WO2011001777A1 - 花の色を薄く又は濃くする方法 - Google Patents

花の色を薄く又は濃くする方法 Download PDF

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seq
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anthocyanin content
reducing
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滋 飯田
裕将 森田
敦 星野
田中　良和
正子 水谷
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サントリーホールディングス株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis

Definitions

  • the present invention is a method for changing the anthocyanin content in the petal of a plant by controlling the expression of type IV chalcone isomerase (Type IV Chalcone I Isomerase), more specifically, to lighten or darken the flower color of the plant.
  • the present invention relates to a method for reducing the anthocyanin content in a petal of a plant by suppressing the expression of type IV chalcone isomerase to lighten the color of the flower of the plant, and a novel gene useful for these methods.
  • Methods for modifying plant traits including flower color include (i) crossing, (ii) mutation, and (iii) gene recombination.
  • crossing As a method of lightening or whitening flowers by genetic recombination, the genes of enzymes involved in the biosynthesis of anthocyanins that are flower pigments in Petunia, Torenia, roses, chrysanthemum, carnations, etc. It is realized by suppressing some expression by antisense method, sense method (cosuppression method), RNAi method and the like.
  • Chalcone isomerase is one of the enzymes involved in the biosynthesis of anthocyanins, and catalyzes a reaction for isomerizing chalcone to flavanone.
  • a typical chalcone is 2 ', 4,4', 6'-tetrahydroxychalcone, and chalcone isomerase catalyzes the reaction of isomerizing it to naringenin.
  • Chalcone isomerase that catalyzes this reaction is called type I chalcone isomerase (see Non-Patent Document 1 below).
  • legumes have a chalcone isomerase that catalyzes the isomerization of 6′-deoxychalcone to 5-deoxyflavanone, and this chalcone isomerase is called type II chalcone isomerase.
  • type II chalcone isomerase The amino acid identity between these chalcone isomerases is 55-90% for L. japonicum.
  • Proteins showing homology to the amino acid sequence of chalcone isomerase are known in addition to the above types I and II. There are also groups classified as type III and type IV based on the molecular phylogenetic tree based on amino acid sequences. Since both type III chalcone isomerase and type IV chalcone isomerase do not have a catalytic activity center of type I chalcone isomerase, it is considered that there is no activity as chalcone isomerase (see Non-Patent Document 1). As type IV chalcone isomerase, it is known that the protein encoded by AT5G05270 of Arabidopsis shows weak identity, but its function is unknown.
  • type IV chalcone isomerase is involved in the synthesis of anthocyanins, and no examples of changing the color of flowers using the gene of type IV chalcone isomerase have been reported yet.
  • enzymes involved in the synthesis of anthocyanins have been proposed to form supramolecular structures due to protein-protein interactions.
  • Type IV chalcone isomerase is involved in such interactions. Is also not known.
  • the morning glory (Ipomoea nil) is one of the popular horticultural plants in Japan, and has been improved since the Edo period.
  • the mutagen of mutable morning glory is known to be a Tpn1-related DNA transposon.
  • Tpn1 when Tpn1 is inserted into a structural gene such as chalcone synthase or chalcone isomerase (isomerase), anthocyanin synthesis is inhibited and the flower color becomes white.
  • Tpn1 Dilute, Intense, Light, Tinged, Fainted, etc. are known as loci related to flower color shades, but these genes have not yet been identified and used industrially.
  • morning glory is known to produce anthocyanins with complex structures.
  • the most complex anthocyanin is called Heavenly Blue Anthocyanin, which has 6 glucose and 3 caffeic acids attached to peonidin.
  • the Heavenly Blue anthocyanin without the 3 'methoxy group on the B ring is called a wedding bell anthocyanin.
  • the biosynthetic pathway of these anthocyanins has not been fully elucidated, but the anthocyanins that are their precursors, that is, anthocyanins with a low number of bound glucose and caffeic acid are contained in the morning glory petals.
  • the high-speed liquid is used for the type and content of the morning glory varieties Chidori that blooms red flowers, and the dull zigzag anthocyanin that is an easy-to-change mutant color that appears by spontaneous mutation.
  • Analyzed by chromatography Prior to analysis by HPLC, anthocyanins were extracted from flowered petal enlargements with 95% MeOH / 5% acetic acid. The amount of anthocyanins in the mutants decreased compared to the varieties Chidori, but the types of anthocyanins contained in the petals, including wedding bell anthocyanins, did not change between the varieties Chidori and the mutants. This suggests that the reason why the flower color in the mutant of the morning glory varieties of staggered birds is not due to the mutation of the enzyme involved in the biosynthesis of anthocyanins.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a new method for changing the color of a flower to light or dark.
  • the present inventors predicted that the genetic difference between the staggered line that produces red flowers and the dull staggered line that produces pink flowers is due to the transposon inserted in the causative gene, and the transposon display method was used.
  • a region near the transposon was amplified to obtain a DNA fragment that specifically increased to the dull staggered line. Since such a DNA fragment did not encode a protein, a nearby genomic region was isolated from a red staggered line using inverse PCR. The resulting genomic region was found to show homology with chalcone isomerases classified as type IV isolated from soybean.
  • the present invention is as follows. [1] A method of changing the anthocyanin content in a petal of a plant to lighten or darken the color of the plant flower, comprising the step of controlling the expression of type IV chalcone isomerase. [2] A method for reducing the color of the flower of the plant by reducing the anthocyanin content in the petal of the plant, comprising the step of suppressing the expression of type IV chalcone isomerase.
  • the anthocyanin content in the petal of a plant can be changed to make the color of the plant flower lighter or darker.
  • the base sequence of a 254 bp DNA fragment which specifically increases in the morning glory dwarf staggered line is shown.
  • the RT-PCR analysis results regarding the spatial expression of the morning glory CHI-B gene are shown.
  • the northern blot analysis result of the transcriptional product of CHI-B gene accompanying the developmental stage of a morning glory petal is shown.
  • petunia cultivar Safinia Purple Mini (Suntory Flowers, Inc.)
  • the petal flower color of the line in which the amount of the transcript of the PtCHI-B gene has decreased has been reduced.
  • Torenia cultivar Summer Wave Blue (Suntory Flowers, Inc.)
  • the petal flower color of the line in which the amount of the transcription product of TrCHI-B2 or TrCHI-B11 gene has decreased is lightened.
  • type IV chalcone isomerase As described above, the function of type IV chalcone isomerase was unknown. It is also unclear whether type IV chalcone isomerase is involved in the synthesis of anthocyanins, and there was no example of changing the color of flowers using the gene of type IV chalcone isomerase. In addition, several enzymes involved in the synthesis of anthocyanins have been proposed to form supramolecular structures due to protein-protein interactions. Type IV chalcone isomerase is involved in such interactions. Was also not known.
  • the present invention is based, in part, on the discovery that when the expression of type IV chalcone isomerase is suppressed, the anthocyanin content in the morning glory petals decreases and the color of the flower becomes lighter.
  • both type IV chalcone isomerases do not have the catalytic activity center of type I chalcone isomerase, they are considered to have no activity as chalcone isomerase.
  • type IV chalcone isomerase is responsible for the formation of supramolecular structures formed by the interaction between multiple enzymes involved in the synthesis of anthocyanins. Involved, it is estimated that it indirectly influences the content of atocyanin in petals.
  • One aspect of the present invention is a method of changing the anthocyanin content in a petal of a plant to lighten or darken the flower color of the plant, comprising the step of controlling the expression of type IV chalcone isomerase. It is.
  • the present invention provides a method for reducing the color of a plant flower by reducing the anthocyanin content in the petal of the plant, comprising the step of suppressing the expression of type IV chalcone isomerase.
  • “Type IV chalcone isomerase” refers to a chalcone isomerase classified as type IV according to the description of Non-Patent Document 1.
  • inventions include the following (a) to (d): (A) DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25; (B) A function similar to that of DNA consisting of a base sequence of SEQ ID NO: 25, comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence of SEQ ID NO: 25, and having an anthocyanin content reduction effect DNA having: (C) a DNA that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 25 and has the same function as the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 25 with respect to the effect of reducing the anthocyanin content; (D) a DNA having at least 90% sequence identity with the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 25 and having the same function as the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 25 with respect to the effect of reducing the anthocyanin content; A method for reducing the color of petun
  • the term “one or several” in the DNA of (b) means that the base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 has a function similar to that of the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 with respect to the effect of reducing the anthocyanin content It means that 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, may be deleted, substituted or added. Further, “deletion”, “substitution”, and “addition” refer to those that give rise to a base sequence that encodes a protein having the same properties as the protein encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 25 (SEQ ID NO: 26). .
  • the “stringent conditions” in the DNA of (c) above are the temperature at the time of hybridization, preferably further at the time of washing, depending on the DNA hybridized to the complementary strand of DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25. Although it is set by appropriately determining the salt concentration, stringent conditions, e.g., Zanburuku (Sambrook) et al., eds., "Molecular cloning: a Laboratory manual 2nd Edition (Molecular cloning: a Laboratory manual 2 nd Ed .) ”[(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] etc. Specifically, for example, (i) 6 ⁇ SSC (composition of 1 ⁇ SSC: 0.15 M NaCl, 0.
  • Tm 81.5 + 16.6 (log [Na +]) + 0.41 (% G + C) - (600 / N) ( where, N is the The length of the oligonucleotide is determined by:% G + C is the content of guanine and cytosine residues in the oligonucleotide.)
  • the hybridization operation may be performed with reference to the above-mentioned document. The operations described in this specification can be appropriately performed by referring to the book.
  • the DNA capable of hybridizing is at least 60% or more, preferably 70% or more, more preferably more than the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 when calculated using analysis software such as BLAST and FASTA. May be DNA having identity of 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 97% or more.
  • (D) is a DNA having at least 90% sequence identity with the DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 25 and having the same function as the DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 25 with respect to the effect of reducing the anthocyanin content Is stipulated.
  • the suppression of the expression of the gene may be any of an antisense method, a sense method (cosuppression method), an RNAi method, and the like, but the RNAi method is preferable.
  • the petunia obtained by the above-mentioned method or progeny having the same properties as the petunia with respect to the effect of reducing the anthocyanin content, or their tissue, part, particularly a part including a petal, is also within the scope of the present invention.
  • DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 used in the above method is within the scope of the present invention.
  • inventions include the following (a) to (d):
  • C The same function as that of DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 or 31 with respect to the effect of lowering the anthocyanin content with respect to the complementary strand of the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 or 31 under stringent conditions DNA having: (D) having at least 90% sequence identity with the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 or 31, and having the same function as the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 or 31 with respect to the
  • Still another embodiment of the present invention provides the following (a) to (d): (A) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10; (B) A function similar to that of DNA consisting of a base sequence of SEQ ID NO: 10 with a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence of SEQ ID NO: 10 and having an anthocyanin content reduction effect DNA having: (C) a DNA that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 and has the same function as the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 with respect to the effect of reducing the anthocyanin content; (D) a DNA having at least 90% sequence identity with the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 and having the same function as the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 with respect to the effect of reducing the anthocyanin content; A method for reducing the color of the morning glory flower by
  • DNAs comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 29, 31, and 10 used in the above method are within the scope of the present invention.
  • EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not intended to be limited thereto.
  • Example 1 Acquisition of a morning glory DNA fragment
  • the present inventors presumed that the genetic difference between the staggered line that blooms red flowers and the dull staggered line that blooms pink flowers is due to the transposon inserted into the causative gene. . Therefore, the transposon display method (see Fukada-Tanaka et al. Plant Biotech. 18, 143-149. 2001) was used to amplify the region near the transposon, and the 259 bp DNA fragment that was specifically increased in the dull staggered lineage. Obtained (see SEQ ID NO: 1, FIG. 1).
  • TaqI adapters (5′-GCGGATGAGTCCTGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 2) and 5′-CGCTCAGGACTCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 3)) were bound to genomic DNA digested with the restriction enzyme TaqI, Two primers, TaqI-C (5′-GAGGATGAGTCCTGAGCGAC-3 ′ SEQ ID NO: 4) and TIR-T (5′-TGTGCATTTTTCTTGTAGTGT-3 ′ SEQ ID NO: 5) were used. Since the DNA fragment obtained by the transposon display method did not encode a protein, the nearby genomic region was isolated from the red staggered line using the inverse PCR method.
  • genomic DNA digested with the restriction enzyme TaqI was circularized using T4 DNA ligase, and PCR was performed using primers designed for the DNA fragment obtained by the transposon display method.
  • IPCR-A1 5'-ATTCATGTCTAAAATGTGACACC-3 'SEQ ID NO: 6
  • IPCR-B1 5'-TCAATTTCAGACGAGAAAACTC-3' SEQ ID NO: 7
  • primers -A2 5'-TGACACCCTGGCTAGTTCAG-3 'SEQ ID NO: 8
  • IPCR-B2 5'-GAAAACTCATAACTACTACTCC-3' SEQ ID NO: 9 were used.
  • the 1.1 kb DNA region obtained by the inverse PCR method showed homology with chalcone isomerase (AY595417) (see Non-Patent Document 1) classified into type IV isolated from soybean.
  • Example 2 Screening of genes The above obtained by inverse PCR from a database of an EST library created using RNA extracted from buds and seedlings of wild-type Asagao strain TKS in the National BioResource Project (NBRP) A cDNA corresponding to a 1.1 kb DNA region was isolated and this gene was named CHI-B.
  • the sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence encoded by this sequence (SEQ ID NO: 11) showed 59% and 56% identity to the aforementioned Arabidopsis AT5G05270 and soybean AY595417, respectively.
  • the tissue specificity of this gene expression was examined by RT-PCR.
  • FIG. 2 shows the results of PCR using CHI-B LA-F2 (5′-AGTTCTTCTTGCAGGCTGCAGAC-3 ′ SEQ ID NO: 12) and CHI-B R1 (5′-ACTCCATAGGATCACCAAACTCTC-3 ′ SEQ ID NO: 13) as primers. .
  • FIG. 2 shows that the CHI-B gene is specifically expressed in the petals.
  • CHI-A and CHI-C represent genes encoding type I chalcone isomerase and type III chalcone isomerase, respectively. Further, when the transcript of the CHI-B gene accompanying the petal development stage was examined by Northern analysis, it was found that it was most strongly expressed 12 hours before flowering as shown in FIG. CHI-B gene expression was not observed in the petals of flowers in which the transcription factor c-1 or ca was mutated. These results suggest that CHI-B plays some role in the synthesis of anthocyanins.
  • CHIB-F1 (5'-GGMATHACMGAYGTMGARABHCAYTTY-3 'SEQ ID NO: 14)
  • CHIB-F2 (5'-TMWSMYTMHTMGGMCAMGGMATHAC-3 'SEQ ID NO: 15)
  • CHI-B R1 (5'-CCYTTDATYTCYTMDATMACMAC-3 'SEQ ID NO: 16)
  • CHI-B R2 (5'-TCYTCYTCYTCYTCRTAYTTKTC-3 'SEQ ID NO: 17)
  • CHI-B R3 (5'-TTYTTRAARTAYTTMSWYTGRAA-3 'SEQ ID NO: 18)
  • pSPB3387 has a CHI-B partial cDNA inserted therein.
  • the 5 'and 3' sequences of the above DNA fragment were amplified using GeneGRacer (Invitrogen) according to the manufacturer's recommended protocol. That is, the sequence on the 5 'side is the first PCR using GeneRacer 5' primer (5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 'SEQ ID NO: 19) and PtCHIB-R1 primer (5'-CTCTTACAGCACTCTCTAGC-3' using petal cDNA as a template. SEQ ID NO: 20).
  • a second PCR was performed using GeneRacer 5 'nested primer (5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3' SEQ ID NO: 21) and PtCHIB-RI primer. This DNA band was ligated to pCR2.1TOPO to obtain pSPB3401.
  • the first PCR was performed using the petal cDNA as a template, GeneRacer 3 ′ primer (5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3 ′ SEQ ID NO: 22) and PtCHIB-F1 primer (5′-CATTGAGATACACTTTCTCC-3 ′ SEQ ID NO: 23 ).
  • the second PCR was performed using GeneRacer 3 ′ nested primer (5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3 ′ SEQ ID NO: 24) and PtCHIB-F1 primer.
  • PSPB3402 was obtained by ligating this DNA band to pCR2.1TOPO.
  • Plasmid pSPB3400 containing the full length (SEQ ID NO: 25) of petunia CHI-B classified as chalcone isomerase type IV by ligating the DNA fragment obtained by digesting pSPB3401 with BamHI to pSPB3402 obtained by digesting with BamHI Got.
  • the amino acid sequence encoded by this sequence (SEQ ID NO: 26) showed 74%, 56%, and 58% identity to the morning glory CHI-B, Arabidopsis AT5G05270, and soybean AY595417, respectively.
  • Example 4 Acquisition and functional analysis of torenia homologues Torenia homologues were obtained in the same manner as in Example 3. RNA was extracted from the petals of buds of Torenia cultivar Summer Wave Blue (Suntory Flowers). CDNA was synthesized using this as a template, and PCR was performed using primers CHIB-F2 and CHI-BR2. The obtained DNA fragment was cloned into pCRTOPO and designated pSPB3388. Using this, a Torenia cDNA library (described in Molecular Breeding 6, 239-246 2000) was screened, and TrCHI-B2 (SEQ ID NO: 29) and TrCHI were encoded as genes encoding proteins classified as type IV chalcone isomerase.
  • SEQ ID NO: 31 The amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 29 (SEQ ID NO: 30) is 67%, 70%, 58%, and 57% for Asagao CHI-B, Petunia CHI-B, Arabidopsis AT5G05270, and soybean AY595417, respectively. Showed identity.
  • the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 31 (SEQ ID NO: 32) is 65%, 70%, 94% for Asagao CHI-B, Petunia CHI-B, TrCHI-B2, Arabidopsis AT5G05270, and soybean AY595417, respectively. It showed 58% and 57% identity.
  • the fragment was ligated to obtain pSPB3403.
  • a DNA fragment obtained by digesting this plasmid with HindIII and EcoRI was cloned into HindIII and EcoRI of pBin +.
  • This binary vector pSPB3405 is designed to constitutively transcribe torenia CHI-B2 double-stranded RNA.
  • a binary vector for suppressing the expression of ThCHI-B11 was prepared as follows. A DNA fragment obtained by digesting plasmid pSFL313 with BamHI, a 670 bp DNA fragment obtained by digesting pSPB3399 with BglII and HindIII, and a 360 bp DNA fragment obtained by digesting pSPB3399 with BglII and EcoRI, and ligating pSPB3404 Obtained. A DNA fragment obtained by digesting this plasmid with AscI was cloned into pBin + AscI.
  • This binary vector pSPB3406 is designed to constitutively transcribe torenia CHI-B11 double-stranded RNA.
  • TrCHIB-FW 5'-GTATGGCCGGCGGTGAAG-3 'SEQ ID NO: 33
  • TrCHIB-RV 5'-CTCATTTCGATAACTCAGC- 3 ′ SEQ ID NO: 34
  • Torenia cultivar Summer Wave Blue (Suntory Flowers Ltd.) was transformed with Agrobacterium containing the binary vector pSPB3406.
  • RNA is extracted from the petals of the resulting transformant buds, and the amount of the TrCHI-B11 transcript contained in the bud petals of the obtained transformants is determined using an RT-PCR kit (commercial company, primer). It was measured.
  • the petals of the lines with the reduced amount of the transcript had a lighter flower color than the petals of the lines with the host and the amount of the transcript not decreased (see the lower row of FIG. 5 and Table 3).
  • Anthocyanins were extracted by infiltrating 0.5 g of these petals into 5 ml of methanol containing 1% hydrochloric acid. A spectrum of 400 to 600 nm of the extracted anthocyanins was measured. When anthocyanins were quantified by absorbance at the maximum wavelength, it was shown that the amount of anthocyanins in petals with reduced transcripts was low.
  • the present invention relates to a method for reducing the anthocyanin content in a petal of a plant by suppressing the expression of type IV chalcone isomerase (Type IV Chalcone I Isomerase), and a novel useful for the method. Since a gene can be provided, for example, it can be suitably used in the flower industry.

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Abstract

　花の色を薄く又は濃く変化させる新規方法の提供。本発明に係る方法は、以下のステップ：タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を制御するステップを含む、植物の花弁中のアントシアニン含量を変化させて該植物の花の色を薄く又は濃くする方法である。

Description

花の色を薄く又は濃くする方法
　本発明は、タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を制御することにより、植物の花弁中のアントシアニン含量を変化させて該植物の花の色を薄く又は濃くする方法、より詳しくは、タイプＩＶカルコンイソメラーゼの発現を抑制することにより、植物の花弁中のアントシアニン含量を低下させて該植物の花の色を薄くする方法、及びこれらの方法に有用な新規遺伝子に関する。
　花の色は、花卉の重要な形質であることから、色を変えることは花卉産業上有用である。花の色を含む植物の形質を改変する方法としては、（ｉ）交雑、（ｉｉ）突然変異、（ｉｉｉ）遺伝子組換えなどの方法がある。遺伝子組換えにより花の色を薄くするか又は白くする方法として、ペチュニア(Petunia)、トレニア(Torenia)、バラ、キク、カーネーション等において花の色素であるアントシアニンの生合成に関わる酵素の遺伝子の内いくつかの発現をアンチセンス法、センス法（コサプレッション法）、RNAi法等により抑制することにより実現されている。
　カルコンイソメラーゼは、そのようなアントシアニンの生合成に関わる酵素の内の一つであり、カルコンをフラバノンに異性化する反応を触媒する。代表的なカルコンは、2’,4,4’,6’-テトラヒドロキシカルコンであり、カルコンイソメラーゼは、これをナリンゲニンへと異性化する反応を触媒する。この反応を触媒するカルコンイソメラーゼは、タイプＩカルコンイソメラーゼと呼ばれる（以下、非特許文献１参照）。マメ科植物は、この反応に加え、6'-デオキシカルコンを5-デオキシフラバノンへと異性化する反応も触媒するカルコンイソメラーゼを持ち、このカルコンイソメラーゼは、タイプＩＩカルコンイソメラーゼと呼ばれる。これらのカルコンイソメラーゼ間のアミノ酸同一性はミヤコグサ(L. japonicum)の場合、５５～９０％である。
　カルコンイソメラーゼのアミノ酸配列に相同性を示す蛋白質は、上記タイプＩ、タイプＩＩ以外にも知られている。アミノ酸配列にもとづいて分子系統樹に基づくと、タイプＩＩＩ、及びタイプＩＶと分類されるグループも存在している。かかるタイプＩＩＩカルコンイソメラーゼ及びタイプＩＶカルコンイソメラーゼは両者とも、タイプＩカルコンイソメラーゼの触媒活性中心を持たないため、カルコンイソメラーゼとしての活性はないと考えられている（非特許文献１参照）。タイプＩＶカルコンイソメラーゼとしては、アラビドプシスのAT5G05270にコードされる蛋白質が弱い同一性を示すことが知られているが、その機能は不明である。タイプＩＶカルコンイソメラーゼがアントシアニンの合成に関与しているかどうかも不明であり、タイプＩＶカルコンイソメラーゼの遺伝子を用いて花の色を変えた例は未だ報告されていない。また、アントシアニンの合成に関わる複数の酵素は、蛋白質間の相互作用により、超分子構造を形成していると提唱されているが、このような相互作用にタイプＩＶカルコンイソメラーゼが関与していることも知られていない。
　ところで、アサガオ（Ipomoea nil）は、日本で人気のある園芸植物の一つであり、江戸時代から品種改良が行われてきた。その過程で花色や形態が変化したさまざまな変異株が得られている。これらの変異株の内の易変異性アサガオの変異原は、Tpn1類縁のDNA型トランスポゾンであることが知られている。例えば、カルコン合成酵素、カルコンイソメラーゼ（異性化酵素）などの構造遺伝子にTpn１が挿入されることによりアントシアニンの合成が阻害され、花色が白くなる。Tpn１の脱離により構造遺伝子の機能が回復するとアントシアニンの合成が復活し、着色が起こる。一方、花色の濃淡に関わる遺伝子座として、Dilute、Intense、Light、Tinged、Faintedなどが知られているが、これらの遺伝子は未だ同定されていないし、産業的に利用されてもいない。
　また、アサガオは複雑な構造のアントシアニンを生産することが知られている。最も複雑なアントシアニンは、ヘブンリーブルーアントシアニンと呼ばれ、ペオニジンにブドウ糖が6個、カフェ酸が3個結合している。ヘブンリーブルーアントシアニンのB環の3’のメトキシ基がないものは、ウェディングベルアントシアニンと呼ばれる。これらのアントシアニンの生合成経路は完全には解明されていないが、これらの前駆体であるアントシアニン、すなわち、結合しているブドウ糖やカフェ酸の数が少ないアントシアニンがアサガオ花弁には含まれている。アントシアニンや花色に係わる遺伝子の転写は、R2R3-Mybドメイン、bHLHドメイン、WD40リピートを持つ転写調節因子により制御されていることが知られていて、アサガオからもこれらに対応する遺伝子座と遺伝子が同定されている。遺伝子座c-1とcaは、それぞれ、R2R3-MybドメインとWD40リピートを持つ転写調節因子をコードしている。
　赤い花を咲かせるアサガオ品種千鳥と、千鳥から自然突然変異により現れた花色の薄い易変異株であるくすみ千鳥のアントシアニンの種類、含量を、以下の非特許文献２に記載された方法に従って、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により分析した。ＨＰＬＣによる分析に先立ち、９５％ＭｅＯＨ／５％酢酸で、開花した花弁拡大部からアントシアニンを抽出した。品種千鳥に比べ、変異株ではアントシアニンの量が減少していたが、ウェディングベルアントシアニンを始め花弁に含まれるアントシアニンの種類は品種千鳥と変異株の間で変化はなかった。これは、アサガオ品種千鳥の変異株において花色が薄くなった原因はアントシアニンの生合成の関わる酵素の変異に因るものではないことを示唆している。
Plant Physiology, April 2005, Vol. 137, pp. 1375-1388 Phytochemistry, February 1992, Vol. 31, pp. 659-663
　本発明が解決しようとする課題は、花の色を薄く又は濃く変化させる新規方法を提供することである。
　本発明者らは、赤色の花を咲かせる千鳥系統とピンク色の花を咲かせるくすみ千鳥系統の遺伝的な違いが、原因遺伝子に挿入したトランスポゾンによるものであると予想し、トランスポゾンディスプレイ法を用いてトランスポゾン近傍領域を増幅して、くすみ千鳥系統に特異的に増えるＤＮＡ断片を取得した。かかるＤＮＡ断片はタンパク質をコードしていなかったため、近傍のゲノム領域を、インバースＰＣＲ法を用いて赤色の千鳥系統から単離した。得られたゲノム領域は、ダイズから単離されたタイプＩＶに分類されるカルコンイソメラーゼと相同性を示すことを発見した。かかる発見に基づき、タイプＩＶカルコンイソメラーゼの発現を抑制することにより、植物の花弁中のアントシアニン含量を低下させて該植物の花の色を薄くすることができるのではないかと推定し、実験を重ね、これを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
　［１］タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を制御するステップを含む、植物の花弁中のアントシアニン含量を変化させて該植物の花の色を薄く又は濃くする方法。
　［２］タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を抑制するステップを含む、植物の花弁中のアントシアニン含量を低下させて該植物の花の色を薄くする方法。
　［３］以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号２５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップを含む、ペチュニアの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該ペチュニアの花の色を薄くする、前記［２］に記載の方法。
　［４］前記遺伝子の発現の抑制がＲＮＡｉ法による、前記［３］に記載の方法。
　［５］前記［３］又は［４］に記載の方法により得られたペチュニア、又はアントシアニン含量低下効果に関し該ペチュニアと同様の性質を有する子孫、あるいはそれらの組織。
　［６］以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号２５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子。
　［７］以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号２９又は３１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップを含む、トレニアの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該トレニアの花の色を薄くする、前記［２］に記載の方法。
　［８］前記遺伝子の発現の抑制がＲＮＡｉ法による、前記［７］に記載の方法。
　［９］前記［７］又は［８］に記載の方法により得られたトレニア、又はアントシアニン含量低下効果に関し該トレニアと同様の性質を有する子孫、あるいはそれらの組織。
　［１０］以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号２９又は３１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子。
　［１１］以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号１０の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップを含む、アサガオの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該アサガオの花の色を薄くする、前記［２］に記載の方法。
　［１２］前記遺伝子の発現の抑制がＲＮＡｉ法による、前記［１１］に記載の方法。
　［１３］以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号１０の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子。
　本発明により、タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を制御することによって、植物の花弁中のアントシアニン含量を変化させて該植物の花の色を薄く又は濃くすることができる。
アサガオくすみ千鳥系統に特異的に増える２５４ｂｐＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 アサガオＣＨＩ－Ｂ遺伝子の空間的発現に関するＲＴ－ＰＣＲの分析結果を示す。 アサガオの花弁の発育段階にともなうＣＨＩ－Ｂ遺伝子の転写産物のノザンブロット分析結果を示す。 ペチュニア品種サフィニアパープルミニ（サントリーフラワーズ社）において、ＰｔＣＨＩ－Ｂ遺伝子の転写産物量が低下した系統の花弁の花の色が、薄くなったことを示す。 トレニア品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ社）において、ＴｒＣＨＩ－Ｂ２又はＴｒＣＨＩ－Ｂ１１遺伝子の転写産物量が低下した系統の花弁の花の色が、薄くなったことを示す。
　前記したように、タイプＩＶカルコンイソメラーゼの機能は不明であった。また、タイプＩＶカルコンイソメラーゼがアントシアニンの合成に関与しているかどうかも不明であり、タイプＩＶカルコンイソメラーゼの遺伝子を用いて花の色を変えた例もなかった。また、アントシアニンの合成に関わる複数の酵素は、蛋白質間の相互作用により、超分子構造を形成していると提唱されているが、このような相互作用にタイプＩＶカルコンイソメラーゼが関与していることも知られていなかった。
　本発明は、タイプＩＶカルコンイソメラーゼの発現が抑制されていると、アサガオの花弁中のアントシアニン含量が低下して花の色が薄くなったという発見に一部基づくものである。
　前記したように、タイプＩＶカルコンイソメラーゼは両者とも、タイプＩカルコンイソメラーゼの触媒活性中心を持たないため、カルコンイソメラーゼとしての活性はないと考えられている。したがって、特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、タイプＩＶカルコンイソメラーゼは、アントシアニンの合成に関わる複数の酵素間の相互作用により形成される超分子構造の形成に、関与して、花弁中のアトシアニン含量に間接的に影響を及ぼしていると推定している。
　本発明の１の態様は、タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を制御するステップを含む、植物の花弁中のアントシアニン含量を変化させて該植物の花の色を薄く又は濃くする方法である。特に、本発明により、タイプＩＶカルコンイソメラーゼの発現を抑制するステップを含む、植物の花弁中のアントシアニン含量を低下させて該植物の花の色を薄くする方法が提供されるである。尚、この遺伝子を過剰発現させることにより花の色を濃くすることも可能であろう。
　本明細書中、「タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)」とは、非特許文献１の記載に従ってタイプＩＶに分類されるカルコンイソメラーゼをいう。
　本発明の他の態様は、以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号２５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップを含む、ペチュニアの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該ペチュニアの花の色を薄くする方法である。
　前記（ｂ）のＤＮＡにおける「１若しくは数個」とは、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有する範囲であれば、配列番号２５の塩基配列において塩基が、１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは1～５個、欠失、置換若しくは付加されていてもよいことを意味する。また、「欠失」、「置換」、「付加」とは、配列番号２５の塩基配列によりコードされる蛋白質（配列番号２６）と同様の性質を有する蛋白質をコードする塩基配列を生じるものをいう。
　前記（ｃ）のＤＮＡにおける「ストリンジェントな条件」とは、配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズさせるＤＮＡに応じて、ハイブリダイゼーション時の、好ましくはさらに洗浄時の温度及び塩濃度を適宜決定することにより設定し得るが、ストリンジェントな条件としては、例えば、ザンブルーク（Sambrook）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、(i) ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、プローブと共に４２℃で一晩保温し、(ii) 非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、よりストリンジェントには、３０℃下、さらにストリンジェントには、２５℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下で洗浄を行う、という条件が挙げられる。Ｔｍは、例えば、下記式：Ｔｍ＝81.5+16.6（log[Na+]）+0.41（%G+C）-（600/N）（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により求められる。ハイブリダイゼーションの操作は、例えば、前記成書を参照して行えばよい。尚、本明細書において記載する操作は、当該成書を参照することにより適宜実施することができる。
　ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。前記（ｄ）は、配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡを規定している。
　前記遺伝子の発現の抑制は、アンチセンス法、センス法（コサプレッション法）、ＲＮＡｉ法等、いずれでも構わないが、好ましくは、ＲＮＡｉ法である。
　前記方法により得られたペチュニア、又はアントシアニン含量低下効果に関し該ペチュニアと同様の性質を有する子孫、あるいはそれらの組織、部分、特に花弁を含む部分も、本発明の範囲内にある。
　また、前記方法に使用する配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ等も本発明の範囲内にある。
　本発明に他の態様は、以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号２９又は３１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップを含む、トレニアの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該トレニアの花の色を薄くする方法である。
　本発明のさらに他の態様は、以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ；
　（ｂ）配列番号１０の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｃ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
　（ｄ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップを含む、アサガオの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該アサガオの花の色を薄くする方法である。
　配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡに関して前記した事項は、配列番号２９、３１、及び１０の塩基配列からなるＤＮＡにも同様に該当し、これらの遺伝子の発現の抑制は、アンチセンス法、センス法（コサプレッション法）、ＲＮＡｉ法等、いずすれでも構わないが、好ましくは、ＲＮＡｉ法であり、また、前記方法により得られたトレニア又はアサガオ、又はアントシアニン含量低下効果に関し該トレニア又はアサガオと同様の性質を有する子孫、あるいはそれらの組織、部分、特に花弁を含む部分も、本発明の範囲内にある。さらに、前記方法に使用する配列番号２９、３１、及び１０の塩基配列からなるＤＮＡ等も本発明の範囲内にある。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されることを意図されない。
実施例１：アサガオＤＮＡ断片の取得
　本発明者らは、赤色の花を咲かせる千鳥系統とピンク色の花を咲かせるくすみ千鳥系統の遺伝的な違いが、原因遺伝子に挿入したトランスポゾンによるものと推定した。そこで、トランスポゾンディスプレイ法（Fukada-Tanaka et al. Plant Biotech. 18, 143-149. 2001参照）を用いてトランスポゾンの近傍領域を増幅し、くすみ千鳥系統に特異的に増えていた259bpのDNA断片を取得した（配列番号１、図１参照）。DNA断片の増幅には、制限酵素TaqIで消化したゲノムDNAに、TaqI adapter (5’-GCGGATGAGTCCTGAG-3’（配列番号２）と5’-CGCTCAGGACTCAT-3’（配列番号３））を結合後、TaqI-C (5’-GAGGATGAGTCCTGAGCGAC-3’配列番号４）とTIR-T (5’-TGTGCATTTTTCTTGTAGTGT-3’配列番号５）の２つのプライマーを用いた。トランスポゾンディスプレイ法により得られたDNA断片はタンパク質をコードしていなかったため、近傍のゲノム領域を、インバースPCR法を用いて赤色の千鳥系統から単離した。DNA断片の増幅には、制限酵素TaqIで消化したゲノムDNAをT4 DNAライゲースを用いて環状化させ、トランスポゾンディスプレイ法により得られたDNA断片に設計したプライマーを用いてPCRを行なった。一次増幅には、IPCR-A1 (5’-ATTCATGTCTAAAATGTGACACC-3’配列番号６)とIPCR-B1 (5’-TCAATTTCAGACGAGAAAACTC-3’配列番号７)の二種類のプライマーを、二次増幅には、IPCR-A2 (5’-TGACACCCTGGCTAGTTCAG-3’配列番号８)とIPCR-B2 (5’-GAAAACTCATAACTACTACTCC-3’配列番号９)の二種類のプライマーを用いた。インバースPCR法により得られた1.1 kbのDNA領域は、ダイズから単離されたタイプＩＶに分類されるカルコンイソメラーゼ（AY595417）（非特許文献１参照）と相同性を示した。
実施例２：遺伝子のスクリーニング
　ナショナルバイオリソースプロジェクト(ＮＢＲＰ）における野生型系統のアサガオ系統TKSのつぼみ及びシードリングから抽出したRNAを用いて作成されたESTライブラリーのデータベースから、インバースPCRにより得られた上記1.1 kbのDNA領域に対応するcDNAを単離し、この遺伝子をＣＨＩ－Ｂと名付けた。その配列を配列番号１０に示す。この配列がコードするアミノ酸配列（配列番号１１）は、前述のアラビドプシスAT5G05270とダイズAY595417に対して、それぞれ、５９％と５６％の同一性を示した。この遺伝子の発現の組織特異性をRT-PCRにより調べた。それぞれの組織からCsCl法又はGet pureRNA Kit (Dojindo社）を用いて取得したRNAを、SuperScript ファーストストランド システム（RT-PCR用）(invtrogen社)を用いてDNAに逆転写し、このDNAを鋳型に、CHI-B LA-F2 (5’-AGTTCTTCTTGCAGGCTGCAGAC-3’配列番号１２)とCHI-B R1 (5’-ACTCCATAGGATCACCAAACTCTC-3’配列番号１３)をプライマーに用いてPCRを行なった結果を図２に示す。図２から、ＣＨＩ－Ｂ遺伝子は花弁で特異的に発現していることが分かる。尚、図２中、ＣＨＩ－ＡとＣＨＩ－Ｃは、それぞれ、タイプＩカルコンイソメラーゼとタイプＩＩＩカルコンイソメラーゼをコードする遺伝子を示す。
　また、花弁の発育段階にともなうCHI-B遺伝子の転写産物をノザン解析により調べたところ、図３に示すように、開花の12時間前に最も強く発現していたことが分かった。転写調節因子c-1又はcaが変異している花の花弁では、CHI-B遺伝子の発現は見られなかった。これらの結果は、CHI-Bがアントシアニンの合成に何らかの役割を担っていることを示唆している。
実施例３：ペチュニアのホモログの取得と機能解析
　CHI-A蛋白質では保存されていないが、CHI-B蛋白質では保存されているアミノ酸配列に基づいて、以下のプライマーを合成した。ここで、Mは、デオキシイノシン、Hは、A、T、Cの混合物、Yは、CとTの混合物、Rは、AとGの混合物、Bは、デオキシウラシル、Wは、AとTの混合物、Dは、AとTとGの混合物、Kは、TとGの混合物、そしてSは、CとGの混合物を表す。
　CHIB-F1 (5'-GGMATHACMGAYGTMGARABHCAYTTY-3’配列番号１４) 
　CHIB-F2 (5'-TMWSMYTMHTMGGMCAMGGMATHAC-3’配列番号１５）
　CHI-B R1 （5'-CCYTTDATYTCYTMDATMACMAC-3’配列番号１６）
　CHI-B R2 （5'-TCYTCYTCYTCYTCRTAYTTKTC-3’配列番号１７）
　CHI-B R3 （5'-TTYTTRAARTAYTTMSWYTGRAA-3’配列番号１８）
　ペチュニアの蕾からRNeasy Plant Kit (QIAGEN社)を用いてRNAを抽出した。スーパースクリプトファーストストランドシステム（インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡを合成し、これを鋳型にし、（CHIB-F1、CHI-B R1）、（CHIB-F1、CHI-B R2）、（CHIB-F1、CHI-B R3）、（CHIB-F2、CHI-B R1）、（CHIB-F2、CHI-B R2）、及び（CHIB-F2、CHI-B R3）のプライマー・セットを用いてＰＣＲを行なった。反応は、25μｌで行い、95℃30秒、72℃30秒、55℃30秒を1サイクルとし、これを30回繰り返した。それぞれの反応液を100 倍に希釈したもの1μｌを鋳型として、上述と同じＰＣＲを繰り返した。その結果、（CHIB-F２、CHI-B R2）のプライマー・セットでDNAバンドが得られたのでこれをpCR2.1TOPOに連結することにより、pSPB3387を得た。ｐSPB3387にはCHI-Bの部分cDNAが挿入されている。
　全長ｃDNAを得るために、上記DNA断片の5'側、3'側の配列をGene Racer（インビトロジェン社）を用いて製造者の推奨するプロトコールに従って増幅した。すなわち、5’側の配列は、1回目のPCRは花弁のｃDNAを鋳型にしてGeneRacer 5’ プライマー（5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'配列番号１９）とPtCHIB-R1プライマー（5'-CTCTTACAGCACTCTCTAGC-3'配列番号２０）を用いて行なった。増幅されたDNAを鋳型に2回目のPCRをGeneRacer 5’ネステッドプライマー（5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3'配列番号２１）とPtCHIB-RIプライマーを用いて行なった。このDNAバンドをpCR2.1TOPOに連結することにより、pSPB3401を得た。3'側の配列は、1回目のPCRは花弁のｃDNAを鋳型にGeneRacer ３’ プライマー（5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'配列番号２２）とPtCHIB-F１プライマー（5'-CATTGAGATACACTTTCTCC-3'配列番号２３）を用いて行なった。増幅されたDNAを鋳型に2回目のPCRをGeneRacer 3’ネステッドプライマー（5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'配列番号２４）とPtCHIB-F1プライマーを用いて行なった。このDNAバンドをpCR2.1TOPOに連結することにより、pSPB3402を得た。ｐSPB3401をBamHIで消化して得られるDNA断片を、BamHIで消化して得られるｐSPB3402に連結することにより、カルコンイソメラーゼタイプIVに分類されるペチュニアCHI-Bの全長（配列番号２５）を含むプラスミドpSPB3400を得た。この配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２６）は、アサガオCHI-B、アラビドプシスAT5G05270、及びダイズAY595417に対して、それぞれ、７４％、５６％、及び５８％の同一性を示した。
　（ｉ）ｐSPB3401をEcoRVとXhoIで消化して得られるDNA断片、（ｉｉ）ｐSPB3401をXhoIとBamHIで消化して得られるDNA断片、（ｉｉｉ）ｐSPB3400をBamHIとRsaIで消化して得られる約400bpのDNA断片を、連結することによりプラスミドpSPB3407を得た。このプラスミドをKpnIとXbaIで消化して約1050ｂｐのDNA断片を回収し、これを、XbaIとKpnIで消化したバイナリーベクターに連結した。得られたプラスミドをpSPB3408とした。このプラスミドはペチュニアのCHI-B遺伝子の二本鎖RNAが構成的に転写されることを意図したものである。
　PtCHI-B遺伝子の発現を抑制するために、ペチュニア品種サフィニアパープルミニ（サントリーフラワーズ株式会社）を、バイナリーベクターpSPB3408を含むアグロバクテリウムにより形質転換した。得られた形質転換体のつぼみの花弁からRNAを抽出し、RT-PCRキット(プロメガ社、プライマーとしてPtCHIB-FW （5'-ATGGGAAAGAACGAAGTGATGG-3'配列番号２７）とPtCHIB-RV （5'-TCATTTAGATAATTCAGCAGAG-3'配列番号２８）を使用して、得られた形質転換体のつぼみ花弁に含まれるPtCHI-B遺伝子の転写産物の量を測定した。転写産物の量が減少した系統の花弁は、宿主及びび転写産物の量が減少していない系統の花弁に比べて、花の色が薄かった（図４参照）。また、これらの花弁0.5ｇからアントシアニンを抽出し、加水分解後、アントシアニジンの量を高速液体クロマトグラフィーにより測定した。実験の手順は、ＷＯ　２００５／０１７１４７に記載の方法に依った。アントシアニジンの総量の相対量を高速液体クロマトグラフィーによる測定で得られたピークの面積を指標にして比較した。CHI-Bを抑制したペチュニアの面積は約30％程度にまで減少していた。結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１及び図４から、ペチュニアのCHI-B遺伝子の発現を抑制することにより、花弁中のアントシアニン含量が減少し、花の色が薄くなっていたことが分かった。
実施例４：トレニアのホモログの取得と機能解析
　実施例３と同様にトレニアのホモログを取得した。トレニア品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ社）のつぼみの花弁からRNAを抽出した。これを鋳型にcDNAを合成し、プライマーCHIB-F２とCHI-B R２とを用いて、PCRを行なった。得られたDNA断片をｐCRTOPOにクローニングし、これをpSPB3388とした。これを用いてトレニアのｃDNAライブラリー（Molecular Breeding 6, 239-246 2000に記載）をスクリーニングし、タイプＩＶカルコンイソメラーゼに分類される蛋白質をコードする遺伝子として、TrCHI-B2（配列番号２９）とTrCHI-B11（配列番号３１）を得た。そしてこれらをそれぞれ含むプラスミドpSPB3398とpSPB3399を得た。配列番号２９がコードするアミノ酸配列（配列番号３０）は、アサガオCHI-B、ペチュニアCHI-B、アラビドプシスAT5G05270、及びダイズAY595417に対して、それぞれ、６７％、７０％、５８％、及び５７％の同一性を示した。配列番号３１がコードするアミノ酸配列（配列番号３２）は、アサガオCHI-B、ペチュニアCHI-B、TrCHI-B2、アラビドプシスAT5G05270、及びダイズAY595417に対して、それぞれ、６５％、７０％、９４％、５８％、及び５７％の同一性を示した。
　WO2005/059141に記載されているプラスミドpSFL313をBamHIで消化したDNA断片と、ｐSPB3398をBglIIとSmaIで消化して得られる５４０ｂｐのDNA断片と、ｐSPB3398をBglIIとPvuIIで消化して得られる280ｂｐのDNA断片とを連結し、pSPB3403を得た。このプラスミドをHindIIIとEcoRIで消化して得られるDNA断片を、ｐBin＋のHindIIIとEcoRIにクローニングした。このバイナリーベクターｐSPB3405は、トレニアのCHI-B2の二本鎖RNAを構成的に転写するように設計されている。
　また、ThCHI-B11の発現を抑制するためのバイナリーベクターを以下のように作製した。プラスミドpSFL313をBamHIで消化したDNA断片と、ｐSPB3399をBglIIとHindIIIで消化して得られる670ｂｐのDNA断片と、ｐSPB3399をBglIIとEcoRIで消化して得られる360ｂｐのDNA断片とを連結し、pSPB3404を得た。このプラスミドをAscIで消化して得られるDNA断片を、ｐBin＋のAscIにクローニングした。このバイナリーベクターpSPB3406は、トレニアのCHI-B11の二本鎖RNAを構成的に転写するように設計されている。
　トレニア品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ株式会社）を、バイナリーベクターｐSPB3405を含むアグロバクテリウムにより形質転換した。得られた形質転換体のつぼみの花弁からRNAを抽出し、RT-PCRキット(プロメガ社、プライマーTrCHIB-FW （5'-GTATGGCCGGCGGTGAAG-3'配列番号３３）とTrCHIB-RV （5'-CTCATTTCGATAACTCAGC-3'配列番号３４)を用いて、得られた形質転換体のつぼみ花弁に含まれるTrCHI-B2の転写産物の量を測定した。転写産物の量が減少した系統の花弁は、宿主及び転写産物の量が減少していない系統の花弁に比べて、花の色が薄かった（図５上段、表２参照）。また、これらの花弁0．5ｇを、1％塩酸を含むメタノール５ｍｌに浸潤することによりアントシアニンを抽出した。抽出したアントシアニンの400nm～650nmのスペクトルを測定した。極大値の波長での吸光度によりアントシアニンを定量したところ、転写産物の量が減少した系統の花弁のアントシアニン量は少ないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　同様に、トレニア品種サマーウェーブブルー（サントリーフラワーズ株式会社）を、バイナリーベクターpSPB3406を含むアグロバクテリウムにより形質転換した。得られた形質転換体のつぼみの花弁からRNAを抽出し、RT-PCRキット(業者、プライマー)を用いて、得られた形質転換体のつぼみ花弁に含まれるTrCHI-B11の転写産物の量を測定した。転写産物の量が減少した系統の花弁は、宿主及び転写産物の量が減少していない系統の花弁に比べて、花の色が薄かった（図５下段、表３参照）。また、これらの花弁0．5ｇを、1％塩酸を含むメタノール５ｍｌに浸潤することによりアントシアニンを抽出した。抽出したアントシアニンを400nm～600nmのスペクトルを測定した。極大値の波長での吸光度によりアントシアニンを定量したところ、転写物量が減少した系統の花弁のアントシアニン量は少ないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明は、タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を抑制すことにより、植物の花弁中のアントシアニン含量を低下させて該植物の花の色を薄くする方法及び該方法に有用な新規遺伝子を提供することができるので、例えば、花卉産業において好適に利用可能である。

Claims (13)

  1. 　タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を制御するステップを含む、植物の花弁中のアントシアニン含量を変化させて該植物の花の色を薄く又は濃くする方法。
  2. 　タイプＩＶカルコンイソメラーゼ(Type IV Chalcone Isomerase)の発現を抑制するステップを含む、植物の花弁中のアントシアニン含量を低下させて該植物の花の色を薄くする方法。
  3. 　以下の（ａ）～（ｄ）：
    　（ａ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号２５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｄ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップをを含む、ペチュニアの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該ペチュニアの花の色を薄くする、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記遺伝子の発現の抑制がＲＮＡｉ法による、請求項３に記載の方法。
  5. 　請求項３又は４に記載の方法により得られたペチュニア、又はアントシアニン含量低下効果に関し該ペチュニアと同様の性質を有する子孫、あるいはそれらの組織。
  6. 　以下の（ａ）～（ｄ）：
    　（ａ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号２５の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｄ）配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    のいずれかからなる遺伝子。
  7. 　以下の（ａ）～（ｄ）：
    　（ａ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号２９又は３１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｄ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップを含む、トレニアの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該トレニアの花の色を薄くする、請求項２に記載の方法。
  8. 　前記遺伝子の発現の抑制がＲＮＡｉ法による、請求項７に記載の方法。
  9. 　請求項７又は８に記載の方法により得られたトレニア、又はアントシアニン含量低下効果に関し該トレニアと同様の性質を有する子孫、あるいはそれらの組織。
  10. 　以下の（ａ）～（ｄ）：
    　（ａ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号２９又は３１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｄ）配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号２９又は３１の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    のいずれかからなる遺伝子。
  11. 　以下の（ａ）～（ｄ）：
    　（ａ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号１０の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｄ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    のいずれかからなる遺伝子の発現を抑制するステップを含む、アサガオの花弁中のアントシアニン含量を低下させて該アサガオの花の色を薄くする、請求項２に記載の方法。
  12. 　前記遺伝子の発現の抑制がＲＮＡｉ法による、請求項１１に記載の方法。
  13. 　以下の（ａ）～（ｄ）：
    　（ａ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ；
    　（ｂ）配列番号１０の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｃ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    　（ｄ）配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、アントシアニン含量低下効果に関し配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡと同様の機能を有するＤＮＡ；
    のいずれかからなる遺伝子。
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