DE69332951T2

DE69332951T2 - Gensequenzen kodierend für enzyme des flavonoid stoffwechselweges mit einer flavonoid 3'-hydroxylase aktivität une ihre anwendungen

Info

Publication number: DE69332951T2
Application number: DE69332951T
Authority: DE
Inventors: Timothy Albert Holton; Cecily Edwina CORNISH; Yoshikazu Tanaka
Original assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Current assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Priority date: 1992-03-27
Filing date: 1993-03-25
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2013-03-26
Also published as: EP0640136A4; US5639870A; DK0640136T3; JPH07505772A; NZ249808A; EP0640136A1; DE69332951D1; ATE239793T1; CA2132961A1; ES2196005T3; WO1993020206A1; AU673514B2; EP0640136B1; AU3741393A

Description

Die vorliegende Endung betrifft allgemein Gensequenzen, die für Flavonoid 3'-Hydroxylasen oder Fragmente oder Derivate davon kodieren, und deren Verwendung zur Manipulation der Pigmentiening in Pflanzen und anderen Organismen.
Die Pflanzenindustrie ist bestrebt, neue und unterschiedliche Blütenpflanzensorten zu entwickeln. Ein wirksamer Weg, um solche neuen Sorten zu erzeugen, besteht in der Manipulation der Blütenfarbe. Mit Hilfe klassischer Züchtungsverfahren wurde recht erfolgreich ein großes Farbspektrum für die meisten gewerblichen Blumensorten erzeugt. Dieser Ansatz ist jedoch durch die Beschränkungen des Genpools einer bestimmten Spezies beschränkt und aus diesem Grund steht bei einer einzelnen Sorte selten das volle Farbspektrum zur Verfügung. Zudem mangelt es herkömmlichen Züchtungsverfahren an Genauigkeit. Der ästhetische Reiz einer Blüte ist eine Kombination aus vielen Faktoren, wie der Form, dem Geruch und der Farbe; die Veränderung einer Eigenschaft durch Hybridisierung erfolgt häufig auf Kosten einer ebenso wertvollen anderen Eigenschaft. Die Fähigkeit, präzise Farbveränderungen in Schnittblumen- und Zierpflanzensorten zu erzeugen, würde in einem Industriezweig, der einen schnellen Produktumsatz aufweist und wo Neuheit eine wichtige Markteigenschaft ist, entscheidende gewerbliche Möglichkeiten bieten.
Die Blütenfarbe geht im Wesentlichenauf zwei Pigmenttypen zurück: Flavonoide und Carotinoide. Flavonoide tragen zu einer Reihe Farben von Gelb bis Rot und Blau bei. Carotinoide verleihen einen Orange- oder Gelbstich und bilden üblicherweise das Hauptpigment in gelben und orangen Blüten. Die Flavonoidmoleküle, welche den Hauptbeitrag zur Blütenfarbe leisten, sind die Anthocyanine, welche glycosylierte Derivate von Cyanidin, Delphinidin, Petunidin, Peonidin, Malvidin und Pelargonidin sind und sich in der Vakuole befinden. Die verschiedenen Anthocyanine können zu deutlichen Farbunterschieden führen. Die Blütenfarbe wird auch durch die Co-Pigmentierung mit farblosen Flavonoiden, Metallkomplexierung, Glycosylierung, Acylierung und den vakuolären pH-Wert (Forkmann, 1991) beeinflusst.
Dem Biosyntheseweg der Flavonoidpigmente (im Folgenden als „Flavonoidweg" bezeichnet) ist allgemein bekannt und in 1 gezeigt (Ebel und Hahlbrock, 1988; Hahlbrock und Grisebach, 1979; Wiering und De Vlaming, 1984; Schram et al, 1984; Stafford, 1990). Der erste durchlaufende Schritt in dem Syntheseweg umfasst die Kondensierung von drei Molekülen Malonyl-CoA mit einem Molekül p-Coumaroyl-CoA.
Diese Reaktion wird durch das Enzym Chalconsynthase (CHS) katalysiert. Das Produkt aus dieser Reaktion, 2',4,4',6'-Tetrahydroxychalcon, wird normalerweise schnell durch das Enzym Chalconflavanon-Isomerase (CHI) isomerisiert, so dass Naringenin entsteht. Naringenin wird anschließend in der 3-Position des mittleren Rings durch Flavanon 3-Hydroxylase (F3H) hydroxyliert, so dass Dihydrokaempferol (DHK) entsteht.
Das Hydroxylierungsmuster am B-Ring von DHK spielt eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung der Blütenblattfarbe. Der B-Ring kann entweder an der 3'- oder sowohl an der 3'- und 5'-Position hydroxyliert werden, so dass Dihydroquercetin (DHQ) bzw. Dihydromyricetin (DHM) entstehen. Die zwei an diesem Synthesewege beteiligten Schlüsselenzyme sind Flavonoid 3'-Hydroxylase und Flavonoid 3',5'-Hydroxylase, beide aus der Cytochrom P450-Klasse. Cytochrom P450-Enzyme sind in der Natur weit verbreitet und Gene aus Vertebraten, Insekten, Hefen, Pilzen, Bakterien und Pflanzen wurden isoliert und sequenziert.
Flavonoid 3'-Hydroxylase bewirkt, dass aus DHK DHQ und aus Naringenin Eriodictyol entsteht. Die Reduktion und Glycosylierung von DHQ erzeugt die Cyanidin-Glycosid- und Peonidin-Glycosid-Pigmente, welche in vielen Pflanzensorten (beispielsweise Rose, Gartennelke und Chrysanthemum) zu einer roten und rosa Blütenfarbe beitragen. Die Synthese dieser Anthocyanine kann auch zu anderen Blütenfarben führen. Beispielsweise enthalten blaue Kornblumen Cyanin. Die Fähigkeit, die Aktivität der Flavonid 3'-Hydroxylase oder anderer Enzyme, die an dem Flavonoidweg beteiligt sind, in Blütenpflanzen zu kontrollieren, würde ein Mittel zur Manipulierung der Blütenblattfarbe bereitstellen. Verschiedenfarbige Versionen einer einzigen Sorte ließen sich so herstellen und in einigen Fällen könnte eine einzige Sorte ein breiteres Farbspektrum erzeugen.
Die WO 90/12084 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die ein oder mehrere gewünschte phenotypische Züge zeigen. Bei diesem Verfahren wird ein Nukleinsäurefragment, welches für ein endogenes Gen des Flavonoid-Biosynthesewegs kodiert, insbesondere Chalconsynthase, in eine Zelle eingeführt.
Erfindungsgemäß wurden die für Flavonoid 3'-Hydroxylase kodierenden Gensequenzen identifiziert und kloniert. Diese rekombinanten Sequenzen erlauben die Modulierung der Hydroxylierung von Substraten, wie DHK und Naringenin, was zu einer Modifizierung der Anthocyaninzusammensetzung führt und damit ein Mittel zur Veränderung der Blütenblattfarbe bereitstellt. Das Vorliegen von Flavonoid 3'-Hydroxylase würde erlauben, dass man den Stoffwechselweg von DHK zu Anthocyaninderivaten von Anthocyaninen, wie Cyanidin und Peonidin, umleitet und dadurch durch die Modulierung des 3'-Hydroxylie rungsgrads ein Mittel zur Veränderung der Blütenblattfarbe bereitstellt. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Veränderung der Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität in Pflanzen, wobei man den vorhandenen Aktivitätsgrad der Flavonoid 3'-Hydroxylase durch Einführen der erfindungsgemäßen Sequenzen erhöht oder verringert. Die Verringerung des Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivitätsgrad kann auch als Niederregulierung bezeichnet werden. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner über Blütenpflanzen hinaus auf Obst- und Gemüsepflanzen und auf Blätter, beispielsweise von Zierpflanzen.
Ein Aspekt der vorliegenden Endung betrifft ein Nukleinsäure-Isolat, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Sequenz kodiert oder zu dieser komplementär ist, welche für das Flavonoid 3'-Hydroxylase-Enzym (im Folgenden als 3'-Hydroxylase bezeichnet) oder ein funktionales Derivat des Enzyms, wie hiernach beschrieben, kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, kodierend für ein Flavonoid 3'-Hydroxylase-Enzym oder ein Derivat davon mit Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität, oder die dazu komplementäre Sequenz, wobei die Sequenz umfasst:
die Nukleotidsequenz, umfassend
die Nukleotidsequenz gemäß 5 oder einen Teil davon, kodierend für ein Protein mit Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität, oder eine Sequenz, welche wenigstens 55%-ige Ähnlichkeit mit der Sequenz gemäß 5 aufweist;
oder die dazu komplementäre Sequenz, oder
eine Sequenz, welche mit der Nukleotidsequenz gemäß 5 oder einer Sequenz, welche wenigstens 55% Ähnlichkeit hierzu aufweist oder einer dazu komplementären Sequenz unter folgenden Bedingungen hybridisiert: 20 Formamid, 6 × SSC, 1% w/v SDS bei 42°C und 16 Stunden, gefolgt von Waschen in 6 × SSC, 1% w/v SDS bei 65°C und 1 Stunde;
oder die dazu komplementäre Sequenz;
oder die Antisense-Sequenzen davon. Solche Moleküle werden auch bereitgestellt.
Der Begriff „Nukleinsäure-Isolat" steht für eine Gensequenz in einem nicht natürlich vorkommenden Zustand. Allgemein bedeutet dies, dass sie aus ihrem natürlichen Zustand isoliert wurde oder in einer nicht natürlich vorkommenden Umgebung synthetisiert oder hergestellt wurde. Insbesondere umfasst dies Nukleinsäuremoleküle, die in vitro gebildet oder erhalten wurden; einschließlich genomische DNA-Fragmente, rekombinante oder synthetische Moleküle sowie Nukleinsäuren in Kombination mit heterologen Nukleinsäuren. Der Begriff erstreckt sich auch auf die genomische DNA oder cDNA oder Teile davon, welche für 3'-Hydroxylase oder Teile davon in umgekehrter Orientierung in Bezug auf ihren oder weitere Promotoren kodieren. Er erstreckt sich ferner auf natürlich vorkommende Sequenzen, die in Bezug auf andere Nukleinsäuresequenzen wenigstens teilweise gereinigt wurden.
Der Begriff „Gensequenzen° wird hier in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst alle aufeinander folgenden Reihen von Nukleotidbasen, die direkt oder über eine komplementäre Basenreihe für die Aminosäuresequenz einer 3'-Hydroxylase stehen. Solche Aminosäuresequenzen können eine full-length 3'-Hydroxylase oder eine aktive verkürzte Form davon sein oder sie können einem bestimmten Bereich, wie einem Nterminalen, C-terminalen oder einem inneren Bereich des Enzyms entsprechen. Die hier betrachteten Nukleinsäuresequenzen umfassen auch Oligonukleotide, die sich als genetische Sonden oder als „Antisense"-Moleküle eignen und fähig sind, die Expression des entsprechenden Gens in einer Pflanze zu regulieren. Ein „Antisense-Molekül", wie hier verwendet, umfasst auch ein Genkonstrukt, welches das strukturelle genomische oder cDNA-Gen oder einen Teil davon in umgekehrter Orientierung in Bezug auf seinen oder weitere Promotoren umfasst.
In einer Ausführungsform werden die für 3'-Hydroxylase oder verschiedene funktionale Derivate davon kodierenden Nukleinsäuresequenzen zur Verringerung der Aktivität einer endogenen 3'-Hydroxylase verwendet oder alternativ wird die für dieses Enzym oder verschiedene Derivate oder Teile davon kodierende Nukleinsäuresequenz in der Antisense-Orientierung verwendet, um die Aktivität der 3'-Hydroxylase zu verringern. Obwohl es nicht beabsichtigt ist, die vorliegende Erfindung auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, ist es möglich, dass ein Antisense-3'-Hydroxylase-Transkript oder ein Fragment oder Teil davon (beispielsweise ein Oligonukleotidmolekül) einen Doppelstrang mit der gesamten oder einem Teil der natürlich vorkommenden mRNA, die für das Enzym spezifisch ist, bildet und damit die Anreicherung oder die Translation der mRNA zu dem aktiven Enzym unterbindet. In einer weiteren Alternative könnten Ribozyme verwendet werden, um Zielnukleinsäuresequenzen zu inaktivieren.
Die hier beschriebene Veränderung der Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität betrifft eine Erhöhung oder Verringerung der Aktivität um bis zu 30% oder vorzugsweise 30 bis 50%, oder weiter bevorzugt 50 bis 75% und insbesondere bevorzugt 75% oder mehr über oder unter dem normalen endogenen oder bestehenden Aktivitätsgrad. Der Aktivitätsgrad lässt sich leicht mit Hilfe einer modifizierten Version des von Stotz und Forkmann (1982) beschriebenen Verfahrens ermitteln (siehe Beispiel 1).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können Ribonukleinsäure oder Desoxyribonukleinsäure, einsträngig oder doppelsträngig, sowie lineare oder kovalent geschlossene kreisförmige Moleküle sein. Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül cDNA. Wie oben erwähnt, erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Nukleinsäuremoleküle, welche unter gering, vorzugsweise mittel und am meisten bevorzugt hoch stringenten Bedingungen mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisieren und insbesondere mit den in 5 gezeigten Nukleotidsequenzen. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf ein Nukleinsäuremolekül mit einer in 5 gezeigten Nukleotidsequenz oder ein Molekül, welches wenigstes 55 %, bevorzugt wenigstens 65 bis 70% und insbesondere bevorzugt über 85% Ähnlichkeit mit der in 5 gezeigten Sequenz auf Nukleotid- oder Aminosäuresequenzebene aufweist und worin die Nukleinsäure für eine Sequenz kodiert oder komplementär dazu ist, welche für ein Enzym mit 3'-Hydroxylase-Aktivität kodiert. Es sei jedoch erwähnt, dass Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen Ähnlichkeiten unterhalb der oben angegebenen Prozentangaben aufweisen und dennoch für 3'-Hydroxylase-Aktivität kodieren können. Die vorliegende Erfindung kann mit Nukleinsäuremolekülen in Form von Oligonukleotidprimern oder Sonden durchgeführt werden, die fähig sind, an einen Teil der oben betrachteten Nukleinsäuremoleküle zu hybridisieren und insbesondere an solchen, die in 5 gezeigt sind, und zwar unter gering, vorzugsweise mittel und am meisten bevorzugt hoch stringenten Bedingungen. Vorzugsweise entspricht der Teil dem 5'- oder 3'-Ende des Gens. Der Einfachheit halber steht hier das 5'-Ende für einen Bereich, der im Wesentlichen zwischen dem Startcodon der Strukturgensequenz und einem zentralen Bereich des Gens liegt, und das 3'-Ende steht für einen Bereich, der im Wesentlichen zwischen einem zentralen Bereich des Gens und dem Stopcodon der Strukturgensequenz liegt. Daher ist klar, dass Oligonukleotide oder Sonden an das 5'-Ende oder das 3'-Ende oder an einen Bereich, den das 5'- und 3'-Ende gemeinsam haben, hybridisieren können. Bevorzugte Oligonukleotide sind in Beispiel 1 gezeigt.
Die Nukleinsäure oder ihre komplementäre Form kann für das Full-Length-Enzym oder einen Teil oder ein Derivat davon kodieren. Mit „Derivat" ist jede einzelne oder mehrfache Aminosubstitution, Deletion und/oder Addition in Bezug auf das natürlich vorkommende Enzym gemeint, welches 3'-Hydroxylase-Aktivität besitzt. In dieser Hinsicht umfasst die Nukleinsäure alle natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen, die für 3'-Hydroxylase kodieren, oder kann eine oder mehrere Nukleotidsubstitution, Deletion und/oder Addition bezüglich der natürlich vorkommenden Sequenz enthalten.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ihre komplementäre Form kann auch für einen „Teil" der 3'-Hydroxylase mit Hydroxylase-Aktivität kodieren. Inaktive Teile können als Oligonukleotid-Sonden, Primer für Polymerase-Kettenreaktionen oder in verschiedenen Mutationsverfahren oder zur Erzeugung von Antisense-Molekülen verwendet werden.
Aminosäureinsertionsderviate der erfindungsgemäßen 3'-Hydroxylase umfassen Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen sowie Intrasequenzinsertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren. Aminosäuresequenz-Insertionsvarianten sind solche, worin ein oder mehrere Aminosäurereste an einer vorbestimmten Stelle in dem Protein eingefügt werden, obwohl Zufallsinsertionen mit einem geeigneten Screening des resultierenden Produkts auch möglich sind. Deletionsvarianten sind durch die Entfernung von ein oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz gekennzeichnet. Substitutions-Aminosäurevarianten sind solche, worin wenigstens ein Rest aus der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an seiner Stelle eingefügt wurde. Übliche Substitutionen sind solche, die gemäß umseitiger Tabelle 1 hergestellt wurden.
Dort wo die 3'-Hydroxylase durch Aminosäuresubstitution derivatisiert wurde, wurden die Aminosäuren im allgemeinen durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften, wie der Hydrophobie, der Hydrophilie, der Elektronegativität, sperrigen Seitengruppen und dergleichen, ersetzt. Aminosäuresubstitutionen betreffen typischerweise einzelne Reste. Aminosäureinsertionen erfolgen üblicherweise in einer Größenordnung von 1 bis 10 Aminosäureresten und Deletionen betreffen 1 bis 20 Reste. Vorzugsweise werden Deletionen oder Insertionen bei benachbarten Paaren durchgeführt, d.h. eine Deletion von zwei Resten oder eine Insertion von zwei Resten.
Die oben genannten Aminosäurevarianten lassen sich leicht durch aus dem Stand der Technik bekannte Peptidsyntheseverfahren, wie der Festphasenpeptidsynthese (Merrifield, 1964) und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulationen herstellen. Verfahren zur Erzeugung von Substitutionsmutationen an bestimmten Stellen in der DNA mit bekannten oder teilweise bekannten Sequenzen sind allgemein bekannt und umfassen beispielsweise die M13-Mutagenese. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zum Herstellen von Proteinvarianten, in Form von Substitions-, Insertions- oder Deletionsvarianten, sind zweckmäßigerwiese, z. B. in Sambrook et al (1989) beschrieben.

TABELLE 1 Geeignete Reste für Aminosäuresubstitutionen

Ursprünglicher Rest	Beispiele der Substitution
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln; Glu
Met	Leu; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

Weitere Beispiele rekombinanter oder synthetischer Mutanten und Derivate der erfindungsgemäßen 3'-Hydroxylase umfassen einzelne oder mehrfache Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen von beliebigen Molekülen, die mit dem Enzym assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide.
Die Begriffe „Analoge" und „Derivate" erstreckt sich auf jedes funktionale chemische Äquivalent der 3'-Hydroxylase und auch auf jedes oben beschriebene Aminosäurederivat. Der Einfachheit halber bezieht sich „3'-Hydroxylase" hierin auch auf alle Mutanten, Derivate, Analoge, Homologe oder Fragmente davon.
Die vorliegende Erfindung wird an Hand von Nukleinsäuresequenzen, die von Petunia abstammen, beschrieben, da dies das derzeit praktischste und am meisten bevorzugte Ausgangsmaterial ist. Der Fachmann wird jedoch sofort erkennen, dass ähnliche Sequenzen aus einer Anzahl von Quellen, wie anderen Pflanzen oder bestimmten Mikro organismen, isoliert werden können. Beispiele anderer Pflanzen umfassen Gartennelke, Chrysanthemum, Rose, Mais, Löwenmaul, Tabak, Kornblume, Pelargonium und Winde, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Alle derartigen Nukleinsäuresequenzen, die direkt oder indirekt für ein Enzym des Flavonoidwegs und insbesondere für die 3'-Hydroxylase kodieren sind, unabhängig von ihrem Ursprung, von vorliegender Erfindung umfasst.
Die hier betrachteten Nukleinsäuremoleküle können in beiden Orientierungen alleine oder in Kombination mit einem Vektormolekül, beispielsweise einem Expressionsvektor, vorliegen. Der Begriff Vektormolekül wird in seinem breitesten Sinn verwendet und umfasst alle Zwischenvehikel für Nukleinsäuremoleküle, die den Transfer der Nukleinsäure in die Pflanzenzelle und/oder die Integration in das Pflanzengenom erleichtern können. Ein Zwischenvehikel kann beispielsweise an die Verwendung bei der Elektroporation, dem Mikroprojektilbeschuss, dem Agrobacterium-vermittelten Transfer oder der Insertion mittels DNA- oder RNA-Viren angepasst sein. Das Zwischenvehikel und/oder das darin enthaltene Nukleinsäuremolekül müssen gegebenenfalls stabil in das Pflanzengenom integriert werden oder auch nicht. Solche Vektormoleküle können auch in prokaryontischen Zellen repliziert und/oder exprimiert werden. Vorzugsweise sind die Vektormoleküle oder Teile davon fähig, in das Pflanzengenom zu integrieren. Vorzugsweise ist der Vektor ein binärer oder ein viraler Vektor. Besonders bevorzugt ist der Vektor und das Nukleinsäure-Isolat pCGP809, wie hier in Beispiel 1 beschrieben. Das Nukleinsäuremolekül kann zudem eine Promotorsequenz enthalten, die fähig ist, die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Pflanze zu steuern. Das Nukleinsäuremolekül und der Promotor kann auch durch jedes beliebige Mittel, wie die oben beschriebenen, in die Zelle eingeführt werden.
Erfindungsgemäß kann eine für 3'-Hydroxylase kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein Derivat oder Teil davon, wie hier beschrieben, in beiden Orientierungen in eine Pflanzenzelle eingeführt und exprimiert werden, wodurch ein Mittel bereitgestellt wird, um entweder DHK und/oder andere geeignete Substrate, falls sie in der Pflanzenzelle synthetisiert werden, letztlich in Anthrocyaninderivate von Anthocyanidinen, wie Cyanidin und/oder Peonidin, umzuwandeln oder alternativ eine solche Umwandlung von Metaboliten durch Verringern oder Hemmen der endogenen oder bestehenden 3'-Hydroxylase-Aktivität zu unterbinden. Die Produktion von Anthocyaninen trägt zur Erzeugung einer roten oder blauen Blütenfarbe bei. Die Expression der Nukleinsäuresequenz einer der beiden Orientierungen in der Pflanze kann konstitutiv, induzierbar oder in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium sein und kann auch gewebespezifisch erfolgen. Das Wort Expression wird hier in seiner breitesten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder sowohl RNA als auch Protein. Es erstreckt sich auch auf die teilweise Expression eines Nukleinsäuremoleküls.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereitgestellt, die fähig ist 3'-Hydroxylase oder aktive Mutanten oder Derivate davon zu produzieren, wobei das Verfahren das stabile Transformieren einer Zelle oder einer geeigneten Pflanze mit einem hier zuvor beschriebenen Nukleinsäuremolekül unter Bedingungen umfasst, die eine eventuelle Expression des Nukleinsäuremoleküls erlauben, so dass eine transgene Pflanze aus der Zelle entsteht und man die transgene Pflanze für eine Zeit und unter Bedingungen kultiviert, die ausreichen, um die Expression der Nukleinsäure zu ermöglichen. Die transgene Pflanze kann daher erhöhte 3'-Hydroxylaseaktivitätsspiegel in Bezug auf die Menge, die in einer vergleichbaren nichttransgenen Pflanze exprimiert wird, erzeugen. Vorzugsweise wird die Expression des Nukleinsäuremoleküls in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium gesteuert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, welche die endogene oder bestehende 3'-Hydroxylase-Aktivität verringert, wobei das Verfahren das stabile Transformieren einer Zelle aus einer geeigneten Pflanze mit einem hier zuvor beschriebenen Nukleinsäuremolekül, das Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der Zelle und, falls erforderlich, die Aufzucht der transgenen Pflanze unter Bedingungen umfasst, die ausreichen, um die Expression der Nukleinsäure zu ermöglichen. Vorzugsweise wird die Expression des Nukleinsäuremoleküls in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium gesteuert.
Noch ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch modifizierten Pflanze mit verringerter endogener oder bestehender 3'-Hydroxylaseaktivität, wobei das Verfahren das Verändern des 3'-Hydroxylase-Gens umfasst, indem man die endogenen Sequenzen durch homologe Rekombination aus einem wie hier zuvor beschriebenen Nukleinsäuremolekül, welches auf geeignete Weise verändert und in die Pflanzenzelle eingeführt wird, modifiziert, und man die genetisch veränderte Pflanze aus der Zelle, welche im Vergleich zu dem endogenen oder bestehenden Aktivitätsspiegel eine veränderte Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität zeigt, regeneriert.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Blütenpflanze mit veränderten Blütenstand-Eigenschaften, wobei das Verfahren das stabile Transformieren einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, das Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Aufziehen der transgenen Pflanze für eine Zeit und unter Bedingungen umfasst, welche die Expression der Nukleinsäuresequenz zu dem 3'-Hydroxylase-Enzym erlauben. Alternativ umfasst das Verfahren das stabile Transformieren einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder seiner komplementären Sequenz, das Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Aufziehen der transgenen Pflanze für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um den Aktivitätsgrad der endogenen oder existenten 3'-Hydroxylase zu verändern. Vorzugsweise liegt der geänderte Spiegel unter dem endogenen oder existenten Spiegel der 3'-Hydroxylase-Aktivität in einer vergleichbaren nicht-transgenen Pflanze. Ohne die vorliegende Erfindung beschränken zu wollen, besagt eine Theorie zum Wirkmechanismus, dass man zum Verringern der Aktivität der endogenen 3'-Hydroxylase die Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz oder seiner komplementären Sequenz benötigt. Es kann jedoch sein, dass man die Expression der eingeführten Gensequenz oder seiner komplementären Sequenz nicht benötigt, um die gewünschte Wirkung zu erzielen: nämlich bei einer Blütenpflanze mit veränderten Blütenstand-Eigenschaften.
In einer verwandten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Blütenpflanze, die veränderte Blütenstand-Eigenschaften zeigt, wobei das Verfahren das Verändern des 3'-Hydroxylase-Gens durch die Modifikation der endogenen Sequenzen mittels homologer Rekombination aus einem in geeigneter Weise veränderten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, welches in die Pflanzenzelle eingeführt wurde, und die Regeneration der genetisch veränderten Pflanze aus der Zelle umfasst.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium gesteuert sein oder auch nicht. Vorzugsweise werden bei dem veränderten Blütenstand rote Blüten oder andere Farbschattierungen, je nach physiologischen Bedingungen der Empfängerpflanze, erzeugt. Mit „Empfängerpflanze" ist eine Pflanze gemeint, die ein Substrat für das 3'-Hydroxylase-Enzym oder das 3'-Hydroxylase-Enzym selbst herstellen kann und die geeigneten physiologischen Eigenschaften und den Genotyp besitzt, die (der) für die Entwicklung der gewünschten Farbe erforderlich sind (ist). Dazu gehören Petunia, Gartennelke, Chrysanthemum, Rose, Löwenmaul, Tabak, Kornblume, Pelargonium, Lisianthus und Purpur-Trichterwinde.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, welche, wie zuvor beschrieben, fähig ist, ein rekombinantes für 3'-Hydroxylase kodierendes Gen zu exprimieren oder welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die im Wesentlichen komplementär zu dem gesamten mRNA-Molekül oder einem Teil davon ist und gegebenenfalls bei Bedarf transkribiert werden kann, um die 3'-Hydroxylase zu regulieren, wobei das Verfahren das stabile Transformieren einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Isolat, gegebenenfalls unter Bedingungen, die eine eventuelle Expression des Nukleinsäure-Isolats ermöglichen, und das Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der Zelle umfasst.
Der Fachmann wird sofort die verschiedenen Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren erkennen, wie das Erhöhen oder Verringern der Expression des natürlicherweise in der Zielpflanze vorliegenden Enzyms, so dass verschiedene Farbschattierungen, wie verschiedene Rotschattierungen, entstehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher alle transgenen Pflanzen, welche die gesamte oder einen Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz umfassen, und/oder ein beliebiges Homolog oder eine verwandte Form davon oder Antisense-Formen einer dieser und insbesondere solche transgenen Pflanzen, die veränderte Blütenstand-Eigenschaften zeigen. Die transgenen Pflanzen können, wie zuvor beschrieben, ein eingeführtes Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz enthalten, die für die Sequenz einer 3'-Hydroxylase kodiert oder komplementär dazu ist. Im allgemeinen wird die Nukleinsäure stabil in das Pflanzengenom eingefügt, obwohl die vorliegende Erfindung auch das Einführen der 3'-Hydroxylase-Nukleotidsequenz in eine autonom replizierende Nukleinsäuresequenz, wie einen DNA- oder RNA-Virus, der sich in der Pflanzenzelle vermehren kann, umfasst. Die Erfindung betrifft auch Samen solcher transgenen Pflanzen. Solche Samen, insbesondere wenn sie farbig sind, sind nützliche Eigenschaftsmarker für Pflanzen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante Formen der 3'-Hydroxylase. Die rekombinanten Formen des Enzyms bilden Ausgangsmaterial für Forschungsarbeiten, um beispielsweise aktivere Enzyme zu entwickeln, und können bei der Entwicklung von in vitro-Systemen zur Herstellung farbiger Verbindungen nützlich sein. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Flavonoid 3'-Hydroxylase oder einem Derivat davon mit Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität, wobei eine Zelle stabil mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure unter Bedingungen transformiert wird, die eine eventuelle Expression der Nukleinsäure zulassen.
Die hier beschriebenen Gensequenzen können zur Herstellung eines Genkonstrukts verwendet werden, dass fähig ist, ein 3'-Hydroxylase-Enzym zu exprimieren oder eine endogene 3'-Hydroxylase in einer Pflanze nieder zu regulieren.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezug auf nachstehende nicht-beschränkende Figuren und das Beispiel weiter beschrieben.
In den Figuren:
1 ist eine schematische Darstellung des Biosynthesewegs der Flavonoidpigmente. Enzyme, die am ersten Teil des Synthesewegs beteiligt sind, sind wie folgt angegeben: PAL = Phenylalanin-Ammoniak-Lyase; C4H = Cinnamat-4-Hydroxylase; 4CL = 4-Coumarat: CoA-Ligaset CHS = Chalcon-Synthase; CHI = Chalcon-Flavanon-Isomerase; F3H = Flavanon-3-Hydroxylase; DFR = Dihydroflavonol-4-Reduktase; UFGT = UDP-Glucose: Flavonoid-3-O-Glucosyl-Transferase. Die letzteren Schritte betreffen Umwandlungen, welche in P. hybrida-Blüten erfolgen, und umfassen: 1 = Addition eines Rhamnosezuckers an den Glycosylrest von Cyanidin-3-Glucosid und Delphinidin-3-Glucosid; 2 = Acylierung und 5-O-Glucosylierung; 3 = 3'-Methylierung; 4 = 5'-Methylierung; 5 = 3',5'-Methylierung.
2(A) ist eine schematische Darstellung von DNA-Fragmenten, die als Sonden für die cDNA-Bank Nr.1 verwendet werden, um Cytochrom P450-Homologe nachzuweisen. P450: verbreiteter Cytochrom P450-cDNA-Klon mit der Häm-Bindungsdomäne (Häm), dargestellt durch das dunkel getönte Kästchen; pCGP142: ein 980-bp-Fragment wurde mittels PCR mit den Oligos 1 und 2 und der pCGP142-DNA als Templat gewonnen; pCGP147: ein 1,3-kb-Fragment wurde durch einem SaII-EcoRI-Verdau aus pCGP147 isoliert; pCGP158: ein 900-bp-Fragment wurde mittels PCR mit den Oligos 3 und 4 und der pCGP158-DNA als Templat gewonnen; pCGP160: ein 600-bp-Fragment wurde durch einem PstI-EcoRV-Verdau aus pCGP160 isoliert; pCGP454: das Fragment wurde mittels PCR mit den Oligos 3 und 5 und der pCGP454-DNA als Templat gewonnen. Alle gereinigten Fragmente wurden mit ³²P-dCTP, wie in Beispiel 1 beschrieben, markiert.
2(B) bis (H) zeigen Teile der Nukleotidsequenzen und die entsprechenden vorausgesagten Aminosäuretranslationsprodukte für die cDNA-Inserts von (i) pCGP142, (ü) pCGP147, (iii) pCGP158, (iv) pCGP160 und (v) pCGP454. Die Bereiche, die als Sonden für die cDNA-Bank Nr.1 verwendet wurden, um die jeweiligen Klone zu isolieren, sind durch Pfeile angedeutet.
3(A) bis (D) zeigen die Nukleotidsequenz und die vorausgesagte Aminosäuresequenz für das cDNA-Insert aus pCGP602. Zwei Sonden, welche die Sequenzen zwischen den internen HincII-EcoRV- und EcoRV-HindIII-Bindungsstellen umfassen, wurden verwendet, um die verwandten Sequenzen in einer Gruppe von Cytochrom P450-Homologen nachzuweisen.
4(A) und 4(B) zeigen Teile der Nukleotidsequenz der cDNA-Inserts von 4(A): 1) pCGP161; 2) pCGP162; 3) pCGP163; 4) pCGP165; 5) pCGP166; 6) pCGP167 und 4(B): 7 pCGP168; 8) pCGP169; 9) pCGP171 und 10) pCGP173. Eine Mischsonde, die cDNA-Inserts aller dieser Klone enthielt, wurde verwendet, um die cDNA-Bank Nr.2 nach verwandten Sequenzen zu screenen.
5 zeigt die Nukleotidsequenz und vorausgesagte Aminosäuresequenz für das cDNA-Insert aus pCGP619.
6 zeigt das Diagramm einer Restriktionsenzymkarte für pCGP619. Teilabschnitte des cDNA-Inserts sind durch dickere Linien mit stumpfen Enden (in Gegensatz zu Pfeilen) angedeutet. Diese wurden in M13-mp18 und -mp19 subkloniert und mit Oligonukleotidprimersequenzen, wie angegeben, sequenziert, so dass man überlappende Sequenzdaten erlangte. Das Ausmaß und die Orientierung der aus jedem subklonierten Stück gewonnenen Sequenzinformation ist durch Linien mit Pfeilköpfen gezeigt. Primer –40 wurde verwendet, falls nicht anders angegeben. 190 = Primersequenz 190; 191 = Primersequenz 191; polyT = polyT-Oligonukleotid wurde als Primen verwendet; ds seq = die Sequenz wurde mit doppelsträngiger DNA gelesen; ATG steht für das Methionin-Startcodon und die gesamte Länge des Klons in Rasenpaaren ist auch angegeben.
7 zeigt einen 3'-Hydroxylasetest von Hefeextrakten mit ³H-Naringenin als Substrat. Die Autoradiographie zeigt die Umwandlung von ³H-Naringenin in das 3'-hydroxylierte Derivat Eriodictyol durch ein Hefeextrakt, das mit dem Plasmid pCGP621 (1,2) transformiert wurde. In nicht-transformierter Hefe (C) wurde keine 3'-Hydroxylase-Aktivität nachgewiesen.
8 zeigt die Nukleotidsequenz und die vorausgesagte Aminosäuresequenz für das Insert aus pCGP635. Diese Sequenzen können als Sonden zur Isolierung putativer Rosen-3'-Hydroxylase-cDNA-Klone verwendet werden.
9 zeigt die Nukleotidsequenz und vorausgesagte Aminosäuresequenz für das Insert aus pCGP772. Diese Sequenzen können als Sonden zur Isolierung von putativen Gartennelken-3'-Hydroxylase-cDNA-Klonen verwendet werden.
10 zeigt die Nukleotidsequenz und vorausgesagte Aminosäuresequenz für das Insert aus pCGP773. Diese Sequenzen können als Sonden zur Isolierung von putativen Gartennelken-3'-Hydroxylase-cDNA-Klonen verwendet werden.
11 zeigt einen Teil einer Nukleotidsequenz und der vorausgesagten Aminosäuresequenz für das Insert pCGP854. Diese Sequenzen wurden als Sonde verwendet, um einen putativen 3'-Hydroxylase-cDNA-Klon zu selektieren. Unterstrichene Aminosäuren zeigen solche des cDNA-Inserts von pCGP619 zwischen den Positionen 971 und 1091.
Der deaktivierte Mikroorganismus Agrobacferium fumefaciens-Stamm AGL0, der das Plasmid pCGP809 enthält, wurde am 24. März 1993 bei den Australian Government Analytical Laboratories, 1 Suakin Street, Pymble, New South Wales, 2037, Australien hinterlegt und erhielt eine Hinterlegungsnummer.
BEISPIEL 1
ISOLIERUNG VON MIT 3'-HYDROXYLASE VERWANDTEN NUKLEINSÄURESEQUENZEN
1. Material und Methoden
Chemische Enzyme und Radioisotope
Eriodictyol stammte von der Carl Roth KG und Naringenin von Sigma. [³H]-Naringenin (5,7 Ci/mmol) stammte von Amersham. Alle Enzyme wurden von gewerblichen Quellen bezogen und gemäß den Herstellerempfehlungen verwendet.
Bakterienstämme
Es wurden folgende Escherichia coli-Stämme verwendet:
DHSα supE44, Δ(lacZYA-ArgF)U169, ∅80lacZΔM15, hsdR17 (r_k-, m_k+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, deoR. (Hanahan, 1983 und BRL, 1986).
XL1-Blue supE44, hsdR17 (r_k-, m_k+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, lac^–, [F'proAB, lacI^q, lacZ ΔM15, Tn10(tet^r)] (Bullock et al, 1987).
PLK-F' recA, hsdR17 (r_k-, m_k+), mcrA^–, mcrB^–, lac^–, supE44, galK2, galT22, metBI, [F'proAB, lacI^q, lacZΔM15, Tn10(tet^r)] (Stratagene).
SOLR e14^– (mcrA), Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171, sbcC, recB, recJ, umuC:: Tn5(kan^r), uvrC, lac, gyrA96, thi-1, relA1, [F'proAB, lacI^qZΔM15], Su^– (nichtunterdrückend) (Stratagene).
Der inaktivierte Agrobacterium tumefaciens-Stamm AGLO (Lazo et al., 1991) stammte von R. Ludwig (Abteilung für Biologie, Universität von Californien, Santa Cruz).
Der Klonierungsvektor pBluescript stammte von Stratagene.
Transformation von E. coli und A. fumefaciens
Die Transformation von Zellen des E. coli-Stamms DH5a erfolgt nach dem Verfahren von Inoue et al. (1990).
Das Plamid pCGP809 wurde in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm AGLO durch Zugeben von 5 mg Plasmid-DNA zu 100 ml kompetenter AGLO-Zellen, die durch Beimpfen einer 50-ml-MG/L- (Garfinkel und Nester, 1980) Kultur hergestellt und 16 Stunden unter Schütteln bei 28°C aufgezogen worden wurden, eingeführt. Die Zellen wurden dann pelletiert und wieder in 0,5 ml 85%igem (v/v) 100 mM CaCl₂/15% (v/v) Glycerol suspendiert. Das DNA-Agrobacterium-Gemisch wurde durch zweiminütige Inkubation in flüssigen Stickstoff eingefroren und dann ließ man es durch Inkubation bei 37°C und 5 min auftauen. Das DNA/Bakterien-Gemisch wurde dann für weitere 10 min auf Eis gelegt. Die Zellen wurden dann mit 1 ml MG/L-Medium gemischt und unter Schütteln bei 28°C 16 Stunden inkubiert. Zellen von A. tumefaciens, die das pCGP809 trugen, wurden auf MG/L-Agarplatten, welche 100 mg/ml Gentamycin enthielten, selektiert. Das Vorliegen von pCGP809 wurde durch Southern-Analyse von DNA, die aus den Gentamycin-resistenten Transformanten gewonnen wurden, bestätigt.
Pflanzenmaterial
Samen des Petunia F₁-Hybrids „Old Glory Blue" (OGB) stammten von Ball Seed, USA.
Chrysanthemum morifolium-Sorten stammten von Baguley Flower und Plant Growers, Victoria.
Blüten von Dianthus caryophyllus cv. Laguna und Rosa hybrida cv. Kardinal stammten von Van Wyk und Son Flower Supply, Victoria.
Die Pflanzen wurden in speziellen Wachstumsräumen mit einem 14-Stunden-Tag und einer Lichtintensität von mindestens 10.000 Lux und einer Temperatur von 22 bis 26°C kultiviert.
Für die Petunia-Blütenentwicklung wurden die fünf nachstehenden Stufen definiert:
Stufe 1: Nicht pigmentiert, geschlossene Knospe (< 25 mm lang).
Stufe 2: Pigmentiert, geschlossene Knospe (25–35 mm lang).
Stufe 3: Dunkelviolette Knospe mit hervorkommender Corolla (> 35 mm lang)
Stufe 4: Dunkelviolette geöffnete Blüte vor dem Aufspringen der Antheren (> 50 mm lang.)
Stufe 5: Vollständig geöffnete Blüte mit aufgesprungenen Antheren.
Die Stufen der Chrysanthemum-Blütenentwicklung waren wie folgt:
Stufe 0: Keine sichtbare Blütenknospe.
Stufe 1: Blütenknospe sichtbar: Florett vollständig durch Brakteen bedeckt.
Stufe 2: Blütenknospenöffnung: die Spitzen der Floretts sichtbar.
Stufe 3: Floretts dicht überlappend.
Stufe 4: Die Spitzen fast aller Floretts exponiert; äußere Floretts öffnen sich, jedoch keines davon horizontal.
Stufe 5: Äußere Floretts horizontal.
Stufe 6: Blüte erreicht ihre Reife.
Die Stufen der Dianthus caryophyllus-Blütenentwicklung wurden wie folgt definiert:
Stufe 1: Keine sichtbare Blütenknospe.
Stufe 2: Blütenknospen öffnen sich: die Spitzen der Floretts werden sichbar.
Stufe 3: Die Spitzen fast aller Floretts sind exponiert; die äußeren Floretts öffnen sich, keines davon horizontal.
Stufe 4: Äußere Floretts sind horizontal.
Die Stufen der Rosa hybrida-Blütenentwicklung wurde wie folgt definiert:
Stufe 1: Nicht pigmentiert, fest geschlossene Knospe (10–12 mm hoch; 5 mm breit)
Stufe 2: Pigmentiert, fest geschlossene Knospe (15 mm hoch; 9 mm breit).
Stufe 3: Pigmentiert, geschlossene Knospe; Kelchblätter beginnen gerade sich zu öffnen (20–25 mm hoch; 13–15 mm breit).
Stufe 4: Blütenknospe beginnt sich zu öffnen; Blütenblätter sind stark pigmentiert; die Kelchblätter haben sich getrennt (Knospe ist 25–30 mm hoch und 18 mm breit).
Stufe 5: Die Kelchblätter sind vollständig entfaltet; etwas gerollt. Die Blütenblätter sind stark pigmentiert und entfaltet (die Knospe ist 30–33 mm hoch und 20 mm breit).
Konstruktion der cDNA-Bank Nr.1
20 g des Stufe 3 bis 4 Petunia cv.-OGB-Blütengewebes wurden in 100 ml PEB (200 mM Tris-HCl (pH 8,6), 60 mM KCl, 30 mM MgCl₂, 25 mM EGTA), welches 10 mM Vanadyl-Ribonucleosid-Komplex enthielt, homogenisiert. Die Zelldebris wurden durch Filtration des Homogenats durch steriles Miracloth (Calbiochem) entfernt. Das Filtrat wurde oben auf einen Stufengradienten aus 6 ml PEB, enthaltend 25% (w/v) Sucrose, 250 Einheiten InhibitAce (5-Prime 3-Prime), und 6 ml PEB, enthaltend 50% (w/v) Sucrose und 250 Einheiten InhibitAce, in Ultra-Clear^TMQuick-Seal^TM-Zentrifugenröhrchen (Beckmann) gegeben. Die Röhrchen wurden 3,5 Stunden bei 26.000 Upm in einem 70Ti-Rotor zentrifugiert. Membran-gebundene Polysomen wurden aus der 25% Sucrose / 50% Sucrose-Zwischenschicht gewonnen und zu einer 4 M Guanidium-isothiocyanat-Lösung zugegeben. RNA wurde aus den denaturierten Polysomen durch Pelletieren durch ein 5,7 M CsCl-Kissen isoliert, wie beschrieben von Turpen und Griffith (1986).
Ein Uni-ZAP^TM-XR-Vector-Kit (Stratagene) wurde zur Konstruktion einer direktionalen cDNA-Bank in λZAP mit 25 μg der polysomalen RNA als Templat verwendet. Die primäre Bank, welche 250.000 Plaque-formende Einheiten (pfu) enthielt, wurde durch Wachsen über Nacht auf NZY-Platten (Sambrook et al., 1989) amplifiziert und der amplifizierte Phagenstamm wurde in PSB (100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,01% (w/v) Gelatine), wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben, eluiert.
Konstruktion der cDNA-Bank Nr.2
Gesamt-RNA wurde aus dem Blütenblattgewebe von P. hybrida cv. OGB-Blüten der Stufe 3 bis 4 nach dem Verfahren von Turpen und Griffith (1986) isoliert. Poly(A)⁺-RNA wurde durch drei Zyklen Oligo-dT-Cellulose-Chromatographie (Aviv und Leder, 1972) aus der Gesamt-RNA selektiert.
2 μg Poly(A)+-RNA wurden in einem 20 μl-Volumen, enthaltend 1 × Superscript^TM-Reaktionspuffer, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 500 μM dATP, 500 μM dGTP, 500 μM dTTP, 500 μM 5-Methy-dCTP, 0,75 μg Oligonukleotid Nr.6 und 2 μl Superscript^TM- Reverse Transkriptase (BRL), revers transkribiert. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37°C 50 min, bei 44°C 10 min inkubiert und dann auf Eis gelegt.
Das Reaktionsgemisch für den zweiten Strang (140 μl) wurde zu der Reaktion des ersten Strangs hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch für den zweiten Strang bestand aus 21 μM Tns-HCl, 104 mM KCl, 5,3 mM MgCl₂, 171 μM β-NAD, 11,4 mM (NH₄)₂SO₄, 214 μM dATP, 642 μM dCTP, 214 μM dGTP, 214 μM dTTP, 4 mM DTT, 10 μCi ³²PdCTP (3000 Ci/mmol), 15 Einheiten E. coli-DNA-Ligase, 40 Einheiten DNA-Polymerase (Boehringer) und 0,8 Einheiten RNAse H. Das Endgemisch wurde 150 min bei 16°C inkubiert. Um bei der doppelsträngigen cDNA stumpfe Enden zu erzeugen, wurden 10 Einheiten T4-DNA-Polymerase zugegeben und die Reaktion weitere 15 min bei 16°C fortgesetzt. Die Reaktion wurde dann gestoppt und die cDNA durch Phenol/Chloroform-Extraktion und anschließender Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt.
EcoRI-Adaptoren (Promega) wurden mit der cDNA ligiert und dann erfolgte eine Kinasereaktion, wobei die vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verwendet wurden. Die Enzyme wurden durch Wärme (70°C, 20 min) denaturiert und die DNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt. Die cDNA wurde mit 50 Einheiten Xhol (Boehringer) in einem Reaktionsvolumen von 100 μl verdaut, wobei die vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verwendet wurden. Das Enzym wurde durch Wärme inaktiviert (70°C, 20 min) und das Gemisch durch eine S400-Spinn-Säule (Pharmacia), welche in STE-Puffer (Sambrook et al., 1989) äquilibriert worden war, gegeben.
Das Eluat wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Nach der Mikrozentrifugation bei 4°C und für 30 min wurde das cDNA-Pellet mit 70% (v/v) Ethanol gespült, luftgetrocknet und wieder in 10 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) suspendiert.
Eine NA-45-Membran (Schleicher und Schnell) wurde verwendet, um cDNA in einem Größenbereich von 1,3 bis 2,5 kb aus einer 7,5-μl-Probe zu isolieren, die mittels Elektrophorese auf einem 1%igem (w/v) Agarosegel aufgetrennt worden war.
Die nach Größe aufgetrennte cDNA wurde mit 1 μg mit EcoRI/Xhol/CIAP behandeltem λZAPII-Vektor (Stratagene) in 5 μl Reaktionspuffer, bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase, ligiert. Die Reaktion dauerte 2 Tage bei 4°C.
Nachdem man es 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen hatte, wurde das Ligations-Reaktionsgemisch mit dem Packagene-System (Promega) verpackt. Die Gesamtzahl der Rekombinanten betrug 270.000 pfu.
Eine Menge von 150.000 pfu der verpackten cDNA wurde nach dem Transfizieren der PLK-F'-Zellen mit einer Dichte von 10.000 pfu pro 15-cm-Durchmesser-Platte ausplattiert. Die Platten wurden 8 Stunden bei 37°C inkubiert und dann über Nacht bei 4°C gelagert. Mit Hilfe von Colony/Plaque-Screen^TM-Filtern (DuPont) wurden Duplikatabzüge genommen und wie vom Hersteller empfohlen behandelt.
Konstruktion der cDNA-Bank Nr.3
Gesamt-RNA wurde aus dem Blütenblattgewebe von Chrysanthemum morifolium cv. dunkelrosa Pompom (Bezugsnummer 5999), Blüten der Stufen 1, 2 und 3, wieder nach dem Verfahren von Turpen und Griffith (1986) isoliert. Poly(A)⁺-RNA wurde aus der Geamt-RNA, wie bei P. hybrida, durch drei Zyklen Oligo-dT-Cellulose-Chromatographie (Aviv und Leder, 1972) selektiert. 2 μg Poly(A)⁺-RNA wurden als Templat für die cDNA-Synthese verwendet, wie oben für P. hybrida beschrieben.
Nach der Fraktionierung und Ligierung wurde das cDNA-Reaktionsgemisch mit Hilfe des Packagene-Systems (Promega) verpackt. Die Gesamtzahl der Rekombinationen betrug 37.000 pfu.
Ein Menge von 300.000 pfu (der amplifizierten Bank) verpackte cDNA wurde nach dem Transfizieren von XL1-Blue-Zellen in einer Dichte von 20.000 pfu pro 15-cm-Durchmesser-Platte ausplattiert. Die Platten wurden 8 Stunden bei 37°C inkubiert und dann über Nacht bei 4°C gelagert. Dublikatabzüge wurden auf Colony/Plaque-Screen^TM-Filter (DuPont) genommen und wie vom Hersteller empfohlen behandelt.
Herstellung von PCR-Templaten
1. Plasmid-DNA
DNA wurde nach einem alkalischen Lyseverfahren (Sambrook et al., 1989) isoliert. Plasmid-DNA wurde weiter durch Auftrennung auf einem CsCl-Gradienten gereinigt. Diese DNA wurde als Templat für die PCR verwendet.
2. Genomische Chrysanthemum-DNA
Zur Isolierung von Gesamt-DNA wurden 5 g Chrysanthemum-Blütenblattgewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem kalten Mörser mit einem Stempel zu einem feinen Pulver gemahlen. Das gemahlene Gewebe wurde in 5 ml Phenol : Chloroform und anschließend in 5 ml NTMES-Puffer (0,01 M NaCl; 0,1 M Tris pH 8,5; 5 mM MgCl₂; 1 mM EDTA; 1% SDS) extrahiert. Die wässrige Phase wurde erneut mit 5 ml Phenol : Chloroform extrahiert, und die wässrige Phase wurde nach der Zentrifugation aufgefangen. Die DNA wurde aus dieser Lösung nach der Zugabe von 0,5 ml 3 M NaAc, pH 5,8 und zwei Volumen Ethanol aufgewickelt. Das erhaltene Pellet wurde erneut in 2 ml TE-Puffer suspendiert, und vor dem Einsatz in der PCR wurde die Konzentration bestimmt.
3. Dianthus-cDNA
Gesamt-RNA wurde aus dem Blütenblattgewebe von D, caryophyllus cv. Laguna, Stufe 3-Blüten isoliert, wieder nach dem Verfahren von Turpen und Griffith (1986). Poly(A)⁺-RNA wurde durch Oligotex-dT-30 (Takana, Japan) nach den Herstellerangaben selektiert und 2 μg wurden mit Supercript^TM-Reverse-Transkriptase wie vom Hersteller empfohlen revers transkribiert. Die cDNA wurde in 10 ml TE-Puffer gelöst. Für PCR-Reaktionen wurden 5 ml als Templat verwendet. Die Bedingungen für die PCR sind unten beschrieben.
4. Rosa-cDNA
Gesamt-RNA wurde aus den Knospen der Rosa hybrida cv. Kardinal, Stufe 1 hergestellt. Bei dieser Stufe waren die Knospen 1,0–1,2 cm hoch und etwa 0,5 cm breit. Sie waren vollständig geschlossen und es wurde kein Pigment sichtbar, wenn man die Kelchblätter entfernte.
Gefrorenes Gewebe (1–3 g) wurde mit einem Mörser und Stempel in flüssigem Stickstoff gemahlen, in 25 ml vorgekühlten Puffer A [0,2 M Borsäure, 10 mM EDTA (Natriumsalz) (pH 7,6)] gegeben und kurz homogenisiert. Das Extrakt wurde auf einem Rotationsschüttler gemischt, bis es Raumtemperatur erreichte und ein gleiches Volumen Phenol/Chloroform (1 : 1 v/v), äquilibriert mit Puffer A, wurde zugegeben. Nach weiteren 10 min Mischen wurde das RNA-Präparat bei 10.000 × g 10 min bei 20°C zentrifugiert. Die obere wässrige Schicht wurde zurückbehalten und die Phenolgrenzschicht wie oben neu extrahiert. Die wässrigen Phasen wurden vereint und auf 0,1 M Natriumacetat (pH 6,0) eingestellt, 2,5 Volumen 95%iges Ethanol wurden zugegeben und das Gemisch über Nacht bei –20°C gelagert.
Das Präparat wurde bei 10.000 × g 10 min bei 4°C zentrifugiert, das Pellet sanft in 20 ml Puffer B [25 mM Borsäure, 1,25 mM EDTA (Natriumsalz), 0,1 M NaCl (pH 7,6)] gelöst und 0,4 Volumen 2-Butoxyethanol (2BE) wurden zugegeben. Diese Lösung wurde 30 min auf Eis inkubiert. Dann wurde sie bei 10.000 × g 10 min bei 0°C zentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig aufgefangen. Nach der Zugabe von 1,0 Volumen 2BE und der Inkubation auf Eis für weitere 30 min wurde der Überstand wieder bei 10.000 × g 10 min bei 0°C zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde sanft mit Puffer A : 2BE (1 : 1 v/v), dann mit 70% (v/v) Ethanol, 0,1 M Kaliumacetat und schließlich mit 95%igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde an der Luft getrocknet und in 1 ml mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser gelöst. Dieses wurde auf 3 M Lithiumchlorid eingestellt, 60 min auf Eis gelassen und bei 10.000 × g 10 min bei 0°C zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 3 M LiCl und dann mit 70%-igem Ethanol, 0,1 M Kaliumacetat gewaschen. Das erhaltene RNA-Pellet wurde in 400 ml mit DEPC behandeltem Wasser gelöst und mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert. Das RNA-Gemisch wurde dann bei 10.000 × g 5 min bei 20°C zentrifugiert, die wässrige Phase wurde aufgefangen und auf 0,1 M Natriumacetat gebracht und ein weiteres 2,5-faches Volumen an 95%-igem Ethanol wurde zugegeben. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde das Gemisch bei 13.000 Upm (5.000 × g) 20 min bei 20°C zentrifugiert und das RNA-Pellet wurde wieder sanft in 400 ml mit DEPC behandeltem Wasser suspendiert.
Poly(A)⁺-RNA wurde aus der Gesamt-RNA durch Oligotex-dT-30 (Takana, Japan) nach dem Protokoll des Herstellers selektiert.
Doppelsträngige cDNA wurde aus 2 mg Poly(A)⁺-RNA synthetisiert, wobei das gleiche Verfahren wie oben zur Herstellung der Petunia-cDNA-Bank Nr.2 beschrieben verwendet wurde. Die cDNA wurde in 10 ml TE-Puffer gelöst.
Synthese der Oligonukleotide
Oligonukleotide und Primer wurden auf einem Applied Biosystems PCR-Mate-DNA-Synthetisierer nach den vom Hersteller empfohlenen Verfahren synthetisiert. Die synthetisierten Oligonukleotide und Primer, 5'-3', waren wie folgt:
Die Grundlage für das Entwerten von Oligo 5 war wie folgt: Aminosäuresequenzen aus der putativen Häm-Bindungsdomäne eines Avocado-Cytochrom P450 (Bozal et al., 1990) und die korrespondierenden, von den zwei Petunia-Cytochrom P450-Homologen, pCGP142 und pCGP147, kodierten Sequenzen wurden aligned:
Die Konsensus-Aminosäurensequenz in der Häm-Bindungsregion von Cytochrom P450 der drei Pflanzen kann daher wie folgt gesehen werden:
P F G A(S) G R(K) R I(G) C P G
Mögliche Permutationen der Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuren in der Häm-Bindungsdomäne der drei Cytochrom P450-Moleküle kodieren könnten, lassen sich wie folgt ableiten:
X steht für Nukleotidpositionen, in denen alle vier Nukleotide (A, C, G und T) verwendet werden können. Oligo 5 wurde entworfen, um eine Untergruppe der von den drei Pflanzencytochromen-P450 abstammenden Konsensus-Sequenz zu ergänzen. Desoxyinosin (1) wurde hauptsächlich verwendet, wenn die Basendegenerierung größer als drei war. Die erhaltene Oligonukleotidsequenz ist oben gezeigt.
Polymerase-Kettenreaktionen
1. Amplifikation der klonierten Cytochrom P450-Sequenzen
Zur Amplifikation der klonierten Petunia-Cytochrom P450-Sequenzen enthielten PCR-Mischungen 100 ng Plasmidtemplat, 10 mM Tns-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,25 mM MgCl₂, 0,2 mM jedes dNTPs, 1,0 Oligo 1 μM jedes Primers und 0,5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase (Cetus). Die Reaktionsmischungen (100 μl) wurden 30 Zyklen unterworfen, und zwar jeweils 1 min bei 95°C, 1 min bei 42°C und 2 min bei 72°C.
2. Amplifikation der mit Petunia-3'-Hydroxylase verwandten Dianthus-Sequenzen
Die PCR-Mischungen enthielten 100 ng cDNA-Templat, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% (w/v) Gelatine, 0,2 mM jedes dNTPs, 1,0 μM jedes Primers und 5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase (Cetus). Die Reaktionsmischungen (100 ml) wurden zunächst Zyklen aus 3 min bei 95°C, 1 min bei 55°C und 1 min bei 72°C und dann weiteren 39 Zyklen von jeweils 1 min bei 95°C, 55°C und 72°C unterworfen. Die amplifizierten Produkte wurden in einem Gel aus niederschmelzender Seaplaque-Agarose (FMC) gereinigt. Das Gemisch wurde erwärmt, bis die Agarose geschmolzen war, und dann mit TE-gesättigtem Phenol extrahiert. Die wässrige Phase wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und die amplifizierten Produkte mit Ethanol präzipitiert. Nach der Gelreinigung wurden die amplifizierten Produkte direkt in den ddT-maß-geschneiderten pBluescript-Vektor kloniert, wie von Holton und Graham (1991) beschrieben.
3. Amplifikation von mit Petunia-3'-Hydroxylase verwandten Chrysanthemum-Sequenzen
Chrysanthemum-Reaktionsmischungen enthielten 200 ng genomisches DNA-Templat, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,001% (w/v) Gelatine, 0,2 mM jedes dNTPs, 1,0 μM jedes Primers und 5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase (Cetus). Reaktionsvolumen von 50 ml wurden 35 Zyklen von jeweils 90 s bei 95°C, 55°C und 72°C unterworfen. Die amplifizierten Produkte wurden auf einem Gel mit Geneclean (Bio 101 Inc.) gereinigt und direkt in den ddT-maßgeschneiderten pBluescript-Vektor, wie von Holton und Graham (1991) beschrieben, kloniert.
4. Amplifikation von mit Petunia-3'-Hydroxylase verwandten Rosa-Sequenzen
Rosa-Reaktionsmischungen enthielten 1 μl einer 10-fach-Verdünnung einer wie oben beschrieben hergestellten ds cDNA, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,001% (w/v) Gelatine, 0,2 mM jedes dNTPs, 1,0 μM jedes Primers und 5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase (Cetus). Reaktionsvolumen von 50 ml wurden 30 Zyklen mit jeweils 1 min bei 95°C, 1 min bei 55°C und 3 min bei 72°C umgesetzt. Amplifizierten Produkte wurden auf einem Gel mit Geneclean (Bio 101 Inc.) gereinigt und direkt in den ddT-maßgeschneiderten pBluescript-Vektor, wie von Holton und Graham (1991) beschrieben, kloniert.
Screening von cDNA-Banken
Plaque-Abzüge der cDNA-Bank Nr.2 wurde im Doppel hybridisiert und wie folgt gewaschen: hochstringente Bedingungen (Hybridisierung: 50% (v/v) Formamid, 6 × SSC, 1% (w/v) SDS 16 h bei 42°C und Waschungen: 2 × SSC, 1% SDS, 2 × 15 min bei 65°C und anschließend 0,2 × SSC, 1% SDS, 2 × 15 min bei 65°C) wurde verwendet, um Abkömmlingskolonien nachzuweisen und gering stringente Bedingungen (Hybridisierung: 20% Formamid, 6 × SSC, 1% SDS, 16 h bei 42°C und Waschungen: 6 × SSC, 1% SDS, 1 h bei 65°C) wurden verwendet, um verwandte Sequenzen nachzuweisen.
Abzüge der cDNA-Bank Nr.3 wurden wie folgt hybridisiert und gewaschen: für das primäre Screening mit dem Petunia-3'-Hydoxylase-cDNA-EcoRI-Xhol-Insert aus pCGP619 (siehe 6) waren die Hybridisierungsbedingungen: 20% (v/v) Formamid, 1 M NaCl, 10% (w/v) Dextransulfat, 16 h bei 37°C, und die Waschbedingungen waren: 0,1 × SSC, 1% (w/v) SDS bei Raumtemperatur. Für das sekundäre Screening mit dem EcoRI-Xhol-Insert aus pCGP854 wurden die gleichen Bedingungen verwendet, außer dass die Hybridisierungsreaktion 16 h bei 42°C erfolgte.
³²P-Markierung DNA-Sonden
DNA-Fragmente (50 bis 100 ng) wurden radioaktiv mit 50 μCi [α-³²P]-dCTP mit Hilfe eines Oligolabelling-Kits (Bresatec) markiert. Nicht eingebautes [α-³²P]-dCTP wurde mittels Chromatographie auf einer Sephadex-G-50 (Fine) Säule entfernt.
DNA-Sequenzanalyse
Die DNA-Sequenzierung erfolgte im Wesentlichennach dem Verfahren von Sanger et al. (1977) mit Hilfe des Sequenase-Enzyms (USB, Version 2.1). Die vollständige Sequenz der Klone pCGP602 und pCGP619 wurde durch Zusammentragen der Sequenz aus verschiedenen M13-mp18 und -mp19- (Norrander et al., 1983; Yanisch-Perron, 1985) Subklonen, die durch übliche Klonierungsverfahren gewonnen wurden (Sambrook et al., 1989) bestimmt. Für mache Bereiche war es erforderlich spezifische Oligonukleotid-Primer zu synthetisieren, um überlappende Sequenzdaten zu erhalten, einschließlich der Primer –40, 190 191 und poly-T.
Eine Restriktionskarte von pCGP619 mit den Positionen mehrerer dieser Sequenzen ist in 6 gezeigt.
Homologierecherchen gegen Genbank, SWISS-PROT und die EMBL-Datenbanken wurden mit den FASTA- und TFASTA-Programmen (Pearson und Lipman, 1988) durchgeführt.
3'-Hydroxylase-Assay
Die 3'-Hydroxylase-Enzymaktivität wurde mit einer abgewandelten Version des von Stotz und Forkmann (1982) beschriebenen Verfahrens gemessen. Die Assay-Reaktionsmischung enthielt üblicherweise 100 μl Hefeextrakt, 5 μl 50 mM NADPH in Assay-Puffer (100 mM Kaliumphosphat (pH 8,0), 1 mM EDTA und 20 mM 2-Mercaptoethanol) und 10 μCi [³H]-Naringenin und wurde mit Assay-Puffer auf ein Endvolumen von 210 μl gebracht. Nach der Inkubation für 2 bis 16 h bei 23°C wurde die Reaktionsmischung mit 0,5 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde unter Vakuum getrocknet und dann wieder in 10 μl Ethylacetat suspendiert. Die titrierten Flavonoidmoleküle wurden auf dünnschichtigen Zelluloseplatten (Merck Artikel 5577, Deutschland) mit einem Chloroform : Essigsäure : Wasser- (10 : 9 : 1 v/v) Lösungsmittelsystem aufgetrennt. Nach der Abschluss der Chromatographie wurden die TLC-Platten mit 7% 2,5-Diephenyloxazol in Diethylether besprüht. Die Reaktionsprodukte wurden durch Autoradiographie lokalisiert und durch Vergleich mit nicht-radioaktiven Naringenin- und Eriodictyol-Eichproben, welche man neben den Reaktionsprodukten laufen ließ und unter UV-Licht sichtbar machte, identifiziert.
Konstruktion von pCGP621
Ein 1,8-kb-EcoRI-Xhol-Fragment, welches das gesamte cDNA-Insert von pCGP619 enthielt, wurde mit einem 8-kb-EcoRI-SaII-Fragment aus pYHCC101 (Tanaka et al., 1988) ligiert. Das erhaltene Plasmid, pCGP621, enthielt das pCGP919-cDNA-Fragment, ligiert in sense-Orientiening hinter dem Hefe-Glyeraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor.
Hefetransformation
Der Hefestamm G-1315 (Mat α, trpl) (Ashikari et al., 1989) wurde gemäß Ito et al. (1983) mit pCGP621 transformiert. Die Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit G-1315 wieder in die Tryptophan-Prototrophie zu bringen, selektiert.
Herstellung von Hefeextrakten zur Untersuchung der 3'-Hydroxylase-Aktivität
Ein einzelnes Isolat aus G-1315/pCGP621 wurde verwendet, um 20 ml YNBC [1,2% (w/v) Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren (Difco), 2% (w/v) Glucose und 0,3% (w/v) Gasaminosäure (Difco)] zu beimpfen, die anschließend 2 Tage bei 30°C inkubiert wurden. Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, einmal mit TE-Puffer gewaschen, einmal mit Puffer A [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,65 M Sorbitol, 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA] gewaschen und dann in Puffer B [10 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 1,2 M Sorbitol, 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA], enthaltend Zymolyase (0,1 mg/ml) (Seikagakukogyo, Japan), neu suspendiert. Nach der Inkubation für 1 h bei 30°C wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und wieder in 400 μl Puffer A suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann mit Glaskügelchen (Durchmesser = 0,4 mm) 2 min gevortexed und eine 100-μl-Probe wurde auf die Aktivität untersucht.
Konstruktion von pCGP293
Der binäre Expressionsvektor pCGP293 stammte von dem binären Ti-Vektor pCGN1559 ab (McBride und Summerfelt, 1990). Das Plamid pCGN1559 wurde mit KpnI verdaut und die überhängenden 3'-Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase gemäß üblichen Protokollen (Sambrook et al., 1989) entfernt. Der Vektor wurde dann weiter mit Xbal verdaut und der erhaltene 5'-Überhang wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 repariert. Der Vektor wurde dann wieder ligiert, wobei man pCGP67 erhielt. Ein 1,97-kb-PstI-Fragment, welches den Mac-Promotor, den mas-Terminator und verschiedene Klonierungsstellen (Comai et al., 1990) enthielt, wurde aus pCGP40 isoliert und in die PstI-Stelle von pCGP67 eingefügt, wobei pCGP293 entstand.
Das Plasmid pCGP40 wurde konstruiert, indem man das GUS-Gen (Jefferson et al., 1987) als ein BamHI-SacI-Fragment aus pCGN7334 entfernte und es mit dem BamHI-SacI-Fragment aus pBluescribe M13^– ersetzte, welches die Multicloning site enthielt. Das Plasmid pCGN7334 (erhalten von Calgene Inc., CA, USA) wurde durch Einführen des Fragments mit der Mac-GUS-mas-Gen-Fusion in die Xhol-Stelle von pCGN7329 (Comai et al., 1990) hergestellt.
Konstruktion von pCGP809
Das Plasmid pCGP809 wurde durch Klonieren des cDNA-Inserts aus pCGP619 in sense-Orientierung hinter den Mac-Promotor (Comai et al., 1990) von pCGP293 hergestellt. Das 1,8-kb-BamHI-KpnI-Fragment, welches das cDNA-Insert enthielt, wurde aus pCGP619 isoliert und mit einem BamHI-KpnI-Verdau von pCGP293 ligiert. Das richtige Einfügen des Inserts in pCGP809 wurde durch Restriktionsanalyse der aus Gentamycin-resistenten Transformanten isolierter DNA erreicht.
Petunia-Transformation
a. Pflanzenmaterial
Petunia hybrida (Skr4 × Sw63)-Samen wurden 10 min in 1,25% (w/v) Natriumhypochlorit sterilisiert und dreimal mit sterilem Wasser gespült. Sterilisierte Samen wurden in 100 mg/l Gibberellinsäure- (GA₃) Lösung 16 bis 20 h eingeweicht. Man ließ sie dann 2 Wochen auf 10% (w/v) MS- (Murashige und Skoog, 1962) Medium, welches mit 1% (v/v) Sucrose und 0,8% (w/v) Difco-Bacto-Agar angereichert war, keimen. Junge Keimlinge wurden für 3 Wochen auf MS-Medium, welches mit 3% (w/v) Sucrose angereichert war, übertragen, bevor sie in Jiffy-Peat-Pellets (Jiffy Products Ltd., Norwegen) gesetzt wurden, welche 2 bis 3 Wochen unter Nebel und Beleuchtung (135 μE. Quecksilberhalogenlicht, 22°C) gehalten wurden. Die jungen Pflanzen wurden dann in einem Wachstumsschrank überführt (68 μE. kaltes weiße Fluoreszenzlicht, 25°C). Zur Cokultivierung wurden junge Blätter geerntet und 2 min in 1,3% (w/v) Natriumhypochlorit sterilisiert und anschließend dreimal mit sterilem Wasser gespült. Das Blattgewebe wurde dann in 25-mm²-Vierecke geschnitten und 24 h auf MS-Medium, angereichert mit 0,05 mg/l Kinetin und 1,0 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), vorkultiviert.
b. Cokultivierung von Agrobacterium- und Petunia-Gewebe
Der Agrobacterium tumefaciens-Stamm AGLO (Lazo et al., 1991), der den binären Vektor pCGP809 enthielt, wurde bei 4°C auf MG/L- (Garfinkel und Nester, 1980) Agarplatten mit 100 mg/l Gentamycin gehalten. Eine einzige Kolonie wurde über Nacht in Flüssigmedium, welches 1% (w/v) Bacto-Pepton, 0,5% (w/v) Bacto-Hefeextrakt und 1% (w/v) NaCl enthielt, aufgezogen. Eine Endkonzentration von 5 × 10⁸ Zellen/ml wurde am nächsten Tag durch Verdünnen in flüssigem MS-Medium, welches 3% (w/v) Sucrose (BPM) enthielt, hergestellt. Die Blattscheiben wurden 5 min in BPM, welches AGLO/pCGP809 enthielt, eingetaucht. Die Blattscheiben wurden dann trockengetupft und 4 Tage auf Cokultivierungsmedium gelegt. Das Cokultivierungsmedium bestand aus SH-Medium (Schenk und Hilderbrandt, 1972), welches mit 0,05 mg/l Kinetin und 1,0 mg/l 2,4-D angereichert war, und enthielt eine über das Cokultivierungsmedium ausgebreitete Versorgungsschicht aus Tabakzellsuspension mit einem oben auf die Tabakzellsuspension aufgelegtem Filterpapier.
c. Gewinnung der transgenen Petunia-Pflanzen
Nach der Cokultivierung wurden die Blattscheiben in Selektionsmedium, welches aus frischem, mit 3% (w/v) Sucrose, 2 mg/l a-Benzylaminopurin (BAP), 100 mg/l Kanamycin, 350 mg/l Cefotaxin, 0,3% (w/v) Gelrite-Gellan-Gummi (Schweizerhall) angereichertem MS-Medium bestand, übertragen. Nach 3 Wochen wurden die regenerierenden Explantate in frisches Medium übertragen. Vereinzelte Triebe, die die Kanamycinselektion überlebten, wurden isoliert und auf BPM, welches 100 mg/l Kanamycin und 350 mg/l Cefotaxin zur Wurzelinduktion enthielt, übertragen. Alle Kulturen wurden für eine 16-stündige Photoperiode (60 μE. kaltes weißes fluoreszierendes Licht) bei 23 ± 2°C gehalten. Sobald die Wurzeln eine Länge von 2–3 cm erreichten, wurden die transgenen Petunia-Pflänzchen in autoklaviertes Debco-51410/2-Substrat in 8-cm-Röhrchen gesetzt. Nach 4 Wochen wurden die Pflanzen in 15-cm-Töpfe umgetopft, wobei das gleiche Substart verwendet wurde und sie wurden bei 23°C unter einer 14-stündigen Photoperiode (300 μE. Quecksilberhalogenlicht) gehalten.
2. Ergebnisse
Isolierung von Cytochrom P450-Homologen aus der cDNA-Bank Nr.1
Die Isolierung von fünf Petunia-cDNA-Klonen mit ähnlichen Sequenzbereichen zu dem Cytochrom P450-Enzym wurde zuvor beschrieben (Intemationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU92/00334). Teilsequenzen dieser Klone, die als pCGP142, pCGP147, pCGP158, pCGP160 und pCGP454 bezeichnet werden, sind in 2 gezeigt. Eine Mischsonde aus ³²P-markierten DNA-Fragmenten, welche die kodierenden Bereiche dieser fünf Cytochrom P450-Homologe enthielt (siehe 2A und B) wurde zum Screenen von 50.000 Rekombinanten der cDNA-Bank Nr.1 nach verwandten Sequenzen verwendet. Insgesamt 152 hybridisierende Klone wurden unter niederstringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen nachgewiesen. Weitere 13 verschiedene Cytochrom P450-Homologe wurden durch Sequenzanalyse der aus den hybridisierenden Klonen isolierten DNA identifiziert.
Einer dieser Klone, der als pCGP174 bezeichnet wird, entspricht, wie man zeigen konnte, der HfI-Stelle von Petunia (siehe die internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU92/00334). Die Nukleotidsequenz einer Full-length-Version dieses Klons, pCGP602, isoliert aus der cDNA-Bank Nr.2, ist in 3 gezeigt. 10 der weiteren 13 bei dem Screening isolierten Cytochrom P450-Homologe, pCGP161, pCGP162, pCGP163, pCGP165, pCGP166, pCGP167, pCGP168, pCGP169, pCGP171 und pCGP173, wurden als MischSonden zum Screenen der cDNA-Bank Nr.2 nach weiteren Cytochrom P450-Homologen verwendet (siehe nächster Abschnitt).
Isolierung des Cytochrom P450-Homologen pCGP690 aus Petunia
Eine Mischsonde aus ³²P-markierten cDNA-Inserts von pCGP161, pCGP162, pCGP163, pCGP165, pCGP166, pCGP167, pCGP168, pCGP169, pCGP171 und pCGP173 (4) wurde verwendet, um 1,5 × 10⁵ Rekombinanten der cDNA-Bank Nr.2 zu screenen. Bei wenigstringenter Hybridisierung und Waschen in 2 × SSC und 1% SDS bei 65°C wurden über 200 hybridisierende Klone nachgewiesen. 25 dieser Klone hybridisierten an Sonden, die interne HincII-EcoRV- und EcoRV-HindIII-Fragmente von pCGP602 enthielten (3), und zwar unter niedrigstringenten Bedingungen, nicht jedoch unter hochstringenten Bedingungen. Die Sequenzanalyse dieser Gruppe von Klonen zeigte, dass 17 davon Abkömmlinge von pCGP602 waren (zuvor wurde gezeigt, dass dies dem Hf1-Stelle von Petunia entspricht – internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU92/ 00334) und sechs Abkömmlinge eines weiteren Petunia-cDNA-Klons waren, der von dem Hf2-Stelle kodiert wird (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU92/00334). Ein Klon zeigte keine Sequenzhomologie zur Cytochromen P450 und einer, der als pCGP619 bezeichnet wurde, zeigte 57% bzw. 39% Sequenzhomologie zu pCGP602 auf Nukleotid- und Aminosäureebene. Die vollständige Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der pCGP619-cDNA ist in 5 gezeigt und die Restriktionskarte, welche die Sequenzierungsstrategie zeigt, ist in 6 dargestellt.
Expression von pCGP619-cDNA in Hefe
Das cDNA-Insert von pCGP619 wurde in sense -Orientierung hinter den Glyceraldehyd-3-Phosphat-dehydrogenase-Promotor in dem Hefevektor pYHCC101 ligiert. Das erhaltene Konstrukt, das als pCGP621 bezeichnet wurde, wurde dann in den Hefestamm G-1315 transformiert (Ashikari et al., 1989). Die 3'-Hydroxylase-Aktivität wurde in Extrakten aus G-1315/ pCGP621 nachgewiesen, nicht jedoch in Extrakten aus nichttransgener Hefe (7). Daraus lässt sich schließen, dass das cDNA-Insert aus pCGP619 für eine 3'-Hydroxylase kodiert.
Expression einer 3'-Hydroxylase-cDNA in Petunia
Das als pCGP809 bezeichnete binäre Plasmidkonstrukt wurde mit Hilfe eines Agrobacterium-vermitteltem Gentransfers in das F₁-Petunia-Hybrid Skr4 × Sw63 eingeführt. Blätterscheiben aus Skr4 × Sw63 wurden mit AGL0/ pCGP809 cokultiviert und die Integration des pCGP619-cDNA-Inserts in das Skr4 × Sw63-Genom wurde durch Southern-Analyse von Pflanzen bestätigt, die nach der Kanamycin-Selektion gewonnen wurden.
Die Expression der eingeführten 3'-Hydroxylase-cDNA in das Skr4 × Sw63-Hybrid hatte eine sichtbare Wirkung auf die Blütenfarbe. In Teilen der Blütenblätter des Skr4 × Sw63 änderte sich die Farbe von hellrosa zu rot. Die beobachtete Farbveränderung lässt sich mit Hilfe der Zahlen der Royal Horticultural Society's Colour Chart als eine Verschiebung von 55D-56C/D nach 54A-55A beschreiben. Andere biochemische und physiologische Bedingungen werden das jeweilige Ergebnis beeinflussen und die Nennung einer spezifischen Farbveränderung, die durch die Expression der 3'-Hydroxylase-cDNA in transgenen Pflanzen erreicht wird, ist nicht dahingehend zu verstehen, dass sie die möglich Bandbreite der Farbveränderungen, die beobachtet werden können, beschränkt.
Erzeugung von Mutanten und Derivaten von Flavonoid-3'-Hydroxylase
Mit üblichen hier zuvor beschriebenen Mutationsverfahren lässt sich eine Reihe Mutanten, Derivaten und Teilen von Flavonoid-3'-Hydroxylase gewinnen, welche erfindungsgemäß geeignet sind. Für spezifische Beschreibungen und Protokolle solcher Mutationsverfahren wird praktischerweise auf Sambrook et al. (1989) Bezug genommen.
Beispiele von Mutanten, Derivaten und Teilen von 3'-Hydroxylase, welche isolierbar sind und hierin betrachtet werden, umfassen folgende:
Nachweis verwandter Sequenzen in anderen Pflanzensorten neben Petunia
Mit üblichen Southern-Analysetechniken wurde ein „Gärtnerei-Blot" aus DNA hergestellt, die aus einer Vielfalt Pflanzensorten, einschließlich Apfel, Gartennelke, Kornblume, Purpur-Trichterwinde und Rose ausgewählt war, um nach genetischen Sequenzen zu screenen, die mit der Petunia-3'-Hydroxylase verwandt sind. Die Ergebnisse zeigen deutlich das Vorliegen verwandter genetischer Sequenzen in allen untersuchten Pflanzen. Der Gärtnerei-Blot umfasste die Bahnen 1 bis 5, welche etwa 10 mg DNA von jeder der oben genannten Sorten enthielt. Die verwendete DNA-Sonde war ein HindIII-EcoRV-Fragment aus pCGP619. Southern-Analysen wurde mit einer Reihe Stringenzbedingungen durchgeführt. Geeignete Stringenzbedingungen, die das Vorliegen einer Anzahl ähnlicher Sequenzen in jeder Sorte zeigten, waren die Inkubation über Nacht in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS, 10% Dextransulfat bei 42°C und anschließend 3 × 30 Minuten Waschen in 2 × SSC, 1% SDS bei 60°C.
Isolierung von zu Cytochrom P450 homologen PCR-Produkten aus Rosa
Doppelsträngige Rosenblütenblatt-cDNA, synthetisiert wie in Material und Methoden beschrieben, wurde als Templat zur Amplifizierung von Sequenzen verwendet, die mit der Petunia-3'-Hydroxylase verwandt sind, wobei die Oligonukleotide 7 und 190 verwendet wurden. Ein PCR-Produkt aus etwa 400 bp wurde in pBluescript ligiert und eines der gewonnenen Plasmide wurde als pCGP635 bezeichnet. Die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des pCGP635-Inserts sind in 8 gezeigt. Dieses Insert zeigt eine 60%ige Ähnlichkeit auf Nukleotidebene zu der Petunia-pCGP619-cDNA.
Isolierung von zu Cytochrom P450 homologen PCR-Produkten aus Dianthus
Einzelsträngige Gartennelkenblütenblatt-cDNA, synthetisiert wie beschrieben in Material und Methoden, wurde als Templat zur Amplifizierung von mit Petunia-3'-Hydroxylase verwandten Sequenzen verwendet, wobei die Oligonukleotide 7 und 190 eingesetzt wurden. Ein PCR-Produkt mit etwa 400 bp wurde in pBluescript ligiert. Die Sequenzanalyse der rekombinanten Plasmide zeigte, dass zwei verschiedene Cytochrom P450-Homologe amplifiziert und kloniert wurden. Die repräsentativen Klone dieser zwei Moleküle wurden als pCGP772 und pCGP773 bezeichnet. Die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz für die Inserts sind jeweils in 9 und 10 gezeigt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäurensequenzen mit denen anderer Cytochrome P450 ergab folgende Ergebnisse:
Isolierung eines zu Cytochrom P450 homologen PCR-Produkts aus Chrysanthemum
Genomische Chrysanthemum-DNA, isoliert wie in Material und Methoden beschrieben, wurde als Templat zur Amplifizierung von mit Petunia-3'-Hydroxylase verwandten Sequenzen verwendet, wobei die Oligonukleotide 7 und 190 eingesetzt wurden. Ein PCR-Produkt von etwa 400 bp wurde in das ddT-maßgeschneiderte pBluescript ligiert und eines der gewonnenen rekombinanten Plasmide wurde als pCGP854 bezeichnet. Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von 120 dieser Basenpaare sind in 11 gezeigt. Diese Sequenz wurde mit der des Petunia-cDNA-Klons pCGP619 verglichen, wie in 5 gezeigt, und zeigte 73% bzw. 65% Ähnlichkeit auf DNA- und Aminosäureebene zu dem Sequenzstück zwischen Position 971 und 1091.
Isolierung eines Chrysanthemum-Blütenblatt-cDNA-Klons mit Sequenzähnlichkeit zu der Petunia-3'-Hydroxylase
Das cDNA-Insert aus pCGP619 wurden zum Screenen der cDNA-Bank Nr.3 nach verwandten Sequenzen verwendet. Es wurden die in Material und Methoden beschrie benen Hydridisierungs- und Waschbedingungen verwendet und 64 hybridisierende Klone wurden nachgewiesen. 12 dieser Klone hybridisierten auch mit dem Insert aus pCGP854. Die Sequenzanalyse eines putativen full-length-Klons, der sowohl an die pCGP619- als auch die pCGP854-Sonde hybridisierte, zeigte, dass er eine identische Sequenz zu der in 11 gezeigten PCR-Produktsequenz umfasste und daher für eine putative Chrysanthemum3'-Hydroxylase kodiert.
Expression eines Chrysanthemum-Blütenblatt-cDNA-Klons in Hefe
Der Blütenblatt-cDNA-Klon kann in sense-Orientierung hinter dem Glyeraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor in den Hefevektor pYHCC101 ligiert werden. Das erhaltene Produkt wird dann in den Hefestamm G-1315 transformiert (Ashikari et al., 1989). Die Aktivität der 3'-Hydroxylase kann in Extrakten von G-1315 plus Konstrukt, nicht jedoch in Extrakten nicht-transgener Hefe nachgewiesen werden. Aus diesem Ergebnis lässt sich schließen, dass das cDNA-Insert für eine 3'-Hydroxylase kodiert.
Der Fachmann wird erkennen, dass die hier beschriebene Erfindung auf zahlreiche Arten verändert und modifiziert werden kann, die hier nicht ausdrücklich beschrieben sind. Es versteht sich, dass die Erfindung all diese Variationen und Modifikationen umfasst. Die Erfindung umfasst auch alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird oder die beschrieben sind, einzeln oder gemeinsam, sowie jegliche und alle Kombinationen aus zwei oder mehreren dieser Schritte oder Merkmale.
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Claims

Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, kodierend für ein Flavonoid 3'-Hydroxylase-Enzym oder ein Derivat davon mit Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität, oder die dazu komplementäre Sequenz, wobei diese Sequenz umfasst: die Nukleotidsequenz, umfassend die Nukleotidsequenz gemäß 5 oder einen Teil davon, kodierend für ein Protein mit Flavonoid 3'-Hydroxylaseaktivität, oder eine Sequenz, welche wenigstens 55%ige Ähnlichkeit mit der Sequenz gemäß 5 aufweist; oder die dazu komplementäre Sequenz, oder eine Sequenz, welche mit der Nukleotidsequenz gemäß 5 oder einer Sequenz, welche wenigstens 55% Ähnlichkeit hierzu aufweist oder einer dazu komplementären Sequenz unter folgenden Bedingungen hybridisiert: 20% Formamid, 6XSSC, 1% w/v SDS bei 42°C und 16 Stunden, gefolgt von Waschen in 6XSSC, 1% w/v SDS bei 65°C und 1 Stunde; oder die dazu komplementäre Sequenz; oder die Antisense-Sequenzen davon.
Nukleinsäureisolat nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäure DNA oder cDNA ist.
Nukleinsäureisolat nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäure genomische DNA ist.
Nukleinsäureisolat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Enzym aus Petunia, Gartennelke, Chrysanthemum, Rose, Mais, Löwenmaul, Tabak, Kornblume, Pelargonium oder Winde stammt.
Nukleinsäureisolat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, enthalten in einem Vektor.
Nukleinsäureisolat nach Anspruch 5, worin der Vektor ein binärer Vektor ist.
Nukleinsäureisolat nach Anspruch 5, worin der Vektor ein viraler Vektor ist.
Nukleinsäureisolat nach Anspruch 5 oder 6, worin Vektor und Nukleinsäureisolat pCGP809, wie in Beispiel 1 beschrieben, ist.
Eine Flavonoid 3'-Hydroxylase oder ein funktionales Derivat davon mit Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität, kodiert von einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1, 4 oder 5.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Flavonoid 3'-Hydroxylase oder eines Derivats davon mit Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität, wobei die Zelle mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 stabil transformiert ist, so dass die etwaige Expression der Nukleinsäure ermöglicht wird.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, welche zur Synthese einer 3'-Hydroxylase oder einer aktiven Mutante oder eines Derivats davon befähigt ist, wobei man bei diesem Verfahren eine Zelle einer geeigneten Pflanze mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 stabil transformiert, so dass die etwaige Expression der Nukleinsäure ermöglicht wird, eine transgene Pflanze aus der Zelle regeneriert und diese transgene Pflanze über einen Zeitraum und unter Bedingungen wachsen lässt, ausreichend, um die Expression der Nukleinsäure zu gestatten.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Enzym folgenden Ursprungs ist: Petunia, Gartennelke, Chrysanthemum, Rose, Mais, Löwenmaul, Tabak, Kornblume, Pelargonium oder Winde.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verringerter endogener oder existierender Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität, wobei man bei diesem Verfahren eine Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 stabil transformiert, eine transgene Pflanze aus der Zelle regeneriert und, erforderlichenfalls, die transgene Pflanze unter Bedingungen wachsen lässt, welche ausreichend sind, um die Expression der Nukleinsäure zu gestatten.
Verfahren zur Herstellung einer genetisch modifizierten Pflanze mit verringerter endogener oder existierender Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität, wobei man bei diesem Verfahren das Flavonoid 3'-Hydroxylase-Gen durch Modifikation der endogenen Sequenzen mit Hilfe homologer Rekombination eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8 modifiziert, welches in geeigneter Weise verändert ist und in die Pflanzenzelle eingeführt ist und wobei man die genetisch modifizierte Pflanze aus der Zelle regeneriert, welche im Vergleich zu normalen endogenen oder existierenden Aktivitätswerten eine veränderte Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität zeigt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 13, wobei die Expression des Nukleinsäuremoleküls in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium reguliert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin die transgene Pflanze oder die genetisch modifizierte Pflanze ausgewählt ist unter: Petunia, Gartennelke, Chrysanthemum, Rose, Mais, Löwenmaul, Tabak, Kornblume, Pelargonium oder Winde.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die transgene Pflanze durch Einführung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 produziert wird.
Transgene Pflanze oder Nachkomme davon, die/der ein eingeführtes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 trägt, wobei die Pflanze im Vergleich zu normalen endogenen oder existierenden Aktivitätswerten eine veränderte Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivität zeigt.
Transgene Pflanze oder Nachkomme davon nach Anspruch 18, worin die Veränderung des Flavonoid 3'-Hydroxylase-Aktivitätswertes eine Aktivitätsverringerung ist.
Transgene Pflanze oder Nachkomme davon nach Anspruch 18 oder 19, worin das Enzym folgenden Ursprungs ist: Petunia, Gartennelke, Chrysanthemum, Rose, Mais, Löwenmaul, Tabak, Kornblume, Pelargonium oder Winde.
Transgene Pflanze oder Nachkomme davon nach einem der Ansprüche 18 bis 20, worin die Pflanze ausgewählt ist unter: Petunia, Gartennelke, Chrysanthemum, Rose, Mais, Löwenmaul, Tabak, Kornblume, Pelargonium oder Winde.
Blüte einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 18 bis 21, worin die Blüte ein eingeführtes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 trägt.
Samen einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 18 bis 21, worin der Samen ein eingeführtes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 trägt.