KR860001922B1 - 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법 - Google Patents

소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR860001922B1
KR860001922B1 KR1019860002982A KR860002982A KR860001922B1 KR 860001922 B1 KR860001922 B1 KR 860001922B1 KR 1019860002982 A KR1019860002982 A KR 1019860002982A KR 860002982 A KR860002982 A KR 860002982A KR 860001922 B1 KR860001922 B1 KR 860001922B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ctg
growth hormone
gag
cag
cdna
Prior art date
Application number
KR1019860002982A
Other languages
English (en)
Inventor
엘. 밀러 월티
에이. 마샬 조셉
디. 박스터 존
Original Assignee
더 리젠스 오브 더 유니버시티 오브 칼리포니아
파트릭 케이. 무어
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1019810003125A external-priority patent/KR830007822A/ko
Application filed by 더 리젠스 오브 더 유니버시티 오브 칼리포니아, 파트릭 케이. 무어 filed Critical 더 리젠스 오브 더 유니버시티 오브 칼리포니아
Priority to KR1019860002982A priority Critical patent/KR860001922B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR860001922B1 publication Critical patent/KR860001922B1/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법
제1도는 mRNA의 배열에 대응하는 가닥에 의하여 유전 암호화한 예견된 대응 아미노산 배열 코드와 삽입된 cDNA의 배열.
제2도는 E.coli 카이 1776 소형 세포들을 전기영등 시킨 결과 나타난 밴드이다.
본 발명은 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현전달 벡터를 제조하는 방법, 즉 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 뉴클레오티드 배열을 함유하고 있는 발현전달 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.
한가지 실예를 들어보면, 소의 프리-성장호르몬 배열을 함유하고 있는 DNA전달 벡터를 제조하는 방법은, 소의 프리-성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 제한효소를 사용하여 전달 벡터를 절단하여 제조한 DNA분자와 반응시키는 것이고, 이때 소의 프리-성장 호르몬을 유전암 호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열은 다음의 배열을 갖는 플러스 가닥을 함유하고 있다.
5'-ATG ATG GCT GCA GGC CCC CGG ACC TCC CTG CTC CTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG CCC TGG ACT CAG GTG GTG GGC GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG-3'
여기에서 A는 데옥시아데닐, G는 데옥시구아닐, C는 데옥시시토실, 그리고 T는 티미딜이다. 또 자세히 설명하면, 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 제조하는 방법은 제한효소 Hae Ⅱ로 cDNA(소의 프리-성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열)를 절단하고, 이 절단된 생성물을 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편, T4DNA 폴리머라제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 중에서 선택한 효소로 배양시키는 것을 특징으로 한다.
또 한가지 구체적인 예로써, 소의 성장 호르몬 배열을 제조하는 방법은 dAPT의 존재하에서 상기 Klenow 단편을 사용한 배양을 수행하고 최종산물을 Sl 뉴클레아제로 소화시켜 소의 성장 호르몬의 아미노산 2-191을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 얻어, 결과적으로 다음 배열의 폴러스 가닥을 함유하는 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시 뉴클레오티드 배열을 산출함을 특징으로 한다.
5'-TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG PAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG-3'
여기서 A는 데옥시아데닐, G는 데옥시구아닐, C는 데옥시시토실, 그리고 T는 티미딜이다.
더욱 구체적으로 설명하면, 소의 성장 호르몬 배열을 제조하는 방법은, dATP, dGTP, dCTP, dTTP의 존재하에서 상기 Klenow단편으로 배양시키고, 그결과 생긴 산물을 dCTP의 존재하에서 상기 Klenow 단편, T4DNA 폴리머라제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 중에서 선택한 효소로 배양시킨다음, 이 산물을 Sl 뉴클레아제로 소화시켜 소의 성장 호르몬의 아미노산 1-191을 유전암호화하는 데옥시 뉴클레오티드 배열을 얻고, 결과적으로 다음 배열의 플러스 가닥을 함유하고 있는 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 생성함을 특징으로 한다.
5'-GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG-3'
여기서 A는 데옥시아데닐, G는 데옥시구아닐, C는 데윽시시토실, 그리고 T는 티미딜이다.
부가해서 구체적으로 설명하면, 소의 프리-성장 호르몬을 함유하고 있는 플라스미드 pBP348은, 제한효소로 전달벡터를 절단하므로써 제조된 DNA 분자가 pBR322이고 제한 효소는 Pst I 임을 특징으로 한다.
또 한가지 구체적인 예로써, 소의 성장 호르몬 배열을 함유하고 있는 DNA전달 벡터를 제조하는 방법은 소의 성장호르몬을 유전암호화하는 제조된 데옥시뉴클레오티드 배열을, 제한효소를 사용하여 전달 벡터를 전달하므로써 제조된 DNA분자와 반응시킴을 특징으로 한다.
또 한가지 구체적인 예로써, 발현전달 벡터를 제조하는 방법은, 제한효소로 전달 벡터를 절단 함으로써 제조되는 DNA분자는 발현 가능한 조절 영역내의 한 점에서 절단되는 것을 특징으로 한다.
부가해서 구체적으로 설명하면, C-말단기로써 소의 성장호르몬의 아미노산 배열 또는 소의 프리-성장 호르몬의 아미노산 배열을, N-말단기로써 일부 원핵 단백질을 함유하고 있는 융합 단백질을 제조하는 방법은, 상기 소의 성장호르몬이나 프리-성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 함유하고 있는 발현 전달 벡터에 의해 형질전환된 미생물을 배양시킴을 특징으로 한다.
더 나아가 소의 성장 호르몬을 합성하는 방법은, 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 상기 배열의 발현에 적합한 조건하에서 상기 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 함유하고 있는 발현 전달 벡터에 의해 형질전환된 미생물을 배양하고, 이 미생물의 용해질 혹은 배지로부터 소의 성장 호르몬을 정제함을 특징으로 한다.
성장 호르몬은 샘 뇌하수체(뇌하수체의 전엽)에서 합성되고 분비된 폴리펩티드 호르몬이다. 성장호르몬은 N| 말단 신호 펩티드와 성장 호르몬 배열을 함유하고 있는 전구 단백질(프리-성장 호르몬)로써 합성된다. 소의 성장 호르몬에 대한 아미노산 배열이 결정되었다.
[Dayhoff, M. D., et al., Atals of Protein Sequence and Structure, Vol. 5 Supp. 3, pp.245-352, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978) 참조].
성장 호르몬은 성인기 이전에 최다량이 생성되지만 일반적으로 일생을 통해 생성된다. 이 호르몬은 성인기 이전의 성장에 필요하다. 이 호르몬의 메카니즘에 대해서는 자세히 알려져 있지 않지만, 성장 호르몬은 골격성장, 질소 보유량, 단백질 합성을 증진시키고 포도당과 지방 대사에 영향을 미친다. 다시 말해서 성장 호르몬은 일반적인 동화제(anabolic agent)이다.
소의 성장 호르몬의 사용은 위에서 설명한 알려져 있는 생물학적 활성을 근거로 한다. 소의 성장 호르몬을 어린 송아지에 투여하여 성장 속도와 체중을 증가시키고 그러므로써 태어나 쇠고기용으로 판매되기까지 걸리는 시간을 감소시킨다. 정육 생산에 있어서 이러한 증가는 중요한 의미가 있다.
더우기 소의 성장 호르몬은 양의 성장 호르몬과 겨우 몇가지 아미노산만 다르므로 소의 성장 호르몬을 양에게 투여하여 양에서도 소에서와 똑같은 목적을 달성할 수 있다. 즉 성장 속도와 체중을 증가시켜 정육생산을 증가시킨다. 소의 성장 호르몬을 돼지나 기타 동물에 투여하여도 똑같은 목적을 달성할 수 있다.
DNA 배열을 클로닝하는 기본적인 기술은 현재 알려져있다. 예를들면 Seeburg ,P.H., et al., Nature, 270, 486(1977)에는 쥐 성장 호르몬 유전자의 클로닝에 대해 설명되어 있고 ; Shine, J., et al., Nature, 270, 494(1977)에는 사람의 융모성 소마토맘모트로핀(somatomammotropin ; 체하수체 전엽의 최유 호르몬) 유전자의 클로닝에 대하여 ; 그리고 Derynck, R., et al., Nature, 285, 542(1980)에는 사람 섬유 아세포 인터페론 유전자의 클로닝에 대해 설명되어 있다.
미생물내에서 이종성 DNA를 발현하는 방법이 현재 알려져 있다. 원칙적으로 이종성 DNA유전암호 배열은 발현 가능한 오페론내에 위치한 한 점에서 DNA전달벡터로 삽입된다. 혼성 단백질을 생산하려면, 이 삽입된 배열은 오페론의 유전암호 배열과 함께 리딩 프레임 상(reading frame phase)에 있어야 하며 번역하는 방향과 똑같은 방향으로 향하여야 한다. 이러한 상황이 되면, 오페론의 번역은 결과적으로 삽입된 코우딩 배열을 완벽하게 번역하는데 이때 생성된 단백질은 발현가능한 오페론에 의해 유전암호화된 N-말단 아미노산 배열을 함유하는 융합 단백질이며, 이 단백질은 삽입체에 의해 유전암호화된 아미노산 배열을 뒤에 함유한다.
Polisky, B., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 73, 3900 (1976) ; Itakura, K., et al., Science, 198, 1056 (1979) 참조.
β-갈락토시다아제, β-락타마아제, 그리고 트립토판을 포함하는 몇가지 발현 가능한 오페론을 사용하였다.
본 명세서에 사용되는 약자들은 일반적으로 받아들여지고 있으며 당해 업계에서 보통 기술자들이 사용하고 있는 약자들이다. 예를들어 이러한 약자들은 어떤 설명없이 J. Biol. Chem에 사용되고 있다.
본 발명은 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현전달벡터를 제조하는 방법에 대해 기술하고 있다.
소의 프리-성장 호르몬을 유전암호화하는 mRNA는 소의 뇌하수체로 부터 분리된다. mRNA의 역전사(cDNA 사본)가 이루어져 전달 벡터내로 삽입된다. 소의 성장호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열은, 소의 프리-성장호르몬의 cDN A로 부터, 프리-배열을 유전 암호화하는 배열을 가수분해 하므로써 제조된다. 발현전달 벡터는 클로닝된 cDNA를 발현시키는 박테리아를 형질 전환시키는데 사용된다.
소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 DNA배열은 cDNA방법을 사용하여 얻는다. cDNA방법의 기본적인 기술은 공지되어 있으며 상기의 Seeburg, P.H., 씨등의 저서및 Derynck, R., 씨등의 저서에 의해 설명될 수 있다. cDNA는 소의 놔하수체로 부터 추출한 RNA 제조물을 주형으로 사용하므로써 합성된다.
RNA는 종래 방법을 사용하여 소의 뇌하수체로 부터 분리되고 폴리아데닐산염화 RNA는 친화성 크로마토그래피에 의해 분리된다. 폴리아데닐산염화 RNA의 본래 모습은 Miller, W.L. and McCarthy, B. J., J. Biol. Chem., 254, 742 (1979) 및 Martial, J. A, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74, 1816(1977)에 설명된 바와 같이 폴리아데닐산염화 RNA를 세포없이 번역하고 Laemmli, U. K., Nature, 227, 680(1970)에 설명된 바와 같은 SDS- 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 생성된 단백질을 분석하므로써 평가된다. 소의 성장 호르몬은 더나아가 상기한 Martial J. A., et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA에 설명된 바와 같이 면역 침전 반응에 의해 식별된다.
폴리아데닐산염화 RNA는 종래 방법으로 이중 가닥 cDNA 사본을 제조하고자 할때 주형으로 사용된다.
첫번째 cDNA 가닥은 상기 Miller and McCarthy의 저서 및 Monahan, J. J., et al.,Biochem., 15, 223(1976)에 설명된 바와 같이 역전사효소, 올리고-dCT시발체(primer) 및 폴리아데닐산염화 RNA를 사용하여 합성된다.
RNA는 알칼리 소화에 의해 제거되고 단일 가닥 cDNA는 역전사효소에 의한 두번째 가닥의 합성을 자진 준비한다. 단일 가닥의 머리핀 루우프는 Sl 뉴클레아제로 소화시킴으로써 제거된다.
[Leong, J. A., et al., J. Virol., 9, 891(1972), Ullrich, A., et al., Science, 196 : 1313 (1977)참조].
이제 cDNA는 적당한 전달 벡터내로 삽입될 준비가 되어 있다. 적당한 전달 벡터는 Escherichia coli(대장균) 및 Bacillus subtilis(고초균)과 같은 박테리아, 효모(Saccharomyces cerevisiae), Neurospora crassa(빵 곰팡이)의 inl, csp, esp 돌연변이 균주들, 그리고 조직 배양으로 얻은 동물 세포들을 형질전환시킬 수 있는 것들을 포함한다.
대장균을 변형시킬 수 있는 것으로, 본 발명에 사용할 수 있는 전달 벡터를 예로 들면 플라스미드 pSC101, pMB9, pBR313, pBR315, pBR316 및 pBR322가 있고, 박테리오파아지로 부터 유리된 벡터를 예로 들면 카론 3A, 카론4A, 카론16A 및 람다 gtWES. 람다 B가 있다.
이러한 전달 벡터의 제조방법 및 특징에 대해 설명하고 참조 자료를 표 1에 작성하였다.
[표 1]
Figure kpo00001
대장균을 형질전환시키는 기타 적당한 벡터들에 대해서는 Sinsheimer, R. L., Ann. Rev. Biochem. 46, 415(1977)에 설명되어 있다.
고초균을 형질전환시키는 적당한 벡터에 대해서는 Iordanescu, S.,J.Bacteriol .124, 597(1964) 및 Ehrlich, S. D., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 74, 1680(1977)에 설명되어 있다. 이러한 벡터는 플라스미드 pC194로 분류되었다. 효모 DNA…플라스미드 및/혹은 크로모소옴…및 박테리아 DNA…에, 폴라스미드…을 함유하고 있는 흔성 플라스미드는 효모를 형질전환시킨다. 이러한 플라스미드에 대해서는 Beggs, J. D., Nature 275, 104(1978); Asiav, C. L, and Carbon, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829(1979); and Kingsman, .A. K., et al., Gene 7, 141(1979)에 설명되어 있다.
조직 배양시 동물 세포를 형질전환시키는데 이용될 수 있는 전달 벡터에는 Adeno손상 비루스, SV-40손상 비루스 및 폴리오마 비루스가 포함된다.
cDNA는 종래 방법을 사용하여 전달 벡터 내로 삽입된다. 이 cDNA는 보통 전달 벡터의 독특한 제한부위내로 삽입된다. 카론3A, 카론4A 및 람다 gtWESㆍ람다 B는 독특한 부위를 가지고 있지 않아 결과적으로 한정된 수의 제한 부위가 이러한 벡터를 위해 사용된다. 여러가지 전달벡터의 독특한 제한 부위와 벡터 카론3A, 카론4A 및 람다 gtWESㆍ람다 B의 유용한 제한 부위는 표2에 나타나 있다.
[표 2]
Figure kpo00002
일반적으로 cDNA는 선택이 용이하도록 표현 형질내에 있는 제한 부위내로 삽입된다. 예를들어 pSC101. pMB9, pBR313, pBR315, pBR316 및 pBR322의 Hind Ⅲ, Sal I, Bam HI은 테트라사이클린 내성 혹은 이의 조절 영역을 위한 유전자내에 존재한다. 이 부위에서의 삽입은 테트라사이클린 내성의 상실을 초래한다.
cDNA는 제한 부위 결합체나 데옥시뉴클레오티드 말단연결(tailing)을 사용하여 전달 벡더내로 삽입될 수 있다. 전자에 있어서, 위에서 설명한 바와 같은 특정한 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인지 부위를 함유 하고 있는 합성 뉴클레오티드를 cDNA에 둔단 결합시킬 수 있다.
cDNA와 전달 벡티를 제한 엔도뉴클레아제로 따로따로 배양시킨다음 cDNA를 함유하는 전달 벡터를 형성하도록 어니일링 시킨다. 후자의 경우에 cDNA는 Roychoudhury, R., et al,, Nucl. Acids Res., 3, 863 (1976)에 설명된 바와 같이 데옥시뉴클레오티드 및 말단 전이 효소를 사용하여 말단에 연결시킨다.
전달 벡터는 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 후 같은 방법으로 상보적 데옥시뉴클레오티드를 사용하여 말단에 연결시킬 수 있다. 말단 연결된 전달 벡터와 cDNA를 어니일링시켜서 cDNA를 함유하고 있는 전달 벡터를 형성한다. 예를들어 cDNA는 dC-말단에 연결될 수 있고 전달 벡터는 Pst Ⅰ부위에서 노출되어 dG-말단에 연결된다.
그 다음에 cDNA를 함유하고 있는 전달 벡터는 적당한 숙주를 형질전환시터는데 사용된다. 여러 가지 전달벡터에 적당한 숙주로는 대장균, 고초균, 효모, 빵 곰팡이 및 조직 배양된 동물 세포를 들 수 있다.
이러한 각각의 숙주들을 형질전환시킬 수 있는 전달 벡터에 대해서는 위에서 설명하였다. 대장균의 세가지 돌연변이 균주가 보통 사용되고 있는데 카이 1776, RRI 및 HB101이 그것이다. 대장균 카이 1776에 대해서는 Curtis, R., Ann. Rev. Microbiol. 30, 507 (1976) 및 미국 특허번호 제 4,190,495호에 설명되어 있다. 대장균 RRI에 대해서는 Dugaiczyk, A., et al., Molecular Mechanisms in Control of Gene Expression at p. 543에 설명되어 있고 대장균 HB101에 대해서는 Kedes, D.H. and Thomas, C. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1537 (1976)에 설명되어 있다.
적당한 숙주들은 종래의 기술로 형질전환시킬 수 있다. 예를들어 대장균 카이 1776은 Cooke, N. E., et al., J.Biol. Chem., 255, 6502 (1980)에 설명된 바와 같이 cDNA를 함유하고 있는 전달 벡터에 의해 형질전환된다. 콜로니들은 종래 방법대로 선택되거나 선별된다.
예를들어 콜로니들은 데트라사이클린 내성과 같은 표현 형질의 상실을 근거로 선택될 수 있으며, 다음과 같은 방법에 의해 선별될 수도 있다. 그 방법으로는(1) 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 cDNA를 제거하고, 전기 영동법과 혼성화에 의해 이를 분석하거나 〔Southern E.M., J.Mol. Biol., 98, 503 (1975)참조], (2) Grunstein, M. and Hogness, D.S., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975)에 설명된 바와 같은 레플리카 평탄 및 적당한 소식자(probe)로의 혼성화 또는 (3) RIA나 기타의 기술에 의한 발현으로 콜로니들을 직접 검사하는 것이다.
소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 DNA는 소의 프리-성장 호르몬을 유전암호화하는 삽입체로 부터 제조될수 있다. 소의프리-성장호르몬을 유전암호화하는 DNA는 적당한 제한 엔도뉴클레아제에 의해 제거된다.
예를들어 cDNA가 플라스미드 pBR322의 PstⅠ 부위에 삽입되면, cDNA삽입체는 PstⅠ으로 부분적 소화에 의해 두 개의 내부 PstⅠ 부위를 함유하고 있는 소의 성장호르몬의 cDNA로 제거될 수 있다.
그 다음에 cDNA를 Hae Ⅱ로 소화시킨다.
또 pBR322로부터 유래된 재결합 플라스미드를 Hae Ⅱ로 소화시켜 cDNA삽입체의 일부를 제거한다.
Hae Ⅱ 소화에 의해서, N-말단신호 펩티드를 유전암호화하는 DNA와, 성장호르몬의 N-말단알라닌을 유전암호화 하는 세개의 염기중 둘은 제거한다.
이 염기들은 삽입체를 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편 및 데옥시뉴클레오티드로 배양시키므로써 대치된다.
또 알라닌을 유전암호화 하는 염기들은 cDNA를 dATP의 존재하에서 Klenow 단편, T4DNA 폴리머라제 혹은 3'-5' 엑소뉴클레아제로 배양시킴으로써 제거될 수있다.
Klenow 단편에 대해서는 Klenow, H. and Henningsen, I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, 168(1970)에 설명되어 있다.
그 다음에 성장호르몬을 유전암호화 하는 cDNA는 설명한 바와같이 적당한 전달 벡터내에 삽입된다.
클로닝된 DNA는 박테리아 내에서 발현되어, 삽입된 배열에 의해 유전암호화 된 소의 성장 호르몬을 함유하고 있는 융합단백질 혹은 소의 성장호르몬 그 자체를 생산한다. 몇가지 가능한 방법들을 선테적으로 사용할 수 있는데 그 방법에는 (a) 목적하는 번역 시작점을 정확히 제공하기 위해 유전암호 배열을 수정하는 방법; (b) 가장 적절한 발현 전달벡터를 선테하거나 구성하는 방법; (c) 숙주의 생체내에서 일어나는 활성을 이용하거나 시험관 내에서의 화학적 수단에 의해서 뒤에 번역하는 과정; 및 (d )직접 발현을 들수 있다. 융합단백질이 발현될때 생성된 배열이 정확한 리딩프레임으로 삽입체의 번역을 수행하고 삽입된 배열의 개시 코든앞에 어떤 정지코돈도 나타나지 않는한, 클로닝된 뉴클레오티드 배열을 수정할 필요가 없다.
프리성장-호르몬이나 성장호르몬은 cDNA를 발현된 오페론(발현벡터)내에 있는 적당한 부위내로 삽입하므로써 융합단백질로 발현된다. 예를들면 pBR322의 β-락타마아제 유전자에 있는 Pst I 부위[Villakomaroff, L., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 3727(1978) : Serburg, P., et al., Nature 274 : 795(1978)참조], lac 조절영역 및 β-갈락토시다제의 유전암호 배열을 운반하는 pBR322의 Eco RI부위(상기 Itakura, K. 참조), 혹은 플라스미드 ptrpED50의 trpD 유전자의 Hind Ⅲ부위 [Martial, J., et al., Science, 205, 602(1979)참조]가 이에 속한다. 정확한 리딩프레임을 만들기 위해서 하나 혹은 두 개의 뉴클레오티드에 의해 배열 길이를 수정한다는 것은 해당분야에 잘 알려져 있다. 말단 연결방법을 이용하여 pBR322의 Pst I부위에 삽입하는 것은 1/6의 가능성으로 정확한 상태와 리딩프레임에서 일어난다.
프리성장-호르몬이나 성장호르몬은 시험관 내에서 특정한 절단을 일으킬 수 있는 융합단백질로 부터 제조된다. 클로닝된 뉴클레오티드 배열은 단백 분해효소에 대해 특이성을 갖고있는 아미노산 배열을 유전암호화하기 위해 수정된다. 유용한 배열은 AspAspAspAspLys인데 이는 1980년 2월 29일 제출되어 계류중인 미국특허 출원서 제125,878호에서 설명한 바와같이 우선적으로 엔테로키나아제효소에 의해 절단된다. 이 출원서에 설명된 바와같이 상기 아미노산 배열을 유전암호화하는 결합뉴클레오티드 배열은 프리-성장호르몬의 아미노산 말단을 유전암호화 하는 뉴클레오티드 배열 옆에 삽입된다.
프리-성장호르몬의 경우 이러한 삽입은 프리-성장호르몬 코우딩 배열의 5' 말단에 있는 뉴클레오티드 제거에 의한 본래 cDNA 삽입체의 수정을 요구한다.
앞에서 설명한 성장호르몬에 대한 cDNA 삽입체는 수정할 필요가 없다. 프리-성장호르몬 삽입체를 수정하려면, 3' 엑소뉴클레아제나 T4DNA 폴리머라아제를 사용하여 삽입체의 3' 말단을 조절 소화시키거나, 또는 소망하는 시발점의 5' 측에 있는 점에서 절단하는 제한 엔도뉴클레아제와 이로 인해 제거된 소망하는 배열의 일부를 보충하기 위한 화학적 합성의 조합에 의해 가능하게 된다.
이 과정을 좀더 자세히 알고자하면 계류중인 미국특허 출원서 제125,878호를 참조하라.
이 과정을 마친후 바람직하게 T4DNA 폴리머라아제와 Sl뉴클레아제를 사용하여, 프리-성장호르몬을 유전암호화 하고 5' 번역되지 않은 부분을 가지고있지 않은 cDNA 배열을 얻을 수 있다.
앞서 말한 아미노산 배열을 유전암호화 하는 링커의 뉴클레오티드 배열은 Valenzuela et al., Nature, 280, 815(1979)에 설명된 바와같이 DNA 리가아제를 사용하여 프리-성장호르몬이나 성장호르몬 중의 하나를 유전암호화 하는 cDNA와 둔단 결합시킨다. 수정된 cDNA 배열은 앞서 설명한 바와같이 융합단백질 발현 전달벡터내로 삽입된다. 대장균 HB101, RRI, 카이 1776 같은 숙주박테리아나 기타 박테리아는 삽입된 프리-성장호르몬 유전 암호영역을 가지고 있는 재결합 전달벡터에 의해 형질 전환된다. 형질 전환체는 암피실린에 대해 내성이 있는것을 선택한다. 그 다음에 형질 전환체들은 융합 단백질의 발현에 적당한 조건하에서 성장시킨다.
융합 단백질이 발현된 후 프리-성장호르몬이나 성장호르몬은 엔테로키나아제를 사용한 효소적 가수분해에 의하여 절단된다.
적당한 발현 전달벡터를 사용하므로써 본 발명의 프리-성장호르몬을 직접 발현할 수 있다. 즉 어떤 원핵단백질에 융합시키지 않고도 가능하다. 직접 발현의 기본원리는 삽입된 DNA 세그먼트가 박테리아 조절영역에 의해 정상적으로 전사되고 번역되는 유전암호 세그먼트를 완전히 대치하는 것이다.
보존되어야 할 조절 영역의 필수적인 구성요소는 발현 단위라고 불리는 것으로, 촉진유전자와 숙주 생물에서 작용할 수 있는 리보솜 결합부위를 포함한다.
융합 단백질의 숙주부분을 유전암호화 하는 모든 뉴클레오티드를 제거할 필요는 없다.
리보솜 결합부위와 개시 코든(AUG) 사이의 관계는 개시코돈이 리보솜 결합부위의 3-11 뉴클레오티드내 어디나 위치할 수 있다는 것이다. [Shine, J., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71, 1342(1974)및 Steitz, J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72, 4734(1975)참조.]
이 3-11 뉴클레오티드 영역에 도달하는 첫번째 AUG는 번역을 위해서 리딩프레임에 놓인다. 앞에서 설명한 ptrpED50에서 유래되었으며, 작동유전자, 촉진유전자, 감쇠유전자 및 Hind III부위를 뒤에 두고 trpE 단백질의 일곱개 아미노산을 유전암호화 하는 뉴클레오티드 배열을 갖고있는 트립토판 오페톤의 리보솜 결합부위를 함유하고 있는 ptrpE30의 경우에 Hind III 부위로 부터 최소량의 23-29 뉴클레오티드를 제거하여 트립토판 오페론 조절하에서 cDNA 삽입체를 삽입하기 위한 부위를 얻을 수 있다.
프리-성장호르몬을 직접 발현하는데 있어서, 본래의 cDNA 삽입체는 위에서 설명한 바와같이 5' 번역되지 않은 영역을 제거함으로써 수정된다. 직접 발현하기 위한 벡터는, 위에서 설명한 바와같이 T4DNA 폴리머라제 및 Sl뉴클레아제를 사용하여 23-29뉴클레오티드를 제거함으로써 ptrpE30을 수정하여 제조한다. Bam HI 엔도뉴클레아제에 대한 제한 배열을 함유하고 있는 링커 뉴클레오티드 배열은 상기 Valenzuela씨 등의 방법에 의해 수정된 ptrpE30 및 cDNA 삽입체와 둔단 결합한다. 이는 Ullrich, A., et al., Science, 196, 1313(1977)에 설명된 바와같이 반드시 일어나야 하는 삽입을 용이하게 한다.
E. coli HB101, RRI 카이, 1776 또는 기타 박테리아 같이 적당한 숙주들은 삽입된 프리-성장-호르몬 유전 암호영역을 갖고있는 재결합 전달벡터에 의해 형질이 전환된다.
암피실린에 대한 내성이 있는 형질 전환체들을 선택하여 프리-성장호르몬의 발현에 적당한 조건하에서 성장시킨다.
성장호르몬은 Goeddel, D.V., et al., Nature, 281, 544(1979)에 설명된 다음 방법에 따라 직접 발현될 수 있다. 또 Bam HI 부위 및 개시코돈(AUG)을 함유하고 있는 링커뉴클레오티드 배열은 성장호르몬을 유전암호화 하는 cDNA와 둔단 결합할 수 있다. 이 수정된 cDNA를 앞에서 설명한 바와같이 수정된 ptrpE30에 삽입시킨다.
프리-성장호르몬은 신호 펩티드를 함유하고 있는 소수성 아미노산의 N-말단배열을 제거하므로써 성장호르몬으로 전환된다. 시험관 내에서 신호 펩티드를 제거하려면, Jackson, R. C. and Blobel, G., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5598(1977)에 설명된 바와같이 형질 전환되어 유도된 세포로부터 추출한 단백질을 조면 마이크로소옴 제조물로 처리하므로써 실시된다. 생체내에서의 신호 펩티드 제거는 프리-성장호르몬 유전암호 배열이 박테리아에서 직접 발현하는 동안 일어난다. 박테리아의 신호 펩티드와 포유류의 신호펩티드는 배열에 있어서 유사한 절이 있다.
포유류의 신호펩티드를 갖고있는 단백질을 박테리아 세포로 처리 가공하여, 성장호르몬을 주변 세포질 공간이나 매질내로 배출시킨다.
설명한 대로 합성된 프리-성장호르몬 및 성장호르몬을 당해 업계에 잘 알려져 있는 기술, 예를들어 겔여과, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 차등용해도 기술들을 사용하여 정제한다.
본 발명의 상세한 점은 다음 실시예에서보다 자세히 설명될 것이다. 이 실시예에서 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 소화는 각 효소에 적합한 조건하에서 실시하였다.
제한 엔도뉴클레아제, 이들의 명명법 및 부위 특이성에 대해서는 Roberts, R., Grit. Rev. Biochem. 4, 123(1976)에 자세히 설명되어 있다. 효소는 상업적으로 얻을 수 있으며(메사츄세츠주의 캠브리지에 있는 뉴잉글랜드 생물연구소로 부터), 달리 지적되지 않는 한 공급자의 권고에 따른 최적 조건을 사용한다. 역전사 효소는 Dr. J. Beard, LifeSciences, Inc., St. Petersburg, Florida가 제공해 준다. 역전사 효소의 용도 및 적당한 반응조건에 대해서는 Seeburg, P. H., 씨등의 Nature, 276, 795(1978); 상기 Seeburg, P. H., 씨등의 저서 및 Shine, J. 씨등의 저서에 의해 앞서 설명하였다. T4DNA 폴리머라제는 뉴잉글랜드 생물연구소로 부터 얻을 수 있으며, T4DNA 폴리머라제의 용도 및 적당한 반응조건에 대해서는 계류중인 미국특허출원 제125,878호에 설명되어 있다.
구균의 Sl 뉴클레아제는 인디아나주의 엘크하르트에 있는 마일즈 실험실로 부터 얻을 수 있다. Sl 뉴클레아제의 용도 및 적당한 반응조건에 대해서는 상기한 Ullrich, A. 씨의 저서에 설명되어 있다. 말단 데옥시뉴클레오티드 전이효소는 뉴욕에 있는 Enzo Biochemicals, New York, New York. 로 부터 얻을 수 있으며 이 효소의 용도 및 적당한 반응조건은 상기 Roychoudhury et al. 의 저서에 설명되어 있다. DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편은 인디아나주의 인디아나폴리스에 있는 Boehringer Biochemicals로 부터 얻을 수 있다.
[실시예 1]
소의 프리-성장호르몬 cDNA의 합성
암소가 죽은 즉시 암소의 뇌하수체들을 모아서 질소액체 내에 넣고 냉동시켰다. 구아니딘 티오시안산염 용액에 뇌하수체들을 균질화하여 총 RNA를 제조하였다[Chirginwin, J. M과 그밖에 사람들에 의한 Biochem., 18, 5294(1979)참조].
이 RNA를 상기 Ullrich와 그밖의 사람들에 의해 기술된 바와같이 5.7M CsCl을 이용하여 원심 분리하였다. 이 RNA를 페놀로 추출한 다음 에탄올로 침전시켰다.
폴리아데닐화된 RNA를 상기 Miller와 McCarthy, 및 Aviv, H.와 Leder, P., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 1408(1972)에 기술된 바와같이 올리고-dT-셀룰로오즈 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
폴리아데닐화된 RNA를 상기 Miller와 McCarthy 및 Martial, J. A.(1977)와 그밖의 사람들에 의해 기술된 바와같이 토끼의 망상적혈구를 이용하여 무세포계에서 번역하였다.
이 계에서 합성된 소의 프리-성장호르몬은 이종성 항양(antiovine)성장호르몬의 항혈청을 이용하여 침전시키고 상기 Martial, J. A. et al.,(1977)에 기술된 바와같이 고정된 포르말린에 Staphylococcus aereus Cowan Strain I을 흡수시키므로써 제조되었다.
35S-단백질들을 상기 Laemmli에 의해 기술된 바와같이 12.5%의 SDS 슬랩 폴리아크릴아미드겔에 전기영동하였다. 이러한 분석법에 의하여 소외 프리-성장호르몬을 유전암호화하는 폴리아데닐화된 RNA는 전체 뇌하수체의 폴리아데닐화된 RNA의 약 12.6%를 차지하는 것으로 나타났다.
폴리아데닐화된 RNA는 상기 Miller와 McCarthy 및 Monahan 씨등에 의해 기술된 방법에 따라 역전사효소를 이용하여 단일 가닥 cDNA로 역전사하였다. 그런후 RNA를 알칼리성 가수분해에 의하여 제거시켰다.
단일 각닥 cDNA를 페놀로 추출한 후 C-50 Sephadex(Sweden)의 Uppsala 주식회사의 약품명)상에서 크로마토그래피하고 에탄올 침전시켰다. 단일 가닥 cDNA는 상기에 기술된 바와같이 역전사제를 이용하여 두번째 가닥의 cDNA를 합성하기 위한 자기복제에 사용되었다.
cDNA의 첫번째 가닥의 3' 말단에 단일 가닥의 "머리핀 루우프(hairpin loop)"는 상기 Leong et al. 및 Ullrich, A. 씨등에 의해 기술된 바와같이 Sl뉴클레아제로 소화시키므로써 제거하였다. 이중가닥으로 된 cDNA는 페놀추출물로 정제한 다음 G-50 Sephadex 상에서 그래마토그래피하고 에탄올 침전하였다. 이 이중가닥으로 된 cDNA는 상기 Roychoudhury et al. 에 의해 기술된 바와같이 dCTP와 말단전사효소를 이용하여 3'dCMP에 말단 연결시켰다.
플라스미드 pBR322는 Pst I 엔도뉴클레아제로 절단되어서 dGTP가 dCTP 대신에 사용되는 것을 제외하고는 상기에 기술된 말단연결 방법에 의하여 dGMP와 말단 연결하였다.
플라스미드 pBR322를 절단하는 것으로서 dG-말단연결된 50ng의 Pst I과 dC-말단 연결된 20ng의 이중가닥 cDNA를 상기 Cook et al.에 의해 기술된 바와같이 50㎕ 반응기 내에서 어니일링 시켰다.
플라스미드 제조로 E. coil 카이 1776을 형질 전환시키는 것은 다음과 같이 수행된다.
E. coil 카이 1776은 섭씨 4도에서 20분동안 75mM CaCl2와 5mM MgCl2와 10mM Tris가 혼합된 pH 7.5의 용액내에서 배양시키므로써 DNA로 투과되었다.
플라스미드와 박테리아는 섭씨 4도에서 60분간 배양시킨 후 섭씨 41도에서 2분동안 더 배양시켰다.
형질전환된 콜로니들은 테트라사이클린 내성에 대하여 선택하였다. 클로닝된 DNA의 존재는 Crunstein과 Hogness에 의해 상기에 기술된 바와 같이 신선하게 제조한32P로 표시된 소의 뇌하수체 cDNA와 콜로니의 혼성화에 의하여 결정되었다. 플라스미드 DNA는 Pst I으로 절단하여 1%아가로우즈(agarose)에 전기영동시키고, 브롬화에티듐으로 채색된 후 포토그래피한 다음 최종적으로 상기의 Southern에 기술된 방법에 따라 니트로셀룰로오즈 여과액으로 전달되는 선택된 콜로니들로부터 제조하였다.
전달된 DNA에 있는 성장호르몬 배열의 존재는 닉크트랜스레이션에 의하여 표시된[Maniatis, R.,과 그외의 사람들에 의한 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72, 1184(1975)] 클로닝된 생쥐호르몬 cDNA(상기 Seeburg, .P. H. et al.)의 전체 길이에 혼성화되므로써 평가되었다.
하나의 클론(clone)이 수득되어 닉크트랜스레이션된 DNA로 혼성화되어 pBP 348로 표시되었다.
삽입체는 831개의 염기쌍을 함유한다.
[실시예 2]
cDNA의 배열분석
플라스미드 pBP348은 Pst I으로 절단하였고 DNA 단편의 5' 말단에 있는 인산은 알칼리성 탈인산 가수분해 효소로 제거한 다음 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용하여[32P] 인산으로 대치시켰다. 여러가지 다른 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 다음 폴리아크릴아미드 겔을 전기영동한 후 착색하여 DNA 밴드의 방사 자동 사진법으로 클로닝된 DNA의 제한지도를 만들었다. pBP348의 큰 배치(batch)를 제조한 후 Pst I과 Pvu II 또는 Sau 3A로 절단한 후 [r32P]ATP와 폴리뉴클레오티드 키나아제로 표시한 다음 다른 효소로 절단하여 단일 말단에서 표시된 DNA 단편들을 수득하였다.
이러한 단편들은 폴리아크릴아미드 겔로 용출되므로써 제조된 다음 상기의 Cook et al, 및 Maxam, A. M.과 Gilbert, W., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 1560(1977)에 기술된 바와같이 배열되었다. 삽입된 cDNA 배열은 지각가닥 즉 각각의 mRNA의 배열에 대응하는 가닥에 의하여 유전암호화한 예견된 대응아미노산 배열코드와 함께 제1도에 표시하였다.
정확한 리딩프레임은 삽입체의 실질적인 위치에 있는 말단코돈의 부족에 의해 인식된다. 아미노산의 위치는 소의 성장호르몬의 아미노-말단 아미노산으로부터 시작하여서 양의 방향으로는 탄소말단잔기로 진행되고 음의 방향으로는 번역시초의 위치로 가정되는 첫번째 AUG 코돈으로 진행된다. 많은 다른 호르몬에서와 공통으로, 배열은 성장호르몬의 합성이 후번역적 과정을 포함함을 제안한다.
성장호르몬의 mRNA의 번역은 전구체 즉, 내질성 망상조직으로 통과되는 동안 방출될 수 있는 신호펩티드를 함유하는 프리성장 호르몬을 생성한다.
[실시예 3]
(A) 플라스미드 pBR322 대신 플라스미드 pBR315를 사용하여 실시예 1을 반복하였다. 재결합 클론의 선택을 포함한 모든 조건들은 상기에서 기술된 바와같다.
삽입체를 실시예 2에 기술된 방법으로 제거하고 분석하여서 제1도에 나타난 배열을 갖고있는 약 831개의 염기쌍들로 이루어진 DNA를 수득하였다.
(B) 플라스미드 pBR322 대신 플라스미드 pBR316을 사용하여 실시예 1을 반복하였다. 모든 조건들은 실시예 1에서 기술된 조건들과 동일하다. 실시예 2에 의한 방법으로 삽입체를 제거하고 분석하여서 제1도에 나타난 배열을 갖고있는 DNA를 수득하였다.
[실시예 4]
이 실시예에서, 소의 프리-성장호르몬을 유전암호화 하는 cDNA를 실시예 1에서 기술한 방법으로 제조하였다.
모든 제한부위 링커들을 이 실시예에서 이용하였으며 그러한 것들을 Scheller, R. H와 그밖의 사람들에 의한 Science 196, 177(1977)에 기술된 바와같이 제조하였다.
제한 엔도뉴클레아제를 이 실시예에서 사용하였으며 이러한 것들은 New England Biolabs, Beverly, Massachusetts에서 보통 얻을 수 있으며 공급자의 추천에 의한 광학상의 조건들을 이용하였다. E. coli 카이 1776의 전환은 실시예 1에서 기술된 바와같이 이행되었다.
(A) 5'-CCAAGCTTGG-3' 배열을 갖고있는 Hind III링커들을 Valenzuela, P와 그밖의 사람들에 의한 Nature 280, 815(1979)에 기술된 바와같이 T4DNA 리가아제를 이용하여 둔단 결합에 의하여 실시예 1에서 제조한 cDNA에 결합시켰다. 결합시킨 후 생성물을 Ullrich, A와 그밖의 사람들에 의한 Science 196, 1313(1977)에 기술된 방법에 따라서 Hind III 또는 Hsu I으로 소화시켰다. 플라스미드 pBR322를 Hind III 또는 Hsu I으로 Hind III 제한 부위에서 절단시킨 후 상기의 Ullrich, A와 그밖의 사람들에 의해 기술된 바와같이 알칼리성 탈인산가수 분해 효소로 처리하였다. 에탄올로 침전시킨 후 탈인산 가수분해효소로 처리하고, 절단된 pBR322를 상기의 Ullrich, A와 그밖의 사람들에 의해 기술된 바와같이 Hind III의 결합력이 있는 말단을 포함하는 cDNA에 결합시켰다. E. coli 카이 1776을 결합혼합물로 형질전환 시키고 형질 전환된 콜로니들은 테트라사이클린 민감도에 대해 선택하였다. 실시예 1에서 기술한 바와 같이 클로닝된 DNA의 존재를 결정하였다. 닉크트랜스레이션된 DNA로 혼성화된 삽입체를 함유한 콜로니를 수득하였다. 삽입체를 Hind III 또는 Hsu I로 소화시켜서 제거한다음 실시예 2에 기술한 바와같이 분석하였다. 삽입체는 약 830개의 염기쌍들을 함유하며 제1도에서 나타낸 바와 같은 배열을 갖는다.
(B) pBR322의 대신 몇개의 벡터들을 사용하여 실시예 4(A)를 반복하였다. 이 실시예에서 pBR322 대신 플라스미드 pSC101, pMB9, pBR313, pBR315 및 pBR 316을 이용하였다. 재결합 클론들의 선택을 포함한 모든 조건들은 (A)에 기술된 바와같다. 모든 플라스미드에 대해서 똑같은 결과를 얻었다. 즉 각경우에서 제1도에서 나타낸 배열을 갖고 있는 삽입체를 함유한 재결합 플라스미드를 수득하였다.
(C) 몇몇의 다른 제한부위 링커들과 제한 엔도뉴클레아제들을 이용하여 실시예 4(A)를 반복하였다.
이 실시예에서 Sal I과 Bam HI에 대한 링커가 Hind III에 대한 링커대신 사용되었다. 이러한 링커의 배열은 5'-GGTCGACC-3' 및 5'-CCGGATCCGG-3'이다. Sal I 링커들을 사용할 때 링커로 처리한 cDNA와 pBR322는 제한 엔도뉴클레아제 Sal I 으로 절단하였고 Bam HI 링커들을 사용할때 제한 엔도뉴클레아제는 Bam HI이었다. 재결합 클론들의 선택을 포함한 모든 조건들은 4(A)에서 기술한 바와같다. 링커및 제한 엔도뉴클레아제에 있어서 똑같은 결과를 얻었다.
(D) pBR322대신 플라스미드 pSC101, pMB9, pBR313, pBR315 및 pBR316을 사용하여 실시예 4(C)를 반복하였다. 모든 조건들은 실시예 4(C)에서 기술한 바와 똑같고, 똑같은 결과를 얻었다. 즉 각경우에 있어서 제1도에 나타낸 배열을 갖는 삽입체를 수득하였다.
(E) 5'-CCGAATTCGG-3' 배열을 갖는 Eco R I 제한 링커를 Hind III 링커대신 사용하고, Eco RI을 Hind III(Hsu I)대신 사용하여 실시예 4(A)를 반복하였다. 형질전환된 콜로니들을 테트라사이클린 민감도에 의해 선택하지 않은 것을 제외하고는 모든 조건이 상기에 기술된 바와 같았다. 클로닝된 DNA의 존재는 실시에 1에서 기술한 바와 같이 확인하였다. 제1도에 나타낸 배열을갖는 삽입체를 함유한 재결합 클론을 수득하였다.
(F) pBR322 대신 플라스미드 pSC101. pMB9, pBR313 및 pBR313를 사용하여 실시예 4(E)를 반복하였다. 실시예 4(E)에 기술된 바와 같이 똑같은 조건을 이용하여 각 클라스미드에 대하여 똑같은 결과를 얻었다.
(G) 5'-CCTGCAGC-3' 배열을 갖고있는 Pst I 제한링커 및 Pst I 을 각각 Hind III 링커 및 Hind III(Hus I) 대신 사용하였다. 재결합 클론들의 선택을 제외하고는 실시예 1에서 기술한 바와 같은 조건에서 실시하였다. 제1도에 나타낸 배열을 갖고 있는 재결합 클론을 수득하였다.
(H) pBR322 대신 플라스미드 pBR315와 pBR316을 사용하여 실시예 4(G)를 반복하였다. 실시예 4(G)에서 기술한 바와 같이 똑같은 조건에서 실시하여 똑같은 결과를 수득하였다.
(I) E. coli 카이 1776 대신 E. coli RRI 또는 E. coli HB101를 사용하여 실시예 1, 3(A), 3(B) 및 4(A)-(H)까지를 반복 실시하였다. 상기에 기술된 바와 같은 조건에서 실시하여 똑같은 결과를 수득하였다.
[실시예 5]
본 실시예에서, 소의 프리성장호르몬을 유전암호화하는 cDNA를 실시예 1에서 기술한 방법으로 제조하였다. Eco RI 제한부의 링커들은 상기의 Valezuela, P. 와 그밖의 사람들에 의해 기술된 바와 같이 cDNA와 둔단결합 되었다가 상기의 Ullrich, A. 와 그밖의 사람들에 의해 기술된 바와 같이 Eco RI로 절단되었다.
(A) 상기의 Blattner씨등에 의해 기술된 바와 같이 제조한 카론(charon) 16A DNA를 전달벡터로 사용하였다. 결합력 있는 말단들을 섭씨 42도의 pH8.0인 0.1M Tris-HCl과 10mM MgCl2내에서 60분동안 배양하여 어니일링 시켰다. 벡터를 Eco RI 제한부위에서 Eco RI 엔도뉴클레아제로 절단한 다음 상기의 Ullrich, A. 와 그밖의 사람들에 의해 기술된 바와 같이 알칼리성 인산으로 처리하였다. 에탄올 침전시킨 후에 탈인산가수분해효소로 처리한 벡터 DNA를 벡터 2몰당 1몰의 cDNA의 몰비율로 Eco RI의 응집성 말단을 함유하는 cDNA에 첨가하였다. 혼합물을 상기의 Ullrich, A., 씨 등에 의해 기술된 바와 같이 T4DNA리가제로 결합시켰다. 결합혼합물을 직접 실시예 1에서 기술한 바와 같이 형질전환되도록 제조된 대장균 카이 1776 세포들의 현탁액에 첨가시키고, 형질전환은 실시예 1에서 기술한 바와 같이 이루어졌다. 재결합 파아지들을 복구시키고 카론 16A의 Eco RI 부위로 삽입되는 cDNA를 함유하고 있으면서 5-클로로-4-브로모-3인돌일-β-D-글락토시스(X6),(80㎍/㎖)를 함유하고 있는 판에 있는 Lac-박테리아에 판금된 재결합 파아지를 무색플라크를 제조하기 위하여 선택하였다. 선택된 재결합체를 분리한후 과량의 Eco RI 엔도뉴클레아제로 소화시키고 소화된것을 실시예 2에 기술된 방법으로 분석하였다. 제1도에 나타낸 배열을 가지고 있으며 약 830개의 염기쌍들로 된 DNA를 회수하였다. 또다른 방법으로 Sternberg, N. 과 그밖의 사람들에 의한 Gene 1, 255(1977)에 기술된 바와 같이 시험관내에서 결합혼합물을 이용하여 재결합 파아지들을 형성하였다. 또한 재결합 파아지들은 Benton, W. D. 와 Davis, R. W. 의 Science 196, 180(1977)에 기술된 플라크 수소화반응 기술을 이용하여 선별할 수 있다.
(B) 상기의 Blattner와 그외의 사란들에 의해 기술된 바와 같이 제조된 카론 3A 또는 4A DNA를 상기에 사용된 카론 16A DNA 대신 전달벡터로 사용하였다. 카론 16A DNA 때 사용된 모든 조건들과 동일한 조건에서 실시하였다. 재결합 파아지들의 선택은 X6를 함유하고 있는 판위에 있는 Lac+박테리아에 파아지를 판금시키고, 상기 Blattner와 그밖의 사란들에 의해 기술된 바와 같이 적절한 소식자(probe) 혹은 제한 엔도뉴클레아제와 혼성화함에 따라 무색플라크(plaque)를 분리시킴으로써 수행하였다.
상기에서 기술한 바와 같이 길이로 약 830개의 염기쌍들로 이루어졌으며 제1도와 같은 배열을 갖고있는 DNA로 된 삽입체를 제거하였다.
(C) 상기의 Tiemier씨등에 의해 기술된 바와 같이 제조된 람다 gt WES. 람다 B DNA들은 상기에서 사용된 카론 16A 대신 전달벡터로 사용되었다. 모든 조건들은 카론 16A에서 기술된 조건들과 동일하다. 재결합 파아지들의 선택은 상기의 Benton과 Davis의 혼성화 방법으로 수행하였다. 상기에서 기술된 바와 같이 삽입체를 제거하여 길이로 약 830개의 염기쌍들로 이루어졌고 제1도와 같은 배열을 가지고 있는 DNA를 수득하였다.
(D) E. coli 카이 1776 대신 E. coli RRI 나 E. coli HB101이나 E. coli DP50 또는 E. coli DP50SupF를 사용해서 실시예 5(A)-(C)를 반복실시하였다. 모든 조건들은 동일하며 또한 동일한 결과를 수득하였다.
[실시예 6]
본 실시예에서는 소의 프리성장호르몬을 유전암호화하는 cDNA를 실시예 1에 기술된 방법으로 제조하였다. Hind III 제한부위 링커들을 첨가하고 cDNA는 실시예 4(A)에 기술된 바와 같이 Hind III 나 Hsu I로 소화시켰다. 상기 Ehrlich, S. D.에 의해 기술된 바와 같이 S. aureus에서 분리한 플라스미드 pC194를 전달벡터로 이용하였다.
pC194를 Hind III 부위에서 Hind III 또는 Hsu I로 절단한후 상기의 Ullrich, A와 그밖의 사람들에 의해 기술된 바와 같은 알칼리성 탈인산가수분해효소로 처리하였다. Hind III 응집성 말단을 가지고 있는 cDNA는 상기 Ullrich, A. 와 그외의 사람들에 의해 기술된 바와 같이 절단된 pC194와 결합시켰다. B. subtilis RUB331의 유도능력은 Sgaramella, V씨등에 의한 J. Mol. Biol., 105, 587(1976)과 Borenstein, S. 와 Ephrati-Elizue, E.에 의한 J. Mol. Biol., 45, 137(1969)에 기술된 바와 같이 이행된다.
B. subtilis RUB331의 형질전환은 Sgaramella씨등과 Borenstein씨등에 의해 기술된 바와 같이 결합혼합물을 사용하여 이행되었다. 세포현탁액은 3㎍의 클로로암페니콜을 함유하고 있는 L판에 직접적으로 판금되었다. 선택된 재결합체를 분리하여서 Hind III를 소화시키고 소화시킨것들을 실시예 2에 기술된 바와같이 분석하였다. 제1도에서와 같은 배열을 가지며 약 830개의 염기쌍들로된 DNA를 회수하였다.
[실시예 7]
소의 성장호르몬을 유전암호화하는 cDNA 합성
(A) 1600개의 염기쌍들로된 Hae II 엔도뉴클레아제로 플라스미드 pBP348을 소화시켰다. 하나의 Hae II 부위는 프리-성장 호르몬을 유전 암호화하는 cDNA 삽입체내에 있으며 두번째 부위는 플라스미드의 pBR322 부위에 있다. 소화된 것은 다음과 같이 수득되었다.
Figure kpo00003
소의 성장호르몬은 NH2말단에서 +lala나 +2phe 잔기로 시작하며 (Dayhoff et al., supra)., 그래서 ala코돈을 완성하려고 시도하거나 또는 그것을 없애려고 시도하였다. 삭제에 대한 접근은 dATP로 DNA를 배양하므로써 이루어지며 +2phe 코돈(3'→5' 가닥상에)의 첫번째 염기로써 DNA 폴리머라제의 Klenow 단면은 A이다.
이 반응으로 다음과 같은 것을 수득하였다.
Figure kpo00004
DNA를 페놀로 추출하여 침전시켰다. 과량의 dATP와 소화된 염기들을 G-50 Sephadex 상에서 크로마토그래피하여 제거하였다. 그후 +1 ala 코돈의 C를 돌출시키는 남아 있는 5'는 Shine 씨등의 Nature 285, 456(1980)에 기술된 바와 같이 S1뉴클레아제로 제거하였다.
이 소화법으로 다음과 같은 것을 수득하였다.
Figure kpo00005
(B) Hae II 로 소화시키기 전에 적절한 제한 효소에 의하여 실시예 3, 4, 5 및 6에서 제조된 전달벡터들을 소화시키므로써 소의 프리성장호르몬을 유전암호화하는 데옥시 뉴클레오티드 배열을 제거하는 방법으로 실시예 7(A)을 반복실시하였다. 유용한 전달벡터들과 제한효소들을 표 3에 기술하였다.
[표 3]
Figure kpo00006
적절한 제한효소로 소화시킨후 소의 프리성장 배열을 겔 전기 영동법으로 분리한후 실시예 7(A)에 기술한 방법으로 처리하여 똑같은 결과를 수득하였다.
(C) DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편대신 T4 DNA 폴리머라제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제를 이용하여 실시예 7(A) 및 7(B)를 반복실시 하였다. 모든 다른 조건들은 똑같으며 각 경우에서 똑같은 소의 성장 호르몬 단편의 배열을 얻었다.
[실시예 8]
(A) 소의성장 호르몬 단편을 실시예 7(A) 또는 7(B)에 기술한 방법으로 Hae II 소화에 의해 제조하였다. 다음 방법으로 거의 완성시켰다. DNA를 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 및 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편으로 DNA 배열을 배양하였다. 이 반응으로 다음과 같은 결과를 얻었다.
Figure kpo00007
DNA를 페놀로 추출하고 침전시켰다. 그후 dCTP의 존재하에서 DNA 폴리머라제 I 의 Klenow 단편으로 DNA 배열을 배양하였다. 그리고나서 이 배열을 Shine씨등의 Nature 285, 456(1980)에 기술된 바와 같이 Sl 뉴클레아제로 소화시켜서 다음과 같은 배열을 수득하였다.
Figure kpo00008
(B) 두번째 배양 단계 즉 dCTP 존재하에서 Klenow 단편대신 T4 DNA폴리머라제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제를 사용하여 실시예 8(A)를 반복실시 하였다. 다 조건들을 똑같이하여 각 경우에서 똑같은 소의 성장 호르몬 배열을 얻었다.
[실시예 9]
소의프리 성장 호르몬을 유전 암호화하는 배열에 대해서 앞에서 기술한 바와같이, 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 전달벡터에 삽입시켰다.
(A) 소의 프리-성장 호르몬을 유전 암호화하는 DNA대신 실시예 7(A), 7(B) 또는 7(C)에서 제조한를 DNA 이용하여 실시예 1, 3(A), 3(B), 4(A)-(I), 5(A)-(D) 및 6을 반복실시 하였다. 모든 다른 조건들을 똑같이 하여서 표 3에 기술한 적절한 제한효소로 소화시켜 DNA를 제거한 후 실시예 2에서 기술한 바와같이 분석하였다. 각 경우에서, 2위치에 phe코돈으로 시작하여 제1도에 나타낸 배열의 말단까지 계속되는 배열을 갖고 있는 DNA를 수득하였다.
(B) 소의 프리-성장 호르몬을 유전암호화 하는 DNA대신 실시예 8(A) 또는 8(B)를 사용하여 제조한 DNA로 실시예 1, 3(A), 3(B), 4(A)-(I), 5(A)-(D)및 6을을 반복실시 하였다. 모든 다른 조건들은 똑같았다. 표 3에 있는 적절한 제한효소로 소화시켜 DNA를 제거하여 실시예 2에서 기술한 방법으로 분석하였다.
각 경우에서 1위치에 Ala 코돈으로 시작하여 제1도에서 나타낸 배열의 말단까지 계속되는 배열을 갖는 DNA를 수득하였다.
[실시예 10]
소의 성장호르몬의 발현
소의 성장호르몬은 상기에 기술된 방법중 어떠한 방법에 의해서도 발현될 수 있다.
(A) 융합단백질로써 소의 프리-성장 호르몬의 발현은 방사면역 분석시험과 소형세포 시험을 실시하므로써 증명되었다. 방사면역분석 시험에서 pBP348을 함유한 E. coli카이 1776이나 pBP322를 함유한 E. coli를 영양액에서 성장시킨 후 원심분리하여 모았다. 세포들을 재현탁한후 분리하고 방사분류된 양의 성장호르몬과 성장호르몬에 대한 양(소)의 항체를 첨가하였다. 면역 복합체를 침전시켜서 방사능을 측정하였다. 이 실험에서 융합단백질에 소의 성장호르몬의 면역성이 약간 남아있다는 것을 알았다. 융합단백질의 생성물을 더용 자세히 설명하기 위해 소량의 세포실험을 Meagher, R. B.와 그밖의 사람들에 의한 Cell, 10, 521(1977)에 기술된 방법에 따라 실시하였다.
제2도는 E. coli카이 1776 소형세포들로 부터 얻은 겔전기영동 밴드를 나타낸다. 밴드(a)는 pBP348로 형질전환된 카이 1776으로 부터 얻은것이고 밴드(b)는pBR 322로 형질전환된 카이 1776으로부터 얻은 것이며 밴드(c)는 분자무게를 기록한 것이다.
(A)는 β-락타마제와 소의 프리 성장-호르몬의 융합생성물이고 (B)는 프리 락타마제이며 (C)는 β-락타마제이다. 이 실험에서 pBP348은 보통 번역되지 않은 5'영역에 의해 유전 암호화한 아미노산과 결합하는 소수와 소의 프리-성장 호르몬의 217개의 아미노산과 β-락타마제의 183개 아미노산으로 구성된 융합단백질을 만든다는 것을 알았다. 총 분자무게는 혼성 단백질의 예견된 분자무게와 거의 동일한 약 45,000이다.
(B) 소의 프리-성장 호르몬을 직접 발현하기 위하여 삽입체 DNA는 부분적인 Pst I 엔도뉴클레아제 소화에 의해 pBP348로 부터 먼저 분리하고 예비 겔 전기영동법에 의하여 정제하였다. 250㎕부피내에 70mM Tris와 pH8.8의 70mM MgCl2와 10mM의 디티오쓰레이톨 및 T4 DNA 폴리머라제 13.75유닛(Unit)이 함유된 농축된 염용액을 첨가한 물에 정제된 삽입체 DNA표본 15㎍을 현탁시키므로써 DNA를 수정하였다. 반응혼합물을 수분동안 37℃에서 배양한 후 dATP를 50mM의 농축물에 첨가하고 다음의 아데닌잔기에서 엔도뉴클레올성 소화를 끝마쳤다.
30초동안 더 배양한후 효소를 5분 동안 65℃에서 가열처리하여 비활성화되게 하였다. 이 방법을 한번은 dATP대신 dCTP를 사용하고 또한번은 dTTP를 다시 사용하여 2번더 반복 실시하였다. 이 처리된 DNA를 에탄올 침전물로 회수하였다. Sl뉴클레아제로 소화시켜 둔단을 형성하는 것은 상기 Ullrich, A. 와 그밖의 사람들에 의해 기술된 방법으로 수행하였다. 이 과정은 ―26위치에 게시코돈에서 종결되는 DNA분자를 생성하도록 제안되었다. 상기 분자들은 발현단위의 리보소음 결합부위 배열로부터 약 3-11뉴클레오티드의 삽입부위를 갖는 발현 벡터내에 삽입되었을때 번역될 것이다.
직접적인 발현을 위해서 벡터는 상기에 기술한 바와같이 T4 DNA폴리머라제와 Sl뉴클레아제를 사용하여 23-29뉴클레오티드 제거에 의한 플라스미드 ptrpE30을 수정하므로써 이루어진다.
수정된 cDNA와 수정된 발현 벡터는 하나의 가닥위에 배열 5'―CCGGATCCGG―3'과 상기 Valenzuela에 의해 기술된 바와같이 DNA리가아제를 이용한 둔단결합에 의하여 다른 가닥위에 그것의 상보적인 배열을 갖고있는 특정한 링커로 제조된다. 이 링커들은 삽입을 용이하게 하기 위해 이용하는 Bam HI엔도뉴클레아제에 민감한 제한 부위를 제공한다. 삽입은 상기 Ullrich, A.와 그밖의 사람들에 의해 기술된 방법에 따라 수행한다. 숙주박테리아인 E. coli HB101과 RRI 또는 카이 1776을 수정된 프리성장-호르몬코딩 부위가 삽입된 재결합 벡터에 의해 형질전환 시켰으며 형질전환체는 암피실린에 대한 내성에 대하여 선택하였다. ptrpE30/bGH로 명명된 단일 형질전환체는 분석을 더 진행하기 위하여 선택하였다.
ptrpE30/bGH에 의해 형질전환된 박테리아성 세포들은 Leu, Pro, 비타민 B1및 암피실린이 공급된 37℃의 표준 최소배양지에서 성장시킨다. 초기 측정단계에서 β-인돌일아크릴산(30㎍/㎖배양지)을 첨가하므로써 trp오페론(operon)이 유도되었다. 조절배양지는 유도되지 않은채로 남아있다. 3시간 이상 성장시킨 후 1.5㎖l의 세포들을 35 S―L―Met 20μCi을 첨가하여 방사성으로 표시한 후 10분 동안 배양하였다. 원심분리하여 세포들을 모아서 세척한 후 10%(v/v)글리콜, 5%(v/v) β―메르캅토 에탄올 및 0.0625 M Tris내에 있는 pH6.8의 2.3%(w/v) SDS을 함유하고 있는 250㎕의 완충용액에 재현탁시켰다.
현탁액을 5분동안 끓인 후 10%(w/v) SDS-폴리아크릴아미드겔을 첨가하여서 전기영동법으로 분류하였다. 단백질 밴드들은 방사선자동 사진법으로 눈으로 볼수 있게 하였다. 이 결과 비유도 되었거나 비형질 전환된 배양지내에서 관찰할 수 없었던 약 24,000달톤의 새로운 단백질 밴드가 존재한다는 것을 알았다. 소의 프리-성장 호르몬을 종래의 방법 즉 겔여과법, 이온교환 크로마토 그래피법, 친화력 크로마토 그래피법 및 차등용해도법등과 같은 방법에 의해 정제하였다. 프리-성장 호르몬을 상기 Jackson씨등에 의해 기술된 방법에 따라 성장호르몬으로 전환시켰다.
(C) 한쪽 가닥위에 배열 5'-CCGGATCCGGATG-3'을 갖고 다른 가닥위에 상보적인 배열을 가지고 있는 특정한 링커를 실시예7(A)-(C) 및 (8A)-(B)에서 제조된 것과같은 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 DNA에 둔단결합시켰다. 그리고나서 이 수정된 DNA를 실시예 10(B)에서 기술한 바와같이 수정된 플라스미드 ptrpE30에 삽입시켰다. 숙주 박테리아를 형질전환시킨후 배양한 다음 생긴 소의 성장 호르몬을 실시예 10(B)에 기술한 방법으로 정제시켰다.
본 발명을 특별한 구체적인 설명과 연관하여 기술하여온 동안 본 발명에 대하여 보다 많은 변형이 이루어지는 것이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이 출원서는 본 발명이 속하는 분야에서 공지되고 통상적으로 실시되는 현재 공개된 것으로 부터의 상기와 같은 새롭게 발전된 것을 포함하며 일반적으로 발명의 원리에 따르는 발명의 모든 변용, 사용 또는 적용을 총망라한 것이다.

Claims (1)

  1. 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 데옥시 뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달벡터를 제조하는 방법에 있어서, 제한효소 Hae II로 소의 프리-성장 호르몬을 유전암호화하는 cDNA 배열을 절단한 후, 이 절단된 cDNA 배열을 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP존재하에서 DNA폴리머라제의 Klenow 단편으로 배양하고, dCTP존재하에서 Klenow 단편, T4 DNA폴리머라제 또는 3'-5'엑소 뉴클레아제중에서 선택한 효소로 위에서 배양한 cDNA를 처리한 후, Sl뉴클레아제로 위의 처리한 cDNA를 소화시켜서 소의 성장호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 제조한 다음, 발현가능한 조절영역내의 한점에서 제한 효소로 DNA전달벡터를 절단하고, 이 절단한 전달벡터와 위에서 제조한 소의 성장호르몬을 유전암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 반응시키는 과정으로 구성되는 발현 전달벡터의 제조방법.
    여기에서 소의 성장 호르몬을 유전암호화하는 DNA 배열은 다음과 같은 배열을 갖는 플러스 가닥을 포함하고,
    5'- GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG-3'
    전달벡터는PC194,PBR322,PBR315,PBR316,PBR313,PSC101,PMB9, Charon 16A, Charon 3A, Charon4A, 람다 gtWES. 람다 B 및 ptrpE30중에서 선택한다.
KR1019860002982A 1980-08-26 1986-04-17 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법 KR860001922B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019860002982A KR860001922B1 (ko) 1980-08-26 1986-04-17 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18134880A 1980-08-26 1980-08-26
US181,348 1980-08-26
KR1019810003125A KR830007822A (ko) 1980-08-26 1981-08-26 소의 프리(Pre) 성장 호르몬 또는 성장 호르몬을 유전암호화하는 배열을 함유하고 있는 DNA 전달 매개체를 제조하는 방법
KR1019860002982A KR860001922B1 (ko) 1980-08-26 1986-04-17 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019810003125A Division KR830007822A (ko) 1980-08-26 1981-08-26 소의 프리(Pre) 성장 호르몬 또는 성장 호르몬을 유전암호화하는 배열을 함유하고 있는 DNA 전달 매개체를 제조하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR860001922B1 true KR860001922B1 (ko) 1986-10-25

Family

ID=27348354

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019860002982A KR860001922B1 (ko) 1980-08-26 1986-04-17 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR860001922B1 (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1225948A (en) Bovine growth hormone
EP0020147B2 (en) A dna transfer vector for human pre-growth hormone, a microorganism transformed thereby, and a method of cloning therefor
KR930001117B1 (ko) Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법
CA1340371C (en) Methods and products for facile microbial expression of dna sequences
KR920005918B1 (ko) 인간 푸리푸로 인슐린-양성장 인자 i
WO1988001297A1 (en) Expression of g-csf and muteins thereof
JPH01501840A (ja) 繊維芽細胞成長因子の産生
JPS59144743A (ja) 組換dna技術によつて産生されるブタ成長ホルモン
KR870000501B1 (ko) 사람의 프로인슐린의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법
US4725549A (en) Human and rat prolactin and preprolactin cloned genes
EP0070675A1 (en) Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
EP0133321B1 (en) Dna gene, process for production thereof and plasmid containing the same
EP0046669B1 (en) Somatostatin or somatostatin precursors
US4675297A (en) Genes encoding bovine prolactin
US5747290A (en) Process for the production of recombinant polypeptides
KR860001922B1 (ko) 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법
US6692941B1 (en) Bovine growth hormone
US5332664A (en) Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
JPS58201797A (ja) 豚レラキシンをコード化する遺伝子配列の分子クローニングおよび特性化
US7101981B1 (en) Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli
KR920003664B1 (ko) 합성유전자에 의한 효모세포로부터 소성장호르몬의 대량 제조방법
EP0278121B1 (en) Microbially produced bovine growth hormone (BGH) and its use
JPH02501259A (ja) 合成遺伝子を使用したサケ成長ホルモンの製造方法
JPH0712318B2 (ja) 合成遺伝子を使用したウシ成長ホルモンの製造方法
JPH03503360A (ja) リボソーム結合部位

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right