JP2534221B2 - 牛のプレ成長および成長ホルモン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は牛のプレ成長ホルモンもしくは成長ホルモン
をコードするヌクレオチド配列を含有するDNA転移ベク
ターおよびこの転移ベクターを含有する微生物およびこ
の転移ベクターを製造する方法およびこの牛の成長ホル
モン配列を調製する方法に関する。

一実施態様では、このDNA転移ベクターは牛のプレ成
長ホルモンをコードするかもしくは牛の成長ホルモンを
コードするデオキシヌクレオチド配列を有する。

別の実施例では、牛のプレ成長ホルモンをコードする
このデオキシヌクレオチド配列は次の配列を有する正鎖
を備える： ここで、Ａはデオキシアデニル、 Ｇはデオキシグアニル、 Ｃはデオキシシトシルおよび Ｔはチミジルである。

さらに別の実施態様では、牛の成長ホルモンをコード
するこのデオキシヌクレオチドは次の配列： ここで、Ａはデオキシアデニル、 Ｇはデオキシグアニル Ｃはデオキシシトシルおよび Ｔはチミジルである。

もしくは次の配列： ここで、Ａはデオキシアデニル、 Ｇはデオキシグアニル Ｃはデオキシシトシルおよび Ｔはチミジルである。

を有する正鎖を備える。

さらに別の実施態様では、この転移ベクターはpBP348
である。

この発明のDNA転移ベクターは微生物を形質転換する
のに用いられ得る。この発明はこれら転移ベクターによ
り形質転換される微生物を提供する。

形質転換される微生物は融合蛋白を生産する。この融
合蛋白は、そのＣ−末端に牛のプレ成長ホルモンもしく
は牛の成長ホルモンのいづれかのアミノ酸配列を有しそ
のＮ−末端として一部の原核生物蛋白を有する。この発
明はこれら融合蛋白を提供する。

この発明は、また、牛の成長ホルモンをコードするデ
オキシヌクレオチド配列を調製する方法を提供する。こ
の方法は、牛のプレ成長ホルモンをコードするcDNA（デ
オキシヌクレオチド配列）を制限酵素HeeIIで開裂する
ことおよびこの開裂生成物をDNAポリメラーゼのクレノ
ウフラグメント（Klenow fragment）、T4DNAポリメラー
ゼもしくは３′−５′エキソヌクレアーゼを含有する群
から選択される酵素とインキュベートすることを包含す
る。

一実施態様では、クレノウフラングメントとのインキ
ュベートはATPの存在下で行われ、生成物はS1ヌクレア
ーゼで消化され、それにより牛の成長ホルモンのアミノ
酸２−191をコードするデオキシヌクレオチド配列が得
られる。このデオキシヌクレオチド配列は次の配列を有
する正鎖を備える： ここで、Ａはデオキシアデニル、 Ｇはデオキシグアニル Ｃはデオキシシトシルおよび Ｔはチミジルである。

さらに別の実施態様では、クレノウフラグメントとの
インキュベートはdATP、dGTP、dCTP、dTTPの存在下で行
われ、得られる生成物はdCTPの存在下でこのクレノウフ
ラグメント、T4DNAポリメラーゼもしくは３′−５′エ
キソヌクレアーゼを含有する群から選択される酵素とイ
ンキュベートされる。得られる生成物はS1ヌクレアーゼ
で消化され、それにより牛の成長ホルモンのアミノ酸１
−191をコードするデオキシヌクレオチド配列が得られ
る。このデオキシヌクレオチド配列は次の配列を有する
正鎖を備える： ここで、Ａはデオキシアデニル、 Ｇはデオキシグアニル Ｃはデオキシシトシルおよび Ｔはチミジルである。

この発明は、さらに、牛のプレ成長ホルモン配列を含
有するDNA転移ベクターを製造する方法を提供する。こ
の方法の特徴は、牛の成長ホルモンをコードするデオキ
シヌクレオチド配列を、ある転移ベクターを制限酵素で
開裂することにより調製されるDNA分子と反応させるこ
とにある。

一実施態様では、牛のプレ成長ホルモン配列を含有す
るプラスミドpBP348を製造する方法の特徴は、転移ベク
ターを制限酵素で開裂することにより調製されるDNA分
子がpBR322でありかつ制限酵素がPstIであることにあ
る。

この発明は、また、牛の成長ホルモン配列を含有する
DNA転移ベクターを製造する方法を提供する。この方法
の特徴は、牛の成長ホルモンをコードするデオキシヌク
レオチド配列を、ある転移ベクターを制限酵素で開裂す
ることにより調製されるDNA分子と反応させることにあ
る。

この発明は、さらに、発現転移ベクターを調製する方
法を提供する。この方法の特徴は、ある転移ベクターを
制限酵素で開裂することにより調製されるDNA分子が発
現制御領域内の部位で開裂されることにある。

この発明は、さらに、融合蛋白を製造する方法を提供
する。この融合蛋白は、そのＣ−末端として牛のプレ成
長ホルモンのアミノ酸配列もしくは牛の成長ホルモンの
アミノ酸配列を有しそしてそのＮ−末端として一部の原
核生物蛋白を有する。この方法の特徴は、この牛のプレ
成長ホルモンもしくはこの牛の成長ホルモンをコードす
るデオキシヌクレオチド配列を有する発現転移ベクター
により形質転換される微生物を培養することにある。

この発明は、また、牛の成長ホルモンを合成する方法
を提供する。この方法の特徴は、牛の成長ホルモンをコ
ードするデオキシヌクレオチド配列を有する発現転移に
ベクターにより形質転換される微生物を牛の成長ホルモ
ンをコードするこの配列の発現に適した条件下で培養す
ることおよびこの微生物の細胞破砕物もしくは培養物か
ら牛の成長ホルモンを精製することにある。

成長ホルモンは腺下垂（下垂体の前葉）において合成
されかつ分泌されるポリペプチドホルモンである。成長
ホルモンは、Ｎ−末端シグナルペプチドと成長ホルモン
配列とを含有する前駆体蛋白（プレ成長ホルモン pre-
growth hormone）として合成される。牛の成長ホルモン
のアミノ酸配列はすでに決定されている（Dayhoff,M.
D.,et al.,Atlas of Protein Sequence and Structure,
Vol,5,Supp.3,pp.245-352、National Biomedical Resea
rch Foundation,Washington,D.C.（1978））。

成長ホルモンは、成人前の期間が最高量ではあるが、
正常には生涯を通して生産される。このホルモンは成人
前の成長に必要とされる。成長ホルモンの機構は詳細に
は理解されていないが、成長ホルモンは骨格成長、窒素
保持、蛋白合成を促進させそしてグルコースと脂質との
代謝に影響することが知られている。言いかえれば、成
長ホルモンは一般的な物質合成代謝剤である。

牛の成長ホルモンの使用はその既知の上記生物活性に
基づいている。牛の成長ホルモンを小牛に投与して成長
増加速度と重量増加速度を増大させ、誕生から牛肉とし
て市場に出るまでの所要時間を短縮させ得る。この結果
の肉生産の増加は意味深いものである。さらに、牛の成
長ホルモンはほんの２、３のアミノ酸だけが羊の成長ホ
ルモンと異なる。それゆえ、牛の成長ホルモンを羊に投
与して牛の場合と同じ目的を羊に達成させることができ
る。すなわち、成長増加と重量増加の速度を増大させそ
して肉生産を増大させることができる。牛の成長ホルモ
ンを豚や他の動物に投与して同じ目的を達成させること
も可能である。

DNA配列をクローニングするための基礎技術は現在既
知である。例えば、Seeburg,P.H.,et al.、Nature,270,
486（1977）、は、ねずみの成長ホルモン遺伝子のクロ
ーニングを述べている。

Shine,J.,et al.,Nature,270,494（1977）は、人間の
じゅう毛膜のソマトマモトロピン遺伝子のクローニング
を述べている。そして、Derynck,R.,et al.,Nature,28
5,542（1980）は、人間の線維芽細胞のインターフェロ
ン遺伝子のクローニングを述べている。

微生物の異種DNAを発現する方法は現在既知である。
その考え方は、異種DNAコード配列が発現オペロン内の
部位においてDN転送ベクターに挿入されるというもので
ある。ハイブリッド蛋白の生産には、その挿入配列はオ
ペロンのコード配列と共にリーディングフレーム内にな
ければならず、かつ翻訳に関し同一方向に向いていなけ
ればならない。条件があると、オペロンの翻訳は、次の
ようにこの挿入コード配列に対し「リードスルー」とな
る。すなわち、生産蛋白が、発現できるオペロンにより
コードするされるＮ−末端アミノ酸配列を有し次いでそ
の挿入物をコードするアミノ酸配列を有する融合蛋白で
あるというように（Polisky、B.,et al.,Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA,73,3900（1976）;Itakura,K.,et al.,Scienc
e 198,1056（1979）．）。数個の発現可能オペロン、例
えばβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼおよびト
リプトファンのもの、が用いられている。

ここに用いられている略語は通常認められかつ当業者
に用いられている略語である。これら略語は、例えばそ
れ以上の説明なしにJ.Biol.Chem.により受け入れられて
いる。

本発明は、牛のプレ成長ホルモンもしくは牛の成長ホ
ルモンをコードするDNAのクロニングと、微生物のクロ
ーン化DNAの発現とを開示する。

牛のプレ成長ホルモンをコードするmRNAは牛の下垂体
から単離される。そのmPNAの逆転写（cDNAコピー）が調
製され転移ベクターに挿入される。牛の成長ホルモンを
コードするデオキシヌクレオチド配列は、牛のプレ成長
ホルモンのcDNAからの前配列（プレ・シークエンス）を
コードする配列を加水分解することにより調製される。
この転移ベクターは、クローン化cDNAを発現する微生物
を形質転換するのに用いられる。

以下に本発明を詳述する。

牛の成長ホルモンをコードするDNA配列はこのcDNA法
を使うことにより得られる。cDNA法の基本的技法は既知
であり、前記Seebury,P.H.,et al.およびDerynck,R.,et
al.により説明されている。cDNAは牛の下垂体から抽出
されるRNA調製物を鋳型として用いることにより合成さ
れる。

RNAは通常の技術を用いて牛の下垂体から単離され
る。ポリアデニレートRNAはアフィニティクロマトグラ
フィーにより単離される。このポリアデニレートRNAが
完全なものかどうかは、Miller,W.L.and McCarthy,B.
J.,J.Binil.Chem.,254,742（1979）およびMartial,J.
A.,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,74,1816（1977）に
より述べられているように、ポリアデニレートRNAにつ
いて無細胞系で翻訳を行うことおよびLaemmli,U.K.,Nat
ure,227,680（1970）により述べられているようにその
生産蛋白を分析することにより、評価される。牛の成長
ホルモンは、さらに、前記Martial,J.A.,et al.,Proc.N
at.Acad.Sci.USA、により述べられているように、免疫
沈澱反応により同定される。

ポリアデニレートRNAは、通常技法を用いて二本鎖cDN
Aコピーを作製するための鋳型として用いられる。最初
のcDNA鎖は、前記Miller and McCarthy,およびMonahan,
J.J.,et al.,Biochem.,15,233（1976）により述べられ
ているように、リバーストランスクリプターゼ、オリゴ
−dTプライマーおよびこのポリアデニレートRNAを用い
て合成される。RNAはアルカリ消化により除去される。
一本鎖cDNAは、リバーストランスクリプターゼによる二
本鎖の合成用として用いられる。一本鎖ヘヤピンループ
は、S1ヌクレアーゼによる消化により除去される。（Le
ong,J.A.,et al.,J.Virol.,9,891（1972）;Ullrich,A.,
et al.,Science,196:1313（1977）。

このcDNAは今や適当な転移ベクターへ挿入できる状態
にある。適当な転機ベクターは、Esch-erichia coliやB
acillus subtilisのような細胞、酵母（Saccharomgces
cerevisiae）、Neurospora crassaのinl,cspおよびesp
変異株および動物細胞の培養細胞を形質転換できるベク
ターを包含する。E.coliを形質転換できる転移ベクター
であってこの発明での使用にふさわしいベクターの例に
は次ののもがある。プラスミドpSC101、pMB9、pBR313、
pBR315、pBR316およびpBR322そしてバクテリオファージ
すなわちCharon 3A,Charon 4A,Charon 16AおよびλgtWE
S・λＢから導かれるベクター。これら転移ベクターの
調製と特性を記述する文献を表１に列挙する。

E.coliを形質転換するための他の適当なベクターはSi
nsheimer,R.L.,Ann.Rev.Biochem,46,415（1977）に述べ
られている。B.subtilisはIord-anescu,S.,J.Bacterio
l.,124,597（1964）およびEhrlich,S.D.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,74,1680（1977）に述べられている。一つの
そのようなベクターはプラスミドpC194として同定され
ている。

酵母DNA例えばプラスミドおよび／もしくは染色体と細
菌DNA例えばプラスミドとを含有するハイブリッドプラ
スミドは酵母を形質転換するのに用いられる。そのよう
なプラスミドはBeggs,J.D.,Nature 275,104（1978）;As
iav,C.L.and Carbon,J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76,38
29（1979）；およびKingsman,A.K.et al.,Gene 7,141
（1979）に述べられている。動物細胞の培養細胞を形質
転換するのに利用され得る転移ベクターはアデノ欠損ウ
イルス、SV-40欠損ウイルスおよびポリオマウイルスを
包含する。

このcDNAは従来技法を用いて転移ベクターに挿入され
る。cDNAはその転移ベクターのユニークないづれかの制
限部位に通常挿入される。Charon3Aと4AおよびλgtWES
・λＢはユニーク部位を有さない。その結果、限定数の
制限部位がこれらベクター用に用いられる。種々の転移
ベクターのユニーク制限部位およびベクターCharon 3A
と4AおよびλgtWES・λＢの有用な制限部位を表２に示
す。

表２ 転移ベクター ユニーク制限部位 pSC101 EcoRi,HindIII,SalI,BamHI,Hp aI,SmaI pMB9 EcoRi,HindIII,SalI,BamHI pBR313 EcoRi,HindIII,SalI,BamHI,Hp aI,SmaI,XmaI pBR315 EcoRi,HindIII,SalI,BamHI,Ps tI pBR316 HindIII,SalI,BamHI,PstI pBR322 EcoRI,HindIII,SalI,BamHI,Ps tI pC194 HindIII Charon 16A EcoRI,SstI Charon 3A EcoRI Charon 4A EcoRI λgtWES・λＢ EcoRI 一般に、このcDNAは、選択を容易にするために表現型
特性（phenotypic trait）内の制限部位に挿入される。
例えば、psC101、pMB9、pBR131、pBR315、pBR316および
pBR322のHindIII、SalI and BamHIはテトラサイクリン
耐性遺伝子もしくはその制御領域内にある。この部位で
の挿入によりテトラサイクリン耐性を失うことになる。
cDNAは制限部位リンカーもしくはデオキシヌクレオチド
テーリングを用いて転移ベクターに挿入され得る。前者
においては、上で論じたような特別の制限エンドヌクレ
アーゼの認識部位を含有する合成ヌクレオチドがcDNAに
ブラントエンド結合され得る。このcDNAと転移ベクター
とは制限エンドヌクレアーゼと別々にインキュベートさ
れ、次いでアニールされ、cDNAを含有する転移ベクター
を形成する。後者においては、cDNAは、Roychoudhury,
R.,et al.,Nucl.Acids Res.,3,863（1976）により述べ
られているように、デオキシヌクレオチドおよびターミ
ナルトランスフェラーゼを用いて結合され得る。転移ベ
クターは制限エンドヌクレアーゼでの消化の後、同じ手
順で相補性のデオキシヌクレオチドを用いてテール化さ
れ得る。テール化された転移ベクターとテール化された
cDNAとは次いでアニールされ、cDNAを含有する転移ベク
ターを形成する。例えば、cDNAはdC−テール化され得、
転移ベクターはPstI部位で開裂されdG−テール化され得
る。

cDNAを含有する転移ベクターは次いで適当な宿主を形
質転換するために用いられる。ウイルス転移ベクターと
してふさわしい宿主は、E.coli,B.subtilis、酵母、N.c
rassa、および組織培養の動物細胞を含む。これら宿主
の各々を形質転換できる転移ベクターは、すでに上述さ
れている。E.coliの三つの変異株が従来から利用されて
いる。それはχ1776,RRIおよびHB101である。E.coli χ
1776はCurtis,R.,Ann.Rev.Microbiol.30,507（1976）お
よびU.S.Patent No.4,190,495に述べられている。E.col
i RRIはDugaiczyk,A.,et al.,Molecular Mechanisms in
Control of Gene Expression,p.543に述べられてい
る。E.coli HB101はKedes,D.H.and Thomas,C.A.Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA73,1537（1976）に述べられている。こ
れら適当な宿主は広く知られた技法で形質転換される。
例えば、Ecoli χ1776は、Cooke,N.E.,et al.J.Biol.Ch
em.,255,6502（1980）に述べられているように、cDNA含
有転換ベクターにより形質転換される。コロニーは広く
知られた技法により選択されそして／もしくはスクリー
ニングということで選択され得る。コロニーは、（１）
適当な制限エンドヌクレアーゼによりcDNAを除きかつそ
れを電気泳動およびハイブリダイゼーションにより分析
すること（Southern,E.M.,J.Mol.Biol.98,503（197
5））、もしくは（２）Grunstein,M.and Hogness,D.S.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA72,3961（1975）に述べられて
いるようにレプリカプレーティング行いそして適当なプ
ローブでハイブリダイズすること、もしくは（３）RIA
又は他の技法によりコロニーの発現を直接調べること、
によりスクリーニングされ得る。

牛の成長ホルモンをコードするDNAは、牛のプレ成長
（プレ）ホルモンをコードする挿入物から調製され得
る。この前ホルモンをコードするDNAは、適当な制限エ
ンドヌクレアーゼにより除去される。例えば、cDNAがプ
ラスミドpBR322のPstI部位に挿入される場合には、この
cDNA挿入物は牛の成長ホルモン（GH）用のこのcDNAが二
つの内部のPstI部位を含有するのでPstIとの部分消化に
より除去され得る。cDNAは次いでHaeIIで消化される。
もしくは、pBR322から導かれる組み換えプラスミドはHa
eIIで消化されると一部のcDNA挿入物が除去され得る。
Ｎ−末端シグナルペプチドをコードするDNAおよび成長
ホルモンのＮ−末端Alaをコードする三つの塩基のうち
の二つがこのHaeII消化により除かれる。これらの塩基
は挿入物をDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
とデオキシヌクレオチドと共にインキュベートすること
により回復する。Alaをコードする塩基はcDNAをdATPの
存在下でクレノウフラグメント、T4DNAポリメラーゼも
しくは３′−５′エキソヌクレアーゼとインキュベート
することにより除かれ得る。このクレノウフラグメント
については、Klenow,H.and Henningsen,I.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA65,168（1970）により述べられている。成
長ホルモンをコードするcDNAは次いで上記の適当な転移
ベクター内に挿入される。

クローンされたDNAは細菌内で発現されて融合蛋白も
しくは牛の成長ホルモンそのもののいづれかを生ずる。
この融合蛋白は挿入配列によりコードするされた牛の成
長ホルモンを有する。好みに応じて採用できる技法は数
種ある。それは、（ａ）正確な所望の翻訳出発点を提供
するためにコード配列を修飾すること；（ｂ）最適発現
ベクターを選択もしくは組立てること；（ｃ）宿主の生
体内処理活性を利用するかもしくはインビトロ化学手段
によるかのいづれかによる翻訳後のプロセッシング；そ
して（ｄ）直接的発現を包含し得る。融合蛋白が発現さ
れるとき、クローンされたヌクレオド配列を修飾するこ
とは、生ずる配列により正しいリーディングフレームの
挿入物を翻訳できかついかなる終止コドンも挿入配列の
開始コドノの前に現れないかぎり、一般的に不要であ
る。

プレ成長ホルモンもしくは成長ホルモンは、例えばpB
R322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のPstI部位（Villa-Koma
roff,et al.,Proc.Nat.Acaf.Sci.USA,75,3727（1978）;
Serburg,P.,et al.,Nature 274:795（1978））、β−ガ
ラクトシダーゼのlac制御領域およびコード配列を運ぶp
BR322のEcoRI部位（前記Itakura,K.）もしくはプラスミ
ドptrpED50のtrpD遺伝子のHindIII部位（Martial,J.,et
al.,Science,205,602（1979）を含む発現オペロン（発
現ベクター）内の適切な部位へのcDNAの挿入により、融
合蛋白として発現される。正しいリーディングフレーム
を達成するために１もしくは２のヌクレオチド長さの配
列を修飾するのは、当該技術において周知である。テー
リング操作によりpBR322のPstI部位での挿入が正しい相
とリーディングフレーム内でおきる確率は1/6である。

プレ成長ホルモンもしくは成長ホルモンは、インビト
ロでの特殊な開裂を受けやすい融合蛋白から調製され
る。クローンされたヌクレオチド配列は、修飾され蛋白
分解酵素に特異性を与えるアミノ酸配列をコードする。
有用な配列はAspAspAspAspLysであり、これは、1980年
２月29日出願の米国特許出願第125,878号に述べてある
ように、酵素エンテロキナーゼにより選択的に開裂され
る。その出願に述べられているように、上記アミノ酸配
列をコードする連結ヌクレオチド配列がプレ成長ホルモ
ンのアミノ末端をコードするヌクレオチド配列に隣接し
て挿入される。

プレ成長ホルモンのためのそのような挿入にはこのプ
レ成長ホルモンコード配列の５′末端のヌクレオチドを
除去することによりもとのcDNA挿入物を修飾することが
必要である。上記の成長ホルモン用cDNA挿入物は修飾の
必要がない。プレ成長ホルモン用挿入物の挿入は、次の
いづれかの手順により達成される。その手順は、３′エ
ンドヌクレアーゼもしくはT4DNAポリメラーゼを用いて
挿入物の３′末端を制御下で消化するか、もしくは所望
の出発点の５′側への点で制限エンドヌクレアーゼによ
り開裂を行うこととこのようにして除去された所望配列
のその点を修復するべく化学的合成を行うこととを組合
わせるかのいづれかである。これらの手順のさらに詳細
は米国特許願第125,878号参照のこと。これらの手順に
続いて、望ましくはT4DNAポリメラーゼおよびS1ヌクレ
アーゼを用い、プレ成長ホルモンをコードするし５′非
翻訳領域を欠くcDNA配列を得る。前記アミノ酸配列をコ
ードするリンカーヌクレオチド配列は、Valenzuela et
al.,Nature,280,815（1979）により述べられているよう
に、DNAリガーゼを用いてプレ成長ホルモンもしくは成
長ホルモンのいずれかをコードするcDNAにブラントエン
ド結合される。その修飾されたcDNA配列は前述のように
融合蛋白発現ベクターに挿入される。E.coli HB101,RR
I、もしくはχ1776、もしくは他の細菌のような宿主細
菌は、挿入されたプレ成長ホルモンコード領域を有する
組み換えベクターにより形質転換される。転換体はアン
ピシリン耐性により選択される。転換体は次いで融合蛋
白の発現に適した条件下で生育される。融合蛋白の発現
後、そのプレ成長ホルモンもしくは成長ホルモンは、エ
ンテロキナーゼを用いて酵素による加水分解により開裂
される。

適当な発現転移ベクターを用いることにより本発明の
プレ成長ホルモンは直接発現される。すなわち、どの原
核生物蛋白にも融合しない。直接的発現についてその根
底となる原理は、挿入されたDNAセグメントが細菌の制
御領域により正常に転写されそして翻訳されるコードセ
グメントにとって代わるということである。保持される
べき制御領域の本質的成分は発現ユニットと称される。
発現ユニットは、宿主微生物において行動し得るプロモ
ーターとリボゾーム結合部位とを包含する。融合蛋白の
宿主蛋白をコードするヌクレオチドを正確に除去するこ
とは必要ではない。リボゾーム結合部位と開始コドン
（AUG）との関係は、開始コドンがリボゾーム結合部位
の３〜11ヌクレオチド内のどこかに位置し得るというも
のである。（Shine et al.、Proc.Nat.Acid.Sci.USA,7
1,1342（1974）;Steitz,J.,et al.,Proc.Nat.Acid.Sci.
USA,72,4734（1975））。この３〜11ヌクレオチド領域
において、出くわす最初のAUGが翻訳のためのリーディ
ングフレームを設定する。ptrpE30の場合には、最小量
の23〜29ヌクレオチドをHindIIIから除去することによ
り、トリプトファン・オペロン・コントロール下での発
現単位に挿入するための部位が提供される。このPtrpE3
0は上記ptrpED50から導かれかつトリプトファンオペロ
ンのオペレーター、ブロモーター、アテニュエーターお
よびリボゾーム結合配列をHindIII部位が続くtrpE蛋白
の７アミノ酸をコードするヌクレオチド配列と共に含有
している。

プレ成長ホルモンの直接発現用には、例えばもとのcD
NA挿入物が５′非翻訳領域を除去するべく上述のように
修飾される。直接発現のベクターは、上述のように、T4
DNAポリメラーゼとS1ヌクレアーゼを用いて23〜29ヌク
レオチドを除くことによりptrpE30を修飾して組み立て
られ得る。BamHIエンドヌクレアーゼの制限配列を含有
する結合ヌクレオチド配列は、前記Valenzuela,et al.
の方法により、修飾cDNA挿入物および修飾trpE30の両者
にブラントエンド結合される。これは、Ullrich,A.,et
al.,Science,196,1313（1977）に述べられているよう
に、挿入を容易にするために行われる。E.coli HB101、
RRI、もしくはχ1776もしくは他の細菌のような適切な
宿主は挿入プレ成長ホルモンコード領域を有する組み換
えベクターにより形質転換される。転換体はアンピシリ
ン耐性により選択され次いでプレ成長ホルモンの発現に
ふさわしい条件下で培養される。

成長ホルモンはGoeddel,D.V.,et al.,Nature,281,544
（1979）に述べられる手順に従って直接発現され得る。
もしくは、BamHI部位と開始コドン（AUG）とを含有する
リンカーヌクレオチド配列は成長ホルモンをコードする
cDNAにブラントエンド結合され得る。この修飾cDNAは次
いで上記のように修飾ptrpE30に挿入される。

プレ成長ホルモンは、シグナルペプチドを有する疎水
性アミノ酸のＮ−末端配列を除去することにより、成長
ホルモンに転換される。シグナルペプチドのインビトロ
除去は、Jackson,R.C.and Blobcl,G.,Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,74,5598（1977）に述べられているように、形質
転換された誘導細胞から抽出される蛋白を「粗」ミクロ
ゾーム調製物で処理することにより行われる。シグナル
ペプチドの生体内除去は、プレ成長ホルモンコード配列
の細菌による直接発現の間に起こり得る。細菌と哺乳動
物のシグナルペプチドは配列が類似している。哺乳動物
のシグナルペプチドを有する蛋白は細菌細胞により処理
され得、その結果、ペリプラスミック空間もしくは培養
中へ成長ホルモンを分泌することになる。

既述のように合成されるプレ成長ホルモンおよび成長ホ
ルモンは、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび分別溶解
技法を含む当該技術の周知技法により精製される。

本発明の詳細を、次の実施例によりさらに述べる。こ
れら実施例では、制限エンドヌクレアーゼでの消化は核
酵素の最適条件のもとで行われた。制限エンドヌクレア
ーゼ、それらの命名法および部位特異性についてRobert
s,R.,Crit.Rev.Biochem.,4,123（1976）により詳述され
ている。酵素は市販のものである（New England Biolab
s,Cambridge.Massachusetts）。特にことわりがない限
り、供給元の指示による最適条件が採用された。リバー
ストランスクリプターゼはDr.J.Beard,Life Sciences.I
nc.,St.Petersburg,Florida.から供給された。リバース
トランスクリプターゼの使用と適切な反応条件について
はSeeburg、P.H.,et al.,Nature 276,795（1978）；前
記Seeburg,P.H.,et al.、およびShine,J.,et al.により
述べられている。T4DNAポリメラーゼはNew England Bio
labs.から入手した。T4DNAポリヌクレアーゼの使用と適
切な反応条件については米国特許願125,878に述べられ
ている。ミクロコッカスのS1ヌクレアーゼはMiles Labo
ratories,Elkhart,Indianaから入手した。S1ヌクレアー
ゼの使用と適切な反応条件は前記Ullrich,A.により述べ
られている。ターミナルデオキシヌクレオチドトランス
フェラーゼはEnzo Biochemicals,New York,New York.か
ら入手した。この酵素の使用と適切な反応条件は前記Ro
ychoudhury et al.により述べられている。DNAポリメラ
ーゼＩのクレノウフラグメントはBoehringer Biochemic
als,Indianapolis,Indiana.から入手した。

実施例１ 牛の成長ホルモンcDNAの合成 雌牛の下垂体をと殺後すぐに集め、液体窒素内でただ
ちに凍結した。トータルRNAはグアニジンチオシアネー
ト溶液中にその下垂体をホモジナイズすることにより調
製された（Chirginwin,J.M.,et al.,Biochem.,18,5294
（1979））．このRNAを、前記Ullrich,A.,et al.により
述べられているように、5.7MのCsCl中で遠心分離した。
RNAを次いでフェノールで抽出しそしてエタノール沈澱
した。ポリアデニレートRNAは、前記Miller and McCart
hy and Aviv,H.and Leder,P.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,6
9,1408（1972）により述べられているように、オリゴdT
セルロース・アフィニティ・クロマトグラフィーを用い
て精製した。

そのポリアデニレートRNAは、前記Miller and McCart
hyおよびMartial,A.,et al,（1977）に述べられるよう
に、ねずみの網状赤血球を用いて無細胞系において翻訳
された。この系で合成される牛のプレ成長ホルモンを、
前記Martial,J.A.,et al.（1977）により述べられてい
るように、異種の抗−羊成長ホルモン抗血清を用いて免
疫沈澱し、フォルマリン固定されたStaphylococcus aer
eus Cowan株Ｉへ吸着させることにより調製した。その
³⁵S−蛋白を、前記Laemmliにより述べられているよう
に、12.5％SDSスラブポリアクリルアミドゲルで電気泳
動にかけた。これを分析して、牛のプレ成長ホルモンを
コードするポリアデニレートRNAが全下垂体ポリアデニ
レートRNAの約12.6％に相当することがわかった。

ポリアデニレートRNAは、Miller and McCarthy,and M
onahan et al.により述べられている手順によりリバー
ストランスクリプターゼを用いて一本鎖cDNAに逆転写さ
れた。その一本鎖cDNAを、フェノール抽出しＧ−50セフ
ァデックス（商標Pharmacia,Inc.,Uppsala,Sweden）ク
ロマトグラフィーにかけそしてエタノール沈澱した。一
本鎖cDNAを、上記のように、リバーストランスクリプタ
ーゼを用いてcDNAの第２鎖の合成用に用いた。cDNAの第
１鎖の３′末端での一本鎖「ヘヤピンループ」は、前記
Leong et al.およびUllrich,A.,et al.により述べられ
ているように、S1ヌクレアーゼでの消化により除去し
た。二本鎖cDNAはフェノール抽出、Ｇ−50セファデック
スクロマトグラフィーおよびエタノール沈澱により精製
した。その二本鎖cDNAは、前記Roychoudhury et al.に
より述べられているように、dCTPとターミナルトランス
フェラーゼとを用いて３′dCMP結合された。

プラスミドpBR322は、PstIエンドヌクレアーゼにより
開裂されそして前記の結合（tailing）方法によりdGMP
で結合された。ただし、dGTPがdCTPの代わりに用いられ
た。dG結合し、PstI開裂したプラスミドpBR322の5ngとd
G結合した二本鎖cDNAの20ngとが前記Cook,et al.により
述べられているように50μｌ反応中でアニールされた。

プラスミド調製物によるE.coli χ1776の形質転換は
次のように行なった。E.coli χ1776を75mMのCaCl₂、5m
MのMgCl₂、10mMのトリス、pH7.5において４℃で60分間
次いで41℃２分間インキュベート（incubation）するこ
とによりDNA透過性とした。形質転換されたコロニーを
テトラサイクリン耐性により選択した。クローンされた
DNAの存在は、前期Grunstein and Hognessにより述べら
れているように、牛の下垂体の³²P標識したcDNAを鮮明
に調製するコロニーハイブリダイズにより確めた。プラ
スミドDNAは、前期Southernの方法により、選択コロニ
ーから調製し、PstIで切断し、１％アガロース電気泳動
にかけ、臭化エチジウム染色し、撮影しその最後にニト
ロセルロースフィルターへ移した。成長ホルモン配列が
この転移DNA中に存在することは全長にわたってクロー
ンされたねずみホルモンcDNAへのハイブリダイズにより
確かめ（前記Seeburg,P.H.,et al）そしてニックトラン
スレーションにより標識した（Maniatis,R.,et al.,Pro
c.Nat.Acad.Sci.USA,72,1184（1975）。ニックトランス
レーションされたDNAとハイブリダイズした一つのクロ
ーンが得られ、pBP348と命名した。その挿入物は831の
塩基対を含有する。

実施例２ cDNAの配列分析 プラスミドpBP348をPstIで切断し、そしてそのDNAフ
ラグメントの５′末端のホスフェートをアルカリ性ホス
ファターゼで除去しポリヌクレオチドキナーゼを用いて
〔³²P〕リン酸と置換した。その後の種々の他の制限エ
ンドヌクレアーゼによる切断、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動、およびDNAのバンドの染色とオートラジオグ
ラフィーとにより、クローンされたDNAの制限マップか
ら得られる。大量のpBP348を次いで一度に調製し、〔γ
³²P〕ATPとポリヌクレオチドキナーゼで標識し、次いで
他の酵素で切断して一方の末端が標識されたDNAフラグ
メントを得る。これらのフラグメントをポリアクリルア
ミドゲルからの溶出により調製しそして前記Cooke et a
l、およびMaxam,A.M.and Gilbert,W.Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA,74,1560（1977）により述べられているように配
列させた。挿入cDNAの配列を、センス鎖、すなわち各mP
NAに順次相当する鎖、によりコードするされる対応する
推定アミノ酸配列と共に第１図に示す。

正しいリーディングフレームは、実質的な挿入物蛋白
の終止コドンが欠けていることにより認識される。アミ
ノ酸位置の番号付けは、牛の成長ホルモンのアミノ末端
アミノ酸から始まり正方向にカルボキシ末端に向かって
進み、そして負方向に翻訳開始点と思われる最初のAUG
コドンに向かって進むかたちで行われる。これら配列に
より示唆されることは、多くの他のホルモンと同様に、
成長ホルモンの合成は翻訳後のプロセッシングを包含す
るということである。成長ホルモンmRNAの翻訳により、
エンドプラスミックレティキュラムに移行する間に遊離
されるシングルペプチドを含有する前駆体、すなわちプ
レ成長ホルモンを生ずる。

実施例３ （Ａ） 実施例１をプラスミドpBR322の代わりにプラス
ミドpBR315を用いてくり返えす。組み換えクローンの選
択を含むすべての条件は既述のとおりである。挿入物は
実施例２において述べたように除去され分析されて、第
１図の配列を有する約831塩基対のDNAを得る。

（Ｂ） 実施例１をプラスミドpBR322の代りにプラスミ
ドpBR316を用いてくり返えす。すべての条件は実施例１
に述べたものと同一である。挿入物の除去と分析とは実
施例２に述べたように行ない第１図の配列を有するDNA
を得る。

実施例４ この例用に牛のプレ成長ホルモンをコードするcDNAを
実施例１において述べられているように調製する。この
例および後に用いるすべての制限部位リンカーをSchell
er,R.H.et al.,Science 196177（1977）により述べられ
ているように調製する。この例と後に用いる制限エンド
ヌクレアーゼはNew England Biolabs,Beverly,Massachu
settsから入手し、供給元の指示による最適条件を採用
する。E.coli χ1776の形質転換は実施例１で述べたよ
うに行なう。

（Ａ） 配列５′−CCAAGCTTGG−３′を有するHindIII
リンカーの実施例１で調製したcDNAへの結合は、Valenz
uela,P.,et al.,Nature 280,815（1979）に述べられて
いるように、T4DNAリガーゼを用いたブラントエンド結
合により行なう。結合後、生成物はUllrich,A.et al.,S
cience 196,1313（1977）により述べられる手順に従っ
てHindIIIもしくはHsuIで消化する。プラスミドpBR322
は、前記Ullrich,A.et al.により述べられているよう
に、HindIIIもしくはHsuIのいづれかを用いてHindIII制
限部位において開裂しそしてアルカリ性ホスファターゼ
で処理する。エタノール沈澱の後、そのホスファターゼ
処理開裂pBR322は、前記Ullrich,A.et alにより述べら
れているように、HindIII粘着末端を含有するcDNAに結
合される。E.coli χ1776はこの結合混合物で形質転換
され転換コロニーはテトラサイクリン感受性により選択
される。クローンされたDNAの存在は実施例１で述べた
ように確かめる。ニックトランスレーションされたDNA
とハイブリダイズした挿入物を含有するコロニーを得
る。挿入物は実施例２で述べたようにHindIIIもしくはH
suIでの消化により除き分析される。その挿入物は約830
塩基対を有し第１図に示す配列を有する。

（Ｂ） 実施例４（Ａ）をくり返す。そこでは、数個の
ベクターがpBR322の代わりに用いられる。この例では、
プラスミドpSC101、pMB9、pBR313、pBR315およびpBR316
がpBR322の代わりに用いられる。組み換えクローンの選
択を含む全ての条件は（Ａ）で述べたものである。全プ
ラスミドについて同一結果が得られる。すなわち、第１
図の配列を有する挿入物含有組み換えプラスミドが各場
合に得られる。

（Ｃ） 実施例４（Ａ）をくり返す。そこでは、数個の
他の制限部位リンカーおよび制限エンドヌクレアーゼが
用いられる。この例では、SalIとBamHI用リンカーがHin
dIII用リンカーの代わりに用いられる。これらリンカー
の配列は５′−GGTCGACC−３′および５′−CCGGATCCGG
−３′である。SalIリンカーが用いられるとき、リンカ
ー処理cDNAおよびpBR322は制限エンドヌクレアーゼSalI
により開裂される。BamHIリンカーが用いられるとき、
制限エンドヌクレアーゼはBamHIである。組み換えクロ
ーンの選択を含むすべての条件は４（Ａ）で述べたもの
である。リンカーと制限エンドヌクレアーゼの両方につ
いて、同一の結果が得られる。

（Ｄ） 実施例４（Ａ）をくり返す。そこでは、プラス
ミドpSC101、pMB9、pBR313、pBR315、およびpBR316がpB
R322の代りに用いられる。すべての条件は実施例４
（Ｃ）で述べたもの同一であり、同一の結果が得られ
る。すなわち、各場合について第１図の配列を有する挿
入物が得られる。

（Ｅ） 実施例４（Ａ）をくり返す。そこでは配列５′
−CCGAATTCGG−３′を有するEcoRI制限リンカーがHindI
IIリンカーの代りに用いられる。EcoRIがHindIII（Hsu
I）の代りに用いられる。すべての条件は既述のもので
ある。ただし、組み換えコロニーはテトラサイクリン感
受性になっては選択されない。クローンされたDNAの存
在は実施例１で述べたようになされる。第１図の配列を
有する挿入物含有組み換えクローンが得られる。

（Ｆ） 実施例４（Ｅ）をくり返えす。そこでは、プラ
スミドpSC101、pMB9、pBR313そしてpBR315がpBR322の代
りに用いられる。実施例４（Ｅ）に述べたのと同一の条
件を用い結果が各プラスミドについて得られる。

（Ｇ） 実施例４（Ａ）をくり返す。そこでは配列５′
−GCTGCAGC−３′のPstI制限リンカーとPstIとがHindII
IリンカーとHindIII（HsuI）の代りにそれぞれ用いられ
る。同一条件を採用する。ただし、組み換えクローンの
選択は実施例１に述べたように行う。第１図の配列を有
する組み換えクローンが得られる。

（Ｈ） 実施例４（Ｇ）をくり返えす。そこでは、プラ
スミドpBR315とpBR316がpBR322の代りに用いられる。実
施例４（Ｇ）で述べたのと同じ条件を用い同一結果が得
られる。

（Ｉ） 実施例１、３（Ａ）、３（Ｂ）および４（Ａ）
〜（Ｈ）を、E.coli χ1776の代わりにE.coli RPIもし
くはE.coli HB101を用いてくり返す。すべての条件が既
述のとおりであり同一結果が得られる。

実施例５ この例用に、牛のプレ成長ホルモンをコードするcDNA
を実施例１で述べたように調製する。EcoRI制限部位リ
ンカーが前記Valenzuela,P.,et alにより述べられてい
るようにcDNAにブラントエンド結合されそして前記Ullr
ich,A.,et alにより述べられているようにEcoRIで開裂
される。

（Ａ） 前記Blattner et alにより述べられているよう
に調製したCharon 16A DNAを転移ベクターとして用い
る。粘着末端は0.1Mのトリス塩酸、PH8.0および10mMのM
gCl₂において42℃60分間のインキュベートによりアニー
ルされる。そのベクターはEcoRIエンドヌクレアーゼに
よりEcoRI制限部位において開裂され、前記Ullrich,A.e
t alにより述べられているようにアルカリ性ホスファタ
ーゼで処理される。エタノール沈澱の後、このホスファ
ターゼ処理ベクターDNAは、１モルのcDNAに対し２モル
のベクターのモル比で、EocRI粘着末端含有cDNAに添加
される。その混合物は前記Ullrich,A.,et alにより述べ
られているようにT4DNAリガーゼを用いて結合される。
結合混合物は、実施例１で述べたように形質転換用に調
製されたE.coli χ1776細胞の懸濁液に直接添加され
る。その形質転換は実施例１で述べたようになされる。
組み換えファージは回収され、５−クロロ−４−ブロモ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（X6）（80μ
g/ml）を含有するプレート上のLac^-細胞上の平板培養さ
れる。Charon 16AのEcoRI部位に挿入されたcDNAを含有
する組み換えファージは無色のプラクを産出するとして
選択される。選択された組換え体は単離されて過剰のEc
oRIエンドヌクレアーゼで消化される。消化物は実施例
２で述べたように分析される。約830塩基対の長さをも
ち第１図の配列を有するDNAが回収される。もしくは、
結合混合物が、Sternberg,N.et al.,Gene 1,255（197
7）により述べられているように、インビトロパッケイ
ジングにより組み換えファージを形成するべく用いられ
る。組み換えファージは、また、Benton,W.D.and Davi
s,R.W.,Science 196,180（1977）のインサイツプラク
（in situ plaque）ハイブリダイズ技法によりスクリー
ニングされ得る。

（Ｂ） 前記Blattner,et al.により述べられているよ
うにして調製されるCharon 3A DNAもしくはCharon 4A D
NAは上で用いたCharon 16A DNAの代りに転移ベクターと
して用いられる。すべての条件はCharon 16A DNAについ
て述べられたものと同一である。組み換えファージの選
択は、X6を含有するプレート上のLac⁺細菌上でこれらフ
ァージを平板培養しそして無色のプラクを単離し続いて
前記Blattner,et alにより述べられているように適当な
プローブへのハイブリダイズもしくは制限エンドヌクレ
アーゼ消化によりなされる。挿入物は上述のようにして
除去され、約830塩基対の長さをもちかつ第１図の配列
をもつDNAを得る。

（Ｃ） 前記Tiemier et al.により述べられたように調
製されたλgtWES・λB DNAは、上の用いられたCharon 1
6Aの代りに転移ベクターとして用いられる。すべての条
件はCharon 16Aについて述べられたものと同一である。
組み換えファージの選択は、前記BentonおよびDavisの
ハイプリダイゼーション法によりなされる。挿入物は上
述のようにして除去され、約830塩基対の長さをもちか
つ第１図の配列を有するDNAを得る。

（Ｄ） 実施例５（Ａ）〜（Ｃ）がくり返される。そこ
では、E.coli RPI、E.coli HB101、E.coli DP50もしく
はE.coli DP50SupFがE.coli χ1776の代わりに用いられ
る。すべての条件は同一で同一の結果が得られる。

実施例６ この例用に、牛のプレ成長ホルモンをコードするcDNA
が実施例１で述べられたように調製される。HindIII制
限部位リンカーが加えられ、そのcDNAは実施例４（Ａ）
で述べられたようにHindIIIもしくはHsuIで消化され
る。

前記Ehrlich,S.D.により述べられているようにS.aure
usから単離されたプラスミドpC194は、転移ベクターと
して用いられる。pC194、前記Ullrich,A.et alにより述
べられているように、HindIII部位においてHindIIIもし
くはHsuIで消化されついでアルカリ性ホスファターゼで
処理される。HindIII粘着末端を有するcDNAは、前記UII
rich,et alにより述べられているように、開裂したpC19
4に結合される。B.subtilis RUB331の反応能誘導（コン
ピーテンス・インダクション）はSgarmella,V.,et al.,
J.Mol.BioI.,105,587（1976）およびBorenstein,S.and
Ephrati-Elizue,E.,J.Mol.Biol.,45,137（1969）により
述べられているようにしてなされる。B.subtilis RUB33
1の形質転換はSgaramella et al.およびBorenstein et
alにより述べられているように結合混合物を用いてなさ
れる。細胞懸濁液は３μｇのクロラムフェニコールを含
有するＬプレート上で直接平板培養される。選択された
組換え体は単離され、HindIIIで消化される。その消化
物は実施例２で述べられたようにして分析される。約83
0塩基対の長さをもちかつ第１図の配列を有するDNAが回
収される。

実施例７ 牛の成長ホルモンをコードするcDNAの合成 （Ａ） プラスミドpBR348はHaeIIエンドヌクレアーゼ
で消化され1600塩基対フラグメントを生じる。一つのHa
eII部位はプレ成長ホルモンをコードするcDNA挿入物内
にある。第二部位はプラスミドのpBR322部分内にある。
消化により次のものを生ずる： ＋１ ＋２ ５′− C TTC……３′ ３′−G CGG AAG……５′ 牛の成長ホルモンはNH₂末端における＋alaか＋2phe残基
のいづれかで始まる。（前記Dayhoff et al）それゆ
え、alaコドンを完成させるかそれを削除するかの試み
がなされ得る。削除の考え方は、（３′→５′鎖の）＋
2pheコドンの最初の塩基がＡであるので、dATPとDNAポ
リメラーゼＩクレノウフラグメントとでDNAをインキュ
ベートすることにより達成される。この反応により次の
ものが得られる： ＋１ ＋２ ５′−C TTC……３′ ３′− AAG……５′ このDNAはフェノール抽出されて沈澱される。過剰dAT
Pと消化された塩基とはＧ−50セファデックンクロマト
グラフィーにより除かれる。＋1alaコドンの残っている
５′突出部のＣが次いでShine et al.,Nature 285,456
（1980）により述べられているようにS1ヌクレアーゼで
除かれる。この消化により次のものが得られる： ＋２ ５′−TTC……３′ ３′−AAG……５′ （Ｂ） 実施例７（Ａ）をくり返す。そこでは牛のプレ
成長ホルモンをコードするデオキシヌクレオチド配列
は、HaeIIとの消化に先だって適当な制限酵素により実
施例３、４、５および６で調製した転移ベクターを消化
することにより除かれる。用いる転移ベクターとの制限
酵素を表３に示す。

表３ 制限酵素 転移ベクター（例） Pst I 3A,3B,4G,4H Hind III 4A,4B,6 Sal I 4C,4D Bam HI 4C,4D Eco RI 4E,4F,5A,5B,5C 適当な制限酵素での消化の後、牛のプレ成長配列はゲル
電気泳動により単離され次いで実施例７（Ａ）に述べた
ように処理される。同一の結果が得られる。

（Ｃ） 実施例７（Ａ）と７（Ｂ）とをくり返す。そこ
ではT4DNAポリメラーゼもしくは３′−５′エンドヌク
レアーゼがDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
の代りに用いられる。すべての他の条件は同一で、牛の
成長ホルモンフラグメントの同一配列が各場合に得られ
る。

実施例８ （Ａ） 次の牛の成長ホルモンフラグメントが実施例７
（Ａ）か７（Ｂ）で述べたようにHaeII消化により調製
される： ＋１ ＋２ ５′− C TTC……３′ ３′−G CGG AAG……５′ その完成には次のような方法がとられる。DNAがdATP、d
GTP、dCTP、dTTPおよびDNAポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントとインキュベートされる。この反応により次
のものが得られる： ＋１ ＋２ ５′−G GCC TTC……３′ ３′−G CGG AAG……５′ そのDNAはフェノール抽出され沈澱される。その配列は
次いでdCTPの存在下でDNAポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントとインキュベートされる。その配列は次いで
Shine et al.,Nature 285,456（1980）により述べられ
ているようにS1ヌクレアーゼで消化され、次の配列を生
じる： ５′−G GCC TTC……３′ ３′−C CGG AAG……５′ （Ｂ） 実施例８（Ａ）がくり返される。そこではT4DN
Aポリメラーゼか３′−５′エンドヌクレアーゼが第２
インキュベート工程、すなわちdCTPの存在下で、クレノ
ウフラグメントの代わりに用いられる。その他の条件は
同一で同一の牛の成長ホルモン配列が各場合に得られ
る。

実施例９ 牛の成長ホルモンをコードするデオキシヌクレオチド
配列は牛のプレ成長ホルモンをコードする配列用に前述
のように転移ベクターへ挿入される。

（Ａ）実施例１、３（Ａ）、３（Ｂ）、４（Ａ）〜
（Ｉ）、５（Ａ）〜（Ｄ）および６をくり返す。そこで
は実施例７（Ａ）、７（Ｂ）もしくは７（Ｃ）で調製し
たDNAが牛のプレ成長ホルモンをコードするDNAの代りに
用いられる。すべての条件は同一である。DNAは、例え
ば表３に示す適当な制限酵素での消化により除かれる。
そして実施例２で述べたように分析される。位置２のph
eコドンで始まりそして第１図の配列の末端まで続く配
列を有するDNAが各場合に得られる。

（Ｂ） 実施例１、３（Ａ）、３（Ｂ）、４（Ａ）〜
（Ｉ）、５（Ａ）〜（Ｄ）および６をくり返す。そこで
は実施例８（Ａ）か８（Ｂ）で調製されるDNAが牛のプ
レ成長ホルモンをコードするDNAの代りに用いられる。
すべての条件は同一である。DNAは例えば表３に示す適
当な制限酵素との消化により除かれる。そして実施例２
で述べたように分析される。位置１のAlaコドンで始ま
り第１図の配列の末端に続く配列を有するDNAが各場合
に得られる。

実施例10 牛の成長ホルモンの発現 牛の成長ホルモンは上述の方法のいづれかにより発現
され得る。

（Ａ） 融合蛋白としての牛のプレ成長ホルモンの発現
は、ラジオイムノアッセイ実験を行うことそしてミニセ
ル実験を行うことにより示される。ラジオイムノアッセ
イにおいては、対照としてpBP348を含むE.coli χ1776
かpBP322を含むE.coliが栄養ブロス中で生育され遠心分
離により集められる。細胞は再懸濁されそして細胞溶解
された。放射線標識された羊の成長ホルモンと羊（又は
牛）の成長ホルモンの抗体とが添加された。その免疫複
合体は沈澱されそして放射能が測定された。この実験に
より、融合蛋白はある種の牛成長ホルモン免疫活性を保
持することが示される。融合蛋白の生産をさらに説明す
るために、Meagher,R.B.,et al.,Cell,10,521（1977）
により述べられる手順に従ってミニセル実験がなされ
た。第２図はE.coli χ1776から得られるゲル電気泳動
バンドを示す。バンド（ａ）はpBP348で形質転換された
χ1776から得られた。バンド（ｂ）はpBR322で形質転
換された χ1776から得られた。バンド（ｃ）は分子量
マーカーである。（Ａ）はβ−ラクタマーゼと牛プレ成
長ホルモンとの融合生成物を示す。（Ｂ）は前ラクタマ
ーゼを示し、（Ｃ）はβ−ラクタマーゼを示す。この実
検により示されることは、pBP348は融合生成物を生産
し、その生成物はβ−ラクタマーゼの183アミノ酸と牛
プレ成長ホルモンの217アミノ酸と正常には非翻訳の
５′領域によりコードするされる２、３の結合アミノ酸
とからなるということである。知り得た全分子量約45,0
00はハイブリッド蛋白について想定した分子量に合致す
る。

（Ｂ） 牛プレ成長ホルモンの直接発現のために、挿入
物DNAが部分的なPstIエンドヌクレアーゼ消化によりpBP
348からまず分離されそして調製用ゲル電気泳動により
精製された。精製挿入物DNAのサンプル15μｇが次いで
そのDNAを水に懸濁することにより修飾される。その水
に塩の濃厚溶液を加えて全量250μｌとし最終組成を70m
Mのトリス、pH8.8、7mMのMgCl₂、10mMのジチオセレイト
ルおよび13.75単位のT4DNAポリメラーゼとする。反応混
合物は37℃にて数分間インキュベートされ次いでdATPが
50mM加えられ次のアデニン残基でのエンドヌクレオチッ
ク消化を停止させる。さらに30秒間のインキュベートの
後、その酵素は65℃５分の熱処理により不活性化され
る。この工程が２回くり返えされる。うち１回はdCTPが
dATPの代りに用いられた最後にdTTPが再び用いられる。
処理DNAはエタノール沈澱により回収される。S1ヌクレ
アーゼ消化によりブラントエンドを得る手順は前記Ullr
ich,A.et alにより述べられているように行われる。こ
の手順は位置番号−26での開始コドンで終結するDNA分
子を得るよう設定される。そのような分子は発現ベクタ
ーに挿入されるとき翻訳される。そのベクターは発現ユ
ニットのリボゾーム結合部位配列からの約３〜11ヌクレ
オチドを挿入部位に有する。

直接発現用ベクターは上記のようにT4DNAポリメラー
ゼおよびS1ヌクレアーゼを用いて23〜29ヌクレオチドを
除去することによりプラスミドptrpE30を修飾すること
によって組み立てられる。

修飾cDNAおよび修飾発現ベクターは、特定のリンカー
を備えている。このリンカーは、前記Valenzuelaにより
述べられているようにDNAリガーゼを用いたブラントエ
ンド結合により、一方の鎖に配列５′−CCGGATCCGG−
３′を有し他方の鎖にその相補性配列を有する。これら
リンカーは、挿入を容易にするために用いられるBamHI
エンドヌクレアーゼに感受性の強い制限部位を与える。
挿入は前記Ullrich,A.et alの手順に従って達成され
る。宿主細菌E.coli HB101、RRIもしくはχ1776は、挿
入され修飾されたプレ成長ホルモンコードする領域を有
する組み換えベクターにより形質転換される。転換体は
アンピシリン耐性により選択される。ptrpE30/bGHと称
する単一転換体が次の分析用として選択される。

ptrpE30/bGHにより形質転換される細菌細胞は、Leu、
Pro、ビタミンB1およびアンピシリンを添加した標準最
小培地（M9）中で37℃において培養される。早期のラグ
フェーズにおいて、trpオペロンがβ−インドリルアク
リル酸（30μl/培地ml）の添加により誘発される。対照
培地には誘発されないままである。発育のさらに３時間
後に細胞1.5mlが³⁵S−Ｌ−Metの20μciの添加により放
射線標識され、そして10分間培養される。細胞は遠心分
離で集められ、洗浄されそして10％（v/v）のグリコー
ル、５％（v/v）のβ−メルカプトエタノールおよび2.3
％（w/v）のSDSを0.0625Mのトリス、pH6.8に含有するバ
ッファー250μｌに再懸濁される。その懸濁液は５分間
煮沸され、次いで10％（w/v）のSDSポリアクリルアミド
ゲルに加えられ電気泳動で分画される。蛋白バンドはオ
ートラジオグラフィーにより視覚化される。その結果か
ら、約24,000ダルトンの新しい蛋白バンドの存在が非誘
導培地や非形質転換培地中には認められないことがわか
る。

牛のプレ成長ホルモンは、例えばゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ーおよび分別溶解法を含む通常の技法により精製され
る。プレ成長ホルモンは、前記Jackson,et alにより述
べられている手順に従って成長ホルモンに転換される。

一方の鎖に配列５′−CCGGATCCGGATG−３′を有し他
方の鎖にその相補性配列を有する特定のリンカーが、実
施例７（Ａ）〜（Ｃ）および８（Ａ）〜（Ｂ）で調製さ
れる牛の成長ホルモンをコードするDNAにブラントエン
ド結合される。この修飾DNAは次いで実施例10（Ｂ）で
述べたように修飾プラスミドptrpE30に挿入される。宿
王細菌は形質転換されそして培養される。得られる牛の
成長ホルモンは実施例10（Ｂ）で述べたように精製され
る。

この発明は特定の実施態様に関連して述べられたが、
さらに変更できることはいうまでもない。この発明の精
神に沿い、かつこの発明の属する技術の範囲内の既知で
かつ通常実施される程度に本開示内容から離れた程度の
ものを含むこの発明のいかなる変更、使用もしくは適用
をも包含することを本願は意図するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はcDNA配列をセンス鎖によりコードするされる相
応の想定アミノ酸配列と共に示し、第２図はE.coli χ1
776から得られる蛋白のゲル電気泳動バンドを示し、
（ａ）はpBP348で形質転換されたχ1776からのもの、
（ｂ）はpBR322で形質転換されたχ1776からのもの
（ｃ）は分子量マーカーである。 Ａ……β−ラクタマーゼと牛プレ成長ホルモンとの融合
生成物、Ｂ……前ラクタマーゼ、Ｃ……β−ラクタマー
ゼ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨセフ・ア−・マルシヤル ベルギ−王国パ−・リ−ジユ4000サ−ル −チルマン・アンスチチユ・ド・シミ −・ベ−６ジエニ・ジユネチズ内 (72)発明者 ジヨン・デイ−・バクスタ− アメリカ合衆国カルフオルニア94127サ ンフランシスコ・サンパウロ・アヴエニ ユ131 (56)参考文献 特開 昭55−45395（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｃｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，255［16］（1980）ｐ．7521−7524

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】牛のプレ成長ホルモンをコードするDNA配
   列を有するDNAベクターであって、該DNA配列は、以下の
   アミノ酸配列： をコードする、DNAベクター。
2. 【請求項２】前記牛のプレ成長ホルモンをコードするDN
   A配列が： である、請求項１に記載のベクター。
3. 【請求項３】牛のプレ成長ホルモンをコードするDNA配
   列を有するDNAベクターで形質転換された大腸菌であっ
   て、 該牛のプレ成長ホルモンをコードするDNA配列は、以下
   のアミノ酸配列： をコードするDNA配列である、形質転換された大腸菌。
4. 【請求項４】前記牛のプレ成長ホルモンをコードするDN
   A配列が： である、請求項３に記載の形質転換された大腸菌。
5. 【請求項５】以下の１−191アミノ酸の牛の成長ホルモ
   ンをコードするDNA配列： を有する、DNAベクター。
6. 【請求項６】前記１−191アミノ酸の牛の成長ホルモン
   をコードするDNA配列が、以下の配列： である、請求項５に記載のDNAベクター。
7. 【請求項７】１−191アミノ酸の牛の成長ホルモンをコ
   ードするDNA配列を有するDNAベクターで形質転換された
   大腸菌であって、 該１−191アミノ酸の牛の成長ホルモンをコードするDNA
   配列は、以下のアミノ酸配列： をコードするDNA配列である、形質転換された大腸菌。
8. 【請求項８】前記牛の成長ホルモンをコードするDNA配
   列が： である、請求項７に記載の形質転換された大腸菌。
9. 【請求項９】以下の２−191アミノ酸の牛の成長ホルモ
   ンをコードするDNA配列： を有する、DNAベクター。
10. 【請求項１０】前記２−191アミノ酸の牛の成長ホルモ
    ンをコードするDNA配列が、以下の配列： である、請求項10に記載のDNAベクター。
11. 【請求項１１】２−191アミノ酸の牛の成長ホルモンを
    コードするDNA配列を有するDNAベクターで形質転換され
    た大腸菌であって、 該２−191アミノ酸の牛の成長ホルモンをコードするDNA
    配列は、以下のアミノ酸配列： をコードするDNA配列である、形質転換された大腸菌。
12. 【請求項１２】前記牛の成長ホルモンをコードするDNA
    配列が： である、請求項11に記載の形質転換された大腸菌。