JPS59144743A - 組換ｄｎａ技術によつて産生されるブタ成長ホルモン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に組換ＤＮＡ技術に係る。本発明は、基
本的な動物タンパクたるブタ成長ホルモンのこれまで未
知のアミノ酸配列をコードするこれまで未知のＤＮＡ配
列の製造に組換ＤＮＡ技術を利用し得るという進歩に基
（。本発明は、このタンパクをコードする遺伝子のＤＮ
Ａ配列の解明に基くものであり、推定された該タンパク
の完全アミノ酸配列に係り、また、前記の如き情報の利
用、即ちセルカルチャー中で発現可能な組換ＤＮＡ配列
を含む遺伝的に変容（改変）したセルカルチャーからブ
タ成長ホルモンを高レベルで産生する方法に係る。

ヒト成長ホルモンも含めて種々のポリペプチドを遺伝的
変容セルカルチャーにより産生ずるための手段及び方法
は、Ｃ）ｏｅｄｄｅｌ等のＵ、８．Ｓ、Ｎ。

！５５１２６（１９７９年７月５日出願）即ち米国特許
第４９１４ヱ２２Ｂ　３２号（１９８２年８月３日発行
）に開示されている。この文献は本明細書に含まれるも
のとする。また、成る種のヒト成長ホルモン変異体の製
造は、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０６／３６０，５１７（１９８
２年３月２２日出願）に開示されている。

この出願も本明細書に含まれるものとする。更に、ウシ
成長ホルモンは、外来遺伝子発現の翻訳過程に臨むメツ
センジャーＲＮＡ転写体中の成る種の二次／三次立体構
造的障害の修復を利用し、該ホルモンをコードするＤＮ
Ａ配列の発現によってセルカルチャー中で産生された。

これに関しては、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０６／３０３．６８
７　　（１９８１年９月１８日出願）を参照されたい。

この出願もまた、本明細書に含まれるものとする、 次のことに注目すべぎである。即ち、現在の情況でヲ工
、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンなる２種のタ
ンパクの産生プロセスに於いては、各タンパクをコード
するハイブリッドＤＮＡ配列を調製するステップが含ま
れる。前記の如く調製されたハイブリッドＤＮＡ配列が
発現ベクターに組　３− 込まれ、この発現ベクターが宿主細胞にトランスフェク
トされ、該宿主細胞が所望の各タンパクの産生を行なう
。このようなハイブリッドＤＮＡ配列の調製は、５′−
末端の一部を合成することによって可能になった。これ
により、極めて好ましくはメツセンジャＲＮＡソース組
織から誘導されたｃＤＮＡから得られる残りのＤＮＡ配
列と適正読取りフレームで結合することが容易になった
。前記の如とハイブリッド遺伝子を使用すると、適正な
読取り過程の実行を確保するように発現ベクター内に遺
伝子を適正に組込むことが容易になり、またウシ成長ホ
ルそンの場合には、翻訳の障害になる二次／三次立体構
造が除去される。

組換ＤＮＡ技術の応用により遺伝的変容セルカルチャー
からブタ成長ホルモンを産生ずるための本発明方法では
、前記の如きハイブリッドＤＮＡ配列を構築する必要が
ない。更に本発明は、ブタ成長ホルモンのＤＮＡ配列及
びその結果として推　４一 定された該タンパクの完全アミノ酸配列の解明に基くも
のであり、また、その結果得られた認識、即ち大きな障
害になる二次／三次立体構造を含まない前記の如きＤＮ
Ａ配列は、タンパク産生用セルカルチャーにより遺伝子
発現を介して有効にタンパクを産生ずることを確保する
ように有効に作用し得るプロモータ配列に直接結合され
得ろという認識に基く。

従って、本発明に於けるブタ成長ホルモンのＤＮＡ及び
アミノ酸配列の解明に基いて組換ＤＮＡ技術を更に精巧
に改良することが可能になり、この改良技術を同様の条
件下で更に別の所望の外来タンパクを産生ずるため罠使
用することも可能である。

本発明の第一の目的は、特に第２図に示すようなブタ成
長ホルモンをコードするＤＮＡ配列であり、このような
りＮＡ配列には遺伝コードの既知の縮退に基くヌクレオ
チド変異、更にブタ成長ホルモンの対立遺伝子型（ａｌ
ｌｅｌｉｃ　ｖｅｒｓｉｏｎ　）をコードするヌクレオ
チド配列も含まれるものとする。本発明の第二の目的は
、実質的に第２図に示すブタ成長ホルモンのアミノ酸配
列、即ち、その対立遺伝子型をも含めたブタ成長ホルモ
ンのアミノ酸配列である。本発明の目的はまた、前記Ｄ
ＮＡ配列を担持する複製可能な種々のクローニングベヒ
クルの構築方法、及び、前記ＤＮＡ配列を担持しており
トランスフェクトされたセルカルチャー中でのブタ成長
ホルモンの産生に使用し得る発現ベヒクルの構築方法を
提供することである。従って、本発明のブタ成長ホルモ
ンは、発現人為構造たるいかなるプレ配列もしくは別の
配列をも含まない成熟形で産生されるか、又は、合成的
に誘導された宿主細胞培養物タンパクもしくはそれ自体
のシグナルプレ配列もしくはその一部分との融合タンパ
クとして産生され得る。本発明はまた。トランスフェク
トされたセルカルチャーを用いてブタ成長ホルモン又は
その誘導体を産生せしめるに必要な変容遺伝情報を担う
種々の複製可能なりローニンクヘヒクルと発現ベヒクル
トトランスフエクトされたセルカルチャーとに係る。

本発明のブタ成長ホルモンハ、（もはや時代遅れの）天
然ソースからの抽出により得られる結果とは対照的に、
実質的に純粋な形で産生され、このため、ブタ由来の別
のタンパクを実質的に含まない。本発明のタンパクは、
このように従来では得られなかった純度レベルで産生さ
れるが、宿主動物へ有効に受容され易（するために従来
の担体及びアジュバントと配合してもよい。これらの担
体及びアジュバントには血清アルブミンの如き別のタン
パクも含まれる。

好ましい特定具体例に基いて本発明を説明するが、本発
明は遺伝的変容セルカルチャーを用いたブタ成長ホルモ
ンの産生を全ての角度に於いて包含しており、後記の好
ましい特定具体例に全（限　７一 定されるものではなく特許請求の範囲に基づいて定めら
れるものであると解釈すべ針である。

Ａ、ブタ成長ホルモン 本発明は、遺伝的変容セルカルチャーを用いたブタ成長
ホルモン（ｐＧＨ）の産生を示す。ｐＧＨはブタ内因性
タンパクであ゛り動物の連出な身体的成熟を支配する。

このホルモンの作用はほぼ種特異的であり、哺乳動物の
下垂体により産生される。

訪ホルそンは、直線生長（１ｉｎｅａｒ　ｇｒｏｗｔｈ
　）を支配しており種々の同化プロセスの調節に関与す
る。

ｒａｔｉりを増大させる機能を果す。これまで天然ソー
スから単離して得られた量は、動物育種学の分野で使用
される投与量を与えるどころかタンパクのアミノ酸配列
の決定を行なうためにさえ十分ではなかった。今や本発
明によって、このタンパク及びその対立遺伝子型のアミ
ノ酸配列と対応す　８− るＤＮＡ配列との正確な同定が可能になり、その結果と
して、該化合物を商業規模の量で産生ずることができ動
物育種学の分野に大規模に利用することがで針るように
なった。

ブタ成長ホルモンのＤＮＡ配列とアミノ酸配列との解明
によって、該タンパクが、遺伝的変容セルカルチャーか
ら成熟形で産生され得る、即ち、適正アミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列に達し得るような合成りＮＡを構築
するか又はＣＤＮＡを単独使用し組換ＤＮＡ技術を介し
て適当な発現ベクターに挿入しセルカルチャー中で産生
し得るとの結論が得られた。

本文に記載の操作では特に、参考文献＋１１に記載の如
く微生物として大腸菌（旦。ｃｏｌｌ）ｋ−１２株２９
４　（ｅｎｄ　Ａ、　ｔｈｉ”−、Ｍｒ−、ｋｈａｍ”
）を使用した。この菌株はアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション、ＡＴＣＣ！　受託番号／％３１４
４６として１９７８年１０月２８日に寄託されている。

しかし乍ら種々の別の微生物菌株の使用も可能であり、
例えば旦１皿Ｂ、旦、立艶ｉ、１Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ
腐３１５３７．１９７９年７月３日寄託）及びＥ、Ｃ０
１１Ｗ３１１０　（ｒ　、λ−１ｒｗ栄養性）□（ＡＴ
ＣＣ腐２７３２５　）　　の如き公知の皿、竺迂株、又
は、多くのものがアメリカンΦタイプ・カルチャー拳コ
レクション（ＡＴＣＣ）の如き認可された微生物寄託機
関から（潜在的に）入手可能な別の微生物菌株（ＡＴＣ
Ｃカタログリスト、参考文献（２）参照）を挙げること
ができる。これらの別の微生物として例えば桿菌類（Ｂ
ａｃｉｌｌｉ）例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ）並びに別の腸内細菌類例えばネズミチフ
ス菌８ａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
及び５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓａｎｓがあり、こ
れらはいずれも内部に組み込まれた外来遺伝子配列を複
製発現し得るプラスミドを利用する。

有用なプロモータとして（工、例えばβ−ラクタマーゼ
及びラクトースプロモータ系が外来ポリペプチドの微生
物による産生を開始維持すべく有利に使用された。これ
らのプロモータ系の組立構築の細部に関しては参考文献
（３，４，５）を参照し得る。より最近では、トリプト
ファンに基く系所謂ｔｒｐプロモータ系が開発された。

この系の組立構築の細部に関しては参考文献（６）及び
（７）を参照し得る。多数の他の微生物プロモータが発
見され利用された。これらのプロモータについて、当業
者がプラスミドベクター内で機能的に結合させ得るため
のヌクレオチド配列の細部に関してはすでに発表されて
いる（参考文献（８）参照）。

？−酵母菌／酵母プロモータ 本発明に於ける発現系として例えば、Ｆｚｃｏｌｉと酵
母５ａｃｃｈ＊ｒｏｍｙｃ６ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
との双方中で選択複製し得るプラスミドＹＲｐ７（参考
文献９．１０．１１）をも使用し得る。酵母中での選択
のためにはプラスミドがＴＲＰＩ遺伝子を含んでおり、
該遺伝子は該遺伝子の突然変異を染色体■上に含む酵母
を補充する（トリプトファンの非存在下で成長させ得る
）（参考文献１２）。有用な菌株ハ、アメリカンφタイ
プ・カルチャー舎コレクションに無制限に寄託された（
ＡＴＣＣ，％４４０７６　）　　菌株ＲＴ（２１８であ
るａＬｔ、かし乍ら、細胞をｔｒｐ　１にする突然変異
を含むならばいかなるシ副帥Σ１ヨμソｃｅｒθＶｉｓ
ｉａｅ菌も発現系を含むプラスミドを発現すべく有効な
環境になり得ろことが理解されよう。使用可能な別の菌
株の例としてｐｅｐ　４−１がある０４）。このトリプ
トファン栄９要求株もまた工旦ヱ１遺伝子中に点突然変
異を有する。

（アルコール脱水素酵素１に対する）酵母遺伝子由来の
５′−フランキングＤＮＡ配列（プロモータ）は、非酵
母遺伝子の５′−側に配置されると、酵母力形質転換に
使用されるプラスミド内に置かれた外来遺伝子の酵母中
での発現を促進（プロモート）し得る。酵母中で非酵母
遺伝子が適正発現するためには、プロモータに加えて、
酵母中での適正な転写終了とポリアデニル化とを与えろ
ようにプラスミド上の非酵ｅ遺伝子の３′−末端に配置
された第２の酵母配列が必要である。６を乙プロ千−夕
は、後述する他のプロモータ同様に本発明での使用に適
している。好まＩ７い具体例に於いては、酵母３−ホス
ホグリセレートキナーゼ遺伝子ＯＤの５′−フランキン
グ配列が構造遺伝子の上流側に配置されており、構造遺
伝子の後には終了−ポリアデニル比信号がある。この５
′−フランキング配列は、例えばコリ１遺伝子又はＰＣ
）Ｋ遺伝子から得られろ０ １セルカルチヤー系／セルカルチヤーベクター培養（組
織培養）による背椎動物細胞の増殖は、近年ではもはや
慣例化した手順である（１６参照）。外来タンパクの産
生に有用な宿主はサルの腎線維芽細胞Ｃ０８−７ライン
である（ｌη。しかし乍ら本発明の実施にを工、適合性
ベクターを複製発現し得るいかなるセルラインの使用も
可能である。このようなセルラインとして例えば、ＷＩ
３８、ＢＨＫ、３Ｔ３、ＣＨＯ，ＶＥＲＯ及びＨｅ’Ｌ
ａセルラインがある。更に、発現ベクターは、任意の必
要なり、ボーソーム結合部位とＲＮＡスプライス部位と
ポリアデニル化部位と転写終了配列と共に発現すべき遺
伝子の手前側に位置するプロモータと複製オリジンとを
含むことが必要である。本文中では好ましい具体例に基
いて本発明を説明しているが、本発明が本明細書中に記
載の配列に限定されると解釈されてはならないことが理
解されよう。例えば、別のウィルス（例えばＰａ　ｌｙ
ｏｍａ　。

Ａｄｅｎｏ、　Ｖ　８　Ｖ、　Ｂ　Ｐ　Ｖ等）ベクター
の複製オリジンを使用してもよ（、また、完全体でない
状態で機能し得る細胞性のＤＮＡ複製オリジンを使用し
てもよい。

Ｃ，ベクター系 般に、ベクターとしてｐＢＲ３２２（ｌ［Ｄを使用し翻
訳の開始及び停止のシグナルを伴なう外来遺伝子配列を
適当に挿入することによって誘導される。この際挿入は
、共通制限部位又は合成的に創成され−も た制限部位を利用して、機能プロモータに対して読取過
程が実行され得る結合状態が得られるように行なわれる
。ベクターは、１つ以上の表現型選択形質遺伝子と宿主
内での増幅を確保する複製オリジンとを含むであろう。

また、外来インサートは、例えばｔｒｐ系遺伝子から誘
導され得る融合プレ配列と共に発現され得るように配列
結合される。

２酵母中での発現 ｐＧＨ１７）　ｃＤ　Ｎ　Ａの如鎗外来遺伝子を酵母中
で発現させるには、４成分を含むプラスミドベクターを
構築する必要がある。第１成分は、Ｅ、ｃｏｌｉと酵母
との双方を形質転換し得る部分であり従って各微生物か
ら選択し得る遺伝子を含んでいなけ１５− ればならない。このような遺伝子としてＥ、ｃｏｌｉ由
来のアンピシリン耐性遺伝子及び酵母由来の１旦」！遺
伝子が使用され得る。この成分に於いては更に、双方の
微生物中でプラスミドＤＮＡとして維持されるべ（双方
の微生物由来の複製オリジン、例えばｐＢＲ３２２由来
のＥ　、　ｃｏｌｉオリジン及び酵母の染色体■由来の
４１１オリジンが含まれることが必要である。

プラスミドの第２成分は、下流の構造遺伝子の転写を促
進するために高度に発現された酵母遺伝子から得られた
５ｐ−ｙランキング配列である。この５′−フランキン
グ配列は酵母の３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐ（
）Ｋ）　　遺伝子から得られたものでよい。断片は、Ｐ
ＧＫ構造配列のＡＴＧが除去され、代りにＸｂａ　Ｉ及
びＥｃｏ　ＲＩ制限部位の如き構造遺伝子と５′−フラ
ンキング配列との結合を助ける別の制限部位を含む配列
を入れて構築される。

１６− 系の第３成分は、ＡＴＧ翻訳開始シグナルと翻訳停止シ
グナルとの双方を含むように構築された構造遺伝子であ
る。このような遺伝子の単離及び構築については後述す
る。

第４成分は、酵母遺伝子の３′−フランキング配列を含
む酵母ＤＮＡ配列であり、転写終了及びポリアデニル化
のための適当なシグナルを含む。

３、哺乳動物セルカルチャーに於ける発現哺乳動物セル
カルチャー中での外来ペプチド合成プロセスの設計に於
いては、外来転写ヱニットのコントロール下で外来遺伝
子の自律的複製及び発現の双方を可能にし得るベクター
の開発が極めて重要である。組織培養物中でベクターの
複製を達成するには、（例えば８Ｖ４０ウイルスから得
られる）ＤＮＡｌＩ製オリジンとヘルパー機能（Ｔ抗原
）とを与えるとよい。ヘルパー・機能は、該抗原を内因
的に発現するセルラインにベクターを導入することによ
って得られる（１９．２０）。

ＳＶ４０ウィルスの後期プロモータに構造遺伝子に先行
しており遺伝子の転写を確保する。

発現を得るために有用なベクターは、旦、旦へリュ中で
選択し得る選択マーカー（アンピシリン耐性）と旦１皿
具のＤＮＡ複製オリジンとを与えるｐＢＲ３２２配列か
ら成る。これらの配列は、プラスミドｐＭＬ−１から誘
導され得ろＣＩ）。ＳＶ４０オリジンは、この領域を含
む３４２　ｂｐのヱｖｕ　ｎ−且幻痙■断片から誘導さ
れ得る（２２．２３゜両端はＥｃｏＲＩ　　末端に変換
可能である）。これらの配列は、ＤＮＡ複製のウィルス
性オリジンを含んでおり同時に早期及び後期の双方の転
写ユニットプロモータをコードしている。ＢＶ４０オリ
ジン領域は、後期転写ユニットプロモータがインターフ
ェロンをコードする遺伝子の近位に位置するように配向
される。

詳細な親切 材料 制限エンドヌクレアーゼはＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈＬｕｂｏｒａｔｏｒｆｅｓ　＋　Ｄ　Ｎ　Ａポ
リメラーゼＩ（大断片）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ
、ｎｈｅｉｍ　、　Ｔ　４　　Ｄ　Ｎ　ＡリガーゼはＮ
ｅｗ　Ｅｎｇｌａ、ｎｄ　Ｂｉｏ］、ａｂｓ　、　Ｔ　
４ポリヌクレオチドキナーゼはＰ　Ｌ　−Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓから夫々入手した。〔α−３２Ｐ］ｄＣＴ
Ｐ及び〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍから購
入した。

ＲＮＡの調製とＣＤ　Ｎ　Ａのクローニング（地方屠殺
場から入手した）ブタ下垂体から全ＲＮＡを単離した。

これにはグアニジニウムチオシアネートの使用を含む公
知の手順ＱｔＪを用いた。

オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィを用い全ＲＮ
Ａからポリアデニル化ＲＮＡを得た。このＲＮＡから二
本鎖ｃＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡの（約６００−１００
０　ｂｐの）サイズ画分を、プラスミドｐＢ　Ｒ３２２
を使用し旦、二ｚｌｉ２９４中で標準法及び（５）に記
載のホモポリマーアニーリング法によりクローニングし
た。

１９− ブタｃＤＮＡ含有プラヌミドで形質転換されたコロニー
を１０個の９６ウ工ルマイクロタイター皿に移し、所定
の序列でニトロセルロースフィルターに押付けた。増殖
コロニーを含むフィルターをＧｒｕｎ８ｔｅｉｎ及びＨ
ｏｇｎｅｓｓの手順（ハ）でハイブリダイゼーション処
理した。ラットＧＨｍＲＮＡ（イ）からのクローンｃＤ
　Ｎ　Ａを、〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰとＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、大断片（イ）とを使用し；Ｌ１０８ｃｐｍ／μ
μの特異活性にラベルし、クローンＰＧＨｃＤＮ人検出
用のプローブ（１０’　ｃｎｍ／フィルタ）として使用
した。ハイブリダイズするコロニーを増殖させ（５＋ｎ
Ａり、プラスミドＤＮＡを抽出した。制限エンドヌクレ
アーゼによる開裂とＤＮＡ断片の８係ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動とを順次用いてクローン配列を特性決定
した。

２０− プラスミドｐＰ（）Ｈ−１及びｐＰＧＨ−２からクロー
ンｃＤＮＡをポリアクリルアミドゲルで単離し、ジデオ
キシ法（２８，２９）で配列決定した。この方法では、
ｔ３＋）に記載の如（組換ファージＭ１３クローニング
ベクターｍｐ８及びｍｐ９翰に於けるプライムされたＤ
ＮＡ合成を使用する。

化学合成りＮＡの組立、分子クローニング及び解翌 ＰＣ）Ｈ発現用細菌遺伝子の５′−末端を構築するため
に、１２個のオリゴヌクレオチドの合成が必要であった
（第３図参照）　０３゜これらのオリゴヌクレオチドの
部分標本（０，０１０Ｄ２６ｏ）をＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて３７℃でリン酸化し、５０ｍＭのト
リｘ　−ＭＣＩ（ｐＨ７，５）と１０ｍＭのＪＣＩ２と
１０ｍＭのジチオトレイトールと０．５ｍＭのＡ’ｒＰ
とを含む２００μｈ中で４℃で１晩維持して１０ユニツ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて互いに結合した。結合
産物を過剰量のエンドヌクレアーゼ−ＲＩ及び旦幻色■
で開裂し、開裂産物を１０係ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけた。〜ｓ　ｏ　ｂｐで泳動するＤＮＡをゲ
ルから薄切し、溶出し、同じエンドヌクレアーゼで開裂
したプラスさドｐＢＲ３２２にクローニングした。２１
個のヌクレオチドを含む長さの２つの相補オリゴヌクレ
オチド（第５図参照）をプラスミドｐＢＲ３２２にクロ
ーニングして細菌ＰＧＨ遺伝子の新しい３′−末端配列
を得た。クローニングされた合成りＮＡをプラスミドＤ
ＮＡから開裂し前記の如（配列決定した。

ＰＧＨの細菌発現ベクターの構築 最終発現ベクターｐＰＧＨｅｘ−１を構築するために一
連のＤＮＡ断片を種々のプラスミドに移した。全ステッ
プが第４図乃至第６図に示されている。一般的に、ＤＮ
Ａ断片をゲル電気泳動法で単離し、２ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて５０　ｍＭのトリス−ＭＣＩ　（
ｐＨ７，＋５　）と１０ｍＭオドレイトールと０．５ｍ
ＭのＡＴＰとを含む２０乃至５０μｍ中で別の断片又は
プラスミドＤＮＡに結合した。制限エンドヌクレアーゼ
によるＤＮＡの部分消化が必要な場合、至適開裂時間は
実験的に確定された。

細菌中で産生されたＰＣ）Ｈの同定 プラスミドｐＰＧＨｅｘ−１を含む細菌カルチャーをＬ
Ｂプロス中で１晩増殖した。部分標本を（Ｔｒｐプロモ
ータ誘発のためには）Ｍ９培地、（マイナスコントロー
ルのためには）ＬＢプロスで１：１００に希釈し、振盪
フラスコ内で０Ｄ６ｏ０が１．０になるまで増殖した。

これらのカルチャーの１ｍ７部分標本からの細胞ペレッ
トを２係の８ＤＢと１憾のβ−メルカプトエタノールと
に溶解し、タンパクを１０倍容の低温アセトンで沈殿さ
せた。

沈殿タンパクを８ＤＳサンプルバツフアに再溶解し、部
分標本を１２４’１８ＤＢ−ボリアクリルア２３− ミドゲル０１の電気泳動にかけた。ラジオイムノアッセ
イのためには同様のセルベレットを超音波処理し、タン
パク抽出物についてＰＣ））（の存在を検定した。

ＰＧＨｃＤＮＡのクローニング及び配列解析ブタ丁岳体
から調製されたポリアデニル化ＲＮＡを酵素的に二本鎖
ｃＤＮＡに変換した。双方のＤＮＡの６００−１０００
　ｂｐのサイズ画分をプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの
ｌ已１部位に挿入し、標皐法（５）でＥ　、　ｃｏｌｉ
にクローニングした８各ｃＤＮＡバンクから得た約１０
００個のコロニーヲマイクロタイターウエルに於いズ増
殖し、カルチャーの部分標本を所定の順序でニトロセル
ロースフィルタに押付Ｗ、ｉｎ　５ｔｔｕコロニーハイ
ブリダイゼーシヨン（至）すぺ（処理した。クローン成
長ホルモンｃＤＮＡ配列を含むコロニーを、これらの配
列に於ける既知の進化保存（財）を利用して同定した。

ラジオラベルしたラット成長ホルモン２４− ｃＤＮＡクローンをウシバンク内の１２のコロニー及び
ブタバンク内の４つのコロニーにハイブリダイズした。

プラスミドＤＮＡを対応するカルチャーから調製し、い
くつかの制限エンドヌクレアーゼによる開裂とボリアク
リルア々ドゲル電気泳動とで順次処理して解析した。解
析によれば、推定ＰＣ）ＨｃＤＮＡクローンについて、
最大インサートを持つ２つのクローンｐＰＧＨ−１と−
２（双方共約７００ｂｐ）とは、約５０ｏｂｐｆｅげオ
ーバーラツプすることが知見された。４つの推定ＢＧＨ
ｃＤＮＡクローンはｌ’ｌ　ＯＯｂｐより大佐いインサ
ートを含んでおり、これは完全長ｃＤＮ６体を予想させ
る。これらは、２つの内部ＰｓｔＩ部位と２つのＰｖｕ
ＩＩ部位と１つの８ｍａ　Ｉ部位とを含んでいた。これ
らの２つのクローンの制限マツプを第１図に示す。

クローンｃＤＮＡのＩ）ＮＡ配列解析には、バクテリオ
ファージＭ１３ベクター（３０，３１）を使用し一本鎖
ＤＮＡ鋳凰に対するチェーンターミネーション法（至）
を用いた。結果によれば、クローンｃＤＮＡが真にブタ
成長ホルモンｍＲＮＡに由来していることが判明した。

ｃＤＮＡの一次構造とシグナル配列の殆んどを含むプレ
ＰＣ）Ｉ（のヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸
配列とを第２図に示す。Ｐ（）Ｈのアミノ酸配列の大部
分はこれまで未知であり鏝、ここで初めて明らかにされ
た。

ＰＧＨは１８個の位置でＢＣ）Ｈと異なっている（第２
図参照）。これらの成熟ホルモンは双方共フェニルアラ
ニンで始まる。但し、ある種の下垂体成長ホルモンでは
フェニルアラニンの手前にアラニン残基が存在しこのた
めＢＧＨにＮ−末端不均質性が生じることが公知である
（３）。この不均質性は、遺伝的冬型よりもむしろシグ
ナルペプチドの特異除去を反映していると考えられてい
る０？）。

この説は、アラニン（残基−１）がフェニルアラニン（
残基＋１）に先行する第２図のアミノ酸配列と一致する
。更に、アラニンに先行してグリシンが存在しており、
シグナルペプチドの除去が主として疎水性小側鎖を有す
るアミノ酸残基に隣接して生じろことが知られている（
７）。

発現ベクターの構築 ＰＧＨの有効な細菌産生を達成すべく設計されたプロセ
スは、ＨＧＨの産生に使用されたプロセス（５）と似て
いる。このプロセスは、ホルモンのＮ−末端部分をコー
ドするセクションが合成的に作られたハイブリッド遺伝
子の構築を含む。このような方法によると、第１アミノ
酸をコードするトリブレットの前にＡＴ（）タンパク合
成開始コドンを導入して成熟ホルモンを直接発現させる
ことがでとる。

最終産物の各鎖に各６個のオリゴヌクレオチドが含まれ
るように、長さ１１−１６塩基の１２個の一本鎖オリゴ
ヌクレオチドから合成二本鎖ＤＮＡを組立てた。ＤＮＡ
は、アミノ酸配列と所望のハ２７− イブリッド遺伝子の組立てに使用される制艮エンドヌク
レアーゼの認識部位とが、同程度に配列的に合成ＨＧＨ
コドン（５）に似るように選択された２４個のコドンな
含んでいた。プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡＫ挿入し易
いように、２つの遺伝子の合成部は、エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＴ及びＨｉｎｄ　ｍにより生じた接着末端に
配列的に対応する５′−末端に４塩基の一本鎖延長部を
含むように設計された。

２組９１２個のリン酸化オリゴデオキシヌクレオチドの
結合産物をＥｃｏＲＩ及び且１ｎｄｍで開裂し、所望の
結合産物を約８０　ｂｐのバンドとしてポリアクリルア
ミドゲルから単離した。次に適切に開裂されたｐＢＲ３
２２にこのＤＮＡを挿入し、正確さを確認するために合
成りＮＡクローンを配列決定によって解析した。

先駆物質ＢＧＭハイブリッド遺伝子及び発現ベクターを
構築するために使用される実験ステップ−２、ｓ− が第４図及び第５図に夫々示されている。先ず、シグナ
ルペプチドと成熟ホルモンの最初の２２個のアミノ酸と
をコードするｐＢＧＨ−１の領域が、第３図の遺伝子の
合成部分で置換された。要約すると、ＢＧＨアミノ酸２
３−１８６のコード配列を含む４９０　ｂｐのＰｖｕＴ
Ｉ断片が単離され、最初の２２個のアミノ酸とＮ−末端
メチオニンとをコードする配列を含むｐＢｓｙｎから単
離された合成Ｉで開裂し、２６０　ｂｐのＤＮＡ断片を
、前記の２つのエンドヌクレアーゼで直線化したｐＢＲ
３２２に挿入して、ｐＢ　Ｇ　Ｈｓｙｎ　１−５ｏを得
た。ハイブリッド遺伝子の構築を完結するために、ＢＧ
Ｈ残基９ｌ−１９０（及びＢＧＨｃＤＮＡの３′−非翻
訳部分）のコード配列を含むｐＢＧ）！−１からの４５
０　ｂｐのＰｓｔＩ断片をｐＢ　Ｇ　Ｈ８Ｙｎ＋−９０
の唯一のＰｓｔ１部位に挿入した。プラスミドｐＢＧＨ
ｓｙｎを制限マツプによって同定した。

Ｅ　、　ｃｏｌｉ中でのＴ（ＧＨの産生に使用したベク
ター　（５，３９）に極め【よく似たＢＧＭ発現ペター
を構築した。これは、同等の高い発現効率を得るためで
ある。プラスミドｐＨＧＨ２０７−１に於いて、Ｈ（）
Ｈの発現は且、二色すュｔｒｐプロモータのコントロー
ル下にあり、転写はｐＢＲ３２２（至）のＴ　Ｅ　ＴＲ
遺伝子の方向である。Ｂ（）！（発現ベクターの構築を
開始するために、相同Ｈ（）Ｉ（ハイブリッド遺伝子セ
クション（及びｔｒｐプロモータ領域）を除去したｐＨ
ＧＨ２０７−１（第５図上部）内にｐＢ　ＧＨｓｙｎか
らの５６１５　ｂｐのＢｃｏ　ＲＩ　−Ｐｖｕ■（部分
）ＤＮＡ断片を移動させた。得られたプラスミドｐＢＧ
Ｈｓｙｎ　０１８９に次に、３００　ｂｐのシュＲ１断
片に担持されたプロモータ領域を移入した。このプラス
ミドによって合成されるタンパクは、終りから２番目の
アミノ酸残基として、ＢＧＭの場合のアラニン残基（第
２図）に代えてグリシンを含むと予想される。これは、
（アミノ酸コドン１８７−１８８のＰｖｕＩＩから下流
側の）ｐＢＧＨｓｙｎ　Ｃ）１８９内のハイブリッド遺
伝子の端部がｐＨＧＨ２０７−１から誘導されるためで
ある。

正しいタンパクを発現するためにＢＧＭのＣ−末端をコ
ードする合成りＮＡ片をｐＢＲ３２２にクローニングし
た（第５図）。この合成りＮＡクローンとｐＢＧＨｓｙ
ｎＧ１８９から誘導された２つのＤＮＡ断片とから、第
５図の下部に示すように最終発現プラスミドｐＢ（）Ｈ
ｅｘ−１を組立てた。

ＰＧＨ発現ベクターの構築プロセスを第６図に概略的に
示す。Ｐ（）Ｉ（のアミノ酸残基２２　、２３をコード
する領域にＰｖｕＴＩ部位が存在しないので。

ＰＧＴ（ハイブリッド遺伝子の合成５′一部は、ｐＰＧ
Ｈ−１のコドン１６，１７に生じる涛旦旦■部位を介し
てｃＤＮＡクローンから誘導されたコード配列に接合さ
れた。ＰＧＨ５’−領域をコードする合成り　Ｎ　Ａの
対応する位置にも、心すエ■部位が取込ま３１− れた（第３図参照）。ｃＤＮＡクローン中に付加的Ａｓ
ｕ　Ｉ部位が存在するので、３つのＤＮＡ断片からＰＧ
Ｈハイブリッド遺伝子が組立てられた（第６図）。

ｐＰＧＨ−１から単離された７００ｂｐ１７）ヱ！１！
断片をｅｎｄｏ　　Ｒｓａ　Ｉで開裂し、得られた２０
０ｂｐのシ１■一旦」」、■断片を更に〜ｉｕＩで消化
した・５３　ｂｑの合成ＥｃｏＲＩ−ＡｓｕＩ断片クロ
ーンと７５ｂｐの込互旦Ｉ一旦且ａＩ断片と４８０ｂｐ
　（７）Ｒｓａ　Ｔ−シュＲ１断片とを互いに結合して
ハイブリッド遺伝子を構築した。この３部結合産物をＥ
ｃｏ　ＲＩ及びＰｖｕＴｌで開裂し、サイズ６００対に
対応するＤＮＡをポリアクリルアミドゲルから単離した
。次にこのＤＮＡを、ＢＧＭハイブリット遺伝子のＥｃ
ｏＲＩ−ＰｖｕｌＩ断片が除去された後のｐＢＧＨｅｘ
−１に挿入して、ｐＰＧＨ−１１を得た。ＰＧＩ（とＢ
Ｃ）Ｈとが同じＣ−末端アミノ酸配列を有するのでプラ
スミドｐＰＧ）！−１１はＰＧ）Ｉ３２− の正しいコード配列を含む。ｔｒｐ　　プロモータを含
む３００　ｂｐのμ狂Ｒ■断片をプラスミドｐＰＧＨ−
１１に挿入してこのプラスミドから発現ベクターを得た
。

ＰＧＨの細菌産生 新しく構築された発現ベクターについて、ＰＧＩ（を細
菌産生せしめる能力を測定した。ｔｒｐ−プロモータに
より発現を誘発するための公知の条件下で、プラスミド
ｐＰＧＨ＋＋ｅＭ−１で形質転換した細菌カルチャーを
増殖させた。第７図は、８Ｄ８−ポリアクリルアミドゲ
ル上で前記カルチャーから溶出したタンパク抽出物を示
す。約２２．０００ダルトンのタンパクに対応する顕著
なバンドが見られる。ｔｒｐプロモータからの転写が遮
断される条件下で増殖された細菌の抽出物では前記バン
ドが存在しない。２２，０００ダルトンのタンパクの出
現は、ＢＧＭ及びＰＧＨについてプラスのＲＩＡデータ
と相関関係があり、これらのタンパクが真に下垂体成長
ホルモンであることを示す。高密度発酵を用いるバ・ｌ
ロットテストによれば、ｐＰＧＨｅｘ−１の発現ベクタ
ーにより細菌カルチャー１σ当りＰＧＨ約１．５ｇとい
う収量が得られることが証明された・ 参考文献 １英国特許出願公開腐２０５５３８２Ａ２西独特許出願
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ｔｕｒｅ　　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｐｒａｅｇｅ
ｒ　　５ｃｉｅｎ−ｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ、（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ、Ｍ、Ｊ、。

ａｎｄ　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｒ６，ｅｄｓ、）１９８
２

【図面の簡単な説明】

第１図は、ウシ及びブタの成長ホルモンのコード配列を
含む３種のクローンｃＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
マツプを示す。点線は共通開裂部位を示す。インサート
の１つに示されたＡｓｕ　Ｔ部位は特有ではない。ｐＰ
ＧＨ−１とｐＰ（）Ｈ−２の潜在コード能力に関しては
第２図を参照されたい。 第２図は、ＰＣ）ＨのｃＤ　Ｎ　Ａヌクレオチド配列及
びタンパクアミノ酸配列を示す図である。ＰＧＨｃＤＮ
Ａ配列は、（シグナルペプチドをコードする配列で始ま
り３′−非翻訳領域のヌクレオチド４０で終る）ｐＰＧ
Ｈ−１と（アミノ酸残基３８のコドンで始まり３′−非
コード領域全部を含む）ｐＰＧＨ−２とから組立てられ
たものである。マイナス数字はシグナルペプチド中のア
ミノ酸残基を示し、プラスの数字は成熟ホルモン中のア
ミノ酸残基を示す。比較のために、ＢＧＨのｃＤＮＡヌ
クレオチド配列及びタンパクアミノ酸配列を示す（下線
を引いたアミノ酸残基は、Ｂ（）ＨとＰＧＨとに於いて
異なる）。 第３図は、ＢＧＨ及びＰＣ）ＨのＮ−末端部をコードす
る合成りＮＡ配列を示す図である。数字は、個々に合成
されたオリゴデオキシリボヌクレオチドを示しており、
各々の長さは矢印で示される。 オーバーラツプ構造により自己組立が保証され接着末端
はプラスミドｐＢＲ３２２中でのクローニングを可能に
した。点線で示す制限部位は、合成りＮＡをＣＤＮＡ配
列に接合するために使用された。 第４図及び第５図は、ＰＧＨの発現ベクター構築（第６
図参照）のための前駆物質としてＢＧＨをコードする合
成−天然ハイブリッド遺伝子を得るための構築チャート
を示す。ｐＢＧＨ−１は、３９− ｐＢＲ３２２中のＡｐ　　遺伝子中にクローニングされ
たＢＧＨｃＤＮＡ配列（淡い点彩部分）を含む。ｐＢ　
ｓｙｎはｐＢＲ３２２のＥｃｏ　ＲＩ部位とＨｌｎｄ　
ｍ部位とにクローニングされたＢＧＨの新しいＮ−末端
部をコードする合成りＮＡ（濃い点彩部分）を含む。ｐ
ＢＧＨｓｙｎｘ＝９０は新しく構築されたハイブリッド
遺伝子の（アミノ酸１乃至９０をコードする）５′−ハ
ーフを含んでおり、ｐＢＧＨｓｙｎ　は完全遺伝子を含
む。矢印は、５′→３′の配列コード方向を示す。 ｐＨＧＨ２０７−１は、プロモータＰ　ｔｒｐ　を備え
た成熟ＨＧＨ（４，ｔｓ、ａｓ）の細菌発現用遺伝子を
含む。プラスミドｐＢＧＨｓｙｎＧ　１８９とｐＢ（）
Ｈｓｙｎ（）　１８９　ｅｘ　とに於いて、ＨＧＨ遺伝
子中のＥ！ｃｏ　ＲＩ部位と遠位のヱｖｕＩ［部位との
間の領域は、ｐＢＧＨｓｙｎからの相同ＤＮＡ片で置換
されている（第４図参照）。ｐＢＲ３２２−０２はＢＧ
Ｉ（の正しいＣ−末端部をコードする合成４Ｏ− ＤＮＡ片（点彩部分）を含む。このＤＮＡ片は、ｐＢＧ
ＨｓｙｎＧ１８９ｅｘに組込まれ、ＢＧＭを細菌産生ず
るための機能遺伝子を含むｐＢＧＨｅｘ−１を生じる。 矢印は５′→３′の配列コード方向を示す。 （プラスミドｐＢＧＨ５ｙｎＧ　１８９　ｅｘ及びｐＢ
ＧＨｅｘ−１は内部で最初は夫々Ｔ）ＢＧＨ３３−３及
びｐＢＧＨ３３−４と相称されていた）。 第６図は、ＰＧＨの細菌発現ベクターの構築チャートを
示す。ｐＰＧＨ−１は、成熟ＰＧＨとシグナル配列の２
０個のアミノ酸残基とをコードするｃＤＮＡ断片（第１
図参照）を含む。このｃＤＮＡ断片は、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２０ＡｐＲ遺伝子のＰｓｔ　Ｉ部位にクローニン
グされている。 ｐＰｓｙｎは細菌ＰＣ）Ｈ遺伝子の新しい前端をコード
する合成りＮＡを含む、クローンされた合成１１）ＮＡ
とｃＤＮＡとの適当な組立が行なわれ、ｐＢＧＨｅｘ−
１中の相同ＤＮＡを置換してプラスミドＴ）ＰＧＨ−１
１を生じた。ｐＰＧＨ−１１ＫｐＢ（）Ｈｅｘ−１から
の３００　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　　断片上のプロモータ領
域Ｐ″１１．ｒｐを導入して細菌性産生ベクターｐＰＧ
Ｈｅｘ−１に変換した。矢印は５′→３′の配列コード
方向を示す。 第７図は、ベクターｐＢＧＨｅｘ−１とｐＰＧ’Ｈｅｘ
−１とによる細菌性タンパク産生の結果を示す図である
。Ｅ、ｃｏｌｉ　から得たタンパクリゼート全部を、１
２．５９１１の８Ｄ３−ポリアクリルアミド平板ゲル電
気泳動にかけた。ベクターｐＢＧＨｅｘ−１（レーンａ
、ｂ）、ｐＰＧＩ（ｅｘ−１（レーンＣ１ｄ）及びｐＨ
ＧＴ（２０７−１（レーンｅ）で細菌を形質転換した＠
細菌のトリブトファン飢餓によってｔｒｐ　　プロモー
タからの転写を誘発した（レーンａ、ｃ、ｅ）。レーン
ｆとｇとは分子サイズスタンダードを含む。矢印は、Ｂ
ＧＨ，ＰＣ）Ｅ及びＨＧＨの細菌性発現ベクターにより
ｔｒｉｌＰ　　コントロール下で発現された２２，００
０　　ダルトンのタン４３− 黛　　　８　２　　　　冨　　ｇ　　　　絽　　ｙ　　
　　冨　　２　　　　　ｂｔ　　　　　ｍｚ７ａｙ２　
　　百５イ５Ｅ　　狂　Ｃ 沼　　ｔ　　　　　ｉｉｌ　　ｘ　　　　　日　　ｔ（
Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１／１９　） ■発　明　者　ピータ−・エイチ・シーバーブアメリカ
合衆国カリフォルニア ９４１２２ザン・フランシスコ・カ ークハム８００ 手続補正書く方式） ％式％ ２、発明の名称　　　組換ＤＮＡ技術によって産生され
るブタ成長ホルモン ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　ジエネンテツク・イン］−ボレイテツド
４、代　埋　人　　　東京都新宿区新宿１−Ｊ目１番１
４号　山田ビル（郵便番８１６０）電話（０３＞　　３
５４−８６２３８、補止の内容　　　適正な図面（第２
図）を別紙の通り補充する。 （内容に変更なし） ＰＧＨｐｈｅ　ｃｙｓ　ｐｈｅ　ｓｅｒ　ｇｌｕ　ｔｈ
ｒ　ｌｉｅ　ｐｒｏ　ａｌａ　ｐｒｏ　ｔｈｒ６０ ＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧ
Ｃ丁ＡＴＧＡＴＩ’；ｅｔｍｅｊ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　実質的に第２図に示す如きアミノ酸配列を含
   む実質的に純粋なブタ成長ホルモン。
2. （２）　　遺伝的変容セルカルチャーの産生物たる特許
   請求の範囲第１項に記載のブタ成長ホルモン。
3. （３）　　天然グリコシレージョンを伴なわない特許請
   求の範囲第１項に記載のブタ成長ホルモン。
4. （４）実質的に第２図に示す如きブタ成長ホルモンをコ
   ードする配列を含むＤＮＡ配列。
5. （５）画成ＤＮＡ配列を発見させ得るＤＮＡ配列に有効
   に結合された特許請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ配列
   。
6. （６）トランスフェクトセルカルチャー中で特許請求の
   範囲第５項に記載のＤＮＡ配列を発現し得る発現ベヒク
   〃。
7. （７）特許請求の範囲第６項に記載のベヒクルでトラン
   スフェクトされたセルカルチャー。
8. （８）　　大腸菌（Ｊｃ○１１）株のトランスフェクト
   によって得られる特許請求の範囲第７項に記載の微生物
   。 ＋９＋　　ｌＷ乳動物セルカルチャーのトランスフェク
   トによって得られる特許請求の範囲第７項に記載のセル
   カルチャー。 開　プラスミドｐＰＧＨｅｘ−１゜ ＋１１１　　特許請求の範囲第１０項に記載のプラスミ
   ドでトランスフェクトされたセルカルチャー。 Ｈブタ成長ホルモンの産生を行なうぺ（遺伝的に変容さ
   れたセルカルチャー。 （ｌ湯　　本質的にブタ由来の他のタンパクを含まない
   ブタ成長ホルモンを含む物質。