JP2000023686A - フラボノイド３′，５′―ヒドロキシラ―ゼ活性を有する蛋白質及びそれをコ―ドする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フラボノイド系色素の合成に関与する酵素を
コードする遺伝子の提供。 【解決手段】 ペチュニア、ベーベナ、ヒエンソウ、ブ
ドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、
ホテト、パンジー、ナスなどに由来するフラボノイド
３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子又は
その修飾体が提供され、この遺伝子を植物に挿入するこ
とにより、例えば、花の色を人工的に変えた植物などを
得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一般にフラボノイド
経路代謝酵素をコードする遺伝子配列並びに植物及び他
の生物体における色素形成の操作におけるごときその使
用に関する。

【０００２】

【従来の技術】花類産業は開花植物の新規且つ種々の品
種を開発することに努力している。この様な新規な品種
を創成するための有効な方法は花の色の操作を通してで
あり、そして古典的な育種技法を用いて、花類のほとん
どの商業的品種について広範囲な色を生成することに幾
分成功している。しかしながら、この方法は、特定の種
の遺伝子プールの束縛により制限され、そしてこの理由
のため単一の種が広範囲の種類の着色品種を有すること
はまれである。

【０００３】確かに、青色花の入手可能性が制限されて
いるために、1988年にオランダにおけるオークションで
売られた青色の切花は５％未満であった。12種類の最も
よく売られている花の内、アイリスとフリージアのみが
青色の品種を提供しており、そしてこれらの品種が占め
る割合は全販売花の４％未満である。主要な切花用種、
例えばバラ、菊、カーネーション及びガーベラの青色品
種の開発は、切花市場及び観賞市場の両者においてかな
りの機会を提供するであろう。

【０００４】花の色は主として２つのタイプの色素、す
なわちフラボノイド及びカロチノイドに基く。フラボノ
イドは黄色から赤ないし青色の範囲に寄与する。カロチ
ノイドはオレンジ又は黄の色調に寄与し、そして一般に
黄色又はオレンジ色の花の唯一の色素である。花の色に
主たる寄与をするフラボノイド分子は、シアニジン、デ
ルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジン
及びペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であるアント
シアンである。異るアントシアンが色の顕著な変化を生
成することができる。花の色はまた無色のフラボノイド
の補助発色（co-pigmentation)、金属錯体形成、グリコ
シル化、アシル化、メチル化及び液胞のpHにより影響さ
れる（Forkmann 1991)。

【０００５】フラボノイド色素のための生合成経路（以
後、「フラボノイド経路と称する）はよく確立されてお
り、そして図１及び２に示される（Ebel及びHahlbrock,
1988;Hahlbrock and Grisebach,1979;Wiering and de U
laming,1984;Schramら、1984;Stafford,1990）。この経
路の第一の必須の段階は３分子のマロニル-CoAと１分子
のｐ−クマロイル-CoAとの縮合を含む。この反応はカル
コン合成酵素(chalcone synthase;CHS）により触媒され
る。この反応の生成物である２′，４，４′，６′−テ
トラヒドロキシカルコンは通常、カルコン・フラバノン
・イソメラーゼ（CHI)酵素により急速に異性化され、ナ
リンゲニンを生成する。次に、ナリンゲニンはフラバノ
ン３−ヒドロキシラーゼ（F3H)により中央環の３位にお
いてヒドロキシル化されジヒドロケンフェロール（dihy
drokaempferol;DHK)を生成する。

【０００６】ジヒドロチンフェロールのＢ環は３′位、
又は３′位及び５′位の両方においてヒドロキシル化さ
れて、それぞれジヒドロケルセチン（dihydroquerceti
n;DHQ）及びジヒドロミリセチン（dihydromyricetin;DH
M）を生成することができる。この経路に関与する２つ
の必須の酵素はフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ
（以後、３′−ヒドロキシラーゼと称する）及びフラボ
ノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ（以後、３′，
５′−ヒドロキシラーゼと称する）である。３′，５′
−ヒドロキシラーゼはヒドロキシル化を触媒する広範囲
酵素であって、ナリンゲニン及びDHK の３′及び５′位
並びにエリオジクチオール及びDHQ の５′位（Stotz 及
びForkmann,1982)のヒドロキシル化を触媒し、それぞれ
ペンタヒドロキシフラバノン及びDHM を生成する。Ｂ環
のヒドロキシル化のパターンが花弁の色の決定において
必須の役割を演ずる。

【０００７】ミクロソーム抽出物中のフラボノイド３′
−ヒドロキシル化はNADPH 及びO₂並びにナリンゲニン又
はDHK のいずれかを必要とする。パセリの細胞培養物の
細胞培養物の酵素がよく研究されている（Hagmann ら、
1983）。一酸化炭素、シトクロムｃ及びNADP⁺ による阻
害が示すところによれば、この酵素はシトクロムP450関
連酵素である。類似の酵素、活性がトウモロコシにおい
て証明されている（Larson及びBussard,1986）。３′，
５′−ヒドロキシラーゼもまたシトクロムP450クラスの
酵素である。シトクロムP450酵素は自然界に広く分布し
ており、そして脊椎動物、酵母、菌類、細菌及び１種の
植物において特性決定されている。少なくとも154 のシ
トクロムP450遺伝子の配列が決定されており、そしてこ
れらの遺伝子は27の異る遺伝子ファミリーに類別されて
いる（Nebertら、1991）。１つのファミリー内において
P450蛋白質配列は一般に40％以上の同一性を有するが、
同一のサブファミリー内では46％以上の同一性が存在す
る（Nebertら、1991）。

【０００８】植物において３′もしくは３′，５′−ヒ
ドロキシラーゼ活性又はフラボノイド経路に含まれる他
の酵素を制御する可能性は、花弁の花を操作しそれによ
って単一種が広範囲の花色を発現することを可能にする
手段を提供するであろう。本発明に従って、３′，５′
−ヒドロキシラーゼのごときフラボノイド経路の酵素を
コードする遺伝子配列が同定されそしてクローン化され
た。これらの組換え配列はDHK 代謝並びにDHQ ，ナリン
ゲニン及びエリオディクチオール（eriodictyol)のごと
き他の基質の代謝の調節を可能にし、それによりアント
シアンのヒドロキシル化パターンを決定しそして花弁の
色を操作する手段を提供することを可能にする。しかし
ながら本発明は、花類のみならず、果実及び野菜植物並
びに例えば観賞用植物の葉に拡張される。

【０００９】従って、本発明の１つの観点は、ジヒドロ
カンフェロール（dihydrokaempferol;DHK)ヒドロキシル
化酵素をコードするヌクレオチドの配列又はそれをコー
ドする配列に相補的な配列を含んで成る核酸単離体、あ
るいはその誘導体又は部分を提供する。単に便宜上及び
手短かな表記により、「DHK ヒドロキシル化酵素」への
言及は、DHK,DHQ,ナリンゲニン，エリオディクトイルの
１つ又は複数に作用するフラボノイド経路のヒドロキシ
ル化酵素を包含する。

【００１０】好ましくは、DHK ヒドロキシル化酵素は
３′，５′−ヒドロキシラーゼである。しかしながら、
この酵素をコードする遺伝子配列をクローン化するため
に使用される方法は、３′−ヒドロキシラーゼのごとき
酵素をコードする他の遺伝子配列を単離するために使用
することもできよう。従って、この明細書において
３′，５′−ヒドロキシラーゼの単離及びクローニング
への言及は３′−ヒドロキシラーゼのごとき他のフラボ
ノイドヒドロキシル化酵素への言及を包含すると理解さ
れるべきである。

【００１１】「核酸単離体」なる用語は、非天然存在状
態にある遺伝子配列を意味する。これは一般に、その天
然状態から分離されていること、又はその天然環境にお
いて必ずしも遭遇しない方法により形成されたことを意
味する。さらに具体的には、それはインビトロで形成さ
れ又は維持される核酸分子、組換え又は合成分子、及び
異種核酸と組合わされた核酸を包含する。それはまた、
他の核酸配列に比べて少なくとも部分的に精製された後
の天然配列に拡張される。

【００１２】本明細書において使用する場合、「遺伝子
配列」とは、DHK ヒドロキシル化酵素、例えば３′，
５′−ヒドロキシラーゼ中のアミノ酸の配列を直接的に
特定するか又は塩基の相補的連続を介して特定するヌク
レオチド塩基の連続を意味する。核酸又はその相補形は
全長酵素又はその誘導体もしくは部分をコードすること
ができる。「誘導体」とは、天然酵素に対する任意の単
一の又は複数のアミノ酸置換、除去及び／又は付加を意
味する。これに関し、核酸は３′，５′−ヒドロキシラ
ーゼをコードする天然核酸配列を含み、あるいは該天然
配列に対して１又は複数のヌクレオチド置換、除去及び
／又は付加を含んでいてもよい。

【００１３】本明細書において予定される核酸配列はま
たは遺伝子プローブとして又は植物における対応する遺
伝子の発現を制御することができる「アンチセンス」分
子として有用なオリゴヌクレオチド配列を包含する。従
って、核酸又はその相補形が３′，５′−ヒドロキシラ
ーゼの「部分」をコードする場合、この様な核酸分子は
オリゴヌクレオチドプローブとしてあるいはポリメラー
ゼ連鎖反応のための又は種々の変異誘発技法におけるプ
ライマーとして有用であろう。

【００１４】本発明のDHK ヒドロキシル化酵素のそして
特に３′，５′−ヒドロキシラーゼのアミノ酸挿入誘導
体には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合体並
びに単一アミノ酸又は複数のアミノ酸の配列内挿入体が
含まれる。挿入アミノ酸配列変形体は蛋白質中の所定の
部位に１又は複数のアミノ酸残基が導入されたものであ
るが、得られる生成物の適切なスクリーニングを用いれ
ばランダム挿入も可能である。除去変形体は、配列から
の１又は複数のアミノ酸の除去により特徴付けられる。
置換アミノ酸変形体は、配列中の少なくとも１個の残基
が除去されそしてその位置に異る残基が挿入されている
ものである。典型的な置換は、次の表１に行って作られ
るものである。

【００１５】

【表１】

【００１６】３′，５′−ヒドロキシラーゼがアミノ酸
置換によって誘導体化される場合、アミノ酸は一般に、
類似の性質、例えば疎水性、親水性、電子陰性、大きい
側鎖等を有する他のアミノ酸により置き換えられる。ア
ミノ酸置換は典型的には単一残基によるものである。ア
ミノ酸挿入は通常約１〜10アミノ酸残基のオーダーであ
り、そして除去は約１〜20残基の範囲である。好ましく
は、除去又は挿入は隣接対において、すなわち２残基の
除去又は２残基の挿入として行われる。

【００１７】前記のアミノ酸変形体は、当業界において
よく知られているペプチド合成技法例えば固相合成法
（Merrifield,1964)等を用いて、又は組換えDNA 操作に
より作ることができる。既知の又は部分的に知られた配
列を有するDNA の所定の部位に置換変異を行う方法はよ
く知られており、そして例えばM13 変異誘発法を包含す
る。置換、挿入又は除去変形体として現われる変形体蛋
白質を製造するためのDNA 配残の操作は、例えばSambro
okら（1989）に従来から記載されている。

【００１８】本発明の３′，５′−ヒドロキシラーゼの
組換え又は合成変異体及び誘導体の他の例には、該酵素
と関連する任意の分子、例えば炭水化物、脂質及び／又
は蛋白質もしくはポリペプチドの１又は複数の置換、除
去及び／又は付加が包含される。「類似体」及び「誘導
体」なる用語はまた、３′，５′−ヒドロキシラーゼの
任意の機能的化学的同等物にそしてさらに前記のアミノ
酸誘導体に拡張される。

【００１９】本発明の核酸は、リボ核酸又はデオキシリ
ボ核酸であることができ、単鎖又は二本鎖であることが
でき、そして直鎖状又は共有結合により閉じられた環状
分子であることができる。本発明はまた、低い、好まし
くは中程度のそして最も好ましくは高いストリンジェン
シー条件下で本発明により予定される核酸分子とハイブ
リダイズする他の核酸分子に拡張される。他の用語で表
現すれば、本発明は、図９もしくは図10に示されるヌク
レオチド配列を有する核酸分子に、あるいはヌクレオチ
ド又はアミノ酸配列のレベルにおいて少なくとも35％、
好ましくは少なくとも45％、さらに好ましくは少なくと
も55％、さらに好ましくは少なくとも65〜70％、そして
一層好ましくは85％以上の類似性を有する分子（ここ
で、核酸は３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有する
酵素をコードするか又はそれをコードする配列に相補的
である）に拡張される。

【００２０】しかしながら、ヌクレオチド配列又はアミ
ノ酸配列は前記の％より低い類似性を有しそしてなおDH
K ヒドロキシル化酵素をコードすることができ、そして
この様な分子もそれらが相同性の領域を保存している場
合には本発明の範囲内に考えられることに注目すべきで
ある。本発明はまた、低い、好ましくは中程度のそして
最も好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、上に
予定された核酸分子の部分とハイブリダイズすることが
できるオリゴヌクレオチドプライマーの形の核酸分子に
拡張される。

【００２１】ここに予定される核酸分子は単独で存在す
ることもでき、又はベクター分子そして好ましくは発現
ベクターとの組合せにおいて存在することもできる。こ
の様なベクター分子は真核細胞及び／又は原核細胞中で
複製しそして／又は発現する。好ましくは、ベクター分
子又はその部分は植物ゲノムに組み込まれ得る。核酸分
子はまた、植物細胞中での核酸分子の発現を指令するこ
とができるプロモーター配列を含むことができる。核酸
分子及びプロモーターは、任意の手段により、例えばエ
レクトロポレーション又はアグロバクテリウム（Agroba
cterium)仲介移行により細胞に導入され得る。

【００２２】ペチュニアは今日最も便利で且つ好ましい
材料源を代表するので、本発明はペチュニア由来の核酸
配列を用いて例示される。しかしながら、当業者は、他
の植物又はある種の微生物のごとき任意の分離源から類
似の配列が単離され得ることをただちに理解するであろ
う。３′−ヒドロキシラーゼの遺伝特性はキンギョソウ
（Antirrhinum)、バーベナ（Verbena)及びペチュニア
（Petunia)の花並びにトウモロコシの実生及び糊粉層に
おいて知られている（Heller及びForkmann, 1988）。遺
伝子eos はキンギョソウ（Antirrhinum)において３′−
ヒドロキシラーゼを調節し（Forkmann及びStotz 198
1）、他方Ht１遺伝子及びPr遺伝子はそれぞれペチュニ
ア（Petunia)(Stotzら、1985）及びトウモロコシの糊粉
層（Larson及びBussard,1986）において同様の酵素を調
節する。

【００２３】例えば、バーベナ・ハイブリダ(Verbena h
ybrida) の化学遺伝学的（chemogenetic）研究が示すと
ころによれば、この植物において、アントシアニンのＢ
環の３′及び５′の両位置におけるヒドロキシル化は１
つの遺伝子により調節される（Beale,1940）。３′，
５′−ヒドロキシル化の酵素活性はデルフィニジン（de
lphinidin)生産株の花の抽出物中にのみ存在する（Stot
z 及びForkmann,1982)。３′及び５′位におけるヒドロ
キシル化のためのNADPH-依存性ミクロソーム酵素活性は
またカリステプス（Callistephus) 及びラチルス（Lath
yrus）の花抽出物中に証明された（Forkmann, 1991）。

【００２４】V.ハイブリダ（V.hydrida)の場合と同様
に、フラバノン類及びジヒドロフラバノン類の３′，
５′−ヒドロキシル化のための酵素活性は花に３′，
４′，５′−ヒドロキシル化されたフラボノイド化合物
（又はそれらのメチル化誘導体）を含有する株の花抽出
物中にのみ存在することが見出された。従って、３′，
４′，５′−ヒドロキシル化フラボノイド類の生成は明
らかにフラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性
に依存する。

【００２５】３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードす
る遺伝子は、カリステプス（Callistephus)(Ｒ）、ペチ
ュニア（petunia)（Hf１，Hf２）及びベルベナ（Verben
a)（Ｐ）を含めて多くの観賞用植物において、デルフィ
ニジンを生産することができない対応する変異株の存在
によって同定されている。さらに、各酵素活性が証明さ
れている（Forkmann,1991)。３′，５′−ヒドロキシラ
ーゼはまたミクロソームのシトクロムP450酵素であると
考えられた（Heller及びForkmann, 1988）。しかしなが
ら、これらの及び他の植物種からの３′，５′−ヒドロ
キシラーゼ遺伝子のクローニングの公表された報告は存
在しない。

【００２６】３′，４′，５′−ヒドロキシル化フラボ
ノイド又はそれらの誘導体を生産することができる他の
植物種には、アジサイ（Kakeduら、1985）、ヒエンソウ
（Asenら、1975）、リシアンサス（Lisianthus）（Asen
ら、1986）、トマト（von Wettstein-Knowles,1986）及
びポテト（Harborne及びSimmonds,1968)が含まれる。こ
れらの種又は３′，４′，５′−ヒドロキシル化フラボ
ノイドを生産することができる他の植物もまた３′，
５′−ヒドロキシラーゼ遺伝子の単離源として適当であ
ろう。フラボノイド経路の酵素（例えば、３′，５′−
ヒドロキシラーゼ）を直接又は間接にコードするこの様
なすべての核酸配列は、その由来に関係なく本発明に含
まれる。

【００２７】同様に、本明細書に略記する遺伝子クロー
ニング法を用いて、３′，４′，５′−ヒドロキシル化
フラボノイド類を生産する他の植物から３′，５′−ヒ
ドロキシラーゼ遺伝子を単離することができる。実験手
順の些細な変更は要求されるかもしれないが、本明細書
に記載するのと同じ技法を用いて、類似の遺伝子配列を
検出し、単離しそしてクローン化するためにここに開示
されるクローン及びオリゴヌクレオチドを用いることが
できる。その様な些細な変更のすべてが本発明に含まれ
る。３′，５′−ヒドロキシラーゼのごとき酵素の他の
適当な入手源の例には、バーベナ、ヒエンソウ、ブド
ウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラメン、ポ
テト、パンジー及びナスが含まれる。

【００２８】本発明に従えば、３′，５′−ヒドロキシ
ラーゼのごときDHK ヒドロキシル化酵素をコードする核
酸配列をトランスジェニック植物に導入しそして発現さ
せ、それにより、植物細胞中で合成されるなら、DHK 及
び／又は他の適当な基質を、最終的に、アントシアニジ
ンのアントシアニン誘導体、例えばデルフィニジン、ペ
チュニジン又はマルビジン（malvidin）に転換すること
ができる。これらのアントシアニンの生産は青色及び青
様色の種々の色相の形成に寄与する。植物における核酸
配列の発現は構成的、誘導的又は発生段階に依存的（de
velopmental)であることができる。

【００２９】従って、本発明の他の観点は組換えDHK ヒ
ドロキシル化酵素又はその活性変異体もしくは誘導体を
発現することができるトランスジェニック植物の製造方
法を提供し、この方法は適当な植物の細胞に前記DHK ヒ
ドロキシル化酵素をコードするヌクレオチド配列を含ん
で成る核酸を、該核酸分子の最終的発現を最終的に許容
する条件下に導入し、トランスジェニック植物を該細胞
から再生し、そして該トランスジェニック植物を、前記
核酸の発現を可能にするのに十分な期間及び条件で生長
せしめることを含んで成る。

【００３０】好ましい態様において、本発明は変化した
開花を発現するトランスジェニック花植物の製造方法を
含み、この方法は、適当な植物の細胞に、本発明の核酸
配列を該核酸の最終的発現を許容する条件下に導入し、
該細胞からトランスジェニック植物を再生し、そして該
核酸配列のDHK ヒドロキシル化酵素への発現を可能にす
るために十分な時間及び条件で生長せしめることを含ん
で成る。

【００３１】好ましくは、DHK ヒドロキシル化酵素は
３′，５′−ヒドロキシラーゼであり、発生段階に依存
的（dvelopmental）に制限され、そして変化した花は受
容体植物の生理由条件に依存して青色もしくは赤色の花
又は他の色の色相の生成を誘導する。「適当な植物」と
は、３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素のための基質を
生産することができ、そして所望の色の発生のために必
要な適当な生理的性質及び遺伝子型を有することができ
る植物を意味する。これはバラ、ペチュニア、カーネー
ション、キク及びガーベラを包含するがこれに限定され
ない。幾つかの植物種においては、平均花弁液泡pHより
高いpHを有する品種として定義される「高pH系」を選択
することが望ましいであろう。組換え３′，５′−ヒド
ロキシラーゼ又はその変異体及び誘導体の源は前記した
通りであり、そしてペチュニア、バーベナ、ヒエンソ
ウ、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シクラ
メン、ポテト、パンジー又はナス由来の酵素を含む。

【００３２】当業者は、この方法に適用可能な変法、例
えば標的植物に天然に存在する酵素の発現の増加又は減
少を認識するであろう。これは色の異る色相、例えば青
又は赤の異る色相を導くであろう。標的酵素、例えば
３′，５′−ヒドロキシラーゼの活性を低下させるた
め、この酵素又はその種々の部分をコードする核酸配列
をアンチセンス配向において使用することができるであ
ろう。本発明はいずれか１つの理論に限定することを望
むわけではないが、この様なアンチセンス核酸配列は酵
素について特定される天然mRNAの全部又は部分とデュプ
レックスを形成する可能性がある。あるいは標的核酸配
列を不活性化するためにリボザイムを使用することがで
きる。

【００３３】従って本発明は、組換えジヒドロカンフェ
ロール（DHK)ヒドロキシル化酵素を発現することができ
るか、又はDHK ヒドロキシル化酵素に翻訳され得るmRNA
分子の全部又は部分に実質的に相補的な核酸配列の転写
を指令するトランスジェニック核物の製造方法に拡張さ
れ、この方法は、適当な植物の細胞に、本発明の核酸単
離体を、該核酸単離体の最終的発現を許容する条件下に
導入し、該細胞からトランスジェニック植物を再生し、
そして該核酸単離体の発現を可能にするのに十分な時間
及び条件で該トランスジェニック植物を生長せしめるこ
とを含んで成る。この態様において、適当な受容植物は
特にアイリス、チューリップ、ユリ、リシアンサス（Li
sianthus）、フリージア、ヒエンソウ、リモニウム（Li
monium）及びペラルゴニウム（Pelargonium)に拡張され
る。

【００３４】従って、トランスジェニック植物を製造す
るための上記の方法は、アンチセンスmRNA又はオリゴヌ
クレオチドをコードする遺伝子又はDNA 断片を、３′，
５′−ヒドロキシラーゼをコードするか又はこれをコー
ドする配列に相補的なヌクレオチド配列のすべて又は部
分又は領域に導入するという別法に拡張される。

【００３５】従って、本発明は、本発明の核酸配列のす
べて又は部分、あるいはそのアンチセンス形、及び／又
はその任意の同族体又は変化した形を含有するすべての
トランスジェニック植物、そして特に変化した花を示す
トランスジェニック植物に拡張される。従って、トラン
スジェニック植物は、DHK ヒドロキシル化酵素をコード
するか又はそれをコードする配列に相補的なヌクレオチ
ド配列を含んで成る安定に導入された核酸分子を含有
し、そして特に、上記のような導入された核酸配列を単
離する高pH植物系である。本発明はまた、この様なトラ
ンスジェニック植物からの種子に関する。この様な種子
は、特に着色されていれば、植物のための所有標識とし
て有用であろう。

【００３６】本発明のさらなる観点は、DHK が水分解酵
素の組換え形、特に組換え３′，５′−ヒドロキシラー
ゼに向けられる。本酵素の組換形は、例えば、さらに活
性な酵素を開発するための研究用材料源を提供し、そし
て着色された化合物の製造のためのインビトロ系を開発
するために有用であろう。本発明の他の観点は、植物か
らのシトクロムP450分子又は類似の分子をコードするか
又はそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチ
ド配列を含んで成る核酸分子のクローニング方法を含
み、この方法は、既知ミクロソームのシトクロムP450分
子の１又は複数のコンセンサス配列に由来するヌクレオ
チド配列を有する１又は複数のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応による前記植物の
細胞からの核酸分子の適当な調製からのクロモソームP4
50ヌクレオチド配列又は相補的配列の増幅を含んで成
る。

【００３７】関連する態様において、シトクロムP450核
酸分子又はその相補的配列をクローニングする方法は、
適当なcDNAライブラリーから既知のシトクロムP450分子
の１又は複数のコンセンサス配列に対応する１又は複数
のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする
ことができるクローンを選択することを含んで成る。

【００３８】好ましくは、コンセンサス配列の１つはシ
トクロムP450分子のヘム結合ドメインからのものであ
り、さらに好ましくはF(G,S)XGXRXCXG（ここでＸは任意
のアミノ酸である）又はPGFAGRRICPG である。最も好ま
しい態様において、クローニングされるべき核酸は、DH
K ヒドロキシル化酵素、そして特に３′，５′−ヒドロ
キシラーゼをコードするか又はそれをコードする配列に
対して相補的である。さらに好ましくは、３′，５′−
ヒドロキシラーゼは前に記載したようなものであり、そ
してさらに詳しくは図21〜27に示すようなアミノ酸配列
を有するか又はヌクレオチド配列によりコードされ、あ
るいは前に定義したようにそれに類似性を有する。

【００３９】次に、図及び例に言及しながら本発明をさ
らに記載するが、それらに限定されるものではない。図
１及び図２はフラボノイド色素の生合成経路の模式図で
ある。経路の最初の部分に関与する酵素は次のように表
示されている。PAL ＝フェニルアラニン・アンモニア−
リアーゼ；C4H ＝シンナメート・４−ヒドロキシラー
ゼ；4CL ＝４−クマレート；CoA リアーゼ；CHS ＝カル
コンシンサーゼ；CHI ＝カルコンフラボンイソメラー
ゼ；F3H ＝フラバノン・３−ヒドロキシラーゼ；DFR ＝
ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ；UFGT＝UDP
−グルコース：フラボノイド−３−Ｏ−グルコシルトラ
ンスフェラーゼ。後の段階はＰ．ハイブリダ（P.hybrid
a)の花において起こる変換に対応し、そして１＝シアニ
ジン−３−グルコシド及びデルフィニジン−３−グルコ
シドのグルコシル残基へのラムノース糖の付加；２＝ア
シル化及び５−Ｏ−グルコシル化；３＝３′−メチル
化；４＝５′−メチル化；５＝３′，５′−メチル化を
含む。

【００４０】図３は、Ｐ．ハイブリダcv V23（Hf１／Hf
１，Hf２／Hf２）の花弁抽出物中の３′，５′−ヒドロ
キシラーゼ活性、及びＰ．ハイブリダcv R51（hf１／hf
１，hf２，hf２）における３′，５′−ヒドロキシラー
ゼ活性の失損を示す。３′，５′−ヒドロキシラーゼ活
性は³H−ナリンゲニンの３′−及び３′，５′−ヒドロ
キシル化誘導体エリオジクチオール（eriodictyol)及び
ペンタヒドロキシフラバノンへの転換により検出され
た。この図の左側に、反応の基質ナリンゲニン並びに
３′−ヒドロキシラーゼ生成物エリオジクトール及び
３′，５′−ヒドロキシラーゼ反応の生成物ペンタヒド
ロキシフラバノンが示されている。

【００４１】TLC プレート上の基質及びヒドロキシル化
生成物の位置がこの図の右側に示されており、これは左
から右に、Ｐ．ハイブリダcv V23及びＰ．ハイブリダcv
R51からの花の花弁抽出物により生成される反応生成物
並びにNADPH が反応混合物から省略された場合にナリン
ゲニンのヒドロキシル化が生じないことを示す対照のオ
ートラジオグラフを示す。

【００４２】図４は、異る発達段階におけるＰ．ハイブ
リダcv Old Glory Blue （OGB)花の花弁抽出物中の
３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を示す。左から右
に、TLC プレートのオートラジオグラフは（１）段階１
の花〔未着色、閉じたつぼみ（長さ＜25mm）〕：ナリン
ゲニンから３′，５′−ヒドロキシル化誘導体ペンタヒ
ドロキシフラバノンへの限定的な転換、（２）段階２の
花〔着色、閉じたつぼみ（長さ25〜35mm）：より高い
３′，５′−ヒドロキシラーゼレベルを示す、ペンタヒ
ドロキシフラバノンへの増加した転換、（３）段階３の
花〔出現しつつある花冠を伴う濃紫のつぼみ（長さ＞35
mm）〕：最高３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性、
（４）段階４の花〔濃紫の開いた花、葯裂開前（長さ＞
50mm）〕：最高３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性、
（５）段階５の花〔十分に開いた花。すべての葯裂
開〕：検出可能なレベルの３′，５′−ヒドロキシラー
ゼなし。

【００４３】図５（Ａ）はシトクロムP450をコードする
mRNA分子の模式的表示である。黒くした領域は、ヘム結
合ドメインをコードする配列の相対位置を示す。このド
メインの最も保存された領域のコンセンサスアミノ酸配
列は１文字コードを用いて示されている。SWISS-PROTデ
ーターベース中に存在するシトクロムP450配列の100％
に存在するアミノ酸は箱で囲まれており、そしてＸは低
レベルの配列の保存が存在する位置を示す。

【００４４】図５（Ｂ）は、cDNAライブラリー#1からの
シトクロムP450分子pCGP450 及びpCGP454 のPCR 増幅の
ために使用されたオリゴの部分を示す。オリゴ１及び３
は保存されたヘム結合ドメイン中の配列をカバーし、他
方オリゴ２及び４はそれぞれpBluescript(Strategene）
−20及び逆プライマー配列に対応した。オリゴ１及び２
はpCGP450 中のcDNA挿入部を合成するために用いられ、
オリゴ３及び４はpCGP454 中のcDNA挿入部を合成するた
めに使用された。一般化されたcDNA分子の表示は図5Aに
示されるものと同じであり、ベクター配列は薄い陰によ
り示されている。

【００４５】図６は、pCGP174 及びpCGP175 を含めてシ
トクロムP450同族体を同定するためにcDNAライブラリー
#1をプローブするのに用いたDNA 断片の模式的表示であ
る。P450＝黒い箱により示されるヘム結合ドメイン（Ha
em）を伴う、一般化されたシトクロムP450cDNA；断片１
＝900bp 断片は鋳型としてpCGP142 DNA を用い、オリゴ
５及び６を用いるPCR により得られ；断片２＝1.2Kb 断
片は、pCGP147 のSalI −Eco RI消化により単離され；
断片３＝750bp 断片は鋳型としてpCGP158 DNAを用い、
オリゴ４及び７を用いるPCR により得られ；断片４＝67
0bp 断片は、pCGP160 のPst Ｉ−Eco RV消化により単離
され；断片５＝150bp 断片は鋳型としてpCGP454 DNA を
用い、オリゴ３及び４を用いるPCR により得られた。す
べての精製された断片は「材料及び方法」の項に記載し
たようにして³²Ｐ−dCTPによりラベルした。

【００４６】図７〜図13は、（ｉ）pCGP142,（ii) pCGP
147,（iii ）pCGP158,（iv）pCGP160 及び（ｖ）pCGP45
4 からのcDNA挿入部についての部分ヌクレオチド配列及
び対応する推定アミノ酸翻訳生成物を示す。cDNAライブ
ラリーをプローブしてpCGP174 及びpCGP175 を単離する
ために使用した領域は矢印で示されている。図14及び図
15はそれぞれプラスミドpCGP174 及びpCGP175 のダイア
グラム表示である。cDNA挿入部は中空箱で示されてお
り、仮定的ヘム結合ドメインをコードする領域は黒箱で
示されている。両cDNA挿入部のEco RI部位は５′−末端
にあり、そしてXho Ｉ部位は３′−末端にある。

【００４７】図16はpCGP174 cDNA挿入部の３′−領域に
よりプローブされたDNA ブロットのオートラジオグラフ
である。各レーンは次のペチュニア組織から単離された
全RNA の20μｇのサンプルを含んだ。１〜５は、「材料
及び方法」の項に記載する花の発生段階の５つの異る段
階（１〜５）におけるOGB の周縁（limb）組織であり；
Ｔは、段階３〜４の花からのOGB の管組織であり；Ｌ
は、OGB の６週間の実生からの葉組織であり；ILは、OG
B の６週間の実生からのグルコース／高光処理された葉
組織であり；V23 は段階３〜４の花からのV23 の周縁
（limb）組織であり；R51 は段階３〜４の花からのR51
花冠組織であり；VRは、V23 _X R31 のF₁雑種の段階３〜
４の花からの花弁周縁組織であり；Sw63は、Sw63の段階
３〜４の花からの花弁周縁組織であり；そしてTh7 は、
Th7 の段階３〜４からの花弁周縁組織である。

【００４８】図17はV23 _X R51(V/R)F₂植物のRFLP分析か
らの代表的なオートラジオグラフである。Xba Ｉで消化
されたゲノムDNA がpCGP174 の３′−領域によりプロー
ブされた。プローブに強くハイブリダイズするV23 断片
が、花の管組織中で３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性
（＋）を有するすべてのF₂植物において検出された。強
くハイブリダイズするバンド（RFLP#1）についてのRFLP
判定が種々の植物について示された。Ｖ：V23 −様RFL
P，Ｒ：R51 −様RFLP，Ｈ：ヘテロ接合性（VR）。

【００４９】図18はpCGP175 cDNA挿入部の３′−領域に
よりプローブされたRNA ブロットのオートラジオグラフ
である。各レーンは次のものから単離された全RNA の20
μｇのサンプルを含有した。１〜５は、「材料及び方
法」の項に記載する花の発達の５つ（１〜５）の異る段
階における花のOGB の周縁組織であり；Ｔは段階３〜４
の花からのOGB の管組織であり；Ｌは、OGB の６週間の
実生からの葉組織であり、ILは、OGB の６週間の実生か
らのグルコース／高光処理された葉組織であり；V23
は、段階３〜４の花からのV23 周縁組織であり；R51 は
段階３〜４の花からのR51 花冠組織であり；VRは、V23
_X R51 のF₁雑種の段階３〜４の花からの花弁周縁組織で
あり；Sw63は、Sw63の段階３〜４の花からの花弁周縁組
織であり；そしてTh7 は、Th7 の段階３〜４の花からの
花弁周縁組織である。

【００５０】図19は、V23 _X R51(V/R)F₂植物のRFLP分析
からの代表的なオートラジオグラフである。Xba I で消
化したゲノムDNA をpCGP175 の３′−領域によりプロー
ブした。pCGP175 プローブを用いて得られるRFLP判定は
chi −Ａプローブを用いて帰属されるpo判定と同じであ
った。Ｖ：V23 −様RFLP，Ｒ：R51 −様RFLP，Ｈ：ヘテ
ロ接合性（VR)RFLP 。

【００５１】図20は、pCGP602 の制限酵素地図のダイア
グラム表示である。クローニングに用いたベクターを除
くcDNA挿入部の長さが、太線で示される。これらはM13-
mp18及びmp19にサブクローニングされ、そして示される
オリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて配列決定さ
れ、オーバーラップする配列情報が得られた。各サブク
ローンの断片から得られた配列情報の範囲及び方向を半
矢印を付した線により示す。S1＝プライマー配列１；S2
＝プライマー配列２；S3＝プライマー配列３。ATG はメ
チオニン開始コドンを示し、クローンの長さ（塩基対）
も示される。

【００５２】図21〜図24はpCGP176 及びpCGP602 からの
cDNA挿入部のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸
配列を示す。pCGP602 からの挿入部は、示される全配列
を含む。pCGP176 挿入部の５′−末端が矢印により示さ
れる。図25〜図27はpCGP175 からのcDNA挿入部のヌクレ
オチド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

【００５３】図28はpCGP618 の作製のダイアグラム表示
である。pCGP618 は、発現ベクターpYGA22m 中の酵母グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモ
ーター（PGPD）の後にpCGP175 cDNA挿入部をセンス方向
にクローニングすることにより作製された。pCGP175 か
らのcDNA挿入部をEco RI- Kpn I 断片として、pYGA22m
のEco RI/ Kpn I 消化から生ずる大断片と連結した。Ｅ
＝Eco RI, Ｈ＝Hin dIII ，Ｋ＝Kpn I ，Ｘ＝Xho I ，I
R＝２μｍプラスミドの逆転反復、Trp 1 ＝Trp 1 遺伝
子、Ap＝アンピシリン耐性マーカー。

【００５４】図29は、基質として³H−ナリンゲニンを使
用しての酵素抽出物の３′，５′−ヒドロキシラーゼア
ッセイを示す。このオートラジオグラフは、プラスミド
pCGP618 により形質転換された酵母の抽出物による、³H
−ナリンゲニンの３′，５′−ヒドロキシル化誘導体ペ
ンタヒドロキシフラバノンへの転換を示す（１及び
２）。形質転換されていない酵母においては３′，５′
−ヒドロキシラーゼ活性は検出されなかった（Ｃ）。OG
B の３′，５′−ヒドロキシラーゼによるナリンゲニン
のペンタヒドロキシフラバノンへの転換も示される（OG
B C)。

【００５５】図30は、基質として³H−ジヒドロケルセチ
ン(dihydroquercetin)を使用しての、酵母抽出物の
３′，５′−ヒドロキシラーゼアッセイを示す。このオ
ートラジオグラフは、プラスミドpCGP618 により形質転
換された酵母の抽出物による³H−ジヒドロケルセチン
（DHQ)の³H−ジヒドロミリセチン（dihydromyricetin）
（DHM)への転換を示す（１及び２）。形質転換されてい
ない酵母においては３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性
は検出されなかった（Ｃ）。OGB の３′，５′−ヒドロ
キシラーゼによるDHQ のDHM への転換も示される(OGB
C) 。

【００５６】図31は、基質として³H−ナリンゲニンを用
いての酵母抽出物の３′，５′−ヒドロキシラーゼアッ
セイを示す。このオートラジオグラフは、プラスミドpC
GP618 及びpCGP620 により形質転換された酵母の抽出物
による、³H−ナリンゲニンの３′，５′−ヒドロキシル
化誘導体ペンタヒドロキシフラバノンへの転換を示す
（それぞれ、１及び２）。pCGP620 抽出物から得られた
反応生成物はさらに３′−ヒドロキシル化エリオジクチ
オール（eriodictyol)及びもとのナリンゲニン基質の幾
らかを含んでおり、３′，５′−ヒドロキシル化最終生
成物への転換が不完全であることが示された。形質転換
されていない酵母においては３′，５′−ヒドロキシラ
ーゼ活性は検出されなかった。図32は、プラスミドpCGP
90のダイアグラム表示である。示されるように、pCGP60
2 からのcDNA挿入部が発現ベクターpCGP293 のMac プロ
モーターの後にセンス方向にクローニングされている。

【００５７】図33は、ペチュニアの花弁抽出物の３′，
５′−ヒドロキシラーゼアッセイを示す。このオートラ
ジオグラフは、Skr4 x Sw63 の花弁周縁組織（Ｌ）中に
低レベルの３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性（³H−ナ
リンゲニンの³H−ペンタヒドロキシフラバノンへの転
換）が存在することを示している。２種類のSkr4 x Sw6
3/pCGP90トランスジェニック（T/G 1602及びT/G 1603）
の円周組織（Ｌ）中に有意に高レベルの活性が検出され
た。非トランスジェニックSkr4 x Sw63 雑種又は２種類
のpCGP90トランスジェニックのいずれの花弁管（Ｔ）の
抽出物にも３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性が検出さ
れなかった。OGB の周縁（Ｌ）及び管（Ｔ）花弁組織の
抽出物による、ナリンゲニンのペンタヒドロキシフラバ
ノンへの転換も示される。

【００５８】図34は、³²Ｐ−ラベルされたHf１cDNAによ
りプローブされたRNA ブロットのオートラジオグラフの
写真表示である。各レーンは、（１）Ｐ．ハイブリダ
（P.hybrida)cv.OGBの花弁、（２）パンジーの花弁、
（３）ジャガイモの茎、（４）ナスの皮、（５）ニコチ
アナ・アラト（Nicotiana alata)の花、（６）アゲラツ
ム（Ageratum）の花から単離された全RNA の20μｇのサ
ンプルを含有した。Ａ及びＣのために使用したプローブ
は660bp Bal I DNA断片に由来し、1.4Kb Eco RI/Hin d
III 断片をＣのために使用した。使用した洗浄条件
は、（Ａ）55℃にて6xSSC,（Ｂ）50℃にて2xSSC,（Ｃ）
65℃にて0.2xSSC であった。

【００５９】図35は、³²Ｐ−ラベルHf１cDNAによりプロ
ーブされたサザンブロットのオートラジオグラフの写真
表示である。各レーンは、Eco RIで消化された10μｇの
DNAを含有した。DNA サンプルは、（１）ナス、（２）
オランダアイリス、（３）ジャガイモ、（４）スミレ及
び、（５）アネモニから単離された。洗浄条件は、
（Ａ）50℃にて6xSSC 、及び（Ｂ）65℃にて2xSSC であ
った。

【００６０】

【実施例】１．材料及び方法化学物質酵素及びラジオアイソトープ エリオジクチオール（eriodictyol)及びジヒドロクエル
セチン（dihydroquercetin）はCarl Roth KGから入手
し、そしてナリンゲニンはSigma から入手した。ジヒド
ロミリセチン(dihydromyricetin)はVercraysseら（198
5）の方法によりミリセチン（myricetin)から化学的に
合成した。〔³H〕−ナリンゲニン（5.7Ci/mmole)及び〔
³H〕−ジヒドロクエルセチン（12.4Ci/mmole）はAmerch
amから入手した。すべての酵素は市販品であり、そして
製造者の指示に従って使用した。

【００６１】細菌株 使用した大腸菌（Eschericia coli) 株は次の通りであ
った。

【表２】

【００６２】無力にされた（disarmed）アグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s)AGLO株（Lazoら、1991）はR.Ludwig（カリフォルニア
大学生物学部、サンタクルツ）から入手した。クローニ
ングベクターpBluescript 及びpBluescribe はStratege
neから入手した。

【００６３】大腸菌及びＡ．ツメファシエンスの形質転
換 大腸菌DH5 α細胞の形質転換はInoue ら（1990）の方法
に従って行った。コンピテントAGLO細胞を、50mL MG/L
培地（文献）に接種後28℃で16時間培養して調整した。
その100 μＬに５μｇのプラスミドDNA を加えることに
より、プラスミドpCGP90（図32）をアグロバクテリウム
・ツメファシエンスAGLO株に導入した。次に、細胞をペ
レット化し、そして0.5mL の85％（v/v)100mM CaCl₂/15
％（v/v)グリセロール中に再懸濁した。液体N₂中で２分
間インキュベートすることによりDNA −アグロバクテリ
ウム混合物を解凍し、そして次に37℃にて５分間のイン
キュベーションにより凍結した。

【００６４】次に、DNA/細菌混合物をさらに10分間氷上
に置いた。次に、細胞を１mLのMG/L培地に加え、そして
28℃にて16時間振とうしながらインキュベートした。pC
GP90を有するＡ．ツメファシエンスの細胞を、100 μｇ
／mLのゲンタマイシンを含有するMG/L寒天プレート上で
選択した。ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離され
たDNA のサザン分析によりpCGP90の存在を確認した。使
用したペチュニア・ハイブリダ（Petunia hybrida)の
品種を表３に示す。

【００６５】

【表３】

【００６６】

【表４】

【００６７】植物を特別の成育室で、１日14時間10,000
ルックスの光強度及び22〜26℃の温室にて成育させた。
OGB の花を次に定義する発生段階において収穫した。 段階１：着色なし、つぼみが閉じている（長さ＜25mm） 段階２：着色あり、つぼみが閉じている（長さ25〜35m
m） 段階３：暗紫色のつぼみ、花冠が生じつつある（長さ＞
35mm） 段階４：暗紫色開花、葯裂開前（長さ＞50mm） 段階５：十分に開花、すべての葯裂開 表２に記載する他の品種の花を、最大色素蓄積の段階で
葯の開裂前に収穫した。

【００６８】３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性のアッ
セイのための植物抽出物の調製 植物組織を２〜５倍体積の氷冷した抽出緩衝液〔100mM
リン酸カリウム（pH7.5)，１mM EDTA ，0.25Ｍシューク
ロース，0.25Ｍマンニトール、0.１％（v/v)BSA ，100n
M ペプスタチン，100nM ロイペプチン，0.１mg／mL PMS
F ，20mM ２−メルカプトエタノール及び10mg／mLポリ
クラ（polyclar)AT 〕中でホモゲナイズした。ホモジネ
ートを10,000rpm にてJA20ローター（Beckman)中で４℃
にて10分間遠心し、そして上清の一部を３′，５′−ヒ
ドロキシラーゼ活性についてアッセイした。

【００６９】３′，５′−ヒドロキシラーゼアッセイ ３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素の活性は、Stotz 及
びForkmann（1982）により記載された方法の変法を用い
て測定した。アッセイ反応混合物は典型的には100 μＬ
の抽出抽出物、５μＬの50mM NADPH／アッセイ緩衝液
〔100mM リン酸カリウム（pH8.0)，１mM EDTA ，及び20
mM２−メルカプトエタノール〕、及び10μCiの〔³H〕ナ
リンゲニン又は５μCiの〔³H〕ジヒドロクエルセチンを
含有しており、そしてアッセイ緩衝液により最終体積21
0 μＬにした。23℃にて２〜16時間のインキュベーショ
ンの後、反応混合物を0.５mLの酢酸エチルで抽出した。

【００７０】酢酸エチル相を真空乾燥し、そして10μＬ
の酢酸エチルに再懸濁した。トリチル化されたフラボノ
イド分子をセルロース薄層プレート（メルクArt5577 ，
独国）上で、クロロホルム／酢酸／水（10：９：１ v/
v）溶剤系を用いて分離した。クロマトグラフィーの完
了の際、TLC プレートにエーテル中７％（v/v)２，５−
ジフェニルオキサゾールを噴霧した。反応生成物をオー
トラジオグラフィーにより局在化し、そして反応生成物
と並んで泳動されそしてUV光のもとで可視化された、非
−放射性ナリンゲニン、エリオジクチオール、ジヒドロ
クエルセチン及びジヒドロミルセチン標準との比較によ
り同定された。

【００７１】葉におけるデルフィニジン合成のグルコー
ス／高光誘導 葉をＰ．ハイブリダcv.OGBから収穫し、そして無菌水中
で１cm² 片に切った。次に、葉片を２％（w/v)グルコー
ス溶液上に浮かせ、そして24,000ルックスの光強度に96
時間暴露した。

【００７２】cDNAライブラリー#1の作製 段階３〜４のOGB の花の周縁20ｇを、10mMバナジルリボ
ヌクレオシド錯体を含有するPEB 〔200mM Tris-HClC(pH
8.6)，60mM KCl, 30mM MgCl₂, 25mM EGTA 〕100mL 中で
ホモジナイズした。ホモジネートを無菌のMiracloth(Ca
lbiochem）に通して濾過することにより細胞片を除去し
た。濾液を、Ultra-Clear ^TM Quck-Seal^TM (Beckman)
遠心チューブ中、25％（w/v)シュークロース及び250 ユ
ニットのInhibitAce（５−Prime ３−Prime)を含有する
６mLのPEB 、並びに50％（w/v)シュークロース及び250
ユニットのInhibitAceを含有する６mlのPEB の段階的勾
配の上部に重層した。

【００７３】チューブを70Tiローター中で26,000rpm に
て3.５時間遠心した。25％（w/v)シュークロース／50％
（w/v)シュークロース界面から膜結合ポリゾームを集
め、そして4Mイソチオシアン酸グラニジン溶液に加え
た。Turpen及びGriffith（1986）により記載されている
ようにして5.7M CsCl クッションを通してペレット化す
ることによりRNA を変性したポリゾームから単離した。

【００７４】Uni −ZAP ^TM XR ベクターキット（Strate
gene）を用い、鋳型としてポリゾームRNA を25μｇ使用
してλZAP 中にディレクショナルcDNAライブラリーを作
製した。250,000 プラーク形成ユニット（pfu)を含有す
る一次ライブラリーをNZY プレート（Sambrookら、198
9）上での一夜増殖により増幅し、そして増幅されたフ
ァージストックをSambrookら（1989）により記載されて
いるようにしてPSB 〔100mM NaCl, ８mM MgSO₄, 50mM T
ris −HCl(pH7.5), 0.001 ％（w/v)ゼラチン〕中に溶出
した。

【００７５】cDNAライブラリー#2の作製 全RNA を、Ｐ．ハイブリダcv.OGBの段階３〜４の花の花
弁組織から、Turpen及びGriffith（1986）の方法を用い
て単離した。ポリ（Ａ) ⁺ RNA を前記全RNA から３サイ
クルのオリゴーdTセルロースクロマトグラフィー（Aviv
及びLeder,1972）により選択した。２μｇのポリ（Ａ）
⁺ RNA を、1X Superscript ^TM 反応緩衝液、10mMジチオ
スレイトール，500 μＭ dATP, 500μＭ dGTP, 500μＭ
dTTP, 500μＭ ５−メチル−dCTP, 0.75μｇオリゴヌ
クレオチド#8及び２μＬ Superscript ^TM 逆転写酵素
（BRL)を含む20μＬ体積中で逆転写した。反応混合物を
37℃にて50分間、44℃にて10分間インキュベートし、次
に氷上に置いた。

【００７６】第二鎖反応混合物（140 μＬ）を第一鎖反
応混合物に加えた。第二鎖反応混合物は21mM Tris −HC
l, 104mM KCl, 5.3mM MgCl₂, 171μＭ β−NAD, 11.4m
M(NH ₄)SO₄, 214μＭ dATP, 642μＭ dCTP, 214μＭ dGT
P, 214μＭ dTTP,４mM DTT,10μCi³²Ｐ−dCTP(3000Ci/m
mole），15ユニット大腸菌DNA リガーゼ、40ユニットD
NA ポリメラーゼ（Boehringer）及び0.８ユニットRNAse
H から成った。最終混合物を16℃にて150 分間インキ
ュベートした。２本鎖cDNAを平滑末端化するため、10ユ
ニットのT4 DNAポリメラーゼを加え、そして反応を16℃
にてさらに15分間続けた。反応を停止し、cDNAをフェノ
ール／クロロホルム抽出、そして次にクロロホルム抽出
及びエタノール沈澱により精製した。

【００７７】Eco RIアダプター（Promega)をcDNAに連結
し、そして次に製造者により推奨された条件を用いてキ
ナーゼ処理した。加熱（70℃、20分）により酵素を変性
させ、そしてフェノール／クロロホルム抽出及びエタノ
ール沈澱によりDNA を抽出した。cDNAを50ユニットのXh
o I （Boehringer）により、100mL の反応体積中で、製
造者の推奨する条件を用いて消化した。酵素を加熱失活
させ（70℃，20分間）、そして混合物を、STE 緩衝液
（Sambrookら、1989）中で平衡化されたS400スパンカラ
ム（Pharmacia)に通した。溶出液をフェノール／クロロ
ホルム抽出し、そしてエタノール沈澱させた。４℃にて
30分間のマイクロ遠心分離の後、cDNAペレットを70％
（v/v)エタノールで洗浄し、空気乾燥し、そして10μＬ
のTE緩衝液〔10mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM EDTA 〕中に
再懸濁した。

【００７８】そのうち、7.５μＬを１％（w/v)アガロー
スゲルを用いて電気泳動し、1.３〜2.５Kbのサイズ範囲
のcDNAを単離するためにNA−45膜（Schleicher及びSchu
ell)を用いた。サイズ分画されたcDNAを、50mM Tris-HC
l(pH7.0)，10mM MgCl₂，10mMジチオスレイトール，１mM
ATP及び２ユニットのT4 DNAリガーゼから成る反応緩衝
液５μＬ中で、λ ZAP II Eco RI/Xho I/CIAP処理ベク
ター（Stratagene）１μｇと連結した。反応は４℃にて
２日間行った。

【００７９】室温に２時間置いた後、Packagene 系（Pr
omega)を用いて連結反応混合物をパッケージした。組換
え体の全数は270,000pfuであった。150,000pfuの量のパ
ッケージされたcDNAを、PLK-F'細胞のトランスフェクシ
ョンの後、15cm直径のプレート当り10,000pfu でプレー
トした。プレートを37℃にて８時間インキュベートし、
そして４℃にて一夜貯蔵した。２枚のリフトをColong/P
laqne Screen ^TM フィルター（Dupont）上に取り、そし
て製造者が推奨するように処理した。

【００８０】オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドを、Applied Biosystems PCR-Mate
DNA 合成機上で、製造者により推奨される方法を用いて
合成した。合成されたオリゴヌクレオチドは５′−３′
の方向に次の通りであった。

【００８１】

【表５】

【００８２】オリゴ２及び４は、２本鎖PCR 生成物の濃
縮を促進することが示されている（Lem 及びKemp, 198
9）GCN4結合部位（アンダーラインで示してある）を含
んだ。オリゴ３の設計のための基礎は次の通りであっ
た。アボカドのシトクロムP450の想定されるヘム結合ド
メインからのアミノ酸配列(Bozakら、1990）及び２つの
ペチュニアシトクロムP450相同 pCGP142及びpCGP147 に
よりコードされる対応する配列を整列させた。

【００８３】

【表６】

【００８４】３つの植物シトクロムP450のヘム結合領域
のコンセンサスアミノ酸配列は次の様に見ることができ
よう。Ｐ Ｆ Ｇ Ａ（Ｓ）Ｇ Ｒ（Ｋ）Ｒ Ｉ（Ｇ）
Ｃ Ｐ Ｇ３種のシトクロムP450分子のヘム結合ドメイ
ン中に見出されるアミノ酸をコードすることができるヌ
クレオチド配列の可能な順列は次の様に演えきすること
ができよう。

【００８５】

【表７】

【００８６】Ｘは４種類すべてのヌクレオチド（Ａ，
Ｃ，Ｇ及びＴ）を使用することができるヌクレオチド位
置を示す。オリゴ３は、３種の植物シトクロムP450に由
来するコンセンサス配列のサブセットを相補するように
設計された。塩基の縮重が３より大である場合、デオキ
シイノシン（Ｉ）を用いた。得られるオリゴヌクレオチ
ド配列は上に示す通りであった。

【００８７】PCR 反応 ヘルパーファージR408（Strategane）を用いて、製造者
により記載された方法を用いて、200,000pfuの増幅され
たλZAP cDNAライブラリー#1からペチュニアcDNA挿入部
を含有するpBluescript ファージミドを切り出した。大
腸菌XL1-Blueをファージミド混合物によりトランスフェ
クトし、そして250,000 コロニーをアンピシリン含有培
地上にプレートした。細胞をLB（Sambrookら、1989）に
再懸濁し、そしてアルカリ溶解法（Sambrookら、1989）
を用いてプラスミドDNA を単離した。CsClグラジェント
上でのバンド形成によりプラスミドDNA をさらに精製し
た。このDNA をPCR 用鋳型として用いた。

【００８８】花弁シトクロムP450同族体の増幅のための
PCR 反応混合物は５ngから100ng の切り出されたDNA ，
10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.01
％（w/v)ゼラチン，0.２mMずつのdNTP, 0.４μＭずつの
プライマー及び1.25ユニットのTaq ポリメラーゼ(Cetu
s) を含有した。反応混合物（50μＬ）を、94℃，48℃
及び72℃の間で各温度において１分間ずつ、30回循環し
た。増幅された生成物をGeneclean （Bio 101 Inc.）を
用いてゲル精製し、クローニングのために十分な量を得
るために再増幅し、そして次にT4 DNAポリメラーゼを用
いて末端修復した。オリゴ１及び２を用いて増幅したDN
A をHind III及びXhoIで消化した後にpBluscriptにクロ
ーニングした。オリゴ３及び４間の増幅により生じたPC
T 生成物を、Holton及びGraham（1991）により記載され
たddT −テイルpBluescript に直接クローニングした。

【００８９】cDNAライブラリーのスクリーニング ２枚のプラークリフトを次のようにしてハイブリダイズ
させそして洗浄した。高ストリンジェンシー条件〔ハイ
ブリダイゼーション：50％（v/v)ホルムアミド、6xSSC,
１％（w/v)SDS, 42 ℃にて16時間、及び洗浄：2xSSC,１
％（w/v)SDS, 65 ℃にて２×15分間、これに続き0.2xSS
C,１％（w/v)SDS, 65 ℃にて２×15分間〕を用いて兄弟
クローンを検出し、そして低ストリンジェンシー条件
〔ハイブリダイゼーション：20％（v/v)ホルムアミド、
6xSSC,１％（w/v)SDS,42℃にて16時間、及び洗浄：6xSS
C,１％（w/v)SDS, 65 ℃にて１時間〕を用いて関連配列
を検出した。

【００９０】ノザン分析 全RNA を、液体N₂中で凍結した組織から単離し、そして
乳鉢と乳棒を用いて微粉砕した。4Mイソチオシアン酸グ
アニジン、50mM Tris-HCl(pH8.0 ），20mM EDTA, 0.1％
（v/v)Sarkosylの抽出緩衝液を組織に添加し、そして混
合物を最大速度でポリトロンを用いて１分間ホモジナイ
ズした。懸濁液をMiracloth(Calbiochem）を用いて濾過
し、そしてJA20ローター中で10,000rpm にて10分間遠心
した。上清を集め、そして0.２ｇ／mL CsCl(w/v)にし
た。

【００９１】次に、サンプルを、38.5mLのQuick −seal
遠心チューブ（Beckman)中で5.7M CsCl,50mM EDTA(pH7.
0)の10mLクッション上に重層し、そしてTi−70ローター
中で、42,000rpm にて12〜16時間23℃において遠心し
た。ペレットをTE/SDS〔10mM Tris-HCl(pH7.5)，１mM E
DTA, 0.1％（w/v)SDS 〕中に再懸濁し、そして10mM EDT
A(pH7.5)中で飽和されたフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（25：24：１）により抽出した。エ
タノール沈澱の後、RNA ペレットをTE/SDS中に再懸濁し
た。

【００９２】RNA サンプルを、2.2Mホルムアルデヒド/
1.2％（w/v)アガロースゲルにより、40mMモルホリノプ
ロパンスルホン酸（pH7.0)，５mM酸ナトリウム，0.１mM
EDTA(pH8.0)を含有する泳動緩衝液を用いて電気泳動し
た。RNA を、製造者が記載するようにしてHybond−Ｎフ
ィルター（Amersham）に移行させ、そして³²Ｐ−ラベル
化cDNA断片（10⁸cpm／μｇ，２×10⁶cpm／mL）によりプ
ローブした。プレハイブリダイゼーション（42℃にて１
時間）及びハイブリダイゼーション（42℃にて16時間）
を50％（v/v)ホルムアミド、1M NaCl,１％（w/v)SDS,10
％（w/v)硫酸デキストラン中で行った。ハイブリダイゼ
ーションの段階で、変性したサケ精子DNA(100μｇ／m
L）を³²Ｐ−ラベル化プローブと共に加えた。

【００９３】フィルターを2xSSC ／１％（v/v)SDS 中で
65℃にて１〜２時間洗浄し、そして次に0.2xSSC ／１％
（v/v)SDS 中で65℃にて0.５〜１時間洗浄した。フィル
ターを、増感スクリーンを用いて−70℃にて48時間コダ
ックXAR フィルムに感光した。

【００９４】RFLP分析 ａ．ゲノムDNA の単離 Dellaportaら（1983）が記載したのと実質的に同様にし
て、葉組織からDNA を単離した。DNA 調製物をCsCl浮力
密度遠心（Sambrookら、1989）によりさらに精製した。 ｂ．サザンブロット ゲノムDNA(10μｇ）を60ユニットのXba I により16時間
消化し、そして0.７％（w/v)アガロースゲルを通して、
TAE(40mM Tris-アセテート，50mM EDTA)の泳動緩衝液中
で電気泳動した。次に、DNA を変性溶液（1.5M NaCl/0.
5M NaOH)中で１〜1.５時間変性させ、0.5MTris-HCl(pH
7.5）/1.5M NaCl中で２〜３時間中和し、そして次にDNA
をHybond N(Amersham)フィルターに20xSSC中で移行さ
せた。

【００９５】ｃ．chi −Ａプローブの単離chi −Ａ（van Tunen ら、1988）のcDNAクローンを、PC
R により、OGB の段階３の花弁RNA から作られたcDNA鋳
型及び２つのオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち
公表されたchi −ＡcDNA配列（van Tunam ら、1988）の
ヌクレオチド６〜20をカバーする#9，及びヌクレオチド
711-725 に対して相補的な#10 を用いて合成した。生ず
るPCR 生成物をpBlue scribe M13^- (Stratagene)のSmaI
部位に連絡し、そして配列決定して、クローン化された
断片が公表された配列に対応することを確認した。

【００９６】DNA プローブの³²Ｐ−ラベル化 DNA 断片（50〜100ng)を50μCiの〔α−³²Ｐ〕−dCTPに
より、オリゴラベル化キット（Bresatec）を用いて放射
能ラベルした。取り込まれなかった〔α−³²Ｐ〕−dCTP
はSephadex G-50(Fine）カラムのクロマトグラフィーに
より除去した。

【００９７】DNA 配列分析 Sangerら（1977）の方法と実質上同様にして、Sequenas
e 酵素（USB,バージョン2.1)を用いてDNA 配列決定を行
った。クローンpCGP602 ，pCGP176 及びpCGP175 の完全
な配列を、標準的クローニング方法（Sambrookら、198
9）を用いて得られた異るM13-mp18及び−mp19（Norrand
er ら、1983；Yanish-Perron,1985）サブクローンから
の配列の編集により決定した。幾つかの領域について
は、オーバーラップする配列データーを得るために特定
のオリゴヌクレオチドプライマーを合成する必要があっ
た。この目的のために、次の６種のプライマーを合成し
た。

【００９８】

【表８】

【００９９】これらの配列の幾つかの位置を示すpCGP60
2 の制限地図は図20に見られる。Genbank SWISS-PROT及
びEMBLデータベースに対する相同性の検索を、FASTA 及
びFASTA プログラム（Pearson 及びLipman,1988)を用い
て実施した。

【０１００】pCGP293 の作製 発現バイナリー（binary）ベクターpCGP293 は、Tiバイ
ナリーベクターpCGN1559（McBride 及びSummerfelt,199
0)から誘導された。プラスミドpCGN1559をKpnI で消化
し、そして突出する３′−末端を標準的方法（Sambrook
ら、1989）に行ってT4DNA ポリメラーゼにより除去し
た。次に、ベクターをXba I によりさらに消化し、そし
て生ずる５′突出部をDNA ポリメラーゼＩのKlenow断片
を用いて修復した。次に、ベクターを再連絡してpCGP67
を得た。Mac プロモーター, ノス・ターミネーター及び
種々のクローニング部位を有する1.97KbPst I 断片（Co
maiら、1990）をpCGP40から単離し、そしてpCGP67のPst
部位に挿入してpCGP293 を得た。

【０１０１】pCGN7334からGUS 遺伝子（Jefferson ら、
1987）をBamHI-SacI断片として取り出し、そしてそれ
を、多クローニング部位を含むpBluescribe M13 ^- から
のBamHI- Sac I 断片で置き換えることによりプラスミ
ドpCGP40を作製した。Mac-GUS-mas 遺伝子融合体を含有
する断片をpCGN7329（Comai ら、1990）のXho I 部位に
挿入することにより、プラスミドpCGN7334（Calgene, I
nc, (CA), 米国）を作製した。

【０１０２】pCGP90の作製 pCGP602 からのcDNA挿入部をpCGP293 のMac プロモータ
ー（Comai ら、1990）の後にセンス方向にクローニング
することによりプラスミドpCGP90を作製した。cDNA挿入
部を含有するBam HI- Kpn I 断片をpCGP602 から単離
し、そしてpCGP293 のBam HI- Kpn I 消化物と連結し
た。pCGP90中の挿入部の正しい挿入を、ゲンタマイシン
耐性形質転換体から単離したDNA の制限酵素分析により
達成した。

【０１０３】酵母発現ベクターpYGA22m の作製 M13-mp18をEco RI及びBgl IIにより消化して、マルチク
ローニング部位を含む700bp 断片を生成させた。この断
片をpYGA2269（Ashikariら、1989）からの９KbEcoRI-Bg
l II 断片と連結した。pYGA22m と称する得られた構成
は、酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼプロモーターの下流に挿入されたマルチクロ
ーニング部位を含んでいた（図28）。

【０１０４】pCGP618 の作製 pCGP175 からの全部のcDNA挿入部を含有する1.8Kb Eco
RI- Kpn I 断片をpYGA22m からの９Kb Eco RI- Kpn I
断片と連結した。生ずるプラスミドpCGP618 は、グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモータ
ーの後にセンス方向に連結されたpCGP175 cDNA断片を含
んでいた（図28）。

【０１０５】pCGP620 の作製 pCGP176 からの完全なcDNA挿入部を含有する1.8Kb のEc
o RI- Kpn I 断片を、pYGA22m(pCGP618 の作製について
記載したように）からの９KbのEco RI- Kpn I断片と連
結した。得られるプラスミドpCGP620 は、酵母グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター
の後にセンス方向に連結されたpCGP176cDNA断片を含ん
でいた。

【０１０６】酵母の形質転換 酵母Ｇ−1315株（Mat α, trp 1)（Ashikariら、1989）
をIto ら（1983）に従って、pCGP618 及びpCGP620 によ
り形質転換した。形質転換体を、Ｇ−1315をトリプトフ
ァン自律合成性（prototrophy)に回復させるそれらの能
力により選択した。

【０１０７】３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性のアッ
セイのための酵母抽出物の調製 ａ．Ｇ−1315／pCGP618 トリプトファンを欠く培地上に増殖したＧ−1315／pCGP
618 及びＧ−1315復帰変異株の単一単離体を用いて50mL
のYNBC〔アミノ酸不含酵母ナイトロジェンベース（Difc
o)1.２％（w/v)，２％（w/v)グルコース及び0.３％（w/
v)カザミノ酸（Difco)〕に接種し、そして30℃にて２日
間振とうしながらインキュベートした。細胞を遠心によ
りペレット化し、そしてミクロソーム画分をOedaら（19
85）に従って得たが、但し植物組織中の３′，５′−ヒ
ドロキシラーゼ活性のアッセイのために使用される抽出
緩衝液中でスフェロプラストを破砕した。ミクロソーム
ペレットを400 μＬの緩衝液Ａ〔10mM Tris-HCl(pH7.
5), 0.65M ソルビトール，0.１mM DTT, 0.1mM EDTA〕中
に懸濁し、そして100 μＬのサンプルを３′，５′−ヒ
ドロキシラーゼ活性についてアッセイした。

【０１０８】ｂ．Ｇ1315／pCGP620 Ｇ−1315／pCGP620 の単一単離体を用いて20mlのYNBCに
接種し、次にこれを２日間30℃にてインキュベートし
た。細胞を遠心分離により集め、TEにより１回及び緩衝
液Ａにより１回洗浄し、そして次にザイモリアーゼ100
Ｔ（0.１mg／mL）（生化学工業）を含有する緩衝液Ｂ
〔10mM Tris-HCl(pH7.5), 1.2Mソルビトール，0.１mM D
TT, 0.1mM EDTA〕中に再懸濁した。30℃にて１時間のイ
ンキュベーションの後、細胞を遠心分離によりペレット
化し、そして400 μＬの緩衝液Ａ中に再懸濁した。次
に、細胞懸濁液をガラスビーズ（直径0.４mm）と共に２
分間ボルテックスし、そして100 μＬのサンプルを
３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性についてアッセイし
た。

【０１０９】ペチュニアの形質転換 ａ．植物材料 ペチュニア・ハイブリダ（Skr4 x Sw63 ，及びRp57 x R
w14 ）の種子を1.25％（w/v)次亜塩素酸ナトリウム中で
10分間殺菌し、そして無菌水中で３回洗浄した。殺菌さ
れた種子を100mg/L のジベレリン酸（GA₃)溶液に16〜20
時間浸漬した。次に、これらを、１％（v/v)シュークロ
ース及び0.８％（w/v)ディフコ（Difco)バクトアガーを
補充した10％（w/v)MS(Murashige及びSkooy, 1962)上で
２週間発芽させた。

【０１１０】若い実生を、３％（w/v)シュークロースが
補充されたMS培地に３週間移し、次にジフィー・ピート
（Jiffy peat）ペレット（Jiffy Products Ltd, ノルウ
ェイ）に移し、高湿度のもとに保持し、そして２〜３週
間光照射した（135 μＥ．塩化水銀灯22℃）。次に、こ
れらの若植物を成育キャビネット（68μＥ．冷白色蛍光
灯，25℃）。同時培養（co-cultivation）のため、若い
葉を収穫し、そして1.35％（w/v)次亜塩素酸ナトリウム
中で２分間殺菌し、次に無菌水中で３回洗浄した。次に
葉組織を25mm² の正方形に切断し、そして0.05mg/Lのカ
イネチン及び1.０mg/Lの２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）を補充したMS培地上で24時間前培養し
た。

【０１１１】ｂ．アグロバクテリウムとペチュニア組織
との共存培養 バイナリーベクターpCGP90（図32）を含むアグロバクテ
リウム・ツメファシエンス AGLO（Lazoら、1991）を４
℃にて、100mg/L のゲンタマイシンを含有するMG/L（Ga
rfinkel 及びNester,1980)寒天プレート上に保持した。
１％（w/v)バクト・ペプトン、0.５％（w/v)バクト酵母
エキス及び１％（w/v)NaClを含有する液体培地中で単一
コロニーを一夜増殖させた。

【０１１２】次の日、３％（w/v)シュークロースを含有
する液体MS培地（BPM)中への希釈により５×10⁸ 細胞／
mLの最終濃度を調製した。葉のディスクを、AGLO／pCGP
90を含有するBPM 中に浸漬した。次に葉のディスクを紙
の上で乾燥し、そして共存培養培地上に４日間置いた。
共存培養培地は、0.05mg/Lのカイネチン及び1.０mg/Lの
２，４−Ｄが補充されたSH(Schenk 及びHildebrandt, 1
972 ）から成り、そして共存培養培地に一面に拡がった
タバコ細胞懸濁物のフィーダー層及びそのタバコ細胞懸
濁物の上に置かれた濾紙を含んでいた。

【０１１３】ｃ．トランスジェニックペチュニア植物の
再生 共存培養の後、葉組織を次の選択培地に移した：Skr4 x
Sw63 のディスクは、３％（w/v)シュークロース，２mg
/Lのα−ベンジルアミノプリン（BAP)，100 mg/Lカナマ
イシン，350 mg/Lセファタキシム（cefotaxime）及び0.
３％（w/v)ゼライト・ゼラン・ガム（Gelrite Gellan G
um)(スイス）を補充された新鮮なMS培地へ；Rp57 x Rw1
4 のディスクは、２mg/LのBAP の代りに0.５mg/LのBAP
及びα−ナフタレン酢酸（NAA)を含有する同じ培地に。
３週間後、再生しつつある外植片を新鮮な培地に移し
た。

【０１１４】カナマイシン選択に対して生き残った不定
芽を、根の誘導のため、100 mg/Lカナマイシン及び350
mg/Lセフオタキシムを含有するBPM に移した。すべての
培養物を16時間照射（60μＥ．冷白色蛍光灯）のもとで
23±２℃に保持した。根が２〜３cmの長さに達した時、
トランスジェニックペチュニア植物を、８cmのチューブ
中のオートクレーブ殺菌されたDebco 51410/2 ポットミ
ックスに移した。４週間後、植物を同じポットミックス
を用いる15cmのポットに再移植し、そして14時間照射
（300 μＥ．ハロゲン化水銀灯）のもとで23℃にて保持
した。

【０１１５】タバコの形質転換 ａ．植物材料 ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum) (cv.Xan
thi)ストック植物は、１mg/Lのインドール酪酸（IBA)が
補充されそして0.25％（w/v)ゲルライト（Gelrite)に上
り固化されたMS培地上に維持した。葉の組織を25cm² の
正方形に切断し、そして１mg/LのBAP 及び0.５mg/Lのイ
ンドール酢酸（IAA)を含有するMS培地に24時間置いた。

【０１１６】ｂ．アグロバクテリウムとタバコ組織との
共存培養 ペチュニアについて前記したようにして共存培養を行っ
た。 ｃ．トランスジェニックタバコ植物の再生 共存培養の後、葉のディスクを、１mg/LのBAP, 0.5mg/L
のIAA,100 mg/Lのカナマイシン及び350 mg/Lのセフオタ
キシムが補充されたMS培地（選択培地）に移した。２〜
３週間後、再生しつつある外植片を新鮮な選択培地に移
した。カナマイシン選択に対して生き残った不定芽を単
離し、そして根の誘導のため、１mg/LのIBA, 100mg/Lの
カナマイシン及び350 mg/Lのセファタキシムを含有する
MS培地に移した。根が２〜３cmの長さに達した時、ペチ
ュニアについて記載したようにして、トランスジェニッ
クタバコ植物を土壌に移植した。

【０１１７】アントシアニジンの分析 HPLC分析に先立って、花弁抽出物中に存在するアントシ
アニン分子を酸加水分解して、アントシアニジン核から
グリコシル成分を除去した。アントシアニン色素のＢ環
でのヒドロキシル化パターンをアントシアニジン核分子
のHPLC分析により決定した。この分析において使用した
HPLC系は多波長検出器（MWD)を備えたHewlettPack and
1050であった。Spherisorb S5 ODS2カートリッジカラム
250 mm×４mmID上で逆層クロマトグラフ分離を行った。

【０１１８】ａ．アントシアニン及びフラボノイドの抽
出 花の色素を、花弁の断片（約50mg）から、１％（v/v)の
水性6M塩酸を含有するメタノール５mlにより抽出した。
抽出物を水で希釈し（１：９）、そして濾過した（Mill
ex HV, 0.45 μ）後にHPLC系に注射した。 ｂ．アントシアニンの加水分解 前記ａ．において得た粗メタノール抽出物（100 μＬ）
を室温にて乾燥窒素流を用いてPierce Reacti-Vials 中
で蒸発乾固した。残渣を200 μＬの2MHCl に溶解し、バ
イアルにキャップを付し、そして次に100 ℃にて30分間
加熱した。加水分解混合物を水（１：９）で希釈し、そ
してHPLC分析に先立って濾過した（Millex HV, 0.45
μ）。

【０１１９】ｃ．クロマトグラフィー 花の色素の分離は、次の系を用いるグラジェント溶出に
より行った。 溶剤Ａ：（トリエチルアミン：濃硫酸：H₂O)（３：2.
５：1000） 溶剤Ｂ：アセトニトリル グラジェント条件：20分間にわたり５％Ｂから40％Ｂへ 流 速：１ml／分 カラム温度：35℃ 検 出：280,350 及び546nm での同時データー取得によ
るMWD アントシアニジンのピークは既知標準との比較により同
定した。 ２．３′，５′−ヒドロキシラーゼのクローニング及び
分析

【０１２０】３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素の特性
決定 ａ．発生段階による制御（Develapmentnl Regulation） 前に定義した発達の異る段階における花から収穫した
Ｐ．ハイブリダcv.OGBの花弁の抽出物を３′，５′−ヒ
ドロキシラーゼ活性について測定した。OGB の花弁中の
３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素活性は花冠の成熟の
間に発生段階による制御がされることが見出された（図
４）。この発生的プロフィールはフラボノイド生合成に
関与する他の遺伝子の発現と平行した。３′，５′−ヒ
ドロキシラーゼ酵素の活性、並びにカルコン（chalcon
e）シンサーゼ（CHS)，カルコンフラバノンイソメラー
ゼ（CHI)及びジヒドロフラボノールレダクターゼ（DFR)
遺伝子の発現は花の発達の段階３〜４付近でピークとな
った。

【０１２１】ｂ．葉組織における３′，５′−ヒドロキ
シラーゼ活性の誘導 フラボノイド色素生合成経路の遺伝子は通常は葉組織中
では発現されない。しかしながら、デルフィニジン色素
の合成はOGB の葉において、２％（w/v)グルコース溶液
中強い光のもとでのインキュベーションにより誘導され
た。これらの条件下で、３′，５′−ヒドロキシラーゼ
酵素活性がOGB 葉組織中で検出され得る。酵素活性の最
大誘導が96時間のグルコース／高光処理の後に起こるこ
とが示された。これらの条件下で、幾つかの他の色素生
合成遺伝子の発現も、発生中の花弁中に観察されるレベ
ルに匹敵するレベルに誘導された。これらの結果から、
Hf１及び／又はHf２遺伝子がグルコース／高光処理され
た葉組織において誘導されると結論された。

【０１２２】ｃ．３′，５′−ヒドロキシラーゼがシト
クロムP450クラスの酵素に属することの証明 OGB 花弁中の３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性はミク
ロソーム画分に関連しており、そしてNADPH の存在に依
存することが示された。活性は、一酸化炭素によるミク
ロソームの処理により、及びシトクロムP450酵素を特異
的に不活性化する２種類の阻害前、テトライクラシス
（tetcyclasis)及び１−アミノベンゾトリアジン（Tato
n ら、1988；Matthewsら、1985；Rademacherら、198
7）、により阻害されることができた。

【０１２３】シトクロムP450配列について濃縮されたcD
NAライブラリーの作製 シトクロムP450mRNAの翻訳は膜結合ポリゾームにおいて
起こる（Takemori及びKominami,1989)。従って、シトク
ロムP450配列（３′，５′−ヒドロキシラーゼ配列を含
む）について濃縮するため、段階３〜４の花のOGB の花
弁から単離された膜結合ポリゾームRNA を用いてcDNAラ
イブラリーを作製した。段階３〜４の花からの花弁のRN
A の単離により、３′，５′−ヒドロキシラーゼ配列が
このライブラリーにおいて最高に代表されることが保証
された。なぜなら、３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性
は発生のこの段階において最大であることが示されたか
らである（前記及び図４を参照のこと）。cDNAライブラ
リー#1と称する得られたライブラリーは250,000 の一次
組換体を含んでいた。

【０１２４】ペチュニアの花弁シトクロムP450cDNAのPC
R 増幅 多数のシトクロムP450が、脊椎動物、菌類、昆虫、細菌
及び１種の植物（Nebertら、1991，Bozak ら、1990）
と、多様な生物体から配列決定されている。これらすべ
ての酵素の特徴は、特にヘム結合に関与するシステイン
残基付近での、多数の小さな配列保存領域の存在であ
る。今日までに配列決定されているほとんどすべてのミ
クロソーム由来シトクロムP450のヘム結合ドメインにア
ミノ酸配列F(G,S)XGXRXCXGが存在し、ここでＸはいずれ
のアミノ酸であってもよい（図５）。このコンセンサス
配列をFASTA プログラム（Pearson 及びLipman, 1988)
を用いてNBRF蛋白質データベースと比較することによ
り、データベース中のすべてのミクロソーム性シトクロ
ムP450配列についてこの領域付近のアミノ酸の存在頻度
を決定した。

【０１２５】この分析が示すところによれば、ヘム結合
ドメイン付近の各位置の最も共通なアミノ酸配列は： FMPFGAGXRXCLG アンダーラインを付した配列及び類似の配列をコードす
る遺伝子にハイブリダイズするようにオリゴヌクレオチ
ドを設計した。オリゴ１と称するこのオリゴヌクレオチ
ドを下に示す。 ５′−GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG −３′ アンダーラインを付した部分は、PCR 生成物の方向性ク
ローニングを促進するためのHind III認識部位を含む追
加の配列である。デオキシイノシン（Ｉ）を含めること
により、２以上のコドンが同一のアミノ酸配列をコード
し得るようなコドンの使用の異る可能性がカバーされ
た。デオキシイノシンは類似の効率でＡ，Ｔ，Ｇ及びＣ
に塩基対合する（Martinら、1985；Ohtsuka ら、198
5）。

【０１２６】「材料及び方法」の項に記載したようにし
てcDNAライブラリー#1から得られたプラスミドDNA を、
オリゴ１及び２を用いての360bp のシトクロムP450関連
配列の増幅のための鋳型として使用した（図５）。オリ
ゴ２は−20プライマー（Strategene）の５′−末端にGC
N4結合部位（Lew 及びKemp, 1989）を付加したものに対
応する。PCR 断片をpBluescript にクローニングし、そ
して生ずるプラスミドをpCGP450 と称した。pCGP450 の
５′−領域はすでに配列決定されているシトクロムP450
分子に対して有意に相同性を有するポリペプチド配列を
コードする。

【０１２７】ペチュニアの花弁cDNAライブラリーからの
シトクロムP450同族体の単離 プラスミドpCGP450 を用いて、関連クローンについてcD
NAライブラリー#1（60,000プラーク）をスクリーニング
した。高ストリンジェンシー及び低ストリンジェンシー
の条件下での２つの引続くハイブリダイゼーションを用
いて、pCGP450の兄弟クローン及びシトクロムP450cDNA
の第二グループの両者を検出した。兄弟群のそれぞれの
代表的cDNAクローンを次の段階の分析のために選択し
た。pCGP450 の兄弟クローンをpCGP142 と命名し、そし
て第二グループの代表をpCGP147 と命名した。次に、pC
GP147 のコード配列のみを含むSal I-Eco RI断片を用い
てcDNAライブラリー#1からの16,000プラークを低ストリ
ンジェンシーにおいて再プローブした。このプローブと
ハイブリダイズする合計20クローンを配列決定し、さら
に２つのシトクロムP450同族体pCGP158 及びpCGP160 を
同定することができた（図６）。

【０１２８】追加の花弁シトクロムP450同族体のPCR に
よる単離 ペチュニアのクローンpCGP142 及びpCGP147 並びにすで
に配列決定されているアボカドのシトクロムP450配列
（O'Keete 及びLeto, 1989；Zozak ら、1990）の推定上
のヘム結合ドメイン付近からの配列情報を「材料及び方
法」の項に記載したのと同様にして用いて、前記３つの
シトクロムP450クローンの少なくとも２つによりコード
されるアミノ酸配列をカバーする第二の縮重オリゴヌク
レオチド（オリゴ３）を設計した。

【０１２９】このオリゴヌクレオチドを用い、そして鋳
型としてのcDNAライブラリー#1及び第二プライマーとし
てのオリゴ４を用いて、PCR により関連配列を増幅した
（図5B）。サイズ範囲250 〜500bp の反応生成物を「材
料及び方法」の項に記載したようにして単離し、そして
Holton及びGraham（1991）により記載されたddT を付加
したpBluescript ベクターにクローン化した。クローン
化されたPCR 断片を配列決定し、第五のシトクロムP450
同族体をコードすることが示された。pCGP454と称する
１つのクローンを更なる分析のために選択した。

【０１３０】cDNAライブラリー#1からの更なるシトクロ
ムP450同族体の単離 シトクロムP450同族体pCGP142,pCGP147,pCGP158 及びpC
GP160 のコード領域並びにpCGP454 からのcDNA（図７〜
13）を含む³²Ｐ−ラベル化DNA 断片の混合プローブを用
いて、関連配列のために、cDNAライブラリー#1から50,0
00個のクローンをスクリーニングした。低ハイブリダイ
ゼーション及び洗浄条件下で合計152 個のハイブリダイ
ズするクローンが検出された。ハイブリダイズするクロ
ーンから単離されたDNA の配列分析により更なる13の異
るシトクロムP450同族体が同定された。これらのクロー
ン間で２つの密接に関連する兄弟群が区別された。これ
ら２群のそれぞれのコード領域はDNA レベルで94％の相
同性又は類似性を示した。１つの兄弟群の２つの代表pC
GP174(図14）及びpCGP176,並びに他の兄弟群の１つの代
表pCGP175 （図15）を更なる研究のために選択した。

【０１３１】シトクロムP450同族体のナサン及びRFLP分
析 ３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードするcDNAの分子
的特徴を有するシトクロムP450同族体を区別するために
ノザン及びRFLP分析を用いた。Ｐ．ハイブリド中には
３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を制御する２つの遺
伝子座Hf１及びHf２が存在する（de Vlamingら、1984；
Wiering,1974）。Hf１はＰ．ヒブリダの花の周縁及び管
の両方において発現され、そして周縁のみで発現される
Hf２に比べて非常に高いレベルの３′，５′−ヒドロキ
シラーゼ活性をもたらす。ペチュニアの３′，５′−ヒ
ドロキシラーゼ活性も発生的且つ空間的に制御される。

【０１３２】通常の成育条件のもとで、この酵素は花弁
組織においてのみ検出することができ、花の発達段階の
段階３〜４付近で最高レベルに増加しそして十分に開い
た花において低下する〔段階５；図４を参照のこと〕。
活性はまた、ある種のストレス条件、例えば前記のグル
コース／高光処理のもとで葉組織においても誘導され得
る。従って、３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードす
るcDNAクローンは、酵素活性プロフィールと平行するRN
A ブロット上の発現プロフィールを有すると予想され
た。さらに、Ｐ．ハイブリダの３′，５′−ヒドロキシ
ダーゼをコードする。cDNAはクローンはHf１又はHf２の
いずれかに位置すると予想された。

【０１３３】Hf１はＰ．ハイブリダのゲノムの染色体Ｉ
にマップされており、そしてPh１遺伝子座に連鎖してい
る（Cornu, 1984; Cornuら1990）が、Hf２は染色体Ｖ上
のPoに密接に連鎖している（Wallrothら、1986）。純系
V23(Hf１／Hf１，Hf２／Hf２）とR51(hf１／hf１，hf２
／hf２）との交配に由来する植物のF₂代から単離された
DNA のRFLP分析を用いて、種々のシトクロムP450同族体
についての連鎖データーを得た。Hf１／−遺伝子型は花
の管に３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有するF₂植
物に帰属された。さらに、花弁の液胞のpHに影響を与え
るph遺伝子への連鎖に基いて、Hf１／Hf１遺伝子型をF₂
集団の植物に帰属させることが可能であった（Wiering
及びdeVlaming, 1984)。

【０１３４】V23 親系（Hf１／Hf１）はまた約6.２の花
弁ホネジネートpHをもたらすph１／ph１遺伝子型を有し
ていた。ph１／−植物は5.３の花弁ホモジネートpHを有
するので、花弁ホモジネートのpHを測定することにより
R51 x V23 F₂集団内のph１／ph１（Hf１／Hf１）植物を
区別することが可能であった。

【０１３５】Hf２及びPo遺伝子座間の連鎖を用いて、候
補Hf２クローンを区別した。Po座は、酵素カルコンフラ
バノンイソメラーゼをコードするＰ．ハイブリダchi Ａ
遺伝子に対応することが示されている（van Tunen ら、
1991）。従って、chi ＡのcDNAクローンは、F₂集団中の
個体にPo又はPo遺伝子型を帰属させるためのRFLP分析に
おいて使用することができた。V23 はHf２／Hf２，Po／
Po遺伝子型を有するので、chi Ａプローブにより検出さ
れるV23 様及びR51 様RFLPパターンとPo及びPoパターン
との同時分離（co-segregation）によりHf２遺伝子座へ
の連鎖を決定することができた。

【０１３６】シトクロムP450同族体の３′−非翻訳領域
に対応するcDNA断片を使用して、V23 x R51F₂ 集団中の
個々の植物から単離されたゲノムDNA のサザンブロット
及びRNA ブロットをプローブした。この分析により、cD
NAクローンpCGP174 及びpCGP175 に対応する遺伝子が
３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性に平行する態様で発
現されたことが示された。さらに、pCGP174 に対応する
遺伝子はHf１遺伝子座に密接に関連しており、そしてpC
GP175 はHf２遺伝子座に関連していることが示された。

【０１３７】ａ．pCGP174 クローンpCGP174(図14）からの330bp のHin d III −Kp
n I ３′−断片はRNA及びDNA の両ブロット上のハイブ
リダイゼーションのパターンを与え、このパターンはこ
のクローンがHf１遺伝子座に対応することを示した（図
16, 17）。この遺伝子は周縁組織及び管組織の両方で発
現され、そして３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性と平
行する発達プロフィールを有し、段階３の花弁周縁にピ
ークを示した。葉においては発現は観察されなかった
が、この組織においてグルコース／高光処理により誘導
された。さらに、hf１／hf１変異系R51 及びSw63の花弁
組織中に遺伝子の検出可能な発現は存在しなかった。こ
れに対して、Hf１／Hf１系V23 及びTh7 並びにV23 x R5
1 雑種においては高レベルの発現が観察された（図1
6）。

【０１３８】Xba I により消化されたゲノムDNA のサザ
ンブロットにおいて、pCGP174 からの330bp のHin d II
I −Kpn I ３′−断片は、V23 x R51 F₂集団において独
立に分離する（segregate)２つのRFLPを検出した。RFLP
#1は強くハイブリダイズするDNA バンドに対応し、他方
RFLP#2は弱くハイブリダイズするバンドに対応した（図
17を参照のこと）。ph１／ph１遺伝子型に帰属された12
の植物の11がRFLP#1についてV23 様パターンを有し、そ
して管において３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有
する49の植物の内49がRFLP#1についてV23 又はVR様パタ
ーンのいずれかを有していた。さらに、全32の植物につ
いて、chi Ａ（Po）についてのV23, VR及びR51 RFLPパ
ターンとRFLP#2の対応するパターンとの完全な同時分離
（co−segregation)が存在した。

【０１３９】これらのデーターは、pCGP174 が３′，
５′−ヒドロキシラーゼをコードしておりそしてHf１遺
伝子座（RFLP#1）に対応すること、及び３′−プローブ
がHf２遺伝子座（RFLP#2）にクロスハイブリダイズする
ことの強力な証拠を提供した。

【０１４０】ｂ．pCGP175 クローンpCGP175(図15）からの320bp のHin d III −Xh
o I ３′−断片はRNA及びDNA ブロットの両者上のハイ
ブリダイゼーションのパターンを与え、このパターンは
このクローンがHf２遺伝子座に対応することを示唆した
（図18, 19）。ノザン分析が示すところによれば、この
遺伝子はpCGP174 と同様に発生的に制御され、段階３の
OGB 花弁周縁において最大の発現を示すが、OGB の管組
織においては発現は観察されなかった。この遺伝子はま
た、V23(Hf２／Hf２），Th7(Hf２／Hf２）、及びV23 x
R51 雑種の花弁組織中でも発現された（図18）。

【０１４１】サザンブロットにおいて、pCGP175 からの
320bp Hin d III ／Xho I 断片は、pCGP174 の３′側プ
ローブ（RFLP#2）に弱くハイブリダイズするV23 及びR5
1 ゲノムDNA のXba I 消化により生成した同じゲノム断
片にハイブリダイズした。pCGP175 の３′側プローブに
より検出されるV23 ，VR及びR51 様RFLPパターン並びに
chi −Ａ（Po）についての対応するRFLPパターンの完全
な同時分離（co−segregation)が存在した。

【０１４２】次に発現実験（下記参照のこと）は、pCGP
175 及びpCGP174 の兄弟（pCGP176)の両者が３′，５′
−ヒドロキシラーゼをコードしていることを確認した。
さらに、hf１／hf１，hf２／hf２ペチュニアの変異株に
おけるpCGP174 の完全長バージョンの発現は増加した
３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性、及び非−トランス
ジェニック植物において通常見出される低い基底レベル
を上回る３′，５′−ヒドロキシル化アントシアンの生
産をもたらした。RFLPの結果と相まって、これらのデー
ターから、pCGP174 がHf１遺伝子座に対応し、そしてpC
GP175 がHf２遺伝子座に対応することが結論された。

【０１４３】完全長Hf１cDNAクローンの単離及び配列分
析 予備的配列分析から、pCGP174 は対応する転写物の完全
長クローンを代表せず、pCGP175 が推定上の開始コドン
を含み、そして完全長cDNAであると推定された。配列分
析はさらに、pCGP176 はpCGP174 の一層長いバージョン
であって、５′−末端から176bp にATG コドンを含有す
ることを示した。しかしながら、この分析のみからは、
pCGP176 がこの遺伝子の全コード領を含有するか否かを
確信して予想することは不可能であった。行って、pCGP
174 ／pCGP176 兄弟群の一層長いクローンについて、cD
NAライブラリー#2をスクリーニングした。cDNAライブラ
リー#2からの約1.５×10⁵ 個の組換体を、pCGP174 から
の 0.33Kb Hin d III −Kpn I ３′−断片にハイブリダ
イズするクローンについてスクリーニングした。pCGP60
1 及びpCGP602 と称するハイブリダイズするクローン
を、更なる分析のために選択した。pCGP601 及びpCGP60
2 の両者は推定上の翻訳開始コドンを含んでいたが、pC
GP602 はより長い５′−非翻訳領域を含んでいた。

【０１４４】クローンの配列決定のために適合された方
法及びオーバーラップする配列情報を得るために使用さ
れたオリゴヌクレオチドプライマー配列を示すpCGP602
の制限酵素地図を図20に示す。兄弟株pCGP176 及びpCGP
602 のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を
図21〜24に示す。同様に、図25〜27はpCGP175 のヌクレ
オチド配列及び推定される翻訳生成物を示す。

【０１４５】LFASTAプログラム（Pearson 及びLipman,
1988）により生ずる整列を用いて、ペチュニアの３′，
５′−ヒドロキシラーゼ遺伝子によりコードされるアミ
ノ酸配列は94％の位置的同一性を共有することが見出さ
れた。ヌクレオチド配列は94％同一であった。シトクロ
ムP450の分類方式に基いて、この配列の類似性は両遺伝
子を同じファミリー／サブ−ファミリーに置いた。
３′，５′−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列はシトク
ロムP450スーパーファミリーのすでに特性決定された構
成員のいずれとも40％未満の同一性を共有するので、対
応する遺伝子は、他のすべてのP450遺伝子とは別の新し
いP450ファミリーに属する。

【０１４６】酵母におけるpCGP175 cDNAの発現 pCGP175 からのcDNA挿入部を酵母ベクターpYGA22m 中の
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロ
モーターの後にセンス方向に連結した。pCGP618(図28）
と称する得られた構成物を酵母Ｇ−1315株（Ashikari
ら、1989）に形質転換した。単一形質転換体を50mLのYN
BC中で30℃にて２日間増殖させた。この培養物から調製
したミクロソーム画分は３′，５′−ヒドロキシラーゼ
活性を有することが示されたが、非形質転換酵母から調
製された同等の画分は活性を有しなかった（図29〜3
0）。このことから、pCGP175 からのcDNA挿入部は
３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードしていると結論
された。

【０１４７】酵母におけるpCGP176 cDNAの発現 pCGP176 からのcDNA挿入部を酵母ベクターpYGA22m 中の
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロ
モーターの後にセンス方向に連結した。pCGP620 と称す
る得られた構成物を酵母Ｇ−1315株に形質転換した。形
質転換された酵母から調製された抽出物は３′，５′−
ヒドロキシラーゼ活性を有するが、非形質転換酵母から
調製された同等の画分は活性を有しないことが示された
（図31）。このことから、pCGP176 からのcDNA挿入部は
３′，５′−ヒドロキシラーゼをコードしていることが
結論された。

【０１４８】Hf１cDNAの発現 ａ．hf１／hf１，hf２／hf２ Ｐ．ハイブリダF₁雑種Sk
r4 x Sw63 における発現 pCGP602 のcDNA挿入部をTi−バイナリーベクターpCGP29
3 のMac プロモーターの後に連結した。pCGP90（図32）
と称する得られた構成物を、アグロバクテリウム介在遺
伝子移送を用いてF₁ペチュニア雑種Skrx x Sw63 に導入
した。Skr4 x Sw63 の葉ディスクをAGLO／pCGP90と共に
同時培養し、そしてSkr4 x Sw63 ゲノムへのpCGP602 cD
NA挿入部の組み込みを、カナマイシン選択後に得られた
植物のサザン分析により確認した。

【０１４９】トランスジェニック植物は、非トランスジ
ェニックSkr4 x Sw63 雑種よりも有意に高いレベルの
３′，５′−ヒドロキシラーゼ酵素活性（図33）及び
３′，５′−ヒドロキシル化アントシアニン（表９）の
両方を有していた。Skr4 x Sw63はHf１遺伝子及びHf２
遺伝子の両方についてホモ接合性劣性であるが、低レベ
ルの３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性がSkr4 x Sw63
の花弁抽出物において検出されるので（図33）、これら
の変異は酵素生産を完全にはブロックしない。さらに、
酸加水分解されたSkr4 x Sw63 の花弁抽出物において低
レベル（100 μｇ／gm）のマルビジン（malvisin）が検
出された（表９）。Hf１cDNAの導入が花弁周縁組織中の
３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性のレベルを増加させ
（図33）、そしてトランスジェニック植物からの花弁の
酸加水分解された抽出物は、非トランスジェニック対照
において検出されたマルビジンの４倍のレベルを有して
いた。

【０１５０】ｂ．ニコチアナ・タバクム・カルチバー・
キサンシ（Nicotiana tabacum cultiva Xanthi）で
の発現 タバコ（Ｎ．タバクム cv Xanthi）の花は、唯一のアン
トシアニジンとしてシアニジンを生産する。pCGP90によ
るタバコの形質転換は、シアニジンに加えて有意量のデ
ルフィニジンの蓄積を導いた（表９）。

【０１５１】

【表９】

【０１５２】ｃ．hf１／hf１，hf２／hf２ Ｐ．ハイブ
リダF₁雑種Rp57 x Rw14 における発現 pCGP90，及びSkr4 x Sw63 について使用したのに類似す
る方法を用いて、ペチュニアRp57 x Rw14 系を形質転換
した。トランスジェニック花はかなりの量のペチュニジ
ン及びマルビジンを生産し、これらは非形質転換植物中
では検出されなかった（表10）。ペチュニジン及びマル
ビジンはいずれもデルフィニジンのメチル化誘導体であ
る。

【０１５３】

【表１０】

【０１５４】導入されたHf1 cDNAのSkr4 x Sw63 雑種に
おける発現は花の色に顕著な効果を有した。非トランス
ジェニック花の雄ずい葉及び雄ずい組織が白いが、トラ
ンスジェニック植物の同じ組織は青／紫色であった。さ
らに、Skr4 x Sw63 雑種におけるHf１cDNAの発現は、通
常は非常に淡いピンクである花冠深いピンク／スミレ色
の色合いを与えた。タバコの場合、デルフィニン誘導体
の生産は老化つつある花をわずかに青くした。Rp57 x R
w14 雑種におけるHf１cDNAの発現はやはり花の色に顕著
な効果を有した。非トランスジェニックRp57x Rw14の花
はピンクであり、主たるアントシアニジンであるペオニ
ジンが存在した（表10を参照のこと）。Hf１cDNAによる
形質転換は花の色を顕著に青くした。

【０１５５】観察される色の変化はまた、Royal Hortic
ultural Society's Color Chart からの番号として記載
することができる。一般に、変化は色を60C/D-65C/D の
淡青〜中間ピンク色調から、70と85の間のカラースクエ
アーのすべてではないが多くによって代表される暗青／
紫色調に動かすものとして記載することができる。達成
され得る可能な色の変化を限定することは望まないが、
Skr4 x Sw63 雑種において観察される色の幾つかは、65
B(非形質転換）から70B 及び74B （いずれも形質転換さ
れている）への変化を有するものとして記載することが
できよう。同様に、Rp57 x Rw14 雑種における幾つかは
64C から72B,77B そして82B に動くものとして記載する
ことができよう。他の生化学的及び生理学的条件が個々
の結果に影響を与えるであろうこと、及び達成される特
定の色への言及は可能な範囲を定義するものと解釈すべ
きでないことを記憶すべきである。

【０１５６】他の植物種における推定上の３′，５′−
ヒドロキシラーゼ遺伝子配列の検出 ３′，４′，５′−ヒドロキシル化フラボノイドの存在
は３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性、そしてそれ故に
３′，５′−ヒドロキシラーゼ遺伝子に関連する。他の
種からのこれらの遺伝は低ストリンジェンシー条件下で
ペチュニアの３′，５′−ヒドロキシラーゼ遺伝子とハ
イブリダイズするであろう。RNA(図34）及び／又はDNA
(図35）を多数のデルフィニジン生産植物から単離し、
³²Ｐ−ラベル化Hf１cDNAによりプローブし、そして異る
ストリンジェンシー条件下で洗浄した。すべての例にお
いてハイブリダイズするバンドを検出した。

【０１５７】従って、他のビルフィニジン生産植物から
の３′，５′−ヒドロキシラーゼ遺伝子の単離は、プロ
ーブとしてペチュニアの３′，５′−ヒドロキシラーゼ
遺伝子を用いて可能である。ここに記載した発明は、具
体的に記載したもの以外の変更が可能であることを当業
者は認識するであろう。本発明はこの様な変更のすべて
を包含すると理解すべきである。本発明はまた、本明細
書の個々に又は集合的に言及され又は示される段階、特
徴、組成物及び化合物、並びに該段階又は特徴の２以上
の任意のそしてすべての組合せを包含する。

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【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、フラボノイド色素の生合成経路の模式
図である。

【図２】図２は、フラボノイド色素の生合成経路の模式
図である。

【図３】図３は、Ｐ．ハイブリダcv V23（Hf１／Hf１，
Hf２／Hf２）の花弁抽出物中の３′，５′−ヒドロキシ
ラーゼ活性、及びＰ．ハイブリダcv R51（hf１／hf１，
hf２，hf２）における３′，５′−ヒドロキシラーゼ活
性の失損を示す図である。

【図４】図４は、異る発達段階におけるＰ．ハイブリダ
cv Old Glory Blue （OGB)花の花弁抽出物中の３′，
５′−ヒドロキシラーゼ活性を示す図である。

【図５】図５において、ＡはシトクロムP450をコードす
るmRNA分子の模式的表示図であり、ＢはcDNAライブラリ
ー#1からのシトクロムP450分子pCGP450 及びpCGP454 の
PCR 増幅のために使用されたオリゴの部分を示す図であ
る。

【図６】図６は、pCGP174 及びpCGP175 を含めてシトク
ロムP450同族体を同定するためにcDNAライブラリー#1を
プローブするのに用いたDNA 断片の模式図である。

【図７】図７は、pCGP142 からのcDNA挿入部についての
部分ヌクレオチド配列及び対応する推定アミノ酸翻訳生
成物を示す図である。

【図８】図８は、pCGP147 からのcDNA挿入部についての
部分ヌクレオチド配列及び対応する推定アミノ酸翻訳生
成物を示す図である。cDNAライブラリーをプローブして
pCGP174 を単離するために使用した領域は矢印で示され
ている。

【図９】図９は、pCGP147 からのcDNA挿入部についての
部分ヌクレオチド配列及び対応する推定アミノ酸翻訳生
成物を示す図である。

【図１０】図10は、 からのcDNA挿入部について
の部分ヌクレオチド配列及び対応する推定アミノ酸翻訳
生成物を示す図である。cDNAライブラリーをプローブし
てpCGP174 を単離するために使用した領域は矢印で示さ
れている。

【図１１】図11は、pCG158からのcDNA挿入部についての
部分ヌクレオチド配列及び対応する推定アミノ酸翻訳生
成物を示す図である。

【図１２】図12は、pCG160からのcDNA挿入部についての
部分ヌクレオチド配列及び対応する推定アミノ酸翻訳生
成物を示す図である。

【図１３】図13は、pCGP454 からのcDNA挿入部について
の部分ヌクレオチド配列及び対応する推定アミノ酸翻訳
生成物を示す図である。

【図１４】図14はプラスミドpCGP174 のダイアグラム図
である。

【図１５】図15はプラスミドpCGP175 のダイアグラム図
である。

【図１６】図16はpCGP174 cDNA挿入部の３′−領域によ
りプローブされたDNA ブロットのオートラジオグラフで
あり、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。

【図１７】図17はV23 _X R51(V/R)F₂植物のRFLP分析から
の代表的なオートラジオグラフであり、電気泳動の結果
を示す図面代用写真である。

【図１８】図18はpCGP175 cDNA挿入部の３′−領域によ
りプローブされたRNA ブロットのオートラジオグラフで
あり、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。

【図１９】図19は、V23 _X R51(V/R)F₂植物のRFLP分析か
らの代表的なオートラジオグラフであり、電気泳動の結
果を示す図面代用写真である。

【図２０】図20は、pCGP602 の制限酵素地図のダイアグ
ラム図である。

【図２１】図21はpCGP176 及びpCGP602 からのcDNA挿入
部のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を示
す図である。pCGP602 からの挿入部は、示される全配列
を含む。pCGP176 挿入部の５′−末端が矢印により示さ
れる。

【図２２】図22は、pCGP176 及びpCGP602 からのcDNA挿
入部のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を
示す図である。pCGP602 からの挿入部は、示される全配
列を含む。pCGP176 挿入部の５′−末端が矢印により示
される。

【図２３】図23は、pCGP176 及びpCGP602 からのcDNA挿
入部のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を
示す図である。pCGP602 からの挿入部は、示される全配
列を含む。pCGP176 挿入部の５′−末端が矢印により示
される。

【図２４】図24は、pCGP176 及びpCGP602 からのcDNA挿
入部のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を
示す図である。pCGP602 からの挿入部は、示される全配
列を含む。pCGP176 挿入部の５′−末端が矢印により示
される。

【図２５】図25は、pCGP175 からのcDNA挿入部のヌクレ
オチド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図２６】図26は、pCGP175 からのcDNA挿入部のヌクレ
オチド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図２７】図27は、pCGP175 からのcDNA挿入部のヌクレ
オチド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図２８】図28はpCGP618 の作製のダイアグラム図であ
る。

【図２９】図29は、基質として³H−ナリンゲニンを使用
しての酵素抽出物の３′，５′−ヒドロキシラーゼアッ
セイを示す電気泳動図であり図面代用写真である。

【図３０】図30は、基質として³H−ジヒドロケルセチン
(dihydroquercetin)を使用しての、酵母抽出物の３′，
５′−ヒドロキシラーゼアッセイを示す電気泳動図であ
り、図面代用写真である。

【図３１】図31は、基質として³H−ナリンゲニンを用い
ての酵母抽出物の３′，５′−ヒドロキシラーゼアッセ
イを示す電気泳動図であり、図面代用写真である。

【図３２】図32は、プラスミドpCGP90のダイアグラム図
である。

【図３３】図33は、ペチュニアの花弁抽出物の３′，
５′−ヒドロキシラーゼアッセイを示す電気泳動図であ
り、図面代用写真である。

【図３４】図34は、³²Ｐ−ラベルされたHf１cDNAにより
プローブされたRNA ブロットのオートラジオグラフを示
す電気泳動図であり、図面代用写真である。

【図３５】図36は、³²Ｐ−ラベルHf１cDNAによりプロー
ブされたサザンブロットのオートラジオグラフを示す電
気泳動図であり、図面代用写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コーニッシュ，エドウィナ セシリー オーストラリア国，ビクトリア 3808，ア ッパー ビーコンスフィールド，リードベ ター ロード，ロット 33 (72)発明者 コバシク，フィリパ オーストラリア国，ビクトリア 3072，プ レストン，カリムナ ストリート 11 (72)発明者 タナカ ヨシカズ オーストラリア国，ビクトリア 3084，ロ サナ，ベルビュー アベニュ ５／49 (72)発明者 レスター，ディアン ルース オーストラリア国，タスマニア，7190，ト リアブナ，バートン アベニュ 52

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列（III ）又は（IV）： （III ） Met Met Leu Leu Thr Glu Leu Gly Ala Ala Thr Ser Ile Phe Leu Ile 1 5 10 15 Ala His Ile Ile Ile Ser Thr Leu Ile Ser Lys Thr Thr Gly Arg His 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Val Ile Gly Ala Leu Pro Leu 35 40 45 Leu Gly Ala Met Pro His Val Ser Leu Ala Lys Met Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 Gly Ala Ile Met Tyr Leu Lys Val Gly Thr Cys Gly Met Ala Val Ala 65 70 75 80 Ser Thr Pro Asp Ala Ala Lys Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Ile Asn 85 90 95 Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Asn 100 105 110 Ala Gln Asp Met Val Phe Ala His Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Leu Leu 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Glu Asn 130 135 140 Trp Ala Asn Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ser Met 145 150 155 160 Ser Asp Met Ser Arg Glu Gly Gln Arg Val Val Val Ala Glu Met Leu 165 170 175 Thr Phe Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Met Leu Ser Lys Arg 180 185 190 Val Phe Val Asp Lys Gly Val Glu Val Asn Glu Phe Lys Asp Met Val 195 200 205 Val Glu Leu Met Thr Ile Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile 210 215 220 Pro Cys Leu Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Lys Arg Met Lys 225 230 235 240 Arg Leu His Lys Lys Phe Asp Ala Leu Leu Thr Lys Met Phe Asp Glu 245 250 255 His Lys Ala Thr Thr Tyr Glu Arg Lys Gly Lys Pro Asp Phe Leu Asp 260 265 270 Val Val Met Glu Asn Gly Asp Asn Ser Glu Gly Glu Arg Leu Ser Thr 275 280 285 Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Ser Ser Ser Ala Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Met Lys Asn 305 310 315 320 Pro Ala Ile Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Met Asp Gln Val Ile Gly 325 330 335 Arg Asn Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Arg Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu 355 360 365 Asn Leu Pro Arg Ile Ser Asn Glu Pro Cys Ile Val Asp Gly Tyr Tyr 370 375 380 Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg 385 390 395 400 Asp Pro Gln Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Asn Pro Glu Arg Phe 405 410 415 Leu Ser Gly Arg Asn Ser Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn Asp Phe Glu 420 425 430 Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met 435 440 445 Gly Ile Val Met Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe 450 455 460 Asp Trp Lys Leu Pro Ser Glu Val Ile Glu Leu Asn Met Glu Glu Ala 465 470 475 480 Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Val Thr 485 490 495 Pro Arg Leu Gln Leu Asp Val Tyr Val Pro 500 505 （IV） Met Val Leu Leu Ser Glu Leu Ala Ala Ala Thr Leu Ile Phe Leu Thr 1 5 10 15 Thr His Ile Phe Ile Ser Thr Leu Leu Ser Ile Thr Asn Gly Arg Arg 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Val Ile Gly Ala Leu Pro Leu 35 40 45 Leu Gly Ala Met Pro His Val Ser Leu Ala Lys Met Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 Gly Ala Ile Met Tyr Leu Lys Val Gly Thr Cys Gly Met Val Val Ala 65 70 75 80 Ser Thr Pro Asp Ala Ala Lys Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn 85 90 95 Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Gly 100 105 110 Ala Gln Asp Met Val Phe Ala His Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Leu Leu 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Glu Asn 130 135 140 Trp Ala Asn Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ser Met 145 150 155 160 Phe Asp Met Ser Arg Glu Gly Glu Arg Val Val Val Ala Glu Met Leu 165 170 175 Thr Phe Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Lys Arg 180 185 190 Val Phe Val Asn Lys Gly Val Glu Val Asn Glu Phe Lys Asp Met Val 195 200 205 Val Glu Leu Met Thr Thr Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile 210 215 220 Pro Cys Leu Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Lys Gly Met Lys 225 230 235 240 Arg Leu His Lys Lys Phe Asp Ala Leu Leu Thr Lys Met Phe Asp Glu 245 250 255 His Lys Ala Thr Ser Tyr Glu Arg Lys Gly Lys Pro Asp Phe Leu Asp 260 265 270 Cys Val Met Glu Asn Arg Asp Asn Ser Glu Gly Glu Arg Leu Ser Thr 275 280 285 Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Ser Ser Ser Ala Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Met Lys Asn 305 310 315 320 Pro Ala Ile Leu Lys Lys Ala Gln Gly Glu Met Asp Gln Val Ile Gly 325 330 335 Asn Asn Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Arg Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu 355 360 365 Asn Leu Pro Arg Ile Ser Asn Glu Pro Cys Ile Val Asp Gly Tyr Tyr 370 375 380 Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg 385 390 395 400 Asp Pro Glu Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Tyr Pro Glu Arg Phe 405 410 415 Leu Ser Gly Arg Asn Ser Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn Asp Phe Glu 420 425 430 Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met 435 440 445 Gly Ile Val Met Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe 450 455 460 Asp Trp Lys Leu Pro Ser Glu Val Ile Glu Leu Asn Met Glu Glu Ala 465 470 475 480 Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Val Thr 485 490 495 Pro Arg Leu Pro Ile Asp Val Tyr Ala Pro Leu Ala 500 505 に対して60％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列を
   コードするヌクレオチド配列、又はそれに対して相補的
   なヌクレオチド配列を有する核酸であって、フラボノイ
   ド３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質を
   コードする核酸。
2. 【請求項２】 前記フラボノイド３′，５′−ヒドロキ
   シラーゼ活性を有する蛋白質が、ペチュニア、バーベ
   ナ、ヒエンソウ、ブドウ、アイリス、フリージア、アジ
   サイ、シクラメン、ポテト、パンジー又はナス由来のも
   のである、請求項１に記載の核酸。
3. 【請求項３】 前記蛋白質がペチュニア由来のものであ
   る、請求項２に記載の核酸。
4. 【請求項４】 前記核酸が DNAである、請求項１〜３の
   いずれか１項に記載の核酸。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の核
   酸を含んでなり、核酸を植物細胞又は組織に移行せしめ
   ることができるベクター。
6. 【請求項６】 アグロバクテリウム(Agrobacterium) 属
   微生物により移行される請求項５に記載のベクター。
7. 【請求項７】 ベクターがpCGP90である、請求項５又は
   ６に記載のベクター。
8. 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の核
   酸、又は請求項５〜７のいずれか１項に記載のベクター
   が導入されたトランスジェニック植物もしくはこれと同
   じ性質を有するその子孫又はそれらの組織。
9. 【請求項９】 前記蛋白質がペチュニア、バーベナ、ヒ
   エンソウ、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、
   シクラメン、ポテト、パンジー又はナス由来である、請
   求項８に記載のトランスジェニック植物もしくはそれと
   同じ性質を有するその子孫又はそれらの組織。
10. 【請求項１０】 前記蛋白質がペチュニア由来である、
    請求項９に記載のトランスジェニック植物もしくはそれ
    と同じ性質を有するその子孫又はそれらの組織。
11. 【請求項１１】 前記トランスジェニック植物が、バ
    ラ、ペチュニア、キク、カーネーション、ガーベラ、ア
    イリス、チューリップ、ユリ、リシアンサス (Lisianth
    us) 、フリージア、ヒエンソウ、リモニウム (Limoniu
    m) 又はペラルゴニウム(Pelargonium) である請求項８
    〜10のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物も
    しくはこれと同じ性質を有するその子孫又はそれらの組
    織。
12. 【請求項１２】 前記トランスジェニック植物がバラ又
    はペチュニアである、請求項11に記載のトランスジェニ
    ック植物もしくはこれと同じ性質を有するその子孫又は
    それらの組織。
13. 【請求項１３】 前記組織が花である、請求項８〜12の
    いずれか１項に記載の植物の組織。
14. 【請求項１４】 請求項８〜12のいずれか１項に記載の
    トランスジェニック植物もしくはそれと同じ性質を有す
    るその子孫の切花。
15. 【請求項１５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
    核酸の発現により生成される、フラボノイド３′，５′
    −ヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質。
16. 【請求項１６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の
    核酸によりコードされているアミノ酸配列を有する、フ
    ラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ活性を有する
    蛋白質。
17. 【請求項１７】 次のアミノ酸配列（III ）又は（I
    V）： （III ） Met Met Leu Leu Thr Glu Leu Gly Ala Ala Thr Ser Ile Phe Leu Ile 1 5 10 15 Ala His Ile Ile Ile Ser Thr Leu Ile Ser Lys Thr Thr Gly Arg His 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Val Ile Gly Ala Leu Pro Leu 35 40 45 Leu Gly Ala Met Pro His Val Ser Leu Ala Lys Met Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 Gly Ala Ile Met Tyr Leu Lys Val Gly Thr Cys Gly Met Ala Val Ala 65 70 75 80 Ser Thr Pro Asp Ala Ala Lys Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Ile Asn 85 90 95 Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Asn 100 105 110 Ala Gln Asp Met Val Phe Ala His Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Leu Leu 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Glu Asn 130 135 140 Trp Ala Asn Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ser Met 145 150 155 160 Ser Asp Met Ser Arg Glu Gly Gln Arg Val Val Val Ala Glu Met Leu 165 170 175 Thr Phe Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Met Leu Ser Lys Arg 180 185 190 Val Phe Val Asp Lys Gly Val Glu Val Asn Glu Phe Lys Asp Met Val 195 200 205 Val Glu Leu Met Thr Ile Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile 210 215 220 Pro Cys Leu Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Lys Arg Met Lys 225 230 235 240 Arg Leu His Lys Lys Phe Asp Ala Leu Leu Thr Lys Met Phe Asp Glu 245 250 255 His Lys Ala Thr Thr Tyr Glu Arg Lys Gly Lys Pro Asp Phe Leu Asp 260 265 270 Val Val Met Glu Asn Gly Asp Asn Ser Glu Gly Glu Arg Leu Ser Thr 275 280 285 Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Ser Ser Ser Ala Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Met Lys Asn 305 310 315 320 Pro Ala Ile Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Met Asp Gln Val Ile Gly 325 330 335 Arg Asn Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Arg Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu 355 360 365 Asn Leu Pro Arg Ile Ser Asn Glu Pro Cys Ile Val Asp Gly Tyr Tyr 370 375 380 Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg 385 390 395 400 Asp Pro Gln Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Asn Pro Glu Arg Phe 405 410 415 Leu Ser Gly Arg Asn Ser Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn Asp Phe Glu 420 425 430 Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met 435 440 445 Gly Ile Val Met Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe 450 455 460 Asp Trp Lys Leu Pro Ser Glu Val Ile Glu Leu Asn Met Glu Glu Ala 465 470 475 480 Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Val Thr 485 490 495 Pro Arg Leu Gln Leu Asp Val Tyr Val Pro 500 505 （IV） Met Val Leu Leu Ser Glu Leu Ala Ala Ala Thr Leu Ile Phe Leu Thr 1 5 10 15 Thr His Ile Phe Ile Ser Thr Leu Leu Ser Ile Thr Asn Gly Arg Arg 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Val Ile Gly Ala Leu Pro Leu 35 40 45 Leu Gly Ala Met Pro His Val Ser Leu Ala Lys Met Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 Gly Ala Ile Met Tyr Leu Lys Val Gly Thr Cys Gly Met Val Val Ala 65 70 75 80 Ser Thr Pro Asp Ala Ala Lys Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn 85 90 95 Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Gly 100 105 110 Ala Gln Asp Met Val Phe Ala His Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Leu Leu 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Glu Asn 130 135 140 Trp Ala Asn Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ser Met 145 150 155 160 Phe Asp Met Ser Arg Glu Gly Glu Arg Val Val Val Ala Glu Met Leu 165 170 175 Thr Phe Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Lys Arg 180 185 190 Val Phe Val Asn Lys Gly Val Glu Val Asn Glu Phe Lys Asp Met Val 195 200 205 Val Glu Leu Met Thr Thr Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile 210 215 220 Pro Cys Leu Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Lys Gly Met Lys 225 230 235 240 Arg Leu His Lys Lys Phe Asp Ala Leu Leu Thr Lys Met Phe Asp Glu 245 250 255 His Lys Ala Thr Ser Tyr Glu Arg Lys Gly Lys Pro Asp Phe Leu Asp 260 265 270 Cys Val Met Glu Asn Arg Asp Asn Ser Glu Gly Glu Arg Leu Ser Thr 275 280 285 Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Ser Ser Ser Ala Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Met Lys Asn 305 310 315 320 Pro Ala Ile Leu Lys Lys Ala Gln Gly Glu Met Asp Gln Val Ile Gly 325 330 335 Asn Asn Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Arg Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu 355 360 365 Asn Leu Pro Arg Ile Ser Asn Glu Pro Cys Ile Val Asp Gly Tyr Tyr 370 375 380 Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg 385 390 395 400 Asp Pro Glu Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Tyr Pro Glu Arg Phe 405 410 415 Leu Ser Gly Arg Asn Ser Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn Asp Phe Glu 420 425 430 Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met 435 440 445 Gly Ile Val Met Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe 450 455 460 Asp Trp Lys Leu Pro Ser Glu Val Ile Glu Leu Asn Met Glu Glu Ala 465 470 475 480 Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Val Thr 485 490 495 Pro Arg Leu Pro Ile Asp Val Tyr Ala Pro Leu Ala 500 505 に対して60％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列を
    有し、且つフラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ
    活性を有する蛋白質。
18. 【請求項１８】 前記蛋白質が、ペチュニア、バーベ
    ナ、ヒエンソウ、ブドウ、アイリス、フリージア、アジ
    サイ、シクラメン、ポテト、パンジー又はナス由来であ
    る、請求項15〜17のいずれか１項に記載の蛋白質。
19. 【請求項１９】 前記蛋白質がペチュニア由来である、
    請求項17に記載の蛋白質。
20. 【請求項２０】 フラボノイド３′，５′−ヒドロキシ
    ラーゼ活性を有する蛋白質を発現することができるか、
    又は該蛋白質に翻訳できるmRNA分子の全部もしくは部分
    に実質的に相補的な核酸配列の転写を指令するトランス
    ジェニック植物の製造方法であって、請求項１〜４のい
    ずれか１項に記載の核酸を、最終的発現を可能にする条
    件下で植物の細胞に導入し、該細胞からトランスジェニ
    ック植物を再生し、そして該トランスジェニック植物を
    該核酸の発現を可能にするのに十分な時間及び条件下で
    成長せしめることを特徴とする方法。
21. 【請求項２１】 前記核酸の導入を、請求項５〜７のい
    ずれか１項に記載のベクターを用いて行う、請求項20に
    記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記核酸の発現が発生段階により制限
    される請求項20又は21に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記蛋白質がペチュニア、バーベナ、
    ヒエンソウ、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサ
    イ、シクラメン、ポテト、パンジー又はナス由来である
    請求項20〜22のいずれか１項に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記蛋白質がペチュニア由来である請
    求項23に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記植物がバラ、ペチュニア、キク、
    カーネーション、ガーベラ、アイリス、チューリップ、
    ユリ、リシアンサス、フリージア、ヒエンソウ、リモニ
    ウム又はペラルゴニウムである請求項20〜24のいずれか
    １項に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記植物がバラ又はペチュニアであ
    る、請求項25に記載の方法。