JPS58201797A - 豚レラキシンをコード化する遺伝子配列の分子クローニングおよび特性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、豚・レラキシン（ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｌａ
ｘｉｎ）およびそのサブ−ユニットおよびそれに対応す
るものに対する分子クローン化および遺伝子配列コード
化の特性に関するものである。本発明は、豚のレラキシ
ン、プロレラキシンおよびゾレプロレラキシンの製法用
組換えＤＮＡ技術にも関するものである。

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レラキシンは、妊娠中に、卵巣の黄体腺から生成される
ポリペゾテドホルモンである。は乳類の生殖生理学にお
いて、出産前の頚と恥骨結合部の軟化における重要な役
割に対して、非常に興味あるものである（ヒソ−１１９
２６）。アミノ酸配列分析は、ラット（ジョンら、１９
８１）、豚（シュヮペら；１９７７：ジームスら、１９
７７）の卵巣中にそして奇妙なことに、サメ（シーワペ
ら、１９７８）においても、レラキシンの存在を示めし
ている。

インシュリンのように、レラキシンはジスルフィド結合
によって連結した二つのベゾチド鎖の一次構造をもち、
いくつかの操作工程段階によって、−木調前駆体（プレ
プロレラキシン）かう誘導される。ラットプレグロレラ
キシンは、ＡＳおよびＢ鎖の結鎖ペゾテドの連鎖した１
０５のアミノ酸を含むことが明らかにされている（ヒュ
ドソンら、１９８１）。妊娠豚の卵巣から、分離された
ｍＲＮＡの細胞翻訳およびレラキシン抗血清トのタンパ
ク生成物の免疫沈降は、プレプロインシュリンの１１．
０００ダルトンに比較して、約２３，０００ダルトンの
大きいレラキシン前駆体を示唆している（ガストら、１
９８０）。豚しラキシン前駆体は、Ａおよび・Ｂ鎖が会
合した大きい連結したペプチド（１９） を有するラットレラキシンと構造において類似であると
いうことは、あシうることである。

豚ゾレプロレラキシンの構造の研究のために、豚の卵巣
黄体腺の全ｍＲＮＡを含むＥ、Ｃｏ１１　ｃＤＮＡクロ
ーン集団を、構成するために組換えＤＮＡ手段を用いた
。しかしながら、制限されたアミノ酸配列ｉ　勾ｆｉｉ
ｌ　、は、ラットおよび豚しラキシン間に存在しくジ画
ンら、１９８１）、初期の研究から、入手しやすい（ヒ
ードンンら、１９８１）ラットレラキシンｃ　ＤＮＡと
豚ｃ　ＤＮＡクローンとの間に生ずる有意な交雑−雑種
形成は、ないことを見い出した。

結果どして、豚しラキシンー特異性ｃＤＮＡ　ｔ”合成
するために化学的に合成されたオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用い、次いで豚プレプロレラキシン・コード化
配列を含むｃ　ＤＮＡクローンを分離するための試験材
料として用いる。完全な豚プレグロレラキシン・コード
化配列の一次構造は、組換えｃＤＮＡクローンの分析か
ら決定される。

次のような略語が、この記載において用いられ（２０） る。

ＤＮＡ−デオキシリが核酸 ＲＮＡ−リゾ核酸 ｃＤＮＡ−相補的ＤＮＡ　（酵素的にｍＲＮＡ配列から
合成される） ｍＲＮＡ−メツセンジャーＲＮＡ Ａ−アデニン Ｔ−チミン Ｇ−グアニン Ｃ−シトシン Ｕ−ウラシル ＤＮＡにおけるヌクレオチド配列およびタンノぐりにお
けるアミノ酸配列間のコード化関係は、ひとまとめにし
て、遺伝子コードとして知られておシ、表において示し
た各々３−文字暗号（コドン）、たとえばＡＵＧ　、　
ＣＡＵ　（他方、デオキシヌクレオチドトリジレットも
しくはヌクレオチドトリプレット）左側に５′−末端お
よび右側に３７−末端を有”　　　するｍＲＮＡのトリ
ヌクレオチドに対応する。ヌクレオチド配列を形成する
プリン、ピリミジン塩基は、文字通シの意味を表わす。

ここに引用されているすべてのＤＮＡ配列は、記載され
たｍＲＮＡ配列に対応する配列、ウラシン（財）に対し
てチオン（Ｔ）置換されたストランドのＤＮＡ配列であ
る。

本発明は、主な目的の一つとして、豚プレデロレラキシ
ン用にコード化する構造遺伝子配列およびそのペプチド
サブ−ユニットを含む組換えａＤＮＡクローンの提供を
することである。このようなりローンは、プレプロレラ
キシン、およびそれゆえに、プロレラキシンおよびレラ
キシン自体を、組換えＤＮＡ技術によって生産を可能に
せしめる。

家畜病治療の豚しラキシンの潜在的な有用性および可能
なヒト治療薬とは別に、豚しラキシンに対するｅ　ＤＮ
Ａ構造の十分な特性および有効性は、（２３） ヒトレラキシンに関する今後の研究を、うながすであろ
う。

ヒトレラキシンの現在の材料は、ヒト組織材料、たとえ
ば、妊娠女性の卵巣および胎児膜から抽出されるために
限られている。ヒトレラキシンの構造は、知られてはい
ないけれども、動物のレラキシンとは、実質的に異なる
ことは知られている。

ヒトレラキシンに対するｃＤＮＡ配列の決定および分子
クローン化は、重要な研究目的である。豚しラキシンｃ
　ＤＮＡ配列の全部またはいくつかに基づく遺伝子実験
材料は、このような決定において、価値があると思われ
る。

上記の目的を達成するために、豚グレデロレラキシン用
コード化する構造遺伝子配列を含むクローン化した（！
ＤＮＡ’８のヌクレオチド配列を分析した。

結果は、シグナルペプチドおよび連鎖した（Ｃ）ベゾチ
ーのアミノ酸配列を予測せしめ、先に報告された豚しラ
キシンのＢおよびＡ鎖の配列を確認せしめた（シュワペ
ら、１９７７：ゾームスら、１９７７：ニアルら、１９
８０）。

次に記載における参考として、図面をあげて説明する。

図１は、ｍ　−ＲＮＡ配列に対応する豚しラキシンのＢ
鎖のアミノ酸配列の分節および下肥に記載されり合成プ
ライ−マーを示し； 図２は、ｅＤＮＡ配列のグルクロマトダラムのオートラ
ジオグラフを示し； 図３は、豚しラキシンｃＤＮＡの制限エンドヌクレアー
ゼマツプであシ； 図４は、ラットおよび豚ゾレゾロレラキシンのｍＲＮＡ
およびペプチド配列を示し、 図５は、豚プレプロレラキシンに対するｍＲＮＡおよび
アミノ酸配列を示しくおよび 図６は、ヌクレオチドプライマーとして用いられる二重
ストランドＤＮＡ断片を示す。

本発明の一つの見方からすると、豚プレプロレラキシン
の表現用遺伝子を提供することである。

更に詳しくは、本発明のこの黛からすると、豚プレプロ
レラキシンの表現用二重ストランドＤＮＡ断片を提供す
ることであ）、図５に示したｍＲＮＡ配列に対応する相
補性ストランドおよびコード化するストランドを含んで
表る。

当該分野における熟練技術は、遺伝子の冬型現象が、存
在することを識別可能にする。このような型は、本発明
において含まれる。

本発明は、明細書に記載の該配列のいかなるサブ−ユニ
ットまたは該配列もしくはサブ−ユニットのいかなる相
当物をも含む。この陳述（記述）によって含まれるザブ
−ユニットの間には、図５に示したような非−コード化
領域、を含まない遺伝子でアシ、豚プレプロレラキシン
のシグナルペプチド鎖およびＡ、ＢおよびＣ鎖およびそ
れらの鎖もしくはそのサブ−ユニットのどのような組み
合せ用にコード化する各々構造遺伝子を含む遺伝子（図
４参照）であシ、たとえばＡおよびＢペプチド鎖を表現
するための遺伝子、別々にまたはプロレラキシンとして
（Ｃ鎖とともに）の遺伝子である。

以下余白 （２６） 本発明は、更に、上記配列の相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａ）、サブーユニッ）ｆたは相当物および対応するＲ
ＮＡ配列、サブ−ユニットまたは相当物を含む。

本発明は、ヒトまたは他の霊長類レラキシン遺伝子のス
クリーン化に適切な合成プライマーを含む。図６に示め
されたこれらの二重−ストランドＤＮＡ断片は、豚とラ
ッ）　ｃＤＮＡ配列の間の最も相同な領域に対応する（
図４比較参照）。配列のがットンストランド（ｂｏｔｔ
ｏｍ　５ｔｒａｎｄｓ　　）は、ヒトまたは他の霊長類
レラキシンをスクリーンするだめのヌクレオチドプライ
マーとして使用のために、合成される。図６における数
字の範囲は、図５における対応する秘列領域を示めす。

発明を更に他の面から、下記に述べる。本発明の根本的
な点は、次の実験結果の記載において示めす。

ポリアデニル化ＲＮＡは、妊娠後期の豚の卵巣から切シ
出された黄体腺から分離する。この物質の無細胞翻訳研
究は、抗−レラキシン抗血清によって、免疫沈降可能な
生成物を容易に示めすことが（２７） できるので、レラキシンー特異性ｍＲＮＡが、豊富に存
在する・ことが期待される。初期の研究において、１妊
娠”および“非−妊娠“豚卵巣からのｃＤＮＡは、レラ
キシンｃ　ＤＮＡから誘導される有力な、妊娠−特異性
断片を見い出すための試みで、制限エンドヌクレアーゼ
で分解する。このアプローチは、不成功であり、レラキ
シンｍＲＮＡは、全卵巣ｍＲＮＡの１％よ多少ないよう
に思われる。この仮定は、全妊娠黄体腺から得られたク
ローンパンクにおいて、レラキシン配列を含ｔｒコロニ
ーの比は、約０．３％であることが発見された後、結果
的に罐められた。

豚しラキシンａＤＮＡクローンを同定するために用いら
れる他のアプローチは：クローン化うットプレプロレラ
キシンａＤＮＡから製造された試験体（ｐｒｏｂｅ）を
有する組侯えプラスミドを含むバクテリアコロニーをス
クリーンすることである。しかしながら、特異交雑−雑
種形成は、雑種形成の相関的に低いス）　ＩＪンジェン
シイの条件下に観察されない。この結果は、ラットと豚
のルプロレラキシンｅＤＮＡ’ｓとの間ヌクレオチド配
列相同によって説明される。一方総体的り相同（６５％
）は、交雑−雑種形成を可能にし、ミスマツチによって
阻害されないヌクレオチド配列の同一性の最も長い領域
は、１３塩基であることは、今や知られている。

図４は、豚プレデロレラキシンアミノ酸と、対応するう
、トレラキシン配列（カトン）を有するｍＲＮＡ配列（
トップ）との比較を示めす。星印は、ヌクレオチド相同
を示めし、一方四角でかこまれた領域は、アミノ酸相同
を示めす。アミノ酸は、Ｂ鎖の初めから番号がつけられ
ている。Ａｌａ　　下の星印は、ラットレラキシンにお
ける推定上のイントロンプＰセス化位置を意味する（ヒ
ュドソンら、、１９８１）。小さなヌクレオチド相同は
、豚とラットレラキシンｍＲＮＡ’ｓとの間の３′−未
翻訳領域で生じ、結果的に、ラットヌクレオチド配列は
、コードン終了後、四角でかこまれた領域およびＡＡＵ
ＡＡＵＡ配列周囲をのぞいて、全部から除去する。

第三のアプローチにおいて、一連のオリゴデオキシヌク
レオチドは豚しラキシンの既知のアミノ酸配列に基づい
て合成された（スカシロン、　１９８１）　。

図１は、 （、）　　特に豚しラキシンｍＲＮＡに雑種形成するに
用いられる８つのオリゴヌクレオチドプライマーの合成
のための主成分を形成する豚しラキシンＢ鎖のアミノ酸
１５−２３　： （ｂ）　　アミノ酸配列に対応するｍＲＮＡ可能なヌク
レオチド配列（ＸＦｉいかなる塩基會も表わす）；（Ｃ
）　　レラキシン特異性ｃＤＮＡ合成を開始するために
実際に用いられるプライマーを示めす。

Ｔｒｙ−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ−１１ｅ領域に対して（ｂ）
によって表わされる８つの１１−塩基プライマーは、す
べて合成される。プライマーのいくつかは妊娠特異ｃＤ
ＮＡ生成物を翻訳開始したが、豚しラキシン用にコード
化する配列を含まないことが、証明された。しかしなが
ら、□合成されたオリゴヌクレオチド〔５′ＡＴＣＴＣ
ＣＡＣｃＣ＾３′〕ノ一つカ、大体３０ｏヌクレオチド
の妊娠特異性ｃＤＮＡを翻訳開始するととが見い出され
、その配列は、レラキシンＢ鎖のＮＨ２−末端領域をエ
ンコード化する。このプライマーを用いて、ｃＤＮＡは
、妊娠および非−妊娠卵巣ｍＲＮＡで合成され、６％ポ
リアクリルアミド７Ｍウレアｒルで分析される。図２は
、ｒルカラムのオートラジオグラフを示めす。矢印は、
（約）３００ヌクレオチド５２Ｐ−標識化ｃＤＮＡを示
めし、豚しラキシンＢ鎖およびシグナルペプチドに対す
るコード化する配列を含むことが見い出されている。こ
のレラキシン特異性ｃＤＮＡは、豚卵巣から分離された
全ｍＲＮＡ　（上記載のように）か９１・、−１、組換
えＤＮＡ技術を用いて、得られたｃＤＮＡクローンパン
クを試験するために用いる。

約５０００　Ｅ、Ｃｏ１１卵果ｃＤＮＡクローンは、イ
ン・シトロでレラキシン一時異性ｃＤＮＡ試験体とフィ
ルター雑種形成によってスクリーン化し、そして１５コ
ロニーが、再スクリーンで、陽性（プラス）と判定され
た（全クローンの０．３％）。それらのプラミド挿入体
は、分離され、１チアガロースダル上で、大きさで分類
される。

いくつかの異なるＰａｔ挿入体サイズが見られ・おそら
く逆転写または二電ストランド反応中”へアービン”ル
ープの８１ヌクレア一ゼ分解における変異によってひき
おこされる。ＦＩＲＬＸ２゜ｐＲＬＸ１３およびｐＲＬ
Ｘ１４として、名づけられた３つのクローンは、ＤＮＡ
配列分析用に選択される。

これらの三つのクローンの分析から決定されたレラキシ
ンｏＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ地図は、配列化手
順（計画）とともに、図３に示めす。

この地図は、混成（合成）構造に関連のある各々のクロ
ーンの長さをも示めす。グループＡは、マックサムおよ
びシルバード法を用いて、篩導された配列を示めす（星
印は、３２Ｐ−末端標識の位置を示めす）。ａ、＊Ｐｓ
ｔ　Ｉ　−Ｈｐａ　ｌ　；ｂ、＊Ｈｐａ　ｌ−Ｂｇｌ　
ｌ　；ｃ、Ｐｓｔ　１−Ｈｐａｌｌ＊；　ｄ、＊Ｈｐａ
トＰｓｔ　Ｉ：　ｅ、Ｐｓｔ　Ｉ−Ｔａｑ　ｌ＊；　ｆ
、＊Ｔａｑ’１−Ｐａｔ；　ｇ、Ｐｓｔ　１−Ｈｌｎｆ
　ｌ＊；　ｈ。

＊Ｈｉｎｆ　Ｉ−Ｐａｔ　ｌ：　１　、Ｈｊｎｆ　１−
Ｐａｔ　ｌ＊：　ｊ、Ｈｉｎｆ　１−Ｈｐａ　ｌ＊。

グループＢは、バタテリオファージＭｌ　３ｍｐ　７．
１およびｍｐ９の過当な位置に、制限断片をサプクロ−
ン化することによって訪導された配列を示めし：（ｋ＋
　ｌ　＋ｎｌ＋　ｐ　ｒ　ｑ）は、Ｐｓｔ　ｌ断片であ
シ、（ｎ、、）は、Ａｃａ１位置にサブクローン化した
Ｈｐａ　ｆＪ　−Ｔａｑ　１断片である０組換え溶函斑
（ｐｌａｑｕｅｓ）は、レラキシンー特異性Ｂ−鎖デ７
（マー［”ＡＴＣＴＣＣＡＣＣｃＡ”、］　。

とプライムする（１）ヲのぞいて、サンジーら（１９８
０）のノブオキシ法によってＭ１３−特異性ブライマー
を用いて配列化される。

挿入体の各々は、シングルＨｐａ［およびＨ１ｎｆｌ制
限位置を含み；それらの位置での開裂は、末端−標識化
およびマックサムおよびシルバード配列化断片を提供す
る。クローンの１つ、ｐＲＬＸ２．について、両方のＤ
ＮＡストランドは、３′−未ＩＩＪ［領域およびＡ鎖領
域を除いて、配列され、全配列は同じストランドから二
つの別々の制限断片を用いて得られる。３′−未翻訳領
域は、＾鎖の末端に、ＵＧＡ終了コードンで始まる長さ
で、２ｏ６ヌクレオテドである。すべて三つのクローン
のＤＮＡ配列は、ヌクレオチド配列が、豚しラキシンの
既知のＡおよびＢ鎖−次構造をエンコード化するととを
確かめる（図４）。Ｃに対応するまたはペプチドおよび
シグナルペプチドに連結する領域は、型の全構盾が得ら
れ：シグナルペプチド−Ｂ鎖−Ｃペプチド−Ａ鎖、同定
される。

他の見方において、本発明は、豚染色体しラキシン遺伝
子の分離法を提供し、上記一記載の遺伝子のサブ−ユニ
ットもしくは、その相当物を含んでなる分子を実験体と
して、使用することを含んでなる。豚しラキシン遺伝子
、およびヒト、他の霊長類、または関連した種との間の
現在既知のヌクレオチド配列相同によって、同様の実験
体（物）は、他の種からこのような遺伝子を分離し、同
定するために用いることができる。

本発明は、更に、遺伝子の産生またはその相当物または
上記一記載の実施態様のいずれかによるそのサブ−ユニ
ットのプロセスを提供することであり、豚黄体腺から分
離された全ｍＲＮＡからｃＤＮＡクローンパンクを得る
だめの組換えＤＮＡ技術（法）を用いることおよび、合
成オリがヌクレオチド［５′ＡＴＣＴＣＣＡＣＣ弘３′
〕、によって翻訳開始されたｃＤＮＡ実験体を用いてク
ローンパンクをスクリーン化することを含んでなる。

本発明は、上記に定義されたように、いがなる遺伝子に
対応するｃ　ＤＮＡデオキシヌクレオチド配列を含んで
なるＤＮＡ転移ベクターを提供する。

本発明は、更に、上記に定義したようにＤＮＡ転移ベク
ターまたは遺伝子を提供し、その場合、１つもしくはそ
れ以上の自然コードンまたはそれらのｃＤＮＡ相当物は
、同じアミノ酸用にコード化する他のコードンによって
置き換えられるが、または、１つもしくはそれ以上の自
然コードンは、除去されるか、および／または自然コー
ドンによるコード化以外のアミノ酸用にコード化するコ
ードンによって置き換えるか、および／または更にコー
ドンを自然配列に加えるかである。

ＤＮＡ　転移ベクターは、バクテリア性プラスミドバク
テリオファージＤＮＡ　ｈ　ｌ：；うる。

本発明の特別の見地において、上記一記載の実施態様に
基づいて、遺伝子、またはそのサブ−ユニットまたはそ
の相当物の挿入位置で、挿入されたプラスミドベクター
を含んでなるプラスミド組換えを提供することであシ、
プラスミド組換えは、挿入された遺伝子またはそのサブ
−ユニットまたはその相当物に対応するｍＲＮＡに対す
る修正相（ｃｏｒｒｅｃｔ　ｐｈａｓｅ）において翻訳
を可能にせしめ、挿入された遺伝子またはそのサブ−ユ
ニットまたはその相当物がバクテリア性プロモーター・
コントロール下にあるように挿入位置に隣接しおよび挿
入位置の上方にバクテリア性プロモーターを有する。

適当なベクターの挿入位置で、レラキシンに対する望ま
しい構造遺伝子に対応するＤＮＡを挿入することを含ん
でなるプロセスによるこのような組換え分子の生成は、
本発明の実施幅様を構成する。

更に本発明は、その中に挿入されたこのような遺伝子ま
たはそのサブ−ユニットまたはその相当物またはこのよ
うなプラスミド組換えを含んでなる形質転換された細胞
をも提供する。

適当なベクターを経由して、細胞に挿入することを含ん
でなるプロセスによるこのような細胞の生成も、本発明
の実施態様を構成する。

更に実施態様において、本発明は、豚プレプロレラキシ
ン、または豚デレプロレラキシンに類似の性質を有する
たんばく質の生成に関するプロセスを提供し、このよう
な細胞の培養および表現されたたんばく質の回復（修復
）することを含んでなる。

本発明は、上記載と類似の方法による豚プロレラキシン
またはレラキシンＡ、ＢおよびＣペプチドの生成を含み
、当該分野においてすでに知られている方法、および実
施応用によるｃＤＮＡの合成法をも含む。

本発明は、物に上記載のプロセスによって製造された場
合、合成デレグロレラキシン、プロレラキシンおよびＡ
、ＢおよびＣ−＜プチド鎖にも及ぶものである。

本発明は、更にプレゾロレラキシｙｔｌｊ：プロレラキ
シンからのレラキシンの生成または、各々の前駆体から
インシュリンの生成に用いられたと類似の方法によって
ＡおよびＢ鎖の会合による生（３８） 成をも含む。

本発明を構成する部分または関連する方法において用い
られた材料および方法（操作）は次に示めす。

材料 ターミナル・トランスフェラーゼを、ラットクリフバイ
オケミカル社（ロス　アラモス、　Ｎ、Ｍ、）から、Ｐ
ａｔｌ、Ｂｇｌｌ、ＤＩ’ＪＡｙｊｅ！Ｊメ、ｉ’−セ
（りＬｙノウ断片）および８１ヌクレアーゼを、がエリ
ンガー・アンハイム社から購入した。Ｉ（Ｉｎｆ　Ｉ　
。

ＴａＱＩ　、Ｈａｓ　ＩＬ　Ａｌｕ　Ｉ　ｒおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ全、ニューイングランドバイオラボ（ベ
パリイ、　ＭＡ）から手に入れた。オリゴ−ｄＴ士ルロ
ースタイプ７を、ＰＬバイオケミカルズ（ミルウォキー
１ｗ１）カラ得た。５２ｐ−標識化ヌクレオチドトリフ
オスフェートおよび３５Ｓ−標識化アミノばを、アマ−
ジャムから得た。

メ、センジャーＲ応り分ｓｇ 妊娠後期の豚の卵巣を屠殺ｉで集めることによって得、
ドライアイスですぐ凍結させる。黄体腺（３９） を、他の組織が入りこまないように切り出し、５Ｍグア
ニジニウムチオシアネート（メルク）（テルクビンら、
、１９７９）中に分離されたＲＮＡおよびＲＮＡ　’ｉ
含むポリＡ＋を、オリゴ−ｄＴセルロースアフィニティ
クロマトグラフィー（アビフおよびレーダー、１９７２
）によって精製する。収量は、約１００ｍｇ組織につき
１’０ｔｉｌ！ポＩＪＡＲＮＡである。レラキシンー含
有メツセージに対するｍＲＮＡ分析のために、無細胞翻
訳は、ウサギ網状赤血球細胞溶解物を用いて行なわれ（
ケスラー。

１９７５）、免疫沈降させたタンパク質は、ＳＤＳポリ
アクリルアミドｒルで、電気泳動を行なう（ステユデエ
ル、１９７３）。

ｅＤＮλハ、リバーストランスクリプターゼおよびオリ
ゴ−ｄＴｆライマー（ヴイ゛カニら、、１９７８）を用
いて製造され、アルカリで加水分解されたＲＮＡ　、お
よびｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼｌ（フレノウ断片
）で二重−ストランド化される（ウルリッヒら、、１９
７７）。単−一ストランド化１ヘアピンルーゾは、Ｓ】
ヌクレアーゼの１０ユニツトで２０℃で５分間で除去さ
れる（ポク　ト　、１９７３）　　。　　　　　　　　
　　　　　　　□ホモポリメリック・デオキシシチジン
・ニステンションは、酵素的に、ターミナル・トランス
フェラーゼ（５０μ）反応容置中に１０ユニ、ト。

３７１４’、１０分間）を用いて、３’−ＯＨ末端に約
３０’Ｃ−残基を加えるために計画されたコントロール
した反応において′（ロイチョウドグリイら、。

１９７６）、酵素的に、ターミナル・トランスフェラー
ゼ（’５０μ１５０μ量中に１０ユニツ′ト。

３７℃で１０分間）を用いて、加えられる。この１テイ
ル化（’ｔａｉｉ’ｅｄ）　’　ａＤＮＡは、Ｐａｔｌ
プラスミドＰＢＲ３２’　２にアニール化され、Ｐｓｔ
’ｌで開裂′され、同様にＧ−残基で“ティル化”され
る。組換えプラスミドはＥ、Ｃ’ｏ　ｌ　ｉ　ＲＲＩ　
ｋ形質転換するために用いられ（′効率’＝１０５クロ
ーン／μｌｌグラスミド）および卵巣ｃＤＮＡを含むレ
ローンは、テトラサイタリン抵抗性（耐性）（モリンン
、　１９７９）に基づいて選択される□。

：以１゛：示白 特異性ｃｌ）ＮＡクローンの選択 レラキシン時異配列用の卵巣ａＤＮＡクローンパンクを
スクリーン化するために、８つの１１−塩基プライアー
は、豚しラキシンＢ鎖におけるペプチド配列Ｔｒｙ　−
Ｖａｌ　−Ｇｕｌ　−１１ｅに対応するすべての可能な
相補的配列を作るために（図、１）ホスホトリエステル
法（イタクラら、、１９７３）によって化学的に合成さ
れる。それらのプライマーは、ｃＤＮＡクローンパンク
への雑徨形成実験体として、使用するために特異ｃＤＮ
Ａ生成物を選択するために用いられる。

オリがヌクレオチドプライマーは、高比活性の合成およ
び完全な長さｃＤＮＡの収敏のために、計画された条件
下に、ｍＲＮＡの逆転写を翻訳開始するために用いられ
る。ｍＲＮＡ　（２μＩ）をプライマー（０，１−１μ
ｇ）に加え、９０℃で２分間加熱し、ゆっくりと冷却し
、リバーストラスクリデターゼ反応ｔ−３７℃のもとて
５０　ｍＭ　）リスｐＨ８，Ｑ　、　５０　ｍＭｔＸ化
ナトリウム＋１０ｍＭ硫酸マグネシウム、６００μ＋１
１１１　ｄＡＴＰ　、　ｄＴＴＰ　、　ｄＧＴＰを含む
０．１　ｍＭ　ＤＴＴ　、　３０　μＭ　ｄｃ’ｌ’Ｐ
　、　３０　Ｃ１β−３２Ｐ　−ｄＣＴＰおよびリバー
ストランスクリグターゼ（１０ユニツト）ヲ含む反応液
で行なう。

反応生成物’ｉ、ＲＮＡ’ｉ除去するためにアルカリ処
理しく　１００　ｍＭ水酸化ナトリウム、８０℃、１０
分間）、妊娠−特異性ｃＤＮＡ’ｓの存在について６チ
アクリルアミド７Ｍウレアグルで分析する（図２）。別
の実験において、シラキシン−特異性配列を含むｃ　Ｄ
ＮＡクローンのどれかを同定するために、プライマー（
５′−ホスフェートの欠損している）は、放射化学的に
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび　Ｐ　−ＡＴＰ
で末端−標識化しく１００Ｃｉ／μＩプライマー）、ｃ
ＤＮＡは、β−３２ｐ−デオキシヌクレオチドの不在下
に合成される（ノイエスら、１９７９）。この得られた
末端−標識化ＤＮＡは、化学的分解法による配列化に適
切である（マックサムおよびシルバー）、１９７７）。

特異性ｃＤＮＡバンドに対応するダルの領域は切り取り
、透析膜バックに入れ、ＤＮＡは、５０ｍＭトリス−ボ
レー）　、　１　ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，１）中で、
ダルマ）　ＩＪワックスら電気泳動的に取り去る。溶出
されたＤＮＡサンプルは、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５，５）中でのエタノール２倍量で、−２０℃のもと
て４時間沈澱させる。

上記載の方法によって同定されたレラキシンー特異性ｃ
ＤＮＡ断片は、１０８ｃｐｒｒｖ’μＩよシ大きい比活
性に合成されポリアクリルアミドで精製され、ｃＤＮＡ
クローンパンクをスクリーン化するために用いる（タイ
ヤ−，１９７９）。この試験体に雑種形成するコロニー
を、特異雑種形成の割合について、陽性（プラス）を分
類するために、二重に再スクリーンする。最も強い雑種
形成りローンは、迅速なプラスミド分離法（ホームズお
よびキンクレイ、１９８１）によってスクリーン化され
、最も大きい組換えプラスミドを含むものを、大きな規
模でのプラスミドの分離のため（タナ力およびパアイス
プルム、１９７５）ＩＪ培養地で増殖させ、プラスミド
約７００μｇが得られる。

組換えシラスミドの配列分析 制限分解（消化）は、ニューイングランドパイオラかに
よって指定された条件下に行なう。５′−突出（ｐｒｏ
ｔｒｕｄｉｎｇ）末端を有する精製したＤＮＡ断片全、
リバーストランスクリックーゼおよび適当なβ−標識化
デオキシヌクレオチドトリホスフェースを用いて末端−
標識化する（ＨｐａＩｌおよびＴａｑｌに対してｄＣＴ
Ｐ　；　Ｈｌｎｆ　Ｉに対してｄＡＴＰ）。

Ｐａｔｌで得られた３′−突出末端は、ターミナルトラ
ンスフェラーゼおよびＣＰ）−コルダイセビントリホス
フェートを用いて、標識化される。断片は一８チポリア
クリルアミドの電気泳動によって分離し、化学的分解法
によって（マヅクサムおよびシルバー）、１９７７）に
よって配列化される。

Ｐｓｔ１分解（消化）によって遊離されたクローン化ａ
ＤＮＡ挿人体は、バクテリオファージＭ１３ｍｐ　９ま
たはｍｐ７．１および分離された単−一ストランド鋳型
ＤＮＡに連結させ、ジデオキシ法（サンジャーら、１９
８０）を用いて配列化させる。

Ｍ１３組換えは、Ｍ２Ｓ−特異性プライマーを用いて、
もしくはインターナルレラキシン配列の特別の領域上で
選択された特異プライマーで配列化される。

豚プレデロレラキシンの表現 表現ベクターＴｒｐＥＤ５−１　（ハレウ、ル、Ｒ，Ａ
およびエンタジ＋　Ｓ、ａ　１９８０　＋　Ｇｅｎｅ　
９巻、２７ページ）Ｆｉ、、トリプトファンプロモータ
ーおよびＴｒｐ　ＥならびにＴｒｐ　Ｄ配列を有するｐ
ＢＲ３２２の復製特性を有する。デＶ′すｉ、レラキシ
ン遺伝子は、ユニーク［相］−（ロ）Ｈｌｎｄ　１１’
：ｐエンドヌクレアーゼ位置を径てＴｒｐ　Ｄ配列に４
入されうるし、融合ＴｒｐＤ／プレデロレラヤシレタン
・臂り質の生成は、訪因性Ｔｒｐプロモーターに門って
調節される。

ＴｒｐＥＤ５−１は、）（ｉｎ；■で３７℃のもとで、
３時間で開裂され（５０ｍＭ　）リスＣ１ｐＪ−１７，
４゜１０ｍＭ塩化マグネシウム＋　５０　ｍＭ塩化ナト
リウム）、酵−は、７０℃のもとて１０分間の加熱で不
活性化させ、スタガー）　（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端
は、Ｔ４ポリメラーゼ（２００ｍＭ　ｄＡＴＰ　、　ｄ
ＣＴＰ　。

ｄＧＴＰ　、　ｄＴＴＰ　：　１１℃で３時間）で飽和
させる。

グレ！ロレラキシン配列〔）・−レイ、Ｊ、Ｄ、　ラ（
１９８２）ＤＮＡ１巻、１５５−１６２−’！−ジ〕は
、５′−未翻訳配列におけるＴＡＧ終了コードンを除去
するためにＸｂａで開裂させる。３′−末端は、Ｐｓｔ
で開裂され、完全な長さである。スタガード終末端（ｓ
ｔａｇｇｅｒｅｄ　ｔｅｒｍｉｎｉ）は、Ｓｔヌクレア
ーゼ（１０ユニツト）で２０℃のもとて５分間（０，３
Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐ１４７．
６．３ｍＭ酢酸亜鉛）でプラント（ｂｌｕｎｔ　）末端
を得るために除去される。フェノール／クロロホルム抽
出、エーテル抽出および上澄のエタノール沈澱によって
反応停止する。グロセス化ＴｒｐＥＰ５１ベクターおよ
びプレプロレラキシンの等量を、Ｔ４！Ｊガーゼと会合
させる（５０ｍＭトリス、　Ｃｔｐ）１７．４　、１０
ｍＭ塩化マグネシウム。

１　ｍＭＤＴＴ　、　１　ｍＭＡＴＰ　、　１０℃のも
とて２４時間）。

ＥＤ６ｏｏ＝０．３で増殖したＥ、Ｃｏ１１２９４は、
塩化カルシウム処理によって、有効にせしめる。

（７５ｍＭ塩化カルシウム、　１０　ｍＭ　）リス、　
ｃｔｐＨ７，４，４℃１時間）会合したＴｒｐ　ＥＤ５
−１　／プレデロレラキシンＤＮＡを加える。氷上で３
時間保持した後、細胞／ＤＮＡ混合物に、熱ショック処
理（４５℃、９０秒間）をし、更に３０分間氷上に保持
する。細胞をアンピシリン（２０μｍ７７ｍｅ）で捕捉
したＬ・グロスプレートにプレートし、組換えバクテリ
アをイン・シトウでフィルター雑種形成によって、β−
３２Ｐ　−ｄＡＴＰ標識化標識化プレクロレラキシンク
リーン化する〔タイヤ−２Ｒ，Ｅ、　（１９７９）　Ａ
ｎａｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　＋　９８巻、６０−６３４−
ジ〕。この方法で生成した組換えバクテリアは、３−イ
ンドールアクリル酸で誘発されるＴｒｐ　Ｄ　／デレデ
ロレラキシン融合タンノ９り質を生成することができる
〔マーティアル、　Ｊ、Ａ、ら（１９７９）　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　、　２０５巻、６０２−６ページ〕。

以下余白

【図面の簡単な説明】

図１１よ、阻−１１Ａ曲乙列１（灯へ°Ｔ３＃レフＮシ
ンめ）３１のア（）Ｉ乙列のす叶も夷込゛Ｔ言乙ｌマ方
乙級ぐ鱈丁；４ン・へブライマーと示し； 図ＺＩＪ、ＣＣ）ＮＡ　’！ｕツのグｔＶ７ｏ　＜　ｈ
グ２Ａ／）１）−フジ′オグラフ了示し； 図３１よ、豚しラヤシンｃＤＮＡ　　の身す／ＪエンＦ
゛又Ｚレアーゼマ・／グア“＾り； 図＋１大、ラヅ１お４バ豚グレブロレラキシシのｙｖＬ
、四へ　お七尺ペガＬＦｐ列Ｙ示し、図５１よ、琢アレ
７°Ｕレラキシン１て灯１３戯悶△およ湾゛アク／峡西
乙りＩ］￥示し；おシ込゛図６１人、スＺレオナＦ′グ
クイマーとして用いられ６二重ストラ・／ド゛［）ＮＡ
　断片？示１゜以下糸白 図面の浄書（内容に変更なし） ａ、　　　　Ｖａｔ　　　Δｒｇ　　　Ｌｅｕ　　　Ｔ
ｒｐ　　　Ｖａｔ　　　［）ＬＵ　　　　Ｉｌｅ　　　
Ｃｙｓ竿１．記 ＰＲＥＧ　　　　　俳−妊娘 鳩、２．（躬 ４４５ １１コ Ａ６Ｕ（ＩＩＡｃＡＵＡＵＬ［ＡＣＵＵＡＵＧＣｃｕＣ
ｕｃｕｃＡｃｃ〔ＡＣＵＧＡＵＵＡＵＵＡＧＣＡｃｕＧ
ＵＵＬＩＡＧＵＧＵＵＵＡ７１ ５′３′ １、−　５４４−５５９　　　　ＧＡＡＧＡＡＴＴＴＭ
ＧＡＡＭＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴ ２、　　４５８−４７１　　　　ＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡ
ＧＧＣＡＴＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＧＴ ３、　　４０５−１＋１６　　　　ＣＡＡＡＧＡＴＧＣ
ＡＧＡＧＴＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴ ７４、　　４７６−４８７　　　　ＴＧＴＣＴＧＡＧＡ
ＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＣＴＣＣＧ ５、　　５７９−５９０　　　　ＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡ
ＧＡＡＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＴ ６　、　　５０１−５１３　　　　ＡＧＡＧＣＴＡＣＡ
ＡＣＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＴ ７、　　６１０−６２０　　　　ＡＡＡＭＣＴＴＡＧＧ
ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＣ ８、６８８−７００ＧＧｎＧＴＡＴＣＡＧＭＣＣＡＡＣ
ＡＴＡＧＴＣＴＴ 笛、６．朋 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号Ｃｌ
２Ｐ　　２１１００　　　　　　　　　　７２３５−４
Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　　１１００ ＣＩ２　Ｒ１／１９　）　　　　　　　　　　　６７６
０−４８（Ｃ１２Ｐ　２１１００ Ｃ１２Ｒ１／１９　）　　　　　　　　　　６７６０−
４Ｂ＠発　明　者　ジョン・ドウグラス・ハレイオース
トラリア国ザ・ステイト ・オブ・ビクトリア・ホウソー ン・ムイール・ストリート２９ア パートメント３ ［相］発　明　者　ユーゴ・デビット・二アールオース
トラリア国ザ・ステイト ・オブ・ビクトリア・エルウラ ド・ベンデイゴ・アベニュ３ ＠発　明　者　ジョン・シャイン オーストラリア国オーストラリ アン・キャピタル・テリトリ− ・スウインガー・ヒル・バーネ ット・クローズ１０７ 手続補正書（方式） 昭和５８年６月３０日 特許庁長官　若　杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年　特許願　　第２１９６７号２、発明の名称 分子クローニングおよび豚しラキシン用にコード化する
遺伝子配列の特性 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４、代理人 ゛６．補正の対象 （１）願書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）法人証明書 （４）図　面 ７、補正の内容 （１１、（２１、（４１別紙の通り （３）図面の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）訂正願書　　　　　　　　　　　　１通（２）委
任状及び訳文　　　　　　　　各１通（３）法人証明書
及び訳文　　　　　　各１通（４）浄書図面　　　　　
　　　　　　　１通（２）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、豚のプレプロレラキシン、もしくはそのサブ−ユニ
   ットの表現用遺伝子またはこのような遺伝子もしくはサ
   ブ−ユニットの相当物。 ２、　コード化ストランドおよび次のような完全なｍＲ
   ＮＡ配列： ＡＵＧ　ＣＣＧ　ＣＧＣＣＵＧ　ＵＵＣＵＣＣＵＡＣＣ
   ＵＣＣＵＡ　ＧＧＵ　ＧＵＣＵＧＧ　ＣＵＧ　ＣＵＣＣ
   ＵＧ　ＡＧＣＣＡＡ　ＣＵＵ　ＣＣＣＡＧＡ　ＧＡＡ　
   ＡＵＣＣＣＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＡＧＵ　ＡＣＧ　ＡＡＣ
   ＧＡＵ　ＵＵＵ　ＡＵＵ　ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＵＧＣＧ、
   ＧＣＣＧＡ　ＧＡＡ　ＵＵＡ　ＧＵＣＣＧＵ　ＣＵＧ　
   ＵＧＧＧＵＧ　ＧＡＧ　ＡＵＣＵＧＵ　ＧＧＣＵＣＣＧ
   ＵＣＵＣＣｔｒａＧＧＧＡ　ＡＧＡ　ＡＣＵ　ＧＣＵ　
   ＣＵＣＡＧＯＣＵＧ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＣＣＵ　ＣＡＧ
   　ＣＵＧ　ＧＡＡ　ＡＣＵ　ＧＧＡ　ＣＣＣＣＣＧ　Ｇ
   ＣＡ　ＧＡＡＡＣＣＡＵＧ　ＣＣＡ　ＵＣＣＵＣＣＡＵ
   ＣＡＣＣＡＡＡ　ＧＡＵ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＡＵＣＵＵ
   Ａ　ＡＡＧＡＵＧ　ＡＵＧ　ＵＵＧ　ＧＡＡ　ＵＵＵ　
   ＧＵＵ　ＣＣＵ　ＡＡＵ　ＵＵＧ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　Ｇ
   ＡＧ　ＣＵＧ　ＡＡＧＧＣＡ　ＡＣＡ　ＵＵＧ　ＵＣＵ
   　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＵＣＡ　ＣＵＧ　
   ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＣＵＡ　ＣＡＡＣＡＡ　ＵＣＡ　ＧＣ
   Ａ　ＵＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＵ　ＵＣＧ　ＡＡＵ　ＣＵＵ
   　ＡＡＣＵＵＵ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＵＵＵＡＡＧ　ＡＡ
   Ａ　ＡＵＵ　ＡＵＵ　ＣＵＵ　ＡＡＣＡＧＡ　ＣＡＡ　
   ＡＡＵ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＣＡＡＡＡＧＵ
   　ＣＵＵ　ＵＵＡ　ＧＡＡ　ＵＵＡ　ＡＡＡ　ＡＡＣＵ
   ＵＡ　ＧＧＵ　ｔＪＵＡ　ＧＡＵ　ＡＡＡ　ＣＡＵ　Ｕ
   ＣＣＡＧＡ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＣＵＧ　ＵＵＣ
   ＣＧＵ　ＡＵＧ　ＡＣＡ　ＣＵＧ　ＡＧＣＧＡＧ　ＡＡ
   Ａ　ＵＧＵＴＪＩＪＣＡＡＧ［ＩＡα１■工訂Ｎ℃Ｍ沃
   思０田Ｎ訂αＩＬＭ仄■乃、ＵＧＣに対応する相補的ス
   トランドを含んでなることを特徴とする豚プレデロレラ
   キシンの表現用二重−ストランドＤＮＡ断片もしくはそ
   のサブ−ユニットまたはこのような遺伝子もしくはサブ
   −ユニットの相当物。 ３、特許請求の範囲第１項もしくは第２項記載の遺伝子
   のサブ−ユニット。 ４、豚プロレラキシンの表現用遺伝子もしくはそのサブ
   −ユニットまたはこのような遺伝子もしくはサブ−ユニ
   ットの相当物。 ５　コード化ストランドおよび次のようなｍＲＮＡ配列
   ： ＣＡＧ　ＡＧＵＡ（Ｉｆｆ　ＡＡＣ ＧＡＵ　［００Ｎ）ＵＡＡＧ　ＧＣＡ　ＴｎＣＧＧＣＣ
   Ｇｋ　ＧＡＡ　ＩＪＵＡ　（ＩＪＣＱＸＪ　ＣＴＪＧ　
   ＴＪ）Ｇ■頁圏ＡＬＩＣＬＩＩＪ世Ｕτ□□□肛田Ｘ島
   旭ΩＪαＭぼｘｉαＩＧ　ＧＡＡ　ＧＡＧαＩＪＣＡＧ
   αＤＧＡＡＡＣＵ（χ汰α℃α１１１；　ＧＣＡ　ＧＡ
   ＡＡＣＣＡＩＤ　ＱＩＡ　ＴＪＣＣｌｌＩＣＡＩＪＣＡ
   ＣＣＡＡＡ　ＧＡＵ　ＧＣスＧＡＡ　ＡＩＪＣＴＪＵＡ
   　ＡＡＧＡＵＧ　Ｍｎ　ＴＭ；　ＧＡＡ　Ｕ［ＪＵ　Ｇ
   ＯＵ　ＯＣＵ　ＡＡＵ　ＩＪＯＧ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　Ｇ
   ＡＧ　Ｃ！Ｇ　ＡＡＧＯＣＡ　ＡＣＡ　ＴＪＯＧ　ＴＪ
   ＩＪ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　Ｕ（スαＩＣ
   ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＱＭ　ＣＡＡＣＡＡ　ＴＪＣＡ　ＧＣ
   Ａ　ＩＪＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＩＪ　ｔｍ　ＡＡｆＪαＪ
   Ｕ　ＡＡＣ［００ＧＡＡ　ＧＡＡ　Ｕ［ＪＵＡＡＧ　Ａ
   ＡＡ　ＡＩＩＪ　ＡＩＪＵ　ＱＪ［Ｊ　ＡＡＣＡｔ”’
   、Ａ　ＣＡＡ　ＡＡＩＪ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　Ｇ
   ＡＣＡＡＡＡｎｌ　ＱＪ［Ｊ　Ｕ［ＩＡＧＡＡ　ＵＵＡ
   　ＡＡＡ　ＡＡＣＵ［族（ＸＩＪ　ＴＪＵＡ　ＧＡＩＪ
   　ＡＡＡ　ＣＡＩＪ　ＵＣＣＡＧＡ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　
   ＡＧＡ　四ＴＸ℃ＣＸ；ＩＪ　ＡＩＪＩＩ；　ＡＣＡ　
   Ｃ５に　ＡＧＣＧＡＧ　ＡＡＡ　ＩＩＩＪＩＸＩＪ　Ｃ
   ＡＡ　Ｇ［ＪＡ　（ＸＩＪ　ＴＪＧＵ　ＡＩＪＣＡＧＡ
   　ＡＡＡ　ＧＡＩＪ　ＡＩＪＵ　ＧＱＪ　ＡＧＡ　ＵＣ
   族ｕ℃に対応する相補的ストランドを含んでなること全
   特徴とする豚プロレラキシンの表現用二重−ストランド
   ＤＮＡ断片もしくはそのサブ−ユニットまたはこのよう
   な遺伝子もしくはサブ−ユニットの相当物。 ６　豚しラキシンのシグナル、Ａ、ＢまたはＣペプチド
   鎖また該鎖の二つもしくはそれ以上の組み合わせの分別
   表現用遺伝子。 ７　コード化ストランドおよび次のようなｍＲＮＡ配列
   ：　　　　　　　′ 肚の；　Ｑ”、Ｃ６田頁肛Ｉ頁■−ωＩＪ（ＩＩは圓の
   Ｉ■冗ＡＧＣ賜但聰」島Ｑ嵯、肛田餐仄 に対応する相補的ストランドを含んでなることを特徴と
   する豚プレプロレラキシンのシグナルペプチド鎖゛の表
   現用二重−ストランドＤＮＡ断片もしくはそのサブ−ユ
   ニットまたはこのような遺伝子もしくけサブ−ユニット
   の相当物。 ８　コード化ストランドおよび次のようなｍＲＮＡ配列
   ： 田Ｊ几ＡＣＡ四肛肋乃Ｗ１す ＴｎＪ　ＣＡＡ　Ｇ［ＩＡ　ＯＧＵ　ｌｌ１Ｕ　ＡＩＪ
   ＣＡＧＡ　ＡＡＡ　Ｑ酊ＡＩＪＵ　ＧＣＵ　ＡＧＡ　Ｕ
   ＵＡ　ＴＪｆに対応する相補的ストランドを含んでなる
   ことを特徴とする豚プレプロレラキシンのＡペプチド鎖
   の表現用二重−ストランドＤＮＡ断片もしくはそのサブ
   −ユニットまたはこのような遺伝子もしくはサブ−ユニ
   ットの相当物。 ９　コード化ストランドおよび次のようなｍＲＮＡ配列
   ： ＣＡＧ　ＡＧｔＪ　ａん℃ ＧＡＵ　ＩＪ［］ＪＵＡＵＵ　ＡＡＧ　ＧｃＡＴＪＧＣ
   ＯＧＣａｉ　ＧＡＡ　ＴＪＩＩＡ　ＧＯＯαＵＣＯＤ１
   ｍＧＵＧＧＡＧＡＩＪＣＵＧ［ＪαＩＴＪＯＣαＪＣＴ
   ＪＣＣＩＤＧ　ＧＧｌｙ　ＡＧＡ　ＡＣＵ　ＧＣＩＪ　
   ＱＪＣに対応する相補的ストランドを含んでなることを
   特徴とする豚プレプロレラキシンのＢペプチド鎖の表現
   用二重−ストランドＤＮＡ断片もしくはそのサブ−・ユ
   ニットまたはこのような遺伝子もしくはサブ−ユニット
   の相当物。 １０、コード化ストランドおよび次のようなｍＲＮＡ配
   列： に；Ｃ（Ｘ］Ｇ　ＧＡＡ　ＧＡＧＯＣＵ　ＣＡＧ　（５
   Ｊ３　ＧＡＡ　ＡＣＵ　Ｑｌａ　ＣＣＣ（ＸＤ　ＧＣＡ
   　ＧＡＡＡＯＣＡＩＪＣＣＣＡ　ＩＪＣＣＴＪＣＣＡＩ
   ＪＣＡｃｅ　ＡＡＡ　ＧＡＵ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＡＩＪ
   ＣＴＪＵＡ　ＡＡＧｆｆ　ｆｆ　Ｕ［Ｉｌ；　ＧＡＡ　
   ＴＪＵＵ　ＧＵＵ　ωｈＷ１田ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＧ
   　ＣＵＧ　ＡＡＧＧＣＡ　ＡＣＡ　ＴＪＩ）：；　ｌＸ
   ５Ｊ　ＧＡＧ　）ｍ　ＣＡＡ　ＯＣＡ　ＩＪＣＡ　Ｏｎ
   　ＡＧＡ　ＧＡＧ　０１　ＣＡＡＣＡＡ　（ＴＣ）−Ｇ
   ＣＡ　ＬＪＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＩＪ　ＩＸＭ　Ａ／旧Ｑ
   ＪＵ　ＡＡＣＵＵＵ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＵＵＵＡＡＧ　
   ＡＡＡ　ＡＵＵ　ＡＩ］ＴＪ　ＣＵＩＪ　ＡＡＣａ　Ｃ
   ＡＡ　ＡＡＵ　ＧＡＡ　（Ｘｉ　ＧＡＡ　ＧＡＣＡＡＡ
   ＡＧＵ　ＣｕＴ　ＬＩＬＩＡ　ＧＡＡ　ＵｔＪＡ　ＡＡ
   ＡＡＡＣＴＪＵＡＧＧＵＵＬＮＡ　ＧＡＩＪ　ＡＡＡ、
   ＣＡＵＴＪＣＣＡＧＡ　ＡＡＡ　ＡＡＧＡＧＡ（ｌｊＧ
   　ＴＪＯＣに対応する相補的ストランドを含んでなるこ
   とを％徴とする豚ゾレプロレラキシンのＣペプチド鎖の
   表現用二重−ストランドＤＮＡ断片もしくはそのサブ−
   ユニットまたはこのような遺伝子もしくはサブ−ユニッ
   トの相当物。 １１、コード化ストランドおよび特許請求の範囲第７項
   から第１０項までのいずれかに記載のｍＲＮＡ配列の適
   当な組み合わせに対応する相補的ストランドを含んでな
   ることを特徴とする豚プレグロレラキシンのシグナル、
   Ａ、ＢおよびＣペプチド鎖の二つもしくはそれ以上のい
   かなる組み合わせからなるペプチドの表現用二重−スト
   ランドＤＮＡ断片。 １２　　下記から： ＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴ ＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＡ ＴＣＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＧＴ ＣＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ ＧＴＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴ ＴＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＣ ＡＣＡＧＡＣＴＣＴＣＣＧ ＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡ ＡＣＴＴＣＧＴＣＴＴＣＴ ＡＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡ ＴＣＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＴ ＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧ Ｔ’ｆ’ＴＴＴＧＡＡＴＣＣ ＧＧＴＴＧＴＡＴＣＡＧＡＡ ＣＣＡＡＣＡＴＡＧＴＣＴＴ。 選択された二重−ストランドＤＮＡ断片。 １３、ヒトまたは他の霊長類または関連した種の染色体
   レラキシンの分離に際し、特許請求の範囲第１項から第
   １１項までのいずれかに記載の遺伝子のサブ−ユニット
   もしくはこのようなサブ−ユニットの相当物を実験材料
   として用いることを含んでなることを特徴とする分離方
   法。 １４、豚黄体腺から分離された全ｍＤＮＡからｃＤＮＡ
   クローンパンクを得るための組換えＤＮＡ技術を用い５
   ′ ることおよび合成オリゴヌクレ粁ド（ＡＴＣＴＣＣＡＣ
   ＣｊＡ３正よって翻訳開始されたｃＤＮＡ実験材料を用
   いてのクローンパンクをスクリーン化することを含んで
   なることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第１３
   項までのいずれかに記載の遺伝子またはその相当物また
   はそのサブ−ユニットの生産方法。 １５、　ｃＩｊＮＡデオキシヌクレオチド配列として、
   特許請求の範囲第１項から第１１項までのいずれかに記
   載の遺伝子もしくはこのような遺伝子のサブ−ユニット
   またはこのような遺伝子もしくはサブ−ユニットの相当
   物を含むことを特徴とするＤＮＡ転移ベクター。 １６１つもしくはそれ以上の自然暗号またはそれらのｃ
   　ＤＮＡ相当物が、同じアミノ酸に対してコード化する
   他の暗号によって置き換えられることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項から簡１１　＠までおよび第１５項の
   いずれかに記載の遺伝子またはｂＮＡ転移ベクター。 １７．１つもしくはそれ以上の自然暗号が削除されるか
   および／または自然暗号によってコードイヒされるのと
   別な方法でアミノ酸に対してコード化する暗号によって
   置き換えされるか、および／または更にコドンが自然配
   列に加えられること全特徴とする特許請求の範囲第１項
   から第１１項までおよび第１５項のいずれかに記載の遺
   伝子またはＤＮＡ転移ベクター。 １８、バクテリアシラスミドであることを特徴とする特
   許請求の範囲第１５項から１７項までのいずれかに記載
   のＤＮＡ転移ベクター。 １９、バクテリオファージＤＮＡである特許請求の範囲
   第１５項からｈ４１γ項までのいずれかに記載のＤＮＡ
   転移ベクター。 ２０、転移ベクターとして、特許請求の範囲第１５項か
   ら第１７項までのいずれかに記載のベクターによって形
   質転換された細胞。 ２１、豚プレグロレラキシンの適当なデオキシヌクレオ
   チド配列または転移ベクターを開裂することによって製
   造されたＤＮＡ分子を有′するサブ−ユニットを、制限
   酵素と反応せしめることを含んでなることを特徴とする
   、豚プレ７″′ロレラキシンまたそのサブーユ・ニット
   用にコード化するデオキシヌクレオチドを維持し、複製
   することにおいて用いられるＤＮＡ転移ベクターを製造
   する方法。 ２２、転移ベクターを開裂することによって、製造され
   たＤＮＡ分子を有する適当なデオキシヌクレオチド配列
   豚プロレラキシンを、制限酵素と反応せし・めることを
   含んでなることを４％徴とする、豚プロレラキシン用に
   コード化するデオキシヌクレオチドを維持し、複製する
   ことにおいて用いられるＤＮＡ転移ベクターを製造する
   方法。 ２３、転移ベクターを開裂することによって、製造され
   たＤＮＡ分子を有する適当人デオキシヌクレオチド配列
   を、制限酵素と反応せしめることを含んでなることを特
   徴とする、豚プレプロレラキシンのシグナルペゾチドま
   たはＡ、ＢまたはＣ鎖ベグチド、または二つ、もしくは
   それ以上の該ペゾチドのいずれかの組み合わせ用にコー
   ド化するデオキシヌクレオチドを維持し、複製すること
   において用いられるＤＮＡ転移ベクターを製造する方法
   。 ′２４．適当なデオキシヌクレオチド配列を含んで力る
   表現転移ベクターによって形質転換された微生物を培養
   せしめることを特徴とする、Ｃ−末端配列トして、豚プ
   レグロレラキシンの一部もしくは全部およびＮ−末端配
   列として、原核性タンパクの部分からなるアミノ酸配列
   を含んでなる融合だんばく質を製造する方法。 ２５、豚プロレラキシン用にコード化する表現配列に適
   切な条件下に、該豚プロレラキシン用にコード化するデ
   オキシヌクレオチドを含んでなる表現転移ベクターによ
   って形質転換された微生物を培養せしめることを含んで
   なることを特徴とするＣ−１！プチドによって相互に分
   ＪＧＩＪされ九ＡおよびＢペプチドを含んでなる豚プロ
   レラキシンを合成する方法。 ２６、Ｃ−末端配列として、豚プレプロレラキシンのア
   ミノ酸配列の一部もしくは全部およびＮ−末端配列とし
   て、原核性タンパク質からなることを特徴とするアミノ
   酸配列を含んでなる融合タンノ臂りタ龜。 ２７、合成された豚プレ７’ｏレラキシン。 ２８、合成された豚プレグロレラキシン。 ２９、豚グロレラキシンの合成されたＡ、Ｂまた沫Ｃペ
   プチド鎖。