JPS62275695A - 成熟型ヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物学的経路による成熟型ヒト血清アルブ
ミン（ｍａｔｕｒｅ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂ
ｕｍｉｎ）の製造に関する。

宿主微生物としては、高い治療学的価値を持った大量の
ヒトタンパク質を製造する目的で可能性として使用する
ことができる修正された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ｌψ乳動
物細胞又は微生物の如き広範な選択かなされる。

組換えＤＮＡ技術による修正された（甫乳動物細胞の使
用は、天然起源の生成物に密接に関連した生成物をもた
らすという利点を持っている。しかしながら、これらの
細胞の培養は複雑であり、限られた規模でのみ行うこと
ができる。

バクテリアの如き微生物の使用は、大規模な製造を可能
とするか、天然起源の生成物とは多少異なる生成物を生
成するという欠点をもたらす。故に、ヒトにおいて通常
グリコジル化されるタンパク質は、一般にバク゛テリア
によりグリコジル化されない〔ビー、バーマン及びエル
、ニー、ラスキー、トレンズ　バイオケム、サイ、、（
１９８５）、Ｌ更、５１頁以下（Ｐ、Ｂｅｒｍａｎ　ａ
ｎｄ　Ｌ、八、１．ａｓｋｅｙ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、、　（１９８５）、　１０．　
ｐ、　５１　ｅｔｓｅｑ）］−更に、大１揚菌（Ｅ、ｃ
ｏｌ−し）の如きバクテリアにおいて高レベルで発現さ
れるヒトタンパク質は、しばしば、細胞内法でんを伴う
自然でないコンホーメーションを有する〔アール、ジー
　ショナー及び共同研究者１．バイオロジカルチクノロ
シー、（１９８５）、３．１５１頁以１・゛（Ｒ，（：
、５ｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、；　　Ｂｉｏ、Ｔ
ｅｃｈｎｏｌ、　　（１９８５）。

３．　ｐ、　１５１　ｅＬ　ｓｅｑ　）　；ジュー。エ
ム、シューメーカー及び共同研究者、、ヨーロピアン、
モレキュラー、バイオロジー、オーガニゼーション、ジ
ャーナル、（１９８５）、先、７７５頁以下（Ｊ、Ｍ、
Ｓｃｈｏｍａｋｅｒ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、、　ＥＭＩＩＩ
ＯＪ、　（１９８５）、　４　ｐ、　７７５ｅｔ　ｓｅ
ｑ　＞ｌ　Ｒ後に、大腸菌の如きバクテリアにおいて遺
伝子が発現するのを可能とするために、天然タンパクτ
をコードしている配列の前にメチオニン開始コドン（＃
１ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　１ｎｉｔｉａｔｏｒ　ｃｏｄｏ
ｎ）を配置することが必須である。一般に、この残基は
、大腸菌のメチオニルアミノペプチダーゼによっては切
り出されない〔ビー、エイチ、シーバーグ及び共同研究
者、、１９８５、斐、３７頁以下（Ｐ、Ｉｆ。

５ｅｅｂｕｒ＋？ｅｔ　ｃａｌｌ、、　１９８５．２．
　ｐ、　３７　ｅｔ　ｓｅｑ　）　；ジュー。エム、シ
ョナー及び共同研究者、、プロシープインク、オブ、ザ
、ナショナル、アカデミ−。

オブ、サイエンス、オブ、ザ、ニー、ニス、ニー。

（１９８１＞、８１．５４ｏ３頁（Ｐ、Ｈ，５ｃｈｏｎ
ｅｒｅｔ　ｃｏｌｌ、、　ｔｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾（１９８１）。

８１、　　ｐ、　５４０３）］　。

このようにして得られたタンパク質は第１残基として異
常なアミノ酸を持っており、このアミノ酸は、タンパク
質の始め（ｂｅｇｉｎｎｉＢ）が活性に関与する場合に
は生物学的活性の立体障害を引き起こしうる。残基はタ
ンパク質のその後の投与にとって有害な免疫原性（ｉｍ
ｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ）であること
もある。

宿主細胞の選択は製造しようとする特定のタンパク質に
依存するということになる。商業的価値が高く且つ必要
量が限定されているタンパク質の場合には、哺乳動物細
胞は特に高度に好適なソースとなる。他方、商業的価値
がより低く且つ大址に、数１０トンのオーダーで要求さ
れる生成物、例えばヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）、の
場合には、微生物の使用に関連した欠点を克服しながら
、微生物を使用することが必須であると思われる。

Ｈ８Ａが、“プロモーター−翻訳開始部位−ＡＴＧ−成
熟型Ｈ８Ａ遺伝子”　（”Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｂｅｇｉ
ｎｎｉｎｅ　　ｏｆ　　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　　５
ｉｔｅ−＾ＴＣ−Ｍａｔｕｒｅ　　［ＩＳ八　ｇｅｎｅ
′°型の遺伝子構造から発現される場せ昏こは、生成す
るタンパク質は、−ａに、Ｎ−末端残基としてメチオニ
ンを有する。大腸菌において発現された異種タンパク質
（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）から
Ｎ−末端メチオニンを除去するために、多数の方法、例
えば、生体内での酵素的開裂、膜を通り抜ける期間又は
その直後のタンパク分解切り出しくｐｒｏｔ。

１ｙｔｉｃ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ）又は生体内でのタンパ
ク分解消化もしくは化学的消化をもくろむことができる
。

特に、ジエー、ビー、ワラ−、ジャーナル９オブ、モレ
キュラー、バイオロジー、、（１９６３）、Ｌ、４８３
頁以下（Ｊ、Ｐ、Ｗａｌｌｅｒ、　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、。

（１９６３）、　１　、　ｐ、　４８３　ｅｔ　ｓｅｃ
＋）に従えば、大腸菌は多数のタンパク質のＮ−末端メ
チオニンを切り出すメチオニルアミノベチダーセを有す
ることが知られている。しかしながら、この機構の特異
性は、上置に確立されておらす、この機構は、メチオニ
ンに続く残基（１個又は複数個）に依存すると推測さｔ
する〔ブイ　エム　フォーブト　ジャーナル９ブ、バ・
イオロシカル、ケミス■−リー　（１９７０）、２４５
．４７６０頁以下（Ｖ、Ｍ、　Ｖｏｇｔ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　（１９７０）、　２４５．　ｐ、　４７６
０　ｅｔ　ｓｅｑ　）］　　；エイチ、ジェー、ジョー
ジ及び共同研究者、、（１９７５）ＤＮＡ、４．２７３
頁（Ｈ，Ｊ、　ＧｅｏｒＨｅ　ｅｔ　ｃｏｉｌ、。

（１９８５）　ＤＮＡ、先、　ｐ、　２７３）］。

分泌タンパク雪は、第１残基を含む“′シグナル配タ１
ド’　（”Ｓｉｇｎａｌ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ”）を含有
して成るプレタンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）の形
態で最初合成される。

この配列は、膜を通り抜ける期間又は通り抜けた直後タ
ンパク分解切り出しを受ける〔アール、シュックマン、
トレンズ　バイオケム、＜１９８０）、−に」−１１７
７頁（Ｒ，Ｓｃｈｅｃｋｅｒｍａｎ、　Ｔｒｅｎｄｓ　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８５）、副、　ｐ、　１７７
）］。しかしながら、この系は細ｉ質タンパク質又は異
種タンパク質の場合には不適当である。その理由は、タ
ンパク質のブー次配列（ｐｒｉｍａｒｙ　　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ）の成る部分によるか〔シェー、トマセン及び共
同研究者、ヨーロピアン　モレキュラー、バイオロジー
　オーガニゼーション、ジャーナル、Ｎ、９８５）、先
、１０４１　Ｎ（Ｊ、Ｔｏｍｍａｓｓｅｎ　ｅＬ　ｃａ
ｌｌ、、　ＥＭＢＯＪ。

（１９８５）　、先、　ｐ、　１０４１）］又はタンパ
ク質の過度に速い細胞質内（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａ
ｓｍｉｃ）沈でんによる輸送の問題があるからである。

更に、肝細胞により分泌されるＩ　Ｓ　Ａの如き、真核
細胞によるタンパク質の分泌に関与する機構は、多分、
ダラム陰性バクテリアの如き微生物の場合に関与する分
泌の機構とは極めて異なったものである〔エヌ、ウィッ
クナー及びエイチ、ロディッシュ、サイエンス（１９８
５）、２３０．４００頁（Ｎ、Ｗｉｃｋｎｅｔ　ｅｔｌ
ｌ、Ｌｏｄｉｓｈ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）、
　２３０．　ｐ、　４００）］　。

融合タンパク１（ｆｕｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の形態
でバクテリアにより合成されるタンパク質を生体外でト
ランスフオームするために、化学的消化又は酵素的消化
を使用することも提唱された。このトランスフオーメイ
ションの目的は、所望のタンパク質にとって外来であり
、Ｎ−末端に位置しており、最初の残基としてメチオニ
ンを含有するペプチド配列の特異的切り出しである。簡
単な例は天然にはメチオニン残基を含まないタンパク質
のそれである〔アール、イー、チャンス及び共同研究者
、。

°“ペプチド二合成−構造−機能″、編者、デー。

エイチ、リッチ及びイー、グロス１．ビースケム社、イ
リノイ州、ロックフォード市、、（１９８１）、７２１
頁以下（Ｒ，Ｅ、Ｃｈａｎｃｅ　ｅｔ　ｃｏｌｔ、、　
”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：５ｙｎｔｌ＋ｅｓｅｓ−Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ−Ｆｏｎｃｔｉｏｎ”、　Ｄ、Ｈ，Ｒｉｃｈ
　　ａｎｄ　Ｅ、Ｇｒｏｓｓ　ｅｄ、、　Ｐｉｅｒｃｅ
　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。

ｒｔ、Ｌ、、　（１９８１）、　ｐ、　７２１　ｅｔ　
ｓｅｑ　）］　、この場合には、臭化シアンによる生体
外処理によりＮ−末端メチオニンを切り出すことが可能
である。しかしながら、このケースは、高分子量のタン
パク質の場合には非常に希にしか起こらない。

コラゲナーゼ（ｃｏｌ　Ｉａｇｅｎａｓｅ）及びＸ因子
（Ｘ　ｆａｃｔｏｒ）の如き成るプロテアーゼは、幾つ
かのアミノ酸の配列を認識し、それによりそれらは比較
的特異的である〔ケー、ナガイ及びエイチ、シー、トガ
ーソン、ネイチャー（１９８４＞、３０９゜８１０頁以
下（Ｋ、Ｎａｇａｉ　ａｎｄ　１１．ｃ、Ｔｈｏｇｅｒ
ｓｏｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）、η主、　ｐ、
　８１０　ｅｔ　５ｅｑ）　；ジェー・ジェルミノ及び
デー、バスチア、プロシーディング。

オブ、ザ、ナショナル、アカデミ−、オブ、サイエンス
、オブ、ザ、ニー９ニス、ニー、（１９８４＞、８１．
４６９２頁以下（Ｊ、Ｃ：ｅｒｍｉｎｏ　ａｎｄ　Ｄ、
Ｂａ５ｔｉａ、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　＾ｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ、１ＪＳＡ　　（１９８４）、　　８
１゜ｐ、４６９２　ｅｔ　ｓｅｑ　）　］。かくして、
遺伝子構築（ｇｅｎｅ乞ｉｃ　　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ）により、必要なタンパク質の第１アミノ酸の前に
、問題のプロテアーゼにより認識される配列を位置付け
ることが可能となる。かくして、この融合タンパク質は
、プロテアーゼの基質となり、その反応の主な生成物は
、Ｎ−末端位置が成熟型タンパク質と同じアミノ酸を含
有するタンパク質である。しかしながら、この方法の大
きい欠点はプロテアーゼの価格にあり、特に大葉のタン
パク質を製造する場合に問題である。

ヒト細胞はプレプローＨＳ　Ａ　（ｐｒｅｐｒｏ−ＩＩ
ｓ＾）（第１図）の形態で最初）Ｉ　Ｓ　Ａを合成する
。１８個のアミノ酸のシグナル配列は、ＨＳＡが小胞体
（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）の腔
（ｌｕｍｅｎ）を通り抜けるときに除去され、そして、
循環しているＩ　Ｓ　Ａには存在しないＮ−末端の６個
のアミノ酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ　　）はまだ残っている。ニス、オー、ブレナ
ン及びアール、ダブリュ、カレル、バイオヒミカ　エ　
バイオフィジカ　アクタ（１９８０）、邊−λ」−５８
３頁以下（Ｓ、０．８ｒｅｎｎａｎ　ａｎｄ　１１．Ｗ
、ｃａｒｒｅｌｌ、　［ｌｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈ）＋！］、　　八ｃｔａ、（１９８０）、　
　６２１．　　ｐ、８３　　ｅｔ　　ｓｅｑ　　）４こ
従えば、このペプチドはＨＳＡの分泌において何等の役
割も果たさないように見える。第２の特異的タンパク分
解はゴルジ体（Ｉｌｚｏｌｇｉ　ａｐｐａｒｅｔｕｓ）
又は血液Ｗ！環系で起こり、その際２つのアルギニン残
基がトリプシンの認識部位と同様な特異性を有するプロ
テアーゼの認識部位を形成するということであるのかも
知れない。事実、プロペプチド（ｐｒｏｐｅｐｔ　１ｄ
ｅ）の最後のアルギニン残基をグルタミンにトランスフ
オームする突然変異による゛クリストチャーチアルプミ
ン＃（Ｃｈｒｉｓｔ−ｃｈｕｒｃｈ　ａｌｂｕｍｉｎ”
）として知られた別の形態は、生体内では成熟型ア　ル
ブミンに転化されないが、生体外でプロペプチドが低濃
度のトリプシンで処理されるとＧｌｕ−ＨＳＡに転化さ
れる。更に、天然形態の成熟型Ｉ　Ｓ　Ａは、同じ条件
下ではトリプシンに耐性である〔ニス、オー、ブレナン
及び共同研究者、、バイオヒミ力　エ　バイオフイジカ
　アクタ（１９８４）、８０２．２４頁以下（Ｓ、０．
８ｒｅｎｎａｎａｎｃｌ　ｃｏｌｌ、、　　Ｂｉｏｃｂ
ｉｎ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ、（１９８４）　。

８０２、　ｐ、２４　ｅｔ　ｓｅｑ　）］。

本発明は、成熟型ヒト血清アルブミンのペプチド配列と
融合した、トリプシンで切断するための優先部位で終わ
っている（　ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ　）親水性Ｎ−末端
ペプチド伸長部を含有するハイブリッドタンパク質（ｂ
ｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の製造方法であり−Ｃ１
成熟型ヒト血清アルブミンをコードしているヌクレオチ
ド配列に融合した、前記Ｎ−末端ペブチド伸長部をコー
ドしているヌクレオチド配列を含有し、これらの配列の
発現は誘導可能なバクテリアプロモーター（ｉｎｄｕｃ
ｉｂｌｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）に
より制御されるプラスミドの保存を確保することができ
る大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の菌株を培養することを含む
ことを特徴とする方法を提供する。

本発明の方法は、下記の工程： Ｉ　Ｓ　Ａの構造遺伝子かλバクテリオファージのｃＩ
Ｉタンパク賞の最初の６個のアミノ酸をコードしている
６個の追加のコドンを有するように、Ｈ３Ａの構造遺伝
子を生体外で修正しくｍｏｄｉｆｉ’）、次いでこのよ
う修正された構造遺伝子を、生来λバクテリオファージ
のゲノムのｃｌ１ｍ伝子のｍｆにくる（ｐｒｅｃｅｄｅ
）ヌクレオチド配列及び高レベルの転写分確実にするプ
ロモーターに連結することと、Ｃ■遺伝子の最初の６個
のアミノ酸及びそれに続く成熟型Ｈ３Ａ配列から成るハ
イブリッドタンパク質〔“′擬−プロー）ＩＳ　Ａ　”
　（”ｐｓｅｕｄｏ−ｐｒｏ−Ｈ５＾″）］を、前記修
正された遺伝子を含有する宿主バクテリアによって製造
することと、 前記ハイブリッドタンパク質を変性しくｄｅｎａｔｕｒ
ｅ）、還元しくｒｅｃｌｕｃｅ）、次いで再生して（ｒ
ｅｎａｔｕｒｅ）、コンフォーメーションが天然起源の
ＨＳ　Ａのコンフォーメーションと同様な可溶性タンパ
ク買を製造することと、 このようにして製造したタンパク質を、ｌ・リプシンを
使用して、生体外で修正して（ｎｏｄ　ｉ　ｆ　ｙ　）
　面記擬−ブローペプチドを切り出しくｅｘｃｉｓｅ）
そして成熟型Ｉ　Ｓ　Ａを製造すこと、 によって行うことができる。

成熟型Ｈ３Ａは、配列が＾バクテリオファージのａｌｌ
タンパク質の最初の６個のアミノ酸の配列とは異なるＮ
−末端ペプチド伸長部（“擬−プローペプチド″′）、
但し、この伸長部は、融合タンパク質の適切な発現と可
能とし、必要な親水性を有しそしてトリプシンを使用し
て切断するための部位を含ん゛で成るものとする、を使
用することにより得られることも見出だされた。例えば
、“擬−プローペプチド゛は、ペニシリン−アミダーゼ
のシグナル配列の最初の５個のアミノ酸（最初のメチオ
ニン残基か含まれている場合には６個）から成ることが
できる。

以下の説明において、分子生物学で使用される技術用語
の意味は、公知であるものとみなす〔例えば、ジエー、
ワトソン、゛°ビオロジー　モレキュレール　デュ　ジ
ェネパ、フランス版、インターエディジョン、１９７８
　（Ｊ、１１ａｔｓｏｎ、　’ＢｉｏｌｏｇｉｅＭｏｌ
ｅｃｕｌａｉｒｅ　ｄｕ　Ｇｅｎｅ”、　Ｆｒｅｎｃｈ
　ｅｄ已ｉｏｎ、　ＩｎＬｅｒｅｄｉｔｉｏｎｓ、　１
９７８）、参照］。遺伝子（７）　分−ｆ’　生’４’
ｌＩ　学テ最近使用される方法は、例えば、チー、マニ
アチス及び共同研究者１１分子クローニング、コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、ニューヨーク
、１９８２　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅ’ｔ　ｃｏｌ
ｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ
１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ１’ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２）に
より記載されている。

構築（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、遺伝子発現方法、
トリプシンによる゛擬−プローＩｔ　Ｓ　Ａ　”の再生
及び転（ヒについては、以下に引き続いて説明する。

Ａ、−反二ｊ°ローＨＳ　Ａ１皿 例兄１ｒ生検により調製される肝細胞を使用し、例えば
ブイ・グリシン（Ｖ、Ｇ１１ｓ目りら、バイオケミ　ス
　ト　リ　−（ｌ１ｉｏｃｌ＋ｃｍｉｓｔｒｙ）　　（
１９’７　４　　）　　、　　１　４−、ペーノ２６３
３以降、及び７−ル・ディレィ（１＜。

１）ｃｅｌｅｙ）ら、ツヤ−ナル・オブ・バイオロゾカ
ル・　ケ　ミ　ス　ト　リ　−　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅ１１！、）　　（１９７７）　　、２５２、ペー７８
３１０以降によって記載された方法に従って二跣らから
メツセンツヤ−ＲＮＡを抽出する。生検は６Ｍグアニノ
ンチオシアネート溶液で処理され、−２０°Ｃのエタノ
ール中で沈殿操作を数回繰り返し、遠心分離し、この遠
心分離した残渣を再溶解する。：とによって全ＲＮ　Ａ
を精製する。

メツセンツヤ−ＲＮＡ調製物は、エイチ・アビブ（１１
，＾ｖｉｖ）及びビー・レーダー（Ｐ、Ｌｅｄｅｒ）、
プロセソシングス・オブ◆ザ・ナシシナル・アカデミ−
・オブ・サイアンス（Ｕ　Ｓ　Ａ　）　（Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）（１９７２）　、６９、ベージ１
４ｏ８ルロースのカラム−ヒの７フイニテイークロマト
グラフイーを数回性うことによって精製される。この方
法で単離された全ＲＮＡの１〜２％を２むメツセンツヤ
ーＲＮ　Ａは一７０°Ｃにおいて水溶液中で貯、ａされ
る。

全個体群中のヒ１血ｈｑアルブミンに特ゲ４的なメツセ
ンツヤ−１’（Ｎ　Ａのｉ！ｔ’１合を測定することが
できる（例疋ばラビットの網状赤血球溶解物中での少量
のＲＮ　Ａ溶液の生体外での翻シ（によって）。一つの
方法はアメルサム（＾ｎｅｒｓｈａｍ）社によって提供
された赤血球溶解物を使用し、この提供者によって推奨
されるプロトコルに従うというものである。

従って、総ての新たに形７＆されたタンパク貿のうちで
、抗アルブミン抗体によって免疫沈殿（１ｎＩＩｌｕｎ
ｏｐｒｅｃｉｐｉｌ：ａｔｅ）可能な新たに形成された
タンパク貿の７フクシヨンを測定することが可能である
。

例えば、６％オーグーの７ラクノａンが得られる。

２、ｃ片凡人Ａ令貞盈１−火徽孟　ｒのりａ−ニンα、
及跋ｐ１冒υしに ノー・エヌ・ブエル（Ｇ、Ｎ、Ｂｕｅｌｌ）ら、ジャー
ナル・オブ・バイオロゾカル・ケミストリー（１９７８
）、２５３、ベージ２４フ１以降に従う方法を修正した
方法を用い、例えば５月の全メツセンツヤ−ＲＮ　Ａが
、ｐＨ８，３の１００砿Ｍトリス１（Ｃｌ　、１０ｎ　
ＭのＭｇＣ１、、Ｕ、４ｍ　ＭのＤｌ”　Ｔ、２（１ｍ
ＭのＫＣＩ　、０．４ｍ　ＭのＮａビロリン酸、１＋ｅ
Ｍの各ヌクレオチド三リン酸（ｄＮ１’　Ｐ　）　、　
　１０　Ｃ１μｉｖ／ｚｆｌのオリゴ（ｄ　Ｔ）　＋２
−１１（１、５（Ｊ　／ｘｉのリボヌクレアーゼ１ｇｔ
害削、５０ピコモルの放射性トレーサー及び４０単位の
逆転写酵素（ライフ・サイアンス（Ｌｉｌ’ｅ　５ｃｉ
ｅｎｃｅＪ社）を含む最Ｐ−容量５０μ！の溶液中で用
いＣ）れる。

相ｍ　的１）　ＮＡ（ｃＤＮＡ）へのメツセンツヤ−１
りＮ／〜の逆転°ツメ反応は４２°Ｃで１時ｍ続けられ
る。

うＤ　Ｎ　Ａ合・又の耐汗は公知７′７法を用い、酸沈
殿性分１’−ｆａｅｉＪ−ｐｒｑｃｉｐｉｋａｂｌｅ　
　ｂ＋ｏｉｅｃｕｌｅ）への放射性）レーサーの偏入さ
れろ度合を測定ｒる二と（こ、トっでＪｉ−算ご−ｉす
る。

１時開後、ＥＤＴＡ（２０艶Ｍ）の添加によっ゛ζ反応
を停止させ、３時間４２“Ｃにおいて５０Ｉ。

ＭのＮａＯＨでアルカリ性消化（ａｌｋａｌｉｎｅ　　
ｄｉｇｅｓＬｉｏｎ）することによってメツセンツヤ−
ＲＮ　Ａ　全破壊する。

例んばセフ７テ°ツクスＧＩＯ（Ｊ（７アーマシアφフ
アインφケミカルス（Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｉａ　Ｆｉｎ
ｅ　Ｃｌ＋ｅ＋ａｉａＩｉｌｓ）　）カラム上のりａマ
ドグラフィーを用い、新たに形成されたｃ　ＤＮＡを編
入されなかったｄＮ’ｒ’Ｐｓ及びＲＮＡ５のアルカリ
性消化生成物から分離する。１．５μｇの一本頻ｃＤＮ
Ａが５μｇの全メツセンツヤ−ＲＮＡから調ｑｉされる
。

ｂ、莱二９ｊじ簀しく ＤＮＡポリメラーゼｌの“クレノワ″（にｌ　ｅｎｏｕ
＋　）断片の作用を用いて一本頻ｃｌ）ＮＡを二本鎖１
）ＮＡ；こ′攻換する。１ 反応条件は以１・のとおりぐある：　ｐ　ｔｌ　’？の
１００拍へ４の１−１ｅｐｅｓ、１．０　＋ａ＼１の￥
１．Ｃ１，，２゜５ｍＭのＤ　Ｔ’ｆ、７０ｖＭのＫＣ
Ｉ　、（１，５ｍ　Ｍの各ｄ　Ｎ　Ｔ）’及Ｖ　５０　
ｉｉ１位のＤＮＡポリ／ラーゼ１の“フレ／つ″断片（
例えばニューイングランド・バイオラブ入社から市販さ
れている）。

反応を１５時間１５゛Ｃで続け、セ７アテ゛７クスＧ１
００カラムとのクロマドグ２フイーを用いて二本鎖１）
　Ｎ　Ａが編入されてないｄＮＴＰｓから再び単離され
る。

Ｃ９二庫　ＤＮＡのクローニング 一杢鎖ＤＮΔの分子を除去し、フラッシュ末端（／１ｕ
ｓｌ＋　ｅｎｄ）を持つ二本ＩＩ　Ｄ　Ｎ　ＡをＡＭす
るために、エイ・工７ストラヂアチス（＾、Ｅｆｓｔｒ
ａｄｉａＬｉｓＪら、セル（Ｃｅ１ｌ）　（１９’７６
　）、Ｌ１ヘーノ２７９以降に記載された方法に従い、
ヌクレアーゼＳ、−Ｃ不対合配列（ｕｎｐａｉｒｅｄ　
　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を処理する。新たに形成された二
本鎖ＤＮＡ５をスクロースこう配（ｓｕｃｒｏｓｅ　　
ｇｒａｄｉｅｎｔ）中で遠心分離することによってそれ
らの寸法に従って単離する。一般に、ｐＨｌ３．５の５
０偲Ｍのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤ′Ｉ’Ａ、８
００ｍ　ＭのＮａＣ１中でスクロースこう配５％〜２０
％が利用され、１５時間２０°Ｃ１：おいて２１０＋０
００ｇで遠心分離され、こう配の１６分への分画を遠心
分離後にイテなう６検体を公知・ｊ°法の探準ＤＮＡと
≠行して電気泳動にかける、−とよって、各フラクンａ
ン中の分子の・ｒ法を検査し、５００塩基討を越える連
結から成るＤＮＡを含む７ラクシタンを集める。

このｌ）　Ｎ　Ａをクローニングするために、その：３
′末端をオリゴ（ｄＣ）を用いてまず延艮し、二Ａ　ｌ
コ’？−イ丁して、工’７−　ｏソデオン（Ｆ、Ｒｏｕ
ｇｃｏｎ）ら、ノ゛ヤーナルφオブ・バイオロノカル・
ケミストリー（１９７７）、２５−ζ、ベーン２２１）
　９以降のｌｊ法に従い、オリゴ（ｄＧ）を用いてベク
ター・プラスミドｐＢＲ：（２２のＰ：＋ｔ１部位の：
３′末端を延反する。

次いで、例えばエル・ビラ・コマロア（Ｌ、Ｖｉｌｌａ
　Ｋｏｍａｒｏｆｆ）ら、プロツセツシングス寺オブー
ザ・ナショナル・アカデミツク・サイアンス（ＵＳＡ）
（１ソ’／８）、’７Σ、ベーン：３７２　’７以降の
方法を用い、６４ｒ記二本［ＤＮＡをベクター・プラス
ミドにハイブリダイズする。

エヌ・マンデル（ＭｏＭａｎｄｅ　ｌ　）及びエイ・ヒ
ｆ（Ａ、Ｉｌｉ、Ｈａ）　、ノ崎・−ナル・オプ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．ｔｌｉｏｌ、）
　（１９７０）　、５じＬ１ベーノ１５４以降並びにエ
ム・グア７−　）　（Ｍ、１ｌａＨｅｒＬ）及１ニス・
す゛イー・エーリフヒ（Ｓ、Ｄ、１ｉｒｌｉｃｈ）、シ
ーン（［；ｅｎｅ）（１’）７９）、６．ベーン２：（
以降に、紅って記載された方法を用い、前記ＤＮＡＴ火
腸菌を形ｌｌｉ転換することによって肝臓ｃ　ＤＮＡク
ローンの“バンク”　（ｂａｎｋ）　　をつくる。

ｄ、アルブミンｅ　ＤＮＡクローンへ先割その配列がヒ
トアルブミンのタンパク貿配列（ビー・メロラン（ＩＪ
、Ｍｅｌａｕｎ）ら、Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　レメース（Ｆビ
ＩＩＳ　　Ｌｅｆｔ：ｅｒｓ）　　（１９７５）　　、
　５　８−１　ベー　ノ　ｌ５（４以降；エム・グルン
シュタイン（Ｍ、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｌｌ）及びディー・
ホグネス（Ｄ、ｌＩｏ［？ｎｅｑｓ）　、プロセッシン
グス・オプ・ザ・ナシ９ナル・アカデミツク・サイ７ン
ス（ｔＪｓΔン（１９７５）、７ヌー、ぺ一ノ３９６１
以降；アール・ビー・ワレース（ｌ（。

１１．１’１ａｌｌｕｃｅ）ら、：−ユ−り’ｙイフク
・７’、ｙ−ｉＶ・レサーチ（Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１
ｄｓｌｉｅｓ、＞　（１’９　Ｂ　１　）、べ−Ｓｌ　
８　’７９以降）から推論されている合成オリゴヌクレ
オチドを用い、コロニー・ハイ−／　ｌｊ　クイゼイン
ジン法を使用ｒる。

２５μｇ／ｘ１のテトラサイクリンを含有するルリア培
地（Ｌｕｒｉｕ　ｎｅｄｉｕｌａ）上、四角イＩＩＩＬ
中におい一ζ、ニトロセルロースフィルター上で直接こ
ツクローンを９６組培豊する。３７°Ｃ″Ｃｈ生付し、
２５０μｇ／ｙｒ１のクロブムフェニコールの存在下で
増＠　（ａｔｏｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後、コロ
ニーを水酸化テトラ・ンムで７８解し、次いで５　Ｘ　
Ｓ　Ｓ　Ｃ、０、、’、）％Ｎ　Ｌ”　４０、煮沸によ
って変性しそしてすぐに水中で・冷やした１　００　ｕ
　ｇ／　ａｌＩ’＞サケＭ子ＤＮＡ及び０．５ｕ　Ｈ７
ｗ１のキナーゼ処理オリゴヌクレオチドを含有する溶液
中て゛５′−放射性標識オリゴヌクレオチドを用いてキ
ナーゼ処理することによってバイブリグイス゛する。１
８時間３７゛Ｃでノ＼イブリダイゼイン３ンを行う。次
いでフィルターを５×Ｓ　Ｓ　Ｃ中で２５゛Ｃで、次に
３７°Ｃ１犬に４５°Ｃで洗浄し、こｔしをそれぞれ１
５分かけて・を回イ１う。

次いで増感紙を用い１５〜２４時間−７０’Ｃでコｒ２
りＸ　−ＯＭ　Ａ　Ｔフィルムにフィルターを露光する
。プローブとハイブリッドを形成するクローンを再びｔ
ｔｔａｔ、、次いで溶解する。公知方法によりセシウム
クロライドーエチノウムブロミド培地中て゛遠心分離す
ることによってプラスミド［３Ｎ八を精製する。

マキサム・ギルバート法（エイ・マキサム（＾。

Ｍａｘｌｌｍ）及びグブリュ・イルバート（Ｗ、Ｇ１１
ｂｅｒｔ）、メソッズ・エンザイモル（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　Ｅｎｚｙｍｏｌ）　（１９８イ））、６５、ベージ４
９９以降）を用いて挿入１）　Ｎ　Ａの塩基配列を決定
し、そのヌクレオチド配列かＣ２導かれるタンパク質配
列をヒト血清アルブミンのタンパク質配列と比較する。

このようにして、挿入部がヒト血清アルブミン遺伝子の
全体に相当するクローンの紺を同定する。

血清アルブミン遺伝子の制限地図を“ｐ”ｒ　１　［３
１１”、ｐＡＡ３８”及び“ｐ６Ｄ８”で表される最も
代表的な３種の挿入部の位置とともに第２図にボす。

ｅ　、嫉Ａ］Ｌ友−茎Ｂｉｔｌ　　／　　））’　７ｎ
＆ｌＡ（第３図） ｌＩ）プラスミド″、　ｉ’　１　＋３１１″のＩ）　
Ｎ　Ａを酵素１’ｓＬｌ及び１．’ｖｕｌｌで消化し、
血清アルブミン遺伝子の５′末端の配列（アミノ酸＋１
０ｓ、１〜６２）に相当する１２５塩基灯を含むＬ’）
　Ｎ　Ａ断片を＋１１部する。Ｌ３ａａ＋Ｈ１酵素認識
部位から成る付着配列はＰｖｕｌｌ末端に結合する。こ
れによってｐｑｔｌ　　ＨａｍＨＩが調製される。

別個に、ヒト血清アルブミンのアミノ酸をフードするヌ
クレオチドの曲に“Ａ　’１”　Ｇ″　トリプレットを
もち及びＮｃｏ　ＩＩＩＩ限部位全部位、その配列が以
下ノモノ、Ｊｊｌｌ　チ５　’　Ｇ　Ａ　Ａ　ＴＣＣＡ
　′ｒＧ　Ｇ　Ａ１”　Ｇ　ＣＡ　ＣＡ　ＣＡ　Ａ　Ｇ
　３　’　である長さ２１塩基の合成オリゴヌクレオチ
Ｆを調ｙする。

）’ｓ　ｔ　　ｌ　−Ｂｕ　＋ｓ　ＨＩＤＮΔＤＮＡ変
性し、合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。

相補的１）ＮＡｌｌの３′末端が不討介な５’６１．Ｇ
Ａ　ｉ’　Ｇ　ＣＡ　ＣΔＣＡＡＧ３’配列を用いてハ
イブリグイゼインヨンを行う。不討介末端を消化し、次
いでエイチ・ツヤコブセン（１１，Ｊａｅｏｂｓｅｎ）
ら、ユーロビアン・ツヤ−ナル・オブ・バイオケミスト
　リ　−　（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ、）　　（
１９７４）　　、　　４　　！シーー、ベーン６２；イ
以降に従い、ＤＮＡポリメラーゼ１の“クレ／ツ”断片
を用いて５’　、、、　３’　方向に重合を行う。

これによＩ）５′に７ラツシユ末端、Ｎｅｏ１部位、次
ぎにＡ　ｉ”　Ｇ　）リブレット及び３゛にＢａ１１ト
］１を含む断片をつくる。

ｂ）３つの１）ＮＡ断片の連結を打う：１）抗生物貿村
性遺伝子、複製起点およびβ−γラクトシグーゼ遺伝子
の３′末端をもつプラスミド“ＰＬＧ２００″（エル・
グアレンチ（Ｌ、Ｇｕａｒｅｎｔｅ）ら、セル（１９８
０）、−ζ」−、ベージ５４３以降）のＥｃ　ｏ　Ｒｌ
−１３ａ　＊　ＨＩ断片２）ＰＬａｃＬａ上−ター及び
大ｆｌｌ萌の１ａｃＺ遺伝子のリボソーム固定部位（Ｒ
Ｂ　Ｓ　）をもつプラスミド“ｐＧＬｌｏｌ”（ノー・
ラフエル（Ｇ、Ｌａｕｅｒ）ら、ノエイ・モル・アプル
・デネット（Ｊ、Ｍｏｌ、＾ｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ、）　
（１９８１）　、上、ベージ１３９以降）のＥｃｏＲＩ
　　Ｐｖｕｌｌ断片３）ヒトアルブミンの最初の６２個
のアミノ酸をフードする突然変ｙ４涼を与えた（ｍｕｔ
ａＨｅｎｉｚｅｄ）１）　ＮΔ断片 ヒト血清アルブミン遺伝子の５′末端と大腸師のβ−γ
ラクトシグーゼ遺伝子との融合物をつくるプラスミド（
ｐＸＬ５２）　を単離する。

ｒ、完全Ａ伝ヂ・０ノリ＝（第３図） 既に述べた）ｊ法を用い、プラスミド“ｐ６Ｌ）８”ノ
ｉ）　Ｎ　Ａをト：ｃｏＲ１で７胃化し、ＢｇＬＬＩで
部分消化する。大断片Ｅｃ　ｏ　ＲＩ　　ＢＧＩ　ＩＩ
を単離する。これはヒト血清アルブミンの最後の４０５
個のアミノ酸、次にプラスミドの複製起点そしてテトラ
サイクリン耐性遺伝子をコードする配列を金層 ＋ｉｆｊ記のプラスミド”　ｐ　ＸＬ５２”　のＤＮＡ
をＥｃｏ　Ｒ１及び５ａｕ３Ａで消化し、２００塩基討
を含む断片を単離する。

プラスミド’、ＡＡ３８″のＤＮＡを５ａｕ３Δｔ’　
？ｌ’ｆ化し、５４０塩基討を含む断片を単離する。

５ａｕＪ八部位とＢｇＬ１１部位との間の融合性（ｃｏ
＋＠ｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を利用して３断片をスプラ
イスする（　［ｐ　ＸＬ５２−Ｅｅ　ｏ　Ｒｌ−８ａ　
ｕ　３ＡＪ−Ｌ　　ｐ　　ＡＡ３８−８ａ　ｕ　　３Ａ
］　　　［ｐ　　６Ｄ８　　８ｇ１１１−ＥｃｏＲＩ］
の順序）、”ｐＸＬ５３”と呼ばれるプラスミドをｒｆ
ｉｌ製する。この構造的な貿は挿入部とベクタープラス
ミドとの間の接合部に相当するＥｃｏＲＩ及びＰｓＬ１
部位の〔］に含まれる断片の完全配列によって制御され
る。

完全なヌクレオナト配列と講専されるタンパク貿配列と
を第４図及び５図に示す。

この配列と刊行されたタンパク質配列（ビー・メロラン
（Ｂ、Ｍｅｌｏｕｎ）ら、ＦＥＢＳレタース（１９７５
）、旺、ベージ１３４以降；エム・ディホ７　（Ｍ、Ｄ
ａｙｈｏ［ｆ）　、アトラス・オブ・プロティン・シー
フェンス・アンド・ストラフチャ−（＾Ｌｌａｓ　ｏｆ
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ）　（１！Ｊ’７８）、５、付録３、ベー
ン３０６）との間に観察される変化を以ドに示す。

１；３１　グルタミン　　グルタミン酸３（３４ヒスチ
ジン　　アラニン ３６７　チロシン　　　ヒスチジン ３７（）　アラニン　　　チロシン ３８１　バリン　　　　メチオニン ４６４　グルタミン酸　ヒスチジン ４６５　ヒスチジン　　グルタミン酸 ５０１　グルタミン　　グルタミン酸 ３．１１１！　ニル　　　ル　≧ン　１区１発し庚。

ａ、ラムダ・バクテリオ７アーノのプロモーター・ＰＬ
″の使用 プラスミド”ｐＸＬ５３″を、考慮されている開始コド
ンの５′位置のＮｃｏ１部位のみを酵素Ｎｅｏｌで部分
消化することによって線状にし、７−ルー、ｌＴ−ムー
’７−テ／Ｉ／（Ｒ，ＭＪａｒｔｅｌｌ）及びグプリｘ
６エスー１／ズニ：＋７　（Ｗ、Ｓ、Ｒｅｚｎｉｋｏｆ
ｆ）、シーン（１９８０）、ル、ページ３０フ以降）の
方法に従って充てん（ｆｉｌｌ）することによって７ラ
ツシーＬｒａを形成する。

５′位置にＢａｍＨ［の如き制限酵素のための認識部位
に相当する配列、そして次にリボソーム固定部位に相当
する配列（′コンセンサス″’（ｃ。

ｎ５ｅｎｓｕ！り又は“セオレチカル″（ｔ）＋ｅｏｒ
ｅＬｉｃａｌ）ＲＢ　Ｓ　）を含む“アダプター″（ａ
ｄａｐｔｏｒ）を合成する。７グブタ一配列は５’　Ｇ
ＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＡＡＣ３’である。

フラッシュ端を含むＤＮＡの５′位置の７グプターの連
結は、例えばシー・ビー・バール（Ｃ，Ｐ。

Ｂａｈｌ）　ら、シーン（１９７６）、１．ページ８１
以降に記載されている。

その方法は、５０ｍＭのトリスＨＣＩ　（ｐ　Ｈ７゜５
）、１０ａ＋ＭのＭｇＣ＋　□、１５ｍＭのＤ　Ｔ　Ｔ
　。

１ａ＋ＭのＡ”ｌ’ｌ）１５０μｙ／ｘｉのアゲブタ−
１２０μｙ／ａ１のＩ）　Ｎ　Ａ及び１単位のＬ’）　
Ｎ　Ａ−リ〃−ゼにニーイングランドバイオ２１社）を
含む溶液２０μｌで反応を行うというものである。反応
は１０時間１５℃で続けらｈる。この連結によりＮｃｏ
１部位を欠失することなくＢａｍＨｆ部位を創製する。

連結生成物をＢａｍＨ［、そしてＨｉｎＤｌ［ｌで消化
する。ヒト血清アルブミン遺伝子の３′位置にＨｉ　ｎ
　ＤＩＩ［部位が存在するために、全フード配列を含む
ＤＮＡ断片が調製されるに のようにして調製さｉたＨｉ　ｎ　Ｄ　ＩＩＩ　　Ｂｑ
　＋ｎＨｌ断片を、既に記載した方法に従って、例えば
”ｐＢＲ３２２”において大腸菌を形質転換させること
によってサブクローン化（ｑｕｂｃｌｏｎｅ）　　Ｌ、
プラスミｌ’“ｐＸＬ６１”　を調製する。

プラスミド″ｐＸＬ６１″はプロモーターを含んｒない
。

ラムダ・バクテリオファーノのプロモーター“Ｐ　″を
そのヌクレオチド配列が公知（エフ・すし ンｌｆ　−（Ｆ、Ｓａｎｇｃｒ）ら、ツヤ−ナル・オブ
・モレキュラ〜・バイオロジー（１９８２）、１Ｇ２、
べ−ノ２７９以降）のバクテリオ７アーノ染色体の８Ｆ
？ＬＩＩ？ｆｌＳ位とＢａｍＨ１ｌ’ＦＩＳ位との開（
イー・ノバルスキ（Ｅ、５ｚｙｂａｌｓｋｉ）及びグブ
リュ・ソバルスキ（Ｗ、５ｚｙｂａｌｓｋｉ）　、ジー
ン：１９７９）、Ｌ、ベージ２】７７以降）に配置され
ている。この断片はクローン化され、その制限部位は公
知方法１こよっでイ１正することができる。

Ｐ　をもつプラスミドはりプレッサー遺伝子Ｃ［をもつ
大腸菌株中で増殖する必要があり、これほこのプロモー
ターか構成的に発現されないようにするためである。

最初の構築において、Ｐ　はプラスミド“ｐＰＬ−ラム
ダからＢａｍＨＩ断片（７アーマシア・ビー・エル・バ
イオケミカルス（Ｐｈｕｒｕａｃｉａ　Ｐ。

Ｌ、ＩｌｉｏＣｂｅｍｉｃａｌｓ）　）の形態で人数ａ
ｊ詣である。プラスミド“ｐＸＬｆｉｌ”のＢａｍＦ１
１部位にこの合、ヒト血清フルブミンのだめの構造遺伝
子に対するプロモーターのノｊ向が正しいことが確認さ
れる。

入手可能なプラスミドから他の構築物をｌ１ｉｌ製する
ことができる。例えばプラスミド“ｐＰ　−ラムダ゛が
らプロモーターＰ　を含むＨａｅｌｌｌＨｔＬｅ　ＩＩ
Ｉ断片を切り出し、これを例えばプラスミド“ｐＵＣ８
”（ノエー・ベイラ（Ｊ、Ｖｅｉｒａ）及びジェー・メ
ッシング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、）　−７（１９８
２ン、−ム」−、ベージ２５！〕以降）の如きプラスミ
ド上に担持されたマルチサイトクローニング配列（ｍｕ
ｌｔｉＳｉｔｅ　ｃｌｏｎｉＢ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）の
ＳｍａＪ部位に挿入し、プロモーターの５′位置にＥｃ
。

Ｒ１１位がＪるｐ　Ｕ、Ｃ８、Ｐ　　”　ヲＲ’Ａｌｔ
　７Ｊ。

し プラスミド“ｐｐｓｉ”（ビー・サル；エントス（Ｐ、
５ａｒＩＩＩＩｅｎｔｏｓ）ら、セル（１９８３）、３
２工、ベージ１　：（３’７以降）で出発すると、Ｎｄ
ｅＩ部位に最ち近いＨｉｎｔ）Ｉ１１部位をまず破壊し
く：（図）、次イｉ？Ｅｃ　ｏ　ＲＩ　　Ｈｉ　ｎ　Ｄ
ｌｌｌｌｌｌ全断片方はプロモーターＰ　を含むプラス
ミド“ｐ　ＬＪＣ８−１°Ｉ７”０）・二・・Ｒ１−＋
ｔ・・Ｈ１新片と・らう片フッは血清フル１ミン遺イ二
子を含むプラスミド“ｐＸ　Ｌ、　６　］　”のＢａｍ
ＨＬ　　ＨｉｎＤｉｌｌ斬片と置換することができる。

これにより、組み立て体、即ち“Ｐ　−“フンセンサス
″ＲＢ　Ｓ　−Ａ　ＴＧ−ヒ１゜ ト血ざＩアルブミン遺伝子９がＥｃｏＲＩ　　ＨｉｎＤ
　Ｉ！＋　１）　Ｎ　Ａ断片上にに担持されたプラスミ
ド”ｐＸ　Ｌ　７０″調製される。

その配列及び開始部位が公知のラムダ・バクテリｔ７ｙ
−ノのｃ　ＩＩ遺伝Ｆを有効１こ翻舐する−とができる
（イー・シュワルツ（Ｅ、Ｓｅｔ＋ｖｇｒｚ）ら、ネイ
チャー（Ｎａｌ：ｕｒｅ）　（１９７８）　、　ｇ　７
堅工、ベーン４１（）以降）。

発現系“Ｐ　”プロモーター　ｃＬ［ＲＬ３Ｓ−１゜ Ａ　ＴＬ；　−Ｉｌｌ清アルブミン遺伝子”を含むプラ
スミドを構築する。

例えばＩＪ　Ｕ　Ｃ８Ｐ　Ｌ　’のＢａＩｆｉ８１部位
を８１酵素の作用で破壊（エイ・ノヱー・ベルク（八。

Ｊ、Ｂｅｒｋ）及びビー・、、！−イ・シャープ（ｐ、
＾、ＳＩ＋ａｒｐ）、セル（１９７７）、１虹、ベージ
７２）後、Ｐ、、プロモーターを含むｆ：ｃ　ｏ　Ｒ（
［（ｉ　ｎ　Ｉ）　［１１ＰＭ片を単離し、次いて゛こ
の断片をプラスミド“ｐＤＳ２（）″（ノー・デスタ−
（Ｇ、Ｄｕｃｓｔｅｒ）ら、セル＜＋９８２）、エル、
ベージ８５５以降）のＥ（二ｏＲＩ　　ＨｉｎＤｕｌ大
断片に連結し、プラスミド“ｒ＋ＸＬ７３”を、ｌｉｌ
製することができる。

ｃ　Ｉｔ　ａ伝ｆ）ＲＢ　Ｓ　ヲブラスミト”　ｐ　Ｆ
’Ｓ　１”から抽出する。このプラスミドをＮｄｅ［″
Ｃ消化し、フラッシュ末端を形成した後にＢｕＩａＨｌ
アゲブタ−を挿入する９次いで＋＜　Ｓ　Ｓをト１ｉｎ
ＤＩｌｌ−ＢａｍＨ１断片の形態で切り出す。

Ｈｉ　ｎ　Ｄｕｌ　　Ｂｕｍ　Ｈ［断片をプラスミド“
Ｉ］ＸＬ７３”のＨｉ　ｎ　Ｄ［ｆｌ−Ｂａ　１ＩＩＨ
ｌ大断片に連結し、プラスミド”　ｐ　Ｘ　Ｌ　８８　
’　をまず摺染する。

新ｒこなプラスミド“ｐＸＬ８８”においては、Ｃ１１
＜　Ｂ　Ｓが［）　プロモーターに肘してｊ腹当な方向
り に挿入され、マルチサイト系の全体においてＰＬｃｒｌ
ＲＢｓ組み立て体が５７８塩基討から成るＥｃ　（ｌ　
ＲＩ　　Ｂａ　ｍ　ｔ（Ｉ　ＤＮＡ断片上ｔこ担持され
るようになっている。

Ｂｕｍ８１部位の後にβ−〃ラクトングーゼ遺伝子（Ｌ
ａ　ｃ　Ｚ）をもつプラスミド・ｐＭＣ・１４０３”　
（エム・ノエー・力サグパン（Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂ
ａｉ＋）ら、ジャーナル・オプ・バクテリオロノ−（，
１，１ｌａｃｔｅｒｉｏ１．）　（１９８０）　、ＬＡ
１、ベーン９゛フ１以降）のＥｃｏＲ１部位とＢａｍＨ
［部位との闇でこの５７８塩基討をサブクローン化する
。

この構築により、’　Ｐ　　　ｃ　［ＩＲＢＳ″系の制
御り の下でβ−がラクトシダーゼ遺伝子を発現するプラスミ
ド″ｐＸＬ９１″が導かれる６ 前記のプラスミド″ｐＸＬ６１”のＢａｍＨ（−Ｂｇｌ
１１断片をプラスミド“ｐＭｃ１４０３”のＢａｍ８１
６１位においてサブクローン化する。

（１３ｄωＦ１１部位におけるＢｌ？ＬＩＪ部位の連結
は１ｆ能であるが、Ｂｇｌ、■でのｔ３ａ　ｍ　ｔ−１
１による切り出しはもはや可能ではない；従って一つの
Ｂ　ａｍ８１部位のみが残る）。

この１５により（“ｐＸＬ７１”）、“）３ａｍ）１１
−１　”　＝ｙフンン４ｆｌ”　ＲＢＳｊ　−Ａｉ’Ｇ
−Ｎｃｏｌ−血清アルブミンの部分遺イム子（アミ７竣
１〜２１８をコード゛「る）−β−がラクトシグーゼ遺
伝子”の配列を含んで成る７００塩基討のｌ）　ＮＡ断
片が挿入されるに のプラスミドはＢａ田１−１１及び５ａｃｌ（この５ａ
ｃｌ部位はβ−〃ラクトシグーゼ遺伝了中に存在する）
を用いて切断され、！官記プラスミド“ｐＸＬ９１″に
前から存在するＢａｍｔＩｉｓｕｃ　　１ｍ片の場所」
こ挿入される。

今度は、この生成物は次の構造、即ち“Ｅｃ。

）（］部位−Ｐ　　−ｃ　ＩＩ　Ｌ＜ＢＳ−Ｈａ　ｖ　
Ｈ１％位−１゜ “コンセンサス″ＲＢＳ−Ｎｃ　ｏ　ｌ　？ｆｆ１位−
ＡＴＧ−血清アルブミンの部分遺伝子−β−〃ラクトシ
グーゼ遺伝子”を挿入部にもつプラスミド“ｐＸＬ５３
７″である。

プラスミド″ｐＸＬ９’ｌ″をＢａｍＨｔで消化し、開
始コドンに近いＮｃｏ　丁部位についてのみｆｆ慮し、
Ｎｃｏ［で部分消化し、ヌクレアーゼＳ１の作用でフラ
ッシュ末端を形成し、次いで再び閉環される。この抛１
乍により一方において“フンセンサス”Ｒ）３　Ｓ　ｌ
）　Ｎ　Ａ配列が除去され、他ＨにおいてＩｆ［Ｌ清ア
ルブミン配列をもつ相にｃｌｌＲＢｓのＡＴＧが配置さ
れる。

これ（こより’　Ｅｃ　ｏ　Ｒｆｉｔｓ（立−Ｐ　　−
ｅｌ［ＲＢＳ　−Ａ　ＴＧ−血清アルブミンの部分遺伝
子−β−〃ラクトシグーゼ遺伝子”の配列を含んで成る
プラスミド″ｐＸＬ１３６″が調製される。

血清アルブミンの部分遺伝子はＰｖｕｒ１部位をもつの
で、プラスミド”ＬＩＸＬ１３６”をＥｃ。

Ｒｌ　ｇＬＩｊＰｖ　ＩＪ　ｌで消化し、７６０塩基月
断片を抽出し１、そしてこれをｌ１ｉｉ記プラスミド“
、　Ｘ　Ｌ　’７（）”のｌＥｃ　ｏ　ｌ＜　ｌ　Ｋ６
位とＰＶ　ｕ　　ＩＩ　ｆｆ６位との間ｔｘ　ｈｔ＋人
する。これにより、プラスミド“（＋　Ｘ　ｌ−７０”
のｋうに＠１ｃｏＲｌ　　ｌＩ＋　ｎ　Ｌ）　１１１Ｍ
片とに“Ｐ。

ｅｒｌＲＢｓ−完全血清アルブミン遺伝子”の構造を担
持し、ｃ　ＩＩ遺伝子のＲＢＳ　ｌこよる“コンセンサ
ス″ＲＢＳ置換を有するプラスミド“ｒ＋ＸＬ１３６”
が調製される。

・ｎｊ記プラスミド“、　Ｘ　Ｉ−１３９”をＰしプ・
モーターとｃＩＩＲＢＳとの間のＳａｌ、１部位のみに
おいて区分する（ｓｅｅ　ｔ　ｉ　ｏｎｅｄ　）。この
Ｄ　Ｎ　Ａを酵素Ｂａ１．Ｊｌで消化し、その結果ｃ［
Ｒ）ＪＳの５′位置におけるＬｌ（１転写末端部位を消
化し、次いでＨｉｎＤｌｌＩアゲブタ−を加え、ｔ［（
１から切断されｊこｅｌｌＲＢｓ及びヒト直情アルブミ
ン遺イム子の最初の３５７コドンを含む）ｆｉ　ｎ　Ｉ
）　ＩＩＩ　　Ｘｂ　ｕＩ断片を単離する。このＤｉ　
ｎ　Ｄ　ＩＩ［Ｘｌ＋　ａ　　Ｉ断片の一方をヒト直情
アルブミン遺伝子の末端を含むプラスミド″＋１ＸＬ１
３９″のＸｂａｌＥｃｏＲ１断片と連結し、飢りを１輌
１ｍＦ（１部位破壊後ｉニブラスミド“ｐＵＣ８−β−
”　　”から２：）らバる［７ １）　プロモーターをらつに；ＣすＲｉ　　１ｌｉｎ！
０１月Ｉ。

断片と連結ｆろ、ブラスミ［Ｉ＋　Ｘ　ｌ　、’（２１
”　Ｈま二の、Ｌうにして調製りれる。

４　、１−ｆｆＪ−−ブｌ：１−Ｈ３Ａ”のための　現
プラスミＬへ仇灸 第６Ａ図に示される構造を有する２つの合成オリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーションによってＩ）　Ｎ　
Ａ断片を構築する。この配列は開始コドン“Ａ　”「Ｇ
　’及ゾその後にラムダ・バクテリオ７アーノｃ　ＩＩ
遺１ム子の最初の６コドンを含む。この断片は）（ｉｎ
ｌ）Ｉｌｌ型付着末端を一方に、５ａｌＬ型付着末端を
他方−二もつ。この合成断片をＭ１３ｎｐｌＯベクター
（ノエー・メッシング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メンッ
ズ・エンサイモル（１９＋＋４＞、１０］、ページ２０
以降）のＨｉ　ｎ　ＤＩＩ［と５ａｌｔ部位との間でク
ローン化する。得られたバクテリオ７アー）により感染
した細胞からＭ製した複製型ＤＮＡｆｅ：次の構築段階
で使用する。

ＨＳ　Ａをコードする遺伝子（ｃｌ）ＮＡ）の初め（ｂ
ｅＨｉｎｉｎｇ）を含むプラスミドｐＸＬ３２４から得
られた°７Ｇ５堪−Ｓ、を寸のＳａｌｌＢｇｌｌｉ断片
をこの組換えバクテリオ７７−ノ中でクローン化する。

大１１！ｌｌｆｆｉＪＭ１０１株をこの新たなバクテリ
オ７アーノで感染させ、５時間培養したその上澄み衣を
Ｍ２Ｓ型の線状７アーノに特徴的な一本領ｊ〕ＮＡを含
む７ア一ノ粒子源として使用する１次いで、例えばジエ
ー・ビー・アデルマン（Ｊ、Ｐ、Ａｄｅｌｗａｎ　ｌら
、ＤＮＡ（１９８３）　、Ｌｌ−＜−ノ１８３に記載さ
れた方法に従い、ｃ　ＩＩ遺伝子の６番目のコドンと成
熟型Ｈ８Ａ（ＧＡＴ）の最初のコドンとの間に含まれる
配列を除去することを可能にクスとしてこの一本鎖を使
用する。この指示された変％誘発に使用されるオリゴヌ
クレオチドを第（５１３図に記載する。得られた７アー
ノは新たな融合遺伝子の初めを含む。続く構築に使用さ
れる１）Ｎ　Ａ　断片の構造はエンザイム・シーフェン
シング法（ｅｎｚｙｒａｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａ
＋ｅｔｂｏｄ）を用いて確かめる（エフ・サンが−ら、
プロセツシングス・Ｔブ・ザ・ナシもナル・アカテ゛ミ
ック・サイアンス（ＵＳＡ）（１９７７）　、７支、ペ
ージ５４６３）。

次【こ′擬−ブロートＩＳＡ″融合物をコードする完全
遺伝子の再構築を行つ。アンピシリン耐性遺仏子、複製
起点、軟写ターミネータ−及びＨ８Ａをコ・−ドするｃ
　ＤＮＡの一部をｔむベクターを、プラスミドｐＸＬ７
０を制限酵１ＥｃｏＲ１及び］、）ｖ１１１で処理する
ことにより調製する。約７２（）０堪基討を含む断片を
７がロースデル電気泳動及び電気溶出（ｅｌｅｃＬｒｏ
ｅｌｕｔｉｏｎ）により精製する。

Ｐ　プロモーター及び修正したｃ　１１遺伝子リボン１
、 一部（ＲＢＳ）上の付Ｎ部位を含む４；３０塩基討断片
を、プラスミド“、ＸＬ３２４″をＥｃｏＲＩ及びＮｄ
ｅ［酢索″Ｃ消化し、アガロー電気ル電×泳動及び電気
溶出を用いて精製する。ｄｌｌ−Ｈ８Δハイブリッド遺
伝子の初めを含む２００塩基討のＮｄｅｌ−Ｐｖｕｌｌ
断片を、何記した生体外て゛の変異洟発により修正され
た組換、１−Ｍ１３バクテリオ７アー）のＰＭ、製型分
子からＮ製する。３個のパートナ−（ｐａｒｔｎｅｒ）
の連結反応を打う。得られたプラスミドを“ｐＸＬ、４
６２″とｌＩ”Ｐ　Ｊ：　（第７図）。

プラスミド″ｏＸＬ４６２”を形竹虻浄本用いて６８１
９株に導入する。この株は、プラスミドｐ　ＲＫ２４８
ｃ　ｌ　Ｌ　ｓ　（エイチ・ニー・パーナート（Ｉｆ−
Ｌｌ、１（ｅｒｎａｒｄ）ら、シーン（１９７９）、ペ
ージ５９以降）により形１！Ｌ転換さ九たＥ　１０３９
株（エル・シモン（Ｌ、ＳＩＭＯＮ）　、ワークスマン
・インスチチュート・ホ・ミクロバイオロノー（ｗａｋ
ｓｍｕｎ　１ｎｓＬｉｔｕｊｅ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏＨｙ）　、　Ｏット〃−スーザ・ステイト・ユ
ニバーンナ−（１（ｕｔｇｅｒｓ−ｌ’ｌ＋ｅ　５Ｌａ
Ｌｅ　１Ｉｎｉｖｅｒｓｉ１．ｙ）　、ビス力タウｚ−
（Ｐｉｓｃａｔａｍａｙ）　、エフ・ノエ−（Ｎ、Ｊ、
）　、Ｕ　Ｓ　Ａ）に由来する。このプラスミドは’ｐ
ＸＬ４６２”　と適合的（ｃｏａ＋ｐａｔｉｂｌｅ）で
あり、ｉＪしプロモーターの熱感受性レプレッサーをフ
ードするラムダ・バクテリオ７アーノの０１遺伝子を担
持する。事実、このレプレッサーは３８．５°Ｃ以上で
不活性となる。調製された株はＮｏ、Ｇ　１３９８を有
する。

プラスミド、Ｉ　Ｘ　＋−４６２で出発ｒると、Ｅｃ。

Ｒｌ　−Ｈｉ　ｎ　Ｄｌｌ［制限断片上に含まれるＦゝ
１４プロモーターが種々の誘導可能なバクテリアのプロ
モーターと置換された池のプラスミドが構築されろ。

これらのプラスミドの構築には、ｐＸＬ４６２の一つし
かないＸｂａｌｆｆＫ位及び前記の型の；（つのパート
ナ−の連結反応が用いられる（第°１図を見よ）。本発
明は用いられるバクテリアのプロモーターの型には依存
しないので、Ｐ　プロモーターし を担持ｒるプラスミドｐＸＬ４６２の場合にのみ以ドの
明細書でさ及されるに取ろう。

萌以て３０°Ｃでインキュベートした、５０μｇ／ｚ（
ｌｔｎ７ンビシ’）７（ｐ　ＬＢＡ）　をｔｔｔＬＢ培
地をベースとする寒天ゲルを有虹るペトリ皿中”Ｉ？Ｇ
１３９１＋株をまず再単離し、＋ｉｒｊ培寮物を同じ培
地でｌ　＋）　０　（ざシこ希釈し、ａ！押しながらこ
の培養物を３０　’Ｃでインキュベート仁る。ｆ３１Ｏ
ｒ＋ｍで、読んだ吸−尤度が１．０に達したとき、攪拌
しながら培養物を９（）分間４２“Ｃに加熱する。

２、．１Ｊ３Ｌｆｉ処理、ｃ　ｌｌ−ＨＳ　ＡｎｌＬ！
Ｉｕ遠心分ｉ後に集めた細胞ベレットを容積１／３０の
ＰＢ、Ｓ（０，２ｇ／Ｌ＋７）ＫＣＩ　、０．２ｇ／ｈ
ｎＫＨ２Ｐ　Ｏイ８ｇ／βのＮａＣ１及び１．２５ｇ／
ＮのＮ　ａ　２）Ｉ　Ｌ’　Ｏ、）中で再懸濁する。濃
度１す／ｚｆｌの卵白リゾチームの存在下、２０°Ｃ程
度の温度で１５分間インキエベート後、例えばブランン
ン（Ｂ３０型＞ｍ音波処理機を用い冷却しながら６分間
を２回に分けて連続的に行うことによって、バクテリア
をＯ’Ｃ”Ｃ’ＮｉＲ波処理する。不溶性７ラクンヨン
を１！）分間４　’Ｃ！：　Ｂ　イテ１２　＋　０００
　ｇ　”Ｃ”遠心分離することによって集め、次いでＰ
　ＨＳで洗浄し、１５分間３０°Ｃ′ｃ減圧下１こ乾燥
する。

３、支にいｊｔ友友り肌１ １１！の培養から得な不溶性生成物を含む位音波処理ベ
レットを・ｔバの変性及び遠九音欣（６Ｍのグアニノン
ー）（Ｃ１，Ｏ，ＩＭのＫ　Ｆ（、ｌ：’○、（１）Ｈ
７，５）、（１，ＩＭのβ−メルカプトエタノール）に
収る。このようにしで調製した懸濁液を１（５時間４“
Ｃにおいて密閉チューブ中で穏やかに振とうする。次い
で実質的に透明な溶液が得られる。少量の不溶解沈殿物
を遠心分離によっ′Ｃ除）ぐする。

上澄み液の１／１００希釈液をＩ与生溶液（５０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ８，５）　、１００ｍ　Ｍの
Ｎａ　Ｃ１，１ｎ＋　Ｍのｌ−、Ｄ　１”　Ａ　＞中に
入れ、コノ混合物を２４時間４°Ｃに放置する。次いで
この溶液を遠心分離してやや白い蛋白光物質を除去する
。

調！ｉ！された上澄み液を限外濾過（３０，０００グル
トンの“除外″（ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有するメンプラン
、ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）　ＣＳ　−３０−同
州の限外才濾過単位）により約１００倍に濃縮し、遠心
分離により再び透明化し、次いで２０ｍＭのリン酸（Ｎ
ａ　）ｔｌｍａ（ｐ　）（７，５）に対して透析する。

このようにして調製されたｃｌＪ−Ｈ３Ａ融合タンパク
質（擬−プローＨ８Ａ）はＳ　Ｉ）　Ｓざりアクリルア
ミドデル電気泳動による分析に従い９０％以上均一であ
る６ ４、ｙ／ｊＪ　ＱＨ８Ａｚｎｃ　ＩＩ　　ＩＳＡの変１
トリプシン溶液（例えばボエ７リンガー・マンハイム（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から市販さ
れている分析用の凍結乾燥トリプシンから調製される）
を反応溶液中で調製する。５０／ＪＭのＣａ　Ｃｌ　２
とともに、５０ｍＭのリンＰＩ！（Ｎａ　）　４１ｆｌ
ｊｆｔｋ（ｐ８７．５＞中、３　ｆ）〜６０分間３７°
Ｃで、例え１！ｌｘｙ／ｘ１オーダーの濃度において、
ｉ　／　Ｓ　＋　ｏ　ｔ）０と１　／　１　、　ｌ）　
０１）の間のトリプシン量（ＩＳＡの質鷺に討して）で
ｅｌｆ−ＩＳＡを処理する。

５、坊ｆ’４旦丸食− 変換反応は変性しないポリアクリル７ミドデル上でトリ
プシンを使用して行うことができる＜ｆ５８図）。Ｎ−
末端のへキサベプナド中に幾つかの陽性に帯電したアミ
ノ酸が存在するために、この型のゲルではｃｌ−ＩＳＡ
の？ｌｉ′Ｘ泳動での移動が天然のＨＳ　Ａよりも遅い
。第８図は、市販のＨＳＡが、使用される濃度範囲内で
トリプシンによＩ）顕著には修正さｔしないことを示す
。−ｈ、トリプシンの作用により、市販のＨＳ　Ａと一
緒に移動する号子にｃｌ−ＩＳＡが変換される。このト
リプシン修正タンパク貿のＮ−末端配列は工ＩＩマン分
解により調べられ、得られた結果からタンパク貿加水５
）解部位が、Ｌｙ　ｓ　−Ａｒ　Ｈノベプナドの後のハ
イブリッドタンパク質のｃｌｌｆｌｌｓ分の末端に位置
していることが確認される。このようにして生じたタン
パク貿はＮ−末４残基としてアスパラぞン酸を含む；従
って天然源のＩ−Ｉ　Ｓ　Ａとこれは同一である。　プ
ラスミドｐＸＬ２８８°゛の構築は２００　、５９０号
として出願会社の８萌で刊行されているヨーロッパ特許
明細書ＥＲ８６／４００゜６１８．４に記載されている
。適当な大腸菌株に導入後、このプラスミド（ｍ９図）
は、生体内で成熟してない、大腸菌のペニシリンＧアミ
ダーゼ（ＰＡＭ）（ｌΣｃ：３．ｓ、１ｘ：ペニシリン
、アミ／ヒドラーゼ）のシグナルペプチドと成熟ＨＳ　
Ａ型との間の融合物から成るハイブリッドタンパク質を
尚レベルで発現させる。

プラスミド”、Ｘｉ、２８８″は、ＰＡＭプロセーター
の上ｙｔの大腸菌のトリプト７アンオベコンのＰｌ：ｒ
ｏプロモーター、ＰＡＭ遺伝子のリボンーム同定化部位
、ＡＴＧ開始コドン及びＨ３Ａの構造遺伝子と融合する
ＰＡＭシグナルベブナドのヌクレオナトを含むことを特
徴とする。

ｉ’　Ａ　Ｍのリーグ−ペプチド（１ｅａｄｅｒ　ｐｅ
ｐｔｉｄ＠）のＮ−末端は５個の塩基性アミノ酸の配列
を含むにの塩基性度は分泌シグナルペプチドの一般的な
特徴の一つを形成する（エム・イー・イー・ワト７　ン
（Ｍ、Ｉ：、、Ｅ、ＷｕＬｓｏｎ）　、ヌクル・アシッ
ド・レス（Ｎｕｃｌ、ΔＣ１ｄｓ　１（ｅｓ、）　、　
１４、ベーノ５．１４５以降）。今回、このシグナルペ
プチドの最初の６アミ　／ｍ（Ｍｅｔ　　　　Ｌｙｓ　
　　　Ａｓｈ　　　　Ａｒｇ　　　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ
−１”）’ＡＭ１．”）が“擬−プロ１配列として作用
しうろことが見出だされた。

最後に、前記オリゴヌクレオナトー指示すブレ・フシ３
ン法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｃｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄ　５ｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｌｅｃｈｎｉｑｕｅ）
を用いて成熟型Ｈ３Ａの配列に“１’　Ａ　Ｍ　１”配
列を正確に融合するために、ＰＡＭのリーグーペプチド
のアミノ酸７〜２６に相当するヌクレオチドを除去する
（第９図）。このサブンッシランの作動を可能にＶるオ
リゴヌクレオチドを第１１Δ図に示す。次いで修正され
た配列はプラスミド″ｐχ１．２８８″中で置換されて
以下の構造を有するプラスミド″ｐＸＬ６４１”が得ら
れる：　’　Ｅｃ　ｏ　Ｒ１−Ｐｔ、　ｒ　ｐ　−３ｕ
　ｌ　　］、　−１，ＰＡＭプロモーター　Ｐ　ｔ’、
　Ｍ　　ＲＢ　Ｓ　　Ｋ’　Ａ　Ｍ　１をフードするヌ
クレオチド配列Ｊ−Ｈ８Ａ遺伝子”。

ビー・カーター（Ｐ、Ｃａｒｔｅｒ）ら、ヌクル・アシ
ッド・レス、１　！３８５、■、ベーン４４３１以降に
よって記載された方法に従い、バクテリオ７アーノＭ１
３ｍｐ１８ａｍ■でサブクローニング後、オリゴヌクレ
オチド−指示変異誘発によってｉｆ　ＰＡＭＩ″配列の
２つの透導体が構築される。この変ｙ４誘発をＩＩＩｆ
能にＣるオリゴヌクレオチドを第１１ＢしＪ及び］、Ｉ
Ｃ図に示す。再構築後、”　、１）　Ａ　Ｍ２　″　　
（ごイｅｔ　　　　　　Ｌｙｓ　　　　　Ａｓｎ　　　
　　　Ａｒ）（ＬｙｓＡ　ｒＥ　−；　　プラスミド″
ｐＸＬ７４０″）及１“■〕ｌ＼Ｍ、’（’（Ｍｅｔ　
　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　ＡｒｇＬｙ　ｒ＋　　　Ａｒ　
１（−；　プラスミド’ｐＸＪ−７４１”）をコードす
る配列を含むプラスミド“ｐＸＬ６４４　”に類似する
２つのプラスミドが得られる（第１０図）。

プラスミド’、Ｘ１６４１″、’ｐＸＬ７４ｆ）”ａ［
”、ＸＬ７４１″を大Ｈ菌５４１２５（ハスツール・イ
ンスチチュート会コレクション（ＰＩｌｓｔ、ｅｕｒ　
１ｎｓｔｉ１．ｕｔｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　）の
如き適当な大腸菌゛株に導入後、ヨーロッパ特許明細書
Ｅ　ｌ）　８６／　４００　、　Ｅｉ　１８　、４　（
２００、５９＋）　）に記載の条件で行うと、６１０ｎ
ｍの吸光度１について培地の５〜１０　ｍｙ／　ｌのオ
ーダーの割合でそれぞれハイブリッドタンパク′αＰＡ
Ｍ　１−Ｍ３　ＡＳ　ＰＡＭ　２−　ＨＳ　Ａ及び］）
　Ａ　Ｍ　：う−ＨＳ　Ａを産生する株が得られる。

細１ｆ（溶解物の不溶性７ラクシシン１こハイブリッド
タンパク質が見出だされ、こｒしは前記方法を用いて丙
生じ、部分的に１１！製することができる。１１１記条
件の下でトリプシンの最適語厚物により透導された消化
によって成熟型ＨＳ　Ａに再生後に得られるハイブリッ
ドタンパク質の各を変換ｒることができる。

ブタベスト条約の規定に従い、セントラル・ブー・ビュ
ーロー・ンメルカルチャ−（Ｃｅｎｔｒａａｌ　ｌ−１
ｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　５ｃｈｉｎ＋ｍｅｌｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ）　（ＣＢ　Ｓ　）　（オフング国、バーン市、
オオスターストラート［３７４ｆ）Ａ　　Ｇ　（０ｏｓ
１．ｅｒｓｔｒａａｔ　　　ｌ　　　３７４０　　八Ｇ
　　１ｌａａｒｎ　　Ｎｅｔｌ＋ｅｒｌａｎｄｑ）　）
においで１９８７年２月２　Ｅｌに以下の寄託を行った
： Ｎｏ　、（二Ｂ８１４３．８７とし″〔、プラスミドｐ
ｘＬ４６２を含む大腸１４（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉｎ　
　ｃｏｌｉ）Ｅ　１（１３ｓ（ｐＲＫ　　２４８　　ｃ
Ｈ，５（Ｇ−１３９８株））の標本； Ｎｏ　、ＣＢＳ　１４４．８７としてプラスミドｐＸＩ
−６４１を含む大腸菌Ｂ（Ｇ−２０８３株）の標本：Ｎ
ｏ　、ＣＢＳ　１４５．８７とし′ＣプラスミドｐＸＩ
−７４０を含む大腸菌Ｂ（Ｇ−２１４６株）の標本；及
び Ｎｏ　、ＣｌＢ５１４６．８７としてプラスミドｐＸＬ
７４１を含む大腸菌Ｂ（Ｇ−２１４７株）の標本。

【図面の簡単な説明】

第１図はブレブローＨ８Ａの構造を示す。 第２図は、：３つの代表的な挿入部を示すＩ（Ｓ　Ａ遺
イバ子の制限地しＩ’ｔ’ある。 第３図はプラスミドへのｌ（Ｓ　Ａ遺伝子の編入を示す
。 ｆ：ｐＪ４図はプラスミドｐＸＪ、５３におけるＨ８Ａ
をコードしている完全ヌクレオチド配列を示す。 第５図は第・↓し１のヌクレオチド配列に相当するタン
パク質配列をボす。 第６　ｒＡは、（Ａ）ｃ　口遺伝子の最初の６フドンを
コードしているオリゴヌクレオナト及び（１欠失変異誘
発のために使用されるオリゴヌクレオチドの構造をボす
。 第°を図はプラスミド“ｐＸｌ、４６２”の構造？ボｒ
。 １８図は成熟ＨＳＡへｔｎｃ　（１−Ｈ８Ａの転化を示
ｒ電う（２／に動パターンの図である。 第９図はプラスミド“ｐｘｌ、２８８”の構造を示す。 第１０図は種々の擬−プロ−Ｈ８Δセグメントのアミ／
ｆｅ配列を示ｒ。 第１１図はプラスミドｐ　ＸＬ６４１、ｐ　ＸＬ７４（
）及びｐＸＬ７４１の構築における欠失友異禽発のため
に使用される３つのオリゴヌクレオチド配列を示す。 ３　（ヤの５） ＣＨＲＢＳ　　ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＡＴＣ；　　　ＧＡ’丁　　ＣＣ八　　ＣＡＣ＾ＡＧ　
　　ＡＣＴ　　　ＧＡＣＧＴＴ　　　ＧＣＴｈＥＴＩＡ
ＩＳｌ：“　ＡＬＡ　　Ｈ工Ｓ　ＬＹＳ　ＳＥＲＧＬＬ
Ｉ　　リ＾Ｌ　＾Ｌ＾■ ＡＡ＾　ＧＣＣＴＴＣＧＴＧ　　ＴＴＧ　　白ＴＴ　　
ＧＣＣＴＴＴ　　ＧＣＴＬＹＳ　　＾Ｌ＾　ＬＥＵ　　
リＡＬ　　ＬＥＵ　　工しＥ　　Ａｌ−Ａ　　Ｆ’１−
ＩＥ　　＾Ｌ＾２り５ ＧＴＡ　　Ａ白Ａ　　ＴＴ自　ＧＴＧ　　＾ＡＴ　　Ｇ
Ａ白　ＣＴ白　ＡＣＴ　　Ｇ＾＾すＡＬ　　ＬＹＳ　　
ＬＥｔＪ　　リＡＬ　　ＡＳＮ　　ＧＬＬＩ　　リ＾Ｌ
　　ＴＨＲＧＬＬＩＧＡＡ　　ＡＡＴ　　ＴＣ；Ｔ　　
Ｇ白ＣＡＡＡ　　ＴＣＡ　　ＣＴＴ　　ＣＡＴ　　＾Ｃ
ＣＧＬＬＪ　　＾ＳＮ　　ＣＹＳ　　Ａ！ＥＦ’　　Ｌ
Ｙ！３　　ＳＥＲＬＥＬＪ　　Ｈ工Ｓ　　ＴＨＲＣＡＴ
　　ＣＧに　　１’Ｔ’Ｔ’　　ＡＡＡ　　ＧＡ’Ｔ’
　　ＴＴｒ、；　　［：；ＧＡ　　Ｇ＾Ａ　　ＧＭ　　
ＡＩ？１丁　ＴＴＣＨ工Ｓ　ＡＲＧ　　Ｆ＋ＩＩＥ　　
Ｌ−ＹＳ　　ＡＥｉＦ’　　ＬＥＵ　　ＧＬＹ　　Ｇ口
Ｊ　　ＧＬＩＪ　　＾ＳＮ　　Ｆ’１−ＩＥＺＯＯ２１
’、：Ｊ　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０Ｃ
ＡＧ　　ＴＡＩ’　　　ＣＴＴ　　ＣＡＣ；　　　ＣＡ
Ｃ’ｒＧＴ　　　（’ｌ：ＣＡ　　　ＴＴＴ　　ＧＡＡ
　　　ＧＡ　ｒ　　ＣＡＴＧＬＮＴＹＲｌ−ＥｌｌＧＬ
ＮＧＬＮＣＹＳＰＦ＜０ｌ−ＨＬＧＬｕＡＳＦ’Ｈ工５
ＴＴＴ　　ＧＣＡ　　八ＡＡ　　白ＣＡ　　ＴＧＴ　　
ＧＴＴ　　ＧＣＴ　ＣへＴＧ＾Ｇ　　ＴＣ＾　ＧＣ丁Ｆ
“Ｉ−（Ｅ　’ＡＬＡ　　Ｌ’１ＳＴｌ−１１で　ＣＹ
Ｓ　　リＡｌ−ＡＬ白　＾ＳＰ　　ＧＬＵ　　ＳＥＲ八
り八ＣＴＴ　　ＴＴＴ　　ＧＧ＾　ＧＡＣＡＡＡ　　Ｔ
Ｔ＾　ＴＣ；ＣＡＣＡ　　ＧＴＴ　　ＧＣ＾　＾ＣＴＬ
ＥＬＩ　　Ｆ’ＨＥ　ＧＬＹ　　ＡＳＰ　ＬＹＳ　　Ｌ
ＥＬＩ　　ＣＹＳ　ＴＨＲリＡＬ　　ＡＬＡ　　ＴＨＲ
ＣＴＴ　　ＣＧＴ　　ＧＡＡ　　ＡＣＣＴＡＴ　　ＧＧ
Ｔ　　Ｇ＾Ａ　＾ＴＧ　　ＧＣＴＬＥＵ　　ＡＲＧ　　
ＧＬＬＩ　　ＴＨＲ：　　丁ＹＲＧＬＹ　　ＧＬＵ　　
ＭＥＴ　　白ＬＡＧＡＡ　　ＴＧＣＴＴＣＴＴＧ　　Ｃ
＾Ａ　　ＣＡＣＡＡＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡＣ（１；ＬＵ
　　ＣＹＳ　　Ｆ’ＨＥ　　ＬＥＵ　　Ｃ；ＬＮ　　Ｈ
工Ｓ　ＬＹＳ　　ＡＳＦ’　　＾Ｓ１”１８′５ ＧＴＴ　　ＧＡＴ　　ＧＴＧ　　ＡＴＧ　　ＴＧＣＡＣ
Ｔ　　ＧＣＴ　　ＴＴＴ　　ＣＡＴすＡＬ　　ＡＳＦ’
　　リ白Ｌ　　ＭＥＴ　　ＣＹ！３　　ＴＨＲＡＬＡ　
　Ｆ’ＨＥ　　ｌ−１工Ｓ５１＋５ ＴＡＴ　　ＧＡＡ　　ＡＴＴ　　ＧＣＣＡＧＡ　　ＡＧ
Ａ　　ＣＡＴ　　ＣＣＴ　　Ｔ＾ＣＴＹＲＧＬＬＩ　　
工ＬＥ　　ＡＬＡ　　Ａｆ、：Ｇ　　白ＲＧ　　Ｈ工Ｓ
　Ｆ’ＲＯＴＹＲ３Ｆ３０　　　　　　　　　　　　　
　　３９５　　　　　　　　　　　　　　　　’＋１０
ＧＡＣＴＧＣＴＧＴ　　ＧＣＡ　　ＡＡ＾　ＣＡ＾　Ｇ
ＡＡ　　ＣＣＴ　　ＧＡＧ　　＾Ｇ＾　＾＾ＴＡＳＦ’
　ＣＹＳ　　ＣＹ’Ｅ　　ＡＬＡ　　ＬＹＳ　　ＧＬＮ
　　ＧＬｕ　　Ｆ玉ＯＧＬＵ　　ＡＲＧ　　ＡＳＮ府５
′５ ＡＡＴ　　ＣＣＡ　　Ａ白Ｔ　　ＣＴＣＣＣＣＣＣＡ　
　ＴＴＧ　　ＧＴに　　ＡＧＡ　　ＣＣＡ　　ＧＡＰ；
ＡＳＮ　　Ｆ’ｌ、：Ｏ＾Ｓ’Ｎ　　ＬＥＬＩ　　Ｆ’
Ｆ：Ｏ八ＲＧ　　ＬＥＵ　　リ＾Ｌ　＾１でＧ　　Ｆｏ
Ｒｒ）ＧＬＵ５００　　　　　　　　　　　　　　　　
５１″５　　　　　　　　　　　　　　　　５３０ＧＡ
ＣＡＡＴ　　ＧＡＡ　　ＧＡＧ　　ＡＣＡ　　ＴＴＴ　
　ＴＴＧ　　ＡＡ＾　＾＾＾　Ｔ＾ＣＴＴ＾ＡＳＦ’　
　ＡＳＮ　　ＧＬＵ　　ＧＬＬＩ　　ＴＩＥＲＦ’ＨＥ
　　ＬＥＬＩ　　ＬＹＳ　ＬＹＳ　　ＴＹＲＬＥＬＩ５
７′５ ＴＴＴ　　ＴＡＴ　　ＧＣＣＣＣ（１；　　Ｇ＾Ａ　　
ＣＴＣＣＴＴ　　ＴＴＣＴＴＴ　　（１；ＣＴ　　ＡＡ
＾Ｆ’ＨＥ　　ＴＹＲＡＬ＾　Ｆ’ｆ、：ＯＧＬＵ　　
ＬＥＩＪ　　ＬＥＬＩ　　ＰＩ−ＩＥ　　Ｆ’ＨＥ　　
ＡＬＡ　　ＬＹ’ＳＡＧＧ　　ＴＡＴ　　ＡＡＡ　　Ｇ
ＣＴ　　ＧＣＴ　　ＴＴＴ　　ＡＣＡ　　ＧＡＡ　　Ｔ
ＧＴＡＦｉ：Ｇ　ＴＹＦｔ’　ＬＹＳ　ＡＬＡ　　ＡＬ
Ａ　Ｆ’ＨＥ　Ｔ＋−１１で　ＧＬＬＩ　　ＣＹＳＣＣ
Ａ　　ＡＡＧ　　ＣＴＣＧへＴＧ白Ａ　　ＣＴＴ　　Ｃ
（１；Ｇ　　Ｇ＾１’　　Ｇ＾＾ＰＲＯＬＹＳ　　ＬＥ
ＬＩ　　ＡＳＦ’　　ＧＬｕ　　ＬＥＬＩ　　ＡＲＧ　
　＾ＳＦ’　　ＧＬＵ丁ＧＴ　　ＧＣＣＡＧＴ　　ＣＴ
ＣＣＡＡ　　ＡＡＡ　　ＴＴＴ　　ＧＣ；Ａ　　ＧＡＡ
ＣＹＳ　ＡＬＡ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＬＹＳ
　　ＰＨＥ　　ＧＬＹ　　ＧＬＵＡＧＣＣＡＣ；　　Ａ
にＡ　　ＴＴＴ　　ＣＣＣＡＡＡ　　ＧＣＴ　　ＧＡＧ
　　ＴＴＴＳＥＲＧＬＮ　　ＡＲＣ；　Ｆ’ＨＥ　Ｆ′
Ｆ、：ＯＬＹＳ　＾ＬＡ　　ＧＬＬＪ　　Ｆ’ＨＥ６２
０　　　　　　　　　　　　　　　６３’：ｉ　　　　
　　　　　　　　　　　　６５０ＴＧＣＣＡ白　ＧＣＴ
　　ＧＣＴ　　ＧＡＴ　　ＡＡＡ　　Ｇ口＾　ＧＣＣＴ
ＧＣＣＴＧ　　ＴＴ（１；ＣＹＳ　　ＧＬＮ　　白ＬＡ
　　ＡＬＡ　　ＡＳＦ’　　ＬＹＳ　　ＡＬＡ　　ＡＬ
＾　ＣＹＳ　　ＬＥＬＩ　　ＬＥＵ６Ｂ０　　　　　　
　　　　　　　　　６９５　　　　　　　　　　　　　
　　７１０６ＣＣ＾ＡＧ　　にＣＴ　　ＴＣに　　ＴＣ
Ｔ　　ＧＣＣＡＡ＾　ＣＡＧ　　＾Ｇ八　ＣＴＣ＾＾Ｇ
ＧＬＹ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　　ＳＥＲＳＥＲＡＬＡ　　Ｌ
ＹＳ　ＧＬＮ　　ＡＲＧ　　ＬＥＵ　　ＬＹＳ７／＋０
　　　　　　　　　　　　　７５’５　　　　　　　　
　　　　　７７０ＡＧＡ　　ＧＣＴ　ＴＴＣＡＡＡ　　
ＧＣＡ　　ＴＧＧ　　ＧＣＡ　　ＧＴＡ　　ＧＣＴ　　
Ｃ［；ＣＣＴにＡＦｉ：Ｇ　　ＡＬＡ　　ＰＨＥ　　Ｌ
Ｙ！３　　ＡＬＡ　　ＴＲＰ　ＡＬＡ　　１．ＩＡＬ　
　１’ｌＬＡ　　ＡＲに　　ＬＥＵ日００　　　　　　
　　　　　　　　　８１５　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｅ３３０ＧＣＡ　ＧＡＡ　　ＧＴＴ　ＴＣＣＡＡ
Ｇ　　ＴＴＡ　　ＧＴＧ　　ＡＣＡ　　ＧＡＴ　　ＣＴ
Ｔ　　ＡＣＣＡＬＡ　ＧＬＵ　υ＾Ｌ　　ＳＥＲＬＹＳ
　　ＬＥＬＩ　　υ＾Ｌ　ＴＨＲＡＳＦ’　　ＬＥＬＩ
　　ＴＨＦ、’ＡＡＡ　　ＧＴＣＣＡＣ＾ＣＧ　　ＧＡ
Ａ　　丁にＣＴＧＣＣＡＴ　　ＧＧＡ　　Ｇ＾ＴＬＹＳ
　ｕＡＬ　　Ｈ工Ｓ　　ＴＨＦｔ：　　ＧＬＬＩ　　Ｃ
ＹＳ　ＣＹＳ　　Ｈ工Ｓ　　ＧＬＹ　　ＡＳＰＣＴＴ　
ＧＣＣＡＡＧ　ＴＡＴ　　ＡＴＣＴＧＴ　　ＧＡ＾　Ａ
ＡＴ　　ＣＡＡ　　ＧＡＴＬＥＬＩ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　
ＴＹＲ工ＬＥ　ＣＹＳ　　ＧＬｔＪ　　＾ＳＮ　　ＧＬ
Ｎ　　＾ＳＦ’ＧＡＡ　　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　　
ＴＴ（１；　ＧＡＡ　　ＡＡＡ　　ＴＣＣＣＡＣＴＧＣ
ＧＬＵ　ＬＹ！３　ＰＲＯＬＥＵ　　ＬＥＬＩ　ＧＬＵ
　　ＬＹＳ　ＳＥＲＨ工Ｓ　　ＣＹＳ１０２５　　　　
　　　　　　　　　　　１０’ｔＯＧＣＴ　ＧＡＣＴＴ
Ｇ　ＣＣＴ　　ＴＣＡ　ＴＴＡ　　ＧＣＧ　ＧＣＴ　　
ＧＡＴ　　ＴＴＴ　１＾ＬＡ　ＡＳＰ　ＬＥＵ　Ｆ’Ｒ
ＯＳＥＲＬＥＵ　　ＡＬＡ　　ＡＬＡ　　ＡＳＰ　　Ｐ
）（Ｅ　１８７″５　　　　　　　　　　　　　　８９
０ＣＴＧ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　
ＧＡＣＡＧＧ　　ＧＣ［；　　ＧＡＣＬＥＵ　ＬＥＵ　
ＧＬＵ　ＣＹＳ　　ＡＬＡ　ＡＳＦ’　ＡＳＦ’　ＡＲ
Ｇ　ＡＬＡ　ＡＳＰ９３５　　　　　　　　　　　　　
　９ｅＪＯＴＣＧ　ＡＴＣＴＣＣＡＧＴ　ＡＡＡ　ＣＴ
ＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＴにＣＴ［；ＴＳＥＲ工ＬＥ　ＳＥ
Ｒ５ＥＦｔ：　ＬＹＳ　ＬＥＬＩ　Ｌ’＋ｓ　ＧＬＬＩ
　ＣＹｓＣ’１ｓ９９′５　　　　　　　　　　　　　
１０１０ＱＴＴ　ＧＣＣＧＡＡ　にＴＣ；　ＧＡＡ　Ａ
ＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＴに　ＣＣＴＩＤＬＥ　ＡＬ
Ａ　ＧＬＬＩ　ｔ／ＡＬ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＡＳＦ′Ｇ
ＬＬＩ　ＭＥＴ　Ｆ’Ｒ０１０５′：Ｊ　　　　　　　
　　　　　　　１０７０；ＴＴ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　ＡＡ
Ｇ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＣｌｌ’ｌＡｌ’ｌ　ＡＡＣ
ＴＡＴ）ＡＬ　　ＧＬＵ　　ＥｉＥＲＬＹＳ　　ＡＳＦ
’　　Ｌ−’ＡＬ　　ＣＹＳ　　　ＬＹＳ　　　ｆ￥；
Ｎ　　ＴＹＲＣ；ＣＴ　　Ｃ；＾Ｇ　　ＧＣＡ　　ＡＡ
Ｇ　　Ｇ＾Ｔ　　Ｃ；ＴＣ丁ＴＣＴＴＧ　　ＧＧＣＡＴ
ＧＡＬＡ　　ＧＬＵ　　ＡＬＡ　　Ｌ’ＩＳ　ＡＳＦ’
　　Ｌ、＋ＡＬ　　Ｆ’ＨＥ　　ＬＥＬＪ　　ＧＬＹ　
　ＭＥＴ１１’ｉ５　　　　　　　　　　　　　　　１
１６ＯＧＡＴ　　ＴＡＣＴＣＴ　　ＧＴＣＧ丁＾　ＣＴ
Ｇ　　ＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＡＧＡ　　ＣＴＴＡＳＰ　
　ＴＹＲＳＥＲ’、Ｉ＾Ｌ　リ＾Ｌ　　ＬＥＬＩ　　Ｌ
ＥＬＩ　　ＬＥＬＩ　　＾ＲＧ　　ＬＥＬ１ＴＧＣＴに
Ｔ　　ＧＣＣＧＣＴ　　ＧＣＡ　　Ｃ；ＡＴ　　ＣＣＴ
　　ＣＡＴ　　ＧＡＡ　　ＴＧＣＣＹＳ　　ＣＹＳ　／
’ＩＬＡ　　＾ＬＡ　　ＡＬＡ　　＾ＳＰ　Ｆ’Ｆ、：
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　　　　　　　　　１２８０ＣＴＴ　　ＡＴに　　Ｇ＾
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ｒｒ−Ｈβへの戚多シｈｓへ＼めｆ幻乙手続補正書（龍
） 昭和６２年５月２８日 待詐庁民官　黒１）明雄殿 １、事件の表示 昭和６２年特許顧第３１６８３号 ２、発明の名称 成熟型ヒト血清アルブミンの製造方法 ３、Ｎ正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名　称　ノエネテイカ ４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　　　昭和６２年４月２８日（発送
日）６、補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成熟型ヒト血清アルブミンのペプチド配列と融合し
   た、トリプシンで切断するための優先部位で終わってい
   る親水性Ｎ−末端ペプチド伸長部を含有するハイブリッ
   ドタンパク質の製造方法であって、成熟型ヒト血清アル
   ブミンをコードしているヌクレオチド配列に融合した、
   前記Ｎ−末端ペプチド伸長部をコードしているヌクレオ
   チド配列を含有し、これらの配列の発現は誘導性バクテ
   リアプロモーターにより制御されるプラスミドの保存を
   確保することができる大腸菌（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）の菌
   株を培養することを含むことを特徴とする方法。 ２、前記Ｎ−末端ペプチド伸長部をコードしているコド
   ンがλバクテリオファージｃII遺伝子の最初の７コドン
   及びペニシリンアミダーゼ遺伝子の最初の６コドンから
   選ばれ、その各々は随意に指示変異誘発によりトランス
   フォームされていてもよい、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３、成熟型ヒト血清アルブミンのペプチド配列と融合し
   たＮ−末端ペプチド伸長部を含有するハイブリッドタン
   パク質の製造方法であつて、特許請求の範囲第１項記載
   の方法によって得られた変性された不溶性の分子を、ポ
   リペプチド鎖の二次及び三次構造再配列（ｒｅａｒｒａ
   ｎｇｅｍｅｎｔ）を可能とする変性及び再生方法を使用
   することによって、再生された可溶性分子に転化するこ
   とを特徴とする方法。 ４、得られたハイブリッドタンパク質はトリプシンによ
   り一次構造がヒト血清アルブミンと同一であるタンパク
   質に転化される。特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、ＰＬプロモーターと、ｔＲ１転写終結シグナルが欠
   失したｃII遺伝子のリボソーム固定部位と、ＡＴＧ開始
   コドンと、成熟型ヒト血清アルブミンの構造遺伝子と融
   合したｃII遺伝子の最初の６コドンとを含有するプラス
   ミド“ｐＸＬ４６２”。 ６、プラスミド“ｐＸＬ４６２”の保持を確保すること
   ができる大腸菌の菌株の培養により生成したとき、成熟
   型ヒト血清アルブミンのペプチド配列と融合した、λバ
   クテリオファージｃII遺伝子の最初の７個のアミノ酸で
   ある（Ｍｅｔ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｒｇを、Ｎ−末端に含有して成るハイブリッド
   タンパク質。 ７、Ｐｔｒｐプロモーター及びそれに続くペニシリンア
   ミダーゼプロモーターと、ペニシリンアミダーゼ遺伝子
   のリボソーム固定部位と、成熟型ヒト血清アルブミンの
   構造遺伝子と融合したペニシリンアミダーゼ遺伝子の最
   初の６コドンとを含有するプラスミド“ｐＸＬ６４１”
   。 ８、プラスミド“ｐＸＬ６４１”の保持を確保すること
   ができる大腸菌の菌株の培養により生成するとき、成熟
   型ヒト血清アルブミンのペプチド配列と融合したペニシ
   リンアミダーゼの最初の６個のアミノ酸であるＭｅｔ−
   Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇを、Ｎ−末端
   に含有して成るハイブリッドタンパク質。 ９、Ｐｔｒｐプロモーター及びそれに続くペニシリンア
   ミダーゼプロモーターと、ペニシリンアミダーゼ遺伝子
   のリボソーム固定部位と、成熟型ヒト血清アルブミンの
   構造遺伝子と融合した、指示変異誘発により修正された
   ペニシリンアミダーゼ遺伝子の最初の６コドンとを含有
   するプラスミド“ｐＸＬ７４０”。 １０、プラスミド“ｐＸＬ７４０”の保持を確保するこ
   とができる大腸菌の菌株の培養により生成するとき、成
   熟型ヒト血清アルブミンのペプチド配列と融合した、指
   示変異誘発により修正されたペニシリンアミダーゼの最
   初の６個のアミノ酸であるＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａ
   ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを、Ｎ−末端に含有して成るハイ
   ブリッドタンパク質。 １１、Ｐｔｒｐプロモーター及びそれに続くペニシリン
   アミダーゼプロモーターと、ペニシリンアミダーゼ遺伝
   子のリボソーム固定部位と、成熟型ヒト血清アルブミン
   の構造遺伝子と融合した、指示変異誘発により修正され
   たペニシリンアミダーゼ遺伝子の最初の６コドンとを含
   有するプラスミド“ｐＸＬ７４１”。 １２、プラスミド“ｐＸＬ７４１”の保持を確保するこ
   とができる大腸菌の菌株の培養により生成するとき、成
   熟型ヒト血清アルブミンのペプチド配列と融合した、指
   示変異誘発により修正されたペニシリンアミダーゼの最
   初の６個のアミノ酸であるＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌ
   ｙｓ−Ａｒｇを、Ｎ−末端に含有して成るハイブリッド
   タンパク質。