PL177743B1

PL177743B1 - Sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej i wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny

Info

Publication number: PL177743B1
Application number: PL94311691A
Authority: PL
Inventors: Timothy A. Holton; Yoshikazu Tanaka
Original assignee: Int Flower Dev Pty Ltd
Priority date: 1993-05-20
Filing date: 1994-05-20
Publication date: 2000-01-31
Also published as: SG45175A1; WO1994028140A1; KR100337755B1; CA2163220A1; JPH08511683A; NZ266401A; PL311691A1; CN1127015A; EP0703982A4; EP0703982A1

Abstract

1. Sposób uzyskiwania nowej barwy rosliny ozdobnej, znamienny tym, ze do komórek rosliny wprowadza sie wektor binarny zawierajacy rekombinowany gen chimeryczny, w którego sklad wchodzi promotor pochodzacy z genu kodujacego enzym szlaku flawo- noidów oraz kontrolowana przez ten promotor sekwencja kodujaca 3’, 5’ -hydroksylaze flawonoidowa, zwieksza sie ilosc wytwarzanych antocyjanidynowych pochodnych anto- cyjanów pochodzacych od delfinidyny wywolujac ekspresje genu chimerycznego. 6. Wektor binarny zawierajacy rekombinowany gen chimeryczny, w którego sklad wchodzi promotor pochodzacy z genu kodujacego enzym szlaku flawonoidów oraz kon- trolowana przez ten promotor sekwencja kodujaca 3’,5’ -hydroksylaze flawonoidowa. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej, charakteryzujący się tym, że do komórek rośliny wprowadza się wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny, w którego skład wchodzi promotor pochodzący z genu kodującego enzym szlaku flawonoidów oraz kontrolowana przez ten promotor sekwencj a koduj ąca 3 ’, 5 ’-hy droksylazę flawonoidową, zwiększa się ilość wytwarzanych antocyjanidynowych pochodnych anocy-janów pochodzących od delfinidyny wywołując ekspresję genu chimerycznego.

177 743

Korzystnie sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidowąstosowana w sposobie według wynalazku pochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, w szczególności z petunii lub lisianthusa. Równie korzystnie promotor stosowany w sposobie według wynalazku pochodzi z genu kodującego syntetazę chalkonową (CHS).

Korzystnie wektorem binarnym wprowadzanym w sposobie według wynalazku jest plazmid wybrany z grupy, do której należąpCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458. Korzystnie komórki roślinne stosowane w sposobie według wynalazku pochodzą z rośliny takiej jak róża, goździk albo chryzantema.

Kolejnym aspektem wynalazku jest wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny, w którego skład wchodzi promotor pochodzący z genu kodującego enzym szlaku, flawonoidów oraz kontrolowa przez ten promotor sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidową.

Korzystnie wektor binarny według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidowąpochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, w szczególności z petunii lub lisianthusa. Korzystnie wektor binarny według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor stanowi promotor genu CHS.

Korzystnie wektor binarny według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest to plazmid wybrany z grupy, do której nale:żąpCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458.

W sposobie według wynalazku wytwarzana jest roślina transgeniczna, lub jej potomstwo, dobrana z grupy, do której należą róża, goździk i chryzantema, wytwarzająca polipeptyd wykazujący aktywność 3’,5’ -hydroksylazy flawonoidowej, przy czym ta roślina transgeniczna wytwarza większe ilości antocyjanów pochodnych delfinidyny, niż nietrasgeniczne rośliny tego samego gatunku.

W szczególności wytwarzana jest roślina transgeniczna, lub jej potomstwo, dobrana z grupy, do której należą róża, goździk i chryzantema, wykazująca ekspresję polipeptydu o aktywności 3’,5’ -hydroksylazy flawonoidowej, przy czym ta roślina transgeniczna wytwarza większe ilości delfinidyny i/lub pochodnych delfinidyny, niż nietransgeniczne rośliny tego samego gatunku.

Ekspresjonowany polipeptyd pochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, korzystnie, peptyd stanowi 3’,5’ -hydroksylaza flawonoidowa, a najkorzystniej, 3’,5’ -hydroksylaza pochodząca z petunii.

Stosowana sekwencja genów zawiera cząstkę kwasu nukleinowego, kodującą sekwencję koduj ącą3’,5’ -hydroksylazę i, jeżeli to niezbędne, zawierająca dodatkowe sekwencje genetyczne, takie jak np. sekwencje promotorowe i terminatorowe, umożliwiające ekspresję cząsteczki w roślinie transgenicznej. Gdy sekwencję genów stanowi DNA, może to być cDNA lub DNA genomowe. DNA występuje wpostaci wektora binarnego, zawierającego sekwencję genów chimerycznych, zdolną do włączenia do genomu rośliny w celu wytworzenia rośliny transgenicznej.

Sekwencja genów chimerycznych zawiera promotor roślinny, jak np. CHS lub też sekwencj a genowa 3’ ,5 ’ -hydroksylzzy może być zmodyfikowana w taki sposób , aby zwiększyćekspresję i spowodować podwyższenie poziomu delfinidyny i/lub jej pochodnych. Promotor CHS jest szczególnie korzystny, ponieważ stanowi on promotor roślinny szlaku flawoaoidowżgo i kieruje wysokim poziomem ekspresji sekwencji genetycznych za promotorem. Najkorzystniejsze wektory binarne stanowiąpCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458.

„Cząsteczka kwasu nukleinowego” w rozumieniu niniejszego opisu oznacza dowolny ciąg zasad nuklidowych, określających sekwencj ę aminokwasów 3’,5 ’ -hydroksyl<sz'’ Kwas nukleinowy może kodować enzym o pełnej długości lubjego czymaąpochodną. Termin „pochodna” oznacza dowolnąpochodną, u^^^at^iąpoprzez pojedyncząl^ mnogąsuastytucję, delecję i/lub addycję aminokwasów w porównaniu z enzymem występującym naturalnie. W tym rozumieniu kwas nukleinowy zawiera naturalnie występującą sekwencję nukleotydową, kodiu^t^ią3’,5’ hydroksy^ę,

177 743 lub też sekwencję poddaną pojedynczej lub mnogiej substytucji, delecji i/lub addycji nukleotydów w porównaniu z sekwencją występującą naturalnie. Terminy „analogi” i „pochodne” obejmująrównież dowolne czynne ekwiwalenty chemiczne 3’,5’ -hydroksylazy pod warunkiem, że taka cząsteczka kwasu nukleinowego przy wytwarzaniu rośliny transgenicznej według niniejszego wynalazku powoduje, że roślina transgeniczna wykazuje jedną lub więcej z następujących właściwości:

(i) wytwarzanie 3’,5’ -hydroksylazo-swoistego mRNA;

(ii) wytwarzanie białka 3’,5’ -hydroksylazy;

(iii) wytwarzanie delfinidyny i/lub jej pochodnych, i/lub (iv) zmieniony kwiatostan.

W szczególności, roślina transgeniczna wykazuje jedną lub więcej z następujących właściwości:

(i) podwyższenie poziomu- 3’,5’ -hydroksylazo-swoistego mRNA w porównaniu z nietransgenicznym poziomem endogennym;

(ii) zwiększone wytwarzanie białka 3’,5’ -hydroksylazy;

(iii) zwiększone wytwarzanie delfinidyny i/lub jej pochodnych, w porównaniu z nietransgenicznym poziomem endogennym, i/lub (iv) zmieniony kwiatostan.

Cząsteczki kwasów nukleinowych mogą być stosowane same lub w połączeniu z cząsteczką wektora, korzystnie, wektora ekspresyjnego. Takie cząsteczki wektora uleg^jćąreplikacji i/lub ekspresji w komórkach eukariotycznych i/lub prokariotycznych. Korzystnie, cząsteczki wektora, lub jej części mają zdolność włączania się do genomu rośliny. Cząsteczka kwasu nukleinowego może dodatkowo zawierać sekwencję ułatwiającą to włączenie i/lub sekwencję promotorową zdolną do kierowania ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce roślinnej. Cząsteczka kwasu nukleinowego i promotor mogą wchodzić do komórki w różny sposób, np. poprzez elektroporację, bombardowanie mikropociskami lub przeniesienie poprzez Agrobacterium.

W sposobie według wynalazku komórki transgenicznej dobranej z grupy, do której należą róża, goździk i chryzantema, wprowadza się cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą 3’,5’ -hydroksylazę, przez co możliwa staje się przemiana DHK i/lub innych odpowiednich substratów w pochodne antocyjanowe antocyjanidyn, takichjak petunidyna, malwidyna i w szczególności delfinidyna. Wytwarzanie tych antocyjanów odgrywa rolę w wytwarzaniu różnych odcieni barwy niebieskiej lub barwy zbliżonej do niebieskiej, lub też w inny sposób modyfikuje barwę kwiatów, zmieniając wytwarzanie antocyjanów, z wytwarzania pelargonidyny, cyjanidyny i peonidyny, i ich pochodnych, ku wytwarzaniu delfinidyny i jej pochodnych. Ekspresja sekwencji kwasu nukleinowego w roślinie może być cechąkonstytucyjną wywołaną lub rozwojową. Wyrażenie „zmieniony kwiatostan” oznacza dowolną zmianę barwy kwiatów w porównaniu z barwą kwiatów występujących naturalnie, biorąc pod uwagę naturalne wahania pomiędzy poszczególnymi kwitnieniami. Korzystnie, „zmiana kwiatostanu” oznacza wytwarzanie różnych odcieni barwy niebieskiej, purpurowej lub różowej, różnych od występujących w roślinach nietransgenicznych.

Powstające w sposobie według wynalazku transgeniczne rośliny kwitnące, wykazująpodwyższony poziom wytwarzania delfinidyny i/lub jej pochodnych w porównaniu z nietransgenicznym poziomem endogennym, przy czym sposób ten polega na wprowadzaniu do komórki rośliny, dobranej z grupy, do której należąróża, goździk i chryzantema, cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującej sekwencję kodującą 3’,5’-hydroksylazę w warunkach umożliwiających ostateczną ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego, regenerację rośliny transgenicznej z komórki i uzyskanie wzrostu rośliny transgenicznej przez pewien czas w warunkach odpowiednich dla osiągnięcia ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego w enzym 3’,5’ -hydroksylazę.

W sposobie według wynalazku następuje wytwarzanie rośliny transgenicznej, dobranej z grupy, do której należąróża, goździk i chryzantema, w sposób polegający na wprowadzaniu do rośliny sekwencji genowej, zawierającej sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą 3’,5’ -hy6

177 743 droksylazę flawonoidową, przez co roślina transgeniczna wytwarza większe ilości antocyjanów pochodnych delfinidyny w porównaniu z roślinami nietransgenicznymi, odpowiednio, tego samego gatunku.

W preferowanym wykonaniu sposobu powstająca transgeniczna roślina kwitnąca wykazuje zmianę właściwości kwiatostanu z jednoczesnym zwiększeniem poziomu wytwarzania delfinidyny, przy czym zmiana kwiatostanu polega na wytwarzaniu kwiatów niebieskich lub w odcieniach niebieskawych, w zależności od stanu fizjologicznego rośliny biorcy. W przypadku niektórych gatunków roślin korzystne może być dobranie „wysokiej linii pH”, zdefiniowanej jako odmiana wykazująca wyższe niż przeciętne pH w wakuolach płatków. Rekombinacyjna 3’,5’ - hydroksylaza lub jej mutanty i pochodne mogą pochodzić z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, lisianthusa, dzwonka lub bakłażana.

W związku z tym w sposobie według wynalazku wytwarzana jest transgeniczna róża, goździk lub chryzantema, zawierająca całą lub część cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującej 3’,5’ -hydroksylazę i/lub jej dowolne homologii lub formy pochodne, w szczególności zaś rośliny transgeniczne wykazujące wysoki poziom 3’,5’ -hydroksylazo-swoistego mRNA i/lub zwiększone wytwarzanie pochodnych delfinidyny i/lub zmienione właściwości kwiatostanu. Rośliny transgeniczne zawierają wprowadzoną w sposób stabilny cząsteczkę kwasu nukleinowego, zawierającą sekwencję nukleotydową, kodującą enzym 3’,5’ -hydroksylazę. Produktami sposobu według wynalazkujest ponadto potomstwo takich roślin transgenicznych, jak również ich materiał reprodukcyjny (np. nasiona). Takie nasiona, zwłaszcza, jeśli są barwne, nadają się m. in. do zastosowania jako znaczniki roślin.

Niniejszy wynalazek opisano poniżej w odniesieniu do następujących, nie ograniczających, figur i przykładów.

Na figurach:

Figury 1 (A) i (B) stanowią schematyczne przedstawienie szlaku biosyntezy barwników flawonoidowych. Enzymy w pierwszej części szlaku oznaczono następująco: PAL = liaza fenyloalaninowo-amonowa: C4H = 4-hydroksylaza cynamonowa; 4CL = ligaza 4-kumarynoCoA; CHS = syntetaza chalkonowa; CHI = izomeraza chalkonowo - flawononowa; F3H = 3-hydroksylaza flawononowa; DFR = 4-reduktaza dihydroflawonolowa; UFGT = 3-0-glukozylotransferazaUDP-glukozo-flawonoidowa. Następne etapy odpowiadąjąkonwersjom zachodzącym w kwiatach P. hybrida i stanowią: 1 = przyłączenie ramnozy do reszty glukozylowej cyjanidyno-3-glukozydu i delfinidyno-3-glukozydu; 2 = acylację i 5-0-glukozylację; 3 = metylację w pozycji 3’; 4 = metylację w pozycji 5’; 5 = metylację w pozycjach 3’, 5’.

Figura 2 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP812, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 3. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II; GUS = region kodujący β -glukuronidazy. Zaznaczono opisany w przykładzie 3 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.

Figura 3 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP485, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 4. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II. Zaznaczono opisany w przykładzie 4 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.

Figura 4 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP628, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 5. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; rB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II. Zaznaczono opisany w przykładzie 5 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.

Figura 5 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP653, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 6. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II.

177 743

Zaznaczono opisany w przykładzie 6 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.

Figura 6 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP484, którego wytwarzanie opisano w przykładzie 7. Gent = gen oporności na gentamycynę; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II. Zaznaczono opisany w przykładzie 7 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.

Figura 7 stanowi schematyczne przedstawienie binarnego wektora ekspresyjnego pCGP1458, którego wytwarzanie opisano w Przykładzie 8. nptI = gen oporności na fosfotransferazę I neomycyny; LB = granica lewa; RB = granica prawa; nptII = kaseta ekspresji fosfotransferazy neomycynowej II. Zaznaczono opisany w przykładzie 8 insert genu chimerycznego. Zaznaczono miejsca enzymów restrykcyjnych.

Figura 8 stanowi zdjęcie autoradiograficzne hybrydyzacji sposobem Southern tkanki przyrannej odmiany Royalty transformowanej pCGP628. DNA genomowe zostało przecięte EcoRI i sondowane 720 bp ECoRV fragmentem wewnętrznym Hf1 cDNA. Kontrolę ujemną(N) stanowi tkanka przyranna odmiany Royalty, transformowana pCGP293. Kontrola dodatnia (H) zawiera 10 pg fragmentu Hf1. Strzałki wskazują 2 kb fragment ECoRI, którego obecność jest spodziewana w transformowanych roślinach.

Figura 9 stanowi zdjęcie autoradiograficzne hybrydyzacji sposobem Southern tkanki przyrannej chryzantemy odmiany Blue Ridge transformowanej pCGP484. DNA genomowe zostało przecięte XbaI, który uwalnia 2,3 kb fragment Hf1-PLTP, i sondowane 1,8 kb fragmentem FspI/BspHI, uwolnionym z pCGP602, zawierającym Hf1 cDNA. Kontrolę ujemną (N) stanowi DNA genomowe wyizolowane z nietransformowanych roślin odmiany Blue Ridge. Kontrolę dodatnią (P) stanowi DNA plazmidowe pCGP485, pocięte XbaI. Strzałki wskazują2,3 kb produkt, którego obecność jest spodziewana w transformowanych roślinach.

Przykład 1. Materiał

Eriodiktiol i dihydrokwercetynę uzyskano z firmy Carl Roth KG, a naringeninę - z firmy Sigma. Dihydromirycetynę wytworzono chemicznie z mirycetyny (Extra Synthese, Francja) sposobem opisanym przez Vercruysse i wsp. (1985). [³H]-naringeninę (5,7 Ci/mmol) i [³H]-dihydrokwercetynę (12,4 Ci/mmol) uzyskano z firmy Amersham. Wszystkie enzymy uzyskano ze źródeł handlowych i zastosowano zgodnie z zaleceniami producentów.

Zastosowany szczep Escherichia coli stanowił:

DH5 α supE44, Δ (lacZYA-ArgF)U169,<^_80lacZAM15, hsdR17(r_k-,m_k+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, deoR (Hanahan, 1983 i BRL, 1986).

Niewirulentne szczepy Agrobacterium tumefaciens AGLO (Lazo i wsp., 1991) i LBA 4404 (Hoekema i wsp., 1983) uzyskano, odpowiednio, od dr. R Ludwig, Department of Biology, University of California, Santa Cruz, Stany Zjednoczone, i z firmy Calgene, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone.

Wirulentny szczep Agrobacterium tumefaciens ICMP 8317 uzyskano od dr. Richarda Gardnera, Centre for Gene Technology, Department of Cellular and Molecular Biology, University of Auckland, Nowa Zelandia.

Wektor klonujący pBluescript uzyskano z firmy Stratagene. Rośliny hodowano w wyspecjalizowanych cieplarniach, przy czym światło dzienne utrzymywano przez 14 godzin na dobę, a natężenie oświetlenia wynosiło co najmniej 10000 luksów, w temperaturze 22-26°C.

Przykład 2. Wytwarzanie pCGP 90

Plazmid pCGP90 wytworzono, klonując insert cDNA z pCGP602 (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe PCT/AU92/00334; numer publikacji WO 93/01290), za promotorem Mac (Comai i wsp., 1990) pCGP293.

Binarny wektor ekspresyjny pochodził z wektora binarnego Ti pCGN1559 (McBride i Summerfelt, 1990). Plazmid pCGN1559 pocięto KpnI, a wystające końce 3’ usunięto, stosując polimerazę DNA T4, zgodnie ze standardowymi protokołami (Sambrook i wsp., 1989). Wektor cięto następnie XbaI, a powstałe w wyniku tego wystające końce 5’ poddano reparacji za pomocą

177 743 fragmentu Klenow polimerazy I DNA. Następnie wektor poddano powtórnej ligacji dla uzyskania pCGP67. Z pCGP40 wyizolowano 1,97 kb fragment PstI, zawierający promotor Mac, terminator mas i różne miejsca klonujące (Comai i wsp., 1990), i włączono go do miejsca Pst I pCGP67, w wyniku czego wytworzono pCGP293.

Plazmid pCGP40 wytworzono, usuwając gen GUS (Jefferson i wsp., 1987) jako fragment BamHI-SacI zpCGN7334, i zastępując go fragmentem BamHI-SacI z M13 pBluescribe, w skład którego wchodzi miejsce multiklonujące. Plazmid pCGN 7334 (uzyskany z firmy Calgene, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone) wytworzono poprzez insercję fragmentu zawierającego chimeryczny gen Mac-GUS-mas do miejsca XhoI pCGN7329 (Comai i wsp., 1990)

Z pCGP602 wyizolowano następnie fragment BamHI/KpnI, zawierający wyżej wzmiankowany insert cDNA, i fragment ten poddano ligacji z fragmentem BamHI/KpnI pCGP293. Poprawność insercji insertu pCGP90 stwierdzono za pomocą analizy restrykcyjnej DNA, wyizolowanego z transformantów opornych na gentamycynę.

Przykład 3. Wytwarzanie pCGP 812

Binarny wektor ekspresyjny pCGP812 pochodził z wektora binarnego Ti pCGN1558 (McBride i Summerfelt, 1990). ZpKIWI 101 (Jannsen i Gardner, 1989) wyizolowano 5,2 kb fragment XhoI, zawierający chimeryczny gen mas-35S-GUS-ocs, a następnie fragment ten subklonowano do miejsca Xhol pBluescript KS dla wytworzenia pCGP82. Następnie ponownie wyizolowano fragment 5,2 kb poprzez trawienie HindIII/KpnI, i subklonowano go do miejsc HindII/KpnI pCGN1558 dla wytworzenia pCGP83.

Plazmid pCGP83 poddano restrykcji za pomocąKpnI, a wystające końce 3’ usunięto, stosując polimerazę DNA T4, zgodnie ze standardowymi protokołami (Sambrook i wsp., 1989). Następnie do wypełnionych miejsc KpnI dołączono adaptor SmaI-BamHI (Pharmacia) dla wytworzenia „lepkich” końców BamHI. Do „lepkich” końców BamHI pCGP83 przyłączono 3,8 kb fragment BgIII, zawierający chimeryczny gen Mac-Hf1 -mas, pochodzący z pCGP807 (opisanego poniżej), dla wytworzenia pCGP812 (Fig. 2).

Plazmid pCGP807 wytworzono poprzez ligację 1,8 fragmentu BamHI-KpnI, zawierającego wyżej wzmiankowany insert Hf1 cDNA, pochodzący z pCGP602, wraz z końcami BamHi-KpnI pCGP40.

Przykład 4. Wytwarzanie pCGP 485

Binarny wektor pCGP485 pochodził z wektora binarnego Ti pCGN 1547 (McBride i Summerfelt, 1990). Wytworzono gen chimeryczny, zawierający (i) sekwencję promotorową z genu CHS lwiej paszczy, (ii) region kodujący wyżej wzmiankowanego insertu cDNA z pCGP602 petunii oraz (iii) sekwencję terminatorową białka transferazy fosfolipidowej petunii (PTLP). Promotor CHS zawiera 1,2 kb fragment genowy 5’ miejsca inicjacji translacji (Sommer i Saedle, 1986). Insert cDNA petunii składa się z 1,6 kb fragmentu Bcll/FspI, pochodzącego z klonu cDNApCGP602 (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe PCT/AU92/00334; numer publikacji WO 93/01290). Sekwencja terminatorowa PLTP składa się z 0,7 kb fragment SmaI/XhoI, pochodzącego z pCGP 13 Δ Bam (Holton, 1992), w skład którego wchodzi 150 bp region nie poddany translacji z poddanego transkrypcji regionu genu PLTP. Chimeryczny gen CHS/insert cDNA/PLTP klonowano do miejsca PstI pCGN1547 dla wytworzenia pCGP485.

Przykład 5. WytwarzaniepCGP628

Plazmid pCGP176 (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe PCT/-AU92/00334; numer publikacji WO 93/01290) pocięto EcoRI i SpeI. Pocięte DNA upakowano do fragmentów Klenow zgodnie ze standardowymi protokołami (Sambrook i wsp., 1989), po czym uległy one samorzutnej ligacji. W ten sposób uzyskany plazmid oznaczono jako pCGP627. Trawienie pCGP627 przez XbaI/KpnI dało w wyniku 1,8 kb fragment, który następnie poddano ligacji z fragmentem 14,5 kb, uzyskanym poprzez trawienie pCGP293 za pomocąXbaI/Kpn'I. Plazmid uzyskany w ten sposób oznaczono jako pCGP628.

Przykład 6. Wytwarzanie pCGP 653

Plazmid pCGP293 (opisany powyżej w przykładzie 2) poddano trawieniu XbaI, a powstałe w wyniku tego wystające końce 5’ upakowano stosując fragment Klenow, zgodnie ze standardo177 743 wymi protokołami (Sambrook i wsp., 1989). Następnie poddano go trawieniu HindIII. Podczas tej procedury promotor Mac (Comai i wsp., 1990) uległ delecji. 0,8 kb promotor CHS-A z petunii, pochodzący z pCGP669 (opisanego poniżej) poddano ligacji z tym „rdzeniem”jako fragment EcoRI/HindIII o tępych końcach. Ten produkt plazmidowy oznaczono jako pCGP672. Trawienie pCGP807 (opisanego w powyższym przykładzie 3) za pomocąXbaI/Asp718 pozwoliło uzyskać 1,8 kb fragment, zawierający Hf1 cDNA, który poddano ligacji z 16,2 kb fragmentem XbaI/Asp718, pochodzącym z pCGP672. Plazmid uzyskany w ten sposób oznaczono jako pCGP653.

Fragment promotorowy genu CHS-A podano amplifikacji metodą PCR, stosując jako primery oligonukleotydy CHSA-782 i CHS+34 (porównaj poniższe sekwencje), oraz genomowe DNA Petunia hybrida V30jako matrycę. Produkt PCRklonowano następnie do pBluescript o końcu ddT (Holton i Graham, 1991), a orientację fragmentu genu sprawdzano poprzez mapowanie enzymem restrykcyjnym. Plazmid uzyskany w ten sposób oznaczono jako pCGP669. Te primery oligonukleotydowe zostały opracowane dla opublikowanej sekwencji promotora CHS-A petunii (Koes, 1988).

CHSA-782

5’ GTTTTCCAAATCTTGACGTG 3’

CHSA+34

5’ ACGTGACAAGTGTAAGTATC 3’

Przykład 7. Wytwarzanie pCGP 484

Wytwarzanie pCGP 484 przebiega identycznie, jak opisane powyżej w przykładzie 4 wytwarzanie pCGP485, z tym wyjątkiem, że pCGP484 zawiera fragment 3,4 kb PstI (zawierający chimeryczny gen CHS-Hf1-PLTP) o przeciwnej orientacji.

Przykład 8. Wytwarzanie pCGP 1458

Plazmid pCGP1458 wytworzono, stosując jako rdzeń 10 kb wektor binarny pBIN19 (Bevan, 1984). Plazmid pBIN19 trawiono EcoRI, a powstałe w wyniku tego końce 5’ upakowano, stosując fragment Klenow, zgodnie ze standardowymi sposobami (Sambrook i wsp., 1989). Plazmid pCGP485 trawiono PstI dla usunięcia chimerycznego genu CHS/insert cDNA/PLTP, jako fragmentu 3,5 kb. Wystający koniec 3’, powstały w wyniku trawienia za pomocą PstI, usunięto za pomocąpolimerazy DNA T4, a następnie fragment ten poddano ligacji do upakowanego miejsca EcoRI plazmidu pBIN19.

Przykład 9. Transformacja E. coli i A. tumefaciens

Transformację komórek DH5 a szczepu Escherichia coli jednym z wektorów pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653, pCGP484 lub pCGP1458 przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami (Sambrook i wsp., 1989, lub Inoue i wsp., 1990). Plazmid pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653, pCGP484 lub pCGP1458 wprowadzano do odpowiedniego szczepu Agrobacterium tumefaciens, poprzez dodanie 5 pg plazmidowego DNA do 100 pl 1 kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens, wytworzonych przez inokulację 50 ml hodowli MG/L (Garfinkel i Nester, 1980) i dalsze prowadzenie hodowli przez 16 godzin z zastosowaniem mieszania, w temperaturze 28°C. Komórki poddano następnie granulacji i resuspendowano w 0,5 ml 85% (v/v) 100 mM CaCl₂/15% (v/v) glicerolu. Mieszaninę DNA/Agrobacterium zamrażano poprzez inkubację w płynnym N₂ przez 2 minuty, po czym rozmrożono poprzez inkubację w temperaturze 37°C przez 5 minut. Mieszaninę DNA/bakterii umieszczono następnie w lodzie na kolejne 10 minut. Komórki zmieszano potem z 1 ml pożywki MG/L i inkubowano, mieszając, przez 16 godzin w temperaturze 28°C. Na płytkach agarowych MG/L, zawierających 100 pg/ml gentamycyny, wyselekcjonowano komórki A. tumefaciens, zawierające pCGPŚ 12, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653 lub pCGP484. Komórki A. tumefaciens, zawierające pCGP1458, wyselekcjonowano na płytkach agarowych MG/L, zawierających 100 pg/ml kanamycyny. Obecność plazmidu potwierdzono analizą Southern DNA wyizolowanego z transformantów opornych na gentamycynę.

177 743

Przykład 10. Transformacja Dianthus caryophyllus

a. Materiał roślinny

Sadzonki Dianthus caryophyllus (odmiany Crowley Sim, Red Sim, Laguna) uzyskano z firmy Van Wyk and Son Flower Supply, Victoria, Australia. Usunięto liście zewnętrzne i sadzonki krótko wyjałowiono w 70% (v/v) etanolu, a następnie w 1,:25% (w/v) podchlorynie sodowym (z dodatkiem Tween 20) przez 6 minut, i przemyto trzykrotnie jałową wodą. Przed wspólną hodowląusunięto pod mikroskopem disekcyjnym wszystkie widoczne liście i pączki pachwinowe.

b. Wspólna hodowla Agrobacterium i tkanki Dianthus

Szczep Agrobacterium tumefaciens AGLO (Lazo i wsp., 1991), zawierający dowolny z wektorów binarnych pCGP90, pCGP812, pCGP485 i pCGP653, utrzymywano w temperaturze 4°C na płytkach agarowych MG/L (Garfinkel i Nester, 1980), zawierających 100 mg/l gentamycyny. Pojedyncze kolonie hodowano przez noc w płynnym bulionie MG/L i rozcieńczono do stężenia 5 x 10⁸ komórek/ml następnego dnia, przed inokulacją. Tkankę Dianthus hodowano wspólnie z Agrobacterium na pożywce Murashige i Skoog (1962) (MS) z dodatkiem 3% sacharozy (w/v), 5 mg/l kwasu α-naftalenooctowego (NAA), 20 pM acetosyringonu i 0,8% agaru Difco Bacto (pH 5,7).

c. Regeneracja transgenicznych roślin Dianthus

Po wspólnej hodowli tkankę przeniesiono do pożywki MS z dodatkiem 1 mg/l benzyloaminopuryny (BAP), 0,1 mg/l NAA, 150 mg/l kanamycyny, 500 mg/l tikarcyliny i 0,8% agaru Difco Bacto (pożywka selekcyjna). Po trzech tygodniach przeszczepy przeniesiono do świeżej pożywki selekcyjnej; na tym etapie z przeszczepów łodyg starannie usunięto pędy pachwinowe.Po 6-8 tygodniach hodowli na pożywce selekcyjnej zdrowe pędy przybyszowe przeniesiono do pozbawionej hormonów pożywki MS, zawierającej 3% sacharozy, 150 mg/l kanamycyny, 500 mg/l tikarcyliny i 0,8% agaru Difco Bacto. Na tym etapie dla zidentyfikowania pędów transgenicznych stosowano test histochemiczny GUS (Jefferson, 1987) i/lub test dot-blotNPT II (McDonnell i wsp., 1987). Pędy transgeniczne przenoszono do pożywki MS z dodatkiem 3% sacharozy, 500 mg/l tikarcyliny i 0,4% (w/v) Gelrite Gellan Gum (Schweizerhall) dla pobudzenia ukorzeniania. Wszystkie hodowle prowadzono z oświetleniem przez 16 godzin na dobę (zimnym białym światłem fluorescencyjnym 120 pE) w temperaturze 23 ± 2°C. Kiedy rośliny ukorzeniły się i osiągnęły wysokość 4-6 cm, aklimatyzowano je we mgle. Do aklimatyzacji zastosowano mieszaninę o wysokiej zawartości perlitu (75% lub więcej), nasiąkniętą mieszaniną hydroponiczną (Kandreck i Black, 1984); aklimatyzacja trwała, typowo, 4-5 tygodni. Rośliny aklimatyzowano w temperaturze 23°C, stosując oświetlenie przez 14 godzin na dobę (światłem rtęciowo-halogenowym 200 pE).

Przykład 11. Transformacja Rosa hybrida

1. Rosa hybrida odmiany Royalty

Tkanki roślinne róży odmiany Royalty transformowano według sposobu opisanego w PCT 91/04412, o numerze publikacji WO92/00371.

2. Rosa hybrida odmiany Kardinal

a. Materiał roślinny

Pędy Kardinal uzyskano z firmy Vand Wyk and Son Flower Supply, Victoria, Australia. Usunięto liście i pozostałe pędy (5-6 cm) wyjałowiono w 1,25% (w/v) podchlorynie sodowym (z dodatkiem Tween 20) przez 5 minut, i przemyto trzykrotnie jałową wodą. Izolowane czubki pędów namoczono na 1 godzinę w jałowej wodzie, po czym prowadzono hodowlę wstępną przez 2 dni na pożywce MS zawierającej 3% sacharozy, 0,1 mg/l BAP, 0,1 mg/l kinetyny, 0,2 mg/l kwasu giberelowego, 0,5% (w/v) poliwinylopirolidonu i 0,25% Gelrite Gellan Gum, przed hodowlą wspólną

b. Wspólna hodowla Agrobacterium i tkanki pędu Rosa

Szczepy Agrobacterium tumefaciens ICMP 8317 (Janssen i Gardner 1989) i AGLO, zawieraj ące wektor binarny pCGP812, utrzymywano w temperaturze 4°C na płytkach agarowych MG/L, zawierających 100 mg/l gentamycyny. Pojedyncze kolonie poszczególnych szczepów Agrobacterium hodowano przez noc w płynnym bulionie MG/L. Końcowe stężenie,

177 743 wynoszące 5 x 10⁸ komórek/ml, wytwarzano następnego dnia poprzez rozcieńczenie w płynnym MG/L. Przed inokulacją obie hodowle Agrobacterium mieszano w stosunku 10:1 (AGLO/pCGP812:8317/pCGP812). Na czubku pędu wykonywano cięcie podłużne i umieszczano tam 2 μΐ próbkę mieszaniny hodowli Agrobacterium, w postaci kropli. Czubki pędów hodowano, poddawano następnie wspólnej hodowli przez 5 dni na tej samej pożywce, co stosowana do hodowli wstępnej.

Szczep Agrobacterium tumżyacieas AGLO, zawierający wektor binarny pCGP1458, utrzymywano w temperaturze 4°C na płytkach agarowych mG/L, zawierających 1 θ0 mg/l kanamycyny. Pojedyncze kolonie poszczególnych szczepów Agrobacterium hodowano przez noc w płynnym bulionie MG/L. Końcowe stężenie, wynoszące 5 x 10⁸ komórek/ml, wytwarzano następnego dnia poprzez rozcieńczenie w płynnym MG/L.

c. Regeneracja tpankgżniczaych roślin Rosa

Po wspólnej hodowli czubki pędów przenoszono na pożywkę selekcyjną. Czubki pędów przenoszono na świeżą pożywkę selekcyjną co 3-4 tygodnie. Galasy, stwierdzane na czubkach pędów, obcinano, kiedy osiągały średnicę 6-8 mm. Oddzielone galasy przenoszono na pożywkę MS, zawierającą 3% sacharozy, 25 mg/l kanamycyny, 250 mg/l cefotaksymu i 0,25% Gelrite Gellan Gum, w celu wytwarzania pędów. Regenerowane z tkanki galasowej pędy izolowano i przenoszono na pożywkę selekcyjną. W celu zidentyfikowania pędów traasgeniczazch stosowano test histochemiczny GUS i test tkanki przyrannej. Pędy traakgżaicsaż przenoszono na pożywkę MS, zawierającą 3% sacharozy, 200 mg/l cefotaksymu i 0,25% Gelrite Gellan Gum, w celu pobudzenia ukorzeniania. Wszystkie hodowle prowadzono, stosując oświetlenie przez 16 godzin na dobę (zimnym białym światłem fluorescencyjnym 60 μΕ) w temperaturze 23 ± 2°C. Kiedy system korzeniowy był dobrze rozwinięty, a pędy osiągały długość 5-7 cm, tpaasgeaicsae róże przenoszono do 8 cm rurek, napełnionych wyjałowioną w autoklawie mieszanką doniczkową Debco 514110/2. Po 2-3 tygodniach rośliny przesadzano do 15 cm donic, stosując tę samą mieszankę doniczkową, i utrzymywano w temperaturze 23°C, stosując oświetlenie przez 14 godzin na dobę (światłem rtęciowo-halogenowym 300 μΕ). Po 1-2 tygodniach donice z roślinami przenoszono do cieplarni (temperatura w dzień/w nocy: 25-28/14°C) i hodowano aż do kwitnienia.

Przykład 12. Transformacja Chpykaathżmum monfolium

a. Materiał roślinny

Sadzonki Ch^santhemum monfolium (odmiany Blue Ridge, Pemine Chorus) uzyskano z F & I Baguley Flower and Plant Growers, Victoria, Australia. Z sadzonek usunięto liście, po czym sadzonki wyjałowiono krótko w 70% (v/v) etanolu, a następnie w 1,25% (w/v) podchlorynie sodowym (z dodatkiem Tween 20) przez 3 minuty, i przemyto trzykrotnie wodąjałową. Do wspólnej hodowli stosowano przekroje łodyg na poziomie między węźla.

b. Wspólna hodowla Agrobacterium i tkanki Chpykanthemum

Agrobacterium tumefaciens szczepu LBA4404 (Hoekema i wsp., 1983), zawierający dowolny z wektorów binarnych pCGP90, pCGP484, pCGP485 i pCGP628, hodowano na płytkach agarowych MG/L, zawierających 50 mg/l riyampicyay i 10 mg/l gentamyczay. Pojedyncze kolonie poszczególnych Agrobacterium hodowano przez noc na tej samej płynnej pożywce. Z tych płynnych hodowli wytwarzano 10% zawiesiny w glicerolu, i próbki o objętości 1 ml przenoszono do zamrażarki (-80°C). Próbki o objętości 100-200 μl poszczególnych zamrożonych szczepów Agrobacterium hodowano przez noc na płynnym MG/L, zawierającym 50 mg/l rifampiczay i 10 mg/l gżntamzcyaz. Końcowe stężenie, wynoszące 5 x 10⁸ komórek/ml, wytwarzano następnego dnia poprzez rozcieńczenie w płynnym MS, zawierającym 3% (w/v) sacharozy. Przekroje łodyg hodowano następnie wraz z Agrobacterium, zawierającym dowolny z LBA4404/pCGP90, LBA4404/pCGP484, LBA4404/pCGP485, LBA4404/pCGP628, na pożywce do wspólnej hodowli, przez 4 dni.

c. Regeneracja traakgeaiczazch roślin Chrykaathemum

Po wspólnej hodowli, przekroje łodyg przenoszono na pożywkę selekcyjną. Po 3-4 tygodniach regenerujące przeszczepy przenoszono na świeżą pożywkę. Pędy przybyszowe, które przeżyły selekcję kaaamzcyaową, izolowano i przenoszono na pożywkę MS, zawi erąjąc ąkana12

177 343 mycynę i cefotaksym, dla uzyskania wzrostu pędów i ukorzenienia. Przy wszystkich hodowlach stosowano oświetlenie przez 16 godzin na dobę (zimnym białym światłem fluorescencyjnym 80 μΕ) w temperaturze 23 ± 2°C. Z roślin, które ukorzeniły się na kanamycynie, pobierano, próbki liści i za pomocą analizy Southern biot identyfikowano rośliny transgeniczne. Kiedy transgeniczne chryzantemy osiągały długość 4-5 cm, przenoszono je do 8 cm rurek, napełnionych wyjałowioną w autoklawie mieszanką doniczkową Debco 51410/2. Po 2 tygodniach rośliny przesadzano do 15 cm donic, stosując tę samą mieszankę doniczkową, i utrzymywano w temperaturze 23°C, stosując oświetlenie przez 14 godzin na dobę (światłem rtęciowo-halogenowym 300 μΕ). Po 2 tygodniach donice z roślinami przenoszono do cieplarni (temperatura w dzień/w nocy: 25-28/14°C) i hodowano aż do kwitnienia.

Przykład 13. Analiza Southern

a. Izolacja genomowego DNA z Dianthus

DNA z tkanki izolowano w zasadzie w sposób opisany przez Dellaporta i wsp. (1983). Preparaty DNA oczyszczano następnie przez odwirowywanie hydrostatyczne CsCl (Sambrook i wsp., 1989).

b. Izolacja genomowego DNA z Chrysanthemum

DNA izolowano z tkanki liści, stosując bufor ekstrakcyjny, zawierający 4,5 M tiocyjanianu guanidynowego, 50 mM EDTA o pH 8,0,25 mM cytrynianu sodowego o pH 7,0,0,1 M 2-merkaptoetanolu, 2% (v/v) sarkozyny laurylowej. Tkankę roślinną rozdrabniano na miałki proszek w płynnym N₂, po czym dodawano bufor ekstrakcyjny (5 ml/g tkanki) i roztwór mieszano w wirówce przez 16 godzin. Mieszaninę ekstrahowano dwukrotnie fenolem: chloroformem: izoamyloalkoholem (w stosunku 50:49:1), a genomowe DNA poddawano precypitacji, dodając trzykrotną objętość etanolu i stosując odwirowanie przez 15 minut z prędkością 10000 obrotów/minutę.

c. Izolacja genomowego DNA z Rosa

DNA ekstrahowano, rozdrabniając tkankę w obecności płynnego N₂ w moździerzu i dodając 1 ml bufora ekstrakcyjnego (0,14 M sorbitu, 0,22 M Tris-HCl [o pH 8,0], 0,022 M EDTA, 0,8 M NaCl, 0,8% (w/v) CTAB, 1% N-laurylosarkozyny), ogrzanego do temperatury 65°C. Następnie do mieszaniny dodano chloroformu (200 μΐ) i inkubowano ją w temperaturze 65°C przez 15 minut. Po odwirowaniu supernatant ekstrahowano za pomocą fenolu-chloroformu, po czym dodano do równej objętości izopropanolu, odwracając dla wymieszania. Mieszaninę tę odwirowano, a grudkę przemyto 95% etanolem, ponownie odwirowano i przemyto 70% etanolem. Grudkę wysuszono pod próżnią i resuspendowano w 30 μΐ bufora TE (o pH 8,0).

d. Southern Biot

Genomowe DNA (10 μg) poddawano trawieniu przez 60 jednostek EcoRI przez 16 godzin, a następnie elektroforezie na 0,7% (w/v) żelu agarozowym w przepływającym buforze TAE (40 mM Tris-octanu, 50 mM EDTA). DNA denaturowano następnie w roztworze denaturującym (1,5 M NaCl/0,5M NaOH) przez 1-1,5 godziny, zobojętniano w 0,5 M Tris-HCl (o pH 7,5)/1,5 M NaCl przez 2-3 godziny, po czym DNA przenoszono na filtr Hybond N (Amersham) w 20 x SSC.

Analiza metodą Southern domniemanych transgenicznych Dianthus, Rosa i Chrysanthemum, uzyskanych po selekcji na kanamycynie, potwierdziła integrację odpowiednich genów chimerycznych do genomu.

Przykład 14. Analiza Northern

a. RNA Dianthus i Chrysanthemum

Z tkanki, którą uprzednio poddano zamrażaniu w płynnym N2 i rozdrabnianiu na miałki proszek w moździerzu, wyizolowano całkowite DNA. Do tkanki dodano bufor ekstrakcyjny, zawierający 4 M izotiocyjanianu guanidynowego, 50 mM Tris-HCl (o pH 8,0), 20 mM EDTA, 0,1% (v/v) sarkozylu, po czym mieszaninę homogenizowano przez 1 minutę, stosując politron ustawiony na maksymalną prędkość. Zawiesinę przefiltrowano przez Miracloth (Calbiochem) i odwirowano w wirówce JA20 przez 10 minut z prędkością 10000 obrotów/minutę, po czym supernatant zebrano i dodano do 0,2 g/ml CsCl (w/v). Próbki nałożono następnie warstwowo na

177 743 ml „podlkadki”, utworzone z 5,7 M CsCl, 50 mM EDTA (o pH 7,0) w 38,5 ml iru-kach do odwirowywania Quick-seal (Beckman) i odwirowano z prędkością 42000 obrotów/minutę przez 12-16 godzin w temperaturze 23°C w wirówce Ti-70. Grudki resuspendowano w TE/SDS (10 mM Tris-HCl (o pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 (w/v) SDS) i ekstrahowano mieszaniną fenolu : chloroformu: alkoholu izoamylowego (w stosunku 25:24:1) saturowanąw 10 mM EDTA (o pH 7,5). Po precypitacji etanolowej grudki RNA resuspendowano w TE/SDS. Próbki RNA poddano elektroforezie na mieszaninie zawierającej 2,2 M formaldehydiE1,2% (w/v) żel agarozowy, stosując przepływający bufor o składzie: 40 mM kwasu morfolinopropanosulfonowego (o pH 7,0), 5 mM octanu sodowego, 0,1 EDTA (o pH 8,0). RNA przeniesiono na filtry Hybond-N (Amersham) w sposób podany przez producenta, i sondowano fragmentem cDNA, znakowanym ³²P( 10⁸ cpm/pg, 2 x 10⁶ cpm/ml). Prehybrydyzację (1 godzina w temperaturze 42°C) i hybrydyzację (16 godzin w temperaturze 42°C) przeprowadzono w mieszaninie 50% (v/v) formamidu. 1 MNaCl, 1%o(w/v) SDS, 10% (w/v) siarczanu dekstranowego. W etapie hybrydyzacji do próbki znakowanej ³²P dodawano zdegradowane DNA spermy łososiowej (100 pg/ml). Filtry przemywano w 2 x SSC/1% (w/v) SDS w temperaturze 65°C przez 1 -2 godzin, a następnie w 1,2 x SSC/1% (w/v) SDS w temperaturze 65°C przez 0,5-1 godziny, po czym filtry eksponowano na film Kodak XAR z zastosowaniem ekranu wzmacniającego w temperaturze -70°C przez 48 godzin.

Analiza Northern Dianthus odmiany Red Sim, transgenicznego z plazmidem pCGP90, wykazała, że na trzynaście roślin osiem było dodatnich.

b. RNA Rosa

Z płatków (pączków i kwiatów 5 dni po ich zebraniu) wyekstrahowano całkowicie RNA sposobem opisanym przez Maneiega (1991).

Przykład 15. Znakowanie próbek DNA za pomocą 32P

Fragmenty DNA (50-100 ng) znakowano radioaktywnie, stosując 50 pCi [α-32P]-dCTP, z wykorzystaniem zestawu do oligoznakowania (Bresatec). Niezwiązany [a-32P]-dCTP usunięto poprzez chromatografię na kolumnie Sephadex G-50 (Fine).

Przykład 16. Analiza antocyjanidyny

Przed analiząHPLC cząsteczki anSocyjjeów, obecne w wyciągu z płatków, poddawano hydrolizie kwaśnej dla usunięcia cząstek glikozylowych z rdzenia aeSocyjaeidynowego. Wzorzec hydroksylacji na pierścieniu B barwników aeSocyjaeowych określano poprzez analizę HPLC cząsteczki rdzennej antocyjanidyny. W analizie tej stosowano system HpLC Hewlett-Packard 1050, wyposażony w detektor wielu długości fali (MWD). Rozdzielenie za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami przeprowadzono na kolumnie nabojowej Spherisorb S5 ODS2, 250 mm x 4 mm ID.

a. Ekstrakcja anSocyjanów i flawonoidów

Barwniki kwiatowe ekstrahowano z segmentów płatków (ca. 50 mg), stosując 5 ml metanolu, zawierającego 1%o (v/v) wodnego 6 M kwasu solnego. Wyciągi rozcieńczano wodą(1:9) i filtrowano (Millex HV, 0,45p) przed iniekcją do systemu HPLC.

b. Hydroliza aeSocyjaeów

Niepreparowane wyciągi metanolowe (100 pl), wytworzone w powyższym punkcie a., odparowywano do sucha w Pierce ReactiVials, stosując strumień suchego azotu w temperaturze pokojowej. Pozostałości rozpuszczano w 200 pl 2M HCl, fiolki kapslowano, po czym ogrzewano w temperaturze 100°C przez 30 minut. Mieszaninę hydrolitycznąrozcieńczono wodą (w stosunku 1:9) i przefiltrowano (Millex HV, 0,45p) przed analizą HPLC.

c. Chromatografia

Rozdzielenie barwników kwiatowych przeprowadzono poprzez elucję gradientową z zastosowaniem następującego systemu:

Rozpuszczalnik A : (trójetylojmiina:stęż. H₃PO₄: H₂O) ((3 : 2,5 : 1000)

Rozpuszczalnik B: acetonitryl

Warunki gradientowe: 5% B do 40% B przez 20 minut

Prędkość przepływu: 1 ml/min

177 743

Temperatura: 35°C

Wykrywanie: MWD z symultanicznym zbieraniem danych przy długości fali 280, 350 i 546 nm.

Piki antocyjanidyn identyfikowano w odniesieniu do znanych standardów. Inny sposób analizy cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, można znaleźć u Brugliera i wsp., 1994.

Analizę HPLC przeprowadza się dla wykrycia obecności barwników delfinidyny, pelargonidyny i cyjanidyny w próbkach tkanki goździka, chryzantemy i róży po ich transformacji jednym z plazmidów pCGP90, pCGP485, pCGP484, pCGP628, pCGP653 lub pCGP1458. Reprezentatywne dane, dotyczące pCGP90, pCGP485 i pCGP653 w transgenicznych goździkach przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Analiza HPLC kwiatów transgenicznych pCGP90, pCGP485 i pCGP653

Próbka	% Delfinidyny	% Pelargonidyny	% Cyjanidyny
Goździk nietransgeniczny: Odmiana: Red Sim	0	85,3	0,8
Goździk transgeniczny: Red Sim + pCGP90 (i) Nr 1933	1,9	82,7
(ii) Nr 2011	3,7	76,9	-
Red Sim + pCGP485 (i) Nr 3654B	13,0	75,1	2,3
Red Sim + pCGP653 (i) Nr 3660/2	18,1	71,4	3,2
(ii) Nr 3655	35,6	49,1	7,5

Nr - numer nabycia rośliny (-) - nie wykryto

Przykład 17. Wytwarzanie wyciągów roślinnych do testu aktywności 3’,5’ -hydroksylazy

Tkankę roślinną homogenizowano w 10-krotnej objętości lodowatego bufora ekstrakcyjnego (100 mM fosforanu potasowego (o pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,25 M sacharozy, 0,25 M mannitu, 0,1% (w/v) BSA, 0,1 mg/ml PMSF, 20 mM 2-merkaptoetanolu i 10 mg/ml poliklarowego AT). Homogenizat odwirowywano z prędkością 13000 obrotów na minutę w wirówce JA20 (Beckman) przez 10 minut w temperaturze 4°C, po czym oznaczano aktywność 3’ ,5 ’ - hydroksylazy w próbce supernatantu.

Test 3’,5’ -hzdro0kylazz

Aktywność enzymu 3’,5’ - hydroksylazy mierzono stosując zmodyfikowaną wersję sposobu opisanego przez Stotz i Forkmann (1982). Testowa mieszanina reakcyjna typowo zawierała 195 μΐ wyciągu roślinnego, 5 μΐ 50 mM NADPH w buforze testowym (100 mM fosforanu potasowego (o pH 8,0), 1 mM EDTA i 20 mM 2-merkaptoetanolu), oraz 10⁵ dpm [¹⁴C] naringeniny w końcowej objętości 200 μΐ. Po inkubacji przez noc w temperaturze 23°C mieszaninę reakcyjną dwukrotnie ekstrahowano, stosując 0,5 ml octanu etylowego. Fazę octanu etylowego wysuszono pod próżnią a następnie resuspendowano w 10 μl octanu etylowego. Znakowane radioaktywnie cząsteczki flawonoidów oddzielano następnie na cienkowarstwowych płytkach celulozowych

177 743 (Merck Art 5577, Niemcy), stosując system rozpuszczalnikowy chloroform: kwas octowy: woda (w stosunku 10:9:1 v/v). Po wykonaniu chromatografii płytki TLC wysuszano na powietrzu, a produkty reakcji lokalizowano poprzez autoradiografię i identyfikowano przez porównanie z nieradioaktywnymi standardami naringeniny, eriodiktiolu, dihydrokwercetyny i dihydromirycetyny, umieszczonymi obok produktów reakcji i uwidocznionymi w promieniach UV.

Przykład 18. Transformacja różnych odmian

Geny chimeryczne, zawarte w dowolnej z sekwencji pCGP90, pCGP812, pCGP628, pCGP485, pCGP653, pCGP484 lub pCGP1458 wprowadza się do odmian róży, goździka lub chryzantemy, stosując transfer genów poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładach 10, 11 i 12. Integrację odpowiedniego genu chimerycznego dogenomu rośliny potwierdź się analiząSouthem roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej, a dla wykrycia obecności antocyjanów stosuje się analizę HPLC, jak to opisano w powyższym przykładzie 16. Rośliny, które udało się uczynić transgenicznymi, zdolne do ekspresji transgenu według niniejszego wynalazku, wykazują znaczący poziom aktywności enzymu 3’,5’ -hydroksylazy, jak również 3’,5’ -hydroksylowanych antocyjanów (por. przykład 16) w porównaniu z nietransgenicznymi roślinami kontrolnymi, które nie zawierają genu niezbędnego do wytwarzania aktywności 3’,5’ -hydroksylazy.

Przykład 19. Goździk odmiany Crowley Sim + pCGP 90

Do goździka odmiany Crowley Sim wprowadzono plazmid pCGP90, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 10. Integrację sekwencj i do genomu rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dziewięć roślin badano na obecność genów nptII i Hf1 oraz na wytwarzanie delfinidyny. Osiem z dziewięciu analizowanych roślin było dodatnich zarówno ze względu na nptII, jak i Hf1, lecz w analizie HPLC nie udało się wykryć żadnego dowodu wytwarzania delfinidyny przez te rośliny (por. tabela 2; „kan” = kanamycyna).

Tabel a 2

Lp.	Nr	Kan	Hf1	Delfinidyna
1	1930A	+	+	-
2	1942B	+	+	-
3	2008B	-	-	-
4	2217A	+	+	-
5	2217B	+	+	-
6	2338A	+	+	-
7	2338B	+	+	-
8	2338C	+	+	-
9	2338D	+	+	-

Przykład 20. Goździk odmiany Laguna + pCGP 485

Do goździka odmiany Laguna wprowadzono plazmid pCGP485, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 10. Integrację sekwencji do genomu rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dla wykazania obecności 3’,5’ -hydroksylowanych pochodnych antocyjanów przeprowadzono analizę HPLC cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, zgodnie z procedurą opisaną w powyższym przykładzie 16. Te 3’,5’ -hydroksylowane antocyjany wytwarzane są tylko dzięki ekspresji egzogennej sekwencji DNA, tzn. sekwencji Hf1 cDNA, wprowadzonej poprzez transformację binarnym wektorem pCGP485.

Przykład 21. Róża odmiany Royalty + pCGP 485/pCGP 628

Do róży odmiany Royalty wprowadzono plazmidy pCGP485 i pCGP628, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 11. Integrację sekwencji do genomu

177 743 rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dla wykazania obecności 3’,5’ - hydroksylowanych pochodnych antocyjanów przeprowadzono analizę HPLC cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, zgodnie z procedurą opisaną w powyższym przykładzie 16. Te 3’,5’ -hydroksylowane antocyjany wytwarzane sątylko dzięki ekspresji egzogennej sekwencji DNA, tzn. sekwencji Hf1 cDNA, wprowadzonej poprzez transformację binarnym wektorem pCGP485 lub pCGP628.

Przykład 22. Róża odmiany Kardinal + pCGP 1458

Do róży odmiany Kardinal wprowadzono plazmid pCGP1458, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 11. Integrację sekwencji do genomu rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dla wykazania obecności 3’,5’ -hydroksylowanych pochodnych antocyjanów przeprowadzono analizę HPLC cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, zgodnie z procedurą opisaną w powyższym przykładzie 16. Te 3’,5’ - hydroksylowane antocyjany wytwarzane sątylko dzięki ekspresji egzogennej sekwencji DNA, tzn. sekwencji Hf1 cDNA, wprowadzonej poprzez transformację binarnym wektorem - pCGP1458.

Przykład 23. Chryzantema odmiany Blue Ridge + pCGP 484/pCGP485/pCGP628

Do chryzantemy odmiany Blue Ridge wprowadzono plazmidy pCGP484, pCGP485 i pCGP 628, stosując transfer genu poprzez Agrobacterium, jak to opisano w przykładzie 12. Integrację sekwencji do genomu rośliny potwierdzono analizą Southern roślin uzyskanych po selekcji kanamycynowej. Dla wykazania obecności 3’, 5’ -hydroksylowanych pochodnych antocyjanów przeprowadzono analizę HPLC cząsteczek antocyjanów, obecnych w wyciągach z płatków, zgodnie z procedurą opisaną w powyższym przykładzie 16. Te 3’, 5’ -hydroksylowane antocyjany wytwarzane sątylko dzięki ekspresji ezgogennej sekwencji DNA, tzn. sekwencji Hf1 cDNA,wprowadzonej poprzez transformację binarnym wektorem pCGP484, pCGP485 lub pCGP 628.

Przykład 24. Zmiana kwiatostanu

Ekspresja aktywności wprowadzonego enzymu 3’,5’ -hydroksylazy flawonoidowej rośliny transgenicznej może wywierać istotny wpływ na zabarwienie kwiatu. Tkanki kwiatowe w roślinach transgenicznych mogą ulegać zmianie, w porównaniu z bladoróżowym lub czerwonym zabarwieniem nietransgenicznych roślin kontrolnych, do barw z zakresu od ciemnoróżowej/kasztanowatej do niebieskiej/purpurowej. Barwy można również opisywać w odniesieniu do numerów Karty Barw Królewskiego Towarzystwa Ogrodniczego. Ogólnie rzecz biorąc, zmiany można opisać jako przejście zabarwienia z odcieni różu bladego lub o średnim natężeniu, odpowiadających 60C/D - 65C/D, do odcieni ciemniejszych, bardziej niebieskich/purpurowych, jak na wielu spośród kwadratów barwnych 70-85 (jednak nie na wszystkich z nich). Należy pamiętać, że inne warunki biochemiczne i fizjologiczne mogą wpływać na poszczególne przypadki i wspomnianych w niniejszym opisie konkretnych barw nie należy interpretować jako definiowania możliwego zakresu.

W przypadku transgenicznego goździka, o numerze nabycia 3655, wytwarzanego z zastosowaniem wyżej opisanej sekwencji plazmidowej pCGP653, zaobserwowano ewidentny wpływ na zabarwienie płatków, tzn. uzyskanie koloru bardziej niebieskiego. Goździki odmiany Red Sim, wykazujące zwykle zabarwienie pomarańczowoczerwone (odpowiadające mniej więcej 45A/B Karty Barw Królewskiego Towarzystwa Ogrodniczego), zmieniły odcień na niebieski/purpurowy.

Dla specjalisty oczywiste jest, że opisany wynalazek można stosować w różnych odmianach i modyfikacjach, odmiennych od konkretnie przedstawionych w niniejszym opisie. Należy rozumieć, że zakres wynalazku obejmuje wszystkie takie odmiany i modyfikacje. Zakresem wynalazku objęte są również wszystkie etapy, cechy, kompozycje i składniki, wspomniane i wskazane w niniejszym opisie, pojedynczo lub zbiorczo, w dowolnej i we wszystkich kombinacjach dowolnych dwóch lub więcej etapów lub cech.

177 743

Literatura

Bethesda Research Laboratories. BRL pUC host: E. coli DH5a ™ competent cells. Bethesda Res. Lab. Focus 8(2):9, 1986.

Bevan, M. Nucleic Acid Res. 12:8711-8721, 1984.

Brugliera, F., Holton, T.A., Stevenson, T.W., Farcy, E., Lu, C-Y. i Cornish, E. C., Plant J.

5(1):81-92, 1994.

Comai, L., Moran, P. i Maslayr, D., Plant Molecular Biology 15:373-381, 1990. Dellaporta, S. J., Wood, J. i Hick, J. B., Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21,1983.

Ebel, J. i Hahlbrock, K., w: The Flavonoids: Advances Research Since 1980. Red.: Harborne, J. B., Academic Press, New York, Stany Zjednoczone, 641 -679, 1988.

Forkmann, G. Plant Breeding 106: 1-26, 1991.

Garfinkel, D. J. i Nester, E. W., J. Bacteriol. 144:732-743,1980.

Hahlbrock, K., i Grisebach, H., Annu. Rev. Plant Physiol. 30: 105-130, 1979.

Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166: 557, 1983.

Holton, T. A., praca doktorska, University of Melbourne, Australia, 1992.

Holton, T. A. i Graham, M. W., Nucleic Acid Res., 19:1156, 1991.

Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., Eichholz, D.,

Rogers, S. G. i Fraley, R. T., Science 227: 1229-1231,1985.

Inoue, H., Nojima, H. i Okayama, H., Gene 96: 23-28,1990.

Jannsen, B-J. J. i Gardner, R. C., Plant Mol. Biol. 14: 61-72, 1989.

Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. i Bevan, M. W., EMBO J. 6(13): 3901-3907,1987. Kandreck, K. A. i Black., N. D., Growing media for ornamental plants and turf., str. 317,

NSW University Press, Kensington, Australia, 1984.

Koes. R. F. Genes involved in flavonoid biosynthesis in Petunia hybrida: The chalcone synthase multigene family. Praca doktorska, Vrije Universiteit, Amsterdam, Holandia, 1988.

Lazo, G. R., Pascal, A. S. i Ludwig, R. A., Bio/technology 9: 969^-^7^(537,1991. McDonnell, R. E., Clarke, R. D., Smith, L. A. i Hinchee, M. A., Plant Mol. Biol. Rep., 4:

380-386, 1987.

Manning, K. Anal. Biochem. 195: 45-50,1991.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (wydanie II). Cold Spring Harbor laboratory Press, Stany Zjednoczone, 1989.

Schram, A. W., Jonsson, L. M. V. i Bennink, G. J. H., „Biochemistry of flavonod synthesis in Petunia hybrida”, w:

Petunia, pod red. Sink, K. C., Springer-Verlag, Berlin, Niemcy, str. 68-75, 1984. Sommer, H. i Saedler, H., Mol. Gen. Genet., 202: 429-434, 1986.

Stafford, H. A., Flavonoid Metabolism, CRC Press, Inc., Boca Raton, Floryda, Stany Zjednoczone, 1990.

Stotz, G. i Forkmann, G., Z. Naturforsch 37c: 19-23,1982.

Vercruysse, S. A. R., Delcour, J. A. i Dondeyne, P., J.

Chromatography 324: 495-497,1985.

Wiering, H. i De Vlaming, P., „Inheritance and Biochemistry ofPigments”, w; Petunia, pod red. Sink, K. C.,

Springer-Verlag, Berlin, Niemcy, str. 49-^fS, 1984.

ΠΊ 743

Fig. 1

177 743

Tetrahydroksychalkon

ICHI

HO,

OH

HO 0

Naringenina |F3H ^ηο'τΔχ>οη

HO O °^HDihydrokaempferol

DFR

3'Hydroksylaza

HO.

UFGT

-OH O-GIc

3',5*Hydroksylaza

HO θ'²¹'

Pełargonidyno-3-giukozyd ιΠίΊΙ-Ι 3'.5’-Hydroksylaza lit OH OH

HO O

Dihydrokwercetyna

HO O

Dihydromirecetyna

Fig. IA

ΠΊ 743 η Ο ^ΟΗ HQ

ΊξΚΜΧΟΗ 3',5'-Hydroksyl V Υ ΟΗ Laza

ΗΟ Ο

XX

ΗΟΟ

ΟΗ

ΟΗ ΟΗ'ΟΗ

Dihydrokwercetyna

DFR

ΗΟ.

UFGT

ΟΗ Ώ>~ ΟΗ

Dihydromirycetyna

DFR I UFGTy nu ^H0XX?

HO O-Glc

Delfinidyno-3-glukozyd

HO O-Glc

Cyjanidyno-3-glukozyd

Cyjanidyno-3-nrtynozyd

HQ

Glu-O

OH OH

OH

O-GIc-O-Rha-pCum Glc-O O-GIc-O-Rha-pCum —Delfinidyno-3 (ρ-Kumarylo) Rttynozydo-5-Glukozyd

OH O>-OH ^HCX^

Cyjanidyno-3(p-Kumarylo) Rutynozydo-5-Glukozyd

CHo :o>-oh

OCH₃sy-0H

HO.

Glu-0 O-GIc-O-Rha-pCum

Peonidyno-3(p-Kumaryló)Ku.ćynozydo-5-Glukozyd

Fig.l B

HO

(0X5

OH

O-GIc-O-Rha-pCum

Petunidyno-3-(p-Kumarylo)Rutynozydo-5-Glukozyd

Glc-0

OCH o f»-OH

OCH₃O-GIc-O-Rha-pCum

Malwidyno-3-(p-Kumarylo) Rutynozydo-5-Glukozyd

177 743

BamHI Xhol

GUS

Fig. 2

Xhol RB Hindlll

pCGP485

18.10 Kb

Fig. 3 m 743

Fig. 5

Fig.

Maci

nptll

17.97 Kb

KpnI mas3‘ v//_7/

sp718 mas3'

177 743

Pstl

\O

2P

E

177 743

rώ £

177 743

2 3 5 6 8 9 10 11 12 17 Ν

24 29 30 31 39 47 48 51 Ν

Fig. 8

I

177 743

Fig. 9

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł..

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób uzyskiwania nowej barwy rośliny ozdobnej, znamienny tym, że do komórek rośliny wprowadza się wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny, w którego skład wchodzi promotor pochodzący z genu kodującego enzym szlaku flawonoidów oraz kontrolowana przez ten promotor sekwencj a koduj ąca 3’ ,5 ’ -hydroksylazę flawonoidową, zwiększa się ilość wytwarzanych antocyjanidynowych pochodnych antocyjanów pochodzących od delfinidyny wywołując ekspresję genu chimerycznego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidową pochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, w szczególności z petuni lub lisianthusa.
3. Sposób według dowolnego z zastrz. 1, znamienny tym, że promotor pochodzi z genu kodującego syntetazę chalkonową (CHS).
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprowadzanym wektorem binarnym jest plazmid wybrany z grupy, do której nale&ąpCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki roślinne pochodząz rośliny takiej jak róża, goździk albo chryzantema.
6. Wektor binarny zawierający rekombinowany gen chimeryczny, w którego skład wchodzi promotor pochodzący z genu kodującego enzym szlaku flawonoidów oraz kontrolowana przez ten promotor sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidową.
7. Wektor binarny według zastrz. 6, znamienny tym, że sekwencja kodująca 3’,5’ -hydroksylazę flawonoidową pochodzi z petunii, werbeny pospolitej, ostróżki ogrodowej, winorośli, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka, bakłażana, lisianthusa lub dzwonka, w szczególności z petunii lub lisianthusa.
8. Wektor binarny według zastrz. 6, znamienny tym, że promotor stanowi promotor genu

CHS.
9. Wektor binarny według zastrz. 6, znamienny tym, że jest to plazmid wybrany z grupy, do której należą pCGP484, pCGP485, pCGP653 i pCGP1458.

* * *

Przedmiotem niniejszego wynalazku sątransgeniczne rośliny kwitnące. W szczególności, przedmiotem niniejszego wynalazku sątransgeniczne róże, goździki i chryzantemy, zmodyfikowane genetycznie w taki sposób, aby umożliwić ekspresję 3’,5’ -hydroksylazy flawonoidowej, umożliwiając w ten sposób manipulację substancjami pośrednimi w szlaku przemian flawonoidów.

W przemyśle kwiatowym dąży się do opracowania nowych, różnych odmian roślin kwitnących, o ulepszonej charakterystyce, od odporności na choroby i patogeny aż do zmian kwiatostanu. Jakkolwiek zastosowanie klasycznych technik hodowli dało pewne rezultaty, sposób ten ma pewne ograniczenia, związane z pulą genetyczną danego gatunku. Tak więc np. rzadko zdarza się, aby ujednego gatunku występował pełny zakres odmian barwnych. W związku z tym trwają prace nad wytworzeniem roślin transgenicznych, wykazujących pożądaną charakterystykę. I tak np. opracowanie niebieskich odmian głównych gatunków kwiatów ciętych, takich jak róża, goździk i chryzantema, byłoby bardzo korzystne dla rynku kwiatów ciętych i rynku roślin ozdobnych.

ΠΊ 743

Barwa kwiatów zależy przede wszystkim od typów barwników: flawonoidów i karotenoidów. Flawonoidy odgrywąjąrolę w powstawaniu barw od żółtej do czerwonej i niebieskiej. Karotenoidy nadają zabarwienie pomarańczowe lub żółte; stanowią one zwykle jedyny barwnik w kwiatach żółtych i pomarańczowych. Cząsteczki flawonoidów, odgrywające największą rolę w zabarwieniu kwiatów, stanowią antocyjany, które sąglikozylowanymi pochodnymi cyjanidyny, delfinidyny, petunidyny, peonidyny, malwidyny i pelargonidyny, i znajdują się w wakuoli. Różne antocyjany mogą dawać wyraźne różnice zabarwienia. Barwa kwiatów zależnajest również od kopigmentacji flawonoidami bezbarwnymi, kompleksami metali, od glikozylacji, acylacji, metylacji i wpływu pH wakuoli (Forkmann, 1991).

Szlak biosyntezy barwników flawonoidowych (zwany w dalszej części niniejszego opisu „szlakiem flawonoidowym”) jest dobrze znany; przedstawiono go na Fig. 1 (Ebel i Hahlbrock, 1988;HahlbrockiGrisebach, 1979, Wiering i de Vlaming, 1984; Selmami wsp., 1984, Stafford, 1990). W pierwszym etapie szlaku zachodzi kondensacja trzech cząsteczek malonylo-CoA z jedną cząsteczką p-kumarylo-CoA. Reakcję tę katalizuje enzym syntetaza chalkonowa (CHS). Produkt tej reakcji, 2’,4,4’, 6’ -czterohydroksychalkon, w warunkach prawidłowych szybko ulega reakcji izomeryzacji z wytworzeniem naringeniny, przy udziale enzymu izomerazy chalkonowo-flawanonowej (CHI). Następnie naringenina jest hydroksylowana w pozycji 3 pierścienia centralnego przez 3-hydroksylazę flawanonową(F3H), a produktem reakcji jest dihydrokaempferol (DHK).

Pierścień B dihydrokaempferolu może ulegać hydroksylacji w pozycji 3’ lub w pozycjach 3’ i 5’, z wytworzeniem, odpowiednio, dihydrokwercetyny (DHQ) i dihydromirycetyny (DHL). Kluczowe enzymy w tym szlaku stanowią 3’ -hydroksylaza flawonoidowa i 3’,5’ -hydroksylaza flawonoidowa, 3 ’ -hydroksylaza flawonoidowa katalizuje reakcję DHK z wytworzeniem DHQ i reakcję naringeniny z wytworzeniem eriodiktiolu. 3’,5’ - hydroksylaza flawonoidowa (zwana w dalszym ciągu niniej szego opisu 3’ „5 ’ -hydroksyazzą) saanowi enzym o szerokim spektrum, kaaalizujący hydroksylację naringeniny i DHK w pozycjach 3’ i 5’ oraz hydroksylację eriodiktiolu i DHQ w pozycji 5 ’ (SSoSz i Forkmamn, 1982!), przy czym w obu tych przypadkach powstają, odpowiednio, pentahydroksyflawanon i DHM. Wzorzec hydroksylacji pierścienia B antocyjanów odgrwa kluczową rolę w powstawaniu zabarwienia płatków.

Z powodu omówionych wyżej ograniczeń, związanych z pulą genową, wiele głównych gatunków kwiatów ciętych nie posiada 3’,5’ -hydroksylazy, w związku z czym nie uzyskuje się pełnego spektrum barw, które w przeciwnym wypadku byłoby możliwe do uzyskania. Dotyczy to w szczególności róż, goździków i chryzantem, które stanowią większą część światowego rynku kwiatów ciętych. Istnieje zatem potrzeba modyfikacji roślin, w szczególności róż, goździków i chryzantem, dla wytworzenia roślin ttaesgenicznych, zdolnych do wytwarzania 3’,5’ -hydroksylazy z zapewnieniem środków modulacji metabolizmu DHK, jak również metabolizmu innych substratów, takich jak DHQ, naringenina i eriodiktiol. Taka modulacja dotyczy wzorca hydroksylacji aetocyjaeów i umożliwia wytwarzanie anSocyjanów pochodnych delfinidyny i w ten sposób zmianę zabarwienia płatków, oraz osiągnięcie przez pojedynczy gatunek pełnego spektrum zabarwienia kwiatów; W szczególności, istnieje potrzeba wytworzenia roślin ttaesgeeicsnych, wytwarzających duże ilości antocyjanów pochodnych delfinidyny. Według niniejszego wynalazku, wytwarza się sekwencje genów dla wytworzenia roślin Sransgeniczeych, wykazujących ekspresję wysokiego poziomu delfinidyny i/lub jej pochodnych, w porównaniu z nieSransgeeicznymi roślinami tego samego gatunku. Wytwarzanie tych dużych ilości delfinidyny i pochodnych cząsteczek jest w szczególności korzystne dla wytwarzania roślin wykazujących zmienione właściwości kwiatostanu.