ スコ培養から大型発酵装置による培養に大型化しても、生産レベルは維持される 。培地へ分泌され、回収された動物リゾチームＣの実質的に全ては、成熟型タン パク質とシグナル配列との連結部で正確に切断されており、適切に折り畳まれた タンパク質を形成するためのジスルフィド結合を正確にもち、生物活性を有して いる。さらに、分泌された成熟型タンパク質は、天然に存在する動物リゾチーム Ｃと基本的に同じ免疫学的性質と比活性を有している。それに加え、分泌された 動物リゾチームＣは、培地中に存在するタンパク質の少なくとも５０χを構成し 、動物リゾチームＣ以外のタンパク質は、動物リゾチームＣに比べ少量しか存在 しない。

本発明は、動物の前駆型リゾチームＣを発現するためにＰ。

バストリスを形質転換するためのＤＮＡおよび、該ＤＮＡによって形質転換され たＰ、バストリス細胞の培養をも包含している。

本発明のＤＮＡにより形質転換されたＰ、バストリス細胞は、動物リゾチームＣ を作るための本発明の方法を実施するために培養される。

最後に、本発明は、ウシリゾチームＣ２およびウシ前駆型リゾチームｃ２のシグ ナルペプチドの発見を包含しており、また本発明は、これらのポリペプチドをコ ードする配列を持つＤＮＡを含んでいる。

図１μγ童皇ｍ吸 第１図は、−ａ化したピキア・バストリスの発現ベクターｐＡＯ８０４の制限酵 素地図である。このプラスミドの主な機能的特徴と制限酵素切断部位が示されて おり、またそれは実施例にも記載されている。

第２図は、ウシ前駆型すゾチーム０２発現プラスミドｐＳＬ１２Ａの制限酵素地 図を与え、プラスミドｐＡＯ８０４およびＥｃｏＲＩ末端をもつ、ウシ前駆型リ ゾチームｃ２をコードするプラスミドｐＢＬＩ６ｃ（クローンλＢＬ３由来）の 断片からなるプラスミドの構築法を示している。　ｐｓＬ１２Ａの主要な機能上 の特徴と制限酵素部位は図に示されており、また以下の実施例中に記載されてい る。

第３図は、ウシ前駆型すゾチームｃ２発現プラスミドｐＢＬ１１の制限酵素地図 である。このプラスミドの主要な機能上の特徴と制限酵素部位は図に示されてお り、また以下の実施例中に記載されている。

図中、括弧で制限酵素を表示した部位は、ある断片が、表示された酵素の一方に より生じた末端で、表示されたもう一方の酵素により生じた末端においてもう１ つの断片に連結した部位であり、そのような部位でこれらの断片が連結すること により、表示された酵素のどちらに対する切断部位も失われている。

１里生■膳互翌皿 ある態様において、本発明は、Ｐ、バストリス内で前駆型リゾチームＣを発現す ることが出来る遺伝子をもつＰ、バストリス細胞の培養からなる動物リゾチーム Ｃの生産法を含んでおり、該培養は、この遺伝子が細胞内で転写されるような条 件下でなされる。

本発明は、さらに、（１〕第１のＰ、バストリス遺伝子のプロモーター断片、す なわち該第１遺伝子のプロモーターと転写開始部位を含む該断片と、第２のＰ、 バストリス遺伝子の終結断片すなわち、該第２遺伝子のポリアデニル化シグナル およびポリアデニル化部位をコードする断片と、転写終結シグナルからなる該終 結断片を含み、該第１遺伝子および第２遺伝子は、同一あるいは異なる遺伝子で あり、該終結断片は、該プロモーター断片の該第１遺伝子のプロモーターからの 転写方向を考慮して、該終結断片の該第２遺伝子の該転写終結部位において、該 プロモーターからの転写終結に働くように方向付けがなされており、また、（２ ）動物リゾチームＣの該第】遺伝子をコードするＤＮＡ断片の該プロモーターか らの転写、および該終結断片中の第２遺伝子のポリアデニル化シグナルおよびポ リアデニル化部位をコードする断片からの転写に働くように、該プロモーターと 終結断片の間に方向付けをして置いた、動物前駆型リゾチームＣをコードするＤ ＮＡ断片からなるＤＮＡをさらに包含している。

さらにもうひとつの態様において、本発明は、Ｐ、バストリス細胞を形質転換し て動物前駆型リゾチームＣを発現させることができ、また前段落に記載された本 発明のＤＮＡの特質を有し、それに加え、そのＤＮＡを含む細胞を選択するマー カーを与える遺伝子を含むＤＮＡを伴っている。

また、他の態様として、本発明は、本発明記載のＤＮＡにより形質転換したＰ、 バストリス細胞の培養を包含している。

さらに他の態様として、本発明は、ウシ前駆型リゾチームＣ２の配列を持つポリ ペプチドおよび、ウシ前駆型リゾチームＣ２のシグナルペプチドの配列を持つポ リペプチドならびに、ウシ前駆型リゾチームｃ２あるいはそのシグナルペプチド をコードする断片を含むＤＮＡ断片を伴う。

本発明は、生物活性を有し、容易に精製される動物リゾチームＣを大量に生産す るための新規で、驚くべき、かつ予想外に効果的な方法を与えている。

この出願において用いられている種々の用語は一般に以下のように定義されてい る： （１）「培養」という用語は、細胞をその生育をもたらす培地中で増殖させるこ とを意味し、その副培養も全てこれを意味する。

（２）「副培養」という用語は、目的の副培養と起源培養の間で行なわれた副培 養の回数に関わらず、別の培養（起源培養）の細胞あるいは、起源培養由来のい ずれかの副培養から生育した細胞の培養を意味している。

（３）「動物前駆型リゾチームＣ」という言葉は、成熟型リゾチームＣのアミノ 末端に融合した、天然に存在するりゾチームＣのシグナルペプチドを含む動物リ ゾチームＣタンパク質の前駆型を意味している０本発明にしたがって作られた前 駆型ウシリゾチームｃ２は、実施例１に示された、１８アミノ酸からなるシグナ ルペプチドと１２９アミノ酸からなる成熟型タンパク質を含む、１４７アミノ酸 配列をもっている０本発明にしたがって作られた前駆型ヒトリゾチームＣは、実 施例１２において記載されたアミノ酸シグナルペプチドおよび１３０アミノ酸の 成熟タンパク質を含む１４８アミノ酸からなる配列を存している。

（４）　ここに示されている種々のアミノ酸配列中のアミノ酸は、以下の３文字 あるいは１文字の略号により照合されるだろう：ヱまｊ且　主文主監号　上文主 監号 し一アラニン　Ａｌａ　Ａ Ｌ−アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ Ｌ−アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ Ｌ−アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ Ｌ−システィン　Ｃｙｓ　Ｃ Ｌ−グルタミン　Ｇｉｎ　Ｑ Ｌ−グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ Ｌ−ヒスチジン　旧ｓ　Ｂ Ｌ−イソロイシン　ｌｉｅ　Ｉ Ｌ−ロイシン　Ｌｅｕ　Ｌ Ｌ−リジン　Ｌｙｓ　Ｋ Ｌ−メチオニン　Ｍｅｔ　ｒＩ Ｌ−フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ Ｌ−プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ Ｌ−セリン　Ｓｅｒ　５ Ｌ−）レオニン　Ｔｈｒ　Ｔ Ｌ−）リブトファン　Ｔｒｐ　Ｈ Ｌ−チロシン　Ｔｙｒ　Ｙ Ｌ−バリン　Ｖａｌ　Ｖ （５）　ここに示されている種々のヌクレオチド配列中のヌクレオチドは、本技 術において日常的に用いられている、通常の１文字呼称を有している； （６）「動物リゾチームＣ」という用語は、動物界および鳥類あるいは咄乳類（ 鳥および哺乳動物）の生物由来のりゾチームＣを意味している。

異種タンパク質を発現するための遺伝子を含むベクターを含んだＤＮＡにより、 ピキア・バストリス形質転換する方法は、当業者に既知のものである。同様に、 異種タンパク質の遺伝子をもつＰ、バストリスを、そのような遺伝子由来の異種 タンパク質を発現させるために培養する方法も知られている。さらに、細胞から 培地中に分泌されたＰ、バストリスの異種タンパク質をこうした培養培地から単 離する方法も知られている。これらの既知の方法は、本発明にしたがってＰ、バ ストリスの培養を作製し、こうした培養を用いて動物リゾチームＣを生産するた めの本発明の方法を行なうために用いることが可能である。これらの方法のある ものは、以下の実施例中である程度詳細に記載されている。

選択可能なマーカー遺伝子を含む本発明記載のＤＮＡにおいて、本発明のＤＮＡ によって形質転換された細胞を、それによって形質転換されていない細胞と区別 できるようなＰ、バストリス細胞内で機能するいずれのマーカー遺伝子も用いら れるだろう。

選択マーカー遺伝子の型のうち、本発明記載のＤＮＡ上の選択マーカー遺伝子は 、優性の選択マーカーあるいは、形質転換される細胞の栄養要求性突然変異を相 補するマーカーを与えることが出来る。Ｐ、バストリス細胞内で優性な選択マー カーを与えることが可能な遺伝子は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与える細 菌のトランスポゾンＴｎ５由来の既知のネオマイシン耐性遺伝子である。栄養要 求性突然変異に対する相補能を与える遺伝子には、Ｐ、バストリスの旧Ｓ４遺伝 子ＣＰ、バストリスの）ｌｉｓ４−株を形質転換するためのもの）、およびＳ、 セレビシェのＨＩＳ４遺伝子（Ｐ、バストリスの旧ｓ４−株を形質転換するため のもの）、Ｐ、バストリスのＡＲＧ４　（アルギノコハク酸リアーゼ）遺伝子（ ｐ、ハストリスのＡｒｇ４−株を形質転換するためのもの）、ならびにＳ、セレ ビシェのＡＲＧ４遺伝子（Ｐ、バストリスのＡｒｇ４−株を形質転換するための もの）などがある。

動物リゾチームＣを作るために、Ｐ、バストリスを形質転換するＤＮＡ　（ここ では、「本発明の形質転換ＤＮＡ　Ｊと呼ぶ）を含むいずれのＰ、バストリス遺 伝子のプロモーターも、本発明のＤＮＡの動物前駆型リゾチームＣをコードする ＤＮＡ断片の転写を行なうために用いることが出来る。動物前駆型リゾチームＣ をコードする断片の転写を行なうプロモーターは、Ｐ、バストリスの培養中で容 易に変えられる因子、例えば、培養の生育のための炭素源、によってその転写が 厳密に調節されているＰ、バストリス遺伝子のプロモーターであることが好まし い、このようなＰ、バストリス遺伝子のうちで、好ましいものは、主要なアルコ ール・オキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ遺伝子）であり、このプロモーターは、培 地中にメタノールが存在しない場合、完全に不活性であるが、メタノールが存在 すると非常に活発となり、高レベルの遺伝子産物を生ずる０本発明のＤＮＡのプ ロモーター断片では、転写開始シグナルおよびプロモーターと転写開始シグナル の間の断片は、プロモーターとして同じＰ、バストリスの遺伝子由来であること が好ましい。

本発明の（形質転換ＤＮＡを含む）ＤＮＡの「終結断片Ｊは、本発明のＤＮＡの プロモーターからの転写におけるポリアデニル化シグナルおよびポリアデニル化 部位をコードする副断片を有し、この転写産物は本発明のＤＮＡの動物前駆型リ ゾチームＣをコードする囲Ａの転写産物ならびに、該プロモーターからの転写の ための転写結語シグナルを与える副断片を含んでいる０本発明の形質転換ＤＮＡ の「終結断片」全体は、ひとつのＰ、バストリスタンパク質をコードする遺伝子 由来のもので、動物前駆型９片、ならびにポリアデニル化部位をコードする断片 の転写を行なわせる本発明のＤＮＡのプロモーターが由来したＰ、バストリス遺 伝子と同一であるかあるいは異なるものであることが好ましい。好ましい例にお いては、動物前駆型リゾチームＣをコードするＤＮＡ断片の転写を調節する終結 断片およびプロモーターの両者は、Ｐ、バストリスＡＯＸＩ遺伝子由来だろう。

本発明記載のＤＮＡにおいては、動物前駆型リゾチームＣをコードするＤＮＡ断 片は、イントロンを含まない配列を有し、翻訳開始部位をコードするトリブレッ ト（ここでは、「翻訳開始トリブレット」と呼ぶ）および、翻訳終結シグナルを コードするトリブレンド（ここでは、「翻訳終結トリブレットＪと呼ぶ）を含み 、また、翻訳開始トリブレットに始まり、転写終結トリブレットに（終結トリブ レッドから見て５′一方向に）隣接したトリブレットで終わる、完全な動物前駆 型リゾチームＣをコードするような、いずれのＤＮＡ断片でも有り得る。そのよ うなりＮＡ断片の例は、ウシ前駆型リゾチームＣ２の配列をもった、以下の実施 例２中に記載されたように構築れれた、約４６０ｂｐのＥｃｏＲ１部位を末端に もつ断片である。熱論、実施例２に記載したように構築されたこの断片と、ひと つあるいはそれ以上のヌクレオチド変化によって異なっているもうひとつの断片 もまた、本発明記載のＤＮＡにおいて用いられ得るウシ前駆型リゾチームＣ２を コードする断片である。

分子生物学的技術において良く知られる方法にしたがって、ウシリゾチームｃ２ 以外の前駆型リゾチームＣをコードする配列をもつＤＮＡ断片を単離することが 出来る０例えば、目的の成熟リゾチームＣのアミノ酸配列に基づいて、目的のＩ ＩＮＡ断片を含む適当なりＮＡを単離するために、含まれている種のｃＤＮＡラ イイブラリ−を検索するためのプローブを用いて、そのようなりＮＡ断片を単離 することが出来る。以　下の実施例も参照のこと。ウシ以外のりゾチームＣの中 で好ましいものは、ヒトのものである。

ウシ前駆型リゾチームＣ２あるいはウシ前駆型リゾチームＣ２のシグナル断片を コードする断片を含む本発明のＤＮＡは、（Ａ）（成熟型タンパク質の一部の９ ８番目の位置が、ヒスチジンかあるいはリジン、但し、ヒスチジンが好ましい） ウシ前駆型リゾチームＣ２をコードする４４１塩基対からなる配列、あるいはウ シ前駆型リゾチームＣ２のシグナル断片をコードする５４塩基対からなる配列を もつ断片をもち：また、（Ｂ）　（ｉ）宿主への形質転換に際して、それから前 駆型リゾチームＣ２あるいは（成熟型動物リゾチームＣ２またはその他の目的の タンパク質に融合した）シグナル断片を作るために発現でき、（ｉｉ）前項（Ｂ ）（ｉ）に記載されたような、タンパク質の発現に影響を与えることが出来るも うひとつのＤＮＡに連結され得る、いずれのＤＮＡでも有り得る。

したがって、例えば、ウシ前駆型リゾチームＣ２のシグナル断片をコードする断 片を含む本発明のＤＮＡは、ウシ前駆型リゾチームＣ２のシグナル断片が成熟型 ヒト乳汁リゾチームのアミノ酸末端に融合したような、融合ポリペプチドをコー ドするＤＮＡであることも可能である。

前駆型リゾチームＣをコードする断片を囲むプロモーターおよび終結断片をもつ 本発明記載のＤＮＡにおいて、動物前駆型リゾチームＣをコードする断片は、Ｐ 、パストリスプロモーターおよび終結断片を考慮して、動物前駆型リゾチームＣ のＰ、バストリスにおける発現を与えることが可能な転写産物に対する、該プロ モーター断片のプロモーターの調節下で、動物前駆型リゾチームＣをコードする 断片の転写に働くように置かれ、方向付けがなされている。当業者には、もし動 物前駆型リゾチームＣをコードする断片が該プロモーターから転写されるならば 、Ｐ、バストリスにおける本発明のＤＮＡからの動物前駆型リゾチームＣの発現 を与えるように働く、このような配置と方向付がいかにして影響を与えるかが理 解されるだろう、当業者に理解されるように、その翻訳開始および翻訳終結トリ ブレットを含む動物前駆型リゾチームＣをコードする断片は、該プロモーターか らの転写方向に関して、転写開始部位の下流になければならず、また終結断片の ポリアデニル化シグナル部位およびポリアデニル化部位をコードする副断片から は上流になければならないが、逆にこれは、終結断片の転写終結部位の上流にな ければならない、動物前駆型リゾチームＣをコードする断片は、翻訳終結トリブ レットの上流にある翻訳開始トリブレットで方向付がなされている０本発明のＤ ＮＡの下流にある末端の終結断片の転写終結点から上流のプロモーターとポリア デニル化部位の間には、転写終結部位がないことが好ましい０本発明記載のＤＮ Ａでは、動物リゾチームＣをコードする断片の転写を行なうプロモーターから転 写を行なうような方向性では、該プロモーターと該プロモーターからの該転写を 終結する転写終結点の間には、動物前駆型リゾチームＣをコードする配列をもつ 、単一の、長い読み枠だけしか存在しないだろう、同様に、この転写産物は、単 一のポリアデニル化シグナルおよび部位をもつだろう。

本発明のＤＮＡにおける「下流」および「上流」という呼び方は、動物前駆型リ ゾチームＣをコードする断片の転写を行なうプロモーターからの転写の方向につ いて、それぞれ「下流」および「上流」であることを意味している。

ｐｓＬＩ２Ａ、　ｐＢＬｌｌおよびｐＨＬＺ１０３を含む本発明記載のいくつか の形質転換ＤＮＡの構築法は、以下の実施例に記載されている。

これら３つのプラスミドＤＮＡについて、Ｃ１ａ　Ｔ部位を末端にもつウシ前駆 型すゾチーム０２発現カセットおよび、Ｐ、バストリスＢＩＳ４遺伝子を含むｐ ｓＬ１２ＡのＣ１ａ　Ｉ−（Ｂａ＋ｗＨＩ／Ｂａｌ　ＩＩ）断片と、Ｃ２ａ　１ 部位を末端にもつウシ前駆型リゾチームと２発現カセットおよび、Ｓ、セレビシ ェのＡＲＧ４遺伝子を含むｐＢＬｌｌのＣ１ａ　１−　（Ｂａｗｌ　Ｉ　／　Ｂ ｇｌ　Ｉｆ　）断片ならびに、Ｃ１ａ　１部位を末端にもつヒト前駆型リゾチー ムＣ２発現カセットおよ・び、Ｐ、バストリスＨＩＳ４遺伝子を含むｐＨＬＺ１ ０３のＣ１ａ　Ｉ−ＣＢａｍＢＩ／（Ｂｇｌ　■）断片も、本発明記載のＤＮＡ である。

本発明記載の形質転換ＤＮＡは、細菌、特に大腸菌における選択と複製に必要な 要素を含み、それによって、細菌における複製によるＤＮＡの大量連座が促進さ れるだろう、この点については、本発明の好ましいＤＮＡは、プラスミドｐＢＲ ３２２の複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子あるいはテトラサイクリン耐 性遺伝子を含むプラスミドである。

もしＰ、バストリスにおける染色体外での維持に働く複製開始点、あるいは自己 複製配列（ＡＲＳ）を含むなら、本発明のＤＮＡはＰ、バストリスへ形質転換し た後、染色体外ＤＮＡとして（例えば閉環状プラスミドとして）維持されるだろ う、ピキア・バストリス内で機能する複製開始点あるいはＡＲＳを含む多数のＤ ＮＡ断片が当業者に知られている。

本発明のＤＮＡは、ある割合の細胞において、Ｐ、バストリス染色体へ、相同的 組換えによって組み込まれるかも知れない。

このような組み込みは、相同的ＤＮＡ配列からなる直鎖化したプラスミド、ある いは環状化したプラスミド、または直線化した断片のいずれかを用いてＰ、バス トリスを形質転換することによって行なわれ得る。したがって、本発明の好まし いＰ、バストリス培養において、本発明のＤＮＡは、細胞の染色体の一部として 細胞内に維持されるだろう、Ｐ、バストリスのＤＮＡを含む異種ＤＮＡを酵母染 色体へ組み込む方法は、当業者によく知られており、本発明のＤＮＡにも適用で きるだろう０例えば、欧州特許第０２２６７５２号明細書を参照のこと、特に、 以下の実施例に説明されるように、Ｐ、バストリス染色体へのＤＮＡの組み込み の可能性は、染色体外型のＤＮＡを維持するためにＰ、バストリス内で機能する 複製開始点あるいはＡＲＳのＤＮＡがないことによって増大する。さらに、Ｐ、 バストリスの染色体上の好ましい部位への組み込みの部位を標的とすることは、 通常、本発明により直線化されたＤＮＡの両端にある断片である形質転換ＤＮＡ に「標的断片」を取り入れることによって行なわれるが、この断片は、目的とす る、染色体への組み込み部位に相同な配列をもつものである。もし形質転換ＤＮ Ａがプラスミドである場合は、適当な部位で切断する制限酵素部によって切断す ることによって簡便にそれは直線化され、あるいは直線化された断片に切断され ることができ、その末端に標的断片をもつ本発明の直線の形質転換ＤＮＡを生ず る。適当な標的断片は、少なくとも約２００塩基対の長さであろう、この方法に より本発明の形質転換プラスミドＤＮＡを処理した例は、実施例に与えられてい る。例えば、直線化した形質転換プラスミドＤＮＡは、ＥｃｏＲ１部位に組み込 まれた（Ｓａｃ　１部位を欠く）動物前駆型リゾチームＣをコードする断片をも つｐＡＯ８０４誘導体をＳａＣＩ　（Ｓａｔ　Ｉのイソシゾマー）で切断するこ とにより得られ、また形質転換ＤＮＡの直線化された形質転換断片は、ＥｃｏＲ １部位に組み込まれた（Ｂａｌ　１１部位を欠いた）動物前駆型リゾチームＣを コードする断片をもつｐＡＯ８０４誘導体をＢｇｌ　ＩＩで切断することにより 得られる。

無傷の動物リゾチームＣシグナル配列（あるいは、ヒトリゾチームＣまたはウシ リゾチームＣ２シグナル配列）を用いることによって、本発明はＰ、バストリス 細胞から培地中へ意外なほど効率的に動物リゾチームＣを分泌させることが出来 る。驚いたことに、培地中に分泌された動物リゾチームＣは、天然に存在する酵 素と同じ生物活性を有し、また、前駆型酵素は、成熟タンパク質とシグナル配列 の連結部で正しくプロセスされる。

したがって、意外にも、動物前駆型リゾチームＣシグナル配列は、Ｐ、バストリ ス分泌経路において正しく認識され、プロセスされるものである。

本発明の培養を行なった培地から単離した動物リゾチームＣは、いくつかの規範 によって、真のりゾチームＣと同一であると判断される。第１に、成熟した、分 泌されるタンパク質のＮ−末端配列は、天然に存在する酵素のものと同一である 。第２に、分泌されたりゾチームＣのウェスタン・プロット分析により、天然に 存在する成熟型酵素と同じ分子量をもつ唯一の免疫反応物しか現れない、最後に 、分泌されたリゾチームＣのミクロコツカス・ルテウス（正しい名称は、ミクロ コツカス・リゾデイクティクス）を溶菌する能力に基づいた生物学的定量法にお いて、Ｐ、バストリス細菌から培地へ分泌されたタンパク質は、天然に存在する 材料から単離されたりゾチームＣと基本的に同じ比活性を有している。

本発明によって生産された動物リゾチームＣが、有意な量の分泌された酵素断片 （または、成熟型タンパク質よりも大きな分子量を有する不正確にプロセスされ たタンパク質）の混入を受けていないという驚くべき、かつ有利な結果は、成熟 型酵素よりも大きな、そうした混入断片またはタンパク質が存在しないことを示 す電気泳動およびアミノ末端の配列分析によって確立された。

本発明によりＰ、バリトリス培養液中に存在する動物リゾチームＣは、培地に酵 素が高濃度で存在し、また、混入したタンパク質あるいはタンパク質断片が低濃 度であるために、タンパク質精製の当業者によく知られた技術によって容易に精 製され得る。簡単な２段階の精製法が以下の実施例に記載されている。

本発明により与えられる動物リゾチームＣは、当業者に知られるように、−ｉに こうしたりゾチームのために用いられ得る。

例えば、リゾチームＣは、クローン化された、遺伝学的に操作されたプラスミド を単離するために大腸菌の分解に用いることが出来る０例えば、マニアナイス（ Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニ ュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、コールド・ スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、ペイ（１９８２）を参照のこと。

他のりゾチームと同様に、本発明により与えられるリゾチームＣは、単独もしく は他の構成要素と組み合わせることによって、チーズの熟成剤として、あるいは 化粧品、界面活性剤、種々の食物製品の抗菌剤として、またチーズ、ソーセージ 、海産物などの食物の防腐剤として、あるいはヒトを含む動物の細菌による感染 に対する処を薬として用いることが出来る。しかし、リゾチームＣを他の抗生物 質と組み合わせて用いる場合、その構造が、この酵素の糖基質と関連している、 ネオマイシンＢ、ゲネタマイシンＣ＋ａ　、カナマイシンあるいはジヒドロスト レプトマイシンなどのアミノ糟抗生物質を除外することが重要である。

本発明の方法によって与えられるリゾチームＣに関するその他に報告されている 利用法は、小児科（リゾチームの添加による、ウシ乳の母乳化）における場合と 同様に、種々の苦痛、アレルギー、炎症、結腸炎、帯状ヘルペス、リューマチ熱 、リューマチ性関節炎などの処置を含んでいる０例えば、ジョレスら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、６３．１６５　（１９８４）を参照のこと。

本発明によって与えられるリゾチームＣに関するもう１つの可能な方法は、瓦材 動物が生育のために食物を利用する効率を増大させるために、この動物の試料に 対する添加物としての方法である。瘤胃細菌は、反蛎動物にとって重要な栄養源 である。

しかし、それを利用する際に重要な因子は、その動物が細菌を分解する能力であ る。すでに述べたように、細菌はリゾチームによって切断され得るグリコシド結 合を含むペプチドグリカンによって覆われている。試料添加物としてリゾチーム Ｃを用いることは、反蛎動物の皺胃の底部領域におけるリゾチームＣのレベルを 上昇させることになり、今度はこれにより、庸胃から胃のこうした領域へ入った 細菌集団の分解レベルが上昇するだろう、この細菌集団の分解が増加することに より、反蛎動物はエネルギー生産および生育のための細菌含有物の量を増加する ことができる。

以下の実施例は、さらに詳細に本発明を記載、説明している。

この出願において引用された特許および出版物の全ては、そのためにこの特許に 対する引用文献に加えられている。

（実施例１） ウシリゾチームＣコード　る　ｃＤＮＡ　ローンの　と”折 ｐＬｌと呼ばれるウシリゾチームＣの部分的ゲノムクローン、およびそのＤＮＡ 配列はジノ・コルドパ７シ（Ｇｉｎｏ　Ｃｏｒｔｏｐａｓｓｉ）博士から入手し た。新鮮なウシ皺胃組織は米国カリフォルニア州ニスコンデイドのティロン・ミ ート・バンキング社から入手した。λｇｔｌｏおよび大腸菌Ｃ６００ＨＦ１株は クロンチク・ラブズ社（４０５５Ｆａｂｉａｎ　Ｗａｙ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ 、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９４３０３）から入手した。λｇｔｌＯのパンケー ジングに用いたパンケージングキットはマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、 上述、の方法に従って調製した。

制限酵素およびＤＮＡ収縮酵素はベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル社 （インディアナ州インディアナポリス）および二ニー・イングランド・バイオラ ブズ社（マサチニーセッツ州ベバリー）から入手し、販売元の指示に従って使用 した。

シールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）とブローベル（Ｂｌａｂｅｄ）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７４：２０５９（１９７７）の修飾法によっ てウシ皺胃組織的２０ｇから完全な全ＲＮＡを調製した後、オリゴｄＴカラムを 用いた標準的な方法によってポリアデニル化されたＲＮＡをポリアデニル化され ていないＲＮＡから分離した。

反蛎皺胃の底部は高濃度の膵臓リボヌクレアーゼを含んでいるので、ＲＮＡを保 持するためには、低温処置を含む、組織の迅速で適切な扱いが必要である。

略述すると、凍結したウシ皺胃組織を液体窒素存在下で、ステンレス製手動粉砕 機でパウダー状にした。パウダー状にした組織に４００４／ｄのプロテイナーゼ Ｋ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル社）を含むプロテイナーゼＫＷ 衝液（０，１４Ｍ　ＮａＣ１，０，０５Ｍ　）リス／７．４．０．０１？ｌ　Ｅ ＤＴＡ　／８．０．１％　ドデシ弗硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　）を加えた。混 合液を直ちによく振とうし、室温で１５分間インキュベートした。

インキュベーション後、調製液を等体積のＰＣＩＡ（フェノール：クロロホルム ：イソアミルアルコール、２５　：　２４　：　１）で抽出し、続いて等体積の ＣＩＡ　（クロロホルム：イソアミルアルコール、２４：１）で抽出した。得ら れたＤＮＡ／ＲＮＡ混合液のＮａＣ］濃度を０．２５Ｈに合わせ、２倍体積のエ タノールを加えて一２０°Ｃで一装置いて沈澱させた。　５０００ｇで６０分間 遠心した後、ＤＮＡ／ＲＮＡを２０ｄのＥＴＳ緩衝液（０，ＩＭ　）リス、ｐＨ ７，６，０，ＯＩＭ　ＥＤＴＡ、　０．２χ５ＤＳ）に再溶解した。　ＰＣＩＡ 抽出およびＣＩＡ抽出、ＤＮＡ／ＲＮＡ沈澱を上述のように行なった。　ＤＮＡ ／Ｉ？ＮＡ沈澱物は遠心によって回収し、３２ｍの１０１トリス、１０ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、　ｐＨ７−４に再溶解した。

再溶解後、この溶液中に存在するＲＮＡを４本のチューブに各々加えである４ｄ のＣｓＣ］（Ｉｇ　ＣａＣ１／ｄ）のクッションのうえに載せて分注することに よって濃縮した。次に調製液を３７．０００ｘｇで２０分間遠心した（ペンクマ ン籏４１０−ター）、遠心後、上滑を注意深く取り除き、ＲＮＡペレットを８＋ ｄのＥＴＳ緩衝液に再溶解し、エタノール沈澱を２回行い（ＮａＣ１を最終濃度 ０．２５Ｍとなるように加えた後に２倍体積の９５スエタノールを加える）、５ ｄのＥＴＳ！！を衝液に再溶解した。ポリアデニル化された（ポリ（Ａ）”）） ＲＮＡを、アビブ（Ａｖｉｖ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　６９：１４０８（１９７２）に記述されているように、オリゴデ オキシチミジル化セルロースカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによ ってポリアデニル化された（ポリ（Ａ）’　）ＲＮＡを選択した。　ＲＮＡをオ リゴ−ｄ丁カラムに０．５カのＮＥＴＳ緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩ Ｍ　）リス、０．０１Ｍ　ＥＩＩＴＡ、　０．２χＳＤＳ、　ｐＨ７，６）で結 合させた後、カラムを３０Ｒ１の０．５Ｍ　ＮＥＳＴで洗浄した。続いてポリア デニル化ＲＮＡを５−のＥＴＳ緩衝液で溶出し、エタノール沈澱を行なった。

１１０ｌ１のポリアデニル化ＲＮＡを２１のＣ！（ｓＨｇＯＨ（アルファ・プロ ダクツ社、マサチューセッツ州デンバー）中で、室温で５分間変性させた。ヒュ ン（Ｈｕｙｎｈ）他、ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｎｇ：　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡ ｐｐｒｏａｃｈ　（Ｄ、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）　Ｗ集）ＩＲＬブレス、オ ックスフォード（１９８４）の方法に従って、この［ｌＮＡを用いてｃＤＮＡ合 成反応を行い、全ポリＡ−ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、λｇｔ ｌＯに挿入した（ガプラー（Ｇｕｂｌｅｒ）他、Ｇｅｎｅ　３７：２１５（１９ ８５））、略述すると、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて−ＲＮＡからｃＤＮＡを合 成した。その後にＲＮアーゼＨ処理を行い、ＤＮＡポリメラーゼ１による第二の ｃＤＮＡ鎖合成を行なって二本鎖ＣＤＮＡを生成した。二本鎖合成後、ｃＤＮＡ を５１ヌクレアーゼで平滑末端とし、さらに大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノ ー断片で平滑化処理を行なった（チルフォード（Ｔｅｌｆｏｒｄ）他、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：２５９０　（１９７９ ））。

ＥｃｏＲＩアダプター、（ウッド（Ｗｏｏｄ）他、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：３３ ０（１９８４））を二本鎖ｃＤＮＡに連結し、メチル化およびそれに続（ｃＤＮ ＡのＥｃｏＲＩ消化の必要性を排除した。過剰なアダプターは、１０ｍＭ）リス 、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラムで クロマトグラフィーによって除去した。　４００ｂｐ以上のｃＤＮＡを含むカラ ム画分を保存し、ＥｃｏＲＩで消化してホスファターゼ処理したｃＤＮＡバクテ リオファージクローニングベクターλｇｔｌＯに連結した。連結反応は５　ｐｌ の体積中で行い、１６°Ｃで１８時間インキュベートした０反応液は１周のλｇ ｔｌｏベクター（最終濃度−２００４／Ｍ１）と５０〜１００　ｎ　ｇのｃＤＮ Ａ　（ベクターに対して２倍〜４倍モル過剰の挿入断片）を含むものとした。

得られたｃＤＮＡをラムダバフケージングキットを用いてパフケージソゲし、得 られたベクターを大腸菌Ｃ６００ＨＦ１株の上にブレーティングし、プラークを 放射性標識したｐＬｌでスクリーニングした。少なくともウシリゾチームＣの一 部をコードするｃＤＮＡを含むものと同定されたこれらのプラークのプラーク精 製を行い（マニアティス他、前述）　、　ｐＬｌおびコルトバンシ博士から与え られたＤＮＡ配列情報から合成したオリゴヌクレオチドプローブの双方でスクリ ーニングを行なった。このようなプローブの塩基配列はウシリゾチームＣ遺伝子 のエクソン２０５′末端のＤＮＡ断片の一方のＤＮＡ１ｉ由来のもので、成熟ウ シゾチームｃ２のアミノ酸２９〜３８をコードする以下のような配列を含む：３ ’　−ＡＡＣＡＣＡ　ＡＡＣＴＧＧ　ＴＴＴ　ＡＣＣＣＴＴ　ＴＣＧ　ＴＣＡ　 ＡＴＡ−５’。

プラークの写し取りは実質的にベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）他、５ｃｉｅｎｃｅ１ ９６：１８０（１９７７）に示された方法で行なった。　５　Ｘ５ＳＰＥ（０， ９Ｍ　ＮａＣ１゜０．０４Ｍ　ＮａＯＨ，０，０５Ｍ　ＮａＨｚＰＯａ−ＨｚＯ ，０，００５Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０）　５　Ｘデンハルト溶液（５０Ｘデ ンハルト溶液：５ｇフィコール４００（ファルマシア社、ニューシャーシー州ビ スカタウエイ、カタログ番号１７−０４００−０１、平均分子量約４００，００ ０ダルトン）、５ｇ　ポリビニルピロリドンＰＶＰ−３６０（シグマ・ケミカル 社、ミズーリ州セントルイス、平均分子量約３６０．０００ダルトン）、５ｇ　 ウシ血清アルブミンをＨｚＯで５００ｍとしたもの）、５０χ（ν／ν）ホルム アミド、０．２χ（ｗ／ｖ）　ＳＯ５および２００！＠／、ｗ！シアリングした ニシン精子ＤＮＡ（バーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社）中で、ニ トロセルロースフィルターのプレハイブリダイゼーションを４２℃で４時間行な った。ニックトランスレーションを行なったｐＬ］プローブをＩ　ＸＩＯ’　ｃ ｐ＋ｅ／−の濃度で直接プレハイブリダイゼーション溶液に加えた後、フィルタ ーのハイブリダイゼーションを４２℃で１６時間行い、Ｏ，ｌＸ５ＳＰＥ、０， １χ（−／ν）　ＳＤＳ中６５°Ｃで１回あたり１５分間の洗浄を数回繰り返し 、オートラジオグラフにかけた。オリゴヌクレオチドを用いたスクリーニングの 場合には、５ＸＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、２５χホルムアミド、０．２χ （賀／ν）ＳＤＳ　、　２００ｐｇ／ｄニシン精子ＤＮＡ中、４２°Ｃで２時間 、フィルターのプレハイブリダイゼーションを行なった。それを同じ緩衝液中で ４２℃で３時間ハイブリダイゼーションを行い、Ｉ　Ｘ５ＳＰＥで４５°Ｃで数 回洗浄した。

オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、プラーク精製したクローンの一つを λＢＬ３と名づけ、ファージ“ミニプレツブ２産物（ベンソン（Ｂｅｎｓｏｎ） 他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ＋　ｉ３　、１２６（１９８４））を制限酵素 ＥｃｏＲ１で消化してｃＤＮＡ挿入断片のサイズを決定したところ９５０ｂｐで あった。

クローンλＢＬ３のｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列を、サブクローニング したＭ１３テンプレートおよびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３（１９７７）、および Ｍ１３　Ｃ１゜ｎｉｎｎｇ／Ｄｉｄｅｏｘｙ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｌ’１ａ ｎｕａｌ　、ベセスダリサーチ１ラボラトリーズ社、メリーランド州ガイザース バーグ（１９８０）によるジデオキシヌクレオチド法を用いて決定し、次の配列 が得られた： この結果は、λＢＬ３　ｃＤＮ＾挿入断片がウシリゾチームｃ２のコード領域４ ３６ｂＰおよび３′非翻訳非コ一ド配列からなることを示した。

λＢＬ３中の３′非コ一ド領域配列はポリアデニル化シグナルあるいはポリ（Ａ ）４テイルを含んでいなかった。λＢＬ３中のｃＤＮＡ挿入断片の５′末端のＤ ＮＡ塩基配列から、該挿入断片はタンパク質シグナル配列のＣ末端領域をコード する４９ｂｐを含むが、プレーリゾチームｃ２　ｍＲＮＡの翻訳開始コドンに対 応するＡＴＧ　）リブレットは含まないことが示唆された。したがって、ｃＤＮ Ａ挿入断片は成熟タンパク質のアミノ末端までのアミノ末端１６アミノ酸までを コードする。

λＢＬ３のｃＤＮＡ挿入断片に対応するヌクレオチド配列から推定したタンパク 質のアミノ酸配列は、前述のヌクレオチド配列の下に示したように、成熟タンパ ク質の９８遺伝子のアミノ酸はヒスチジンであるが、報告されたタンパク質配列 （ジョレスＵｏｌｌｅｓ）他、Ｊ、旧ｏｆ、　Ｃｈｅｗ、　２５９．１１６１７ （１９８４））ではこの位置はリジンであることが示唆されている。この部位に ヒスチジン残基は存在することは、挿入断片から発現されたタンパク質のＣ末端 ＣＮＢｒ断片のＮ末端解析から確認された。さらに、ウシ皺胃組織由来のりゾチ ームＣ７の配列決定から、少なくともこの仕事でＲＮＡｎとして用いた動物内で は９８位のアミノ酸は実際にヒスチジンであることが示された。

カランタナシス（Ｋａｒａｎｔｈａｎａｓｉｓ）　、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ 、　Ｌａｂ、　Ｆｏｃｕｓ４：３．６（１９８２）　（ベセスダ・リサーチ・ラ ボラトリーズ社）に推奨されるジデオキシ塩基配列決定法の修飾法を用いてウシ リゾチームｍＲＮＡの連続した塩基配列決定を行なった。４尾の皺胃ポリ（Ａ） ’ＲＮＡを鋳型として使用し、ウシリゾチーム遺伝子の５′末端のＤＮＡ配列か らコピーしてアプライド・バイオシステム合成ｗｉ（モデル３８０Ａ）で標準的 なホスホルアミダイト法によって合成した２７塩基の合成ヌクレオチド　５’　 −ｄＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＣＴ丁Ｇ−３′を逆転写 酵素による伸長反応のプライマーとして使用した。　ｍＲＮＡの塩基配列決定か ら、λＢＬ３の挿入断片は、その５′末端のＡＴＧ開始コドンを含む５ｂｐを欠 いていることが明らかになった。さらに、ＲＮＡ配列からλＢＬ３挿入断片の２ 位の塩基はＡではなくＧであることが示された。さらにこの塩基配列決定から、 ウシリゾチームＣのアミン末端の開始メチオニンの位置を含むシグナル配列のア ミノ酸配列が明らかになった。このシグナル配列は以下のようなものであった： 　ＭＫＡＬＶ　Ｉ　ＬＧＦＬＦＬＳＶＡＶＱＧ、既知の配列（ジョレス（ＪｏＴ 　１ｅｓ）他、上述）との比較により、クローンλＢＬ３のｃＤＮＡ挿入断片が コードするウシリゾチームＣは、三つのウシリゾチームＣのなかで最も多量に存 在するウシリゾチームｃ２と非常によく似ていることが分かった。　ｃＤＮＡの 配列とジョレスらに報告されたウシリゾチームｃ２の配列との唯一の相違は、上 述のように、成熟タンパク質の９８位のリジンとヒスチジンの違いである。多数 のアミノ酸変換および／またはアミノ酸総数の違いにより、λＢＬ３のｃＤＮＡ 挿入断片にコードされるタンパク質かりゾチームｃ１あるいはＣ３である可能性 は否定される。λＢＬ３にコードされるリゾチームとジョレスらに報告されたり ゾチームｃ２との間の唯一の、保存されたアミノ酸変換は、二つのヌクレオチド 変換によるものであり、おそらくアリルの相違で説明することができるであろう 。

以下の実施例で示すように、９８位がヒスチジンであるリゾチームｃ２でも、ウ シ皺胃組織から単離されたリゾチームｃ２と実質的に同じ性質を有する。

（実施例２） 発塊二久久二ｑ１築 ＋ｐｕｍｒ兄現ベクターに連結できるように操作し、また他ｉいくつかの操作を 行なうために、λＢＬ３のウシプレリゾチームｃ２コード領域の５′末端および ３′末端の２カ所について１ｎｖｉ　ｔｒｏ　ミュータジェネシスを行い、その のちにコード領域をピキア・バストリス発現ベクター１）ＡＯ８０４（後述）に 挿入した。コード領域の３′末端は、４８２ｂｐの非コード領域を除去し、翻訳 終止コドンをコードするＴＡＡ　）リブレットの３′側直後にＡｓｕ　ＩＩｌ制 限部位　５’−ＴＴＣＧＡＡ−３’）およびＥｃｏＲｌ制限部位（５’　−ＧＡ ＡＴＴＣ−３”）を導入するようにミュータジェネシスを行なった。３′末端に これらの変化の導入が確認されたクローン（ｐＢＬ４Ｃと呼ぶ）中の挿入断片の ５′末端は、ＲＮＡシークエンシングで示唆された正しい配列である７塩基対の 配列（５’　−ＡＴＧＡＡＧＧ−３’　）　を導入するミュータジエネシスを行 なった。５′末端のこの修飾によりシグナル配列（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−・ ・・）のＮ末端のコード配列が完結し、さらにＭｅｔコドンをコードするＡＴＧ の直前に第二のＥｃｏＲｌ制限部位が付加された。クローンｐＢＬ１６ｃは、末 端が両方とも目的どおりミュータジエナイズされていることが確認されたもので ある。

第一のｉｎ　ｖｉｔｒｏミュータジェネシス法では、５’　−ｄＧＡＧＣＴＧＡ ＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＡ−３’の配列を持つミュータジェネシス用のオリゴマ ーを合成し、λＢＬ３のウシリゾチーム遺伝子挿入断片の３′末端のミュータジ ェネシスおよびスクリーニングに使用した。二次ハイブリダイゼーションスクリ ーニング由来の４つのポジティブなプラークをシーフェンシングのための鋳型Ｄ ＮＡの調製に使用した。鋳型ＤＮＡの一つであるｐＢＬ４ｃは正しい配列、およ び翻訳終止コドンをコードするＴＡＡの３′側のＥｃｏＲ１部位を有することが 示された。

５’−ｄＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣ丁ＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣ ＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧ−３’の配列を持つ第二のミュータジェネシス用オ リゴマーを、第二のミュータジェネシスのためのｐＢＬ４Ｃ鋳型ＤＮＡのプライ マーとして用いた。この修飾ニツイテ、５’　−ｄＴＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＴＴ ＣＡＴＧＡＡＴ丁Ｃ−３’の配列を有する合成オリゴヌクレオチドをスクリーニ ングに使用した。クローンｐＢＬ１６ｃは５′末端のＥｃｏＲ１部位、翻訳開始 コドンをコードするＡＴＧ　）リブレフトおよびそれに続く二つのアミノ酸１ｙ ｓおよびａｈａをコードする配列を含む目的の配列を有するものとして同定され 、これを鋳型ＤＮＡの調製に使用した。

ミュータジェネシス用オリゴヌクレオチドのアニーリング、プライマー伸長反応 およびアルカリ蔗糖勾配分離は、シラー（Ｚｏｌ　１ｅｒ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ　、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９８ ３）に示された方法で行なった。ポジティブなりローンのスクリーニングはホブ デン（Ｈｏｂｄｅｎ）他、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ■、　１４４ニア５　（１ ９８５）記述されている液体ハイブリダイゼーションおよびアガロースゲル電気 泳動を用いて行なった。

第１図に示した、作成したピキア・バストリス発現カセットベクターｐＡＯ８０ ４は一つの断片を切り出す二つのＢｇｌ　１１部位を持ち、該断片はＣ］ａ　１ 部位から約１００ｂｐの位置のＢｇｌ　Ｉ［部位から第１図で時計回りに以下の 要素を有する：（１）約９００塩基対（ｂｐ）断片（図では“５’−ＡＯＸＩｏ と示す）であって、本発明において“プロモーター断片１と呼び、ピキア・バス トリス主要アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸＩ）由来であってプロモーターと転 写開始部位を含み、ＡＯＸＩ遺伝子産物の翻訳開始コドンの直上流に付加されて （エリス（Ｅｌｌｉｓ）他、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：１１１Ｈ １９８５）ｐＡＯ８０４中の唯一のＥｃｏＲ１部位を与えるＥｃｏＲＩリンカー ンで終わる断片；（２）約３００ｂｐの断片（図テ“３′−ＡＯＸＩｏと表す） であって、本発明において“ターミネータ−断片”と呼びピキア・バストリスＡ ＯＸＩ遺伝子由来であって、該断片は５′末端にＥｃｏＲＩリンカ−１３′末端 にＣ１ａ　１部位を有し、ポリアデニル化シグナルをコードする断片およびポリ アデニル化部位をコードする断片、およびＡＯＸＩ遺伝子の転写ターミネータ− を含む；（３）約２７００ｂｐのピキア・バストリス　ヒスチジノールデヒドロ ゲナーゼ（Ｈ１ｓ４）遺伝子を含むＢｇｌ　Ｉｔ断片（第１図に示した向き）で 、ピキア・パストリスのＨｉｓ４−株の選択マーカーを与えるものであり（フレ フグ（Ｃｒｅｇｇ）他、上述）　、ｐＢＲ３２２のＢａ＋ａＨ１部位に挿入され た該断片をｐＡ０８０４の構築に使用した：および（４）約８００ｂｐのピキア ・バストリスＡＯＸＩ遺伝子座の転写ターミネータ−より下流から採った３′配 列の断片（図では“ＡＯＸＩ　３’由来°と表す）で、該断片の一端はＢｇｌ　 Ｉｆ　（ｐＢＲ３２２のＰνυ■部位を修飾することによって作成）で終結し、 他方の末端はＸｈｏ　１部位とｐＢＲ３２２のＳａｌ　１部位が結合した状態で 終止している。　ｐＡＯ８０４はｐＢＲ３２２由来のいくつかの断片を含んでい る：　（１）　”３’−ＡＯＸＩ″で示した断片の末端のＣｌａ　１部位から、 ピキア・パストリス旧ｓ４遺伝子を含む断片の一端のＢａｍＨ１部位の片割れま での約３５０ｂｐの断片；（２）ピキア・バストリスＨＩＳ４遺伝子を含む断片 のもう一方の末端のＢａａ＋ＨＴの片割れから゛ＡＯχ１３′由来”断片の一端 のＳａｌ　ＩＯ片馴れまテノ約２８０ｂｐ　１７）断片；および（３）　”ＡＯ ＸＩ　３”断片（およびその外側）の一端のＢａｌ　ｍ部位の数塩基対の中のｐ ＢＲ３２２Ｐｖｕ■部位（図には示していない）から“５”−ＡＯＸＩ”断片の 一端のＢａｌ　ｍ部位の近傍のＣ１ａ　１部位までの約２３２０ｂｐの断片、　 ２３２０ｂｐｐＢＲ３２２断片はｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＴ部位を除くように修 飾され、ｐＢＲ３２２の複製開始点およびベーターラクタマーゼ遺伝子（プラス ミドを形質転換すると細菌をアンピシリン耐性にする）を含む。

ｐＡＯ８０４の構築は実施例１５で述べる。

第１図のｐＡＯ８０４に関して示された、Ｂａｌ　１１部位に挟まれた°発現ユ ニコピ　（あるいは、例えばＢａｌ　１１部位に挾まれた断片を含むＣ１ａ　Ｉ 　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片）はＥｃｏＲＩ部位にイントロンのないＤＮＡ断片を挿入 することによって作成し、３’−ＡＯχ１断片から与えられるポリアデニル化シ グナルおよびポリアデニル化部位を持つその転写産物は、ＡＯχ１プロモーター から目的のタンパク質に翻訳される。

ＡＯＸＩプロモーターと転写開始部位を含む約９ｏｏｂｐのＢｇｌＩ［−Ｅｃｏ ＲＩ断片、およびＡＯＸＩ遺伝子の３′側由来の約８００ｂｐゲノム断片（図で は“ＡＯＸＩ　３’由来”）は、Ｂｇｌ　ｎ部位で挾まれた発現ユニットの、プ ラスミドで形質転換したピキア・バストリス細胞のＡＯＸ１部位への部位特異的 挿入に使用した。

該プラスミド（あるいはそのＢｇｌ　１１部位を末端とする発現ユニット）で形 質転換したピキア・バストリス細胞をＡＯＸＩプロモーター転写に関して活性化 されるように炭素源としてメタノールを用いて培養すると、リゾチームの配列が ＡＯＸＩプロモーターからの転写が行なわれるような向きでＰＡＯ８０４の唯一 のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたｐＢｔｒｓｃ由来のＥｃｏＲ１部位に挟まれたウ シブレリゾチームｃ２コード領域から、ＡＯＸＩプロモーターの転写制御下でプ レリゾチームｃ２が発現される。

主要アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸＩ）あるいはｐ７６遺伝子（ジヒド ロキシアセトン合成酵素（ＤＡＳ）　、ヨーロッパ特許出願公開公報第０１８３ ０７１号）などの、ピキア・パストリス由来のある種のメタノール制御プロモー ターが工業的規模の工程での異種遺伝子発現に特に適していることが、ピキア・ バストリスの研究から明らかになった。このようなプロモーターは単一コピーの 場合でさえも高レベルの転写を与え、厳密に制御されるので、発現期間を制限す ることができる。エタノール、グリセロール、あるいはグルコースで増殖させた 野生型細胞中にはアルコールオキシダーゼは存在しない、しかし、メタノールで 培養した細胞では全細胞性タンパク質の３０χをも占める。

ＡＯＸＩ欠失変異体は野性型アルコールオキシダーゼ酵素の約１５２の活性を産 生（非主要アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ２）由来するが、ＡＯＸ２欠失変異 体はメタノール上で培養すると野生型レベルのアルコールオキシダーゼを産生ず る。

ピキア・バストリスＡＯχ１プロモーターは既知のプロモーターのなかで最も強 力で厳密に制御されているものの一つである。

ピキア・バストリス細胞をグルコースあるいはグリセロール上で培養する場合に はＡＯＸＩプロモーターは抑制されており、アルコールオキシダーゼｍＲＮＡは 合成されず、アルコールオキシダーゼは発現されない、それに対して該細胞をメ タノール上で培養した場合には、ＡＯＸＩプロモーターが誘導され、ＡＯＸＩ遺 伝子から発現されたアルコールオキシダーゼがある条件下では全細胞性タンパク 質の３０χを占めることもできる。　ＡＯＸＩ遺伝子はそのプロモーターも含め て単離され、詳細に解析された。研究の結果、ＡＯＸＩの制御は転写レベルで起 き、遺伝子が転写されるとＡＯＸＩｍＲＮＡは定常状態のｍＲＮＡ中で豊富な種 となることが示唆された。

ピキア・バストリスＡＯＸ２遺伝子もメタノール制御を受けるが、ＡＯＸＩ程高 度には転写されない、したがって、ＡＯＸ２が正常であるＡＯχ１欠失変異体は メタノール上で増殖できるが、メタノール上での世代期間が野生型株よりも顕著 に長くなる。

複製型のｐＢＬＩ６ｃから二本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切り出し、得られた約４ ６０ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩで消化してアルカリホスファターゼ（ バーリンガー・マンハイム・バイオケミカル社）処理したＰＡＯ８０４ＯＮＡに 連結した。得られた二種類の発現プラスミドのうち一つは第２図に示すようにｐ ｓＬ１２Ａと呼ばれ、ＡＯＸＩプロモーターおよび°５’−ＡＯＸＩ“プロモー ター断片中の転写開始部位および°３’−ＡＯＸＩ”ターミネータ−断片の位置 と向きと比較して、ウシリゾチームコード配列が正しい５’−３’の向きを有す るものである。

（実施例３） ＳＬ］２ＡによるＧ５１１５　のノ　・Ａ３７ヒスチジンを必要とする栄養要求 性株であるピキア・バストリスＧ５１１５株（（Ｈｉｓ４−）；フレラグ他、前 述）は、以前にヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（旧Ｓ４）に欠損があることが 決定され、ヒスチジン非要求性への復帰頻度が１０−　”以下であることが決定 されており、それをｐｓＬｌ　２Ａでの形質転換のための遺伝子発現宿主として 使用した。ピキア・バストリスＧ５１１５株はヒスチジンを添加した限定最少培 地中のメタノール上で効率よく高細胞密度で増殖し、単一細胞タンパク質産生を 目的とする宿主系として望ましい。該株は、細菌性レプリコン、抗生物質耐性遺 伝子、あるいはその他の潜在的な生物学的脅威と考えられるような異種配列を含 まない。

プラスミドｐｓＬＩ２Ａを制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ　ＩＩで消化し、得ら れたＤＮＡ断片混合液を全細胞ＬｉＣｌ酵母形質転換系によるピキア・バストリ スＧ５１１５株の形質転換に使用した。形質転換法の詳細は以下に示す。

Ｂｇｌ　ＩｔによるｐｓＬ１２Ａの消化の結果、上述のようにピキア・パストリ スＡＯＸＩ遺伝子の５′および３′領域と相同な末端を持つＤＮＡ断片が生じる 。この断片を旧ｓ４−ピキア・パストリス株に形質転換し、選択条件下で維持す ると（ヒスチジン非存在下で培養）、Ｂｇｌ　１１部位を末端に持つ発現カセッ トを含む断片（ＨＩＳ４遺伝子を含む）のＡＯＸＩ座に置換型挿入が起こる細胞 がある。この挿入により、ＡＯＸＩ遺伝子産物の欠損にってＭｕｔ”た（“メタ ノール代謝＋７−°の意味）で表される形質を有する細胞が生じるが、非主要ア ルコールオキシダーゼ遺伝子産物（ＡＯχ２）を保持するためメタノール上でも ゆっくりと増殖することができる。この一段階遺伝子置換法は異種遺伝子の染色 体への挿入を行い、プラスミドの不安定性、寄与、およずコピー数に関連した困 難を回避し、発現系の高信頼性を与える。この方法はまた、ピキア・バストリス のゲノムへ最少量の異種ＤＮＡの導入を行う。適当な挿入が行なわれた細胞はＨ ｉｓ’となり、メタノール上で増殖速度が遅くなることによってＡＯＸＩ座以外 の部位に挿入が起こった細胞と区別することができる。挿入が起こらなかった細 胞、あいは挿入がＡＯＸＩ座で起こらなかった細胞では、ＡＯＸＩ遺伝子は機能 を有しており、そのような細胞ではメタノール上で増殖能は損なわれない。

サツカロミセス゛セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｓ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）のための方法（伊藤他、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　４Ｂ ＝３４１（１９８４））を修飾した完全細胞塩化リチウム酵母形質転換法にって Ｇ５１１５へ直鎖状ＤＮＡ断片を導入した。該方法はスフェロプラストの作成お よび維持が不要なので、スフェロプラスト法よりも簡便で時間もかからない、し かしながら、再生寒天がソルビトールを含まずプレートが０．６Ｍのｋｃｌを含 んでいること以外はフレラグ（Ｃｒｅｇｇ）他、Ｍｏ］、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　５：３３７６（１９８５）に述べられたのと全（同様なスフェロプラスト 法は、ピキア・パストリス細胞の形質転換にも使用でき、多数の形質転換体が得 られるので推奨される。

ピキア・パストリスＧ５１１５株の５０雄振とうフラスコ培養液をνＰＤ（Ｌｏ ｇバクトー酵母抽出物、２０ｇバタトーベプトン、２０ｇデキストロース、２０ ．バクトー寒天、１０００ｄ　＠菌水）中、０Ｄｂｏ。

が約１．０（５ＸＩＯ’細胞／ｄ）となるまで３０″Ｃで振とう培養した。

集菌時の細胞密度は０．１から２．０００ｈ。。であればよい。細胞を一度１０ ｍの滅菌水で洗浄した後、約１５００　ｘ　ｇで３〜５分間遠心してペレットと し、同様の方法でもう一度ベレントにして１０ｇの滅菌ＴＥＩ衝液（１０ｍＭ　 ）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で１回洗浄した。細胞を２０ ｍの滅菌した塩化リチウム＋ＴＥ緩衝液（ｏ、ＩＭ　ＬｉＣ１，］Ｏａ＋Ｍ　ト リス−ＭＣＩ、　ｐＨ７，４，］ｓＭ　ＥＤＴＡ）に再懸濁し、３０°Ｃでとき どき振とうしながら１時間インキュベートした。

Ｈａｅ　ｍで消化した大腸菌キャリアＤＮＡ　１０ｘ、Ｂｇｌ　ＩＩで切断した プラスミドｐｓＬＩ２Ａ由来のｏＮＡ２ｇ、およびＬｉＣ１を含むＴＥ緩衝液中 のピキア・バストリスコンピテント細胞０．１ｄが入っている１２Ｘ７５ｍ滅菌 ポリプロピレンチューブを３０°Ｃのウォーターパス中で３０分間インキュベー トした。約０．１〜２０．のベクターＤＮＡを細胞の形質転換に使用することが できる。塩化リチウム＋ＴＥ緩衝液中４０χポリエチレングリコール（ＰＥＧ３ ３５０、フィッシャー・サイエンティフィンク社、ニューシャーシー州フェアロ ーン）を添加し、チューブを短時間ポルテックスにかけ、再度３０℃のウォータ ーバス中で３０分間インキュベートした。細胞を３７°Ｃで５分間ヒートショッ クにかけた後、混合液を遠心し、０．１ｄの滅菌水に再懸濁した。細胞を選択プ レー）（０，６７χ　酵母窒素ベース（アミノ酸非含有）、２χ　グルコース、 ２χ　寒天）上に広げ、３０℃で３日間インキュベートした。

Ｍｕｔ”の表現型の形質転換体を以下のように同定した：Ｒ３ｓ”形質転換体を 、単一細胞から生成したコロニーを得るためにブレーティングした。個々のコロ ニーを最少グルコース（２χ）マスタープレートに移した。３０℃で一晩インキ ユベートした後、マスタープレートを最少量グルコース（０，２２）プレートに レプリカブレーティングし、さらに３０°Ｃで一晩インキユベートした０次の日 に、低グルコース培地を最少メタノール（０，５χ）プレートにレプリカブレー ティングし、室温で２〜５日インキュベートした。目に見える増殖を示したコロ ニーをＭｕｔ”　と見なし、目に見える増殖をしなかったものをＭｕｔ”たと見 なした。

５ｄの滅菌水をプレートに加えてスプレッダ−で細胞を！！渇することにより寒 天プレート表面から形質転換体コロニーを回収し、高周波音分解後に細胞を懸濁 してブレーティングし、単一細胞コロニーを得た。ピキア・バストリス細胞は凝 集して増殖する傾向があるため、高周波音分解過程は該細胞の分離には必要であ る。

回収された２７６のＨｉｓ”形質転換体の約２０χがメタノール上でゆっくりと 増殖し、結果として上述のＭｕｔ”−表現型であることが示された。９個のＭｕ ｔ”−形質転換体のサザンプロット分析で同一のハイブリダイゼーションパター ンが示され、細胞中でＡＯＸＩ座中に予想された挿入が行なわれたことが確認さ れた。

これらのＡＯＸド形質転換体の一つである、Ａ３７と呼ばれるものを選んでさら なる解析を行なった。

７つのＭｕｔ”−株を１００ｄ振とうフラスコ培養液中で培養した。

このうち６個の株は正しい向きにリゾチーム遺伝子を含み、一つの株は逆向きに 該遺伝子を含んでいた。振とうフラスコ培養液はまず、０．６７χ酵母窒素ベー ス（ディフコ社、ミシガン州デトロイト）および２χ　グリセロールを唯一の炭 素源・エネルギー源として、３０°Ｃで約１口振とうしながら培養した。遠心し 、細胞ペレットを滅菌水で洗浄した後、グリセロールの代わりに０．５χ　メタ ノールを唯一の炭素源として含む培地に細胞を移した。振とうしながらの３０χ でのインキュベージ；ンを続け、メタノール中で１〜４日培養後に細胞を回収し た。

７個の）７ｕｔｏ／−株由来の細胞を滅菌濾過によって試料から分離したのち、 スロットプロット装置を用いて２００尾の各培養試料をニトロセルロースフィル ターに適用した。ウサギ！１１５６由来の１：２５００希釈の抗血清（実施例６ 参照）を用いて標準的なウェスタンプロット法によってこのニトロセルロースフ ィルターを処理した。

グリセロール上で培養後の株、メタノール上で１〜４日後の株由来の培地試料、 および精製標準ウシリゾチームＣ２を希釈したものを２００ｕＺ使用した後の、 ウエスタンスロットブロフトアッセイの結果は以下のようになった＝（１）　ウ シプレリゾチームｃ２断片を逆向きに挿入した細胞、およびグリセロール中で培 養した細胞は検出できるウシリゾチームの分泌は起こらなかった＝（２）ウシリ ゾチーム挿入断片を正しい向きでもち、メタノール上で培養した細胞は、培地中 に顕著な量のウシリゾチームＣ２を分泌した：　（３Ｈ２）で述べた細胞に関し て、メタノール中１日細胞培養を行なったものとメタノール中４日培養したもの の間では、培地中のリゾチーム濃度が１０倍以上高くなった（約１２５尾分泌物 ／ｄのりファームレベルが１日目に測定され、約１．２５■分泌物／ｄのリゾチ ームレベルは４日目に測定された）：（４）正しい向きにリゾチームをコードす る断片を有する株のうちで、分泌レベルに株間の多様性はほとんどなかった。

（実施例４） ピキア・バストミス　Ａ３７の　と゛　−スコ立　′　フ　−メン　−（゛への ス　−ルアーブとツーメン　−の７ 上述のように、グリセロール中で増殖している間はアルコールオキシダーゼプロ モーターからの転写は強く抑制されており、メタノール中で増殖すると転写が誘 導される。ファーメンタ−培養では、ＡＯＸＩ座に発現カセットを有する形質転 換体は単純な２段階の産生過程で増殖させる。第一の過程ではグリセロールを炭 素源として用いることにより、異種遺伝子の発現がない状態で細胞量を増大させ る。グリセロールが涸渇するとメタノールの供給を開始する。　ＡＯＸＩ欠損株 はメタノール上ではゆっくりと増殖し、世代時間は野生型株と比較してメタノー ル上で約１０倍となるので、最少の細胞分裂で３０〜２００時間もの長い産生相 がある。グルコースやグリセロールのような抑制性炭素源上で最初に発現宿主を 培養することによって、異種遺伝子発現に欠損のある変異体の選択を特に行なわ ずに、多量の細胞を生成することができる０次に、細胞に抑制性炭素源を涸渇さ せてメタノールを添加することによって、高レベルの異種遺伝子発現が開始され る。

Ｇ５１１５株Ａ３７からウシリゾチームｃ２を大量に産生させるために、２段階 高細胞密度バッチ発酵法を実施した。第一の過程、すなわち増殖過程では、Ａ３ ７を炭素源としてグリセロール含む限定最少培地で培養した。達成されるべき目 的の細胞密度は、培地中のグリセロール初濃度を調節することによって設置した 。

グリセロールの涸渇によて、望みの細胞密度で、メタノールを加えることにより 培養液を第二の過程すなわち産生過程へ移行させた。

）７−メンタ−培養液は以下のものからなる市販の分析用試薬で調製した無機塩 を基本とする培地中で培養した二基下の最終濃度の無機塩０．３０Ｍ　Ｈ３ＰＯ ４，４，２ｍＨＣａ５Ｏ−２Ｈｚ０．６５１１Ｍ　ＫｚＳ０４゜３８１１ＭＭｇ ＳＯａ、以下の最終濃度トレース塩　０．４ｕＭ　Ｃｕ５Ｏ−５Ｈｚ０゜２．５ ｕＭ　Ｋｌ、　９．ＯｕＭ　Ｍｎ５Ｏａ−ＨｔＯ＋　４．ＯｕＭ　ＮａｔＭｏｏ ａ−２１（ｚＯ，１，５ｕＦＩＨ３ＢＯｓ、　３５ｕＭ　ＺＺｎＳｏｎ−７Ｈｚ Ｏ９８９ｕ　ＰｅＣ１ｓ−６ＨｚＯ，２００Ｘストツクとして調製し、濾過滅菌 する：２■／ｄ　ビチオン；および、２リツトルの二ニー・ブルンスウィンク・ バイオフロー・ファーメンタ−には２χグリセロール、１５リツトルのパイオア ツイツチ・ファーメンタ−には６χグリセロール。ＮＨ３を添加してイノキュレ ーション前に培地のｐＨをｐ）１５．５に合わせ、発酵中もそのｐＨを維持した 。グリセロールが涸渇したら、メタノール添加を開始して、メタノール濃度を０ ．２χ〜０．１χの間に維持した。発酵中にトレース塩が栄養的に不測するのを 避けるために、培養液にトレース塩溶液を定期的にさらに補充した。

Ａ３７株の２リツトルおよび１５リツトル（実施体積は１リツトルおよび１０リ ツトル）発酵を数回行なった結果から、Ａ３７株は２１および１５２培養液中で メタノール上で５〜７日間培養した場合にウシリゾチームＣ２の高レベルでの産 生および分泌を維持できることが明確に示された。ファーメンタ−運転１１８２ では、ＯＤ＆。。−７６で無細胞発酵培地中でウシリゾチームＣ２レベルが約２ ００■７２であると測定された。別の場合には、細胞濃度をＯＤ＆。。＝１９５ までメタノール上で７日間培養したファーメンタ−運転１２０７由来の無細胞発 酵培地を実施例６で述べるようにラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）でアッセイし 、ウシリゾチームＣ２が２００■／Ｉ！であることが示された。ファーメンタ− で培養した培養液に関して測定された特異的産生性は、１００ｍ振とうフラスコ 培養液で培養したＡ３７細胞で観測された範囲内であった。したがって、２１あ るいは１５ｊ！ファーメンタ−まで規模を大きくすることによって細胞あたりの 産生性は損なわれなかった。

ファーメンタ−運転５１８２由来の培地の１２４ｄアリコートを濃酢酸でｐＨ− ４に合わせ、１００どのウォーターバスに３〜５分間置いた。　ＮＨ，ＯＨでｐ Ｈ＝５に合わせた後に、ウシリゾチームＣ２を陽イオン交換樹脂（ホワフトマン Ｃ）１−５２）を用いて、ドブメン（Ｄｏｂｓｏｎ）他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｗ、　２５９：１１６０７（１９８４）に記述されているように精製した： 　１２．５２変性ポリアクリルアミドゲルにより、少な（とも９５χの純度であ ることが示された。染色したゲルから、ウシリゾチームＣ２はファーメンタ−培 地中に存在するタンパク質の約５ｏｚを占め、他のいかなるタンパク質もウシリ ゾチームｃ２と比べると少量しか存在していないことが示された。さらに、組換 えウシリゾチームＣ２と天然ウシリゾチームＣ２は完全に一致して泳動されるこ とが示された。細胞抽出物の染色ゲルからは、ウシリゾチームｃ２に対応する明 確なバンドは見られなかった。

ファーメンタ−運転５１８２で培養したピキア・バストリスＡ３７から分泌され た組換えウシリゾチームｃ２の精製試料（２５０ｐｍｏｌｅ）を自動化されたＮ 末端配列分析機（アプライド・バイオシステムス社、　４７０Ａ、カリフォルニ ア州フォスターシティ−）を用いて分析した。１４サイクルで照合された配列は 、バンクグラウンドが非常に低く、部分精製されたウシリゾチームＣ２の８８％ 以上がシグナル配列と成熟タンパク質の間の接合部で正しくプロセスされたこと が明らかになった。組換え体の最初の１４アミノ酸は成熟酵素のすでに報告され ているタンパク質配列の最初の１４アミノ酸と同じであった。

Ａ３７株の１０１の発酵であるファーメンタ−運転５２５０由来の分泌されたウ シリゾチーム０２使用のラエムリゲルのウェスタンプロットの短時間怒光から、 正しい分子量を持つ単一の免疫反応性タンパク質が検出された。可溶性および不 溶性細胞画分中に、培地中よりもはるかに低い濃度であるが、標準試料と同一の 位置に移動する免疫反応性バンドが見られた。同じ大きさの位置に移動する物質 は、発現カセットを含まないコントロールのＡｏｘドた細胞からは見られなかっ た。ウシリゾチームＣ２分泌における抑制された細胞培養の効果を数回の別の運 転で試験した。

細胞増殖を制限するために、限定量（２，５ｄ／ｊ２．５ｄ＃２、および１０ｄ ／　ｆｆｉ　）のトレース塩を運転雲２３９、＄２４０　、および＃２４１でそ れぞれ使用した。培地中に分泌されたリゾチームのカーブは、細胞の増殖曲線と 平行になった。このデータから、ウシリゾチームｃ２の蓄積が健康な細胞増殖と 結びついていることが示された。

（実施例５） フ　−メン　−°　・のボ１アクｉルアミド°ルｍのえウシ１ゾチームＣ２の１ 　および 平行１５χポリアクリルアミドラエムリゲル（ラエムリ（Ｌａｅｍｓｌ　ｉ）、 Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０（１９７０）を実施した。１枚は銀染色で染め、 もう一方はイムノプロット処理をした。双方のゲルは、（１）　ウシ胃粘液から 精製されたウシリゾチームｃ２　：　（２）　実施例９のようにＡｏｘドリゾチ ームを分泌している株から精製したウシリゾチームｃ２　：　（３）　ピキア・ バストリス株Ａ３７（運転１１２５０）の１０４２ファーメンタ−運転の中間点 からとった細胞抽出液および培地を泳動した。培地試料では、３０８ｇ／細胞／ ｊ２の密度で、メタノール上で１１１．５時間培養した細胞を低速遠心過程でき れいにした。

細胞抽出液は、１０１　リン酸ナトリウム、ｐＨ７，５，５００＋ｅＭ塩化ナト リウム、０．１χ　トリトンＸ−１００および２＋Ｍフェニルメチルスルフォニ ルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む緩衝液中でグラスビーズを用いて細胞を破壊 することによって作成した。培地および細胞抽出試料に関しては、染色したゲル に流した細胞抽出液の量を加えた培地量の０．１倍と等量であった。イムノプロ ットのために、等量の細胞抽出液および０．１倍の培地を泳動した。イムノプロ ットのだめの抗血清を、実施例６に述べるように皺胃から精製したウシリゾチー ムに対するウサギ抗体を調製し、１：２５０００希釈で用いた。

天然ウシリゾチームｃ２と組換えウシリゾチームＣ２が一緒に泳動すること、ウ シリゾチームｃ２がファーメンタ−粗培地中のタンパク質の少なくとも５０χを 構成すること、およびリゾチームの分解産物は注目に値するほどの量は存在しな いことはゲルから明らかであった。

細胞抽出液および培地中のウシリゾチームｃ２の相対的な比は、細胞密度に基づ いて当量となる体積について行なったイムノプロットから見積ることができる。

これらのデータから分泌効率を計算することは不可能であるが、ファーメンタ− 中のウシリゾチームｃ２の一定の蓄積によって、実施例６に述べるようにこれら のデータおよびｌ？ＩＡによる濃度データから、細胞に産生されたウシリゾチー ムｃ２の５ｚ以下しか細胞内に残存していないことが示された。

（実施例６） ウシ１ゾ　−ムｃ２のイムノア・セイ ウシリゾチームｃ２はドブメン（Ｄｏｂｓｏｎ）他、上述の方法によって、凍結 したウシ皺胃組織から精製した。出発材料が、ドブメンらが使用した量の１５分 の１であったので、カラムの大きさおよび流速はそれにしたがって小さくした。

ドブメンらが報告したように、ホワットマンＣＭ５２のカラムクロマトグラフィ ー後に２８０尾ｍの吸光度によってウシ胃リゾチームＣ１、Ｃ２、およびＣ３に 対応する３つの独立のピークが確認された。

各々の３つのウシ胃リゾチームのピークは、実施例７で述べる分光光度測定アッ セイで測定したところりゾチーム活性を有し、約２ｍ１ｇのタンパク質を含んで いた。ウシリゾチームＣ２の純す 度は１５χポリアクリルアミドゲルによるポリアクセルアミドゲル電気泳動（ラ エムリ、上述）により、９５％以上であると見積られた。

全てのアッセイの結果は、ｌ　ＸＰＢＳに対して透析して一２０度で保存した精 製ウシリゾチームのアリコートを用いた定量に依存している。以下の結果に関し ては、標準は、１χ溶液について２８０尾ｍでの測定値の報告された吸光係数、 Ｅ−２８，２（ジョレス（Ｊｏｌｌｅｓ）他、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ 、　６３．１６５（１９８４））を用いて定量した。

ウシリゾチームＣ２に対してウサギに作らせた抗血清を標準的な方法で調製した 。略述すると、２羽の若い誰の白いニューシーラントラビットを、上述のように 精製して注射前にＰＢＳに対して透析したウシリゾチームｃ２２５Ｏｘずつで免 疫した。３０日後、１００尾のリゾチームｃ２でそれぞれのウサギを追加免疫し 、さらに１００尾のタンパク質で１０日後に追加免疫した。最初の免疫はフロイ ント完全アジュバント（ディフコ・ラブズ社、ミシガン州デトロイト）で乳剤化 したりゾチームＣ２で行なったが、追加免疫にはフロインド不完全アジュバント （ディフコ・ラプズ社、ミシガン州デトロイト）を使用した。ウサギの抗血清の 採取は最後の追加免疫から１週間後に行なった。

リン酸緩衝化生理食塩水中に異なる量の天然および変性精製ウシリゾチームｃ２ とウシ血清アルブミン（シグマ・ケミカル社、ミズーリ州セントルイス）を加え 、異なる希釈の抗血清とインキュベートしておいたニトロセルロースフィルター と結合させ、“スロット・プロット”装Ｗ（シュライヒャー・アンドシュニル社 、ニューハンプシャー州キーン）を用い、標準的なイムノプロット法（トウビン （丁ｏｗｂｉｎ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７６：４３５０（１９７９））を用いて、両方のウサギからの抗血清の 検定を行なった。フィルターの洗浄およびブロッキング、および抗体と＋　ｚｓ エニーロティンＡの希釈に用いた緩衝液は、ＩＸＰＢｓ（１４０Ｍｍ塩化ナトリ ウム、３Ｍｍ塩化カリウム、１０＋ｅＭ　リン酸二ナトリウム、２１１ＩＭ　リ ン酸−カリウム、ｐＨ７，２）、０．２５χゼラチン（バイオ−ラッド社、カリ フォルニア州すッチモンド）　、Ｏ，ＯＳｚトウエーン−２０（シグマ・ケミカ ル社、ミズーリ州セントルイス）、および０．０２χアジ化ナトリウム（シグマ ・ケミカル社、ミズーリ州セントルイス）からなる。＄１１５６と呼ぶ、１羽の ウサギ由来の血清は、ウシ血清アルブミンとの交差反応性が実質的に低かったの で、これを選択した。ウサギ！１１５６由来の血清を１：　２５００＠釈で用い て、標準のリゾチーム２．５ｎｇがスロットプロットで容易に検出でき、２５ｎ ｇでは非常に強いシグナルが得られた。

ＲＩＡでトレーサーとして用いるための、リゾチームの放射性ヨウ素化は、ＴＯ ＤＯＢＥＡＤ”法で行なった。略述すると、ｌ　ｍｃｉＮａ”Ｊ　（二ニー・イ ングランド・ユニクリアー、マサチューセッツ州ボストン）　、５０ｐＺ中の５ ０ｐｇ精製リゾチームｃ２．１０ｐ！の０．５Ｈリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７，３を含む反応混合液に一つのヨードビーズ（ピアス・ケミカル社、イリノイ 州ロックビル）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。続いて、反応バイ アルの内容物をあらかじめ充填しておいたＧ−２５脱塩カラム（ＰＤ−移し、ｏ 、ｏｓｚの結晶ウシ血清アルブミンを含む５０ｄのｏ、　ｏｓｒ　リン酸ナトリ ウム緩衝液、ｐＨ７，３で溶出した。各画分をマイクロメゾイック・ガンマ・カ ウンターでカウントし、１２″′１−リゾチームの位置を決定した。　１０χト リクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈澱させることにより、ヨウ素化産物の調製を検定し 、完全なペプチドの割合を見積った。典型的には、ＲＩＡで使用した１ｔｓ■− リゾチームｉＭＩＭ物ハ９８２以上ＴｃＡａ″Ｒテアツタ。

ＲＩＡによってピキア・パストリス培養液試料中のウシリゾチームｃ２濃度を決 定したが、ＲＩＡの実施は、様々な量の標準試料あるいは未知試料と、１　：２ ５０００最紡希釈したウサギ抗リゾチーム抗体、１００００〜２００００カウン トのｌ２ｓＩ−リゾチームとを最終体ｍ５００ｐｌ　ｆ）　７７　セイｌｌ＆Ｈ （５ｏｌ１Ｍ　’）　ン酸ナトリウム、Ｑ、　ＩＭＮａｃｌ、２５ｍＭ　ＥＤＴ Ａ　、　０．１χ　アジ化ナトリウム、０．１χ　ウシ血清アルブミン（画分Ｖ ）　、０．１！　）　！Ｊ　）　７Ｘ−１００５ｐＨ７，４）中チー（ンキュベ ートすることを含む標準的な方法で行なった。４℃で一晩のインキュベーション に続いて、プロティ刀でコートしたＳ、アウレウス細胞の１：４０希釈パンソル ビン３厘）（カルバイオケ五社、カリフォルニア州すンディエゴ）＠濁液１００ ｐ／を加えて室温で１５分間インキュベートした。２ｍの氷冷した洗浄緩衝Ｗｌ 　（０，９！　ＮａＣ］、　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１！　）　！Ｊ　）　： ／Ｘ−１００）を添加後、チューブを２３６０　Ｘ　ｇで６０分間遠心した。上 滑を検温し、ベレットの′！ＳＩ−リゾチームをカウントした０以上の条件下で 、参照チューブ内のベレット中に全１　ｆｓｌ−リゾチームの約５０１が回収さ れ、非特異的結合チューブ、すなわち過剰の標識をしていないリゾチームの存在 下では１０％が回収された。このアッセイの感度範囲は、約２ｎｇのＥＤＳ。で ０−２〜２Ｏｒ＋ｇであった。未知試料は３種類の希釈で、それぞれ２重に検定 した。

（実施例７） ジ、れた　シ１ゾチームｃ２のバイオアーセイマイクロコツカス・ルテウス（Ｍ ｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）細胞は、シグマ・ケミカル社、ミズーリ 州セントルイスから入手した。

分泌されたウシリゾチームｃ２の住物活性を分析するために、２種類のバイオア ッセイ（分光光度測定アッセイおよびハローアッセイ）を行なった（グロスライ フッ（Ｇｒｏｓｓｗｉｃｚ）他、Ｍｅｔｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａｎａｌｙｓ、　２９：４３５（１９８３））。それぞれア ッセイは、リゾチームがマイクロコツカス・ルテウス細胞を溶菌させる能力を測 定するものである。活性アッセイは酵素の最適９Ｈの違いにより、卵白リゾチー ムで標準のｐＨ７，０ではなく、ｐｎｓ、ｏで行なった。

ハローアッセイは、寒天培地上でマイクロコツカス・ルテウス細胞の溶菌のハロ ーを生じさせるｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイである。

ハローアッセイを用いて、１χ寒天および０．１？＋　リン酸緩衝液、ｐｎｓ、 ｏ中１．２ｇ／ｄ乾燥本ルテウス細胞から成る寒天プレート上にあけた２ｍＩ！ の孔に１０ｐ！の試料を添加した。試料は、粗培地、培地から精製したりゾチー ム、あるいは標準リゾチームを使用することができる。生じたハローの直径を室 温で１６時間インキュベートした後に測定し、標準リゾチーム（ウシ皺胃から精 製したウシリゾチームｃ２）を用いて測定した量に対してハローの直径を片対数 プロットで比較することによって定量した。プロットは１１００ｎから１０尾ま で直線であった。検定の感度の下限は約５０ｎｇで、この検定法を用いて、検出 可能な最低濃度は５ｍｇ／　ｆの精製ウシリゾチームｃ２である。

もう１つの検定法すなわち、乾燥肌ルテウス細胞のｉｎ　ｖｉｔｒ。

溶菌を測定する分光光度測定では、異なる量の精製リゾチームを緩衝化したン、 ルテウス細胞懸濁液に加えた。試料を０．１Ｍ　リン酸緩衝液、ｐａｓ、ｏ中の 乾燥マイクロコツカス・ルテウス細胞の０．３ｍｇ／ｗｌ懸濁液に添加した。細 胞の溶菌は、２分間、１５秒ごとに４５０ｎｙａの吸光度の減少を記録すること によって追跡した。

直線の勾配は直線回帰によって計算し、この勾配を、精製した標準濃度に対する 勾配をプロットした直線と比較することによって定量した０分光光度測定アッセ イで検出可能な最低濃度は５ｍｇ／　ｌであった。

（実施例日） ＳＬ１２ＡによるＧ５１５　のン　−：ＬＩＬｌと呼ばれるＡｏｘｌ’　、旧Ｓ ゛株は、ＡＯＸ’細胞中でＡＯＸＩプロモーターから発現されるウシリゾチーム ｃ２が単一コピー挿入された株で、実施例３で述べたように、旧５４座位に挿入 させるためにＳａｌ　Ｊ部位で切断した（ピキア・バストリスＨＩＳ４遺伝子領 域中で切断する）　ｐｓＬ１２ＡでＧ５１１５細胞を形質転換して得られたもの である。

細胞は、０．２χ　グリセロールおよび１．０１　メタノールを含む１００ｗＭ リン酸ナトリウムで緩衝化した最少″培地中で４〜５０Ｄ、。。

ユニット／ｄの濃度まで４〜５日間振どうフラスコで培養した。

細胞から蓄積したウシリゾチームｃ２の最終レベルは、０．２４〜０．５６■／ ｌであった（ＲＩＡによって決定）。

単一細胞タンパク質産生実験から、アルコールオキシダーゼの発現が希釈率に強 く依存していることは知られている。定常状態で、希釈率（Ｄ）は、等式Ｄ＝Ｄ −６９／ｌｂにより世代時間（ｔｄ）に直接依存している。

増殖速度が制御できる、Ｌｌで行なった連続発酵における希釈率実験から、発現 レベルは増殖速度に依存していることが示された。

運転＃２５５からのデータでは、１リットルファーメンタ−中で３ｓＩＭｅＯＨ を供給して行なわれたメタノール制限連続発酵で、希釈率は０．１ｈ−’から０ ．０４ｈ−’の間であり（それぞれｔｄ＝６．９および１７．２５時間毎世代） 、Ｌ１株由来のウシリゾチームｃ２の特異的産生性（産物量／細胞／時間）に希 釈率が顕著な影響を与えることが示された。各希釈の３つのファーメンタ一体積 から採取した３つの試料について、定常状態の値を決定するためにアッセイを行 なった。０．０６５ｈ−’の希釈率、すなわち世代時間１０．６時間でみられた 最大特異的産生性２０ｔｒｇ／ｇ湿潤細胞／時間は、ＡＯＸＩ−’株であるＡ３ ７の７■／ｇ／湿潤細胞／時間よりもはるかに高い。

希釈率実験の際に、６００時間の連続培養後、ファーメンタ−中のウシリゾチー ムｃ２濃度が顕著に減少した。最初の５５０時間の間には、ウシリゾチームｃ２ 産生は希釈率の係数として変化した。　５５０　、６４３　、および７１７時間 後にファーメンタ−から採取した細胞試料から抽出したＤＮＡのサザンプロット 分析から、後半の二つの時点では注目に値する割合のファーメンタ−中の細胞の 制限酵素地図が変化していることが明らかになった。変化は、ウシリゾチームｃ ２をコードする配列およびアルコールオキシダーゼプロモーターを含むＤＮＡ断 片中の約３００ｂｐの欠失であった。欠失を含む新しい断片は６４３時間までに ファーメンタ−中の細胞の約５０χに存在し、７１７時間までには約９０２の細 胞に見られるようになった。

（実施例９） ＳＬ　ＡにトるＧＳ　５の乏　−：Ｃ６Ｃ６と名づけられたＡｏｘド、旧ｓ４” 株は、ＡＯＸＩプロモーターがらウシリゾチームｃ２を発現する異種遺伝子が単 一コピー挿入された株であり、実施例３で述べたように、プロモーターの上流（ プロモーターからの転写の方向にしたがって）の、図中に示した５’ＡＯＸ１領 域中のＳｓｔ　Ｉ　（あるいは同じ切断部位の５ａｃｌ）で切断したｐｓＬ１２ ＡでＧ５１１５細胞を形質転換して得られたものである。形質転換体のうちある ものはＡＯＸＩプロモーターの５′側のＡＯＸＩ座位ニｐＳＬ１２Ａが挿入され た。

細胞は、０．２χ　グリセロールおよび１．０χ　メタノールを含む１００＋ｓ Ｍリン酸ナトリウムで緩衝化した最少培地中で４〜５００．、。

ユニット／Ｉｄの濃度まで４〜５日間振とうフラスコで培養した。

細胞から蓄積したウシリゾチームｃ２の最終レベルは、０．２４〜０．４２■／ ｌであった。

（実施例１０） 太ｌ■製抜工Ｕ銖 大量産生用に通用し得る精製法を、運転目５３において、Ｌ１株から分泌された 組換えウシリゾチームｃ２の精製に使用した。

運転＃２５３の発酵培地８０リツトルから細胞をセラフロー・カートリフジ（１ ミクロン、アミコン社、マサチューセッツ州デンバー）を用いて除去し、得られ た濾過液（８０リツトル）を３．０００分子量カットオフらせん状カートリッジ （アミコン社）で濃縮した。濃縮液を滅菌水で透過させて伝道性を４ｍＳ以下に した。

２．５リツトルの透過液を、あらかじめ５０１　酢酸ナトリウム、ｐＨ５，８で 平衡化しておいたゼータクロム（ＺｅｔａＣｒｏｍ）ＳＰ−１００カプセル（ウ ェスタン・アナリティカル社、カタフォルニア州テメクラ）上に流速１５■／分 で注入した。注入が完了した後、カプセルを平衡緩衝液で洗浄し、１リツトルの ５０ｍＭ　酢酸ナトリウム、ｐＨ５，８と１リツトルの３０ｈＭ酢酸ナトリウム 、ｐＨ８，０から成る直線勾配でウシリゾチームｃ２を溶出した。ピークの初め の３分の１で溶出されたウシリゾチームＣ２は、ＳＯＳゲル電気泳動および高圧 液体クロマトグラフィー（）ＩＰＬＣ）で検定した結果、混入タンパク質が少１ （１５％以下）しか含まれていなかった。５Ｐ−１００カプセルへの結合、洗浄 、および溶出を繰り返すことによってこの混入物を除去した。）ＩＰＬＣ分析は 、μボンダパック（μｂｏｎｄａｐａｋ）　Ｃ−１８カラム（ウォーターズ・ア ソシエイツ社、マサチューセッツ州ミルフォード）を用い、水層トリフルオロ酢 酸中のア七ト二トリル勾配によって行なった。このＨＰＬＣ法は発酵および精製 法の際のりゾチームの定量にも使用した。リゾチーム活性は実施例７に記載した 分光高度測定アッセイによって決定した。

１ユニツトは、２５°Ｃで１分あたり０Ｄ４ｓｅの１χ変化として定義した。タ ンパク質濃度は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱後のローリ−（Ｌｏｗｒｙ）他 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１９３：２６５（１９５１）による方法、あ るいはノルロイシンを内的水準として用いて定量的アミノ酸分析によって決定し た。

以上の３段階法を用いて、ピキア・バストリスに分泌されたウシリゾチームｃ２ をほぼ均質に精製することができる。無細胞培地からの酸素の総収量は、粗培地 中で測定された初めのりゾチーム量の約６０χであり、スルフォブロビルディス クで不純画分のクロマトグラフィーを再度行なうと７５χまで上がる。ＳＤＳ電 気泳動および）ＩＰＬｃで判断すると、純度は９０％以上である。

（実施例］１） ブースミドＢＬＩＩおよび５Ｌ１２ＡによるＰＰＦＩ　のノ　−　：Ｃ５ＢＬＩ 　およびＣ３ＢＬ３ ＰＰＦＩ（Ｈｆｓ４−　、Ａｒｇ４−　）株のピキア・バストリス細胞を、実施 例３に記載した方法で、ｐＢＬｌｌと呼ばれる切断していないプラスミドで形質 転換した。Ｃ５ＢＬＩＩと呼ばれる、ＡＯＸド、Ａｒｇ”となった形質転換体を 選択して以下の操作に使用した。

第３図に示したプラスミドｐＢＬ１１は、プラスミドｐｓＬ１２Ａと僚ているが 、ピキア・バストリスＨＩＳ４遺伝子を含むＢｇｌ　１１部位を末端とする断片 の代わりにｐｓＬ１２ＡのｐＢＲ３２２Ｂａ爾Ｈ１部位にクローニングされたＳ 、セレビシェのＡＲＧ４遺伝子を含むＨｐａ　１部位を末端とする断片を選択の ために有する点が唯−異なっている。

Ｓ、セレビシェＡＲＧ４遺伝子はＰ、バストリスでも機能する。

ｐＢＬｌｌ上の５’−ＡＯＸＩ配列は、いくつかの形質転換体でＡＯＸＩ座位の ５′末端に環状の挿入が行なわれた。形質転換体はまずＡｒｇ’の表現型で選択 した。　Ａｒｇ”　、Ａｏｘｌ’形質転換体は、サザンハイブリダイゼーション により該プラスミドがＡＯ×１座位の５′末端に挿入されていることを確認した 。

５ＢＬＩＩ細胞を切断していないｐｓＬ１２Ａ　ＤＮＡで再度形質転換した。

Ｈｉｓ−形質転換体を選択し、サザンハイブリダイゼーションでスクリーニング した。形質転換体はウシプレリゾチームｃ２、ＡＯＸＩプロモーターに依存する 発現カセットの２コピ一挿入体であった。２コピ一挿入体のゲノム中のｐｓＬ１ ２Ａの位置は、旧Ｓ４あるいはＡＯＸｌ座位ではないが、明らかになっていない 、　Ｃ５ＢＬ３と呼ばれる、一つのＡｏｘｌ’　、）ｌｉｓ’　、Ａｒｇ”形質 転換体を選択し、さらなる研究に使用した。

Ｃ３ＢＬａ株を用いたファーメンタ−運転（運転＄２７４）により、希釈率０． ０８ｈ−’で３３ｔｒｇ／ｇ湿潤細胞／時間、および希釈率０．０６ｈ−１で２ ８ｇ／ｇ湿潤細胞／時間の特異的産生性が得られた。

天然リゾチームＣおよび組換えリゾチームＣは、同一のアッセイを用いて平行し て検定すると、同等の生物活性を有することが見いだされた。

（実施例１２） ヒト１ゾチーム　ベク　−ＨＬＺ１０３のｐＨＬＺｌｏｏと名づけたプラスミド を標準的な方法で調製した。

ヨーロッパ特許出願出版番号０２２２３６６およびカスタノン（Ｃａｓ　ｔａｎ ｏｎ）他、Ｇｅｎｅ　６６、２２３−２３４（１９８８）参照、プラスミドｐ） ＩＬＺｌｏｏは、ｐＬｌｃ９　（ビエイラ（ν１ｅｉｒａ）およびメッシング（ Ｍｅｓｓｉｎｇ）、Ｇｅｎｅ　１９．２５９（１９８２））　、およびそのＳａ ｌ　Ｉと旧ｎｄＩ［１部位の間の、胎盤由来のヒトプレリゾチームＣのシグナル ペプチドのＮ末端の４アミノ酸を除く全配列及び翻訳停止シグナルをコードする ４３５塩基対からなる挿入断片から構成される。このプレリゾチームＣに対応す る成熟リゾチームＣはヒト乳リゾチームと同一のアミノ酸配列を有する。ジョレ ス（Ｊｏｕｌｅｓ）とジョレス、（１９８４）上述、参照． サンガージデオキシ法を用いて、この４３５ｂｐ断片の塩基配列が以下に示した ものであることが明らかになった：５’−ＡＴＴＧ丁丁ＣＴＧＧＧＧＣＴ丁ＧＴ ＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴＡＣＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＴＴＴＧＡ ＡＡＧＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＴ丁ＧＧＧ ＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＡＧＣＣ丁ＡＧＣＡＡＡＣＴＧ ＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＧＣＣＡＡＡ丁ＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＴ丁ＡＣＡＡＣＡＣ ＡＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＡＡ丁ＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＣ ＴＧＡ丁ＴＡＴＧＧＧＡＴＡＴＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＣＣＧＣＴＡＣＴＧ ＧＴＧＴＡＡＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＴＧＣ ＣＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧ丁ＧＣＴＴＴＧＣτＧＣＡＡＧＡＴＡＡ ＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＧＴＴＧＴ ＣＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧ ＧＡＧＡＡＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＧＡＴＧ丁ＣＣＧＴＣＡＧＴＡ ＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴＴＡＡ上記３′側３９３塩基対に遺 伝子コードを単純に当てはめることにより、１３０アミノ酸の成熟リゾチームＣ のアミノ酸配列を演鐸することができ、上記配列を持つＤＮＡはそれに対応する プレリゾチームＣのＮ末端■アミノ酸を除く全アミノ酸をコードしている。以下 に記載するｐＨＬＺ１０２を調製するためのｐＨＬＺ１０１の部位特異的ミュー タジェネシスに示されるように、゛ブレリゾチームＣのＮ末端の４つのアミノ酸 の配列はＭＫＡＬであり、それに対応する１４４カルボキシ末端のアミノ酸をコ ードするヌクレオチド配列および翻訳停止コドンは上に示されている．塩基配狗 が上に示されている４３５ｂＰ断片は、ヒト組織球腫瘍細胞系ｔｌ−９３７　（ スンドストローム（Ｓｕｎｄｓｔｒｏａ＋）とエルシン（Ｎｊｌｓｓｏｎ）、Ｔ ｎｔｌ．　Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　１１７，　５６５−５７７（１９７６））から単 離されたｍＲＮＡで調製したヒトプレリゾチームＣの、シグナルベブチドのＮ末 端４アミノ酸を除く全てをコードする４３５ｂｐのｃＤＮＡと、２塩基対の違い 以外は同じ配列を有する．プレリゾチームＣをコードするｃＤＮＡヌクレオチド 配列の２塩基の違いはアミノ酸配列を変化させないので、胎盤由来のブレリゾチ ームＣのアミノ酸配列と細胞系Ｕ−９３７由来のアミノ酸配列は同一である（カ スタノン（Ｃａｓ　ｔａｎｏｎ）他、Ｇｅｎｅ　６６．　２２３−２３４（１９ ８８））　．ヌクレオチド配列中の２塩基相違の位置は、上記配列の下線で示す ，　Ｕ−９３７細胞系由来ｃＤＮＡでは、シグナルペプチド中の−３位のＶａｌ をコードする上記配列中のＧＴＣのうちＣの代わりにＴになっており、シグナル ペプチド中の−２位のＧｉｎをコードする上記配列中のＣＡＧのうちＧの代わり にＡになっている．ｐＨＬＺ１００では、上記配列に示された４３５ｂｐの５′ 末端断片とＳａ１１部位である５’　−ＧＴＣＧＡＣ−　３’との間に５’−Ｃ ＴＧＣＡ　｛Ｃ｝　−３’という配列を含む断片があり、それにおいて５’　− ＣＴＧＣＡ−　３’はｐｔｌｃ９のＰｓｔ■部位の残りであり、｛Ｃ｝は、ｐＨ ＬＺ１００を作成するために４３５ｂｐ断片を含むボリｂｃテイルを付加したｃ ＤＮＡを連結した、ボリｄＣテイルを付加したＰｓｔ　Ｉ消化ｐＵｃ９のボリｄ Ｃテイルに由来するボｌＪｄｃストレッチ（長さ不明）を表す．さらに、ｐ｝Ｉ ＬＺＩＯＯには、上記配列に示した４３５ｂｐの３′末端と｝ｌｉｎｄ　ｎ［部 位である５’　−ＡＡＧＣＴＴ−３′の間に、５′−Ｃ丁ＣＣＡＧＡＡＴＴＴ丁 ｛Ｃ｝　ＴＧＣＡＧＣＣ−３’という配列を含む断片があり、該配列中の｛Ｃ｝ は、少なくとも一つにはｐＨＬＺ１００を作成するためにポリｄＣテイルを付加 したｐＬＩｃ９に該ｃＤＮＡを連結す之前に４３５ｂｐ断片を含むｃＤＮＡのボ リｄＧテイル付加によるものであり、また一つの可能性としてはボリｄＧテイル 付加の前に該ｃＤＮＡの３′末端の一つ以上のｄＧストレンチに由来するもので あるｄＣストレンチを表す：　５’−ＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＴ−３’は、ｐＨ ＬＺ１００作成に使用するｃＤＮＡ合成の基となったりゾチームをコードするａ ＋ＲＮＡ中の翻訳停止コドン後の最初の１２塩基の非翻訳リボヌクレオチドに対 応する：そして５′一τＧＣＡ−３’は、（　ｔ　）ｐＬ！Ｃ９の旧Ｉｌ１ｄｍ 部位の直前の５’−ＧＣＣ−３’および（　ｉｉ　）ｐＨＬＺ１００作成の際に 、ボリｄＣテイルを付加したＰｓｔ　Ｉ消化ｐＵｃ９の３′末端にアニーリング させたボリｄＧテイルを付加したｃＤＮＡの間のギャップのフイルインから生じ た５’　−ＴＧＣＡ−　３’に対応する．約１ｎＨのＨＬＺ−１００で大腸菌Ｍ Ｃ１０６１株を形質転換した．形質転換体はアンビシリン耐性によって同定した ．ブラスミドを形質転換体から調製し、販売元の指示にしたがってＢａＩＩＨ　 Ｉと旧ｎｄｌｎで消化した．正しいブラスミドは約２７５０ｂｐ　（ｐＵＣ９の 旧ｎｄ　ｍ　−ＢａｗｌＩ断片）と約５４０ｂｐ　（上記４３５ｂｐ断片を含む ＢａｍＨ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ｍ断片）のパターンによって同定した． 上記の４３５ｂｐ断片の５′末端に必要な１２ヌクレオチドを付加してプレリゾ チームＣの最初の４つのアミノ酸をコードするようにし、翻訳開始をコードする ＡＴＧとシグナルベブチドの最初のアミノ酸の直前と、翻訳停止コドンをコード するＴＡＡの直後にＥｃｏＲ　Ｉ末端を付加するために、ｐＨＬＺ１００中のＳ ａｌ　１一旧ｎｄ　ｍ部位に結合したヒトプレリゾチームＣ挿入断片をＭ１．３ Ｆｐｌ８に挿入■とＳａｌ　１で消化し、ホスファターゼ処理した。同様に、ｐ ｝ＩＬＺ１００の旧ｎｄｌＩＩ／Ｓａｌ　Ｉ消化を行い、１．０χアガロースゲ ルからプレリゾチームＣを部分的にコードする４３５ｂｐの断片を含む約５３０ ｂｐ断片を単離した．ベクター７５０ｎｇと断片２５０ｎｇを標準的な連結反応 で連結し、連結反応混合液を大腸菌ＪＭ１０３細胞の形質転換に使用した。白い ブラークを選択し、ブラスミドをそれから単離した．プラスミドのＢｉｎｄ　ｍ 　／　Ｓａｌ　Ｉ消化により、７２４０ｂｐと５３０ｂｐの断片が得られ、正し いブラスミドであることが示唆された． 次ぎに、＋１１３■ｐ１８の挿入断片の３′末端の翻訳停止をコードするＴＡＡ 　｝リプレットの直後にＥｃｏＲ　１部位を付加する修飾を行なった。これを行 なうために、ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）とスミス（Ｓｍｉ　ｔｈ）、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１００，　４６８（１９８３）の方法により 、次の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的ミュータジエネシスを 行なった： ５’　−ＧＣＣ　ＡＧτ　ＧＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　Ｔ丁Ｃ　ＴＴＡ　 ＣＡＣ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＡＣＣブラークは次の配列を持つスクリーニング用オ リゴヌクレオドドでスクリーニングした： ５’−ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴτＣ　ＴＴＡ　ＣＡＣそして、ポジティブな ものについて鋳型のミニプレツブを行なった．大腸菌ＪＭ１０３株をミニブレッ プ由来の３′末端を修飾した鋳型で形質転換し、ブラークを同じスクリーニング 用オリゴヌクレオチドで再度スクリーニングした．二次スクリーニングでボジテ ィプだったものを塩基配列決定用の鋳型作成に使用した．以下の配列を持つユニ バーサルブライマーを用いてサンガーのジデオキシ法によって塩基配列を決定し た：５′−Ｇ丁＾　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＣＣＡ　ＧＴ−目的の修飾を有す るプレリゾチームをコードする断片の３′末端を持つブラスミド（ｉ１３■ｐ１ ８のＲＦ型）を同定し、ｐＨＬＺ１０１と命名した． ｐＨＬＺ］ｏ１中の４３５ｂｐのプレリゾチームをコードする断片の５′末端を 、３′末端の場合と同様の部位特異的ミュータジエネシス法で修飾したが、ミュ ータジエネシス用オリゴヌクレオチドは以下の配列のものを用い、 ５’　−ＡＡＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＡＡＣＡＡＴ　ＧＡＧ　ＡＧＣＣＴ丁ＣＡ丁　 ＧＡＡ　ＴＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＧＡスクリーニング用オリゴヌ クレオチドは以下のものを用いた：５’−ＧＡＧ　ＡＧＣＣＴＴ　ＣＡＴ　ＧＡ Ａ　ＴＴＣ。

ユニバーサルブライマーおよび ５’　−ＣＴＣＡＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＣＡＡＡ　ＧＡＣおよび５’−ＡＴＡ　Ａ ＴＣＡＧＴ　ＣＣＴ　丁ＣＴ　ＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＴ　ＧＴＡの二つのプラ イマーを用いてサンガージデオキシ法で塩基配列を決定し、目的の修飾されたプ レリゾチームＣをコードする断片を持つものとし、プラスミドを同定した。該プ ラスミドをｐ）ＩＬＺ１０２と命名した。

プラスミドｐＨＬＺ１０２（Ｍ１３ｍｐ１８のＲＦ型）をＣｓＣ１勾配を用いて 分離した。

ピキア・バストリス発現ベクターを構築するために、約４５０ｂｐの、プレリゾ チームＣをコードするＥｃｏＲＩを末端に持つ断片を、ＥｃｏＲＴ消化によって ｐＨＬＺ１０２から除去し、１．２χアガロースゲルで分離した。つぎに、プラ スミドｐＡＯ８０４をＥｃｏＲＴで消化し、末端をホスファターゼ処理した。消 化してホスファターゼ処理したｐＡ０８０４を２５ｎｇと、プレリゾチームＣを コードする断片２５０ｎｇを標準的な連結反応で連結し、連結混合液を大腸菌Ｍ Ｃ１０６１株の形質転換に使用した。形質転換体をアンピシリン耐性によって選 択し、形質転換体からのプラスミドのミニブレツブ、ミニブレツブしたＤＮＡの Ｐｓｔ　Ｉ消化および、消化したプラスミドＤＮＡ断片サイズの解析によって正 しい構造を持つプラスミドを含む形質転換体を同定した。　ＡＯＸＩプロモータ ーからの転写の向きに対して正しい向きでプレリゾチームをコードする断片が挿 入されているプラスミドは、約ｚｉｏｏｂｐの長さのＰｓｔ　Ｉ断片を持つ二Ａ ＯＸＩプロモーターからの転写の向きに対して正しくない向きにプレリゾチーム をコードする断片が挿入されているプラスミドは１９６０ｂｐの長さのＰｓｔ　 Ｉ断片を有するはずである。正しい構造を持つプラスミドを同定し、ｐ）ＩＬＺ １０３と命名した。

（実施例１３） ヒト１ゾチーム　るピキア・バスト１スブラスミドｐＢＬＺ１０３をＣｓＣ１勾 配で精製した。

５■のｐ）ＩＬＺ１０３のＳａｃ　Ｉ消化産物をスフェロプラスト形質転換法（ フレラグ＜ｃｒｅｇｇ）他、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　５．２２７６− ３３８５（１９８５））を用いてピキア・バストリスＧ５１１５株（ＡＴＣＣ１ ２０８６４）を形質転換した。（Ｓａｃ　１はＳｓｔ　Ｉのイソシゾマーである ）。

Ｈｉｓ’　Ｍｕｔ　’細胞を同定し、いくつかの形質転換のＤＮＡをサザンブロ ットハイブリダイゼーション分析によって解析した。　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消 化し、プラスミドｐＡＯ８０３のＤＮＡをプローブとした。

野生型の５７００ｂｐ断片の消失と、２０００ｂｐおよび１１２００ｂｐの断片 によって、形質転換体中で、形質転換体のＭｕｔ”を残して、ＡＯＸＩコード配 列の５′側のＡＯＸＩ座位への付加によって挿入されていることが示唆された。

このような形質転換体をさらなる研究のために選択し、Ｇ＋ＨＬＺ１０３Ｓと名 付けた。

Ｍｕｔ”ヒトリゾチーム発現株を作成するために、プラスミドＰＨＬＺ１０３を Ｂｇｌ　ＩＴで消化し、断片５■をスフェロプラスト法によってＧ５１１５細胞 に形質転換した。旧Ｓ゛細胞を同定し、そのＭｕｔ表現型についてスクリーニン グした。

Ｍｕｔ表現型のスクリーニングは、ＨＳｓ”形質転換体を最少グリセロール（２ χ）マスタープレート上にブレーティングして単一細胞から生じたコロニーを得 ることによって行なった。３０℃で２日インキュベーションしたのち、最少グＩ Ｊセロールプレートおよび、炭素源を含まずメタノールを気相で加えたプレート にマスターをレプリカした。メタノール添加は、プレートを保持するベトリ皿の 蓋の上面の内側に約２００ｐ１のメタノールを滴下することによっておこなった 。気相に毎日メタノールを添加しなからプレートトを３０°Ｃで２日間インキュ ベートした。目で見える増殖を示したコロニーをＭｕｔ”　とみなし、目で見え る増殖をしなかったものをＭｕｔ”とした。

Ｍｕｔ”形質転換体をサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって解析 した。すなわち、形質転換体のＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＡＯ ８０３のＤＮＡをプローブとして用いた。

２０００ｂｐと５１００ｂｐの断片（および野生型の５７００ｂｐ断片の消失） により、ＡＯＸＩ座位の遺伝子破壊による発現カセットの挿入が示唆された。Ｍ ｕｔ”−形質転換体の一つを選択してさらに研究を進め、これをＧ−ＨＬＺ１０ ３Ｓと名付けた。

（実施例１４） 丁ソ゛チーム　゛、′るＰ　バスト】ス　の立　のための１の抜 本実施例で述べる方法は、ウシリゾチームＣ２を分泌するＰ、バストリスＡ３７ 株（Ｍｕｔ”）およびＬ１株（Ｐｌｕｔ’）で有効に用いられた０本方法はヒト リゾチームを産生するＰ、バストリスＧ−ＨＬＺ１０３５株およびＧ＋ＨＬＺ１ ０３Ｓ株にも適用される。

様々な株を、アミノ酸非含有酵母窒素ベース（ＶＮＢ）　（ディフコ・ラボラト リーズ社、米国ミシガン州デトロイト）÷２χグルコース寒天プレート上で１力 月ごとに植え継いで維持した。本実施例で示した方法のための接種材料は、アミ ノ酸非含有ＶＮＢ＋２χグルコース＋リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中で２０Ｏｒ ｐｍで振とうしなから３０°Ｃで一晩培養した。

１、　ファーメンタ−運転開始と一般的操作２２５　ｍの１０×基本的塩類（４ ２ｄ＃　８５％リン酸、１．８ｇ／　ｆ硫酸カルシウム−２Ｈ２０，２８，６ｇ ／ｆ　ｆＬ酸カリウム、２３．４ｇ／ｌ硫酸マグネシウムー７ＨｇＯ，６，５ｇ ／　ｆ　水酸化カリウム）および３０ｇグリセロールを含む７００ｍの体積で、 ２リットルファーメンタ−（Ｌ、　Ｈ，ファーメンテ−ジョン社、米国カリフォ ルニア州へイワード：あるいは、バイオラフイツト社、ＬＳＬバイオラフイツト 社、米国ニューシャーシー州プリンシトン）をオートクレーブした。滅菌後、３ Ｉ！ｉのＶＴＭ４　）レース塩溶液（５，０ｍ、＃硫酸第１鉄−７Ｈ２０，６， ０ｇ／硫酸銅、２０．０／硫酸亜鉛−７Ｂ！０．３．０ｇ＃硫酸マンガンーＨ２ ０，０，１ｇ／ｆ　ビオチン）を加え、濃い水酸化アンモニウムを添加してｐＨ を５．０に合わせた。ファーメンタ−植菌用細胞を１０から５０−加えた。本実 施例の第２，３゜あるいは４セクシヨンで後に示すように、最初に添加したグリ セロールの涸渇によって、グリセロールの添加を開始した０発酵の間中、０．１ ！ストラクトール（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ）　Ｊ６７３発泡抑制剤（ストラクトール 社、米国オハイオ州ストウ）を含む２０χ水酸化アンモニウム溶液を添加してｐ Ｈを５．０に調節し、過剰の発泡は発泡検査で検知して２χストラクト一ルＪ６ ７３発泡抑制剤で制御した０発酵の際の溶解酸素は、発酵中の空気の流速を３リ ットル／分まで増加させ、さらに攪拌速度を１５０Ｏｒｐｍまで増加させること により、空気飽和を２０％以上に維持した。

１０リットル発酵（バイオラフイツトファーメンタ−）は、Ｍｕｔ−混合培養メ タノール非制限添加バッチ培養法の場合は１．９リツトルの１０×基本的塩類お よび３００ｇグリセロールをふくむ７．０リットル培養体積、Ｍｕｔ”メタノー ル添加バッチ培養の場合には２．４リツトルの１０×基本的塩類および３６０ｇ グリセロールを含む５．０リットル培養体積、あるいは、Ｍｕｔ−メタノール添 加バッチ培養法の場合には３．２リツトルの１０×基本的塩類および４８０ｇグ リセロールを含む８リットル培養体積で開始した。滅菌後、２９ｄのＶＴＭ、　 トレース塩溶液を添加し、ｐＢを合わせて発酵の間中アンモニアを添加して５． ０に調節した。過剰の発泡は１０χストラクト一ルＪ６７３発泡抑制座位の添加 によりて制御した。ファーメンタ−に２００〜５０（ｌｄ体積の植菌用細胞を加 えた。最初に含ましていたグリセロールの涸渇によって、本実施例の第２．３、 あるいは４セクシヨンで述べるようにグリセロール添加を開始した。発酵中の空 気流速を４０リットル／分まで、攪拌速度を１１００Ｏｒｐまで、および／ある いはファーメンタ−の気圧を１．５バールまで増加させることにより、溶解して いる酸素を２０％以上に維持した。

２、　Ｍｕｔ”た細胞：混合添加、メタノール非制限添加バッチ発酵グリセロー ルバンチ相が完了した後（すなわち、最初に添加したグリセロールが涸渇したら ）　、１２ｄ／４２　ＶＴＭ、）レース塩を含む５ｏｚ（重りグリセロール添加 を、２リットルファーメンタ−の場合には５．４　ｄ／ｈで、あるいは１０リッ トルファーメンタ−の場合には５４ｄ／ｈで開始した。グリセロール添加６時間 後、グリセロールの添加量を３．６ｄ／ｈ　（１０リツトルの場合には３６ｄ／ ｈ）に減少させ、１２ｄ／４２のＶＴＭｄ　）レース塩を含むメタノール添加を ２リットルファーメンタ−の場合には１．１ｄ／ｈで、１０リットルファーメン タ−の場合にはｌｉｄ／ｈで開始した。５時間後、残存するメタノール濃度が約 １χまで、望ましくは０．２〜０．８χの間となるようにメタノール添加を調節 した。

発酵はメタノールとグリセロールを添加しながら４０〜５０時間行なった。

３、　Ｍｕｔ”細胞：メタノール添加バッチ発酵最初に添加したグリセロールが 涸渇した後、１２ｍ１／　ｆのＶＴＭ。

トレース塩を含む５０χグリセロール添加を２リツトルの場合には１２ｄ／ｈで 、１０リットルファーメンタ−の場合には２００ｄ／ｈで開始し、全部で７時間 運転した。グリセロールを添加して６時間後、１２ｄ／ｊ２のＶＴＭ４　）レー ス塩を含むメタノールの添加を、２リットルファーメンタ−の場合には１．１ｄ ／ｈで、１０リットルファーメンタ−の場合にはｌｉｄ／ｈで開始し、５分間行 なった。メタノール添加停止後に溶解酸素の増加が見られた場合には、さらに５ 分間置いてからメタノール添加を再開した。

後者の過程は、溶解酸素のメタノール添加停止に対する敏速な反応が観察される まで数回繰り返した：敏速な反応が起こったら、メタノール添加を３０分おきに し、１時間あたり２０χ増加させた。メタノール添加は、添加速度が２リットル ファーメンタ−の場合には７．６ｄ／ｈまで、あるいは１０リットルファーメン タ−の場合には１２６ｄ／ｈに達するまで増加させた。つづいて、発酵を２リッ トルファーメンタ−の場合には４０〜６０時間、１０リットルファーメンタ−の 場合には２３〜３５時間行なった。

４、　Ｍａｔ”−細胞：メタノール添加バッチ発酵最初に加えたグリセロールが 涸渇した後、残存するメタノール濃度を０．２χ〜０．８χに維持するようにメ タノールをファーメンタ−に添加した。１０リツトル運転の場合には、ＶＴＭ４ 　）レース塩を用いず、かわりに４０ｄのＩＭ、トレース塩（５ｄ／ｆ硫酸、４ ．８ｇ／ｌ塩化第１鉄−２８ｚＯ，２，０ｇ／　ｊ！硫酸亜鉛−ｒｈｏ、０．０ ２ｇ／　ｆホウ酸、０．２／ｌモリブデン酸ナトリウム、０．３ｇ／　ｆ硫酸マ グネシウム−ＨｔＯ５０，０８ｇ／　ｌヨウ化カリウム、０．０６ｇ／　ｆ硫酸 銅−５Ｈ２０）および２■／ｌのビオチンを２日ごとにファーメンタ−に注入し た０発酵は２リツトル運転の場合には約１９２時間まで、１０リツトル運転の場 合には約１４４時間まで実施した。

リゾチームＣを分泌するＰ、バストリス株の培養法についてのさらなる情報は、 １９８８年９月２６日に提出された米国特許出願第２４９，４４６号に記載され 、これは本出願に共通に用いられており、ここに参考として含める。

（実施例１５） ブースミドＡＯ８０３ＡＯ８０４お　びＡＯのｉ′１本実施例の方法は、例えば デービス（Ｄａｖｉｓ）他、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ｌ’１ｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、エルセピア−・サイエンス・パブリッシング社、ニ ューヨーク州ニューヨーク（１９８６）およびマニアティス他、上述に記載され ているような標準的な方法で行なった。

プラスミドｐＢＲ３２２を以下のように、ＥｃｏＲ１部位を除去してＰｖｕ■部 位にＢｇｌ　１１部位を挿入することによって修飾した：ｐＢＲ３２２をＥｃｏ ＲＩで消化し、突出末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片でフィル インし、えられたＤＮＡをＴ４リガーゼで再度環状化した。再環状化ＤＮＡを大 腸菌ＭＣｌ０６１株の形質転換に使用し、アンピシリン耐性で選択して、Ｅｃｏ Ｒ１部位を持たない約４．３７ｋｂｐのプラスミドを有することでスクリーニン グした。このような形質転換体の一つを選択して培養して、ｐＢＲ３２２のＥｃ ｏＲｌを次の配列で置換したｐＢＲ３２２ＲＩと名付けたプラスミドを回収した ： ５’　−ＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣ−３’ ３’　−ＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧ−５’ ｐＢＲ３２２ＲＩをＰｖｕ　ｎで消化して、得られた平滑末端に５’　−ＣＡＧ ＡＴＣＴＧ−３’ ３’−ＧＴＣＴＡＧＡＣ−５” の配列を持つリンカ−をＴ４リガーゼを用いて連結した。得られたＤＮＡをＴ４ リガーゼを用いて再環状化し、続いてＢｇｌ　ＩＩで消化してＴ４リガーゼで再 度環状化して、Ｐｖｕ　ＩＩ消化ｐＢＲ３２２Ｒ１に一つ以上のリンカ−が連結 したことによる複数のＢｇｌ　ＩＩ部位を除去した。複数のＢｇｌ　Ｉｆ部位を 除去する処理を行なったＤＮＡを大腸菌ＭＣ１０６１に形質転換してアンピシリ ン耐性で選択した。形質転換体をＢｇｌ　１１部位を持つ約４．３８ｋｂｐのプ ラスミドに関してスクリーニングした。このような形質転換体の一つを選択して 培養し、ｐＢＲ３２２ＲＩＢＧと名付けたプラスミドを回収し、続けて使用した 。プラスミドｐＢＲ３２２ＲＩＢＧは、ｐＢＲ３２２ＲｉのＰｖｕ　ｎ部位の代 わりに、 ５’−ＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧ−３’３’−ＧＴＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＡ Ｃ−５’の配列を有する以外はｐＢＲ３２２ＰＩ　と同一である。

ｐＢＲ３２２ｉ？ＩＢＧをＳａｔ　ＩおよびＢｇｌ　ＩＩで消化し、大きい方の 断片（約２．９７ｋｂｐ）を単離した。ヨーロッパ特許出願公開公報第０２２６ ７５２号に記載されティるブーｙスミドｐＢｓＡＧＩ５１をＢｇｌ　ＩｆとＸｈ ｏ　工で完全に消化し、ＡＯＸＩ遺伝子転写ターミネータ−の下流（ＡＯＸＩプ ロモーターからの転写方向に従って）Ｐ、バストリスＡＯχ１座位領域由来の約 ５ｓｏｂｐ断片を単離した。このｐＢｓＡＧ１５１由来Ｂｇｌ　由来８ズｌｏｌ 断片およびｐＢＲ３２２ＲＩＢＧ由来Ｓａｌ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ｎ断片をＴ４リガ ーゼで連結させた。連結反応混合液を大腸菌ＭＣｌ０６１株のアンピシリン耐性 に関する形質転換に使用し、Ｂｇｌ　ｎ部位を持つ予想された大きさく約３．８ ｋｂｐ）のプラスミドについてスクリーニングした。該プラスミドをｐＡＯ８０ １と命名した。ｐＢＲ３２２ＲＩＢＧ断片由来（ｌＤｓａｌ　１部位の突出末端 と、８５０ｂｐ（７）ｐＢｓＡＧＴ５Ｉ断片のＸｈｏ　１部位の突出末端を連結 したので、この過程中でｐＡＯ８０１中のＳａｌ　１部位とＸｈｏ　１部位はと もに失われた。

次に、ｐＢｓＡＧＩ５１をＣ１ａ　Ｉで消化し、約２．０ｋｂｐ断片を単離した 。

該２．ｏｋｂｐ′＃ｆｒ片は、Ｐ、バストリスＡＯχ１プロモーターおよび転写 開始部位を含む約１．０ｋｂｐ断片、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（”ＨＢｓＡｇ ”）をコードする約７００ｂｐ断片、およびＰ、バストリスＡＯＸＩ遺伝子ポリ アデニル化シグナルとよびポリアデニル化部位をコードする断片および転写ター ミネータ−を含む約３００ｂＰ断片を有する。

２．０ｋｂＰ断片のＨＢｓＡｇコード断片はＡＯＸＩプロモーターをもつ１．０ ｋｂｐ断片に隣接した末端でＥｃｏＲ１部位で終結しており、Ａ＜）Ｘ１転写タ ーミネータ−を持つ３ｏｏｂｐ断片に隣接した末端ではＳｔｕ　１部位で終結し 、１．０ｋｂｐのプロモーターを含む断片と５ｏｏｂｐの転写ターミネータ−を 含む断片に関してＡＯＸＩプロモーターからの転写により）ＩＢｓＡｇの発現が 行なわれるような位置および向きでＨＢｓＡｇをコードするサブ断片を有する。

プロモーター断片を）ＩＢｓＡｇコード断片に連結しているＥｃｏＲ１部位は、 ＡＯＸＩプロモーターの翻訳開始シグナルをコードするトリブレットの直上流（ ＡＯＸＩプロモーターからの転写方向に関して）生じる。

２．０ｋｂｐのプロモーターおよびターミネータ−断片、ｐＢｓＡＧＩ５１のＣ １ａ　１部位で終結する断片についてさらに詳細にはヨーロッパ特許公開公報筒 ０２２６８４６号、およびエリス（Ｅｌｌｉｓ）他、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５．１１１１（１９８５）参照。

プラスミドｐＡＯ８０１をＣ］ａ　Ｉで消化し、ｐＢｓＡＧＩ５１由来の約２． ０ｋｂｐのＣ１ａ　１部位を末端とする断片とＴ４リガーゼで連結した。連結反 応混合液を大腸菌ＭＣ１０６１のアンピシリン耐性に関する形質転換に使用し、 形質転換体をＣ１ａ　ＩとＢｇｌ　ＩＩで消化して約２．３２ｋｂｐ断片（ｐＢ Ｒ３２２由来の複製開始点とアンピシリン耐性遺伝子を含む）と約１．９ｋｂｐ 、１．４８ｋｂｐ　、および１００ｂｐの断片が生じるような、予想されたサイ ズ（約５．８ｋｂｐ）のプラスミドについてスクリーニングした。ＢｇｌＩ［と ＥｃｏＲＩによる消化では、ＡＯＸＩ遺伝子由来の３００ｂｐのターミネータ− とＨＢｓＡｇコード断片を含む約２．４８ｋｂｐ断片、およびＡＯＸＩ座位のＡ ＯＸＩ遺伝子のＡＯＸＩタンパク質コード領域の上流由来の断片を含む約９００ ｂｐ断片、ｐＢＲ３２２由来の複製開始点とアンピシリン耐性遺伝子を含む約２ ．４２ｂｐ断片、およびＡＯχ１の約１ｏｏｂｐのＣ１ａ　Ｔ　−Ｂｇｌ　Ｉｎ 断片（ＡＯＸＩコード領域からみて、最初に述べた９ｏｏｂｐのＥｃｏＲＩ　− Ｂａｌ　Ｉｎ断片のさらに上流）を生じた。このようなプラスミドはｐＢｓＡＧ Ｉ５１由来Ｃ１ａ　ｎ断片を望みの向きで含んでいた：逆の望ましくない向きで は、約３．３ｋｂｐ、２．３８ｋｂｐ　、および９００ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｂ ｇｌ　ｎ断片が得られる。

ｐＡＯ８０２と名付けた望みのプラスミドを有する形質転換体の一つを選択して 引き続いて使用し、培養して該プラスミドを回収した。　ｐＡＯ８０２中のｐＢ ｓＡＧ１５１由来の望みの向きのＣ］ａ　ｎ断片は、）ＩＢｓＡｇコード断片お よびＡＯＸＩ座位中のＡＯＸＩ遺伝子の下流由来で正しい向きの約８００ｂｐＢ ｇｌ　１１部位を末端に持つ断片を含むＡＯχ１座位断片を含み、ＡＯＸＩ座位 中のＡＯχ１遺伝子の下流由来の８００ｂｐ断片の末端のＢｇｌ　ＩＩ部位で切 断して直鎖状にしたプラスミドのＡＯχ１座位でＰ、バストリスのゲノム中への 正しい挿入を誘導する。

次に、ｐＡＯ８０２を操作して、ＥｃｏＲ１部位とＳｔｕ　１部位を末端とする ＨＢｓＡｇ−コード領域を除去した。プラスミドをＳｔｕ　Ｔで消化し、 ５’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’ ３’　−ＣＣＴＴＡＡＧＧ−５’ の配列を持つリンカ−を丁４リガーゼを用いて平滑末端に連結した。反応混合液 をＥｃｏＲＩで処理し、Ｔ４リガーゼで再度連結した。

連結反応混合液を大腸菌ＭＣｌ０６１株の形質転換に使用してアンピシリン耐性 とし、約１．７８ｋｂｐ　、９００ｂｐ、および２．４２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ　 −Ｂｇｌ　Ｉｎ断片、および、約１００ｂｐ　、２．３２ｋｂｐ　、　］、’４ ８ｋｂｐ　、および１．２ｋｂｐのＢｇｌ　ＩＩ　−Ｃ］ａ　ｎ断片を生じる、 予想される長さく５．１ｋｂｐ）のプラスミドを選択した。このプラスミドをｐ ＡＯ８０３と名付けた。

目的のプラスミドを有する形質転換体を以下の過程のために選択し、培養してｐ ＡＯ８０３を回収した。

次に、ｐＡＯ８０３中のｐＢＲ３２２由来Ｂａ＋ｎＨ１部位に、Ｐ、バストリス ＨＩＳ４遺伝子が存在するＰ、パストリスゲノム由来の約２．７５ｋｂｐのＢｇ ｌ　Ｉｎ断片を挿入することにより、ｐＡＯ８０３からプラスミドｐＡＯ８０４ を作成した。フレラグ（Ｃｒｅｇｇ）他、Ｍｏ１．　Ｃｅｌ！、　Ｂｉｏｌ、　 ５＋３３７６（１９８５）およびヨーロッパ特許公開公報筒０１８０８９９号お よび第０１８８６７７号参照。ｐＡＯ８０３をＢａ＋ｎＨＴで消化し、旧ｓ４遺 伝子を含むＢｇｌ　１１部位を末端とする断片と混合し、Ｔ４リガーゼを用いて 連結した。連結反応混合液を大腸菌ＭＣ１０６１株に形質転換してアンピシリン 耐性とし、形質転換をＳａｌ　Ｉで消化して目的の大きさく７．８５ｋｂｐ）と なにプラスミドを選択した。このような形質転換体の一つを以下の過程のために 選択し、それに含まれるプラスミドをｐＡＯ８０４と命名した。

ｐＡＯ８０４は約１．５ｋｂｐのＳａｌ　Ｉ　−Ｃ１ａ　ｎ断片を一つと、１． ３ｋｂｐのＣ１ａ１−Ｃ１ａ　ｎ断片を有する：このことは、該プラスミド中の 旧ｓ４遺伝子の転写の向きがアンピシリン耐性遺伝子の転写の向きと同じであり 、ＡＯＸＩプロモーターからの転写の向きと逆であることを示唆する。

ｐＡＯ８０４中の旧Ｓ４遺伝子の向きは該プラスミドあるいは、ＡＯＸＩプロモ ーターとターミネータ−領域の間のＥｃｏＲＴ部位に挿入したｃＤＮＡコード領 域をもつその誘導体の機能に重要ではない。したがって、ｐＡＯ８０４中の旧Ｓ ４遺伝子と逆向きの旧Ｓ４遺伝子を有するプラスミドも本発明での使用に効果的 であろう。

ｐＡＯ８０４に似ているが、Ｐ、バストリス旧Ｓ４遺伝子以外のＰ６バストリス の選択を可能にするような選択用マーカー遺伝子を有する別のプラスミドも、Ｐ 、バストリス遺伝子以外の選択用マーカー遺伝子を含む断片をｐＡＯ８０３のＢ ａ＋ｅＨ１部位に挿入することによって構築できることは注目すべきである。本 分野で既知のこのような断片には、Ｓ、セレビシェのＡＲＧ４遺伝子、Ｐ、バス トリスのＡＲＧ４遺伝子、およびＳ、セレビシェの旧５４遺伝由来断片がある。

例えば、Ｐ、バストリス旧Ｓ４遺伝子の代わりにＳ、セレビシェのＡＲＧ４遺伝 子を持つｐＡＯ８０４の部位プラスミドで、本発明のプラスミドｐＢＬ１１の作 成に使用されたｐＡＯ８１１と名付けられたプラスミドを作成するには、以下の 方法で行なった：　ｐＡＯ８０３をＢａｍＨＩで消化し、突出末端を大腸菌ＤＮ Ａポリメラーゼのクレノー断片でフィルインした０次に、直鎖状にしてフィルイ ンしたプラスミドをＳ、セレビシェＡＲＧ４遺伝子を含むＳ、セレビシェのゲノ ム由来約２．１ｋｂｐ　Ｈｐａ　Ｉ断片と混合した。チャンバー（Ｔｓｃｈｕｍ ｐｅｒ　）およびカーボン（Ｃａｒｂｏｎ）、Ｊ、　）１ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　 １５６．２９３（１９８２）　：ヨーロッパ特許出願公開公報第０２１１４５５ 号参照、ＨｐａＩ断片は、米国イリノイ州ペオリアの米国農務省の北部リサーチ ・ラボラトリ−へ大腸菌ＭＣ１０６１中にある状態でＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−１８ ０１５号として寄託されておりそこから入手できるｐＶＶＳ２呼ばれるプラスミ ドからも得ることができる。これらの断片を丁４リガーゼを用いて平滑末端連結 反応を行い、連結反応混合液を大腸菌ＭＣ１０６１に形質転換してアンピシリン 耐性とした。形質転換体を予想されるサイズ（約７．２ｋｂｐ）のプラスミドに 関してスクリーニングした。このような形質転換体のうち一つを以後の過程のた めに選択した：それに含まれるプラスミドをｐＡＯ８１１と命名した。

ｐＡＯ８１１中のＡＲＧ４遺伝子の向きは決定されていないが、Ｈｐａ　１部位 を末端とする断片の、末端のＨｐａ　１部位から約４００〜５００塩基の位置で 、ＡＲＧ４遺伝子の３′末端の近辺にＢｇｌ　ｎ部位が存在することは注目され るべきである。

Ｐ、バストリスＡｌｌｌＧ４遺伝子はヨーロッパ特許出願公開公報第０２１１４ ５５号に開示されている。Ｐ、バリトリスＡＩ？Ｇ４遺伝子を持つ断片を含むプ ラスミドは、大腸菌ＭＣｌ０６１株中の状態で、ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−１８０１ ６号として、米国イリノイ州ベオリアの北部リサーチ・ラボラトリ−に寄託され ており、そこから入手可能である。

Ｓ、セレビシェ旧Ｓ４遺伝子はドナーエ（Ｄｏｎａｂｕｅ）他、Ｇｅｎｅ１８　 ：　４７　（１９８２）に記述されている。Ｓ、セレビシェ旧Ｓ４遺伝子を持つ 断片を含む、ｐＢＰＧｌ−１と呼ばれるプラスミドは、ヨーロッパ特許出願公開 公報第０２２６７５２号に記載されており、大腸菌ＭＣｌ０６１株中の状態でＮ ＲＲＬ寄託番号Ｂ−１８０２０として米国イリノイ州ベオリアの北部リサーチ・ ラボラトリーズに寄託さており、そこから入手することができる。

！丘 Ｐ、バストリス株Ｇ５１１５およびＰＰＦＩならびに、プラスミドｐＢｓＡＧ１ ５１をもつ大腸菌に一１２株ＭＣ１０６１は、アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１２３０１バークローン・ドライン“、ロックビＪし 、メリーランド州２０８５２米国に、対応するＡＴＣＣ寄託番号とともに、以下 のデーターで、寄託されている： 豊ｍ五死　足付　酊μｍ■し１号 Ｇ５１１５　８月１８．１９８７　２０８６４ＰＰＰ１　８月１８．１９８７　 ２０８６５大腸菌ＭＣ１０６１（ｐＢｓＡＧＩ５１）　９月１５．１９８７　６ ７５１２該寄託は、ブタベスト条約のもとで試行される特許手続きおよび規制を 行なう目的で、微生物の寄託の国際的承認に基づいた該条約の協定のもとで、Ａ ＴＣＣによって作製、および受け入れられた。該条約および承認にしたがって、 アメリカ合衆国並びにその他の国の特許法および承認のもとで権利を与えられた 、産業属性のある事務所およびその他の人と実在物、ならびに、この出願あるい はこの出願の優先権を請求している出願が提出されている国際組織には、該寄託 の試料を得ることが出来るだろう、該寄託の試料の公共利用に関する全ての制約 は、最低でも、この出願における米国特許が発布されている間は、最終的に除か れることはないだろう。

本発明の種々の態様がいくつかの特徴とともに、ここで記載されているが、この 分野の当業者は本発明の意図する中に残される修飾および変化を認識するだろう 、これらの修飾および変化は、ここで記載ならびに請求されるような発明の範晴 にあるものである。

ＦＩＧ、Ｉ Ｅｃｏ　ＲＩ（０） ＦＩＧ、　３ ＰｓｔＩ（〜３００） 国際調査報告

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. １．（１）第１のＰ．バストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）遺伝子のプロモータ ー断片および第２のＰ．バストリス遺伝子の終結断片であって、該第１遺伝子お よび第２遺伝子は、同一あるいは異なる遺伝子であるもの；および
2. （２）動物前駆型リゾチームｃ、該プロモーターおよび終結断片に関して、該前 駆型リゾチームｃをコードする断片と該終結断片のポリアデニル化シグナルをコ ードする断片とポリアデニル化部位をコードする断片の該プロモーター断片のプ ロモーターからのＰ．バストリスにおける転写に作用するように方向付けと配置 を行なった該断片をコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ。 ２．該第１のＰ．バストリス遺伝子と該第２のＰ．バストリス遺伝子が同一であ り、Ｐ．バストリスのＡＯＸ１遺伝子である、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
3. ３．前駆型リゾチームｃをコードする断片が哺乳類種由来の前駆型リゾチームｃ をコードする、請求の範囲第２項記載のＤＮＡ。
4. ４．種かヒトである場合の、請求の範囲第３項記載のＤＮＡ。
5. ５．ヒト前駆型リゾチームｃをコードする断片が、前駆型リゾチームｃをコード するＥｃｏＲＩ部位を末端にもつプラスミドｐＨＬＺ１０２断片の配列、あるい は、前駆型リゾチームのシグナルペプチドの−３の位置においてＶａＩをコード するトリプレット５′−ＧＴＴ−３′および、前駆型リゾチームｃのシグナルペ プチドの−２の位置にＧＩｎをコードするトリプレット５′−ＣＡＡ−３′を有 するように改変した、該前駆型リゾチームｃをコードするＥｃｏＲＩ部位を末端 にもつプラスミドｐＨＬＺ１０２断片の配列をもつ、請求の範囲第４項記載のＤ ＮＡ。
6. ６．種がウシである、請求の範囲第３項記載のＤＮＡ。
7. ７．ウシ前駆型リゾチームｃをコードする断片が、前駆型リゾチームｃ２をコー ドする、ＥｃｏＲＩ部位を末端にもつ、プラスミドｐＢＬＩ６ｃの断片を有する 、請求の範囲第６項記載のＤＮＡ。
8. ８．Ｐ．バストリス細胞を形質転換して該前駆型リゾチームｃを発現することが でき、該ＤＮＡをもつＰ．バストリス細胞に選択マーカーを与える遺伝子を含む 、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
9. ９．選択マーカーを与える遺伝子が、Ｐ．バストリスのＨＩＳ４遺伝子、Ｐ．バ ストリスの且ＲＲＧ４遺伝子、Ｓ．セレビシエのＡＲＧ４遺伝子および、Ｓ．セ レビシエのＨＩＳ４遺伝子からなるグループから選択される、請求の範囲第７項 記載のＤＮＡ。
10. １０．該第１Ｐ．バストリス遺伝子および該第２Ｐ．バストリス遺伝子が同一で 、Ｐ．バストリスＡＯＸ１遺伝子である、請求の範囲第９項記載のＤＮＡ。
11. １１．前駆型リゾチームｃをコードする断片が、哺乳類種由来の前駆型リゾチー ムｃをコードする、請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ。
12. １２．種がヒトである場合の、請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ。
13. １３．ヒト前駆型リゾチームｃをコードする断片が、前駆型リゾチームｃをコー ドするＥｏｏＲ１部位を末端にもつプラスミドｐＨＬＺ１０２断片の配列あるい は、前駆型リゾチームのシグナルペプチドの−３の位置においてｖａｌをコード するトリプレット５′−ＧＴＴ−３′および、前駆型リゾチームｃのシグナルペ プチドの−２の位置にＧｌｎをコードするトリプレット５′−ＣＡＡ−３′を有 するように改変した、該前駆型リゾチームｃをコードするＥｃｏＲＩ部位を末端 にもつプラスミドｐＨＬＺ１０２断片の配列を有する、請求の範囲第１２項記載 のＤＮＡ。
14. １４．プラスミドがｐＨＬＺ１０３である、請求の範囲第１３項記載のＤＮＡ。
15. １５．種がウシである、請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ。
16. １６．ウシ前駆型リゾチームｃをコードする断片が、前駆型リゾチームｃ２をコ ードする、ＥｃｏＲＩ部位を末端にもつプラスミドｐＢＬＩ１６Ｃの断片を有す る、請求の範囲第１５項記載のＤＮＡ。
17. １７．ｐＳＬＩ２ＡおよびｐＢＬＩＩからなるグループから選択される、請求の 範囲第１６項記載のＤＮＡ。
18. １８．請求の範囲第８項記載のＤＮＡで転換したＰ．バストリスの培養物。
19. １９．請求の範囲第９項記載のＤＮＡで形質転換したＰ．バストリスの培養物で ある、請求の範囲第１８項記載の培養物。
20. ２０．請求の範囲第１０項記載のＤＮＡにより形質転換したＰ．バストリスの培 養物である、請求の範囲第１９項記載の培養物。
21. ２１．請求の範囲第１１項記載のＤＮＡにより形質転換したＰ．バストリスの培 養物である、請求の範囲第２０項記載の培養物。
22. ２２．請求の範囲第１２項記載のＤＮＡにより形質転換したＰ．バストリスの培 養物である、請求の範囲第２１項記載の培養物。
23. ２３．請求の範囲第１３項記載のＤＮＡにより形質転換したＰ．バストリスの培 養物である、請求の範囲第２２項記載の培養物。
24. ２４．請求の範囲第１４項記載のＤＮＡにより形質転換したＰ．バストリスの培 養物である、請求の範囲第２３項記載の培養物。
25. ２５．該培養物がＧ−ＨしＺ１０３ＳおよびＧ＋ＨＬＺ１０３Ｓからなるグルー プから選択されたＰ．バストリス株である、請求の範囲第２４項記載の培養物。
26. ２６．請求の範囲第１５項記載の、ＤＮＡで形質転換したＰ．バストリスの培養 物である、請求の範囲第２１項記載の培養物。
27. ２７．請求の範囲第１６項記載の、ＤＮＡで形質転換したＰ．バストリスの培養 物である、請求の範囲第２６項記載の培養物。
28. ２８．請求の範囲第１７項記載の、ＤＮＡで形質転換したＰ．バストリスの培養 物である、請求の範囲第２７項記載の培養物。
29. ２９．該培養物が、Ａ３７，Ｌ１，Ｃ６，ＣＳＢＬ１１およびＣＳＢＬ３からな るグループから選択されたＰ．バストリス株である、請求の範囲第２８項記載の 培養物。
30. ３０．Ｐ．バストリス内で相当する前駆型動物リゾチームｃを発現することが出 来る遺伝子をもつＰ．バストリス細胞を、該遺伝子が該細胞内で転写されるよう な条件下で培養することからなる、動物リゾチームｃを製造する方法。
31. ３１．細胞が、Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃを発現するこ とが出来る請求の範囲第８項記載のＤＮａにより形質転換した培養物あるいは培 養の副培養物でをある、請求の範囲第３０項の方法。
32. ３２．細胞が、Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃを発現するこ とが出来る請求の範囲第９項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは培 養の副培養物である、請求の範囲第３１項の方法。
33. ３３．細胞が、Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃを発現するこ とが出来る請求の範囲第１０項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは 培養の副培養物である、請求の範囲第３２項の方法。
34. ３４．製造されるべきリゾチームｃが哺乳類リゾチームｃであり、また細胞が、 Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃを発現することが出来る請求 の範囲第１１項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは培養の副培養物 である、請求の範囲第３３項の方法。
35. ３５．製造されるべきリゾチームｃがヒト・リゾチームｃであり、また細胞が、 Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃを発現することが出来る請求 の範囲第１２項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは培養の副培養物 である、請求の範囲第３４項の方法。
36. ３６．製造されるべきリゾチームｃがヒト・リゾチームｃであり、また細胞が、 Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃを発現することが出来る請求 の範囲第１３項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは培養の副培養物 である、請求の範囲第３５項の方法。
37. ３７．製造されるべきワゾチームｃがヒト・リゾチームｃであり、また細胞が、 Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃを発現することが出来る請求 の範囲第１４項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは培養の副培養物 である、請求の範囲第３６項の方法。
38. ３８．細胞が、Ｇ−ＨＬＺ１０３ＳおよびＧ＋ＨＬＺ１０３Ｓからなるグループ から選択された株である、請求の範囲第３７項記載の培養物。
39. ３９．製造されるべきリゾチームｃがウシ・リゾチームｃであり、また細胞が、 Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃを発現することが出来る請求 の範囲第１５項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは培養の副培養物 である、請求の範囲第３４項の方法。
40. ４０．製造されるべきウシ・リゾチームｃがウシ・リゾチームｃ２であり、また 細胞が、Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃ２を発現することが 出来る請求の範囲第１６項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは培養 の副培養物である、請求の範囲第３９項の方法。
41. ４１．製造されるべきリゾチームｃがウシ・リゾチームｃ２であり、また細胞が 、Ｐ．バストリス内で、相当する前駆型リゾチームｃ２を発現することが出来る 請求の範囲第１７項記載のＤＮＡにより形質転換した培養物あるいは培養の副培 養物である、請求の範囲第４０項の方法。
42. ４２．細胞が、Ａ３７，Ｌ１，Ｃ６，ＣＳＢＬ１１およびＣＳＢＬ３からなるグ ループから選択された株である、請求の範囲第４１項記載の方法。
43. ４３．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３０項の方法。
44. ４４．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３１項の方法。
45. ４５．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３２項の方法。
46. ４６．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３３項の方法。
47. ４７．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３４項の方法。
48. ４８．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３５項の方法。
49. ４９．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３６項の方法。
50. ５０．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３７項の方法。
51. ５１．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３８項の方法。
52. ５２．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第３９項の方法。
53. ５３．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第４０項の方法。
54. ５４．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第４１項の方法。
55. ５５．該培養が、炭素源としてメタノールを含む培地中で行なわれる、請求の範 囲第４２項の方法。
56. ５６．配列が 【配列があります】 である、１８個のアミノ酸からなるポリペプチド。
57. ５７．配列が 【配列があります】 であるポリペプチドをコードする配列中の５４−塩基対の断片および、Ｘ９８が ＫあるいはＨを示している、配列が【配列があります】 であるポリペプチドをコードする配列中の４４１−塩基対の断片、ならびに、【 配列があります】の配列をもつポリペプチドが成熟型ヒト乳汁リゾチームのアミ ノ酸末端に融合した、融合ポリペプチドをコードする配列中の４４４−塩基対の 断片からなる群から選択された断片を含むＤＮＡ。
58. ５８．配列が 【配列があります】 であるポリペプチドをコードする配列中の５４−塩基対の断片を含む、請求の範 囲第５７項記載のＤＮＡ。
59. ５９．配列が 【配列があります】のポリペプチドをコードする配列中の４４１−塩基対の断片 を含む請求の範囲第５８項記載のＤＮＡ。
60. ６０．【配列があります】の配列のポリペプチドが、成熟型のヒト乳汁リゾチー ムのアミノ酸末端に融合した融合ポリペプチドをコードする配列中の４４４−塩 基対の断片を含む、請求の範囲第５８項記載のＤＮＡ。