WO2005017147A1 - 花色が変更されたバラの製造方法 - Google Patents

花色が変更されたバラの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005017147A1
WO2005017147A1 PCT/JP2004/011958 JP2004011958W WO2005017147A1 WO 2005017147 A1 WO2005017147 A1 WO 2005017147A1 JP 2004011958 W JP2004011958 W JP 2004011958W WO 2005017147 A1 WO2005017147 A1 WO 2005017147A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
para
gene
blue
derived
group
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/011958
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshikazu Tanaka
Yuko Fukui
Junichi Togami
Yukihisa Katsumoto
Masako Mizutani
Original Assignee
International Flower Developments Proprietary Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by International Flower Developments Proprietary Limited filed Critical International Flower Developments Proprietary Limited
Priority to AT04771919T priority Critical patent/ATE527348T1/de
Priority to KR1020067003032A priority patent/KR101100930B1/ko
Priority to AU2004264488A priority patent/AU2004264488B2/en
Priority to US10/567,931 priority patent/US8410335B2/en
Priority to EP04771919A priority patent/EP1652916B1/en
Priority to CN2004800230883A priority patent/CN1836039B/zh
Priority to CA2537065A priority patent/CA2537065C/en
Priority to JP2005513219A priority patent/JP4690197B2/ja
Publication of WO2005017147A1 publication Critical patent/WO2005017147A1/ja
Priority to IL173603A priority patent/IL173603A/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing para having a new flower color. Specifically, a gene that artificially suppresses para endogenous metabolic pathways, and that encodes a flavonoid 35 light, monohydroxylase, and dihydromyricetin, which reduces pancreatic flavonoids.
  • the present invention relates to a method for producing roses by expressing a gene encoding flavonol reductase.
  • the current yellow paras were bred by crossing Rosa foeti da native to West Asia with paras that did not have the yellow variety.
  • the color of flowers is determined by the genetic ability of the plant, and there is a limit to the flower color that can be achieved by breeding by crossing, which has limited available gene sources (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1126, 1998, Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999). Above all, it is said that it is impossible to cultivate a blue para, but it has been considered a synonym for King Arthur's Holy Grail. 1990 Kodansha Blue Pax, Saizuki Aizuki "Blue Para" 2001 Shogakkan).
  • blue para refers to “mauve” para. It is said that the first breeding of “Blue Para” by mating is “Gray Pearl”, a gray with light purple color, created in 1945. Later, in 1957, light purple pink “Sterling Silver” was produced, and many varieties of these varieties, such as “Bloom-In” (created in 1964) and “Madam Biore” (created in 1981), were used as mating parents. A color para is being made. By using these mauve-type paras and breeding more, pale gray paras such as Seiryu (created in 1992) and Blue Heaven (created in 2002) are created. It is attracting attention as a new type of “blue para.”
  • the color of these flowers is not actually blue, but rather a greyish, crisp pink, and despite years of breeding efforts, there is still no para to be called “blue”.
  • the Royal Horticulture Society Color Chart generally refers to the group of palaces, villas and benorays as “blue”.
  • the present invention aims at the creation of paras having flower colors indicated by the Pirate Group, the Pirates Toble Group or the Blue Group at the Royal Horticultural Society Power Ratchato.
  • the color of the flower is mainly derived from three kinds of compounds, anthocyanins, carotenoids and betalains, but the blue color has the maximum absorption wavelength range.
  • Anthocyanin is a type of flavonoid and is biosynthesized by the metabolic pathway shown in Fig. 1.
  • Antosyanin is normally located in the vacuoles of epithelial cells.
  • the color of anthocyanin ie, the color of the flower greatly depends on the structure of anthocyanin, and the more the number of hydroxyl groups in the B ring, the more blue.
  • Ring B hydroxylation is catalyzed by flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) and flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase (F3'5'H). If there is no F3'H activity and no F3'5'H activity, pelargidine (orange to red) is synthesized, and if there is F3'H activity, cyanidin (red to red) is synthesized, and F3'5 If there is' H activity, delphinidin (purple) is synthesized.
  • flavonoid 3'-hydroxylase F3'H
  • flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase F3'5'H
  • anthocyanidins are modified with sugars and acyl groups to produce various anthocyanins.
  • the more aromatic acyl groups to modify the bluer the anthocyanin.
  • Anthocyanin changes its color significantly depending on the vacuolar pH, coexisting flavonol-flavones, metal ions, etc. (Norio Saito Protein Nucleic Acid Enzyme 47 202-209 2002, Broullard and Dangles, In the flavonoids: Advances in Research since ⁇ 986 (Ed by Harborne) Capmann and Hall, London pp5b5-588, Tan aka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1126, 1998, Mol et al, Trends in Plant Science 3, 212-217 1998, Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999).
  • Parapetal anthocyanin is a derivative of peranolegonidin, a derivative of cyanidin and zeonidine, and no derivative of delphinidin (Biolley and May, J. Experimental Botany, 44, 1725-1734).
  • R. mui t if ⁇ ora, R. chinens is, R. igantean, R. moschata, R. gal ⁇ ica, R. whichuraiana, R. foetida, etc.
  • indigo eg, Appl Microbiol Biotechnol 2003 Feb; 60 (6): 720-5
  • indigo plants as examples of blue and purple pigments produced by living organisms, and violacein produced by microorganisms (J. Mol. Microbiol. Biotec hnol. 2000 Oct; 2 (4): 513-9, Org. Lett., Vol. 3, No. 13, 2001, 1981-1984), which may be derived from tryptophan.
  • biosynthetic pathway eg, Appl Microbiol Biotechnol 2003 Feb; 60 (6): 720-5
  • indigo plants as examples of blue and purple pigments produced by living organisms
  • violacein produced by microorganisms
  • DFR dihydrokenferol
  • DFR dihydroflavonol reductase
  • DFR has already been cloned from many plants (petunia, octopus, para, trennia, goldfish, gerbera, cymbidium, oats, corn, etc.) (Meyer et al. Nature 330, 677-678, 1987, Helariutta et al. Plant Mol. Biol. 22 183-193 1993, Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, John son et al. Plant J. 19, 81-85, 1999).
  • the substrate specificity of the DFR gene varies depending on the plant species.
  • the DFR genes of petunia, tobacco, and symbidium cannot reduce DHK, and the DFR gene of petunia efficiently reduces DDH even if it has DHM in dihydroflavonol. It has been abandoned (Forkmann et al. Z. Naturforsch. 42c, 1 146-1148, 1987, Johnson et al. Plant J. 19, 81-85, 1999). However, no examples have been reported in which these DFR genes are expressed in para.
  • RNAi method Waterhouse et al. Pro Natl. Acd. Sci. USA 95, 13959-13964 1998.
  • Patent Document 2 W093 / 18155
  • Patent Document 3 USP 5480789
  • Patent Document 4 USP 5792927
  • Patent Document 5 EP 536 327 A1
  • Patent Document 6 US 20010007157 Al
  • Patent Document 7 W094 / 28140
  • Non-Patent Document 1 Honda Toshio et al. Hyundai Kagaku May 25-32 (1998)
  • Non-Patent Document 2 Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-11 26, 1998
  • Non-Patent Document 3 Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999
  • Non-Patent Document 4 Hideaki Oba "Birth of Para” 1997 Chuko Shinsho
  • Non-patent document 5 Masahiko Suzuki "The magic of plant bio The blue para is also a dream It's gone. '' .1990 Kodansha Blue Pax
  • Non-patent document 6 Saizu Azuki “Blue Para” 2001 Shogakukan
  • Non-Patent Document 7 Norio Saito Protein Nucleic Acid Enzyme 47 202-209 2002
  • Non-special reference literature 8 Broullard et al. In the flavonoids: Advances in Research since 1986 (Ed by Harborne) Capmann and Ha ⁇ ⁇ , ndon pp565-588
  • Non-Patent Document 9 Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-11 26, 1998
  • Non-Patent Document 11 1 Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 1998-201 1999
  • Non-Patent Document 1 Biolley and May, J. Experimental Botany, 4 4, 1725-1734 1993
  • Non-Patent Document 13 Mikanagi Y, et al. (2000) Biochem Systematics Ecol. 28: 887 902
  • Non-Patent Document 14 Appl Microbiol Biotechnol 2003 Feb; 60 (6): 7
  • Non-Patent Document 15 J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000 Oct; 2 (4): 513-9
  • Non-Patent Document 16 Lett., Vol. 3, No. 13, 2001, 1981-198
  • Non-Patent Document 17 S. Fujikawa, et al. (1987) Tetrahedron Lett. 28 (40), 4699-700
  • Non-Patent Document 18 S. Fujikawa, et al. (1987) J. Ferment. Tec hnol. 65 (4), 419-24
  • Non-Patent Document 1 9 Holton et al. Nature 366, 276-279, 1993
  • Non-Patent Document 20 Tanaka et al. Plant Cell Phvsiol. 37, 711-716 1996
  • Non-patent document 22 Protein nucleic acid enzyme, Vol. 47, No. 3, p228, 2002
  • Non-patent document 23 Meyer et al. Nature 330, 677-678, 1987
  • Non-patent document 24 Helariutta et al. Plant Mol. Biol . 22 183- 193 1993
  • Non-Patent Document 25 Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 102 3-1031
  • Non-Patent Document 26 Johnson et al. Plant J. 19, 81-85, 1999
  • Non-Patent Document 28 Nat Biotechnol 2002, 20: 1030-4
  • Non-patent Document 29 van der Krol et al. Nature 333, 866-869, 1988
  • Non-patent document 30 Napoli et al. Plant Cell 2, 279-289, 1990
  • Non-patent document 3 Waterhouse et al. Pro. Natl. Acd. Sci. USA 95, 13959-13964 1998
  • Non-Patent Document 3 2 Gutterson HortScience 30: 964-966 1995
  • Non-Patent Document 3 3 Shozo Suzuki, “Rose and Flower Charts", Shogakukan, p.256-260, 1990 Disclosure of the Invention
  • the color of the para flower could be modified by introducing the F3'5'H gene into para and expressing it in petals.
  • the F3'5'H gene and the petunia DFR gene were expressed in DFR-deficient varieties.
  • a blue-violet carnation was created.
  • “blue para” has not yet been created. Therefore, the present invention seeks to provide paras that bloom blue flowers. Therefore, the present invention is characterized by (1) artificially suppressing the intrinsic metabolic pathway of para and expressing a gene encoding a flavonoid 3,5′-hydroxylase derived from pansy. Provide a method for producing roses.
  • the present invention also provides (2) a gene which artificially suppresses the endogenous metabolic pathway of para and encodes flavonoids 3, 5, 5, monohydroxylase derived from pansy and dihydroflavonol reductase. And a method for producing para, characterized by expressing a gene to be transformed.
  • the present invention further provides (3) a gene other than para and a gene encoding a flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase derived from pansy, which artificially suppresses the expression of para endogenous dihydroflaponol reductase. It is intended to provide a method for producing para, which is characterized by expressing a gene encoding dihydroflaponol reductase derived therefrom.
  • the present invention further provides (4) a gene which artificially suppresses the expression of para endogenous flavonoid 3'-hydroxylase and encodes flavonoid 3 ', 5' monohydroxylase derived from pansy And a method for producing para.
  • the gene encoding the flavonoid 3 ', 5, -hydroxylase of the panji is, for example, the gene described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. Further, the gene encoding dihydroflavonol reductase is preferably derived from Iris, Neirenbergia, Petunia, Cymbidium, Gentian, Eustoma.
  • the present invention further provides (5) a para or a child thereof having the same properties as those obtained by the production method according to any one of (1) to (4). Provide grandchildren or their organizations.
  • the present invention also provides (6) para or the same property as that of para, in which the color of the petals of the para obtained by any one of the above-mentioned processes (1) to (4) is purple, bluish purple or blue.
  • the color of the petals of the para belongs to the violet group, violet table group or blue group of the Royal Horticultural Society Color Chart (RHSCC).
  • RHSCC Royal Horticultural Society Color Chart
  • the present invention further relates to the aforementioned para (7), wherein the color of the petals of the para belongs to 85a or 85b of the biolet group of the Royal Horticultural Society Color Chart (RHSCC). Or provide offspring or their tissues with the same properties.
  • RHSCC Royal Horticultural Society Color Chart
  • Figure 1 shows the flavonoid biosynthetic pathway.
  • CHS chalcone synthase
  • CHI chalcone isomerase
  • FNS Flavone synthase
  • F3H Flapanon 3-hydroxylase
  • F3'H Flavonoid 3, monohydroxylase
  • F3'5'H Flavonoid 3,5'_hydroxylase
  • FLS Flavonol synthase
  • FIG. 2 shows the structure of plasmid pBERDl.
  • FIG. 3 shows the structure of plasmid pBPDBP2.
  • FIG. 4 shows the structure of plasmid pBPDBP8.
  • FIG. 5 shows the structure of the Plushead PSPB461.
  • FIG. 6 shows the structure of the positive head PSPB472.
  • FIG. 7 shows the structure of PSPB130.
  • FIG. 8 shows the structure of PSPB919.
  • FIG. 9 shows the structure of PSPB920.
  • FIG. 10 shows the structure of PSPB1106. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the flower color does not turn blue when rose produces delphinidin.
  • Modification of the acyl groups and sugars alters the stability, solubility, and color of anthocyanins. That is, it is known that the color becomes blue due to the addition of an aromatic acyl group.
  • a co-pigment such as flavonol-flavones and anthocyanin form a complex, the color turns blue, the maximum absorption wavelength shifts to longer wavelengths, and the absorbance increases.
  • the color of anthocyanin also changes with pH.
  • the color of the flower depends on the pH of the vacuole where anthocyanin is localized, because it becomes red at low pH and becomes blue near neutrality.
  • the formation of a metal complex due to coexistence with metal ions such as Al 3 + and Mg 2 + has a significant effect on flower color in some cases.
  • pansy F3'5'H gene and pechu were added to white flower variety Tineke.
  • the DFR gene was transfected, the accumulation of delphinidin was observed, but the amount was small and did not result in blue para.
  • the gene of DFR an enzyme belonging to the para-endogenous flavonoid synthesis pathway, is artificially suppressed using genetic engineering techniques, and the F3'5'H gene of pansy is expressed. Furthermore, by expressing the DFR gene that reduces dihydromyristetin to reduce the content of delphinidin to approximately 80-100% of the total anthocyanidins contained in petals, a blue paraffin can be obtained. Was realized.
  • the iris (Iridaceae), Neirenbergia (Solanaceae), and Petunia (Solanaceae) DFR genes used to reduce dihydromilistetin were used.
  • Other sources of DFR genes that reduce dihydromilistetin include tobacco. Plants that do not accumulate pelargodin, such as (Solanaceae), Cyclamen (Prunaceae), Delphinium (Ranunculaceae), Cymbidium (Ranaceae), Gentian (Lentinaceae), Eustoma (Lentinaceae) (Forkmann 1991 Plant Breeding 106 1-26 Johnson et al., Plant J. 1999 19 81-85).
  • the DFR gene used in the present invention is preferably a gene that preferentially reduces dihydromyristin.
  • the gene of flavonoid 3′-hydroxylase (F3′H), which is an enzyme belonging to the para-endogenous flavonoid synthesis pathway, is artificially suppressed using genetic engineering techniques.
  • F3′H flavonoid 3′-hydroxylase
  • the paras obtained according to the present invention have an unprecedented flower color, and according to the present invention, the Red-Purple Gnorape, the Purple Group and the Purple-Paio on the Royal Horticultural Society Color Chart. It is possible to provide not only lett-go-no-rape but also flower-let-no-go-no-go, bio-let-blue group, and paras with flower color belonging to the blue group.
  • the petal color evaluation was measured using a spectrophotometer CM2022 (Minolta Co., Japan) with a 10-degree field of view and a D65 light source, and analyzed by the color management software SpectraMagic (Minolta Co., Japan). went.
  • the British Royal Horticultural Society Power Color Chart (RHSCC) number is based on the color values (CIE L * a * b * color system) obtained by visual judgment and the above instrument measurement. Approximate color matching was performed using a classification system Version 2.1.1 (Japan Research Institute, Limited, Japan, JP-A-2002-016935). By using this system, an approximate RHSCC number can be selected objectively.
  • Detection was performed using a photodiode array detector SPD-M10A (Shimadzu Corporation) to measure the spectrum from 600 to 400 nm, identified by the absorption maximum ( ⁇ max) and retention time (RT), and quantified by the area of the absorbance at 520 nm. did. Under these HPLC conditions, the retention times of delphinidin and cyanidin and L max were 4.0 min, 5.2 min and 534 nm, 525 nm. For identification and quantification, delphinidin hydrochloride and cyanidin hydrochloride purchased from Funakoshi Co., Ltd. were used as standards. 3) Flavonol analysis
  • Petal extraction filtrate (0.2 ml) was vacuum-dried in a 1.5 ml Eppendorf tube, dissolved in 0.2 ml of 0.1M potassium phosphate buffer (KPB) pH 4.5, and 6 units of] 3-darcosidase (Shin Nippon Chemical Co., Ltd.) and 1 unit of naringenase (Sigma Chemical Co., MO, USA)! ], And kept at 30 ° C for 16 hours. After the reaction, 0.2 ml of 90% CH 3 CN was added to the enzyme reaction solution to terminate the reaction. This solution was filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and subjected to HPLC under the following conditions.
  • KPB potassium phosphate buffer
  • the column used was Develosil C30-UG-5 (4.6 mm x 15 cm, Nomura Chemical Co., Ltd.), the flow rate was 0.6 ml / min, and the mobile phase was 18% to 63% CH 3 CN / H 2 containing 0.1% TFA. After a 10-minute linear gradient of 0, an isocratic elution of 63% CH 3 CN / H 20 containing 0.1% TFA was performed for 10 minutes.
  • the detection was performed using the photodiode array detector SPD-M10A, and the wavelength region of 400 to 250 nm was detected. Under these conditions, the RT. And ⁇ max of kenferol and quercetin were 370 nm for 11.6 minutes, 365 nm and 10.3 minutes, respectively.
  • the quantification was performed on an area of A330 nm, and Kenfueronoré and Kenorecetin from Funakoshi Co., Ltd. were used as standards.
  • a cDNA library derived from rose petals of cardinal petals was screened using the petunia DFR gene (described in W096 / 36716) as a probe to obtain para DFR cDNA, which was designated as pCGP645. Details have already been reported (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031 1995).
  • DFR gene In order to produce blue varieties by genetic modification, only the DFR gene is used to avoid competition between the endogenous anthocyanin synthesis pathway and the gene to be introduced (specifically, the F3'5'H gene). Defective varieties can be selected, and the DFR gene and F3'5'H gene derived from petunia can be introduced into the varieties (W096 / 36716).
  • the composition of petal flavonoids was analyzed by the method described in Example 1 for 112 white paralines, and a line with a high accumulation of flavonols was selected. Then, the pH of the petal juice was measured, and 80 varieties with relatively high pH were selected as primary candidates.
  • RNA was extracted according to a known method (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-103 1 1995).
  • the presence or absence of mRNA corresponding to the para DFR gene (Tanaka et al. PIant Cell Physiol. 36, 1023-1031 1995) and the paraantocyanidin synthase (ANS) gene was examined.
  • Eight varieties with low levels of endogenous DFR mRNA and normal ANS mRNA levels by RT-PCR (WKS-11, 13, 22, 22, 36, 43, White Killarney, Vine .2, Tineke).
  • RT-PCR was performed using RNA obtained from the petals of each cultivar. Script First-strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) was used. Detection of DFR mRNA PKO POMA For detection of ANS mRNA, primers of AN S-2F (5, -TGGACTCGAAGAACTCGTCC-3 ') (SEQ ID NO: 15) and ANS-2B (5, -CCTCACCTTCTCCCTTGTT-3') (SEQ ID NO: 16) were used.
  • pE2113 (Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37, 45-59 199 (6) has a reflowering mosaic virus 35S (E1235S) promoter and a nopalin synthase terminator with repeated enhancer sequences.
  • This plasmid was digested with Sacl and blunt-ended using Blunting Kit (Takara). This DNA fragment was ligated with an 8-bp Sail linker (Takara), and the resulting plasmid was designated as pUE5.
  • pBE5 Approximately 3 kb DNA fragment obtained by digesting PUE5 with Hindlll and EcoRI was digested with Hindill and EcoRI.pBinl9 (Bevan M, Binary Agrobacterium Vector for plant transformation.Nucl.Acid Res. 12.8711 -21, 1984), and the resulting plasmid was designated as pBE5.
  • pCGP645 was digested with BamHI and Xhol to obtain a DNA fragment containing full-length para-DFRc DNA. This was ligated to pBE5, which was transformed with BamHI and Xhol, to give pBERDl (Fig. 2). This plasmid was introduced into Agrobacterium tumefaciens AglO strain.
  • PBERDl (Fig. 2) was introduced into the white para variety Tineke, and 18 transformants were obtained. Flower color changed in 6 individuals among the obtained transformants. Colorimetric analysis was performed on the two individuals that had a distinct flower color from white to pink, and both showed accumulation of cyanidin and pelargonidin (Table 2). Based on these results, it was inferred that the cultivar Tineke was a cultivar lacking the DFR gene.
  • the membrane was prehybridized in a hybridization buffer (10% (v / v) formamide, 1 NaCl, 10% (w / v) dextran sulfate, 1% SDS) at 42 ° C for 1 hour. Thereafter, a probe labeled with 32 P was added thereto at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cpm / ml, and hybridization was carried out at 42 ° C. for 16 hours. Thereafter, the membrane was washed in 2 x SSC, 1% SDS at 42 ° C for 1 hour, and further washed with a new washing solution for 1 hour. After washing, the membrane was exposed to Kodak XAR film together with the sensitized screen, and a hybridization signal was detected.
  • a hybridization buffer 10% (v / v) formamide, 1 NaCl, 10% (w / v) dextran sulfate, 1% SDS
  • pUE5 was digested with EcoRI and ligated with a blunt-ended DNA fragment and an 8-bp Hindlll linker (Takara) using a Blunting Kit (Takara), and the resulting plasmid was designated as pUE5H.
  • Plasmid p CGP1959 (containing pancreatic F3,5'H # 18 cDNA) was completely digested with BamHI, and a DNA fragment of about 1.8 kb obtained by partially digesting with Xhol was recovered.
  • the plasmid obtained by ligating with pUE5H digested with Xhol was designated as pUEBP18.
  • a DNA fragment containing petunia DFR cDNA was recovered by digesting pCGP1403 (W096 / 3 6716) with BamHI and Xhol, and ligating this DNA fragment with pBE5 digested with BamHI and Xhol, pBEPD2.
  • pUEBP18 was partially digested with Hindlll, and a DNA fragment of about 2.8 kb containing the E1235S promoter, pansy-derived F3, 5, H # 18 cDNA and nos terminator was recovered.
  • This fragment and a DNA fragment obtained by partially digesting pBEPD2 with Hindi II were ligated to obtain a binary vector plasmid pBPDBP2 (FIG. 3).
  • This plasmid was used as an Agrobacterium tumefaciens AglO strain.
  • PBPDBP2 (Fig. 3) was introduced into a white para variety “Tineke” to obtain 40 transformants.
  • Plasmid pE2113 (Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37, 45-59 1996) was digested with Hindll I and Xbal, and a DNA fragment of about 800 bp was recovered, and pBinl9 (Bevan M9) was digested with Hindlll and Xbal. , Binary Ag robacteriumium Vector for plant transformation.Nuc ⁇ . Acid Res.
  • pCGP1391 The obtained plasmid was designated as pCGP1391.
  • pCGP669 (described in W094 / 28140) contains the promoter of the petunia chalcone synthase A (CHS-A) gene. This Plasmids were digested with EcoRI, blunt-ended, and further digested with Hindlll.
  • This approximately 700 bp DNA fragment was ligated with pCGP1391 digested with Hindlll and SnaBI, and the resulting plasmid was designated as PCGP1707.
  • a plasmid pCGP1961 containing F3, 5, HMO cDNA derived from pansy is completely digested with BamHI, and a DNA fragment of about 1.8 kb obtained by partially digesting with Xhol is recovered, and digested with BamHI and Xhol.
  • the resulting plasmid ligated with pUE5H was designated as PUEBP40.
  • An approximately 5.5 kb DNA fragment obtained by digesting pUEBP40 with EcoRV and Xbal was recovered.
  • pUFBP40 was partially digested with HindIII to recover a DNA fragment of about 3.4 kb containing cauliflower 35S promoter-enhancer, CHS-A promoter, pansy-derived F3,5, and H # 40 cDNAnos terminator.
  • This fragment was ligated with a DNA fragment obtained by partially digesting PBEPD2 with Hindlll to obtain a binary vector plasmid pBPDBP8 (FIG. 4). This plasmid was introduced into Agrobacterium tumefaciens AglOte 7 cells.
  • PBPDBP8 (Fig. 4) was introduced into a white rose cultivar “Tineke” to obtain 53 transformants. Flower color changed in 17 of the obtained transformants, and accumulation of delphinidin was confirmed in 8 of 9 out of 9 plants subjected to pigment analysis (Table 4). The delphinidin content reached a maximum of 93% (average 79%), but the pigment content was extremely low at 0.014mg / g of petals even at the highest, and the flower color was 56a (from RHS color chart 158d (YELL0W-WHITE GROUP)).
  • PBPDBP2 (Fig. 3) was introduced into the white para-WKS36, and 138 transformants were obtained. Flower color was changed in 10 individuals among the obtained transformants, and accumulation of delphinidin was confirmed in all individuals (Table 5). The content of delphinidin reached a maximum of 91% (average 60%), but the amount of pigment was extremely low at 0.033mg / g of petals, and the flower color changed only to pale pink, and RHSCC's knowledge group, Violet One Blue Group and Blue Group were not reached, and the desired blue para could not be obtained. In addition, the above suggests that cultivar WKS36 is not a cultivar lacking only the DFR gene. Table 5
  • Chromosomal DNA was extracted from young leaves of rose variety Kardinal (Tanaka et al., Plant Cell Physiol., 36: 1023-1031, 1995). About lOO ⁇ g of DNA was partially digested with Sau3AI, and a DNA fraction of about 20 kb was recovered by sucrose density gradient.
  • Lambda CHS20 of the obtained chromosome clone of chalcone synthase contained a DNA sequence of about 6.4 kb upstream of the initiation codon of chalcone synthase.
  • the approximately 2.9 kb DNA fragment obtained by laminating lambda (1 ⁇ 20 with 11] ⁇ 11 and £ 001 ⁇ contains the chalcone synthase promoter region.
  • This fragment was ligated to a fragment obtained by digesting pUC19 (Yanisch-Perron C et al., Gene 33: 103-119, 1985) with Hindlll and Smal. This was designated as pCGPll16.
  • the sequence of the chalcone synthase promoter portion contained therein is shown in SEQ ID NO: 21.
  • an approximately 300 bp nono obtained by digesting pUE5 with Sacl and Kpnl.
  • the DNA fragment containing the Lin Synthase Terminator was blunt-ended, digested with EcoRV and BamHI, and ligated with blunt-ended pBluescriptSK-.
  • the 5 'side of the terminator was close to the Sail of pBluescriptSK-V, and the one was pCGP1986.
  • pCGP1986 was digested with XhoI, blunt-ended, and the DNA fragment digested with Sail was ligated to the DNA fragment obtained by digesting pCGP197 with HindiII, blunt-ended and digested with Sail, and PCGP2201 was ligated. Obtained.
  • pCGP2201 was digested with Sail, blunt-ended DNA fragment and pCGP1959, digested with BamHI and Kpnl, and blunt-ended, about 1.7 kb DNA fragment (pansy flavone 3 ', 5' _ (Including the hydroxylase gene).
  • the parachalcone synthase promoter sequentially moves the pansy flaponoid 3 ', 5'-hydroxylase gene.
  • the one inserted so that it can be transcribed in the direction was designated as pCGP2203.
  • Plasmid pCGP2203 was recovered by digestion with Hindlll and Sacl.
  • plasmid pE2113 was digested with SnaBI, and a plasmid obtained by inserting BamHI linker (Takara) was used as pUE6.
  • This plasmid is designed to constitutively express the petunia-derived DFR gene in plants and to transcribe the pancreatic F3'5'H # 18 gene in a petal-specific manner. This plasmid was led by AgroOacterium tumefaciens AglOfe.
  • PSPB461 (Fig. 5) was introduced into the white para “WKS36” to obtain 229 transformants.
  • the delphinidin content was up to 79% (average 58%) the amount of pigment was extremely low at 0.031 mg per g of petals, and the flower color was only a pale pink change.
  • WKS36 was not a cultivar in which only the DFR gene was deleted. Table 6
  • Hydroxycinamoyl CoA derived from perilla A gene in which an initiation codon is added to the anthocyanin 3-glucoside acyltransferase (3AT) gene is pSAT208F (Yonekura-Sakakibara et al. Plant Cell Physiol. 41, 495-502). , 2000). An approximately 3.9 kb DNA fragment obtained by digesting pSPB580 (PCT / AU03 / 00079) with BamHI and Xhol and an approximately 1.8 kb DNA fragment obtained by digesting pSAT208F with BamHI and Xhol were ligated.
  • the resulting plasmid was digested with Ascl to recover a DNA fragment containing the E1235S promoter, the perilla 3AT gene, and a terminator derived from the petunia phospholipid transfer protein.
  • This DNA fragment was inserted into the Ascl site of pSPB461 described above, and the plasmid pSPB472 (in which the transcription direction of the perilla 3AT, the tuyua DFR, and the pansy F3'5'H # 18 gene was in the forward direction).
  • Figure 6 was obtained.
  • PSPB472 (FIG. 6) was introduced into the white para “WKS36” to obtain 75 transformants.
  • Flower color was changed in 4 individuals among the obtained transformants, and accumulation of delphinidin was confirmed in all three individuals subjected to pigment analysis (Table 7).
  • the delphinidin content was up to 67% (49% on average), but the pigment content was extremely low at O.Ollmg per lg petal, and the flower color only changed to very pale pink. I could't get to the desired blue para, because I didn't reach the top group or the blue group.
  • the above suggests that cultivar WKS36 is not a cultivar lacking only the DFR gene.
  • Example 13 Suppression of para-derived DFR gene by cosapresion pBERDl was introduced into seven mauve-colored papa varieties, "Lavande", and 26 transformants were obtained. However, no flower-colored individuals were obtained at all. It was suggested that it was difficult to suppress the endogenous DFR gene in para by the ratio method.
  • anthocyanin By modifying anthocyanin with an aromatic acyl group, anthocyanin can be stabilized and its color can be made blue (for example, dynamic 6/25500).
  • the following experiment was performed with the aim of producing acylated delphinidin-type anthocyanin.
  • RNA was obtained from the petals of the Torenia variety Summer @ Ave, and polyA + RNA was prepared therefrom. This p. LYa + RNA force al; I ZAPI I (Stratagene, Inc.) to c DNA library one to vector using directional c DNA library prepared kit (Stratagene Co.) manufacturer manufactured by the method recommended.
  • I ZAPI I (Stratagene, Inc.) to c DNA library one to vector using directional c DNA library prepared kit (Stratagene Co.) manufacturer manufactured by the method recommended.
  • the 5-position glucose is modified with an aromatic acyl group (Suzuki et al. Molecular Breeding 2000 6, 239-246), so that anthocyanin transylase is expressed in the trennia petals. are doing.
  • the amino acid sequence of Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys is preserved in anthocyaninyltransferase, and the corresponding DNA is used as a primer to synthesize anthocyaninyltransferase.
  • a transylase gene can be obtained (W096 / 25500).
  • the single-stranded cDNA lOng synthesized during preparation of the trainer cDNA library was designated as type I, and 100 ng of ATC primer (5, -GA (TC) TT (TC) GGITGGGGIAA-3, Is inosine) (SEQ ID NO: 17), 100 ng of oligo dT primer ( 5T TTTTTTTTTTTTTTCTCGAG3 ,) ( Torimoto ij number: is) as primer and Taq polymerase (Takara, Japan) PCR was performed under the conditions recommended by the manufacturer.
  • ATC primer 5, -GA (TC) TT (TC) GGITGGGGIAA-3, Is inosine
  • SEQ ID NO: 17 100 ng of oligo dT primer ( 5T TTTTTTTTTTTTTTCTCGAG3 ,) ( Torimoto ij number: is) as primer and Taq polymerase (Takara, Japan) PCR was performed under the conditions recommended by the manufacturer.
  • This DNA fragment was labeled with DIG using a DIG label detection kit (Roche Japan), and Treurea cDNA library was screened by plaque hybridization according to the method recommended by the manufacturer. .
  • the clones that yielded the obtained positive signals were randomly selected 12, the plasmid was recovered therefrom, and the nucleotide sequence was determined. They showed good homology to anthocyaninyltransferase. From these clones, the entire nucleotide sequence of the cDNA contained in the clone designated as pTAT7 was determined.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 7, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • PBE2113-GUS (Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37, 45-59 1996) was digested with Sacl, blunt-ended, and an 8 bp Xhol linker was digested.
  • pUEBP40 Plasmid obtained by ligation with pUE5H digested with BamHI and Xhol was designated as pUEBP40.
  • PUEBP40 was digested with SnaBI and BamHI, blunt-ended, and ligated to obtain pUEBP40. Partially erase pUEBP40 'with Hindl ll The resulting DNA fragment of about 2.7 kb was recovered and ligated to the DNA fragment obtained by partially digesting pSPB120 'with Hindlll. Among the obtained plasmids, the neomycin phosphotransferase gene, the pansy F3 and 5'H # 40 genes, and the trainer 5AT gene were sequentially oriented in the same direction from the light border side on the binary vector. The ligated pine tree was named pSPB130 (FIG. 7).
  • This plasmid is constitutively expressed in plants such that the F3'5'H # 40 gene derived from pansy and the 5AT gene derived from torenia are constitutively expressed, and the gene is transcribed in a petal-specific manner.
  • This plasmid was used as an Agro bacterium tumefaciens AglO strain.
  • the PSPB130 (Fig. 7) was introduced into the mauve rose cultivar "Lavande", and 41 transformants were obtained. Accumulation of delphinidin was confirmed in 20 of the 32 individuals subjected to pigment analysis (Tables 11 and 12). Delphinidin content was up to 71% (average 36%). The flower color was changed from RHS color chart h 186c (GRAYED—PURPLE GROUP) to 79 d (PURPLE GROUP). In this case, the ratio of acylated anthocyanin remained at about 30% of the total anthocyanin.
  • PSPB130 (Fig. 7) was introduced into the mauve-colored para “WKS100”, and 146 transformants were obtained. Delphinidin accumulation was confirmed in 56 of the 63 individuals for which the pigment analysis was performed (Tables 13 to 15). Delphinidin content was up to 95% (mean 44%). The flower color was changed to RHS color chart 56 d (RED GROUP), 186 d (GRAYED-PURPLE GROUP). Nevertheless, the group did not reach the RHSCC's knowledge group, bioreaction-blue group, or blue group, and could not obtain the desired blue rose. Table 13
  • na Not analyzed / measured
  • Example 17 Introduction of pansy-derived F3,5'H gene (# 40) and trainer-derived anthocyanin 5-acyltransferase gene into WKS116
  • PSPB130 (Fig. 7) was introduced into the light-colored rose “WKS116”, and 282 transformants were obtained. Delphinidin accumulation was confirmed in 33 of the 36 individuals subjected to pigment analysis (Tables 16 and 17). Delphinidin content was up to 80% (average 73%).
  • the RHS color chart 196d (GR AYED—GREEN GROUP) has been changed to 186d (GREYED—PURPLE GROUP). However, they did not reach the RHSCC's biolet, biolet blue and blue groups, and could not obtain the desired blue rose. Table 16
  • PSPB130 (Fig. 7) was introduced into the light orange para “WKS124” to obtain 50 transformants. Accumulation of delphinidin was confirmed in 13 of the 15 individuals subjected to pigment analysis (Table 18). Delphinidin content was up to 95% (mean 82%). The flower color was changed from RHS color chart 52d (RED G ROUP) to 71c (RED-PURPLE GROUP). From the power of the power, the power of the RHS CC, the bioreet group, the bioreet, the venorre, the gnore, and the bull group did not reach the desired blue para. Table 18
  • PSPB130 (Fig. 7) was introduced into a bright red para “WKS132” to obtain 24 transformants. Accumulation of delphinidin was confirmed in six of the seven individuals that were subjected to pigment analysis (Table 19). The delphinidin content was up to 43% (average 12%). The flower color changed from RHS color chart 57a (RED-PURP LE GROUP) to 66a (RED-PURPLE GROUP). S and S did not reach the RHSCC's pilot group, biolets toe blue group, or blue group, and were unable to obtain the desired blue para. Table 19
  • PSPB130 (Fig. 7) was introduced into the dark reddish purple para “WKS133” to obtain 16 transformants. Delphinidin accumulation was confirmed in all eight animals subjected to pigment analysis (Table 20). Delphinidin content was up to 34% (11% on average). The flower color was changed to RHS color chart 53a (RED GROUP) power, etc. 61a (RED-PURPLE GROUP). It was not possible to get the desired blue para, because it did not reach RHSCC's knollet gnorap, violet, bunoregnorp, or bunoregnorp.
  • PSPB130 (Fig. 7) was introduced into the deep reddish purple para “WKS137” to obtain 20 transformants. Delphinidin accumulation was confirmed in all 17 individuals subjected to pigment analysis (Table 21). Delphinidin content was up to 1.3% (0.4% on average). The flower color did not change from RHS color chart 61b (RED-PURPLE GROUP).
  • PSPB130 (Fig. 7) was introduced into the mauve-colored para “WKS140”, and 197 transformants were obtained. Delphinidin accumulation was confirmed in 37 of the 45 individuals subjected to pigment analysis (Tables 22 and 23). Delphinidin content was up to 94% (average 47%).
  • na No analysis / measurement
  • Example 24 Introduction of pansy-derived F3,5'H gene (# 40) and trainer-derived anthocyanin 5-acyltransferase gene into WKS82
  • PSPB130 (Fig. 7) was introduced into mauve-colored para “WKS82” to obtain 89 transformants. Accumulation of delphinidin was confirmed in all 44 individuals subjected to pigment analysis (Tables 25 and 26). Delphinidin content was up to 91% (average 49%). The flower color was changed to RHS color chart 186 d (GREYED-P URPLE GROUP) and 80c (PURPLE-VIOLET GROUP). However, the group did not reach the RHSCC's knowledge group, Violet Bull Group, or Blue Group, and was unable to obtain the desired blue rose. Table 25
  • Example 26 Expression of F3'5'H gene (# 40) derived from pansy and DFR gene derived from iris in Labande and suppression of paraendogenous DFR gene
  • RNA was obtained from cut flower blue iris petals, and polyA + RNA was prepared therefrom.
  • a cDNA library using this polyA + RNA force, LZAPII (Stratagene) as a vector was prepared using a cDNA library-preparation kit (Stra tagene) according to the method recommended by the manufacturer.
  • the iris DFR gene fragment was reported in the same manner as in the report on the acquisition of the gentian DFR gene fragment (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37, 711-716, 1996).
  • the obtained DNA fragment of about 400 bp was recovered by Gene Clean using the method recommended by the manufacturer and subcloned into pCR-TOPO. When its nucleotide sequence was determined, a sequence homologous to the para-DFR gene was found.
  • the Iris cDNA library was screened using this DNA fragment to obtain an Iris DFRcDNA containing a full-length amino acid sequence.
  • the entire nucleotide sequence of the cDNA contained in the clone designated as pSP B906 was determined. This nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 9, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • PSPB909 a plasmid obtained by ligating a DNA fragment of about 3.9 kb obtained by digesting PSPB580 with BamHI and Xhol and a DNA fragment of about 1.5 kb obtained by digesting pSPB906 with BamHI and Xhol is called PSPB909. did.
  • pCGP1364 (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. (1995) 36 1 023-1031) with Pstl and partially digested with a DNA fragment of about 3.5 kb (including the Mac 1 promoter, para-DFR cDNA, and mas terminator) into pUC 19 (Yanisch-Perron C et al., Gene 33: 103-119, 1985), the plasmid obtained by inserting the Hindi II site of PUC19 close to the Macl promoter among the plasmids obtained by inserting it into the Pstl site was named pCGP1394.
  • PSPB528 is a binary vector that can express a plant by inserting a structural gene between a potent refluo- mosaic virus 35S promoter having an enhancer and a manopin synthase terminator. Also, in order to shorten the sequence of the 5 'untranslated region of para DFRc DNA contained in pCGP645, pCGP645 was digested with SmaI and PvuI, blunt-ended, and ligated to obtain pCGP645s.
  • the 5 side sequence of Nora DFR cDNA was amplified by PCR using pCGP645s as a cyclized reverse primer and a synthetic primer RDF310 (5, -CCCTCGAGCCCTTGATGGCCTCGTCG-3 ') (SEQ ID NO: 19) as a primer. And cloned into pCRTOPO. The nucleotide sequence of the DNA was determined, and it was confirmed that there were no errors due to PCR. This was designated as pSPB569.
  • the 5 'side sequence of para DFRc DNA of different length was changed to pCGP645s It was obtained by amplifying by PCR using a lipase primer and a synthetic primer RDF830 (5′-GGGTCGACGCGGCCCTCTGCTTTCGG-3 ′) (SEQ ID NO: 20) as a primer, and cloned into pCRTOPO.
  • the nucleotide sequence of the DNA was determined, and it was confirmed that there were no errors due to PCR.
  • PSPB570 This was designated as PSPB570. Obtained by digesting pSPB528 with BamHI and Sacl, and digesting pSPB569 with Sacl and Xhol, and digesting pSPB569 with Sacl and Xhol, and digesting pSPB570 with BamHI and Sail. The DNA fragments were ligated to obtain pSPB572. This vector is designed to transcribe double-stranded RNA of para-DFR cDNA in plants.
  • PUE6 was digested with Sacl, blunt-ended, and a S linker was inserted to obtain pUE8.
  • the DNA fragment obtained by digesting pUE8 with HindI ⁇ and EcoRI was introduced into the Hindlll and EcoRI sites of pBinPLUS to obtain pSPB189.
  • An approximately 3.7 kb DNA fragment obtained by digesting pSPB189 with BamHI and Sail and an approximately 1.8 kb DNA fragment obtained by completely digesting pCGP1961 with BamHI and further partially digesting with Xhol were ligated to obtain PSPB567. .
  • pSPB572 is digested with Pacl and dephosphorylated, a DNA fragment of about 2.8 kb obtained by digesting pSPB567 with Pacl is ligated, and the nptll gene and pansy F3'5'H # 40 are the same.
  • the plasmid transcribed in the direction was selected and named pSPB905.
  • a DNA fragment of approximately 2.5 kb obtained by digesting pSPB909 with Ascl is ligated, and the iris DFR gene is transcribed in the same direction as the nptll gene.
  • the plasmid was obtained and named pSP B919 (Fig. 8). This plasmid transcribes the iris-derived DFR gene and the pansy-derived F3'5'H # 40 gene in para, and is expected to suppress the para-DFR gene expression by transcription of double-stranded RNA .
  • This plasmid was introduced into Agrobacterium tumefaciens AglO strain.
  • pansy F3'5'H # 40 mRNA For detection of pansy F3'5'H # 40 mRNA, pCGP1961 was used as a type I gene and transcribed with a T7 primer was used as a probe.
  • pSPB906 was used as a type I gene and transcribed with T7 primer was used as a probe.
  • pansy-derived F3,5'H # 40 and mRNA of the iris DFR gene were detected.
  • nora DFR mRNA was significantly reduced as compared to the host, and detection of a band at a low molecular weight position indicated that degradation of para DFR mRNA had occurred.
  • na Analysis ⁇ Not measured Example 27.
  • Expression of F3'5'H gene (# 40) derived from pansy and DFR gene derived from 21 Lenbergia in Labande and suppression of para-endogenous DFR gene Nirenmbergia hybrida RNA was obtained from the petals of B 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ 7 Airi Ichinore / ⁇ 0 Tioraito Blue (Suntory Flowers Co., Ltd.), and polyA + RNA was prepared therefrom.
  • a cDNA library using this polyA + RNA gene and IZAPII (Stratagene) as a vector was prepared using a cDNA library synthesis kit (Stratagene) according to the method recommended by the manufacturer.
  • This cDNA library was screened using a DIG-labeled petroleum DFRc DNA (derived from pCGP1405). Screening conditions followed the plaque hybridization procedure recommended by the manufacturer for the DIG labeling system. However, the pre-hybridization and the pre-hybridization buffer Hybridization was performed at 37 ° C with a formamide concentration of 30%. Washing of the membrane was performed at 55 ° C in 5xSSC containing 1% SDS. Plasmids were collected from 20 plaques among the many positive signals obtained, and the nucleotide sequence was determined using a reverse primer (Takara). They showed homology to the DFR genes of petunia and other plants. Of these, the entire cDNA sequence of the clone designated as pSPB709 was determined. The obtained base sequence is shown in SEQ ID NO: 11, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • a plasmid obtained by ligating a DNA fragment of about 3.9 kb obtained by digesting PSPB580 with BamHI and Xhol and a DNA fragment of about 1.5 kb obtained by digesting pSPB709 with BamHI and Xhol was used as pSPB910.
  • pSPB910 After digesting pSPB905 with Ascl and subjecting it to dephosphorylation, a DNA fragment of about 2.5 kb obtained by digesting pSPB910 with Ascl is ligated, and a plasmid in which the Neirenbergia DFR gene is transcribed in the same direction as the nptll gene. was obtained and named pSPB920 (Fig. 9).
  • This plasmid transcribes the DFR gene from Neirenbergia and the F3'5'H # 40 gene from pansy in para, and is expected to suppress the expression of the para DFR gene by double-stranded RNA transcription. You. This plasmid was used by Agrobacterium tumefaciens and AglOte.
  • PSPB920 (Fig. 9) was introduced into the mauve-colored para cultivar “Labande”, and 56 transformants were obtained. Delphinidin accumulation was confirmed in 23 of the 24 individuals subjected to pigment analysis (Table 30). Delphinidin content was up to 100% (average 43%). The flower color changed from RHS color chart 186c (GREYED-PURPLE GROUP) to 85b (VIOLET GROUP). Table 30
  • the transformant (LA / 919-2-13) obtained by introducing the pSPB919 (Fig. 8) into the mauve-colored para variety “Lavande” was used as the pollen parent, and the non-recombinant WKS77 or mother was used as the mother. Crossing was performed using WKS133 (Shozo Suzuki, “Rose and Flower Charts", Shogakukan, p. 256-260, 1990). Fruits were harvested 100 days after pollination. For sowing, first peel the fruits to collect the thin fruits, After removal of the embryos, the embryos were placed on a damp filter paper in a petri dish.
  • the water used at the time of sowing is 1 ml of PPM TM (Plant Preservative Mixture, PLANT CELL TECHNOLOGY, INC.) And 5 Kg of kanamycin added to sterilized water, and only those that have germinated normally are picked up and seedlings are grown. went.
  • Example 29 Expression of pansy F3,5, H # 40 gene and iris DFR gene in WKS140 and suppression of para endogenous DFR gene
  • na Analysis ⁇ Not measured
  • Example 30 Expression of pansy F3'5, H # 40 gene and British DFR gene in WKS77 and suppression of para endogenous DFR gene
  • PSPB919 was introduced into a deep red purple rose cultivar “WKS77”, and 50 transformants were obtained. Delphinidin accumulation was confirmed in 21 of the 23 individuals subjected to pigment analysis. Delphinidin content was up to 81% (average 19%).
  • na Analysis ⁇ Not measured
  • Example 31 Expression of pansy F3,5, H # 40 gene and Nirenbergia DFR gene in WKS77 and suppression of para endogenous DFR gene
  • PSPB920 was introduced into dark reddish purple para “WKS77”, and 30 transformants were obtained. Accumulation of delphinidin was confirmed in 26 out of 27 individuals subjected to pigment analysis. Delphinidin content was up to 98% (average 60%). The flower color was changed to RHS color chart 57a (RED-PURPLE GROUP) power, et al. 77b (PURPLE GROUP). Table 35
  • Example 32 Expression of pansy F 3,5, H # 40 gene and petunia DFR gene and suppression of rose endogenous DFR gene in WKS77
  • PSPB921 was introduced into the dark reddish purple para “WKS77”, and 15 transformants were obtained. Accumulation of delphinidin was confirmed in 12 of the 13 individuals subjected to pigment analysis. Delphinidin content was up to 98% (average 60%). Flower color is RHS color chart 57a (RED-PURPLE GROUP) (RED-PURPLE GROUP).
  • Example 28 Using the transformant (LA / 919-4-10) obtained by introducing pSPB919 into the mauve-colored rose cultivar "Lavande" as the pollen parent, using the non-recombinant para cultivar Black Pacara as the mother Mating was performed as in Example 28. Fruit was harvested 100 days after pollination. For seeding, first, the fruits were peeled to collect the thin fruits, and then the thin fruits were peeled to remove the embryos, and then placed on moist filter paper in a petri dish.
  • PSPB1106 (Fig. 10) was introduced into a dark reddish purple para variety “WKS77” to obtain 40 transformants. Delphinidin accumulation was confirmed in all 26 individuals subjected to pigment analysis. Delphinidin content was up to 80.0% (average 30.5%). The flower color changed greatly from RHS color chart 57a (RED-PURPLE GRO UP) to 83d (VIOLET GROUP). Table 38
  • the pSPB1106 was introduced into the mauve-colored para variety “Lavande”, and 40 transformants were obtained. Delphinidin accumulation was confirmed in 23 of the 25 individuals subjected to pigment analysis. Delphinidin content was up to 98.3% (average 46.9%). Table 39
  • na No analysis / measurement The above indicates that the introduced foreign gene is transmitted to progeny, and that the gene is expressed in progeny, and the trait of producing diffinidine, which is not normally found in para petals, is transmitted to progeny para. ing. Therefore, it is shown that by breeding paras with a changed color using this gene, paras of a new color including blue and purple can be produced. Industrial applicability

Abstract

バラの内在性の代謝経路を人為的に抑制し、かつパンジー由来のフラボノイド3',5'−水酸化酵素をコードする遺伝子を発現させることを特徴とするバラの製造方法。

Description

花色が変更されたパラの製造方法 技術分野
本発明は、 新たな花色を有するパラの製造方法に関するものであ る。 詳しくは、 パラ内在性の代謝経路を人為的に抑制し、 かつパン ジ一のフラボノイ ド 3 5明，一水酸化酵素をコ一ドする遺伝子と、 ジヒ ドロ ミ リセチンを還元するジ田ヒ ドロフラボノール還元酵素をコ 一ドする遺伝子を発現させることによるバラの製造方法に関するも のである。 背景技術
花弁の役割は花粉を運ぶ昆虫 · 鳥類などのポリネーターを魅了す ることにあるため、 花の色や形、 模様、 香りはポリネーターと共進 化してきた （本田利夫ら 現代化学 5月号 25 - 32 (1998)) 。 おそら くはその結果、 ひとつの種の花があらゆる色をもつ場合は少なく、 例えば、 パラやカーネーショ ンには紫から青の品種がなく、 ショ ウ ブゃリ ンドウには鮮やかな赤い品種はない。 花の色は鑑賞の際にも 花卉の最も重要な形質であることから、 古くから様々な色の花が交 配によって育種されてきた。 特にパラは花の女王と呼ばれ、 また、 市場価値も高いことから、 世界中で交配が行われてきた。
例えば、 黄色の品種のなかったパラに西アジア原産の Rosa foeti da を交配することによ り現在の黄色のパラが育種された。 しかし ながら花の色はその植物のもつ遺伝的能力によって決定されている ため、 利用できる遺伝子源が限定される交配による育種では実現で きる花色には限界がある （Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1126, 1998、 Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10， 1 98-201 1999) 。 なかでも青いパラの育成は不可能の代名詞とも、 アーサー王の聖杯に匹敵するとされてきた （大場英章 「パラの誕生 」 1997中公新書、 鈴木正彦 「植物バイオの魔法 青いパラも夢では なくなった」 1990 講談社ブルーパックス、 最相葉月 「青いパラ」 2001小学館） 。
現在、 一般に 「青パラ」 と呼ばれる品種は存在するが、 これは 「 藤色系」 のパラのことを指す。 交配による 「青パラ」 の品種改良は 1945年作出された薄紫を帯びた灰色の 「グレーパール」 が最初であ ると言われている。 その後、 1957年に薄紫ピンクの 「スターリ ング シルバー」 が作出され、 これらの品種を交配親と して 「ブルーム一 ン」 （1964年作出） や 「マダムビオレ」 （1981年作出） など、 多く の藤色系パラが作られている。 また、 これらの藤色系パラなどを利 用し、 さらに育種を重ねることで、 「青龍」 (1992年作出) や 「ブ ルーヘブン」 (2002年作出） などの、 淡いグレー系のパラが作出さ れ、 新タイプの 「青パラ」 と して注目を集めている。
しかしながらこれらの花の色は実際には青く はなく灰色がかった ぽんやり したピンクに留まっており、 長年の育種努力にも関わらず 、 未だ 「青」 と呼べるパラは存在しない。 園芸業界においては一般 にイギリス王立園芸協会カラーチャー ト （RHSCC: The Royal Horti cultural Society Colour Chart) でパ、ィォレッ トカゝらブノレーのグ ループが 「青」 と呼ばれることが多い。 本発明はイギリス王立園芸 協会力ラーチャ一トでパイォレッ トグループ、 パイォレツ トーブル 一グループまたはブルーグループに示される花色を有するパラの創 出を目指すものである。
花の色は主にアントシァニン、 カロテノィ ド、 ベタレイ ンの 3種 の化合物群に由来するが、 青色を司るのは極大吸収波長の幅が最も 広い (オレンジ色から青色) アン トシァニンである。 アントシァニ ンはフラボノィ ドの一種で図 1に示した代謝経路で生合成される。 アン トシァニンは、 通常上皮細胞の液胞中に局在する。 アン トシァ ニンの色調 （すなわち花の色） は、 アントシァニンの構造に大きく 依存し、 B環の水酸基の数が多いほど青くなる。 B環の水酸化は、 フ ラボノィ ド 3' -水酸化酵素 （F3'H) およびフラボノィ ド 3'，5'—水 酸化酵素 （F3'5'H) によって触媒される。 F3'H活性と F3'5'H活性が ない場合にはペラルゴ二ジン （橙色から赤色） が合成され、 F3'H活 性がある場合はシァニジン （赤から紅色） が合成され、 F3'5'H活性 がある場合はデルフィ二ジン （紫色） が合成される。
これらのアントシァニジンは糖やァシル基によ り修飾され、 様々 なアントシァニンとなる。 一般的に修飾する芳香族ァシル基が多い ほどアントシァニンは青くなる。 アントシァニンは液胞の pH、 共存 するフラボノ一ルゃフラボン、 金属ィオンなどによっても大きく色 を変える（斎藤規夫 蛋白質核酸酵素 47 202-209 2002, Broullard and Dangles , In the f lavonoids： Advances in Research since 丄 986 (Ed by Harborne ) Capmann and Hall , London pp5b5~588 , Tan aka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1126, 1998、 Mol et al ， Trends in Plant Science 3， 212-217 1998， Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10， 198-201 1999)。
パラの花弁のアン トシァニンは、 ペラノレゴニジンとシァニジンお よびぺォニジンの誘導体であり、 デルフィ二ジンの誘導体は存在し ない （Biolley and May, J. Experimental Botany, 44, 1725-1734
1993， Mikanagi Y， Saito N， Yokoi M and Tatsuzawa F (2000) B iochem Systematics Ecol. 28:887— 902) 。 これ力 S青 ヽ / ラカ Sなレヽ 最大の理由とされている。 現在のパラは、 交配可能なパラの近縁種
(R. mui t if丄 ora， R. chinens is , R. igantean, R. moschata , R. gal丄 ica, R. whichuraiana, R.foetidaなど） の交配によって作出された
多くの交配の努力にもかかわらず、 青いパラが実現していないの はパラの近縁種にはデルフィ二ジンを生産する能力がないからだと 考えられている。 花弁でデルフィ二ジンを生産するためには上述の ように F3'5'Hが花弁で発現する必要があるが、 パラ及びバラの近縁 種の花弁では F3'5'Hが発現していないと考えられている。 したがつ て交配によ りデルフィ二ジンを花弁で蓄積させ青いパラを取得する ことは不可能であろう。 また、 パラ花弁に微量の青い色素ロザシァ ニンが含まれることは知られており、 その化学構造も決定されてい るが（特開 2002-201372)、 ロザシァニンを増加させることにより青 いバラを作出した報告はなく、 ロザシァニンの生合成経路、 それに 関わる酵素や遺伝子の知見もない。
また、 生物が生産する青や紫の色素の例として藍が生産するイン ディゴ（たとえば、 Appl Microbiol Biotechnol 2003 Feb;60(6) :72 0-5)や微生物が生産するビオラセイン（J. Mol. Microbiol. Biotec hnol. 2000 Oct; 2 (4)： 513 - 9、 Org. Lett. , Vol. 3， No. 13， 20 01， 1981 - 1984)があり、 これらはト リ プトファンに由来することや 生合成経路についても知見はある。
この他にクチナシの実由来のイ リ ドィ ド化合物による青色色素（S . Fujikawa, Y. Fukui , K. Koga , Τ. Iwashita , Η. Komura , Κ. No moto , (1987) Structure of genipocyanin Gl， a spontaneous rea ct ion product between genipin and glycine, retrahedron Lett.
28 (40) , 4699-700、 S. Fujikawa, Y. Fukui, K. Koga, J. Kuma da , (1987) Brilliant skyblue pigment format ion from gardenia fruits. J. Ferment. Technol. 65 (4)， 419 - 24)や、 コケ由来の ァズレン（和光純薬工業株式会社）なども知られているが、 これらを 植物花弁で発現させ、 花色を青く した報告はない。
パラに他の植物で発現している F3'5'Hの遺伝子を導入し花弁で発 現させることができれば青いパラを作出できるのではないかと期待 されていた （最相葉月 「青いパラ」 2001小学館） 。 F3'5'H遺伝子 はペチュニア、 リ ンドウ、 トルコギキヨ ウなど多くの榷物から得ら れている（Holton et al. Nature 366, 276-279, 1993, Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37， 711-716 1996, W093/18155)。 また 、 パラの形質転換系についても報告はある （たとえば Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 (1994) , US 5棚 789、 US 5792 927、 EP 536 327 Al、 US 20010007157 Al ) 。
さらに、 実際にパラにペチュニアの F3'5'H遺伝子を導入した報告 もある （画 3/18155、 W094/28140) 。
しかしながら、 青いパラを得るまでには到っておらず、 青いパラ を得るためにはパラに適した花色色素の代謝を改変する工夫が必要 であると考えられる。
一方、 F3'5，H遺伝子を、 デルフィ二ジンを生産せずペラルゴニジ ンを生産している赤い力一ネーショ ンに導入したところ、 ペラルゴ 二ジンと ともに、 デルフィ二ジンの蓄積が確認されたが、 花色はや や紫がかった赤に変わるに留まった （W094/28140) 。 この結果は、 F3，5'Hの発現だけでは 「青い」 カーネーシ ョ ンを得ることはできず 、 カーネーショ ンの内在†生のペラノレゴニジン合成への代謝の流れを 抑制する必要があることを示唆している。
カーネーショ ンの内在性の代謝経路 （ジヒ ドロフラボノール還元 酵素 （DFR) によるジヒ ドロケンフエロール （DHK) の還元） との競 合を回避するために、 白いカーネーシ ョ ンの中から DFRが欠損して いる品種を選択した。 このカーネーシ ョ ンに、 F3'5'Hとペチュニア DFR (DHKを還元できず、 ジヒ ドロ ミ リセチン （DHM) を効率よく還 元することが知られていた） の遺伝子を導入した。 その結果、 デル フィ二ジンの含量がほぼ 100%で、 花色も従来のカーネーショ ンには ない青紫色となった組換えカーネーショ ンを取得することができた 例がある （蛋白質核酸酵素， Vol.47, No.3, p228, 2002) 。 このよ うにカーネーショ ンに青い花を実現するためには、 F3'5'H遺伝子の 発現によるデルフィ二ジンの蓄積だけではなく、 工夫が必要であつ た。
DFRはすでに多くの植物からク ローニングされている (ペチュニ ァ、 タノ コ、 パラ、 ト レニァ、 キンギヨ ソゥ、 ガーベラ、 シンビジ ゥム、 ォォムギ、 トウモロコシなど） (Meyer et al. Nature 330， 677-678, 1987,Helariutta et al. Plant Mol. Biol. 22 183 - 193 1993, Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023 - 1031， John son et al. Plant J. 19, 81-85， 1999) 。 DFR遺伝子については植 物種によって基質特異性が異なり、 ペチュニア、 タバコ、 シンビジ ゥムの DFR遺伝子は DHKを還元できないこと、 ペチュニアの DFR遺伝 子はジヒ ドロフラボノールの中では DHMをもつとも効率よく還元す ること力 S失口られている (Forkmann et al. Z. Naturforsch. 42c, 1 146-1148, 1987， Johnson et al. Plant J. 19, 81-85, 1999) 。 しかしながらこれらの DFR遺伝子をパラで発現させた例は報告され ていない。
内在性の代謝経路や酵素と外来の遺伝子由来の酵素たとえば F3'5 'Hとの競合を回避する方法としては上述のように、 ある遺伝子が欠 損した品種に遺伝子を導入する方法がある。 また、 人為的に目的の 遺伝子の発現を抑制する方法として、 目的の遺伝子を相同組換えな どによ り欠失させる方法も知られてはいるが、 相同組換えの頻度が 低く、 適応できる植物種も限定されているため、 実用化にはいたつ ていない （たとえば、 Nat Biotechnol 2002、 20:1030-4) 。 転写レベルでの抑制方法として、 標的遺伝子の mRNAのァンチセン ス RNAを転写させるアンチセンス法（van der Krol et al. ature 3 33， 866-869, 1988)、 標的の遺伝子の mRNAと同じ RNAを転写させる センス （コサブレッシヨ ン） 法（Napoli et al. Plant Cell 2, 27 9-289, 1990)、 標的の遺伝子の mRNAに対応する二本鎖 RNAを転写す る方法（RNAi法、 Waterhouse et al. Pro. Natl. Acd. Sci. USA 95 ， 13959-13964 1998)が利用されている。
これらの 3つの方法については多くの成功例が知られている。 パ ラにおいてはアントシァニンの合成に必要なカルコンシンターゼ （ CHS) 遺伝子のコサプレツショ ンによ り、 花色を赤からピンクに改 変した報告力 Sある（Gutterson HortScience 30:964—966 1995)力 S、 この場合 CHSの抑制が不完全であり、 完全にアントシァニンの合成 を抑制し白い花の系統を得るには至らなかった。
特許文献 1 特開 2002- 201372号公報
特許文献 2 W093/18155
特許文献 3 USP 5480789
特許文献 4 USP 5792927
特許文献 5 EP 536 327 A1
特許文献 6 US 20010007157 Al
特許文献 7 W094/28140
非特許文献 1 本田利夫ら 現代化学 5月号 25-32 (1998) 非特許文献 2 Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-11 26, 1998
非特許文献 3 Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10， 19 8-201 1999
非特許文献 4 大場英章 「パラの誕生」 1997中公新書
非特許文献 5 鈴木正彦 「植物バイオの魔法 青いパラも夢では なく なった」 .1990講談社ブルーパックス
非特許文献 6 最相葉月 「青いパラ」 2001小学館
非特許文献 7 斎藤規夫 蛋白質核酸酵素 47 202-209 2002 非特言午文献 8 Broullard et al. In the f lavonoids： Advances in Research since 1986 (Ed byHarborne ) Capmann and Ha丄丄， ndon pp565 - 588
非特許文献 9 Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-11 26, 1998
非特許文献 1 0 Mol et al, Trends in Plant Science 3, 212 - 217 1998
非特許文献 1 1 Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10， 1 98-201 1999
非特許文献 1 2 Biolley and May, J. Experimental Botany , 4 4, 1725-1734 1993
非特許文献 1 3 Mikanagi Y, et al. (2000) Biochem Systemat ics Ecol. 28:887 902
非特許文献 1 4 Appl Microbiol Biotechnol 2003 Feb;60(6) :7
20-5
非特許文献 1 5 J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000 Oct； 2 (4)： 513-9
非特許文献 1 6 Lett. , Vol. 3， No. 13， 2001， 1981-198
4
非特許文献 1 7 S. Fujikawa, et al. (1987) Tetrahedron Lett . 28 (40), 4699-700
非特許文献 1 8 S. Fujikawa, et al. (1987) J. Ferment. Tec hnol. 65 (4) , 419-24
非特許文献 1 9 Holton et al. Nature 366, 276-279, 1993 非特許文献 2 0 Tanaka et al. Plant Cell Phvsiol. 37， 711- 716 1996
'非特許文献 2 1 Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-8 88 (1994)
非特許文献 2 2 蛋白質核酸酵素， Vol.47， No.3, p228, 2002 非特許文献 2 3 Meyer et al. Nature 330, 677 - 678， 1987 非特許文献 2 4 Helariutta et al. Plant Mol. Biol. 22 183- 193 1993
非特許文献 2 5 Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36， 102 3-1031
非特許文献 2 6 Johnson et al. Plant J. 19, 81-85， 1999 非特許文献 2 7 Forkmann et al. Z. Natur f or sch. 42c , 1146- 1148, 1987
非特許文献 2 8 Nat Biotechnol 2002、 20:1030 - 4
非特許文献 2 9 van der Krol et al. Nature 333, 866-869， 1 988
非特許文献 3 0 Napoli et al. Plant Cell 2， 279-289, 1990 非特許文献 3 Waterhouse et al. Pro. Natl. Acd. Sci. USA 95， 13959-13964 1998
非特許文献 3 2 Gutterson HortScience 30:964-966 1995 非特許文献 3 3 鈴木省三， 「ばら、 花図譜」 ，小学館， p.256-26 0， 1990 発明の開示
上記のようにパラに F3' 5 'H遺伝子を導入し、 花弁で発現させるこ とによ りパラの花の色を改変することができた。 カーネーショ ンで は、 DFR欠損の品種で F3'5'H遺伝子とペチュニア DFR遺伝子を発現さ せることによ り、 青紫色のカーネーショ ンを作ることができた。 し かしながら、 いまだに 「青いパラ」 は創出されていない。 そこで、 本発明は、 青い花を咲かせるパラを提供しょ う とするものである。 従って本発明は、 （ 1 ) パラの内在性の代謝経路を人為的に抑制 し、 かつパンジー由来のフラボノィ ド 3，，5 '—水酸化酵素をコ一ド する遺伝子を発現させることを特徴とするバラの製造方法を提供す る。
本発明はまた、 （ 2 ) パラの内在性の代謝経路を人為的に抑制し 、 かつパンジー由来のフラボノィ ド 3，， 5，一水酸化酵素をコードす る遺伝子及びジヒ ドロフラボノール還元酵素をコー ドする遺伝子を 発現させることを特徴とするパラの製造方法を提供する。
本発明は更に、 （ 3 ) パラの内在性のジヒ ドロフラポノール還元 酵素の発現を人為的に抑制し、 かつパンジー由来のフラボノィ ド 3 ' ，5 '—水酸化酵素をコー ドする遺伝子及びパラ以外の由来のジヒ ド ロフラポノール還元酵素をコードする遺伝子を発現させることを特 徴とするパラの製造方法を提供する。
本発明は更に、 （4 ) パラの内在性のフラボノイ ド 3 '—水酸化酵 素の発現を人為的に抑制し、 かつパンジー由来のフラボノィ ド 3 '，5 '一水酸化酵素をコードする遺伝子を発現させることを特徴とする パラの製造方法を提供する。
前記のパンジ一のフラボノィ ド 3 '，5，—水酸化酵素をコ一ドする 遺伝子は、 例えば、 配列番号 ： 1または配列番号 ： 3記載の遺伝子 である。 また、 前記のジヒ ドロフラボノール還元酵素をコードする 遺伝子は、 好ましくは、 アイ リ ス、 ニーレンベルギア、 ペチュニア 、 シンビジユウム、 リ ンドウ、 トルコギキヨ ウ由来である。
本発明は更に、 （ 5 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) のいずれかに記載の製 造方法によ り得られるパラもしく はそれと同じ性質を有するその子 孫またはそれらの組織を提供する。
本発明はまた、 （ 6 ) 上記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) のいずれかの製造方法 によ り得られたパラの花弁の色が、 紫、 青紫又は青であるパラもし く はそれと同じ性質を有する子孫またはそれらの組—織を提供する。 本発明はまた、 パラの花弁の色が、 イギリス王立園芸協会カラ一 チャー ト (RHSCC) のバイオレツ トグループ、 バイオレッ ト一ブル 一グループまたはブルーグループに属するものであり、 上記 （ 6 ) に記載のパラもしく はそれと同じ性質を有する子孫またはそれらの 組織を提供する。
本発明は更に、 パラの花弁の色が、 イギリス王立園芸協会カラー チャー ト (RHSCC) のバイオレツ トグル一プの 8 5 a または 8 5 b に属するものである、 上記 （ 7 ) に記載のパラもしく はそれと同じ 性質を有する子孫またはそれらの組織を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 フラボノイ ドの生合成経路を示す。
CHS ： カルコン合成酵素、 CHI ： カルコンイ ソメラーゼ、
FNS ： フラボン合成酵素、 F3H： フラパノ ン 3—水酸化酵素、 F3'H： フラボノィ ド 3，一水酸化酵素、
F3'5'H： フラボノィ ド 3，5'_水酸化酵素、 FLS： フラボノール合 成酵素、
DFR： ジヒ ドロフラボノール 4一還元酵素、
ANS : アントシァニジン合成酵素、 AS : オーロン合成酵素、
C2'GT： カルコン 2，配糖化酵素
図 2は、 プラスミ ド pBERDlの構造を示す。
図 3は、 プラスミ ド pBPDBP2の構造を示す。
図 4は、 プラスミ ド pBPDBP8の構造を示す。 図 5は、 プラス へ ド PSPB461の構造を示す。
図 6は、 プラスへ ド PSPB472の構造を示す。
図 7は、 プラス -、 ド PSPB130の構造を示す。
図 8は、 プラス 、 ド PSPB919の構造を示す。
図 9は、 プラス 、 ド PSPB920の構造を示す。
図 10は、 プラス 、 ド PSPB1106の構造を示す。 発明を実施するための最良の形態
バラでデルフィ二ジンが生産されても花色が青くならない理由に はいくつか考えられる。 ァシル基や糖の修飾によってアントシァニ ンの安定性、 溶解度、 色が変化する。 すなわち、 芳香族ァシル基の 付加により青くなることが知られている。 また、 ブラボノールゃフ ラボンといったコピグメ ント とアントシァニンが複合体を形成する と、 色が青くなり、 極大吸収波長は長波長にシフ ト し吸光度も増す
。 アントシァニンの色は pHによっても変化する。 pHが低いと赤く、 中性付近で青くなるため、 花の色はアントシァニンが局在する液胞 の pHに依存する。 また、 A l 3 +、 Mg 2 +などの金属イオンとの共存に よる金属錯体の形成が花色に重要な影響を与える場合もある。 試行 錯誤と鋭意検討の結果、 ここでは花弁でのデルフィ二ジンの割合を 高める工夫を考案した。
まず、 青紫色のカーネーショ ンの作出と同様な手法で青いパラの 作出を試みた。 すなわち白いパラ 112品種を解析し DFR欠損株の同定 を試みたが、 カーネーショ ンの場合とは異なり完全な DFR欠損系統 を取得することはできなかった。 これはカーネーショ ンが 2倍体で あるのに対し、 通常栽培されるパラは 4倍体であるため、 単一の遺 伝子の欠損株を求めることが困難であるためであろう。
次に、 花色が白い品種 Tinekeにパンジーの F3 ' 5 ' H遺伝子とペチュ =·ァの DFR遺伝子を導入したところ、 デルフィニジンの蓄積は認め られたが、 量がわずかであり、 青いパラには至らなかった。
本発明においては、 パラの内在性のフラボノィ ド合成経路に属す る酵素である DFRの遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて人為的に抑 制し、 かつパンジーの F3' 5' H遺伝子を発現させ、 さ らにジヒ ドロ ミ リセチンを還元する DFR遺伝子を発現させることによ りデルフィ 二ジンの含有率を花弁に含まれる総アントシァニジン中のほぼ 80 - 1 00%にすることによ り、 青いパラを実現することができた。
ジヒ ドロミ リセチンを還元する DFR遺伝子はここではアイ リス （ アヤメ科） 、 ニーレンベルギア （ナス科） 、 ペチュニア （ナス科） を用いたが、 他にジヒ ドロ ミ リセチンを還元する DFR遺伝子の起源 としてはタバコ (ナス科) 、 シクラメン (サクラソゥ科) 、 デルフ ィニゥム （キンポゥゲ科） 、 シンビジゥム （ラ ン科） 、 リ ンドウ （ リ ンドウ科） 、 トルコギキヨウ （リ ンドウ科） などペラルゴ二ジン を蓄積しない植物を挙げることができる （Forkmann 1991 Plant Br eeding 106 1 - 26 Johnson ら、 Plant J. 1999 19 81-85) 。 本発 明において使用する DFR遺伝子は、 ジヒ ドロ ミ リセチンを好んで還 元する遺伝子が好ましい。
また、 本発明においては、 パラの内在性のフラボノイ ド合成経路 に属する酵素であるフラボノイ ド 3' —水酸化酵素 （F3' H) の遺伝 子を遺伝子工学の手法を用いて人為的に抑制し、 かつパンジーの F3 ' 5' H遺伝子を発現させることによ り、 デルフィ二ジンの含有率を 花弁に含まれる総アントシァニジン中のほぼ 80— 100%にすること により、 青いパラを実現することができた。
本発明によ り得られたパラは、 これまでにない花色を有するもの であり、 本発明によ り、 イギリス王立園芸協会カラーチャートで、 レッ ド—パープルグノレープ、 パ一プルグループ、 パープル—パイォ レツ ト グノレープのみならず、 バイオレッ ト グノレープ、 バイオレッ ト 一ブルーグループ、 ブルーグループに属する花色を有す パラを提 供することができる。 実施例
以下実施例に従って、 発明の詳細を述べる。 分子生物学的手法は とく ίこ断らなレヽ限り、 Molecular Cloning (Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harb or , New York) に依った。
実施例 1. 花色測定方法
花弁色彩評価は、 分光測色計 CM2022 (ミ ノルタ株式会社、 日本） を用いて 10度視野、 D65光源で測定し、 色彩管理ソフ ト SpectraMagi c (ミ ノルタ株式会社、 日本） によ り解析を行った。 なお、 ィギリ ス王立園芸協会力ラーチャート（RHSCC)番号は、 目視判定および上 記の機器測定によ り得られた色彩値 （CIE L*a*b*表色系） をもとに 、 色彩分類システム Version2.1.1 (株式会社日本総合研究所 （日 本） 、 特開 2002- 016935号公報） を用いて近似色の照合をおこなつ た。 このシステムを用いることによ り客観的に近似の RHSCC番号を 選択できる。
この方法で従来いわゆる "青いパラ" と呼ばれている品種の花弁 の色彩を測定し、 RHSCCにおける近似色を求めたところ、 プルーム ーンゃマダムビオレは 186d (GREYED- PURPLE GROUP) 、 ラバンデは 1 86c (GREYED-PURPLE GROUP) 、 青龍は 189d (GREYED- GREEN GROUP) 、 プノレーヘブンは 198d (GREYED— GREEN GROUP) であった。 したがつ てこれらの品種は青いパラと呼ばれているが RHSCC番号の分類では グレーグループであり、 本発明が目的と している青さを有していな 力 つた。 実施例 2. フラボノイ ドの分析
1 ) 花弁色素の抽出
凍結乾燥した花弁 0.5gを 4mlの 0.1% TFAを含む 50% ァセ トニ ト リ ル （CH3CN) 中で 20分間、 超音波下で抽出し 0.45μιηのフィルターで 濾過した。 この抽出液のアントシァニンの高速液体ク口マトグラフ ィー （HPLC) 分析は以下の条件で行った。 カラムは RSpak DE-413L
(4.6 ππηφχ 25 cm 、 昭ェ株式会社） を用い、 流速 0.6ml/minで、 移動相は 0.5%ト リ フルォロ酢酸 （TFA) を含む 10%から 50% の CH3CN/ H20の直線濃度勾配 15分間の後、 0.5% TFAを含む 50% CH3CN/H20で 10 分間のイ ソクラティ ック溶出を行った。 検出はフォ トダイオードァ レイ検出器 SPD-M10A (島津製作所） を用い、 600-250 nmの波長領 域を検出し、 520nmの吸光度の面積によ り各アン トシァニンの存在 比を求めた。
2 ) アントシァニジンの分析
上記濾液 0.2mlをガラス試験管中で減圧乾固し、 0.2 mlの 6 N 塩 酸 （HC1) に溶解し、 100 °Cで 20分間、 加水分解を行った。 分解後 のアントシァニジンは 0.2 mlの 1_ペンタノールで抽出し、 有機層を HPLCで以下の条件により分析した。 カラムは 0DS- A312 (6 mm φ x 1 5cm, ヮイエムシ一株式会社） を用い 移動相には CH3C00H ： CH30H ： H20 = 15 ： 20 ： 65の溶液を用い流速 1 ml/minで溶出した。
検出はフォ トダイォードアレイ検出器 SPD- M10A (島津製作所） で 600- 400 nmのスペク トルを測定し、 吸収極大 （ λ max) およびリ テンショ ンタイム (R.T.) で同定し 520nmの吸光度の面積で定量し た。 この HPLC条件下でデルフィ二ジンおよびシァニジンのリテン シヨ ンタイムおよび； L maxは 4.0分、 5.2分および 534nm、 525nmであ つた。 同定、 定量にはフナコシ株式会社よ り購入したデルフィニジ ン塩酸塩およびシァニジン塩酸塩を標品と して用いた。 3 ) フラボノールの分析
花弁の抽出濾液 0.2mlを 1.5mlのェッペン ドルフチューブ中で減圧 乾固し 0.2 mlの 0· 1M リ ン酸カ リ ウム緩衝液 （KPB) pH 4.5 に溶解 し、 6 ユニッ トの ]3 -ダルコシダーゼ （新日本化学株式会社）と 1 un itのナリ ンゲナーゼ （Sigma Chemical Co. , MO, USA)を力！]え、 30 °Cで 16 時間 保持した。 反応後、 0.2 mlの 90% CH3 CN を酵素反応液 に添加し、 反応を終了した。 この液を 0.45 μ mのフィルターでろ過 し、 下記の条件で HPLCを行った。
カラムは Develosil C30- UG- 5 (4.6mm x 15cm, 野村化学株式会 社） を用い、 流速 0.6ml/minで、 移動相は 0.1% TFA を含む 18%から 63%の CH3CN/H20の直線濃度勾配 10分間の後、 0.1% TFA を含む 63% の CH3 CN/H20 のイソクラティ ック溶出 10分間を行った。 検出はフォ トダイオードアレイ検出器 SPD- M10Aを使用し、 400-250 nmの波長 領域を検出した。 この条件下で ケンフエロールとケルセチンの R.T .と λ maxはそれぞれ 11.6 分間、 365 nm および 10.3分間、 370nmで あった。 定量は A330nmの面積で行い、 標品としてフナコシ株式会社 のケンフエロ ーノレとケノレセチンを用いた。
実施例 3. P Hの測定方法
-80°Cで 1時間以上凍結したパラ花弁約 2gを、 ホモジナイザ一を用 いて搾り、 搾汁液を得た。 これを p Hメーター （F— 22、 堀場製作所
) に微小電極 6069- 10C (堀場製作所） を接続し pHを測定した。
実施例 4. パラの形質転換
パラの形質転換に関してはすでに多くの方法が報告されており （ たとえば Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883 - 888 (1994) 、 US 5480789, US 5792927、 EP 536 327 Al、 US 20010007157 Al ) 、 これらの方法に従って形質転換を実施できる。 具体的にはァグロ ノ クテリ ゥム · ッメ ファシエンス (Agrobacterium tumef ac i ens) A glO株 (Lazo et al. Bio/Technology 9: 963-967, 1991) の菌液 中に、 無菌苗の葉から誘導したパラのカルスを 5分間浸し、 滅菌濾 紙で余分な菌液を拭き取った後、 継代用培地に移植し、 2日間暗所 で共存培養した。
その後、 カルペニシリ ンを 400mg/L 加えた MS液体培地で洗浄し、 継代用培地 にカナマイシン 50mg/L とカルペニシリ ン 200mg/Lをカロ えた選抜 · 除菌用培地へ移植した。 選抜培地上で生育阻害を受けず 、 正常に増殖する部分の移植と培養を繰り返し、 カナマイシン耐性 カルスを選抜した。 カナマイシン耐性を示した形質転換カルスを、 カナマイシン 50mg/L、 カルペニシリ ン 200mg/Lを添加した再分化用 の培地で培養し、 カナマイシン耐性シュートを得た。 得られたシュ ートは 1/2MS培地で発根させた後、 馴化を行った。 馴化個体は鉢上 げ後、 閉鎖系温室で栽培して開花させた。
実施例 5. パラのフラポノイ ド遺伝子の取得
バラ品種カーディナル花弁由来の cDNAライブラリーをペチュニア の DFR遺伝子 （W096/36716に記載） をプローブにしてスク リ ーニン グしパラの DFR cDNAを取得し、 pCGP645とした。 詳細はすでに報告 されている （Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36， 1023-1031 1995) 。
同様に、 同じライブラリーをペチュニアのカルコンシンターゼ -A (CHS- A)遺伝子 （Koes et al. Gene (1989) 81, 245-257) とキン ギヨ ソゥのアントシァニジンシンターゼ (ANS) 遺伝子 (Martin et al. Plant J， (1991) 1， 37-49) で、 公知の方法 （Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031 1995) でスク リーニングす ることによ りパラのカルコンシンターゼ (CHS) とアントシァニジ ンシンターゼ （ANS) のホモログを取得し、 それぞれ pCGP634と pCGP 1375と した。 パラの CHSの塩基配列を配列表 ·配列番号 ： 5に、 パ ラの ANSの塩基配列を配列番号 ： 6にそれぞれ示す。
実施例 6. 白パラスク リーニング
遺伝子耝換えの手法で青い品種を作出するためには、 内在性のァ ントシァニン合成経路と導入する遺伝子 （具体的には F3'5'H遺伝子 ) との競合を回避するために DFR遺伝子のみが欠損している品種を 選抜し、 その品種にペチュニア由来 DFR遺伝子と F3'5'H遺伝子を導 入すればよい （W096/36716) 。
白いパラの品種は多数あり、 この中で DFR遺伝子のみが欠損し、 他のアントシァニン生合成酵素遺伝子は正常に発現している品種を 探索した。 花の色が白くなる原因は、 アントシァニン生合成に関わ る構造遺伝子の変異あるいは欠失に寄る場合とアントシァニン生合 成に関わる構造遺伝子の転写を制御する転写調節因子の欠失に寄る 場合があると考えられる。 こ こでは W096/36716に従い、 DFR遺伝子 の mRNAが欠損しているバラを探索した。
主に白色のパラ 112系統についてまず実施例 1 に記載した方法に より花弁のフラボノィ ドの組成を分析し、 フラボノールが高蓄積し ている系統を選択した。 その後、 花弁の搾汁の pHを測定し、 相対的 に pHが高い品種 80系統を一次候補とした。
次に、 これら品種の花弁から RNAを抽出した。 RNAの抽出は公知の 方法に従った (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-103 1 1995) 。 得られた RNAを用いてパラ DFR遺伝子 （Tanaka et al. PI ant Cell Physiol. 36, 1023-1031 1995) とパラアントシァニジン シンターゼ （ANS) 遺伝子に対応する mRNAの有無を調べた。 RT-PCR 法によ り、 内在性の DFR mRNAの発現量が低く、 かつ ANS mRNA量が 正常なレベルの品種 8品種 （WKS-11、 13、 22、 36、 43、 ホワイ トキ ラニー、 つる No.2、 ティネケ） を選抜した。
なお、 RT- PCRはそれぞれの品種の花弁から得た RNAを用いて Super Script First-strand Synthesis System for RT-PCR ( Invitrogen ) を用レヽた。 DFRmRNAの検出 ίこ ίま DFR—2F (5' -CAAGCAATGGCATCGGAA TC -3' ) (配列番号 ： 13) と DFR-2B (5' -TTTCCAGTGAGTGGCGAAAGT C -3， ) (配列番号 ： 14) のプライマーを、 ANSmRNAの検出には AN S-2F (5， -TGGACTCGAAGAACTCGTCC-3' ) (配列番号 ： 15) と ANS- 2B (5， -CCTCACCTTCTCCCTTGTT - 3' ) (配列番号 ： 16) のプライマ一 を用いた。
これらの 8品種について、 ノザン解析を行い （表 1 ) 、 DFRmRNA レベルが低い傾向を示し、 ANSmRNAレベルが正常であり、 かつ培養 特性が優れ、 形質転換可能な 2品種 （ティネケ、 WKS36) について 実際にデルフィ二ジン生産用コ ンス トラタ トを導入することを決定 した。
表 1
Figure imgf000020_0001
+ ： mRNAが有色のパラ （品種ローテローゼ） と同程度検出されたもの。 一 ： mRNAが有色のパラ （品種ローテローゼ） より低レベルなもの。
Q：ゲノレセチン、 K：ゲンフェローノレ 実施例 7 . ティネケへのパラ由来 DFR遺伝子の導入
pE2113 (Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37， 45-59 199 6) はェンハンサー配列を繰り返した力 リ フラワーモザイクウィル ス 35S (E1235S) プロモーターとノパリ ンシンターゼターミネータ 一を有する。 このプラスミ ドを Saclで消化し、 Blunting Kit (タカ ラ） を用いて平滑末端にした。 この DNA断片を 8bpの Sailリ ンカ一 （ タカラ） とライゲーシヨ ンし、 得られたプラスミ ドを pUE5とした。
PUE5を Hindlllと EcoRIで消化して得られる約 3 kbの DNA断片を Hin dillと EcoRIで消ィ匕した pBinl9(Bevan M, Binary Agrobacter ium Ve ctor for plant transformation. Nucl. Ac id Res. 12. 8711-21， 1984)に導入し、 得られたプラスミ ドを pBE5 とした。 pCGP645を Bam HIと Xholで消ィヒして完全長のパラ DFRc DNAを含む DNA断片を得た。 これを BamHIと Xholで f肖ィ匕した pBE 5に連結し、 pBERDl (図 2 ) と し た。 このプラスミ ドを Agrobacterium tumefaciens AglO株 に導入 した。
白色系パラ品種 「ティネケ」 へ pBERDl (図 2 ) を導入し、 18個体 の形質転換体を得た。 得られた形質転換体のうち 6個体で花色が変 化した。 白からピンクへの明確な花色がみられた 2個体について色 素分析を行ったところ、 いずれもシァニジン、 ペラルゴ二ジンの蓄 積が確認された （表 2 ) 。 この結果によ り、 品種ティネケは DFR遺 伝子が欠損した品種であるという ことが推察された。
表 2
Figure imgf000021_0001
Cya： シァニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン 実施例 8. ティネケへのパンジー由来 F3' 5' H遺伝子 （#18) と ペチュニァ由来 DFR遺伝子の導入 パンジー（品種ブラックパンジー）の若い蕾の花弁から Turpenと Gr iffithの方法 （BioTechniques 4:11-15， 1986) に従って RNAを抽出 し、 oligotex- dT(Qiagen)を用いて polyA+RNAを精製した。 本 polyA+ RNA t λ ZAPII/Gigapackll ク ローニングキッ ト （Stratagene) を 用いて、 パンジー若い蕾の花弁に由来する cDNAライブラリ一を作製 した。 NZYプレー ト上で生育させた約 100，000pfuのファージプラー クを Colony/PlaqueScreen (Dupont) に転写した後、 製造元推奨の 方法に従って処理をした。 これらを32 Pでラベルした、 ペチュニア H flcDNA (pCGP602、 Holton et al.， Nature, 366, p276-279, 1993 ) をプローブと してスク リーニングした。
メ ンブレンをハイブリダイゼーショ ンバッファ一（10% (v/v) ホ ルムアミ ド、 1 NaCl,10% (w/v) デキス トランサルフエート、 1 % SDS)中で 42°C、 1時間プレハイブリ ダィゼーシヨ ンした後、 32P ラベルしたプローブを 1 X 106 cpm/mlとなるように加えて、 42°C、 1 6時間ハイブリ ダィゼーシヨ ンを行った。 その後、 メ ンプレンを 2 xSSC，l%SDS中、 42°C、 1時間洗浄し、 さらに新たな洗浄液に換えて 1時間洗浄した。 洗浄後のメンブレンをコダック XARフィルムに増感 スク リーンと ともに感光させ、 ハイブリ ダイゼーショ ンシグナルを 検出した。
得られた cDNAの解析の結果、 ペチュニア Hflと高い同一性を示す 2 種類の cDNAが得られたことが明らかとなった。 この 2種類の cDNAを パンジーの F3',5'H cDNA, BP#18(pCGP1959)ならびに BP#40(pCGP19 61)と した。 #18の塩基配列を配列番号 ： 1、 そのアミ ノ酸配列を配 列番号 ： 2に示し、 #40の塩基配列を配列番号 ： 3、 そのアミ ノ酸 酉己歹 ijを酉己歹 U番号 ： 4に示す。 BP«8と ΒΡίί40は DNAレべノレで 82%の同 一' ["生を有する。 また ΒΡ#18と ΒΡ#40はともに DNAレベルで、 ペチュニ ァ Hflと 60%、 ペチュニアお (Holton et al. , Nature, 366， ρ27 6-279, 1993) と 62%の同一'性を示す。
一方、 pUE5を EcoRIで消化し、 Blunting Kit (タカラ） を用いて 平滑末端にした DNA断片と 8bpの Hindlllリ ンカ一 （タカラ） とライ ゲーシヨ ンし、 得られたプラスミ ドを pUE5Hとした。 パンジー由来 の F3，5'H #18 c DNAを含むプラスミ ド p CGP1959 (を BamHIで完全 消化し、 さらに Xholで部分消化し得られる約 1.8kbの DNA断片を回収 した。 一方、 これと BamHIと Xholで消化した pUE5Hとライゲーシヨ ン し得られたプラスミ ドを pUEBP18と した。
—方、 ペチュニア DFR c DNAを含む DNA断片を、 pCGP1403 (W096/3 6716) を BamHIと Xholで消化することによ り回収し、 この DNA断片と BamHIと Xholで消化した pBE 5 と連結し、 pBEPD 2 とした。 次に pUEBP 18を Hindlllで部分消化し、 E1235Sプロモーター、 パンジー由来 F3， 5，H#18cDNA、 nosターミネーターを含む約 2.8kbの DNA断片を回収し た。 この断片と pBEPD2を Hindi IIで部分消化した DNA断片とを連結 し、 バイナリーベクタープラスミ ド pBPDBP2 (図 3 ) を得た。 この プラスミ ドをァグロパクテリ ゥム ♦ ッメファシエンス （Agrobacter ium tumefaciens) AglO株 {こ専人した。
白色系パラ品種 「ティネケ」 へ PBPDBP2 (図 3 ) を導入し、 40個 体の形質転換体を得た。 得られた形質転換体のうち 23個体で花色が 変化し、 色素分析を行った 19個体のうち 16個体でデルフィニジンの 蓄積を確認した （表 3 ) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 100% (平 均 87%) となったが、 色素量が最高でも花弁 l gあたり 0.035mgと極 めて少なく、 花色は RHSカラーチャート 158d(YELL0W- WHITE GROUP) 力、ら、 56a (RED GROUP) や 65b (RED-PURPLE GROUP) への変ィ匕に止 ま り RHSCCのバイオレツ トグループ、 バイオレツ トープル一グルー プ、 ブルーグループには至らず、 目的の青いパラを得ることは出来 なかった。 表 3
Figure imgf000024_0001
Del：デルフィ二ジン、 M： ミリセチン 実施例 9. ティネケへのパンジー由来 F3'5'H遺伝子 （#40) とぺ チュニァ由来 DFR遺伝子の導入
プラスミ ド pE2113 (Mitsuhara et al. Plant Veil Physiol. 37, 45-59 1996) を Hindll Iと Xbalで消化して得られる約 800bpの DNA断 片を回収し、 Hindlllと Xbalで消化した pBinl9(Bevan M, Binary Ag robacter ium Vector for plant transformation. Nuc丄. Acid Res.
12. 8711-21， 1984) に連結した。 得られたプラス ミ ドを pCGP139 1と した。 一方、 pCGP669(W094/28140に記载）はペチュニアのカルコ ンシンターゼ A (CHS- A) 遺伝子のプロモーターを含んでいる。 この プラスミ ドを EcoRIで消化した後平滑末端化し、 さ らに Hindlllで消 化した。
この約 700bpの DNA断片を Hindlllと SnaBIで消化した pCGP1391と連 結し、 得られたプラスミ ドを PCGP1707と した。 また、 パンジー由来 の F3，5，H MO c DNA を含むプラスミ ド pCGP1961を BamHIで完全消化 し、 さらに Xholで部分消化し得られる約 1.8kbの DNA断片を回収し、 これと BamHIと Xholで消化した pUE5Hとライゲーショ ンし得られたプ ラスミ ドを PUEBP40と した。 pUEBP40を EcoRVと Xbalで消化した約 5.5 kbの DNA断片を回収した。
この断片と、 PCGP1707を Hindlllで消化後平滑末端化し、 さらに X balで消化して得られる約 700bpの断片を連結し、 pUFBP40を得た。 次にpUFBP40をHindIIIで部分'消ィ匕し、 カリ フラワー 35Sプロモータ ーェンハンサー、 CHS- Aプロモーター、 パンジー由来 F3，5，H#40 cDN A nosターミネータ一を含む約 3.4kbの DNA断片を回収した。 この断 片と PBEPD2を Hindlllで部分消化した DNA断片とを連結し、 バイナ リーベクタープラスミ ド pBPDBP8 (図 4 ) を得た。 このプラスミ ド を Agrobacter ium tumefaciens AglOte ίこ導入し 7こ。
白色系バラ品種 「ティネケ」 へ PBPDBP8 (図 4 ) を導入し、 53個 体の形質転換体を得た。 得られた形質転換体のうち 17個体で花色が 変化し、 色素分析を行った 9個体のうち 8個体でデルフィ二ジンの蓄 積を確認した （表 4 ) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 93% (平均 79 %) となったが、 色素量が最高でも花弁 1 gあたり 0.014mgと極めて 少なく、 花色は RHSカラーチャート 158d(YELL0W- WHITE GROUP)から 、 56a (RED GROUP) や 65b (Red-Purple Group) への変化に止ま り R HSCCのバイォレッ トグループ、 バイオレツ トーブルーグループ、 ブ ルーグループには至らず、 目的の青いパラを得ることは出来なかつ た。 また、 以上は品種ティネケカ SDFR遺伝子のみが欠損した品種で はないことを示唆している。
Figure imgf000026_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 10. WKS36へのパンジー由来 F3'5'H遺伝子 （#18) とペチュ ユア由来 DFR遺伝子の導入
白色系パラ 「WKS36」 へ pBPDBP2 (図 3 ) を導入し、 138個体の形 質転換体を得た。 得られた形質転換体のうち 10個体で花色が変化し 、 全ての個体でデルフィ二ジンの蓄積を確認した （表 5 ) 。 デルフ ィニジン含有率は最高 91% (平均 60%) となったが、 色素量が花弁 1 gあたり 0.033mgと極めて少なく、 花色はごく薄いピンクへの変化 に止まり RHSCCのノ ィォレッ トグループ、 バイオレッ ト一ブルーグ ループ、 ブルーグループには至らず、 目的の青いパラを得ることは 出来なかった。 また、 以上は品種 WKS36は DFR遺伝子のみが欠損した 品種ではないことを示唆している。 表 5
Figure imgf000027_0001
実施例 11. WKS36へのパンジー由来 F3' 5' H遺伝子 （#18) とペチ ュニァ由来 DFR遺伝子の導入
pUCAP (van Engelen et al. Transgenic Research 4 , 288 - 290， 1995)の Ascl部位を Paclリ ンカーで置換したプラスミ ドを pUCPPとし た。 一方、 パラのカルコンシンタ一ゼプロモーターとノ、。ンジ一由来 の F3' 5' H#18c DNAと nosターミネータ一を連結した発現カセッ ト を以下のように得た。
バラ品種 Kardinalの若い葉から染色体 DNAを抽出した（Tanaka et al. , Plant Cell Physiol. , 36: 1023-1031， 1995)。 約 lOO^ gの DN Aを Sau3AIで部分消化し、 ショ糖密度勾配によ り約 20kbの DNA画分を 回収した。
これと BamHIで消化したラムダファージ EMBL3 (たとえばス トラタ ジーン社） と連結し、 製造者が推奨する方法で染色体 DNAライブラ リーを作製した。 このライブラ リ一をパラのカルコンシンターゼ c DNA (赚データベース GenBankのァクセシヨ ン番号 AB038246) をプ ローブと して公知の方法 (Tanaka et al. , Plant Cell Physiol. , 36: 1023-1031, 1995)でスク リーニングした。 得られたカルコンシ ンターゼの染色体ク ローンのうちラムダ CHS20にはカルコンシンタ ーゼの開始コ ドンの上流約 6.4kbの DNA配列が含まれていた。 ラムダ (1^20を11]^ 11と£001^で消ィ匕して得られる約 2.9kbの DNA断片には カルコンシンターゼのプロモーター領域が含まれている。
この断片を pUC19 (Yanisch-Perron C et al. , Gene 33:103-119， 1985) を Hindlllと Smalで消化した断片と連結した。 これを pCGPll 16とした。 これに含まれるカルコンシンターゼプロモーター部分の 配列は配列番号 ： 2 1 に示した。 pCGP1116を Hindlllと Kpnlで消化 して得られる約 2.9kbの DNA断片と、 pJBl (Bodeau, Molecular and genetic regulation of Bronze - 2 and other maize anthocyanin g enes. Disser tat ion (学 iiL論文)， Stanford University, USA, 1994 ) を Hindlllと Kpnlで消化して得られる DNA断片を連結し pCGP197を 得た。
他方、 pUE5を Saclと Kpnlで消化して得られる約 300bpのノノ、。リ ン シンターゼターミネーターを含む DNA断片を平滑末端化し、 EcoRVと BamHIで消化しさらに平滑末端化した pBluescr iptSK-と結合した。 得られるプラスミ ドのうちターミネータ一の 5' 側が pBluescriptS K-の Sailに近 V、ものを pCGP1986と した。 pCGP1986を Xho Iで消ィ匕し、 平滑末端化し、 さらに Sailで消化した DNA断片と、 pCGP197を Hindi I Iで消化した後平滑末端化しさらに Sailで消化して得られる DNA断片 を連結し、 PCGP2201を得た。
さ らに、 pCGP2201を Sailで消化し、 平滑末端化した DNA断片と p C GP1959を BamHIと Kpnlで消化しさ らに平滑末端化した約 1.7kbの DNA 断片 （パンジーのフラポノィ ド 3'，5'_水酸化酵素遺伝子を含む）を 連結した。 得られるプラスミ ドのうちパラカルコンシンターゼプロ モーターがパンジーのフラポノィ ド 3'，5'—水酸化酵素遺伝子を順 方向に転写できる向きに挿入されたものを pCGP2203と した。 プラス ミ ド pCGP2203を Hindlllと Saclで消化することによ り回収した。 こ の DNA断片を pUCPPの Hindlllと Sac I部位にクローニングし、 これを p SPB459とした。 次にプラスミ ド pE2113を SnaBIで消化し、 BamHIリ ン カー (タカラ） を挿入して得られたプラスミ ドを pUE6とした。
pUE6を Hindlllと BamHIで消化して得られる約 700bpの DNA断片と、 PCGP1405 (W096/36716) を BamHIと Bgl 11で消化して得られる約 2.2k bの DNA断片と、 Hindlllと BamHIで消化したパイナリーべクタ一 pBin plus (van Engelen et al. Transgenic Research , 288-290 , 199o )を連結し、 pSPB460を得た。 pSPB459を Paclで消化して得られる約 5 kbの DNA断片を、 pSPB460の Paclサイ トに導入することによって、 パ イナリ一ベクター上でペチュニア DFRとパンジー F3'5'H #18遺伝子 が順方向に連結された PSPB461 (図 5 ) を得た。 本プラスミ ドは植 物においてはペチュニア由来の DFR遺伝子を構成的に発現し、 パン ジー由来の F3'5'H #18遺伝子を花弁特異的に転写するよ うに工夫さ れている。 このプラスミ ドをァグロパクテリ ゥム · ッメファシェン ス ( Agrooacter ium tumefaciens) AglOfe ίこ導人した。
白色系パラ 「WKS36」 へ pSPB461 (図 5 ) を導入し、 229個体の形 質転換体を得た。 得られた形質転換体のうち 16個体で花色が変化し 、 色素分析を行った 12個体全てでデルフィ二ジンの蓄積を確認した (表 6 ) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 79% (平均 58%) となった が、 色素量が花弁 1 gあたり 0.031mgと極めて少なく、 花色はごく薄 いピンクへの変化に止ま り RHSCCのパィォレツ トグル一プ、 バイオ レッ ト一プノレーグノレープ、 ブルーグ/レープには至らず、 目的の青い パラを得ることは出来なかった。 また品種 WKS36は DFR遺伝子のみが 欠損した品種ではないことを示唆された。 表 6
Figure imgf000030_0001
実施例 12. WKS36へのパンジー由来 F3'5'H遺伝子 （#18) 、 ペチュ ユア由来 DFR遺伝子およびシソ由来アントシァニン 3 -ダルコシド ァシル基転移酵素遺伝子の導入
シソ由来のヒ ドロキシシナモイル CoA： アン トシァニン 3-グルコ シドアシル基転移酵素 （3AT) 遺伝子に開始コ ドンを付加した遺伝 子を pSAT208F(Yonekura- Sakakibara et al. Plant Cell Physiol. 41, 495-502, 2000)と した。 pSPB580(PCT/AU03/00079)を BamHIと Xh olで消化して得られる約 3.9kbの DNA断片と pSAT208F を BamHIと Xhol で消化して得られる約 1.8kbの DNA断片を連結した。
得られたプラスミ ドを Asclで消化することによ り、 E1235Sプロモ 一ターとシソ 3AT遺伝子とペチュニアフォスフオ リ ピ ド トランァス ファー蛋白質由来のターミネータ一を含む DNA断片を回収した。 こ の DNA断片を前述の pSPB461の Ascl部位に揷入し、 シソ由来 3AT、 ぺ チュユア由来 DFR，パンジー由来 F3'5'H #18の遺伝子の転写方向が順 方向になっているプラスミ ド pSPB472 (図 6 ) を得た。 本プラスミ ドは植物においてはシソ由来 3AT遺伝子とペチュニア由来 DFR遺伝子 を構成的に発現し、 パンジー由来 F3'5'H #18遺伝子を花弁特異的に 転写するように工夫されている。 このプラスミ ドをァグロパクテリ ゥム · ッメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens) AglO株に 導入した。
白色系パラ 「WKS36」 へ pSPB472 (図 6 ) を導入し、 75個体の形質 転換体を得た。 得られた形質転換体のうち 4個体で花色が変化し、 色素分析を行った 3個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した （ 表 7 ) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 67% (平均 49%) となったが 、 色素量が花弁 lgあたり O.Ollmgと極めて少なく、 花色はごく薄い ピンクへの変化に止まり RHSCCのパイォレッ トグループ、 パイォレ ッ トープノレーグノレープ、 ブルーグループには至らず、 目的の青いパ ラを得ることは出来なかった。 以上も品種 WKS36は DFR遺伝子のみが 欠損した品種ではないことを示唆している。
表 7
Figure imgf000031_0001
このように多数の白いパラをスク リ一二ングしたにもかかわらず
DFR遺伝子のみが欠損した品種を得ることができなかった。 すなわ ち、 青色のカーネーシ ョ ンを作出した方法 （W094/28140) では青い パラを得ることはできなかった。
実施例 13. コサプレツシヨ ンによるパラ由来 DFR遺伝子の抑制 藤色系パ 7品種 「ラバンデ」 へ pBERDlを導入し、 26個体の形質転 換体を得た。 しかし、 花色の変化した個体は全く得られず、 コサプ レツシヨ ン法ではパラの内在性の DFR遺伝子を抑制することが困難 であることが示唆された。
実施例 14. 有色パラのスク リーニング
次に有色のパラの中から、 青いバラを作製するための品種を選抜 することにした。 有色のパラの中で相対的に青みを帯びている品種 を中心に目視によ り 136系統を選抜し、 89系統について色素分析を 行った。 調査した有色パラの分析値を表 8〜表 10に示す。
表 8
Figure imgf000033_0001
Peo：ぺォニジン εε
ベ -^ ： oej
Figure imgf000034_0001
6挲
請 OOZdf/IOd LtlLlO/SOOZ OAV 表 10
Figure imgf000035_0001
Peo：ぺ才ニジン 実施例 15. ラバンデへのパンジー由来 F3'5'H遺伝子 （#40) と ト レニァ由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
アン トシァニンを芳香族ァシル基によ り修飾することによりアン トシァニンを安定化させ、 かつその色を青くすることができる （た とえば、 動 6/25500) 。 ァシル化したデルフィニジン型アントシァ ニンの生産を目指して以下の実験を行った。
トレニァ品種サマーゥエーブ花弁から RNAを得、 さらにこれから p olyA+RNAを調製した。 この p。lyA+ RNA力 ら； I ZAPI I ( Stratagene社） をベクターとする c DNAライブラリ一を directional c DNAライブラ リー作製キッ ト （Stratagene社） を用いて製造者が推奨する方法で 作製した。 ト レニァの主要アントシァニンはその 5位のグルコース が芳香族ァシル基により修飾されている （Suzuki et al. Molecula r Breeding 2000 6， 239-246) ので、 ト レニァ花弁においてはアン トシァニンァシル基転移酵素が発現している。
アントシァニンァシル基転移酵素は Asp- Phe- Gly-Trp- Gly- Lysと いうアミ ノ酸配列が保存されており、 これに対応する合成 DNAをプ ライマーとして用いることによりアントシァニンァシル基転移酵素 遺伝子を取得することができる （W096/25500) 。 具体的には、 トレ ニァ c DNAライプラリ一作製の際に合成した 1本鎖 c DNAlOngを铸型 と し、 100ng の ATCプライマー（5，-GA(TC)TT(TC)GGITGGGGIAA- 3，、 I はイ ノシン ） （配列番号 ： 17) 、 100ngのオリ ゴ d Tプライマー （5 TTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAG 3， ） （酉己歹 ij番号 ： is) をプライマー とし、 Taqポリ メラーゼ （タカラ、 日本） を用いて製造者の推奨す る条件で PCRを行った。
PCRは、 95°Cにて 1分間、 55°Cにて 1分間、 及び 72°Cにて 1分間を 1 サイクルとする反応を 25サイクル行った。 得られた約 400 bpの DNA 断片を Gene Clean II (BIO, 101. Inc. ) によ り製造者の推奨する方 法で回収し、 pCR- T0P0にサブクローニングした。 その塩基配列を決 定したところリ ンドウのァシル基転移酵素遺伝子 （Fuj iwara et al . ( 1998 ) Plant J. 16 421-431) に相同な配列が見られた。 なお塩 基配列はダイプライマー法 （アプライ ドバイオシステムズ社） を用 い、 シークェンサ一 310あるいは 377 (いずれもアプライ ドパイオシ ステムズ社） を用いて決定した。
この DNA断片を DIG標識検出キッ ト （日本ロッシュ） を用いて D IG によ り標識し、 製造者が推奨する方法でトレユアの c DNAライブラ リーをプラークハイブリ ダイゼーショ ン法によ りスク リーニングし た。 得られたポジティブシグナルをもたらしたクローンを無作為に 1 2選択し、 そこからプラスミ ドを回収し、 塩基配列を決定した。 これらはアントシァニンァシル基転移酵素によい相同性を示した。 これらのクローンのうち pTAT7と したクローンに含まれる c DNAの全 塩基配列を決定した。 この塩基配列を配列番号 ： 7に示し、 そして そてに対応するァミノ酸配列を配列番号 ： 8に示す。
PBE2113-GUS ( Mi t suhara et al . Plant Vei l Phys iol. 37， 45 - 5 9 1996) を Sac lで消化した後、 平滑末端化し、 8bpの Xho lリ ンカ一
(タカラ） を挿入した。 このプラスミ ドの BamHIと Xho l部位に pTAT7 を BamHIと Xho lで消化して得られる約 1. 7kbの MAを挿入し、 pSPB120 を得た。 pSPB120を SnaB Iと BamHIで消化した後平滑末端化しライゲ ーシヨ ンすることによ り PSPB120' を得た。 一方、 パンジー由来の F 3' 5' H#40 c DNA を含むプラスミ ド pCGP1961を BamHIで完全消化 し、 さ らに Xho lで部分消化し得られる約 1. 8kbの DNA断片を回収し、 これと BamHIと Xho lで消化した pUE5Hとライゲーショ ンし得られたプ ラスミ ドを pUEBP40とした。
PUEBP40を SnaB Iと BamHIで消化した後平滑末端化しライグーショ ンすることにより pUEBP40， を得た。 pUEBP40' を Hindl l lで部分消 化し得られる約 2.7kbの DNA断片を回収し、 pSPB120' を Hindlllで部 分消化した DNA断片と連結した。 得られたプラスミ ドのうち、 パイ ナリ—ベクター上でライ トボーダー側から、 ネオマイシンフォスフ オ トランスフェラーゼ遺伝子、 パンジー由来 F3，5'H #40遺伝子、 ト レニァ由来 5 AT遺伝子の順にそれぞれが同方向に連結されたパイナ リーベクターを pSPB130 (図 7 ) とした。 本プラスミ ドは植物におい てはパンジー由来 F3'5'H #40遺伝子と トレニァ由来 5AT遺伝子構成 的に発現し、 遺伝子を花弁特異的に転写するように工夫されている 。 このプラスミ ドをァグロパクテリ ゥム · ッメファシエンス （ Agro bacterium tumefaciens) AglO株 ίこ辱人し 7こ。
藤色系バラ品種 「ラバンデ」 へ PSPB130 (図 7 ) を導入し、 41個 体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 32個体のうち 20個体でデ ルフィ二ジンの蓄積を確認した （表 11及び表 12) 。 デルフィ二ジン 含有率は最高 71% (平均 36%) であった。 花色は RHSカラーチヤ一 h 186c (GRAYED— PURPLE GROUP) 力 ら 79 d (PURPLE GROUP) へ変ィ匕 した。 またこの際のァシル化アントシァニンの割合は総アントシァ 二ンの 30%程度に留まつた。 ァシル化されたァントシァニンのスぺ ク トルを測定したところ、 その吸収極大波長はデルフィ二ジン 3， 5 -ジダルコシドより も 4nm長波長シフ ト していたが、 総アントシァ ニン中の割合が低いため、 花色に明瞭な効果を与えるには至らなか つた。
表 11
Figure imgf000039_0001
na：分析 ·測定せず
表 12
Figure imgf000040_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 16. WKS100へのパンジー由来 F3' 5' H遺伝子 （#40) と ト レニァ由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
藤色系パラ 「WKS100」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 146個体の形 質転換体を得た。 色素分析を行った 63個体のうち 56個体でデルフィ 二ジンの蓄積を確認した （表 13〜表 15) 。 デルフィ二ジン含有率は 最高 95 % (平均 44 % ) であった。 花色は RHSカラーチャート 56 d (R ED GROUP) 力、ら 186 d ( GRAYED— PURPLE GROUP) へ変ィ匕した。 し力、し ながら RHSCCのノ ィォレッ トグループ、 バイオレツ ト一ブルーグル ープ、 ブルーグループには至らず、 目的の青いバラを得ることは出 来なかった。 表 13
Figure imgf000041_0001
na：分析 ·測定せず 表 14
Figure imgf000042_0001
na：分析 ·測定せず 表 15
Figure imgf000043_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 17. WKS116へのパンジー由来 F3，5 ' H遺伝子 （#40) と ト レ ニァ由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
薄藤色系バラ 「WKS116」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 282個体の 形質転換体を得た。 色素分析を行った 36個体のうち 33個体でデルフ ィニジンの蓄積を確認した （表 16及び表 17) 。 デルフィ二ジン含有 率は最高 80 % (平均 73 % ) であった。 RHSカラーチャー ト 196 d ( GR AYED— GREEN GROUP) 力、ら 186d ( GREYED—PURPLE GROUP) へ変化した 。 しかしながら RHSCCのバイオレッ トグループ、 バイオレッ トーブ ルーグループ、 ブルーグループには至らず、 目的の青いバラを得る ことは出来なかった。 表 16
Figure imgf000044_0001
na：分析 '測定せ-
表 1
Figure imgf000045_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 18. WKS124パンジー由来 F3'5'H遺伝子 （#40) と トレユア 由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
薄橙色系パラ 「WKS124」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 50個体の 形質転換体を得た。 色素分析を行った 15個体のうち 13個体でデルフ ィニジンの蓄積を確認した （表 18) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 95% (平均 82%) であった。 花色は RHSカラーチャー ト 52 d (RED G ROUP) 力 ら 71c (RED-PURPLE GROUP) へ変ィ匕した。 し力、しな力 ら RHS CCのバイオレツ ト グループ、 バイオレツ ト ーブノレ一グノレープ、 ブル 一グループには至らず、 目的の青いパラを得ることは出来なかった 表 18
Figure imgf000046_0001
na :分析 ·測定せず 実施例 19. WKS132へのパンジー由来 F3，5 ' H遺伝子 （#40) と ト レ ニァ由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
鮮紅色系パラ 「WKS132」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 24個体の 形質転換体を得た。 色素分析を行った 7個体のうち 6個体でデルフィ 二ジンの蓄積を確認した （表 19) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 43 % (平均 12 % ) であった。 花色は RHSカラーチャート 57a (RED- PURP LE GROUP) 力 ら 66a ( RED-PURPLE GROUP) へ変ィ匕した。 し力、しな力 S ら RHSCCのパイォレッ トグループ、 バイォレツ トーブルーグループ 、 ブルーグループには至らず、 目的の青いパラを得ることは出来な 力 つた。 表 19
Figure imgf000047_0001
実施例 20. WKS133へのパンジー由来 F3 ' 5 ' H遺伝子 （#40) と トレ ユア由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
濃赤紫系パラ 「WKS133」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 16個体の 形質転換体を得た。 色素分析を行った 8個体全てでデルフィ二ジン の蓄積を確認した （表 20) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 34% (平 均 11 % ) であった。 花色は RHSカラーチャー ト 53a (RED GROUP) 力、 ら 61a (RED-PURPLE GROUP) へ変ィ匕した。 し力 しな力 Sら RHSCCのノ ィ ォレツ ト グノレープ、 バイオレッ ト 一ブノレーグノレープ、 ブノレーグノレー プには至らず、 目的の青いパラを得ることは出来なかった。
表 20
Figure imgf000048_0001
na：分析 ·測定せず
実施例 21. JKS137へのパンジー由来 F3'5，H遺伝子 （#40) と ト レ ニァ由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
濃赤紫系パラ 「WKS137」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 20個体の 形質転換体を得た。 色素分析を行った 17個体全てでデルフィ二ジン の蓄積を確認した （表 21) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 1.3% ( 平均 0.4%) であった。 花色は RHSカラーチャー ト 61b (RED-PURPLE GROUP) から変化はみられなかった。
表 21
Figure imgf000050_0001
na：分析 ·測定せず
実施例 22. WKS140へのパンジー由来 F3'5'H遺伝子 （#40) と ト レ ユア由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
藤色系パラ 「WKS140」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 197個体の形 質転換体を得た。 色素分析を行った 45個体のうち 37個体でデルフィ 二ジンの蓄積を確認した （表 22及び表 23) 。 デルフィ二ジン含有率 は最高 94% (平均 47%) であった。 花色は RHSカラーチャート 186d (GREYED— PURPLE GROUP) 力 ら 79 d (PURPLE GROUP) へ変ィ匕した。 しかしながら RHSCCのノ ィォレッ トグループ、 バイオレッ ト一ブル 一グループ、 ブルーグループには至らず、 目的の青いバラを得るこ とは出来なかった。
表 22
Figure imgf000052_0001
na:分析 ·測定せず
表 23
Figure imgf000053_0001
na:分析 ·測定せず 実施例 23. WKS77へのパンジー由来 F3'5'H遺伝子 （#40) と ト レ二 ァ由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
濃赤紫系パラ 「WKS77」 へ PSPB130 (図 7 ) を導入し、 35個体の形 質転換体を得た。 色素分析を行った 17個体全てでデルフィ二ジンの 蓄積を確認した （表 24) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 57% (平均 33%) であった。 花色は RHSカラーチャート 57a (RED-PURPLE GROUP ) から 71a (RED-PURPLE GROUP) へ変化した。 しかしながら RHSCCの パイォレツ トグループ、 バイオレツ ト一ブルーグループ、 づノレ一グ ループには至らず、 目的の青いバラを得ることは出来なかった。 表 24
Figure imgf000054_0001
na :分析 ·測定せず 実施例 24. WKS82へのパンジー由来 F3，5'H遺伝子 （#40) と ト レ二 ァ由来アン トシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
藤色系パラ 「WKS82」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 89個体の形質 転換体を得た。 色素分析を行った 44個体全てでデルフィニジンの蓄 積を確認した （表 25及び表 26) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 91% (平均 49%) であった。 花色は RHSカラーチャー ト 186 d (GREYED-P URPLE GROUP) 力、ら 80c (PURPLE-VIOLET GROUP) へ変ィ匕した。 し力 しながら RHSCCのノ ィォレッ トグループ、 バイオレッ ト一ブル一グ ループ、 ブルーグループには至らず、 目的の青いバラを得るこ とは 出来なかった。 表 25
Figure imgf000055_0001
na :分析 ·測定せず
表 26
Figure imgf000056_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 25. WKS91へのパンジー由来 F3 ' 5，H遺伝子 （#40) と ト レ二 ァ由来アントシァニン 5—ァシル基転移酵素遺伝子の導入
薄橙色系パラ 「WKS91」 へ pSPB130 (図 7 ) を導入し、 10個体の形 質転換体を得た。 色素分析を行った 2個体のうち 1個体のみでデルフ ィニジンの蓄積を確認した （表 27) 。 デルフィ二ジン含有率は最高 2%であった。 花色は RHS力ラーチャ一ト 43 c ( RED GROUP )から変化 がみられなかった。 表 2
Figure imgf000057_0001
実施例 26. ラバンデでのパンジー由来 F 3'5'H遺伝子 （#40) とァ ィ リス由 DFR遺伝子の発現とパラ内在性 DFR遺伝子の抑制
切花の青いアイ リス花弁から RNAを得、 さらにこれから polyA+RNA を調製した。 この polyA+RNA力、ら L ZAPII (Stratagene社） をべクタ 一とする c DNAライブラリーを c DNAライブラリ一作製キッ ト （Stra tagene社） を用いて製造者が推奨する方法で作製した。 アイ リ スの DFR遺伝子断片は、 リ ンドウの DFR遺伝子断片を取得した報告と同様 に行った (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37, 711-716, 199 6) 。
得られた約 400 bpの DNA断片をジーンク リーンによ り製造者の推 奨する方法で回収し、 pCR-TOPOにサブクローニングした。 その塩基 配列を決定したところパラ DFR遺伝子に相同な配列が見られた。 こ の DNA断片を用いてアイ リ ス cDNAライブラリーをスク リーユングし 、 全長のアミ ノ酸配列を含むアイ リス DFRcDNAを得た。 そのうち pSP B906と したクローンに含まれる c DNAの全塩基配列を決定した。 こ の塩基配列を配列番号 ： 9に示し、 そして対応するアミノ酸配列を 配列番号 ： 1 0に示す。
次に PSPB580を BamHIと Xholで消化して得られる約 3.9kbの DNA断片 と pSPB906を BamHIと Xholで消化して得られる約 1· 5kbの DNA断片を連 結し得られたプラスミ ドを PSPB909と した。
植物中でパラ DFR c DNAの二本鎖 RNAを転写するは次のように作製 した。 pCGP1364(Tanaka et al. Plant Cell Physiol. (1995) 36 1 023- 1031)を Pstlで部分消化して得られる約 3. 5 kbの DNA断片 （Mac 1プロモーター、 パラ DFRcDNA, mas ターミネータ一を含む） を pUC 19 (Yanisch-Perron C et al. , Gene 33:103 - 119， 1985) の Pstl部 位に挿入するこ とによって得られるプラスミ ドのうち PUC19の Hindi II部位が Maclプロモーターに近接しているものを pCGP1394と した。 次に、 pCGP1394を Hindlllと SacIIで消化して得られる約 1.4kbの D NA断片と、 pCGP1394を Pstlで消化した後平滑末端化しさ らに SacII で消化して得られる約 1.9kbの DNA断片と、 pBinPLUSを Saclで消化し た後平滑末端化しさらに Hindlllで消化して得られるバイナリ -べ クタ一断片を連結し PSPB185を得た。 pSPB185を Xbalで消化し、 平滑 末端化し、 Sailリ ンカーとライゲーショ ンすることにより、 pSPB52 1を得た。 PUE6を Hindlllと BamHIで消化して得られる約 700bpの DNA 断片と、 pSPB521を Hindlllと Saclで消化して得られるパイナリ -ベ クタ一 DNA断片と pE2113を BamHIと Sac Iで消化して得られる GUS遺伝 子 DNA断片を連結することによ り pSPB528を得た。
PSPB528はェンハンサーを有する力 リ フラヮーモザィ クウィルス 3 5Sプロモーターとマノ ピンシンターゼターミネータ一の間に構造遺 伝子を挿入し植物で発現させることができるバイナリ -ベクターで ある。 また、 pCGP645に含まれるパラ DFRc DNAの 5' 非翻訳領域配列 を短くするために pCGP645を Sma Iと Pvu Iで消化した後平滑末端化し 、 ライゲーショ ンして得られた pCGP645 s を得た。
ノ ラ DFR c DNAの 5， 側配列を、 pCGP645 s を鐃型にリバースプライ マーと合成プライマー RDF310 (5， -CCCTCGAGCCCTTGATGGCCTCGTCG-3 ' ) (配列番号 ： 19) をプライマーに用いて PCRによ り増幅すること によ り取得し、 pCRTOPOにクローニングした。 DNAの塩基配列を決定 し PCRによるエラーがないことを確認した。 これを pSPB569と した。 また長さの異なるパラ DFRc DNAの 5' 側配列を、 pCGP645 s を铸型に リパースプライマーと合成プライマー RDF830 (5' -GGGTCGACGCGGCC CTCTGCTTTCGG-3' ) (配列番号 ： 20) をプライマーに用いて PCRによ り増幅することにより取得し、 pCRTOPOにクローニングした。 DNAの 塩基配列を決定し PCRによるエラーがないことを確認した。
これを PSPB570と した。 pSPB528を BamHIと Saclで消化して得られ るパーナリ一べクターの DNA断片と、 pSPB569を Saclと Xholで消化し て得られる 0.3kbの DNA断片と pSPB570を BamHIと Sailで消化して得ら れる DNA断片を連結し pSPB572を得た。 本ベクターは植物中でパラ DF R c DNAの二本鎖 RNAを転写するよ うにデザインされている。
PUE6を Saclで消化し、 平滑末端化し、 S allリ ンカーを揷入し pU E8を得た。 pUE8をHindIπとEcoRIで.消化して得られる DNA断片を pBi nPLUSの Hindlllと EcoRI部位に導入し、 pSPB189と した。 pSPB189を B amHIと Sailで消化して得られる約 3.7kbの DNA断片と pCGP1961を BamH Iで完全消化しさらに Xholで部分消化して得られる約 1.8kbの DNA断 片を連結し PSPB567を得た。 pSPB572を Pacl消化し、 脱リ ン酸化処理 を行った後、 pSPB567を Paclで消化して得られる約 2.8kbの DNA断片 を連結し、 nptll遺伝子とパンジー由来の F3'5'H #40が同じ向きに 転写されるプラスミ ドを選択し、 pSPB905とした。
PSPB905を Asclで消化し、 脱リ ン酸化処理を行った後、 pSPB909を Asclで消化して得られる約 2.5kbの DNA断片を連結し、 nptll遺伝子 と同じ方向にアイ リス DFR遺伝子が転写されるプラスミ ドを得、 pSP B919 (図 8 ) とした。 本プラスミ ドはパラにおいてはアイ リス由来 の DFR遺伝子とパンジー由来の F3' 5' H #40遺伝子を転写し、 パラ の DFR遺伝子の発現を二本鎖 RNAの転写により抑制することが期待さ れる。 このプラスミ ドを Agrobacterium tumefaciens AglO株に導入 した。
藤色系パラ品種 「ラバンデ」 へ pSPB919 (図 8 ) を導入し、 87個 体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 38個体のう ち 31個体でデ ルフィ二ジンの蓄積を確認した （表 28及び表 29) 。 デルフィ二ジン 含有率は最高 100% (平均 76%) であった。 花色は RHSカラーチヤ一 ト 186c (GREYED— PURPLE GROUP) カ ら 85a， b (VIOLET GROUP) へと 大きく変化した。 ，
パラ花弁から RNAを前述のように抽出し、 ァガロースゲル電気泳 動により RNAを分離した後ハイボンド N (アマシャム社） に転写した (たとえば Tanaka et al. 1995) 。 mRNAの検出は DIG Northern Starter Kit (Roche) を用いて製造者の推奨する方法により行った 。 パラ DFRmRNAの検出には pCGP645 (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031 1995) を錶型と して用いて T7 プライマー で転写したものをプローブとして用いた。
パンジー F3'5'H #40 mRNAの検出には pCGP1961を錶型と して用い て T7プライマーで転写したものをプローブとして用いた。 アイ リス DFRmRNAの検出には pSPB906を铸型として用いて T7プライマーで転写 したものをプローブと して用いた。 色の変化したパラにおいては、 パンジー由来 F3，5'H #40とアイ リス DFR遺伝子の mRNAは検出された 。 一方、 ノ ラ DFRmRNAは宿主に比べ有意に減少しており、 低分子量 の位置にパンドが検出されることからパラ DFR mRNAの分解が起こつ ていることがわかった。
表
Figure imgf000061_0001
na：分析 ·測定せず
表 29
Figure imgf000062_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 27. ラバンデでのパンジー由来 F3'5'H遺伝子 （#40) と二 一レンベルギア由来 DFR遺伝子の発現とパラ内在性 DFR遺伝子の抑制 ニーレンべノレギア (Nierembergia hybrida) B¾¾ ~7エア リ 一べノレ /ヽ0 ティオラィ トブルー（サントリーフラワーズ株式会社） の花弁から R NAを得、 さらにこれから polyA+RNAを調製した。 この polyA+ RNA力 ら I ZAPII (Stratagene社） をベクターとする c DNAライブラリーを c DNAライブラリー合成キッ ト （Stratagene社） を用いて製造者が推 奨する方法で作製した。 この c DNAライブラ リ一を DIG標識したペチ ュ-ァ DFRc DNA (pCGP1405に由来） を用いてスク リーニングした。 スク リ一二ングの条件は DIG標識システムで製造者が推奨するプ ラークハイプリ ダイゼーショ ン方法に従った。 ただし、 プレハイブ リ ダイゼーショ ンならびにハイプリ ダイゼーショ ンバッファ一中の ホルムアミ ド濃度 30%と し、 37°Cでー晚ハイブリ ダイゼーシ ョ ンを 行った。 またメンブレンの洗浄は、 1% SDS を含む 5xSSC中 55°Cで行 つた。 得られた多数のポシティブなシグナルのうち 20プラークから プラスミ ドを回収し、 リバースプライマー （タカラ） を用いて塩基 配列の決定を行った。 これらはペチュニアはじめ他の植物の DFR遺 伝子に相同性を示した。 これらのうち pSPB709と したクローンの c D NAの全配列を決定した。 得られた塩基配列を配列番号 ： 11に示し、 そしてそれに対応するァミノ酸配列を配列番号 ： 12に示す。
PSPB580を BamHIと Xholで消化して得られる約 3.9kbの DNA断片と pS PB709を BamHIと Xholで消化して得られる約 1.5kbの DNA断片を連結し 得られたプラスミ ドを pSPB910と した。 pSPB905を Asclで消化し、 脱 リ ン酸化処理を行った後、 pSPB910を Asclで消化して得られる約 2.5 kbの DNA断片を連結し、 nptll遺伝子と同じ方向にニーレンベルギア DFR遺伝子が転写されるプラスミ ドを得、 pSPB920 (図 9 ) とした。 本プラスミ ドはパラにおいてはニーレンベルギア由来の DFR遺伝子 とパンジー由来の F3'5'H #40遺伝子を転写し、 パラの DFR遺伝子の 発現を二本鎖 RNAの転写によ り抑制することが期待される。 このプ ラスミ ドをァグロパクテリ ゥム · ッメファシエンス (Agrobacteriu m tumefaciens) AglOte ίこ導人し 7こ。
藤色系パラ品種 「ラバンデ」 へ pSPB920 (図 9 ) を導入し、 56個 体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 24個体のうち 23個体でデ ルフィ二ジンの蓄積を確認した （表 30) 。 デルフィ二ジン含有率は 最高 100% (平均 43%) であった。 花色は RHSカラーチャート 186c ( GREYED-PURPLE GROUP) から 85b (VIOLET GROUP) へと変化した。 表 30
Figure imgf000064_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 28. 後代への形質の遺伝
藤色系パラ品種 「ラバンデ」 へ pSPB919 (図 8 ) を導入し得られ た形質転換体 （LA/919-2- 13) を花粉親に用い、 母親と して非組換 え体の WKS77あるいは WKS133を用いて交配 （鈴木省三， 「ばら、 花図 譜」 、 小学館， p. 256-260、 1990) を行った。 受粉後 100日 目に果実 を収穫した。 播種は、 まず果実を剥いて痩果を採取し、 さらに痩果 を剥いて胚を取り出した後、 シャーレ内の湿らせたろ紙上に置床し た。 播種時に使用する水は滅菌水に PPMTM (Plant Preservative Mi xture, PLANT CELL TECHNOLOGY, INC. ) を lml 、 カナマイシンを 5 Omg 添加したものを用い、 正常に発芽したもののみを鉢上げし、 育苗を行った。
得られた形質転換体後代のうち、 色素分析を行った 40個体全てで デルフィ二ジンの蓄積を確認した （表 31及び表 32) 。 デルフィニジ ン含有率は最高 99% (平均 46%) であった。
表 31 個体番号 Del含有率 Del Cya Peo
(%) (mg/g; (mg/g) (mg/g)
1 89.8 0.494 0.056 0.000 0.000
2 96.1 3.900 0.153 0.005 0.000
3 55.9 0.836 0.660 0.000 0.000
4 24.6 0.041 0.127 0.000 0.000
5 23.5 1.108 3.605 0.009 0.002
6 25.9 0.191 0.545 0.003 0.000
7 0.5 0.013 2.552 0.012 0.002
8 75.8 0.283 0.090 0.000 0.000
9 95.9 1.420 0.061 0.000 0.000
10 30.8 0.862 1.841 0.007 0.105
11 13.3 0.068 0.441 0.004 0.000
12 23.9 0.529 1.667 0.023 0.000
12 43.7 0.280 0.362 0.000 0.000
14 19.3 0.035 0.145 0.000 0.000
15 0.6 0.008 1.418 0.021 0.000
16 20.8 0.048 0.183 0.000 0.000
17 92.5 2.257 0.177 0.007 0.000
18 66.4 2.496 1.247 0.015 0.000
19 42.4 0.369 0.497 0.004 0.000
20 75.6 0.597 0.183 0.010 0.000
21 19.6 0.271 1.103 0.008 0.000
22 71.0 0.107 0.044 0.000 0.000
23 0.6 0.006 0.850 0.004 0.000 表 32
Figure imgf000066_0001
実施例 29. WKS140でのパンジー F3，5，H#40遺伝子とァイ リス DFR 遺伝子の発現とパラ内在性 DFR遺伝子の抑制
藤色系バラ品種 「WKS140」 へ PSPB919を導入し、 89個体の形質転 換体を得た。 色素分析を行った 79個体のうち 74個体でデルフィ二ジ ンの蓄積を確認した。 デルフィ二ジン含有率は最高 100% (平均 68 %) であった。 花色は RHSカラーチャート 186d (GREYED- PURPLE GRO UP) から主に 84c (VIOLET GROUP) へと変化した。 表 33
Figure imgf000067_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 30. WKS77でのパンジー F3'5，H#40遺伝子とァイ リス DFR遺 伝子の発現とパラ内在性 DFR遺伝子の抑制
濃赤紫系バラ品種 「WKS77」 へ pSPB919を導入し、 50個体の形質転 換体を得た。 色素分析を行った 23個体のうち 21個体でデルフィニジ ンの蓄積を確認した。 デルフィ二ジン含有率は最高 81% (平均 19% ) であった。 花色は RHSカラーチャー ト 57a (RED-PURPLE GROUP) か ら 77b (PURPLE GROUP) へ変ィ匕した。 表 34
Figure imgf000068_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 31. WKS77でのパンジー F 3，5，H# 40遺伝子とニーレンベル ギア DFR遺伝子の発現とパラ内在性 DFR遺伝子の抑制
濃赤紫系パラ 「WKS77」 へ pSPB920を導入し、 30個体の形質転換体 を得た。 色素分析を行った 27個体中、 26個体でデルフィ二ジンの蓄 積を確認した。 デルフィ二ジン含有率は最高 98% (平均 60%) であ つた。 花色は RHSカラーチャート 57a (RED-PURPLE GROUP) 力、ら 77 b (PURPLE GROUP) へ変ィ匕した。 表 35
Figure imgf000069_0001
実施例 32. WKS77でのパンジー F 3，5，H#40遺伝子とペチュニア DF R遺伝子の発現とバラ内在性 DFR遺伝子の抑制
濃赤紫系パラ 「WKS77」 へ pSPB921を導入し、 15個体の形質転換体 を得た。 色素分析を行った 13個体のう ち 12個体でデルフィ二ジンの 蓄積を確認した。 デルフィ二ジン含有率は最高 98% (平均 60%) で あった。 花色は RHSカラーチャー ト 57a (RED-PURPLE GROUP) 力、ら 72 (RED-PURPLE GROUP) へ変化した。
表 36
Figure imgf000070_0001
実施例 33. 後代への形質の遺伝
藤色系バラ品種 「ラバンデ」 へ pSPB919を導入し得られた形質転 換体 （LA/919-4- 10) を花粉親に用い、 母親と して非組換え体パラ の品種ブラックパカラを用いて実施例 28と同様に交配を行った。 受 粉後 100日 目に果実を収穫した。 播種は、 まず果実を剥いて痩果を 採取し、 さらに痩果を剥いて胚を取り出した後、 シャーレ内の湿ら せたろ紙上に置床した。 播種時に使用する水は滅菌水に PPMT M ( Pla nt Preservat ive Mixture , PLANT CELL TECHNOLOGY , INC. ) を lml/ 1、 カナマイシンを 50mg八添加したものを用い、 正常に発芽したも ののみを鉢上げし、 育苗を行った。
得られた形質転換体後代のうち、 色素分析を行った 18個体全てで デルフィ二ジンの蓄積を確認した。 デルフィ二ジン含有率は最高 99 . 8% (平均 98. 7 % ) であった。 表 37
Figure imgf000071_0001
実施例 34. WKS77でのパンジー F3'5'H#40遺伝子の発現とパラ内 在性 F3' H遺伝子の抑制
濃赤紫系パラ品種 「WKS77」 へ pSPB1106 (図 10) を導入し、 40個 体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 26個体全てでデルフィ二 ジンの蓄積を確認した。 デルフィ二ジン含有率は最高 80.0% (平均 30.5%) であった。 花色は RHSカラーチャート 57a (RED-PURPLE GRO UP) から 83d (VIOLET GROUP) へと大きく変化した。 表 38
Figure imgf000072_0001
na：分析 ·測定せず 実施例 35. Lavandeでのパンジー F3'5'H# 40遺伝子の発現とパラ 内在性 F3' H遺伝子の抑制
藤色系パラ品種 「Lavande」 へ pSPB1106を導入し、 40個体の形質 転換体を得た。 色素分析を行った 25個体のうち 23個体でデルフィ二 ジンの蓄積を確認した。 デルフィ二ジン含有率は最高 98.3% (平均 46.9%) であった。 表 39
Figure imgf000073_0001
na :分析 ·測定せず 以上は導入した外来遺伝子が後代へ伝達され、 かつその遺伝子が 後代において発現し、 本来パラ花弁では見られないディフィニジン を生成するという形質が後代のパラに伝わることを示している。 し たがって、 本遺伝子を用いて色の変化したパラを交配育種すること によって、 青や紫を含む新しい色のパラを作出できることを示して いる。 産業上の利用可能性
パラの内在性の代謝経路の働き、 例えばジヒ ドロフラボノール還 元酵素の発現、 を人為的に抑制し、 かつパンジー由来のフラボノィ ド 3 '，5 '—水酸化酵素をコー ドする遺伝子及びパラ以外の由来のジ ヒ ドロフラポノール還元酵素をコードする遺伝子を発現させること により、 青〜紫のパラを作出することが出来る。 また、 これらの遺 伝子は次の世代にも伝達され、 青いパラの形質は交配により利用さ れぅ ることもわかった。

Claims

1 . パラの内在性の代謝経路を人為的に抑制し、 かつパンジー由 来のフラボノィ ド 3 ' , 5 '—水酸化酵素をコー ドする遺伝子を発現さ せることを特徴とするパラの製造方法。 ，
2 . パラの内在性の代謝経路を人為的に抑制し、 かつパンジー由 言
来のフラボノィ ド 3 '，5 ' _水酸化酵素をコードする遺伝子及びジヒ ドロフラボノール還元酵素をコー ドする遺伝子を発現させることを 特徴とする請求項 1記載のパラの製造方法。
3 . パラの内在性のジヒ ドロフラボノール還元酵素の発現を人為 的に抑制し、 かつパンジー由来のフラボノ囲ィ ド 3 '，5 '—水酸化酵素 をコ一 ドする遺伝子及びパラ以外の由来のジヒ ドロフラボノール還 元酵素をコードする遺伝子を発現させることを特徴とする請求項 2 記載のパラの製造方法。
4 . パラの内在性のフラボノィ ド 3 '—水酸化酵素の発現を人為的 に抑制し、 かつパンジー由来のフラボノィ ド 3 '，5 '—水酸化酵素を コ一ドする遺伝子を発現させることを特徴とする請求項 1記載のパ ラの製造方法。
5 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の製造方法により得られる パラもしくはそれと同じ性質を有するその子孫またはそれらの組織
6 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の製造方法によ り得られた パラの花弁の色が、 紫、 青紫又は青であるパラもしく はそれと同じ 性質を有する子孫またはそれらの組織。
7 . パラの花弁の色が、 イギリス王立園芸協会カラーチャー ト （ RHSCC) のバイオレッ トグループ、 バイオレッ ト一ブルーグループ またはブルーグループに属するものであり、 請求項 6記載のパラも しくはそれと同じ性質を有する子孫またはそれらの組織。
8 . パラの花弁の色が、 イギリス王立園芸協会カラーチャート （ RHSCC) のバイオレツ トグループの 8 5 aまたは 8 5 bに属するも のである、 請求項 7記載のパラもしくはそれと同じ性質を有する子 孫またはそれらの組織。
PCT/JP2004/011958 2003-08-13 2004-08-13 花色が変更されたバラの製造方法 WO2005017147A1 (ja)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT04771919T ATE527348T1 (de) 2003-08-13 2004-08-13 Verfahren zur erzeugung einer rose mit veränderter farbe
KR1020067003032A KR101100930B1 (ko) 2003-08-13 2004-08-13 꽃의 색상이 변경된 장미의 제조 방법
AU2004264488A AU2004264488B2 (en) 2003-08-13 2004-08-13 Process for producing rose with modified color
US10/567,931 US8410335B2 (en) 2003-08-13 2004-08-13 Method for producing rose with altered petal colors
EP04771919A EP1652916B1 (en) 2003-08-13 2004-08-13 Process for producing rose with modified color
CN2004800230883A CN1836039B (zh) 2003-08-13 2004-08-13 改变了花色的蔷薇的制造方法
CA2537065A CA2537065C (en) 2003-08-13 2004-08-13 Method for producing rose with altered petal colors
JP2005513219A JP4690197B2 (ja) 2003-08-13 2004-08-13 花色が変更されたバラの製造方法
IL173603A IL173603A (en) 2003-08-13 2006-02-08 Process for producing a rose with a modified color

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-293121 2003-08-13
JP2003293121 2003-08-13
JP2004192034 2004-06-29
JP2004-192034 2004-06-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005017147A1 true WO2005017147A1 (ja) 2005-02-24

Family

ID=34197144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/011958 WO2005017147A1 (ja) 2003-08-13 2004-08-13 花色が変更されたバラの製造方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8410335B2 (ja)
EP (1) EP1652916B1 (ja)
JP (1) JP4690197B2 (ja)
KR (1) KR101100930B1 (ja)
CN (1) CN1836039B (ja)
AT (1) ATE527348T1 (ja)
AU (1) AU2004264488B2 (ja)
CA (1) CA2537065C (ja)
IL (1) IL173603A (ja)
SG (1) SG146636A1 (ja)
WO (1) WO2005017147A1 (ja)

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002201372A (ja) * 2000-09-29 2002-07-19 Suntory Ltd 植物色素化合物及びその利用
WO2008120820A1 (ja) 2007-03-29 2008-10-09 International Flower Developments Proprietary Limited 表層キメラ形質転換植物の作出方法
WO2008136434A1 (ja) 2007-04-26 2008-11-13 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. 花色を改変したコチョウランの製造方法
WO2008156206A1 (ja) * 2007-06-20 2008-12-24 International Flower Developments Proprietary Limited フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法
WO2008156214A1 (ja) * 2007-06-20 2008-12-24 International Flower Developments Proprietary Limited フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法
WO2009062253A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 International Flower Developments Pty Ltd Genetically modified chrysanthemums
US7750209B2 (en) 2003-12-17 2010-07-06 International Flower Developments Proprietary Limited Method for producing yellow flower by controlling flavonoid synthetic pathway
EP2213739A1 (en) 2006-02-17 2010-08-04 International Flower Developments Proprietary LTD. Flavonoid glucosyltransferase and use of same
WO2010110382A1 (ja) 2009-03-27 2010-09-30 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 青いバラに含まれる新規化合物
WO2010122850A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
WO2010122849A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 デルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
WO2010122848A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 花弁で機能するシソ由来のプロモーター
WO2011001777A1 (ja) 2009-06-30 2011-01-06 サントリーホールディングス株式会社 花の色を薄く又は濃くする方法
JP2011502523A (ja) * 2007-11-15 2011-01-27 インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド 変更された花部を有する遺伝子改変植物
US8053634B2 (en) 2004-10-29 2011-11-08 Suntory Holdings Limited Stabilization and blueing of anthocyanin pigments using gene encoding aromatic acyltransferase capable of transferring an aromatic acyl group to the 3′-position of anthocyanin
WO2012023583A1 (ja) 2010-08-19 2012-02-23 サントリーホールディングス株式会社 フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素及びその用途
WO2012036290A1 (ja) 2010-09-17 2012-03-22 サントリーホールディングス株式会社 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法
JP2012511916A (ja) * 2008-12-19 2012-05-31 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 変更された花部を有する植物
WO2012096307A1 (ja) 2011-01-14 2012-07-19 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
US8440879B2 (en) 2007-03-15 2013-05-14 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Flavonoid-3′,5′-hydroxylase gene of commelina communis
WO2013108794A1 (ja) 2012-01-17 2013-07-25 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
WO2013125530A1 (ja) 2012-02-24 2013-08-29 サントリーホールディングス株式会社 花弁で機能するトレニア由来のプロモーター
WO2013157502A1 (ja) 2012-04-16 2013-10-24 サントリーホールディングス株式会社 新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子及びその使用
US8629258B2 (en) 2006-06-01 2014-01-14 Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patientenzorg Plant nucleic acids associated with cellular pH and uses thereof
JP7194741B2 (ja) 2018-01-31 2022-12-22 天津大学 グルタミンからインジゴイジンへの合成を触媒して青い花を得る遺伝子組み換え方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1836039B (zh) 2003-08-13 2010-05-26 国际花卉开发有限公司 改变了花色的蔷薇的制造方法
US20140201865A1 (en) * 2012-07-20 2014-07-17 University Of Dubuque Methods for Expanding Color Palette in Dendrobium Orchids
US20160201070A1 (en) * 2012-07-20 2016-07-14 University Of Dubuque Method for Expanding Color Palette in Dendrobium Orchids
CN105349553B (zh) * 2015-12-17 2018-09-07 海南大学 一种花色调节基因VwMYB29及其应用
KR102010831B1 (ko) 2017-09-29 2019-08-16 대한민국 화훼식물의 암술머리 밑 색 및 화형 변형 기능 클레마티스 유래 신규 유전자 및 이의 용도
KR102010833B1 (ko) 2017-11-08 2019-08-16 대한민국 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심 색 변형 기능 매발톱꽃 유래 신규 유전자 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08511683A (ja) * 1993-05-20 1996-12-10 インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミティド トランスジェニック顕花植物
JP3403196B2 (ja) * 1992-03-02 2003-05-06 協和醗酵工業株式会社 新規植物遺伝子

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0536327A1 (en) 1990-06-25 1993-04-14 Florigene Europe B.V. Rose plants and methods for their production and genetic transformation
US5480789A (en) 1991-04-01 1996-01-02 Florigene Europe B.V. Genetically transformed rose plants and methods for their production
PL170326B1 (pl) 1991-07-11 1996-11-29 Int Flower Dev Pty Ltd S posób wytwarzania rosliny transgenicznej PL
US5948955A (en) * 1991-07-13 1999-09-07 International Flower Developments Pty Ltd Transgenic plants having altered anthocyann levels
US20010007157A1 (en) 1993-11-18 2001-07-05 Ebrahim Firoozabady Genetically transformed rose plants and methods for their production
US5568832A (en) * 1994-10-18 1996-10-29 Eddy; Zonell Skylight shade
JPH0970290A (ja) 1995-02-17 1997-03-18 Suntory Ltd アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
AUPN298895A0 (en) 1995-05-16 1995-06-08 International Flower Developments Pty Ltd Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same
AUPN838696A0 (en) 1996-03-01 1996-03-21 Florigene Limited Genetic sequences encoding flavonoid pathway enzymes and uses therefor
JP4532682B2 (ja) 2000-06-29 2010-08-25 株式会社日本総合研究所 異なる光源下におけるカラー画像データの変換方法，装置およびカラー画像データ変換のためのプログラムを記録した媒体
JP4877695B2 (ja) 2000-09-29 2012-02-15 サントリーホールディングス株式会社 植物色素化合物及びその利用
AUPS017402A0 (en) * 2002-01-25 2002-02-14 International Flower Developments Pty Ltd Genetic sequences and uses therefor
WO2004020637A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 International Flower Developments Pty. Ltd. Flavonoid 3',5'hydroxylase gene sequences and uses therefor
CN1836039B (zh) 2003-08-13 2010-05-26 国际花卉开发有限公司 改变了花色的蔷薇的制造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3403196B2 (ja) * 1992-03-02 2003-05-06 協和醗酵工業株式会社 新規植物遺伝子
JPH08511683A (ja) * 1993-05-20 1996-12-10 インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミティド トランスジェニック顕花植物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FORKMAN, G ET AL: "METABOLIC ENGINEERING AND APPLICATIONS OF FLAVONOIDS", CURR OPIN BIOTECHNOL., vol. 12, no. 2, April 2001 (2001-04-01), pages 155 - 160, XP001094351 *
MOL, J ET AL: "NOVEL COLOURED FLOWERS", CURR OPIN BIOTECHNOL., vol. 10, no. 2, April 1999 (1999-04-01), pages 198 - 201, XP002981774 *

Cited By (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002201372A (ja) * 2000-09-29 2002-07-19 Suntory Ltd 植物色素化合物及びその利用
US8350125B2 (en) 2003-12-17 2013-01-08 Suntory Holdings Limited Method for producing yellow flower by controlling flavonoid synthetic pathway
US7750209B2 (en) 2003-12-17 2010-07-06 International Flower Developments Proprietary Limited Method for producing yellow flower by controlling flavonoid synthetic pathway
US8053634B2 (en) 2004-10-29 2011-11-08 Suntory Holdings Limited Stabilization and blueing of anthocyanin pigments using gene encoding aromatic acyltransferase capable of transferring an aromatic acyl group to the 3′-position of anthocyanin
EP2213739A1 (en) 2006-02-17 2010-08-04 International Flower Developments Proprietary LTD. Flavonoid glucosyltransferase and use of same
US8629258B2 (en) 2006-06-01 2014-01-14 Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patientenzorg Plant nucleic acids associated with cellular pH and uses thereof
US8440879B2 (en) 2007-03-15 2013-05-14 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Flavonoid-3′,5′-hydroxylase gene of commelina communis
JPWO2008120820A1 (ja) * 2007-03-29 2010-07-15 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 表層キメラ形質転換植物の作出方法
JP4624478B2 (ja) * 2007-03-29 2011-02-02 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 表層キメラ形質転換植物の作出方法
WO2008120820A1 (ja) 2007-03-29 2008-10-09 International Flower Developments Proprietary Limited 表層キメラ形質転換植物の作出方法
JP2010200754A (ja) * 2007-03-29 2010-09-16 Internatl Flower Dev Pty Ltd 表層キメラ形質転換植物の作出方法
US8183434B2 (en) 2007-03-29 2012-05-22 Suntory Holdings Limited Method for producing transgenic surface layer chimeric plant
AU2008233555B2 (en) * 2007-03-29 2013-10-17 Suntory Holdings Limited Method for producing transgenic surface chimeric plant
WO2008136434A1 (ja) 2007-04-26 2008-11-13 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. 花色を改変したコチョウランの製造方法
US8476490B2 (en) 2007-04-26 2013-07-02 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Method for production of moth orchid having modified flower color
WO2008156214A1 (ja) * 2007-06-20 2008-12-24 International Flower Developments Proprietary Limited フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法
JPWO2008156206A1 (ja) * 2007-06-20 2010-08-26 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法
KR101168421B1 (ko) 2007-06-20 2012-07-25 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 플라본 및 말비딘을 함유하는 장미 및 그 생산 방법
WO2008156206A1 (ja) * 2007-06-20 2008-12-24 International Flower Developments Proprietary Limited フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法
WO2009062253A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 International Flower Developments Pty Ltd Genetically modified chrysanthemums
JP2011502523A (ja) * 2007-11-15 2011-01-27 インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド 変更された花部を有する遺伝子改変植物
JP2012511916A (ja) * 2008-12-19 2012-05-31 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 変更された花部を有する植物
KR20120018741A (ko) 2009-03-27 2012-03-05 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 파란 장미에 함유되는 신규 화합물
US9057076B2 (en) 2009-03-27 2015-06-16 Suntory Holdings Limited Compounds purified from blue roses
EP2947083A1 (en) 2009-03-27 2015-11-25 Suntory Holdings Limited Novel compound contained in blue rose
US20120011771A1 (en) * 2009-03-27 2012-01-19 Suntory Holdings Limited Novel compound contained in blue rose
WO2010110382A1 (ja) 2009-03-27 2010-09-30 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 青いバラに含まれる新規化合物
JP2013014589A (ja) * 2009-03-27 2013-01-24 Internatl Flower Dev Pty Ltd 青いバラに含まれる新規化合物
EP2412715A4 (en) * 2009-03-27 2012-09-26 Suntory Holdings Ltd NEW CONNECTION IN BLUE ROSES
JP5099653B2 (ja) * 2009-03-27 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 青いバラに含まれる新規化合物
JP2014210786A (ja) * 2009-03-27 2014-11-13 サントリーホールディングス株式会社 青いバラに含まれる新規化合物
WO2010122848A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 花弁で機能するシソ由来のプロモーター
US8871998B2 (en) 2009-04-24 2014-10-28 Suntory Holdings Limited Method for producing chrysanthemum plant having petals containing modified anthocyanin
EP2602324A1 (en) 2009-04-24 2013-06-12 Suntory Holdings Limited Method for production of chrysanthemum plant having petals containing modified anthocyanin
CN102421904A (zh) * 2009-04-24 2012-04-18 三得利控股株式会社 生产花瓣中含有经过修饰的花色素苷的菊花植物的方法
WO2010122850A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
US9074215B2 (en) 2009-04-24 2015-07-07 Incorporated Adminstrative Agency, National Agriculture and Food Research Organization Method for production of chrysanthemum plant having delphinidin-containing petals
KR101318414B1 (ko) 2009-04-24 2013-10-16 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 수식된 안토시아닌을 꽃잎에 함유하는 국화 식물을 생산하는 방법
WO2010122849A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 デルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
US8658779B2 (en) 2009-04-24 2014-02-25 Suntory Holdings Limited Perilla-derived promoter functioning in petals
JP5553317B2 (ja) * 2009-04-24 2014-07-16 サントリーホールディングス株式会社 花弁で機能するシソ由来のプロモーター
CN102421904B (zh) * 2009-04-24 2014-09-17 三得利控股株式会社 生产花瓣中含有经过修饰的花色素苷的菊花植物的方法
WO2011001777A1 (ja) 2009-06-30 2011-01-06 サントリーホールディングス株式会社 花の色を薄く又は濃くする方法
WO2012023583A1 (ja) 2010-08-19 2012-02-23 サントリーホールディングス株式会社 フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素及びその用途
WO2012036290A1 (ja) 2010-09-17 2012-03-22 サントリーホールディングス株式会社 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法
JP5945747B2 (ja) * 2010-09-17 2016-07-05 サントリーホールディングス株式会社 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法
RU2590722C2 (ru) * 2010-09-17 2016-07-10 Сантори Холдингз Лимитед Способ получения лилий, содержащих в лепестках делфинидин
WO2012096307A1 (ja) 2011-01-14 2012-07-19 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
US9365836B2 (en) 2011-01-14 2016-06-14 Suntory Holdings Limited Glycosyltransferase gene and use thereof
KR20140116394A (ko) 2012-01-17 2014-10-02 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 신규 당 전이 효소 유전자 및 그의 사용
WO2013108794A1 (ja) 2012-01-17 2013-07-25 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
US10059956B2 (en) 2012-01-17 2018-08-28 Suntory Holdings Limited Glycosyltransferase gene and use thereof
WO2013125530A1 (ja) 2012-02-24 2013-08-29 サントリーホールディングス株式会社 花弁で機能するトレニア由来のプロモーター
EP2818548A4 (en) * 2012-02-24 2015-07-29 Suntory Holdings Ltd PROMOTER FROM TORENIA WITH EFFECT IN FLOWER LEAVES
EP3054011A1 (en) 2012-02-24 2016-08-10 Suntory Holdings Limited Torenia-originated promoter capable of acting in petals
WO2013157502A1 (ja) 2012-04-16 2013-10-24 サントリーホールディングス株式会社 新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子及びその使用
JP7194741B2 (ja) 2018-01-31 2022-12-22 天津大学 グルタミンからインジゴイジンへの合成を触媒して青い花を得る遺伝子組み換え方法

Also Published As

Publication number Publication date
SG146636A1 (en) 2008-10-30
AU2004264488A1 (en) 2005-02-24
US8410335B2 (en) 2013-04-02
CA2537065A1 (en) 2005-02-24
AU2004264488B2 (en) 2008-10-02
JPWO2005017147A1 (ja) 2006-10-12
EP1652916A1 (en) 2006-05-03
KR101100930B1 (ko) 2012-01-02
CA2537065C (en) 2013-05-21
EP1652916A4 (en) 2009-06-03
ATE527348T1 (de) 2011-10-15
IL173603A (en) 2011-07-31
EP1652916B1 (en) 2011-10-05
US20110126320A1 (en) 2011-05-26
IL173603A0 (en) 2006-07-05
JP4690197B2 (ja) 2011-06-01
CN1836039B (zh) 2010-05-26
KR20060081400A (ko) 2006-07-12
CN1836039A (zh) 2006-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005017147A1 (ja) 花色が変更されたバラの製造方法
Katsumoto et al. Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin
EP2423312B1 (en) Method for production of chrysanthemum plant having delphinidin-containing petals
JP6782450B2 (ja) 青系花色を有するキクの作出方法
US8871998B2 (en) Method for producing chrysanthemum plant having petals containing modified anthocyanin
JP5072828B2 (ja) 液胞のｐＨと関連する植物遺伝子配列およびその使用
JPWO2007094521A1 (ja) フラボノイド糖転移酵素及びその利用
JPH11510372A (ja) 子房組織転写因子の用途
Hou et al. Virus-induced gene silencing (vigs) for functional analysis of genes involved in the regulation of anthocyanin biosynthesis in the perianth of phalaenopsis-type dendrobium hybrids
Yu et al. Functional Analysis of Genes GlaDFR1 and GlaDFR2 Encoding Dihydroflavonol 4-Reductase (DFR) in Gentiana lutea L. Var. Aurantiaca (M. Laínz) M. Laínz
JP5945747B2 (ja) 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法
JP5477619B2 (ja) デルフィニウム（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍｓｐｐ．）から単離された配糖体化酵素とその利用
MXPA06001621A (es) Proceso para producir rosas con color modificado
Yu et al. Research Article Functional Analysis of Genes GlaDFR1 and GlaDFR2 Encoding Dihydroflavonol 4-Reductase (DFR) in Gentiana lutea L. Var. Aurantiaca (M. Laínz) M. Laínz
ES2370175T3 (es) Proceso para la producción de una rosa con color modificado.
KR101386190B1 (ko) 꽃잎에서 기능하는 차조기 유래의 프로모터
Povero VU Research Portal

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200480023088.3

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005513219

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004264488

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2537065

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 173603

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: PA/a/2006/001621

Country of ref document: MX

Ref document number: KE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020067003032

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004771919

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2004264488

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20040813

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004264488

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 06024513

Country of ref document: CO

Ref document number: 1200600375

Country of ref document: VN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1372/DELNP/2006

Country of ref document: IN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004771919

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020067003032

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10567931

Country of ref document: US