WO2005059141A1 - フラボノイド合成系の制御による黄色の花の作製方法 - Google Patents

フラボノイド合成系の制御による黄色の花の作製方法 Download PDF

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WO2005059141A1
WO2005059141A1 PCT/JP2004/019461 JP2004019461W WO2005059141A1 WO 2005059141 A1 WO2005059141 A1 WO 2005059141A1 JP 2004019461 W JP2004019461 W JP 2004019461W WO 2005059141 A1 WO2005059141 A1 WO 2005059141A1
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plant
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cgt
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PCT/JP2004/019461
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Yoshikazu Tanaka
Eiichiro Ono
Noriko Nakamura
Masako Mizutani
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Suntory Limited
Suntory Flowers Limited
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a protein having an activity of transferring sugar to chalcone, and a plant having a flower color converted by using the gene. More specifically, a gene encoding a protein having an activity of synthesizing a glycoside at the 4′-position of chalcones, preferably a gene derived from Scrophulariaceae, more preferably a chalcone derived from Goldfish or Linaria. 'Chalcones or aurons by expressing a gene encoding a protein having the activity of synthesizing glycosides, and expressing these genes together with the gene for o-residin synthase (hereinafter referred to as AS) alone or simultaneously.
  • AS o-residin synthase
  • the present invention relates to a technique for altering the color of a flower by accumulating water, preferably a technique for altering the color to yellow.
  • yellow is often derived from compounds other than flavonoids, such as carotinoide and betalain, but the yellow color of some plant species is derived from flavonoids.
  • yellow carney syrup contains 4,2 ', 4', 6'-tetrahydroxychalcone (hereinafter referred to as THC) 2 'glycoside in petals. (Phytochem is try 5,111 (1996)).
  • THC 4,2 ', 4', 6'-tetrahydroxychalcone
  • THC is biosynthesized from three molecules of malonyl-CoA and one molecule of coumaroyl-CoA by the catalysis of chalcone synthase.
  • THC has a pale yellow color but is rapidly converted to colorless naringenin in plant cells, usually by chalcone isomerase (CHI).
  • CHI chalcone isomerase
  • THC is extremely unstable at near neutral pH, and spontaneously closes and converts to naringenin.
  • the 2 ′ position of THC be modified by a sugar so that it cannot be closed.
  • This reaction is carried out by an enzyme that transfers glucose to the 2'-position of THC (UDP-glucose: 4,2 ', 4,, 6'-tetrahydroxychalcone 2, position-glycosyltransferase; 2' CGT). Catalyzed.
  • Enzymes involved in the biosynthesis of flaponoid anthocyanins are thought to be present in the cytoplasm or endoplasmic reticulum within cells. By the action of these enzymes, flavonoid anthocyanins are synthesized outside the vacuole, that is, on the cytoplasmic side, glycosylated, and transported to the vacuole (Natural Product Reports 20, 288, (2003)). .
  • AS is exceptionally present in the vacuole. This led to the idea that in vivo, glycosylated chalcone would be transported to the vacuole, and this would be used as a substrate to synthesize auron in the vacuole.
  • the major orone that accumulates in the vacuoles of the yellow petals of the yellow Qualcomm is the AU 6-glycoside.
  • the 6th position of AU corresponds to the 4 'position of THC, and there is also a THC 4' glycoside in yellow goldfish petals.
  • a series of aurora in which the 4'-position of THC synthesized in the cytoplasm is glycosylated, then transported to the vacuole, and AS is used as a substrate to synthesize the AU 6-position glycoside by AS. The synthesis pathway was deduced.
  • THC 4' Glycosylation of UDP-glucose: 4,2 ', 4', 6'-Tetrahydroxychalcone 4'glycosyltransferase (hereinafter 4'CGT) is required, and 4'CGT gene is obtained There is a need.
  • 4'CGT gene has not been reported to date to be cloned, and the 4' CGT gene has not been isolated to date.
  • Glycosides are produced by catalyzing glycosylation of various compounds, including flaponoids.
  • Enzymes are generally called glycosyltransferases (GTs), and plants have a variety of molecular species corresponding to the substrate and the type of sugar to be transferred, and the genes encoding them. Since GT normally uses UDP-glucose as a glucose donor, its amino acid sequence contains a motif that binds to UDP-glucose (Plant Physiol. 112, 446 (2001)). It has been known that there are 99 GT genes having this motif in Arabidopsis, for which the entire structure of the genome has already been elucidated (J. Biol. Chem. 276, 4338, (2001)).
  • the amino acid sequences and functions of some GTs have also been elucidated from other plants.
  • the genes for enzymes that catalyze the transfer of sugars to the hydroxyl group at position 3 of flavonoids or anthocyanidins are expressed in perilla, corn, And vines and grapes (J. Biol. Chera. 274, 7405 (1999); J. Biol. Chem. 276, 4338, (2001)).
  • the gene for the enzyme that catalyzes the transfer of sugar to the 5-position hydroxyl group of anthocyanin is obtained from perilla, verbena, etc. (J. Biol. Chem., 274, 7405, (1999)).
  • each GT that transfers a sugar to position 3, 5 or 3 'of the common anthocyanidin skeleton belongs to different families in the GT superfamily and between these families.
  • the amino acid identity is only about 20% (Plant Physiol. 132, 1652, (2003), Natural Product Reports 20, 288, (2003)).
  • several methods can be considered to obtain a new gene as well as the 4 'CGT gene.
  • the genes of enzymes involved in the synthesis of rose scent components expressed in petals were comprehensively sequenced and identified by their structure, expression pattern, and expression in E. coli (Plant Cell. 14, 2325 (2002)).
  • Patent Document 1 PCT / JP03 / 10500
  • Patent Document 2 W0 00/49155
  • Non-Patent Document 1 Plant Cell Physiol. 39, 1119 (1998)
  • Non-Patent Document 2 Curr. Opin. Biotechnol. 12, 155 (2001)
  • Non-Patent Document 3 Phytochemistry 5,111 (1996)
  • Non-patent literature 5 omprehens 1 ve Natural Products Chemistry, vo 1 I (ed.Sankawa) pp713-748, Elsevier, Amsterdara (1999)
  • Non-patent literature 6 Biotechnology of Ornamental Plants, Edited by Geneve, Preece and Merkl e, pp259-294, CAB International Wall ingford, UK (1997)
  • Non-Patent Document 7 Plant Cell Physiol. 43, 578 (2002)
  • Non-patent document 8 Plant Cell Physiol. 44, sl58 (2003) Non-patent document 9 Plant J. 13, 259 (1998)
  • Non-Patent Document 10 Science, 290, 1163 (2000)
  • Non-Patent Document 1 Nature 375, 397 (1995)
  • Non-patent document 1 Natural Product Reports 20, 288, (2003) Non-patent document 13 Plant Physiol. 112, 446 (2001)
  • Non-Patent Document 15 J. Biol. Chem. 274, 7405 (1999)
  • Non-Patent Document 16 Plant Mol Biol. 48, 401 (2002)
  • Non-Patent Document 17 Planta 214, 492 (2002)
  • Non-Patent Document 18 Plant Physiol. 132, 1652, 2003 (2003) Non-Patent Document 19 Plant Cell. 14, 2325 (2002) Disclosure of Invention
  • the present invention relates to a protein having an activity of transferring sugar to a 4′-hydroxyl group of chalcone and a gene thereof, preferably a protein having an activity of specifically transferring sugar to a 4′-hydroxyl group of chalcone and To provide the gene. It is still another object of the present invention to provide a plant in which the flower color has been modified, preferably yellow, using the GT gene.
  • the biochemical or molecular biological properties of 4 'CGT were not known, and neither the enzyme was purified nor its gene was cloned.
  • the present inventors used a probe having a base sequence corresponding to the conserved amino acid sequence of the petal cDNA library of GT from one of the petals of yellow butterfly (Butterfly yellow) to obtain the conserved amino acid sequence of the conserved amino acid sequence.
  • Ten types of GT genes having nucleotide sequences were obtained. Further, each of the GT genes is expressed in Escherichia coli, and The activity of transferring glucose to the 4'-position of chalcone in the bacterial extract, that is, the activity of 4'CGT, was confirmed, and it was confirmed that the cloned gene encoded 4'CGT. This gene was expressed in plants to change the flower color, and the present invention was completed.
  • the present invention provides (1) a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 4 ′ position of chalcones.
  • the present invention also provides (2) the gene according to (1), which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also relates to (3) a part or all of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 that hybridizes under the condition of 5 ⁇ SS at 50 ° C., and at the 4 ′ position of chalcone group.
  • the present invention provides the gene according to the above (1), which encodes a protein having a sugar transfer activity.
  • the present invention also relates to (4) a modified amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 by addition or deletion of one or more amino acids and substitution with Z or another amino acid.
  • the gene according to the above (1) which encodes a protein having an amino acid sequence, and having a sugar-transferring activity at the 4′-position of chalcone.
  • the present invention also provides (5) a DNA sequence consisting of part or all of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, which is hybridized under the conditions described above, and which has a sugar at the 4 ′ position of chalcone.
  • the gene according to the above (1) which encodes a protein having an activity of transferring a gene.
  • the present invention also provides (6) the gene according to any one of (1) to (5), which is derived from Scrophulariaceae.
  • the present invention also provides (7) a vector comprising the gene described in any one of the above (1) to (6).
  • the present invention also provides (8) a host cell transformed with the vector of (7).
  • the present invention also provides (9) a protein encoded by the gene according to any one of (1) to (6).
  • the present invention also provides (10) culturing or growing the host cell according to (7), and collecting a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position of chalcone from the host cell.
  • a method for producing the protein is provided.
  • the present invention also provides (11) a plant into which the gene according to any one of (1) to (6) has been introduced or a progeny of the plant having the same properties as the plant. Provide plants or tissues of those plants.
  • the present invention also provides (12) a cut flower of the plant according to (11).
  • the present invention also provides (13) a method for transferring a sugar to the 4'-position of calyuns using the gene according to any one of (1) to (6).
  • the present invention also provides (14) a flower-color-modified plant or plant obtained by introducing and expressing the gene described in any one of (1) to (6) above in a plant.
  • the present invention also provides (15) the plant as described in (14) above, wherein the flower color has a yellow tint.
  • the present invention also provides (16) a method for introducing and expressing in a plant a gene encoding aurethidine synthase together with the gene according to any one of the above (1) to (6), thereby changing the flower color to yellow. provide.
  • the present invention also provides (17) a gene encoding aurethidine synthase, together with the gene according to any one of (1) to (6) above, introduced and expressed in a plant, and further a flavonoid of a host. Expression of synthetic genes The present invention provides a method for changing the flower color to yellow by suppressing the color of the flower. The present invention also provides (18) a gene encoding aurethidine synthase together with the gene according to any one of the above (1) to (6), which is introduced into a plant and expressed, and Provided is a method for changing the flower color to yellow by suppressing the expression of a flavonol reductase gene.
  • the present invention also provides (19) a gene encoding aurethidine synthase, together with the gene according to any one of the above (1) to (6), introduced and expressed in a plant, and a host flavanone. Provided is a method for changing the flower color to yellow by suppressing the expression of 3-hydroxylase gene.
  • Figure 1 shows a typical flavonoid synthesis pathway in plants.
  • the end of the metabolic pathway differs for each plant species depending on the presence or absence of the enzyme gene described here.
  • the yellow petals of Qualcomm there is a pathway leading to auron synthesis in addition to the anthocyanin synthesis pathway.
  • the same sesame plant of the family Scrophulariaceae has a 4 'CGT and AS gene, Can not be synthesized. See below for abbreviations in the figure.
  • FIG. 2 is a continuation of
  • FIG. 3 shows the results of Southern hybridization of the transformant Treure.
  • Genomic DNA was extracted from leaves of a transformant (summer wave blue) introduced with pSFL201, pSFL307, and pSFL308, cut into Kpnl, and subjected to Southern hybridization using the 4 'CGT gene as a probe. .
  • the numbers above each lane indicate the transgene construct and the transformant line number.
  • SWB is Summer Wave Blue used as a host.
  • Ml and ⁇ 2 are dig-labeled size markers (roshes), and the size of each band is shown on the left and right of the figure.
  • Examples of the gene of the present invention include a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • a protein having an amino acid sequence modified by addition, deletion, or substitution of another amino acid with another amino acid also maintains enzyme activity equivalent to that of the original protein. It is known. Therefore, the present invention relates to the addition, deletion and deletion of one or more amino acid sequences with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as long as the protein retains 4 'CGT activity.
  • a protein having an amino acid sequence modified by substitution with another amino acid and / or a gene encoding the protein also belong to the present invention.
  • the term “plurality” refers to 2 to 30, preferably 2 to 9.
  • the present invention also relates to a gene that hybridizes to DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under relatively mild conditions such as 5 ⁇ SS 50 ° C. and encodes a protein having 4 ′ CGT activity. It is. Further, the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 However, a gene that hybridizes under stringent conditions and encodes a protein having 4 ′ CGT activity also belongs to the technical scope of the present invention.
  • the stringent conditions mentioned here include, for example, 2 XSSC and 65 ° C, but the hybridization conditions differ depending on the length and base composition of the DNA used for the probe. Not limited to conditions
  • the genes selected by the above-mentioned hybridization include those derived from a natural source, for example, those derived from a plant, preferably those derived from the Sesame Family, and more preferably those belonging to Kingfishos and Linaria. But not limited to plant-derived genes. That is, the 4 ′ CGT gene of the present invention is not limited to the 4 ′ CGT gene derived from goldfish, linaria, and penguin, but is derived from other species including chalcone 4′-glucoside. Any 4 'CGT gene can be used to breed yellow flowers. Synthetic DNA containing the 4 'CGT gene can be used in the same manner as a plant-derived gene.
  • the gene selected by the hybridization may be cDNA or genomic DNA.
  • a gene having homology to the conserved region of GT can be obtained by, for example, screening a cDNA library prepared from a petal of Kingilla ssp.
  • a DNA encoding a GT having an amino acid sequence in which the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is modified can be obtained by using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 at a known site. It can be synthesized using a specific mutagenesis method or a PCR method. For example, a DNA fragment in which the amino acid sequence has been modified is obtained by treating the cDNA or genomic DNA with a restriction enzyme.
  • a DNA fragment corresponding to the desired amino acid sequence modification can be obtained. Thereafter, the DNA fragment into which this modification has been introduced may be ligated to a DNA fragment encoding another part of the target enzyme. Such DNA can also be chemically synthesized.
  • DNA encoding a protein consisting of a shortened amino acid sequence for example, an amino acid sequence longer than the desired amino acid sequence, for example, a full-length amino acid sequence is encoded. If the DNA to be encoded is cleaved with a desired restriction enzyme and the resulting DNA fragment does not encode the entire amino acid sequence of interest, it corresponds to the missing amino acid sequence DNA fragments to be synthesized and ligated.
  • the GT gene thus obtained is expressed by using a gene expression system in Escherichia coli or yeast, and the activity of 4 ′ CGT in the extract of the Escherichia coli or yeast is measured to obtain the GT gene. It can be confirmed that the obtained GT gene encodes a protein showing 4 'CGT.
  • the activity of 4 ′ CGT is determined by, for example, as described in Example 3, after adsorbing chalcone as a substrate for 4 ′ CGT on a reverse-phase resin, and then transforming the reverse-phase resin with the GT gene. Alternatively, it can be measured by reacting it with a yeast extract and producing the formed chalcone 4 'glycoside by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • a 4' CGT protein which is a product of the gene can be obtained.
  • the 4 'CGT gene of another organism can be obtained by expression cloning using an antibody against a protein or peptide having all or a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It also relates to recombinant vectors containing the 4 'CGT gene, especially expression vectors, and host cells transformed with the vectors. Things. Prokaryote or eukaryote can be used as a host.
  • Prokaryotes include bacteria known in the art, such as bacteria belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli, and microorganisms belonging to the genus Bacillus, such as Bacillus subtilis. Host cells can be used. As eukaryotic cells, for example, eukaryotic microorganisms, preferably yeast or filamentous fungi can be used. Examples of yeast include yeast belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae, and examples of filamentous fungi include Aspergillus.
  • Animal cells or plant cells can also be used as host cells, and animal cells include cell lines such as mouse, hamster, monkey, human, etc. Insect cells such as silkworm cells, or The adult silkworm itself is also used as a host.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region such as a promoter and a terminator depending on the species of the host into which the vector is to be introduced, a replication origin, and the like.
  • a promoter of an expression vector for bacteria particularly in Escherichia coli, a conventionally known promoter, for example, a trc promoter, a tac promoter, a lac promoter and the like can be used.
  • a promoter for yeast for example, Daricelaldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc. are used, and as a promoter for filamentous fungi, for example, a promoter for amylase, trpC, etc.
  • promoters for animal cells include viral promoters such as SV40 early promoter and SV40 late promoter. Is used.
  • the expression vector can be prepared by a conventional method using a restriction enzyme, ligase or the like. Transformation of host cells with an expression vector can also be carried out according to a conventionally known method. Construction of a plant expression vector can be performed, for example, by using a binary vector such as pBI121 when using an agrobacterium. When a vector gun is used with a particle gun, an Escherichia coli vector such as PUC 19 can be used.
  • plant cells transformed with the plant expression vector are selected using a marker gene, such as an antibiotic resistance gene, and redifferentiated using conditions such as appropriate plant hormones. It is possible to obtain a transformed plant into which is introduced. By cultivating the transformed plant, it is possible to obtain a plant whose flower color has been modified by flowering.
  • a marker gene such as an antibiotic resistance gene
  • the host cells or transformed plants transformed by the expression vector are cultured or cultivated, and the culture is subjected to conventional methods, for example, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange.
  • the desired 4, CGT protein can be recovered and purified by chromatography and other methods.
  • the present invention is not limited to the 4 ′ CGT gene of goldfish, but the origin of the 4 ′ CGT or 4 ′ CGT gene is not limited to plants, animals, or microorganisms. 4. If it has CGT activity, it can be similarly used for flower color modification.
  • the present invention also relates to the use of the 4 ′ CGT gene, wherein the 4 ′ CGT gene is introduced into a plant to express the 4 ′ CGT gene.
  • vegetatively propagated plants of these plants or tissues of these plants are also within the technical scope of the present invention, and the form of the tissues may be cut flowers.
  • the plant or its progeny whose flower color has been modified by introducing and expressing the AS gene together with the plant, and in addition, by suppressing the expression of the flavonoid synthesis gene inherent in the host.
  • the plants or vegetatively propagated plants of these plants or the tissues of these plants are also within the technical scope of the present invention, and the form of the tissues may be cut flowers.
  • plants that can be transformed include roses, chrysanthemums, carnations, goldfish, cyclamen, morning glory, begonias, impatiens, geraniums, orchids, eustomas, frigia, gerberas, gladioli, Kasumi, Kalanchoe, Lily, Peranoregonium, Zeranium, Petunia, Trenia, Tulip, Rice, Forsythia, Begonia, Oomgi, Wheat, Rape, Potato, Tomato, Poplar, Banana, Eucari Examples include, but are not limited to, sweet potato, tides, anorefef anoreffa, olepin, corn, potato reflower, etc.
  • a cDNA library was constructed from 5 g of fresh petals of a yellow butterfly, Butterfly Yellow I, as described in a paper (Science 290, 1163 (2000)).
  • the library obtained is 1.6 X 10 5 pi aque forming unit power.
  • the GT used for the probe was UDP-glucose: anthocyanidin 3-dalcoside glycosyltransferase (3GGT) derived from morning glory (JP-A-2003-289884), and 3GT derived from petunia (Plant Mol. Biol. 48, 401, (2002)). ), 5GT from Verbena (J. Biol. Chem. 274, 7405 (1999)), Scutellaria GT (SBGT, Planta 210,1006 (2000)), UDP-glucose from gentian: anthocyanin 3, 5 types of monosaccharide transferase (3 'GT) (Plant Physiol. 132, 1652, (2003)) sequences. For each GT, one set of oligonucleotides was synthesized so that the sequence of the conserved region could be amplified. The sequences of these oligonucleotides are shown in SEQ ID NOs: 3 to L2.
  • SEQ ID NO: 3 5'-GAA ATG GTC GGA TTG GCT GGG-3 '
  • SEQ ID NO: 4 5-ACC TCC ACC CCA ACT TTC AGG-3 '
  • SEQ ID NO: 5 5-GAT GCA TAA TTT GGC TAG AAA AGC-3,
  • SEQ ID NO: 6 5-CCA ATT TGC CAA ACA CTT TCC-3 '
  • SEQ ID NO: 7 5-TGC CTC GAA TGG TTG AGC ACG-3 '
  • SEQ ID NO: 8 5-CTC TCA CTC TCA CAC CCG-3 '
  • SEQ ID NO: 9 5-CAC GAA TGC TTA GCA TGG CTC-3 '.
  • SEQ ID NO: 10 5-CTT ATT GCC CAC TGA AAC CCC-3 ' Lindow 3 'GT
  • Tori system IJ number 11 5, -TGT CTG AAT TGG CTT GAT TCC-1 3,
  • Probes were labeled by PCR using the nonradioisotope DIG-nucleic acid detection system (Roche Diagnostics) according to the conditions recommended by the manufacturer. At this time, a plasmid containing 1 ng of each cDNA was used as ⁇ type, and 100 ng of each gene-specific oligonucleotide described above was used as a primer. The reaction consisting of 1 minute at 55 ° C and 2 minutes at 72 ° C was defined as one cycle, and this was performed for 25 cycles. Using a mixture of equal amounts of PCR amplification products of each gene as a hybridization probe, the cDNA library derived from Kingfisher described in Example 1 was screened.
  • Hybridization was performed at 37 ° C in 5XSSC containing 30% formamide and 1% SDS, and filter washing was performed at 55 ° C for 30 minutes using 5x SSC, 1% SDS.
  • Positive signal detection by screening was performed using the nonradioisotope DIG-nucleic acid detection system (Roche Diagnostics) according to the method recommended by the manufacturer. Approximately 300,000 plaques were screened, and finally clones containing 10 full-length glycosyltransferase genes were obtained, which were designated as pSPB264, 1621, 1620, 1622, 1610, 1609, 1617, 1615, 660, 658. .
  • PCR solutions for Ncol site introduced overlapping the start Mechionin (25 ⁇ 1) is the respective GT c DNA and ⁇
  • the primers from the 3 'side to the 5' call J consist of 0.2 pmol / ⁇ 1 each, lx ExTaq buffer (Takara), 0.2 mM dNTPs, and 1.25 U of ExTaq polymerase.
  • the reaction was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by a reaction at 94 ° C, 1 minute, 55 ° C, 1 minute, 72 ° C, 2 minutes for 28 cycles, and finally at 72 ° C for 5 minutes.
  • the obtained PCR product was subcloned into pCR2.1 T0P0 vector (INVITROGEN) by the method recommended by the manufacturer.
  • the DNA sequence of the amplified DNA fragment was analyzed, and after confirming that there was no error due to PCR, the DNA fragment was introduced into Escherichia coli expression vector (pQE6QIAGEN).
  • cDNA SEQ ID NO: 20
  • 1617BamHINcoI-FW SEQ ID NO: 24
  • 1617XhoIKpnI-RV Toshimi U number: 25
  • PCR was performed using the primers, and an Ncol site overlapping the initiation methionine site and a Kpnl recognition sequence were introduced 3 'to the termination codon.
  • the amplified DNA fragment was subcloned into pCR2.1 T0P0 vector.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D -thiogalactopyranoside
  • the cells were suspended in 10 ml of a buffer solution (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 30 mM NaCI), and disrupted by sonication with S0NIFIER 250 (BRANSON), and then disrupted at 15,000 rpm for 10 minutes. After centrifugation at 4 ° C, the obtained supernatant was used as a crude enzyme solution and used for the following activity measurement.
  • a buffer solution (30 mM Tris-HCl pH 7.5, 30 mM NaCI)
  • T0Y0PEARL HW- 40F after TH C of (500 ⁇ g / ml ethanol solution) was loaded with diluted with H 2 0 in 1 ml, washing As a result, substrate THC immobilized on the resin was obtained.
  • 200 ⁇ l of the crude enzyme solution obtained in 3-1 and 5 mM UDP-glucose ⁇ were added, and reacted at 30 ° C. for 1 hour.
  • the precipitated resin is washed with water, suspended in 300 ⁇ l of 50% acetonitrile containing 0.1% TFA (Trifluoroacetic acid), and flavonoids are removed by ultrasonication. Released. After centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C, the resulting supernatant was filtered to remove insolubles using a filter (pore size: 0.45 mm, 4 mm Millex-LH, Millipore). Was analyzed by liquid high performance chromatography (hereinafter HPLC). Chalcone and its glycosides The body analysis conditions are as follows.
  • the THC glycoside produced by the expression product of PSPB1642 was a THC2 'glycoside. Therefore, it was considered that the cDNA expressed by pSPB1642, that is, the pSPB1617 cDNA, encodes a protein having 2 'CGT activity.
  • Example 2 Approximately 300,000 clones of the cDNA library of yellow quince flower petals were screened again using the full length of PSPB1617 cDNA as a probe. The method described in Example 2 was used for probing by PCR using primers 1617-F (SEQ ID NO: 26) and 1617-R (SEQ ID NO: 27). The same was done. Screening and nucleotide sequence analysis methods are the same as in Example 2.
  • SEQ ID NO: 26 5'-ATG GGA GAA GAA TAC AAG AAA ACA-3 '
  • SEQ ID NO: 27 5'-TAA AAT TTG GTA GTT AAA CCG ATG TA-3 'As a result, five new GT genes, pSPB1721, 1724, 1723, 1719, 1
  • pSPB1725 cDNA contained a 1374 bp (excluding stop codon) translation region coding for a protein consisting of 457 amino acids, a molecular weight of 50.8 kDa and an isoelectric point of 6.82.
  • SEQ ID NO: 2 Comparison of the amino acid sequence encoded by pSPB1725 cDNA (SEQ ID NO: 2) with the previously reported amino acid sequence of GT revealed that the GT derived from Livingstone Daisy (Plant J. 19, 509 (1999) )) And 14%, perilla-derived 5GT and 18%, perilla-derived 3GT and 18%, gentian 3'GT and 23%, and the protein encoded by pSPB1617 used as a probe. It showed only 31% identity with the amino acid sequence.
  • the software used in the homologous analysis was ClustalW contained in MacVector ver.6.5.3 (Oxford Molecule). The conditions were Matrix Blosum 30, ketuple: l, Gap penalty: 3 ⁇ Topdiagonals: 5 , Windows Size: 5.
  • Example 4 With respect to the five types of cDNAs obtained in Example 4, measurement of the enzyme activity of the protein encoded by each cDNA was examined using an E. coli expression system. The construction of expression vector, expression method, and activity measurement method are the same as in Example 3. For example, for pSPB1725, Ncol is placed on the 5, side of the start codon. In order to introduce a recognition sequence, a PCR reaction was performed using the following two primers, 1725-NcoI (SEQ ID NO: 32) and 1725-KpnI (SEQ ID NO: 33).
  • the reaction was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by a reaction at 94 ° C, 1 minute, 55 ° C, 1 minute, 72 ° C, 2 minutes for 28 cycles, and finally at 72 ° C for 7 minutes.
  • the obtained PCR product was subcloned into pCR2.1 T0P0 vector (INVITR0GEN) by the method recommended by the manufacturer.
  • the approximately 1.4 Kb fragment excised from the pCR2.1 T0P0 vector by Ncol and Kpnl treatment was ligated to the Ncol and Kpnl sites of pQE61 (QIAGEN), and the E. coli expression vector was ligated.
  • pSPB1768 was obtained. This was introduced into E. coli JM109 strain (T0Y0B0). E. coli expression vectors using PQE61 were similarly constructed for each of the other four cDNAs, and introduced into JM109.
  • Example 5-1 The Escherichia coli transformant obtained in Example 5-1 was cultured under the same conditions as in Example 3, and the activity of the protein encoded by each cDNA was measured. As a result, a peak thought to be a THC glycoside was detected in a reaction product of THC with a crude enzyme solution of E. coli containing PSPB1768. In order to identify this THC glycoside in more detail, HPLC analysis was performed again under the conditions described below for separating the THC2 'glycoside and the THC4' glycoside.
  • THC elutes at a retention time of 26.7 minutes
  • THC2 'glycoside elutes at 19.8 minutes
  • THC 4' glycoside elutes at 20.6 minutes.
  • the THC glycoside found in the reaction mixture between the Escherichia coli extract and THC expressing pSPB1768 was eluted at 20.6 minutes in the analysis under this condition, and is considered to be a THC 4'-position glycoside.
  • the product eluted at 15.5 minutes is the naringenin 7-position glycoside generated by the THC 4'-position glycoside generated by 4 'CGT coded by PSPB1725 and closed after glycosylation. It is considered to be a naringenin 7-position glycoside generated by the action of 4, CGT on naringenin generated by THC ring closure.
  • Example 6 Expression analysis of 4 'CGT gene in goldfish petals
  • Distribution system IJ number 35 5 '-tgt tgc tgt taa cga tec at-3'
  • Distribution system 'J number 36 5' -age tct tec acc tct cca-3 '
  • PBE2113-GUS Plant Cell Physiol. 37, 45 (1996) was digested with SnaBI and religated to remove the omega sequence, and the resulting plasmid was designated as pUE6.
  • pUCAP van Enge 1 en et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995 was digested with Asc I, blunt-ended, and the plasmid into which Pac I linker was inserted was used as pUCPP.
  • E1 2 35S port of pUE6 The fragment from the motor to the NOS terminator was inserted into Hind III and EcoRI sites of pUCPP to obtain pSPB540.
  • PSFL203 is the Kuta one base to PUCPP, those having 4 'CGT expression cassette controlled by E1 2 35S promoter and N0S terminators one coater.
  • PSPB251 The AS expression construct obtained by ligating pBINPLUS (van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995) with the Mac I promoter, pSPB251, the excised AS cDNA fragment, and the MAS terminator was designated as pSPB1624. .
  • PSFL203 described in Pacl in
  • a chalcone glycosyltransferase gene expression cassette were inserted into a Pacl site of P SPB1624 7-2 described.
  • the obtained construct was designated as PSFL201.
  • pSF L201 is designed to constitutively express the 4 'CGT gene and the AS gene when introduced into plant cells.
  • Traniform dihydroflavonol reductase (DFR) cDNA was obtained as described in the paper (Plant Science 153, 33, 2000).
  • the plasmid in which the trainer DFR cDNA was linked to the vector pBluescriptll SK- was designated as pTDFlO. This was designated as type III, and the M13 reverse primer (SEQ ID NO: 39) derived from the vector sequence and the trainer DFRc DNA sequence were used.
  • PCR was performed as described in Example 3 using ThDFR-NcoI (SEQ ID NO: 40), a primer into which an NcoI recognition site was introduced by base substitution.
  • the obtained 0.75 kb fragment was cloned into pCR2.1-T0P0 (invitrogen), the nucleotide sequence was confirmed, and then 0.75 kb of trainer DFR cDNA was obtained using Sacl and Ncol. The sequence was cut out.
  • pTDFlO was digested with BamHI and Ncol, and a fragment containing l.lkb was recovered from the 5, 5 end of the tren- ial DFR cDNA.
  • pUCAP described in 7-1 was digested with PacI, blunt-ended, and the plasmid into which Ascl linker was inserted was defined as pUCAA.
  • An Xhol linker was inserted upstream of the NOS terminator of pUE6 described in 7-1.
  • the plus mi de a consisting E1 2 35S promoter-vector N0S terminator one obtained by digestion with BamHI and Xho l fragment and 7-2 according LpSPB211 was obtained by ligating the AS cDNA fragment excised with PSPB215, BamHI and Xhol.
  • the AS expression cassette was cut out from PSPB211 using Hindi II and EcoRI, and inserted into Hindlll and EcoRI sites of pBINPLUS.
  • the 4 'CGT expression cassette obtained by Pacl-cutting pSFL203 described in 71 was inserted into the plasmid Pacl site obtained in this way, and the expression cassettes of 4, CGT and AS were inserted. to obtain a P SFL304 linked in tandem. Furthermore, the Transcription DFR double-stranded RNA transcription cassette described in 8-1 was inserted into the Ascl site of pSFL304 to obtain pSFL307. In other words, pSFL307 has three cassettes for the expression of CGT and AS and the suppression of DFR gene expression in trainers.
  • Plasmid PSFL 313 obtained Te This good Unishi, when introduced into plants, and transferred under the control of the E1 2 35S promoter, the double-stranded RNA derived from the F3H cDNA sequence of bets Renia, RNAi method It suppresses F3H gene expression in trainers.
  • pSFL308 has four cassettes for the expression of CGT and AS, and for the suppression of F3H gene expression in trainers.
  • PSFL201, pSFL307 and pSFL308 described in Examples 7-9 were introduced into a trainer (variety Summer Wave Blue (Suntory Flowers Co., Ltd.)) by a known method.
  • the method of transformation was according to the method described in Mol. Breeding. 6, 239, (2000). Individuals exhibiting selective tolerance were selected and their flower colors were observed.
  • flower color change was observed in the 22 strains as compared to the host, and yellowish blue or yellowish was observed. Showed gray.
  • Detection was performed using absorbance at 360 and 400 nm, and absorption spectrum at 250-500 nm using PDA detector SPD-M10AVP (Shimadzu Corporation). Under these conditions, THC 4 'glycoside, AU The 6-position glycoside elutes at retention times of 14.17 minutes and 6.19 minutes, respectively.
  • YMC-ODS-AA312 (6xl50mm, Yemushi Ichigo Co., Ltd.) was used as the column for anthocyanidin.
  • the mobile phase is acetic acid, methanol, H 2 0, respectively 60: 70: using a mixture to 270 and held for 11 minutes.
  • Detection was performed using the absorbance at 520 nm and the absorption spectrum at 400-600 nm using the PDA detector SPD-M10AVP (Shimadzu Corporation). Under these conditions, malvidin is eluted with a retention time of 9.12 minutes.
  • the PSFL201-introduced line one band was observed in any of the lines, indicating that it has one copy of the transgene.
  • the SFL307 transgenic line 1 copy was obtained for individuals with strain numbers 2 and 4, and 2 bands were observed for individuals with strain number 13, indicating that 2 copies of the 4 'CGT cDNA were introduced. Conceivable.
  • the pSFL308-introduced line one band was observed in any of the lines, indicating that it has one copy of the transgene.
  • Trenier dalyceraldehyde dehydrogenase (GAPDH) was used as the endogenous control.
  • Oligo primers include S WB GAPDH-794F (5,-GCA TTG AGC AAG ACG TTT GTG-3 ') (SEQ ID NO: 66) and SWB GAPDH-859R (5'-ACG GGA ACT GTA ACC CCA TTC-3 ' ) (Robot system U number: 67), and SWB GAPDH-816T (5'-AGC TTG TGT CGT GGT ACG-3 ') (SEQ ID NO: 68) was used as a Taq Man probe.
  • the reaction solution was adjusted to a total volume of 50 ⁇ l consisting of cDNA of the original strain or each strain of the transformant, lx Taq Man Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 OOnM each, OOnM and Taq Man probe ⁇ .
  • the reaction conditions are as follows: After reacting at 50 ° C for 2 minutes, 95 ° C, and 10 minutes, perform the reaction at 95 ° C, 15 seconds, 60 ° C, and 1 minute for 40 cycles to generate amplification products by PCR. The process was detected in real time. As a result, it was confirmed that the introduced AS and 4 'CGT were highly expressed in the PSFL201-introduced line.
  • both the transfected AS and 4 'CGT are expressed, and endogenous DFR mRNA is It was confirmed that it was suppressed to about 10% compared to the strain. In addition, it was confirmed that the introduced AS and 4 'CGT were both expressed in the pSFL308-introduced line, and that endogenous F3H mRNA was suppressed to about 5% of the original strain.
  • PHC 4 'glycosides have been identified in petals of yellow snapdragon (Sato, T., et al. Plant Sci. 160, 229-236 (2001)). It is known that a saccharide can be used as a substrate to produce bracteatin and a 6-position glycoside. To determine whether 4 'CGT could catalyze the glycosylation reaction at the 4' position of PHC, the glycosylation activity of 4 'CGT to PHC was measured. According to Example 5-2, an enzymatic reaction was carried out using recombinant 4 'CGT expressed in Escherichia coli using PHC immobilized on a resin as a substrate in the same manner as in Example 3-2.
  • the HPLC analysis conditions are as follows.
  • THC is eluted at a retention time of 38.2 minutes, 27.7 minutes for the THC 2 'glycoside, 30.0 minutes for the THC 4' glycoside, and? 11 (is eluted at 32.4 min, and the PHC 4 'glycoside is eluted at 24.3 min.
  • the PHC glycoside found in the reaction mixture between the E. coli extract expressing PSPB1768 and PHC was analyzed under these conditions. It was eluted at 24.3 minutes and identified as PHC 4 'glycoside pQE61 Crude extract and PH prepared in the same manner from Escherichia coli expressing only vector When C was reacted, no PHC glycoside was detected.
  • PHC 4 glycoside is considered to be a product generated by GT encoded in pSPB1725. From the above results, it was confirmed that GT coded for pSPB1725c DNA had an activity of glycosylating dulose to the 4'-hydroxyl group of PHC. From the above results, it was shown that 4 'CGT catalyzes not only glycosylation at the 4'-position of THC but also glycosylation at the 4'-position of PHC.
  • a 2.4 kb 4 'CGT expression cassette portion was cut out with pSFL203 force, Pacl described in Example 7, and introduced into the pBINPLUS Pacl site to obtain PSFL209.
  • pSFL209 expresses 4 'CGT alone in plants.
  • pSFL210 is intended to suppress the expression of F3H by causing the double-stranded RNA of the F3H gene of the train to be transcribed in a plant of the plant.
  • AS was cut into BamHI and Xhol sites of PSPB120 'in the patent application (P2003-293112) and BamHI and Xhol from pSPB251 described in Example 7
  • AS was cut into BamHI and Xhol sites of PSPB120 'in the patent application (P2003-293112) and BamHI and Xhol from pSPB251 described in Example 7
  • AS was cut into BamHI and Xhol sites of PSPB120 'in the patent application (P2003-293112) and BamHI and Xhol from pSPB251 described in Example 7
  • a vector pSPB211 for expressing AS in plants was obtained.
  • PSFL209, pSFL210 and pSPB211 described in Example 14-1 were introduced into a trainer (variety Summer Wave Bull I (Suntory Flowers Inc.)) by the method described in Example 10.
  • the method of transformation was according to the method described in Mol. Breeding. 6, 239, 2000. Selection marker resistant Individuals showing sex were selected.
  • RNeasy Plant Mini Kit QIAGEN
  • total RNA was extracted from the resulting transformants and the buds of the original strain, Summer Web Blue, and Super Script 1 M First- Reverse transcription was performed using Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) to synthesize cDNA. Further, RT-PCR reaction was performed using Ex Taq (TaKaRa) according to the method recommended by the manufacturer.
  • primers AmAS-INSITU-FW (5'-aattatttc ccaatgttcaaaat-3 ') (SEQ ID NO: 44) and AmAS-INSITU-RV (5, -tggag ctttaggtttgtgaaa-3') (distribution U number 45)
  • Primers KIR-INSITU-FW (5'-atgggagaagaatacaag aaac-3 ') (SEQ ID NO: 46) and KIR-INS ITU-RV (5'-tcttacgataaaac aaactca-3) ') (SEQ ID NO: 47) and primers T.
  • F3H-923F (5, -ATC ATC GAG CGG TGG TGA A-3') (SEQ ID NO: 48) for amplification of endogenous F3H mRNA.
  • F3H-1339R (5'-TGG CCG ACT AGG CAA TAC AAT-3 ') (SEQ ID NO: 49) was used as an internal standard gene.
  • the primer T. GAPDH-F87 (5'- CCC TTC TGT TTG GTG AAA AGC C-3,) (Rooster column number 50) and T.GAPDH—R692 (5'-CCT CGG ATT CCT CCT TG A TAG C-3 ') (SEQ ID NO: 51) .
  • the transgenic Kingfisher 4 ′ CGT transcript was detected in 37 of the 41 transgenic lines obtained, but the flower color change was observed in any of the lines.
  • the PSFL210-introduced lines 37 out of the 44 obtained transformants were able to detect a significant decrease in the amount of endogenous F3'H transcript, and these lines were white. It showed flower color or mixed color of purple and white.
  • the PSPB211-introduced line among the 41 transformants obtained, it was confirmed that the introduced AS was expressed in 31 lines, and flower color change was observed in all lines. Did not.
  • the PSFL209- and pSPB211-introduced lines were subjected to pigment analysis for lines in which the transcript of the introduced gene was detected, and the PSFL210-introduced line was for a line in which the flower color was white.
  • Petals of Summer Web Blue and each transformant were infiltrated with 50% acetonitrile containing 9.1% trifluoracetic acid (TFA), flavonoids were extracted, and then analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). AU6 glycoside and anthocyanidin were analyzed. Anthocyanidin analysis was performed as described in Example 10.
  • the HPLC conditions are as follows.
  • Detection was performed by measuring the absorbance at 360 and 400 nm, and the absorption spectrum at 250-500 nm by the PDA detector SPD-M10AVP (Shimadzu Corporation). Under these conditions, THC 4 'glycoside and AU 6 glycoside preparations are eluted at retention times of 14.17 minutes and 6.19 minutes, respectively.
  • YMC-0DS-AA312 610 mm, YMC Corporation was used as the column for anthocyanidin.
  • the mobile phase is acetic acid, main Tano Lumpur, the H 2 0, respectively 60: 70: using a mixture to 270 and held for 11 minutes.
  • Detection was performed by measuring the absorbance at 520 nm and the absorption spectrum at 400-600 nm using the PDA detector SPD-M10AVP (Shimadzu Corporation). Under these conditions, malvidin elutes at a retention time of 9.12 minutes.
  • chalcone glycosides or aurons are not synthesized in plants only by suppressing F3H expression and AS overexpression.
  • auron was synthesized by co-expression of GT and AS. It was found that overexpression of 4 ′ CGT alone can accumulate chalcone 4′-side glycosides, which is useful for changing flower color.
  • a cDNA library was prepared using RNA extracted from the buds of linaria (Bialaria bipartita) and flower petals of flowering flowers.
  • a library of 8.OxlO 5 pfu / ml was obtained from bud-derived RNA, while a cDNA library of 1.OxlO 6 pfu / ml was obtained from cDNA using flowering petals.
  • the amino acid sequence encoded by the cDNA of pSFL409 had a high homology with that of chalcone 4 'glycosyltransferase of Kingfisher.
  • the amino acid sequence encoded by pSFL409 cDNA was an incomplete cDNA lacking about 10 bp from the starting methionine, when compared to the chalcone 4'-glycosyltransferase cDNA of Kingfisher. Therefore, using the Gene Racer RACE kit (Invitrogen), 5, the upstream cDNA fragment containing the estimated starting methionine was amplified by the RACE method, and this was amplified into the pCRII-T0P0 vector. The cloned one was named pSFL417. The full-length linear cDNA showed 65% sequence identity at the amino acid level with goldfish 4'-glucosyltransferase.
  • Example 16 Expression of Lina cDNA in Escherichia coli and Measurement of Activity
  • the full-length lina cDNA was introduced into the Ncol site and Kpnl site of the E. coli expression vector PQE61, and the E. coli expression system was used to convert this lina cDNA to The activity of the encoded protein was analyzed.
  • PSFL417 was used as type I, and 417-Ncol primer (CCCATATATAGCCATGGAAGATACCATCG) (Tori ij No. 52) and 409-Eco RI (TAGTGTTGTGGAGTCGGGGGATTTCG) (SEQ ID NO: 53) were used.
  • the PCR was performed.

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Abstract

例えば、配列番号：２または配列番号70に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子を提供する。この4’CGT遺伝子とAS遺伝子を、本来オーロン類合成能のない植物において共発現することにより、オーロン類を蓄積することに成功し、花色が黄色味を帯びた色に変化した。さらに、両遺伝子の発現に加えて、宿主植物自身のフラボノイド色素合成系を制御することで、より鮮明な黄色の花を得ることができた。

Description

明 細 書
フラボノィ ド合成系の制御による黄色の花の作製方法
技術分野
本発明はカルコン類に糖を転移する活性を有するタンパク質をコ 一ドする遺伝子、 および当該遺伝子を利用して花色が変換された植 物に関するものである。 更に詳しく は、 カルコン類の 4' 位配糖体 を合成する活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子、 好ま しく はゴマノハグサ科由来の、 よ り好ましく はキンギヨ ソゥあるいはリ ナリ ア由来のカルコン類の 4' 位配糖体を合成する活性を有するタ ンパク質をコー ドする遺伝子、 及びこれらの遺伝子とォ一レゥシジ ン合成酵素 （以下、 ASという） 遺伝子を単独または同時に発現させ カルコン類またはオーロ ン類を蓄積させるこ とによ り花の色を改変 する手法、 好ましく は黄色く改変する手法に関するものである。
背景技術
花色は人が花卉を鑑賞あるいは購入する際に重要な形質であり、 古く から様々な色の花が育種されてきた。 単一の種ですベての色の 花をもつ場合はむしろ稀であるが、 これは花色と して発現する色素 の生合成が遺伝的に規定されているこ とによる。 交配育種では利用 できる遺伝子資源が交配可能な近縁種に限定されているため、 交配 によって目的の種においてすベての色の花を作るこ とは実質的に不 可能であった。 最近になって、 遺伝子組換え技術を利用して、 花色 素を合成する遺伝子をある植物から取得し、 当該遺伝子を別の種で 発現するこ とによ り花の色を改変するこ とが可能となった（Plant C ell Physiol. 39,1119 (1998)、 Curr. Opin. Biotechnol. 12, 155 (2001))。
花の色のう ち、 橙、 赤、 紫、 青は主にアン トシァニンと総称され るフラボノイ ドに由来する。 黄色は、 カ ロチノイ ド、 ベタ レイ ンと いったフラボノィ ド以外の化合物に由来するこ とが多いが、 一部の 植物種の黄色はフラボノイ ドに由来する。 たとえば、 黄色カーネー シ ヨ ンには 4，2' ,4' ,6' - テ ト ラ ヒ ドロ キシカルコ ン （以下 THC) の 2' 位配糖体が花弁中に存在するこ とが知られている （Phytochem is try 5,111 (1996)) 。 また、 キンギヨ ソゥ、 リ ナリ アには THCの 4 ' 位配糖体が存在する。
カルコン類と しては、 THCのほか、 ブティ ン、 イ ソ リ クイチゲニ ン等及びこれらの誘導体の配糖体が知られており、 カーネーショ ン 、 アサガオ、 ボタン、 アスター、 ムギワラギク、 二チニチソゥ、 シ ク ラメ ン、 ペチュニアは TH キンギヨ ソゥゃスターチスは 3，4, 2'
，4， ，6， ^ンタ ヒ ドロ キシカルコ ン （PHC) 、 コスモス、 キクイ モはブティ ン、 ダリ ァはブティ ンおよびィ ソ リ クイチゲニンをァグ リ コンとする配糖体を含んでいる。 また、 キンギヨ ソゥ、 リナリ ア 、 アサガオなどの限られた種にはオーレゥシジン（以下 AU)、 ブラ ッ クテアチンなどのォ一口 ン類と呼ばれる黄色の花色素が存在する。 ォ一口 ンの吸収極大は 399nmから 403nmであるのに対し、 カノレコン の吸収極大は 372nmから 382nraであるから、 両者の色調は異な り、 蛍 光のためォ一口ンのほう が鮮やかな黄色を呈する （バイオホルティ
1 49-57 (1990) 誠文堂新光社） 。 一般にカルコン類、 ォ一口 ン類、 アン トシァニンは植物細胞中では配糖体と して液胞中に蓄積 する。 アン ト シァニンの生合成経路はよく研究されており、 アン ト シァニンの合成に関与する酵素やそれらをコー ドする遺伝子が知ら れ" レヽる (し omprehens 1 ve Natural Products Chemistry , vol I 、e d. Sankawa) pp713-748, Elsevier, Arasterdam( 1999) ) 。 フラボノィ ドの生合成経路は高等植物には広く存在しており、 ま た、 種間で共通している。 THCは、 3分子のマロニル CoAと 1分子のク マロイル CoAからカルコ ン合成酵素の触媒作用によ り生合成される 。 THCは薄い黄色を呈するが、 植物細胞内では、 通常カルコ ン異性 化酵素 （CHI) によ り速やかに無色のナリ ンゲニンに変換される。 また、 THCは中性付近の p Hではきわめて不安定であり、 自発的に閉 環してナリ ンゲニンに変換する。 THCが植物細胞中で安定に存在,、 すなわち黄色を安定に呈するためには、 THCの 2' 位が糖によ り修飾 され閉環できなく なるこ とが必要である。 この反応は THCの 2' 位に グルコースを転移する酵素 （UDP-グルコース ： 4，2' ，4， ,6' - テ ト ラヒ ドロキシカルコン 2， 位-糖転移酵素 以下 2' CGT) によ り 触媒される。
THC2' 位配糖体はカーネーショ ン、 シク ラメ ンなどに存在するこ とから、 2' CGTもこれらの花に存在する と予測される。 したがって 、 2' CGT遺伝子を得る事ができれば、 この酵素遺伝子を植物におい て発現し、 THC 2' 位配糖体を蓄積させ、 黄色の花を作成できる と 考 tられてレヽ 7こ (Biotechnology of Ornamental Plants , Edited by Geneve , Preece and Merkle,pp2b9-294, CAB International Wall ingford, UK (1997)) 。 また、 THC 2' 位配糖体を十分蓄積し黄色 を発色させるためには CHI遺伝子が欠損し、 THCからナリ ンゲニンへ の酵素的変換が抑制されるこ と、 さ らに明瞭な黄色の発色のために は CHI遺伝子と他にフラバノ ン 3-水酸化酵素 （以下、 F3Hという） 遺 伝子も欠損する必要があるこ とが知られていた (Plant Cell Physi ol. 43， 578 (2002)) 。
これまでにカーネーショ ンの 2' CGT遺伝子をク ローニングしたと いう報告はある (Plant Cell Physiol. 44, sl58 (2003)) がその 配列は開示されていない。 また、 カーネーショ ンから 2' CGT活性を コー ドする遺伝子を取得し、 ペチュニアで発現させ、 ペチュニア花 弁において THC 2' 位配糖体を蓄積した例もある （PCT/JP03/10500 ) 。 しかしながら、 2' CGTによって生成する THC 2' 位配糖体は、 その化学構造上、 ォ一口ン合成の前駆体となるこ とが不可能となる 。 また、 前述のよ う に THC2' 位配糖体の蓄積では、 うすい黄色の花 弁にしかならない。
THCの 2' 位の水酸基がメチル化された化合物が蓄積した場合も花 弁は淡い黄色となるこ とは知られているが、 このメチル化を触媒す る酵素やその遺伝子の実体は知られていない。 ダリ ア、 コスモスな どの黄色の品種には 6' -デォキシカルコンが含まれる。 マメ科植物 においては、 6' -デォキシカルコンは 5 -デォキシフラボノィ ドの前 駆体であり、 カルコンシンターゼ （ CHS) とカルコンリ ダクタ一ゼ (CHR) の触媒作用によ り生合成される。 ペチュニアにアルフ ァル ファの CHR遺伝子を導入したと ころ、 ブティ ンなどの 6' -デォキシ カルコン類が生成したこ とが報告されているが、 当該 CHR遺伝子を 白い花をもつペチュニアに導入した場合、 つぼみの段階ではごく薄 い黄色が見られたが、 開花時にはほとんど白であり、 産業上有用な 黄色の花を作出するに至らなかった（Plant J. 13, 259 (1998))。 前述のよ うにカルコン配糖体よ り もオーロ ンのほうが鮮やかな黄 色を呈するため、 オーロ ンを蓄積させる方法を開発できれば産業上 きわめて有用である。 オーロ ンの生合成に関わる酵素の 1つである ASとその遺伝子については既に報告されている（Science, 290， 116 3 (2000))。 この報告によれば ASは TH PHCや、 これらの配糖体を 基質と して AU、 ブラクテアチンならびにこれらの配糖体を生成する 。 しかしながら、 AS遺伝子を用いて AUやブラ ックテアチンなどのォ 一ロ ンを生物において蓄積させた報告はない。
我々は AS遺伝子を構成的プロモーターの制御下に結合したバイナ リーベク ターを構築し、 ァグロパクテリ ゥム法によ りペチュニアや ト レニァに AS遺伝子を導入したが、 オーロ ンの蓄積は認められなか つた。 一方、 アン トシァニジンの 3位の配糖化がアン トシァニンの 液胞への移行に必須である と報告されているが （Nature 375, 397 (1995)) 、 これと同様にオーロ ンの配糖化が液胞への移行シグナル と して必須である可能性が考えられる。 実際に黄色キンギヨ ソゥ花 弁に蓄積している主要なォ一口 ンは AUの 6位の配糖体である。 そ,こ で、 AUの 6位に配糖化活性を示す GT (AU6GT) を取得し （W0 00/4915 5) 、 この AU6GT遺伝子と AS遺伝子を共にペチュニアで構成的に発現 させたが、 オーロ ンの蓄積は見られなかった。
フラポノィ ドゃアン トシァニンの生合成に関与する酵素は細胞内 では細胞質か小胞体に存在する と考えられている。 これらの酵素の 働きでフラボノィ ドゃアン トシァニンは液胞の外側、 すなわち細胞 質側で合成され、 配糖化された後、 液胞に輸送される（Natural Pro duct Reports 20, 288, (2003) )。 ところが、 銳意検討の結果、 A Sは例外的に液胞内に存在するこ とを本発明者らは明らかにした。 このこ とから生体内では、 配糖化されたカルコンが液胞に輸送され 、 これを基質と して液胞内でオーロ ンが合成されるのではないかと いう着想を得た。
前述のよ うに黄色キンギヨ ソゥ花弁の液胞に蓄積する主要なォー ロ ンは AU 6位配糖体である。 AUの 6位は THCの 4' 位に対応し、 黄色 キンギヨ ソゥ花弁には THC 4' 配糖体も存在する。 これらに基づき 、 細胞質で合成された THCの 4' 位が配糖化された後、 液胞に輸送さ れ、 それを基質と して ASによって AU 6位配糖体が合成される という 一連のオーロ ン合成経路を推測するにいたった。 よって AU 6位配糖 体などのオーロ ンを異種植物で合成させるためには、 THC4' 位配糖 体を合成するこ とが必須である と考えた。 そのためには、 THCの 4' 位を配糖化する UDP-グルコース ： 4， 2' ,4' ,6' - テ トラヒ ドロキ シカルコン 4' 位糖転移酵素、 以下 4' CGT)が必要であり 、 4' CGT遺 伝子を取得する必要がある。 しかしながら、 4' CGT遺伝子は今まで にク ローニングされた報告もなく 、 4' CGTが単離された報告もない フラポノィ ドをはじめ多様な化合物の配糖化反応を触媒して配糖 体を生成する酵素は、 一般に糖転移酵素（GT)と呼ばれ、 植物は、 .基 質及び転移する糖の種類に対応した多様な分子種の GTおよびそれら をコー ドする遺伝子を持っている。 GTは通常 UDP-グルコースをグル コース供与体と して利用するので、 そのアミ ノ酸配列中に UDP -グル コースに結合するモチーフを含んでいる （Plant Physiol. 112， 44 6 (2001)) 。 このモチーフを有する GT遺伝子は、 すでにゲノ ムの全 構造が明らかになつているァラビ ドプシスには 99種あるこ とが知ら れている （J.Biol. Chem. 276, 4338, (2001)) 。
また他の植物からも、 いくつかの GTのァミ ノ酸配列と機能が解明 されている。 フラボノィ ドあるいはアン トシァニジンの 3位の水酸 基に糖を転移する反応を触媒する酵素 （UDP-グルコース ： フラボノ ィ ド 3-糖転移酵素、 以下 3GT) の遺伝子は、 シソ、 ト ウモロ コシ、 リ ン ドウ、 ブドウなどから得られている （J. Biol. Chera. 274 ， 7 405 (1999)； J.Biol. Chem. 276, 4338， (2001)) 。 また、 アン ト シァニンの 5位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素 （UDP - グルコース ： アン トシァニン 5-糖転移酵素、 以下 5GT) の遺伝子は 、 シソ、 バーべナなどから得られている（J. Biol. Chem. , 274, 74 05, (1999))。
3 GTや 5GTのァミ ノ酸配列の解析から、 同一機能を有する GTは植 物種が異なっていてもアミ ノ酸配列は類似しているこ と.、 すなわち ファ ミ リ 一を形成するこ とが知られている （J.Biol. Chem. 276, 4 338， (2001)) 。 よって、 既知の GTと同一機能を有する酵素 （オル ソ ログ） を他の植物種から得る事は、 現在の技術水準からすれば困 難ではない。 たとえば、 ペチュニアの 5GT遺伝子は、 シソの 5GT遺伝 子を用いてク ロ一ニングされた （Plant Mol Biol. 48, 401 (2002) . ) 。 しかしながら、 同一の機能を有する酵素が全く得られていな い新規 GT遺伝子の取得には多大の試行錯誤と困難が伴う。
前述のよ う に全ゲノム構造が明らかになつているァラビ ドプシス であるが、 その花弁は白く 、 カルコ ン 4' 位配糖体の蓄積は報告さ れていない。 したがって、 ァラビ ドプシスの GT遺伝子の情報を利用 して 4' CGT遺伝子のク ローユングを行う こ とはできない。 また、 力 一ネーシヨ ンから 2' CGTが単離 （PCT/JP03八 0500) されている力 S、 4' CGT遺伝子と 2' CGTの相同性が高いこ とは必ずしも期待できない 。 なぜならば、 基質が共通であっても糖を付加する位置が異なれば 、 それぞれの GTの生化学的および分子生物学的特性は大き く異なる 可能性が考えられるからである。 これは、 3GTと 5GTが別の GTフア ミ リーに属するこ とによつても支持される。 また、 ベタ二ジンの 5GT と 6GTは基質が共通にも関わらず、 ァミ ノ酸同一性は 19%しかない こ とが報告されている （Planta 214, 492 (2002)) 。
事実、 共通のアン トシァニジン骨格の 3位、 5位または 3' 位に糖 を転移する各 GTは、 GTスーパーフア ミ リーの中の異なるフア ミ リ ー に属し、 これらのフア ミ リ ー間のアミ ノ酸同一性は 20%程度に過ぎ ない （Plant Physiol. 132, 1652, (2003) , Natural Product Rep orts 20, 288， (2003)) 。 4' CGT 遺伝子のみならず、 新規の遺伝 子を取得するには一般にいくつかの方法が考えられる。 たとえば花 弁で発現しているバラの香り成分の合成に関与する酵素の遺伝子は 、 遺伝子を網羅的に配列決定し、 それらの構造、 発現様.式、 大腸菌 での発現によって同定された （Plant Cell. 14, 2325 (2002)) 。 そこで 4' CGT 遺伝子を同定するためにォ一口ンおよびカルコン 4 ， 配糖体を蓄積する黄色キンギヨ ソゥ （品種バタフライイェロー） 花弁由来の cDNAライブラ リ 一からランダムに 5000ク ローンを選 び、 これらの塩基配列を決定した。
公知の DNAデータベースを用いたホモ口ジ一検索の結果、 3種の GT 遺伝子が得られた。 そのう ち 2種は 3 GT遺伝子および前述の、 AU6GT をコー ドする遺伝子 （W0 00/49155) 、 残る 1種が新規 GT(pSPB66?と 命名）であった （配列番号 ： 13) 。 しかし、 pSPB662にコー ドされる GTは THCに対する配糖化活性を示さず、 4' CGTではないこ とが明ら かとなつた。 また、 前述のよ う に同遺伝子と AS遺伝子とを共にペチ ュユアにおいて高発現させた結果、 カルコン配糖体およびォ一口ン の生成は確認されず、 花色についても変化は認められなかった。 こ れらの結果から、 5000ク ローン程度のランダムスク リーニングによ つてはカルコン配糖化酵素遺伝子を単離できないこ とが示唆され、 4' CGT 遺伝子を取得するのは、 困難であった。
特許文献 1 PCT/JP03/10500
特許文献 2 W0 00/49155
非特許文献 1 Plant Cell Physiol. 39,1119 (1998)
非特許文献 2 Curr. Opin. Biotechnol. 12， 155 (2001) 非特許文献 3 Phytochemistry 5,111 (1996)
非特許文献 4 バイオホルティ 1 49-57 (1990) 誠文堂新光 社
非特 §午文献 5 し omprehens 1 ve Natural Products Chemistry, vo 1 I (ed. Sankawa) pp713 - 748， Elsevier, Amsterdara( 1999) 非特言午文献 6 Biotechnology of Ornamental Plant s , Edi t ed by Geneve , Preece and Merkl e , pp259-294 , CAB International Wall ingford, UK (1997) 非特許文献 7 Plant Cell Physiol. 43， 578 (2002)
非特許文献 8 Plant Cell Physiol. 44， sl58 (2003) 非特許文献 9 Plant J. 13， 259 (1998)
非特許文献 1 0 Science, 290， 1163 (2000)
非特許文献 1 1 Nature 375， 397 (1995)
非特許文献 1 2 Natural Product Reports 20, 288, (2003) 非特許文献 1 3 Plant Physiol. 112, 446 (2001)
非特許文献 1 4
Figure imgf000010_0001
非特許文献 1 5 J. Biol. Chem. 274 ， 7405 (1999)
非特許文献 1 6 Plant Mol Biol. 48, 401 (2002)
非特許文献 1 7 Planta 214, 492 (2002)
非特許文献 1 8 Plant Physiol. 132, 1652,2003 (2003) 非特許文献 1 9 Plant Cell. 14, 2325 (2002) 発明の開示
本発明は、 カルコ ン類の 4' 位の水酸基に糖を転移する活性を有 するタンパク質及びその遺伝子、 好ましく はカルコン類の 4' 位の 水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質及びその遺 伝子を提供するこ とにある。 さ らに当該 GT遺伝子を用いて花色を改 変、 好ま しく は黄色に変化させた植物体を提供するこ とにある。 前述のよ う に、 4' CGTの生化学的あるいは分子生物学的な性質は 知られておらず、 酵素が精製されたり、 その遺伝子がク ローニング されたこ と もなかった。 発明者らは、 黄色キンギヨ ソゥ （バタフラ イイエロ一） の花弁 cDNAライブラ リ 一から GTファ ミ リ 一の保存アミ ノ酸配列に対応した塩基配列を有するプローブを用いて、 当該保存 アミ ノ酸配列の塩基配列を有する GT遺伝子を十種類取得した。 さ ら に、 当該 GT遺伝子群を各々大腸菌で発現させ、 その中に、 当該大腸 菌の抽出液中にカルコ ンの 4' 位にグルコースを転移する活性、 す なわち 4' CGT活性を確認し、 ク ローン化した遺伝子が 4' CGTをコー ドすることを確認した。 この遺伝子を植物中で発現させ、 花色を改 変し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 （ 1 ) カルコン類の 4' 位に糖を転移する 活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子を提供する。
本発明はまた、 （ 2 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列を有する 前記 （ 1 ) 記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、 （ 3 ) 配列番号 1 に記載する塩基配列の一部また は全部に対して、 5 X SS 50°Cの条件下でハイブリ ダィズし、 か つカルコ ン類の 4' 位に糖を転移する活性を有する蛋白質をコー ド する前記 （ 1 ) 記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、 （ 4 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列に対して 1個又は複数個のアミ ノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミ ノ酸に よる置換によって修飾されているアミ ノ酸配列を有し、 カルコン類 の 4' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドする前記 ( 1 ) に記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、 （ 5 ) 配列番号 1 に記載する塩基配列の一部また は全部からなる DNAとス ト リ ジェ ン トな.条件下でハイブリ ダイズし 、 かつカルコン類の 4' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質 をコー ドする前記 （ 1 ) 記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、 （ 6 ) ゴマノハグサ科由来である前記 （ 1 ) 〜 （ 5 ) のいずれか 1項に記載の遺伝子を提供する。
本発明はまた、 （ 7 ) 前記 （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記载 の遺伝子を含んでなるベクターを提供する。
本発明はまた、 （ 8 ) 前記 （ 7 ) に記載のベクターによ り形質転 換された宿主細胞を提供する。 本発明はまた、 （ 9 ) 前記 （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記載 の遺伝子によってコー ドされるタンパク質を提供する。
本発明はまた、 （10) 前記 （ 7 ) に記載の宿主細胞を培養し又は 生育させ、 当該宿主細胞からカルコ ン類の 4' 位に糖を転移する活 性を有するタンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の 製造方法を提供する。
本発明はまた、 （11) 前記 （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれか 1·項に記載 の遺伝子が導入された植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有 する該植物体の子孫となる植物体、 またはそれら植物体の組織を提 供する。
本発明はまた、 （12) 前記 （11) に記載の植物体の切り花を提供 する。
本発明はまた、 （13) 前記 （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記載 の遺伝子を用いてカルユン類の 4' 位に糖を転移する方法を提供す る。
本発明はまた、 （14) 前記 （ 1 ) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記载 の遺伝子を植物体に導入 · 発現して得られる、 花色が改変された当 該植物体もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫 となる植物体を提供する。
本発明はまた、 （15) 花色が黄色味を帯びていることを特徴とす る前記 （14) に記載の植物体を提供する。
本発明はまた、 （16) 前記 （1) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記載の 遺伝子と共にオーレゥシジン合成酵素をコー ドする遺伝子を植物体 に導入、 発現させ、 花色を黄色く改変させる方法を提供する。
本発明はまた、 （17) 前記 （1) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記載の 遺伝子と共にオーレゥシジン合成酵素をコー ドする遺伝子を植物体 に導入、 発現させ、 さ らに宿主のフラボノィ ド合成系遺伝子の発現 を抑制するこ とによって花色を黄色く改変させる方法を提供する。 本発明はまた、 （18) 前記 （1) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記載の 遺伝子と共にオーレゥシジン合成酵素をコー ドする遺伝子を植物体 に導入、 発現させ、 さ らに宿主のジヒ ドロ フラボノール還元酵素遺 伝子の発現を抑制するこ とによって花色を黄色く改変させる方法を 提供する。
本発明はまた、 （19) 前記 （1) 〜 （ 6 ) のいずれか 1項に記載の 遺伝子と共にオーレゥシジン合成酵素をコー ドする遺伝子を植物体 に導入、 発現させ、 さ らに宿主のフラバノ ン 3—水酸化酵素遺伝子 の発現を抑制するこ と によって花色を黄色く改変させる方法を提供 する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 植物における典型的なフラボノイ ド合成経路を示す。 こ こに記載された酵素遺伝子の有無によ り植物種ごとに代謝経路の末 節は異なる。 たとえば、 黄色のキンギヨ ソゥ花弁においてはアン ト シァニン合成経路と共にオーロ ン合成に至る経路も存在するが、 同 じゴマノハグサ科の植物である ト レニァは、 4' CGT、 AS遺伝子を有 しないため、 オーロ ン類を合成するこ とは出来ない。 図中の略称に ついては以下参照。 CHS, カルコ ン合成酵素； CHI， カルコ ン異性化 酵素； F3H， フラバノ ン 3—水酸化酵素； DFR， ジヒ ドロフラボノ ール 4-還元酵素； ANS, アン トシァニジン合成酵素； 3GT, UDP-グノレ コース ：アン ト シァニジン 3-配糖化酵素； FLSフラボノール合成酵 素； FNS, フラボン合成酵素； F3' H, フラボノイ ド 3' -水酸化酵 素； F3' ， 5， H， フラボノイ ド 3， ， 5， -水酸化酵素； 2' CGT, UD P-グルコース： 4， 2' ,4， ,6' -テ ト ラヒ ドロキシカルコン 2， 位糖 転移酵素； 4， CGT, UDP-グルコース ： 4， 2' ，4' ,6， -テ トラヒ ド ロキシカルコ ン 4 ' 位糖転移酵素； AS , オーレオシジン合成酵素 図 2は、 図 1 の続きである。 '
図 3は、 形質転換体 ト レユアのサザンハイブリ ダイゼーショ ンの 結果を示す。 pSFL201、 pSFL307、 pSFL308導入の形質転換体 ト レ二 ァ（品種サマーウェーブブルー）葉よ り ゲノム DNAを抽出し、 Kpn l切 断後、 4 ' CGT遺伝子をプローブと したサザンハイブリ ダィゼーショ ンに供した。 各レーンの上の数字は導入遺伝子コ ンス トラク トおよ び形質転換体系統番号を記す。 SWBは宿主と して用いたサマーゥェ ーブブルーである。 Ml、 Μ2は D I Gラベルしたサイズマーカー （ロシ ュ） であり、 各バン ドのサイズを図の左右に記す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の遺伝子と しては、 例えば配列番号 2に記載したァミ ノ酸 配列をコー ドするものが挙げられる。 しかしながら、 複数個のァミ ノ酸の付加、 欠失または他のアミ ノ酸との置換によって修飾された ァミ ノ酸配列を有するタンパク質も、 もとのタンパク質と同等の酵 素活性を維持するこ とが知られている。 従って本発明は、 4' CGT活 性を保持しているタンパク質である限り、 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列に対して 1個または複数個のアミ ノ酸配列の付加、 欠失お よび/または他のアミ ノ酸との置換によって修飾されたアミ ノ酸配 列を有するタンパク質および当該タンパク質をコー ドする遺伝子も 本発明に属する。 なお、 複数個とは、 2〜30個、 好ま しく は 2〜 9 個をいう。
本発明はまた、 配列番号 1 に記載の塩基配列を有する DNAに対し 、 5xSS 50°Cといった比較的温和な条件下でハイブリ ダィズし、 かつ 4 ' CGT活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子に関するも のである。 さ らに、 配列番号 1 に記載の塩基配列を有する DNAに対 しス ト リ ンジェン トな条件でハイプリ ダイズし、 かつ 4 ' CGT活性を 有するタンパク質をコー ドする遺伝子も、 本発明の技術的範囲に属 する。 ここでいうス ト リ ンジヱン 卜な条件とは、 例えば 2 X S S C、 6 5°Cがあるが、 ハイブリ ダイゼーシ ョ ンの条件はプローブに用いる D NAの長さ及び塩基組成によつて異なるから、 この条件に限定されな レ、
上述よ う なハイプリ ダイゼーショ ンによつて選択される遺伝子と しては、 天然由来のもの、 例えば植物由来のもの、 好ましく はゴマ ノハグ科由来のもの、 さ らに好ましく はキンギヨ ソゥ、 リ ナリ ア、 ゥンラン由来の遺伝子が挙げられるが、 植物由来に限定されるもの ではない。 すなわち、 本発明の 4 ' CGT遺伝子は、 キンギヨ ソゥ、 リ ナリ ア、 ゥンラン由来の 4 ' CGT遺伝子に限定されるものではなく 、 カルコン類 4 ' 位配糖体を含む他の生物種に由来する 4 ' CGT遺伝子 であれば、 いずれでも黄色の花を育種するのに用いるこ とができる 。 4 ' CGT遺伝子を含む合成 DNAも、 植物由来の遺伝子と同様に用い るこ とができる。
また、 ハイプリ ダイゼーショ ンによって選択される遺伝子は c DNA であってもよく 、 ゲノム DNAであってもよい。
GTの保存領域の相同性を有する遺伝子は実施例に示すよ うに、 例 えばキンギヨ ソゥゃリ ナリ ア花弁から作製した c DNAライブラ リ 一を スク リ ーニングするこ とによって得られる。 また、 配列番号 2に記 載のアミ ノ酸配列が改変されたアミ ノ酸配列を有する GTをコー ドす る DNAは、 配列番号 1 に記載の塩基配列を有する DNAを用いて、 公知 の部位特定変異誘発法や P CR法を用いて合成するこ とができる。 例 えばアミ ノ酸配列を改変したレ、 DNA断片を c DNAまたはゲノム DNAの制 限酵素処理によって得、 これを铸型にして、 所望のアミ ノ酸配列の 改変に対応したプライマーを用い、 部位特異的変異誘発または P CR 法を実施し、 所望のァミ ノ酸配列の改変に対応した DNA断片を得る こ とができる。 その後、 この改変を導入した DNA断片を目的とする 酵素の他の部分をコー ドする DNA断片と連結すればよい。 このよ う な DNAを化学的に合成するこ と もできる。
あるいはまた、 短縮されたアミ ノ酸配列からなるタンパク質をコ ― ドする DNAを得るには、 例えば目的とするアミ ノ酸配列よ り長い ァミ ノ酸配列、 例えば全長ァミ ノ酸配列をコー ドする DNAを所望の 制限酵素によ り切断し、 その結果得られた DNA断片が目的とするァ ミ ノ酸配列の全体をコー ドしていない場合は、 不足部分のアミ ノ酸 配列に対応する DNA断片を合成し、 連結すればよい。
このよ うにして得られた GT遺伝子を大腸菌又は酵母での遺伝子発 現系を用いて発現させ、 当該大腸菌又は酵母の抽出液中の 4 ' CGTの 活性を測定するこ とによ り、 得られた GT遺伝子が 4 ' CGTを示すタン パク質をコー ドするこ とを確認するこ とができる。 4 ' CGTの活性は 、 例えば実施例 3に記載したよ う に、 逆相樹脂に 4 ' CGTの基質とな るカルコン類を吸着させ後、 当該逆相樹脂を GT遺伝子で形質転換し た大腸菌又は酵母の抽出液と反応させ、 生成したカルコ ン 4 ' 配糖 体を高速液体ク ロマ トグラフィー （HPLC ) で分析するこ とによ り測 定できる。
さ らに、 得られた 4 ' CGT遺伝子を適切な宿主細胞で発現させるこ とによ り、 当該遺伝子の産物である 4 ' C GTタンパク質を得るこ とが できる。 あるいはまた、 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列の全部又 は一部を有するタンパク質又はペプチ ドに対する抗体を用いて他の 生物の 4 ' CGT遺伝子を発現ク ローニングによって得るこ ともできる 本発明はまた、 4 ' CGT遺伝子を含む組換えベクター、 .特に発現べ クタ一、 及び当該ベクターによって形質転換された宿主細胞に関す るものである。 宿主と しては、 原核生物または真核生物を用いるこ とができる。 原核生物と しては細菌、 例えばェシエ リ ヒア （Escher ichia) 属に属する細菌、 例えば大腸菌 （Escherichia coli) 、 バ シルス （Bacillus) 属微生物、 例えばバシルス.スブシルス （Bacil lus subtil is) など従来公知の宿主細胞を用いるこ とができる。 真核細胞と しては、 例えば真核微生物、 好ま しく は酵母または糸 状菌が使用できる。 酵母と しては例えばサッカ ロ ミ セス .セ レビ.シ ェ (Saccharomyces cerevisiae)等のサッカ ロ ミ "^ス ( Saccharomyce s) 属酵母が挙げられ、 また糸状菌と しては、 例えばァスペルギル ス .才 リ セ (Aspergillus oryzae) 、 ァスぺノレギノレス .二カー ( Aspe rgillus niger) 等のァスぺノレギノレス （Aspergillus) 属微生物、 及 びぺニシリ ウム （Penicillium) 属微生物等が挙げられる。 さ らに 動物細胞または植物細胞も宿主細胞と して使用でき、 動物細胞と し ては、 マウス、 ハムスター、 サル、 ヒ ト等の細胞系が使用される。 さ らに昆虫細胞、 例えばカイ コ細胞、 またはカイ コの成虫それ自体 も宿主と して使用される。
本発明の発現ベク ターはそれらを導入すべき宿主の生物種に依存 したプロモーターおよびターミネーター等の発現制御領域、 及び複 製起点等を含有する。 細菌用、 特に大腸菌における発現ベクターの プロモータ—と しては、 従来公知のプロモータ—、 例えば trcプロ モータ一、 tacプロモータ一、 lacプロモーター等が使用できる。 ま た、 酵母用プロモーターと しては、 例えばダリ セルアルデヒ ド 3 リ ン酸デヒ ドロゲナーゼプロ モーター、 PH05プロモーター等が使用さ れ、 糸状菌用プロモーターと しては例えばアミ ラーゼ、 trpC等のプ 口モーターが使用できる力；、 これらのプロモーターに限定されるも のではない。 また動物細胞用プロモーターと してはウィルス性プロ モーター、 例えば SV40アー リ ープロ モーター、 SV40レー ト プロモー ター等が使用される。 発現ベクターの作製は制限酵素、 リ ガーゼ等 を用いて常法に従って行う こ とができる。 また、 発現ベクターによ る宿主細胞の形質転換も従来公知の方法に従って行う こ とができる 植物の発現べクタ一の構築は、 例えばァグロパクテリ ゥムを用い る場合には pB I 121などのバイナリ 一ベクタ一を、 パーティ クルガン を用いる場合には PUC 19などの大腸菌べクターを用いるこ とができ る。 さ らに、 当該植物の発現ベクターで形質転換された植物細胞を 例えば抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、 適切な植物ホルモン等の条件を用いて再分化させ、 4 ' CGT遺伝子を 導入した形質転換植物体を得るこ とができる。 当該形質転換植物を 栽培するこ とによ り、 開花させ、 花色が改変された植物体を得るこ とができる。
発現べクタ一によって形質転換された宿主細胞又は形質転換植物 体を培養又は栽培し、 培養物等から常法に従って、 例えば、 濾過、 遠心分離、 細胞の破碎、 ゲル濾過ク ロマ トグラフィー、 イオン交換 ク ロマ トグラフィ一等によ り 目的とする 4， CGTタンパク質を回収、 精製するこ とができる。
本発明はキンギヨ ソゥゃリ ナリ ァの 4 ' CGT遺伝子のみに限定され るものではなく 、 4 ' CGTあるいは 4 ' CGT遺伝子の起源と しては、 植 物でも動物でも微生物でも合成したものであってもよく 、 4， CGT活 性を有していれば同様に花色改変へ利用できる。 本発明はまた、 4 ' CGT遺伝子の利用に関するものであり 、 4 ' CGT遺伝子を植物体に 導入 ' 発現するこ とによ り、 花色が改変された植物体も しく はその 子孫の植物体も しく はこれらの植物の栄養増殖体又はこれら植物体 の組織も本発明の技術的範囲であり、 組織の形態と しては切り花で あってもよい。 また 4 ' CGT遺伝子のみでなく 、 4 ' CGT遺伝子に加え AS遺伝子も共に植物体へ導入、 発現させたり、 さ らに加えて、 宿主 が本来有するフラボノィ ド合成系遺伝子の発現を抑制するこ とによ つて花色が改変された植物体も しく はその子孫の植物体もしく はこ れらの植物の栄養増殖体またはこれら植物体の組織も本発明の技術 範囲であり組織の形態と しては切花であってもよい。
現在の技術水準をもってすれば、 植物に遺伝子を導入し、 その遺 伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させるこ とは可能である し 、 またアンチセンス法、 コサプレツシヨ ン法、 RNAi法などによって 目的の遺伝子の発現を抑制するこ と も可能である。 形質転換可能な 植物の例と しては、 バラ、 キク、 カーネーショ ン、 金魚草、 シク ラ メ ン、 アサガオ、 べゴニァ、 イ ンパチエンス、 ゼラニゥム、 ラン、 トルコギキヨ ウ、 フ リ ージア、 ガーベラ、 グラジオラス、 カス ミ ソ ゥ、 カランコェ、 ユリ 、 ペラノレゴニゥム、 ゼラニゥム、 ペチュニア 、 ト レニァ、 チューリ ップ、 イネ、 レンギヨ ウ、 べゴニァ、 ォォム ギ、 小麦、 ナタネ、 ポテ ト、 トマ ト、 ポプラ、 バナナ、 ユーカ リ 、 サツマィモ、 タイズ、 ァノレフ ァノレファ、 ノレ一ピン、 トウモロ コシ、 力 リ フラワーなどがあげられるがこれらに限定されるものではない 実施例
以下実施例に従って、 発明の詳細を述べる。 分子生物学的手法は と く に断らなレヽ限り、 W096/25500あるいは Molecular Cloning(Samb rook et. al. し old Spring Harbour Laboratory Press , 1989)ίこ目 [ 載されている方法に従った。
実施例 1 . 黄色キンギヨ ソゥ花弁 cDNA ライブラ リ ーの構築
黄色のキンギヨ ソゥである品種バタフライイエロ一の新鮮な花弁 5gから論文（Science 290, 1163 ( 2000 ))に記载のよ う にして cDNA ライブラ リ一を構築した。 得られたライブラ リ 一は、 1.6 X 105 pi aque forming unit力 らなってレヽた。
実施例 2 . 4， CGT遺伝子のスク リ ーニング 1
すでに開示されている GTのアミ ノ酸配列を比較し、 これらのアミ ノ酸配列の保存領域に相当する塩基配列を増幅し、 これをプローブ と して実施例 1 で述べたキンギヨ ソゥ cDNA ライブラ リーをスク リ 一ユングした。
プローブに用いた GTはアサガオ由来の UDP-グルコース ： アン トシ ァニジン 3—ダルコシ ド糖転移酵素 （3GGT) (特開 2003-289884) 、 ペチュニア由来 3GT (Plant Mol. Biol. 48， 401、 (2002)) 、 バー べナ由来 5GT (J. Biol. Chem. 274, 7405 (1999))、 コガネバナ GT( SBGT、 Planta 210,1006 (2000))、 リ ン ドウ由来の UDP-グルコース ： アン ト シァニン 3， 一糖転移酵素 （3' GT) (Plant Physiol. 132, 1652, (2003))配列の 5種である。 それぞれ GTについて、 保存された 領域の配列を増幅できるよ う に 1組のォリ ゴヌク レオチ ドを合成し た。 これらオリ ゴヌク レオチ ドの配列を配列番号 ： 3〜： L2に示す。
アサガオ 3GGT
配列番号 3 ： 5' -GAA ATG GTC GGA TTG GCT GGG-3'
配列番号 4 ： 5 -ACC TCC ACC CCA ACT TTC AGG-3'
ペチュニア 3GT
配列番号 5 ： 5 - GAT GCA TAA TTT GGC TAG AAA AGC - 3，
配列番号 6 ： 5 -CCA ATT TGC CAA ACA CTT TCC - 3'
バーべナ 5GT
配列番号 7 ： 5 - TGC CTC GAA TGG TTG AGC ACG - 3'
配列番号 8 ： 5 - CTC TCA CTC TCA CAC CCG - 3'
コガネパナ GT
配列番号 9 ： 5 - CAC GAA TGC TTA GCA TGG CTC - 3'.
配列番号 10 ： 5 - CTT ATT GCC CAC TGA AAC CCC - 3' リ ン ドウ 3' GT
酉己歹 IJ番号 11 ： 5， -TGT CTG AAT TGG CTT GAT TCC一 3，
酉己歹 |J番号 12 ： 5， -AAC CCA CAG AAA CCC CTG TTC— 3'
プローブはノ ンラジオアイ ソ トープ DIG-核酸検出システム （ロシ ュ · ダイァグノスティ ッ クス） を用いて、 製造者が推奨する条件に 従い PCRによ り ラベルした。 この際、 铸型と して 1 ngのそれぞれの c DNAを含むプラス ミ ドを用い、 プライマ一と して、 上記の各遺伝 子特異的なオリ ゴヌ ク レオチ ド 100ngを使用し、 95°C1分、 55°C1分 、 72°C 2分からなる反応を 1サイ クルと し、 これを 25サイ クル行つ た。 各遺伝子の PCR増幅産物を等量混合したものをハイブリ ダイゼ ーショ ンのプローブと して、 実施例 1 に記載のキンギヨ ソゥ由来の c DNAライブラ リ 一をスク リ ーニングした。
ハイブリ ダィゼーシ ヨ ンは、 30%ホルムアミ ド、 1 % SDSを含む 5 XSSC中、 37°Cでー晚行い、 フィルターの洗浄は 5x SSC, 1%SDSを用 いて 55°Cで 30分間行った。 スク リーニングによるポジティブシグナ ルの検出はノ ンラジオアイ ソ トープ DIG-核酸検出システム （ロ シュ • ダイァグノスティ ックス） を用い、 製造者の推奨する方法に従つ た。 約 30万プラークをスク リーニングし、 最終的に 10種類の完全長 糖転移酵素遺伝子を含むク ローンを得、 これらを pSPB264，1621,162 0，1622，1610，1609，1617, 1615,660,658と した。 DNA Sequencer mode 1 3100 (Applied Biosystems) を用い、 合成ォリ ゴヌク レオチ ドプ ライマーによるプライマーウォーキング法によってこれらの cDNA配 列を決定した。 これら cDNAのァミ ノ酸コー ド領域の塩基配列を配列 番号 14〜23に示した。
実施例 3. 大腸菌を用いたカルコン GT活性の測定
3-1 大腸菌発現べクターの構築と大腸菌における GT 発現 実施例 2で得られた 10種類の c DNAにコー ドされる GT活性を大腸菌 発現系を用いて解析した。 まず、 各 cDNAの大腸菌発現コ ンス ト ラク トを作製した。 PCR法によって各 c DNAの開始コ ドンと考えられる塩 基配列 ATGに重なる様に Ncolサイ トを導入し、 開始メチォニンから 終止コ ドンに至る領域を大腸菌発現べクタ一 pQE61(QIAGEN)の Ncol および Kpnl、 または Ncolおよび EcoRVサイ 卜に連結した。
開始メチォニンに重なる Ncolサイ ト導入のための PCR液 （25 μ 1 ) は、 各 GT c DNAを铸型と し、 開始メチォニン部位に重なる Ncol認 識配列を導入したプライマー、 及びス ト ップコ ドン付近の 3' 側か ら 5' 伺 Jに向けてのプライマー各 0.2 pmol/ μ 1 ， lx ExTaq buffer (Takara) , 0.2mM dNTPs, , ExTaq polymerase 1.25 U力 らなる 。 反 応は、 94°Cで 5分反応させた後、 94°C、 1分、 55°C、 1分、 72°C、 2分 の反応を 28サイ クル行い、 最後に 72°Cで 5分間処理した。 得られた P CR産物を pCR2.1 T0P0 vector ( INVITROGEN )に製造者が推奨する方 法でサブク ローニングした。 増幅された DNA断片の DNA配列を解析し 、 PCRによるエラーがないことを確認したのち、 大腸菌発現べクタ 一 p QE6 QIAGEN)に導入した。
例えば P SPB1617にコー ドされる cDNA (配列番号 ： 20) について は、 配列表に示した 1617BamHINcoI- FW (配列番号 ： 24) ならびに 16 17XhoIKpnI-RV (酉己歹 U番号 ： 25) の二種のプライマ一を用いて PCRを 行い、 開始メチォニン部位に重なる Ncolサイ ト と、 終始コ ドンの 3 ' 側に Kpnl認識配列を導入した。 増幅された DNA断片を pCR2.1 T0P0 vectorにサブク ローニングした。 塩基配列に PCRによるエラーがな いこ とを確認後、 Ncolと Kpnlで切り 出した DNA断片を p QE61の Ncol および Kpnlサイ 卜に連結し、 p SPB1617cDNAの大腸菌発現べクタ一 である PSPB1642を得た。 同様にして 10種類の GT cDNAの大腸菌発現 ベクタ一を構築した。
1617BamHINcoI-FW 酉己歹1 J番号 24: 5, -ggg gga tec atg get agt gag age caa ata~3
1617XhoIKpnI-RW
目 ii列番号 25: 5' - ccc etc gag ggt acc tea caa aac att at t ca c gac-3'
各発現べクタ一を大腸菌株 JM109 (TOYOBO)に導入し、 37°Cで終 濃度 20ug/mlのアンピシリ ンを含む LB培地で一晩前培養した。 前培 養液の 1 mlをアンピシリ ン 50μ g/ml, カザミ ノ酸 0.5%を含む M9培地 、 50mlに加え Α600=0· 6- 1.0に達するまで培養した後、 IPTG (Isopr opyl- β -D-thiogalactopyranoside) を終濃度 0. ImMになるよ うカロえ 、 さ らに 27°Cでー晚振と う培養し、 3000rpm，10分間、 4°Cで遠心し 、 集菌した。 菌体を 10mlの緩衝液 （30mM Tris-HCl pH7.5、 30mM Na CI) に懸濁し、 S0NIFIER 250 (BRANSON社） での超音波処理によ り 大腸菌を破砕した後、 15，000rpm, 10分、 4°Cで遠心分離を行い、 得 られた上清を粗酵素液と し、 以下の活性測定に用いた。
3-2 酵素活性の測定
H20で平衡ィ匕済みの逆ネ目樹月旨、 T0Y0PEARL HW— 40F(T0S0H) 1mlに TH C (500 μ g/mlエタ ノール溶液） を H20で希釈しながら負荷した後、 水洗するこ とによ り、 樹脂に固定された基質 THCを得た。 この樹脂 固定された THC 100 1に 3-1で得られた粗酵素液 200 μ 1および 5mM UDP-glucose ΙΟμ Ιを加え、 30°Cで 1時間反応させた。 遠心して上清 を除去後、 沈殿した樹脂を水洗し、 0.1% TFA (Trifluoroacetic a c id)を含む 50%ァセ トニ ト リル 300 μ 1 に懸濁し、 超音波処理によ り フラボノイ ドを樹脂よ り遊離した。 15,000 rpm、 5分、 4°Cで遠心 分離し、 得られた上清をフィルター （ポアサイズ 0· 45mm、 4 mm Mil lex-LH, ミ リ ポア） を用いて不溶物を除去して、 上清を液体高速ク ロマ トグラフィー（以下 HPLC)で分析した。 カルコンおよびその配糖 体の分析条件は以下の通りである。
カラムは Develosil C 30 UG— 5(4.5mm ψ xl50mm、 野 ナイ匕学）を用レヽ て、 移動相には A液と して 0.1%TFAを含む H20、 B液と して 0.1%TFA を含む 90%ァセ トニ ト リ ノレを用い、 B液 20%力、ら B液 70%の直線濃度勾 配 10分間の溶出後、 B液 70%で 5分間維持した。 流速は 0.6ml/min -、 検出は 360 nmにおける吸光度、 及び PDA検出器 SPD-M6A (島津製作所 ) による 250- 400nmの吸収スペク トルによ り行った。 この条件で > T HCは保持時間 10.7分に溶出され、 その 2' 位配糖体および 4' 位配糖 体は 8.5分に溶出されるこ とを THC及び THCの 2' 位および 4' 位配糖 体の標品を用いて確認した。
PSPB1642を発現する大腸菌の抽出液を反応させたと ところ、 基質 THCに加え、 8.5分に溶出される新たな生成物が検出された。 これら は PQE61 ベクタ一のみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽 出液および PSPB1642を発現する大腸菌の粗酵素液を煮沸した溶液を 反応させたものでは検出されなかったこ とから PSPB1642から発現さ れる GTによって生じた生成物と考えられる。 さ らに1 H NMR分析によ つて本生成物の構造を調べた。 分析には JNM— EX400 (JE0L) を用い 、 その他の分析条件は論文 （Plant Physiology 132、 1652(2003)) に記載のとおりである。 この結果、 PSPB1642の発現産物によって生 じた THC配糖体は THC2' 位配糖体であるこ とが明らかとなった。 よ つて、 p SPB1642によって発現される c DNA、 つま り pSPB1617 c DNA は 2' CGT活性を有するタンパク質をコ一 ドしている と考えられた。
実施例 4. 4' CGT遺伝子のスク リ ーニング 2
黄色キンギヨ ソゥ花弁の c DNAライブラ リ一約 30万ク ローンを p S PB1617 c DNA全長をプロ一ブと して再度スク リ ーニングした。 PCRに よるプロ一ブラべリ ングには、 1617-F (配列番号 ： 2 6 ) ならびに 1617-R (配列番号 ： 2 7 ) プライマ-を用い、 実施例 2記載の方法 と同様に行った。 スク リ ーニングと塩基配列の解析方法も実施例 2 と同様である。
1617- F
配列番号 26 ： 5' -ATG GGA GAA GAA TAC AAG AAA ACA-3'
1617 - R
配列番号 27 ： 5' -TAA AAT TTG GTA GTT AAA CCG ATG TA - 3' その結果、 新規 GT遺伝子を 5種、 pSPB1721、 1724、 1723、 1719, 1
725を得た。 それぞれの配列を配列表に示した （配列番号 ： 28〜31 及び 1 ) 。
このう ち p SPB1725 c DNAは、 457ァミ ノ酸からなる分子量 50.8kDa 、 等電点 6.82のタンパク質をコー ドする 1374bp (ス ト ップコ ドンを 除く） の翻訳領域を含んでいた。 p SPB1725 c DNAがコー ドするアミ ノ酸配列 （配列番号 ： 2 ) を、 すでに報告のある GTのアミ ノ酸配列 と比較したところリ ビングス トーンデージー由来 G T (Plant J. 1 9、 509 (1999) ) と 14%、 シソ由来 5G Tと 18%、 シソ由来 3G Tと 1 8%、 リ ン ドウの 3' GTと 23%、 プローブと して用いた p SPB1617に コ一 ドされるタンパク質のァミ ノ酸配列とは 31%の同一性しか示さ なかった。 なお、 ホモロ ジ一解析に使用したソ フ トフェアは MacVec tor ver.6.5.3 (Oxford Molecule)に含まれる ClustalWで、 条件は 、 Matrix Blosum 30、 ketuple:l、 Gap penal ty： 3Λ Topdiagonals ： 5、 Windows Size :5で行った。
実施例 5. 得られた cDNAの大腸菌における発現
5 - 1.発現べクターの構築
実施例 4で得られた 5種類の cDNAについて、 大腸菌発現系を用い 各 c DNAにコー ドされるタンパク質の酵素活性の測定を調べた。 発 現べクターの構築ならびに発現方法、 活性測定方法は実施例 3 と同 様である。 例えば p SPB1725については、 開始コ ドンの 5， 側に Ncol 認識配列を導入するために、 以下に示すプライマー 2種 1725-NcoI (配列番号 ： 3 2 ) 、 1725-KpnI (配列番号 ： 3 3 ) を用いて PCR 反応を行った。
1725-NcoI
配歹 IJ番号 32 ： 5' - CCC ATG GGA GAA GAA TAC AAG AAA - 3'
1725-KpnI
配歹' J番号 33 ： 5' -GGT ACC TAT AAA ATT TGG TAG TTA AA-3' PCR液 (25 μ 1 ) は、 p SP1725 DNA lOng, lx ExTaq buffer (Tak ara) , 0.2mM dNTPs, 1725 - NcoI、 1725 - Kpnlプライマ一各 0.2 pmol/ μ 1 , ExTaq polymerase 1.25 U力、らなる 。
反応は、 94°Cで 5分反応させた後、 94°C、 1分、 55°C、 1分、 72°C 、 2分の反応を 28サイ クル行い、 最後に 72°Cで 7分間処理した。 得ら れた PCR産物を pCR2.1 T0P0 vector ( INVITR0GEN)に製造者が推奨す る方法でサブク ローニングした。 増幅産物の塩基配列を確認したの ち、 Ncolおよび Kpnl処理によって pCR2.1 T0P0 vectorから切り 出さ れる約 1.4Kbのフラグメ ン トを pQE61 (QIAGEN) の Ncolと Kpnlサイ 卜に連結し、 大腸菌発現ベクター p SPB1768を得た。 これを大腸菌 JM109 株（T0Y0B0)に導入した。 他の 4種類の c DNAについても同様に してそれぞれ PQE61を用いた大腸菌発現べクターを構築し、 JM109に 導入した。
5-2 組換えタンパク質の大腸菌における発現と G T活性測定
実施例 5-1で得られた大腸菌形質転換株を、 実施例 3と同様の条件 で培養し、 それぞれの cDNAにコー ドされるタンパク質の活性測定を 行った。 その結果、 P SPB1768を含む大腸菌の粗酵素液と THCの反応 物中に、 THC配糖体と思われる ピークを検出した。 この THC配糖体を さ らに詳しく 同定するために、 以下に記載の THC2' 位配糖体と THC4 ' 位配糖体を分離する条件にて再度 HPLC分析を行った。 カラムは YMC - ODS - Α312 ( 6πιιη φ xl 50mm、 株式会社ヮイエムシ一）を 用いて、 移動相には A液と して 2 %酢酸を含む H2 0，B液と してメ タノ —ルを用い、 B液 15%から B液 40%の直線濃度勾配 15分間の溶出後、 B 液 40%で 5分間維持し、 さ らに B液 40%か'ら B液 62%の直線濃度勾配 10分 間の溶出の後、 B液 62%で 2分間維持した。 流速は 1. 0 m l /m i n.で行つ た。 検出は 360 nmにおける吸光度、 及び PDA検出器 SPD- M6A (島津製 作所） による 250 - 400nmの吸収スペク トルによ り行った。
この条件で、 THCは保持時間 26. 7分に溶出され、 THC2 ' 位配糖体 は 19. 8分、 THC 4 ' 位配糖体は 20. 6分に溶出される。 p SPB1768を発 現する大腸菌抽出液と THCの反応液中に見出された THC配糖体は本条 件による分析で 20. 6分に溶出されたので THC 4 ' 位配糖体である と 考えられた。 これは pQE61 ベクターのみを発現させた大腸菌から同 様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったこ と から p SPB1725にコー ドされる GTによって生じた産物と考えられる 。 以上の結果から、 p SPB1725 c DNAにコー ドされる GTは THCの 4， 位 の水酸基にグルコースを転移する活性を有するこ とが確認された。
また、 本反応液中には THC4 ' 位配糖体に加えて 15. 5分に溶出され る新たなピークが検出された。 この物質はナリ ンゲニンの吸収スぺ ク トルを示し、 ナリ ンゲニン 7位配糖体標品と保持時間が一致した 。 よってこの 15. 5分に溶出された生成物は PSPB1725にコー ドされる 4 ' CGTによって生成した THC 4 ' 位配糖体が、 配糖化後に閉環して 生じたナリ ンゲニン 7位配糖体あるいは THCが閉環して生じたナリ ン ゲニンに、 4， CGTが作用して生じたナリ ンゲニン 7位配糖体と考え られる。
実施例 6 . キンギヨ ソゥ花弁における 4 ' CGT遺伝子の発現解析 RT-PCR法によって PSPB1725にコー ドされる 4 ' CGT遺伝子の黄色キ ンギヨ ソゥ花弁における発現様式を解析した。 オーロ ン類を蓄積す る黄色キンギヨ ソゥ （バタフライイェロー品種） の花弁を成長段階 に沿って 5ステージに分離した。 若い順に、 ステージ 1(蕾花弁長 lcm 以下）， 2 (蕾か弁長 1.0— 1.5cm) ,3(蕾花弁長1.5_2.0(^)，4(花弁長 2.0-2.5cm, 開花直前）および 5(花弁長 2.5cm以上、 開花後の花弁） の 5段階と し、 ステージ 5は成熟した花弁に対応する。
分離した花弁から 1 gから RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用 いて RNAを抽出した。 得られた RNA 1 μ gを铸型と して逆転写反応を 行レヽ、 cDNAを得た。 c DNA合成（こ ίま Superscript First-Strand Synt hesis System for RT-PCR(GIBC0 BRL)を利用し、 合成条件は本シス テム製造業者が推奨する条件に従った。 得られたステージ別の c DN Aを铸型に、 実施例 5に記載の 1725- Ncol (配列番号 ： 32) および 172 5 - Kpnlプライマー （配列番号 ： 33) を用いて PCRを行った。 また、 4 ' CGT遺伝子発現量と内在遺伝子発現量とを比較するために、 内部 標準遺伝子と してキンギヨ ソゥのダリ セルアルデヒ ド -3-リ ン酸脱 水素酵素（GAPDH)遺伝子 （配列番号 ： 34) を用い （Nature 339, 46 (1989)) 、 本遺伝子増幅のために AmGAPDH- F (配列番号 ： 35) 、 AmG APDH- R (配列番号 ： 36) のプライマ—を合成した。 また、 比較対象 遺伝子と してキンギヨ ソゥの AS遺伝子増幅のために AmAS- F (配列番 号 ： 37) 、 AmAS-Rプライマ— （配列番号 ： 38) を合成した。
AmGAPDH - F
配歹 IJ番号 35 ： 5' - tgt tgc tgt taa cga tec at - 3'
AmGAPDH- R
配歹 'J番号 36 ： 5' -age tct tec acc tct cca - 3'
AmAS - F
酉己歹1 J番号 37 ： 5' -atg ttc aaa aat cct aat ate cgc— 3'
AmAS-R
酉己歹1 J番号 38 ： 5' -t ta gcc ate aag etc aat ct t gac a - 3 PCR条件は実施例 3と同様の反応組成で、 94°C、 1分、 55°C、 1分、 72°C、 2分を 12サイ クル行った。 PCR産物を 1%ァガロースゲル電気 泳動で分離した後、 常法によつて Hybond-Nナイ ロ ンメ ンブレン（ァ マシャム）にブロ ッティ ングし、 ハイブリ ダイゼーショ ンによる増 幅産物の検出を行った。 ハイプリ ダイゼーショ ン方法については前 述のノ ンラジオァイ ソ トープ DIG-核酸検出システム DIG DNA標識及 び検出キッ トを用い、 製造者の推奨する方法に従った。 プローブに は、 キンギヨ ソゥの AS、 GAPDHおよび pSPB1725にコー ドされる 4， CG Tの cDNAを用い、 実施例 2同様にして、 上記の各遺伝子特異的プライ マ— （配列番号 32, 33， 35〜38) を用いて DIGラベリ ングを行った その結果、 4' CGT遺伝子及び AS遺伝子はと もにステージ 4で発現 がピークに達し、 経時的に同様の発現パターンを示すこ とが分かつ た。 さ らに両遺伝子の発現パターンは黄色キンギョ ソゥ花弁に含ま れるカルコン 4' 位配糖体およびォ一口ン類の蓄積パターンに矛盾 しないと考えられた （Plant Sci. 160， 229 (2001) ) 。
以上の結果から PSPB1725にコー ドされる 4' CGT遺伝子は、 キンギ ョ ソゥ花弁内において AS遺伝子と同一の発現制御支配下に存在する こ とが考えられ、 両者は同一の生合成経路、 すなわちオーロ ン類の 生合成経路に関わっている と考えられる。
実施例 7 植物における 4' CGTと ASの共発現
7-1 4' CGT発現カセ ッ トの構築
PBE2113-GUS (Plant Cell Physiol. 37, 45 (1996)) を SnaBIで 消化し、 再連結するこ とによ り omega配列を除き、 得られたプラス ミ ドを pUE6と した。 一方、 pUCAP (van Enge 1 en et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995)を Asc Iで消化し、 平滑末端化後、 Pac Iリ ンカ一を挿入したプラス ミ ドを pUCPPと した。 pUE6の E1235Sプ口 モーターから NOSターミネ一ターまでを有する断片を、 pUCPPの Hind IIIと EcoRIサイ トに挿入し pSPB540を得た。 pSPB540の GUS遺伝子部 分を PSPB1725から切り 出される 4' CGT cDNA断片に置換し得られた プラス ミ ドを PSFL203と した。 すなわち、 pSFL203は pUCPPをべクタ 一と し、 E1235Sプロ モーターと N0Sターミネ一ターで制御される 4' CGT発現カセッ トを有するものである。
7-2 AS発現カセッ トの構窠
キンギヨ ソゥ由来の AS cDNA (Science 290, 1163， (2000) ) 力 SpBluescript II SK ベクター（ St ratagene )の EcoRIと Xho Iサイ 卜に挿入したプラス ミ ドを PSPB251と した。 pBINPLUS (van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290， 1995)に Mac Iプロモー ター、 pSPB251力、ら切り出した AS cDNA断片、 MASターミネ一ターを 連結した AS発現コンス ト ラク トを pSPB1624と した。
7-3 4' CGTと ASの共発現コ ンス ト ラ ク トの作製
7 - 1に記載の PSFL203を Paclで切断し、 カルコン配糖化酵素遺伝子 発現カセッ トを切り 出し、 これを 7- 2記載の PSPB1624の Paclサイ ト に挿入した。 得られたコ ンス トラク トを PSFL201と した。 よつて pSF L201は植物細胞に導入された場合、 4' CGT遺伝子と AS遺伝子が構成 的に発現するよ う に設計されている。
実施例 8 植物における 4 ' CGTと ASの共発現ならびに ト レニァの D FRの抑制
8- 1ト レニァ由来の DFR遺伝子発現抑制カセッ トの構築
ト レニァのジヒ ドロ フラボノール還元酵素 （DFR) cDNAについて は論文（Plant Science 153, 33， 2000)に記載のよ う にして取得した 。 ト レニァ DFR cDNAがべクタ一 pBluescriptll SK- と連結したプラ ス ミ ドを pTDFlOと した。 これを铸型と し、 ベクター配列に由来する M13リ バースプライマー （配列番号 39) と ト レニァ DFRc DNA配列に 塩基置換で Nco l認識部位を導入したプライマ— ThDFR-Nc o I (配列番 号 40 )を用いて、 実施例 3に記載のよ う にして PCRを行った。 得られ た約 0. 75kbのフラグメ ン トを pCR2. 1-T0P0 (イ ンビ ト ロ ジェン） に ク ローニングし、 塩基配列を確認したのち、 Sac lと Nco lで 0. 75kbの 卜 レニァ DFR cDNA配列を切り 出した。
また pTDFlOを BamH Iと Nco lで切断し、 卜 レニァ DFR cDNAの 5， 末 端から l. lkbを含むフラグメ ン トを回収した。 一方、 7-1記載の pUCA Pを Pac lで消化し、 平滑末端化後、 As c lリ ンカ一を挿入したプラス ミ ドを pUCAAと した。 この pUCAAの Hind l l lと EcoR Iサイ 卜に、 pUE6力、 ら切り 出した E12 35Sプロモータ GUS〜N0Sタ一ミネ一ターに至る フラグメ ン トを挿入し、 得られたプラス ミ ドを pSPB541と した。 pSP
B541を BamHIと Sac lで切断し、 GUS遺伝子部分を除き、 こ こに、 ト レ ユア DFR cDNA由来の 0. 75kbのフラグメ ン ト とおよび 1. Ikbのフラグ メ ン トを、 両フ ラグメ ン トの Nco l部位が連結する方向に挿入した。 このよ うにして得られたプラス ミ ド pSFL314は、 植物体内の導入さ れた場合、 E12 35Sプロモーターの制御下、 ト レユアの DFR cDNA配列 に由来する二本鎖 RNAを転写し、 RNAi法によつて ト レニァの DFR遺伝 子発現を抑制するこ とができるものである。
M13リバースプライマ一
酉己列番号 39 ： 5' -AACAGCTATGACCATG-3'
ThDFR-Nco I
酉己歹 U番号 40 ： 5' -GCTTTACCATGGAGTAATGAGCTT-3'
8-2 4' CGTと ASの共発現ならびに ト レユアの DFR遺伝子発現の抑 制のためのコ ンス ト ラク トの構築
7-1記載の pUE6の N0Sタ一ミネーター上流に Xho lリ ンカーを挿入し た。 このプラス ミ ドを BamHIと Xho lで消化して得られる E12 35Sプロ モーター〜ベクタ N0Sターミネータ一からなる断片と 7- 2記載の PSPB215力、ら BamHIと Xholで切り 出した AS cDNA断片を連結 LpSPB21 1を得た。 PSPB211力 ら Hindi IIと EcoRIで AS発現カセッ トを切り 出し 、 これを pBINPLUSの Hindlllと EcoRIサイ トに挿入した。 このよ う に して得られたプラス ミ ドの Paclサイ トに、 7 1記載の pSFL203を Pacl 切断して得られる 4' CGT発現カセッ トを挿入し、 4， CGTと ASの発現 カセッ トがタンデムに連結した PSFL304を得た。 さ らに 8-1記載の ト レニァ DFR 二本鎖 RNA転写カセッ トを pSFL304の Asclサイ 卜に挿入し 、 pSFL307を得た。 つま り pSFL307は 4， CGTと ASの発現ならびに ト レ ニァの DFR遺伝子発現抑制のための 3つのカセッ トを有する。
実施例 9 植物における 4' CGTと ASの共発現ならびに ト レユアの F3 H遺伝子発現の抑制
9- 1ト レニァ由来の F3H c DNAのク ローニングと同遺伝子発現抑制 カセッ トの構築
シソから得られた F3H cDNA (Plant Mol Biol.， 35， 915 (1997) ) をプローブと して、 ト レ二ァの同酵素をコー ドする cDNAを取得し た。 すなわち、 実施例 2同様にして、 ト レニァ cDNAライブラ リ ー （ Molecular Breeding, 6, 239， 2000) 約 20万のファージをスク ジ 一 ニングした結果、 配列番号 41に示す ト レユア F3H cDNAを得た。 ト レ ニァ F3Hc DNAがべクター pBluescriptll SK—と連結したプラス ミ ド を PSPB266と した。 これを铸型と し、 ベクター配列に由来する M13リ バースプライマ— （配列番号 39) と ト レユア F3Hc DNA配列に塩基置 換で Sail認識部位を挿入したプライマ— ThF3H- Sail- 1(配列番号 42) を用いて、 実施例 3同様にして PCRを行った。
得られた約 0.9kbのフラグメ ン トを pCR2.1-T0P0 (イ ンビ ト ロジェ ン） にク ローニングし、 塩基配列を確認した。 同様にして、 ト レ二 ァ F3H cDNA配列に塩基置換で Sail認識部位を挿入したプライマー Th F3H— Sail- 2 (配列番号 43)と M13リ バースプライマ—を用いて、 約 0. 75kbの DNA断片を調整し、 PCR2.1-TOPOにク ローユングし、 塩基配列 を確認した。 実施例 8- 1に記載の pSPB541を BamHIと Saclで切断し、 G US遺伝子部分を除き、 ここに pCR2.：！-ΤΟΡΟから BamHIと Sail切断で切 り出した 0· 9kbのフラグメ ン ト と、 pCR2.1-T0P0力 ら Saclと Sail切断 で切り 出した 0.7kbのフラグメ ン トを両フラグメ ン 卜の Sail部位が 連結するよ う に挿入した。 このよ うにして得られたプラスミ ド pSFL 313は、 植物体内に導入された場合、 E1235Sプロ モーターの制御下 、 ト レニァの F3H cDNA配列に由来する二本鎖 RNAを転写し、 RNAi法 によって ト レニァの F3H遺伝子発現を抑制するものである。
ThF3H-SalI-l
酉己歹 !J番^ ·42 : 5 -ttctctgtcgacgcccattgcc-3'
ThF3H-SalI-2
酉己歹1 J番^ "43 : 5 -cgccgtgtcgactcgcttgaag-j'
9-2 4' CGTと ASの共発現ならびに ト レニァの F3H遺伝子発現の抑 制のためのコ ンス トラク 卜の構築
9— 1記載の pSFL313力 ら Ascl切断 ίこよ り ト レニァ F3H RNAi力セッ ト を切り 出し、 実施例 8- 2記載の pSFL304の Asclサイ 卜に挿入し、 pSFL 308を得た。 つま り pSFL308は 4， CGTと ASの発現ならびに ト レニァ の F3H遺伝子発現抑制のための 3つのカセッ トを有する。
実施例 10. 植物における遺伝子発現と花色分析
実施例 7- 9で述べた p SFL201, p SFL307および p SFL308を公知の 方法で ト レニァ （品種サマーウェーブブルー （サン ト リ ーフラワー ズ株式会社） ） に導入した。 形質転換の方法は Mol. Breeding. 6， 239, (2000)に記載の方法にしたがった。 選択マ一力一耐性を示し た個体を選抜し、 それぞれの花色を観察した。 P SFL201導入株では 、 得られた 35系統の形質転換体のう ち、 22系統において宿主と比べ て花色変化が見られ、 黄色味を帯びた青、 も しく は黄色味を帯びた グレーを示した。
しかし、 完全に黄色になったものはなかった。 PSFL307導入株で は得られた 36系統の形質転換体のう ち、 19系統において宿主と比べ て花色変化が見られた。 さ らに、 花色が変化した 19系統のう ち 6系 統については宿主本来の青い色がほとんど混在せず、 ほぼ完全な黄 色花色を呈していた。 また p SFL308導入株では得られた 39系統の形 質転換体のう ち、 24系統において宿主と比べて花色変化が見られた 。 さ らに、 花色が変化した 24系統のう ち 17系統については宿主本来 の青い色がほとんど混在せず、 ほぼ完全な黄色花色を呈していた。 花色変化が比較的顕著であったものについて色素分析を行った。 元株および各形質転換体の花弁を 0.1% ト リ フルォロ酢酸 （TFA) を含む 50%ァセ トニ ト リルに浸潤し、 フラボノイ ドを抽出後、 高速 液体ク ロマ トグラフィー （HPLC) によ りオーレゥシジン 6位配糖体 およびアン トシァニジンの分析を行った。 アン トシァニジン分析に ついては花弁よ り抽出したフラボノィ ドを 6N HC1に溶解し、 沸騰水 中に 20分間保持するこ とによ り加水分解後、 ァミルアルコールにて フラボノィ ドを再抽出したものを分析に供した。 HPLC条件はそれぞ れ以下のとおりである。
まず AU6位配糖体の検出には、 SHIM-PACK FC- 0DSカラム（50 X 4.6m m、 島津製作所）を用い、 移動相には A液と して 0.05%TFAを含む H20 、 B液と して 0.05%TFAを含むァセ トニ ト リルを用いた。 B液 10%か ら 23%の直線濃度勾配 3分間の溶出後、 B液 23%で 17分間維持し、 さ らに B液 23%から 80%の直線濃度勾配 2分間の溶出後、 B液 80%で 3分 間維持した。 さ らに B液 80%から 10%の直線濃度勾配 2分間で溶出し た。 流速は 0.8ml/minで行った。 検出は 360、 400nmにおける吸光度 、 および PDA検出器 SPD-M10AVP (島津製作所） による 250- 500nmの吸 収スペク トルによ り行った。 本条件下で、 THC 4' 位配糖体、 AU 6位配糖体標品はそれぞれ保持時間 14.17分および 6.19分に溶出され る。
次にアン トシァニジンはカラムは YMC- ODS- A A312(6xl50mm、 株 式会社ワイェムシ一）を用いた。 移動相には酢酸、 メ タノール、 H20 をそれぞれ 60:70:270に混合したものを用い、 11分間維持した。 検 出は 520nmにおける吸光度、 および PDA検出器 SPD- M10AVP (島津製作 所） による 400- 600nmの吸収スペク トルによ り行った。 本条件下で 、 マルビジンは保持時間 9.12分に溶出される。
その結果、 p SFL201を導入した形質転換体では THC 4' 位配糖体 ならびに AU 6位配糖体と保持時間および吸収スぺク トルが一致する 生成物が、 それぞれ花弁中に 0.02%および 0.05% (花弁新鮮重量中の W ZW)生成しているこ とが確認された。 また宿主が本来含有するアン トシァニジン類も形質転換体に存在するため、 これら形質転換体で 観察された黄色がかった青またはグレーの花色は、 THC4 ' 位配糖 体ならび AU 6位配糖体と、 マルビジンなどのアン トシァニジン類が 共存したためと考えられる。
一方、 p SFL307および 308を導入した形質転換体ではォ一口 ンの 一種である AU6位配糖体のみと保持時間および吸収スぺク トルが一 致する生成物が、 と もに花弁中に 0.09% (花弁新鮮重量中の WZW)生 成しているこ とが確認された。 p SFL307または p SFL308が導入され た系統では、 宿主が本来有するアン トシァニジン類が宿主花弁に含 まれる当該アン トシァニジンの 10〜50%と著しく減少しているこ と が確認された。
実施例 11. ゲノ ミ ックサザンハイブリ ダィゼーシヨ ンによる 4' C GT遺伝子導入の確認
実施例 10で得られた形質転換体のう ち、 花弁の色素分析結果から THC 4' 位配糖体ならびに AU 6位配糖体の蓄積量が比較的多かった 系統を、 各コ ンス ト ラ ク ト導入株から 3系統ずつ選抜し、 ゲノ ミ ツ クハイブリ ダィゼーシヨ ンをおこなった。 形質転換体の葉、 約 lgか ら Phytopure Plant DNA Extraction kit ( Amersham)を用レヽ、 製造業 者推奨の方法によってゲノム DNAを抽出した。 得られたゲノム DNA各 20 gを制限酵素 Kpnlで切断し、 0.7% ァガロ ースゲル電気泳動にて 分離後、 常法にしたがって Hybond- Ν+ナイ ロ ンメ ンブレンに転写後 、 ノ ンラジオアイ ソ トープ DIG-核酸検出システムを用い、 ハイブリ ダイゼーショ ンを行った。
4' CGT遺伝子プローブの DIGラベリ ング、 ハイブリ ダィゼーショ ンならびに検出方法は実施例 6同様に製造業者推奨の方法に従った 。 ハイブリ ダィゼ一シヨ ンの結果を図 2に示す。 p SFL201、 SFL30 7、 pSFL308の制限酵素地図を考慮する とゲノ ミ ックサザンで検出さ れたバン ドの数から各形質転換体に導入された 4' CGT遺伝子コ ピー 数を推定するこ とがでぎる。
PSFL201導入系統については、 いずれの系統でも 1本のバン ドが見 られるこ とから 1コピーの導入遺伝子を有するこ とが推定される。 p SFL307導入系統については、 系統番号 2および 4の個体は 1コ ピー 、 系統番号 13の個体では 2本のバン ドが見られるこ とから 2コ ピーの 4' CGT cDNA が導入されたものと考えられる。 pSFL308導入系統に ついては、 いずれの系統でも 1本のバン ドが見られるこ とから 1コ ピ 一の導入遺伝子を有するこ とが推定される。
実施例 12 定量 RT-PCRによる導入遺伝子の発現解析
RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用いて元株および形質転換 体各系統のつぼみから total RNA を抽出し、 得られた total RNA 1 μ gよ り i>uper icr iptT M First- ¾trand Synthesis System for RT - P CR(Invitrogen)を用ぃてcDNAを合成した。 得られた cDNAのう ち 1 μ 1 をテンプレー 卜 と し、 ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems )にて ト レニァ DFRと F3Hおよび外来性遺伝子 である ASと 4' CGTの転写産物の発現定量を行った。 製造者が推奨す るソフ ト ウェア' Primer Express' にて、 各遺伝子を特異的に増幅 するよ うなオリ ゴプライマーおよび特異的にハイブリ ダィズするよ うな両末端を蛍光ラベルした Taq Man プローブを設計し反応に供し た。 ト レニァ DFRには、 配列番号 ： 54と 55のオリ ゴプライマーおよ び配列番号 ： 56の Taq Manプロ一ブを、 ト レユア F3Hには、 配列番号 ： 57と 58のォリ ゴプライマ一および配列番号 ： 59の Taq Manプ口一 ブを、 ASには配列番号 ： 60と 61のオリ ゴプライマーおよび配列番号 ： 62の Taq Manプローブを、 4 ' CGTには酉己歹 IJ番号 ： 63と 64のオリ ゴ プライマ一および配列番号 ： 65の Taq Manプローブを用いて発現定 量を行った。
ト レニァ DFR
SWB DFR-1158F
5'-AAT GGG ATG CTT CCG ACT TCT - 3' (配列番号 ： 54)
SWB DFR-1223R
5'-CAG TGG TTT CTG CCA TTG CTT - 3' (配列番号 ： 55)
SWB DFR-1180T
5， - AGG AAA AAA CAG GCT GAA AA- 3， （酉己歹 ij番号 ： 56)
ト レニァ F3H
Torenia F3H - 1035F
5 '—CAT CGA GCG GTG GTG AAT T一 3' (酉己列番号 ： 57)
Torenia F3H - 1101R
5'— CTG GCG ATG GGT TTT GAA A— 3' (酉己列番号 ： 58)
Torenia F3H-1055T
5 '-AAA CAC GAA TAG AAT GTC G - 3， （配列番号 ： 59)
S AmAS-1545F
5' - GAA GAT GAC CTT GCG GTG ATT T - 3' (配列番号 ： 60) AmAS-1638R
5'— TTG TCC TCT TCC CCT TTA TAG GTT T一 3， （酉己歹 ij番号 ： 61) AraAS-1582T
5，一 AGT TCG CCG GGA GTT TCG TGA GTC TG— 3， （酉己歹 ,J番号 ： 62) 4' CGT
AmGTcgl2-908F
5，一 GGT TGG CCC GCA TTT CA— 3， （酉己列番号 ： 63)
AmGTcgl2-966R
5，一 TAG AAA ACC CTC CGG CAG AA— 3， （酉己歹 U番号 ： 64)
AmGTcgl2-929T
5'-AGA TGG ACT TAA ATG CG - 3， （配歹 IJ番号 ： 65)
また内在性コ ン ト ロールと して、 ト レニァのダリ セルアルデヒ ド リ ン酸デヒ ドロゲナーゼ（GAPDH)を用いた。 オリ ゴプライマーには S WB GAPDH-794F (5， - GCA TTG AGC AAG ACG TTT GTG - 3') (配列番号 ： 66) と SWB GAPDH-859R (5' - ACG GGA ACT GTA ACC CCA TTC - 3') (酉己歹 U番号 ： 67) を、 Taq Manプローブには SWB GAPDH— 816T (5 '—AG C TTG TGT CGT GGT ACG- 3') (配列番号 ： 68) を用いた。
反応液は、 元株または形質転換体各系統の cDNA ， lx Taq Man Un iversal Master Mix (Applied Biosystems) ,オリ ゴブフィマ一 各 1 OOnM, Taq Manプローブ ΙΟΟηΜからなる 総体積 50 μ 1 に調整した。 反応条件は、 50°Cで 2分、 95°C、 10分反応させた後、 95°C、 15秒、 6 0°C、 1分の反応を 40サイ クル行い PCRでの増幅産物の生成過程をリ アルタイムで検出した。 その結果、 PSFL201導入系統では導入した A S， 4' CGTがと もに高発現しているこ と を確認した。 PSFL307導入系 統では導入した AS， 4' CGTがともに発現し、 内在性の DFRmRNAが元 株に比べて約 10%程度にまで抑制されているこ とが確認された。 ま た、 pSFL308導入系統においては導入した AS， 4' CGTがともに発現 し、 内在性の F3HmRNAが元株に比べて約 5%程度にまで抑制されてい るこ とが確認された。
実施例 13 4 'CGTの PHCに対する配糖化活性の測定
黄色キンギヨ ソゥ花弁内において PHC4' 位配糖体が確認されてお り (Sato, T. , et al. Plant Sci. 160, 229 - 236 (2001)) 、 AS力 S これら PHCおよび PHC4' 位配糖体を基質と してブラクテアチンおよ びブラクテアチン 6位配糖体を生成できるこ とが知られている。 4' CGTが PHCの 4' 位の配糖化反応を触媒できるかどうかを明らかにす るために、 4' CGTの PHCに対する配糖化活性を測定した。 実施例 5 - 2 にしたがって、 大腸菌で発現した組換え 4' CGTを用いて実施例 3-2 と同様の方法で樹脂に固定した PHCを基質と して、 酵素反応を行つ た。 HPLC分析条件は以下の通り である。
カラムは YMC - 0DS - A312(6mm φ xl50mm、 株式会社ヮイエムシ一）を 用いて、 移動相には A液と して 2%酢酸を含む H20、 B液と してメ タノ ールを用い、 B液 15%から B液 40%の直線濃度勾配 22分間の溶出後、 B 液 40%で 5分間維持し、 さ らに B液 40%から B液 62%の直線濃度勾配で 14 分間溶出後、 B液 62%で 2分間維持した。 流速は 1.0 ml/分で行った。 検出は 360 nmにおける吸光度、 及び PDA検出器 SPD- M10AP (島津製作 所） による 220- 400nmの吸収スぺク トルを測定するこ とによ り行つ た。 この条件で、 THCは保持時間 38.2分に溶出され、 THC2' 位配糖 体は 27.7分、 THC 4' 位配糖体は 30.0分、 ？11(は32.4分、 PHC4' 位配 糖体は 24.3分に溶出される。 PSPB1768を発現する大腸菌抽出液と P HCの反応液中に見出された PHC配糖体は、 本条件による分析で 24.3 分に溶出されたので、 PHC 4' 位配糖体である と同定した。 pQE61 ベク タ一のみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液と PH Cを反応させた場合には、 PHC配糖体は検出されなかった。 したがつ て、 PHC 4， 位配糖体は p SPB1725にコー ドされる GTによって生じた 産物である と考えられる。 以上の結果から、 p SPB1725 c DNAにコー ドされる GTは PHCの 4' 位の水酸基にダルコースを配糖化する活性を 有するこ とが確認された。 以上の結果から、 4' CGTは THCの 4， 位の 配糖化のみならず PHCの 4' 位の配糖化反応を触媒するこ とが示され た。
実施例 14 形質転換 ト レニァを用いた 4' CGTおよび ASの機能解析 14-1 コ ンス ト ラ ク トの構築
実施例 7に記載の p SFL203力、ら Paclで 2.4kbの 4' CGTの発現カセッ ト部分を切り 出し、 これを pBINPLUSの Paclサイ トに導入したものを PSFL209と した。 pSFL209は植物体内において 4' CGTを単独で発現さ せるものである。
実施例 9に記載の p SFL313力、ら Asclで 2.7kbの F3H発現抑制用力セ ッ トを切り 出し、 これを pBINPLUSの Asclサイ トに導入したものを pS FL210と した。 pSFL210は、 ト レユア植物体内において ト レエアの F3 H遺伝子の 2本鎖 RNAを転写させるこ とによ り、 F3Hの発現を抑制する こ とを意図したものである。
一方、 ASについては、 特許出願 （ P 2 0 0 3 — 2 9 3 1 2 1 ) に ある P SPB120' の BamHIと Xholサイ トに、 実施例 7に記載の pSPB251 から BamHIと Xholで切り 出した AS cDNA断片を挿入するこ とによって 、 植物体内で ASを発現するベクター p SPB211を得た。
14-2 RT-PCRによる導入遺伝子の発現解析と花色分析
実施例 14-1で述べた p SFL209, p SFL210および p SPB211を実施例 10に記載の方法で ト レニァ （品種サマーウェーブブル一 （サン ト リ —フラワーズ株式会社） ） に導入した。 形質転換の方法は Mol. Bre eding. 6, 239, 2000に記載の方法にしたがった。 選択マーカー耐 性を示した個体を選抜した。 得られた形質転換体および元株サマー ウェブブルー各系統のつぼみから RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN ) を用いて total RNA を抽出し、 得られた total RNA 1 μ gよ り Supe r Script1 M First-Strand Synthesis System for RT~PCR( Invitrog en)を用いて逆転写反応を行い、 cDNAを合成した。 さ らに Ex Taq (T aKaRa) を用いて製造者の推奨する方法によ り RT- PCR反応を実施し た。 ASの mRNAの増幅にはプライマー AmAS- INSITU- FW(5' -aattatttc ccaatgttcaaaaat-3' ) (配列番号 44) と AmAS - INSITU - RV(5， -tggag ctttaggtttgtgaaa-3' ) (配歹 U番号 45) を、 キンギヨ ソゥ 4' CGTの mRNAの増幅にはプライマー KIR - INSITU - FW(5' -atgggagaagaatacaag aaaac-3' ) (配列番号 46) と KIR- INS ITU- RV (5' -tcttacgataaaac aaactca-3' ) (配列番号 47) を、 内在性 F3Hの mRNAの増幅にはプラ イマ一 T. F3H - 923F(5， -ATC ATC GAG CGG TGG TGA A - 3' ) (配列番 号 48) と T. F3H - 1339R (5' -TGG CCG ACT AGG CAA TAC AAT - 3' ) ( 配列番号 49) を、 さ らに内部標準遺伝子と した GAPDHの mRNAの増幅 にはプライマー T. GAPDH - F87(5' - CCC TTC TGT TTG GTG AAA AGC C - 3， ) (酉己列番号 50) と T. GAPDH— R692(5' -CCT CGG ATT CCT CCT TG A TAG C-3' ) (配列番号 51) を用いた。 その結果、 PSFL209導入系 統では取得した形質転換体 41系統のう ち、 導入したキンギヨ ソゥ 4 ' CGT転写物が検出できたのは 37系統であつたが、 いずれの系統に おいても花色変化は認められなかった。 PSFL210導入系統では取得 した形質転換体 44系統のう ち内在性 F3' Hの転写物の量が有為に減 少しているこ とを検出できたのは 37系統であり、 これらの系統は白 色あるいは紫と白色の混色の花色を示した。 さ らに、 PSPB211導入 系統では取得した形質転換体 41系統のう ち導入した ASが発現してい るこ とを確認できたのは 31系統であり、 いずれの系統においても花 色変化は認められなかった。 PSFL209導入系統および pSPB211導入系統は導入した遺伝子の転写 産物が検出できた系統について、 PSFL210導入系統は花色が白色を 示した系統について色素分析を行った。 サマーウェブブルーおよび 各形質転換体の花弁を 9.1% ト リ フルォロ酢酸 （TFA) を含む 50%ァ セ トニ ト リルに浸潤し、 フラボノイ ドを抽出後、 高速液体ク ロマ ト グラフィー （HPLC) によ り AU6位配糖体およびアン トシァニジンの 分析を行った。 アン トシァニジン分析は実施例 10に記載のよ う に行 つた。 HPLC条件はそれぞれ以下のとおりである。
まず AU6位配糖体の検出には、 Shim-Pack FC- 0DSカラム（50 X 4.6m m、 島津製作所）を用い、 移動相には A液と して 0.05%TFAを含む H20 、 B液と して 0.05%TFAを含むァセ トニ ト リノレを用いた。 B液 10%力 ら 23%の直線濃度勾配 3分間の溶出後、 B液 23%で 17分間維持し、 さ らに B液 23%から 80%の直線濃度勾配 2分間の溶出後、 B液 80%で 3分 間維持した。 さ らに B液 80%から 10%の直線濃度勾配 2分間で溶出し た。 流速は 0.8ml/分で行った。 検出は、 360及び 400nmにおける吸光 度、 および PDA検出器 SPD- M10AVP (島津製作所） による 250-500nmの 吸収スペク トルの測定によ り行った。 本条件下で、 THC 4位' 配糖 体、 AU6位配糖体標品はそれぞれ保持時間 14.17分および 6.19分に溶 出される。 次にアン トシァニジンはカラムは YMC-0DS- A A312(6 1 50mm、 株式会社ヮイエムシ一）を用いた。 移動相には酢酸、 メ タノ ール、 H20をそれぞれ 60: 70: 270に混合したものを用い、 11分間維持 した。 検出は 520nmにおける吸光度、 および PDA検出器 SPD- M10AVP ( 島津製作所） による 400-600nmの吸収スぺク トルの測定によ り行つ た。 本条件下で、 マルビジンは保持時間 9.12分に溶出される。
その結果、 p SFL209導入系統では THC 4' 位配糖体と保持時間お よび吸収スぺク トルが一致する生成物が、 新鮮花弁重 *lgあたり 0, 036〜0.762rag生成しているこ とが確認された。 また宿主が本来含有 するアン トシァニジン類も存在した。
P SFL210導入系統ではァン トシァニジン量は、 宿主花弁に含アン トシァニジン量の約 10/0程度に減少しているこ とがわかった。
また PSPB211導入系統では、 宿主と比較してフラボノィ ド色素に 変化は認められなかった。 いずれの形質転換体においてもオーロ ン 類と保持時間および吸収スペク トルが一致する生成物は検出されな かった。
したがって、 F3Hの発現抑制ならびに ASの過剰発現だけではカル コン配糖体あるいはオーロ ンは植物体内で合成されないこ と、 4' C
GTと ASの共発現によ りオーロ ンが合成されるこ とが示された。 4' C GT単独の過剰発現によ り、 カルコン 4' 位配糖体を蓄積させるこ と ができ、 花色の変化に役立つこ とがわかった。
実施例 15 リナリ アからの 4， CGT c DNAのク ローニング
実施例 1と同様にして、 リ ナリ ア （L inar ia b ipar t i ta) の蕾及び 開花した花の花びらから抽出した RNAを用い、 c DNAライブラ リーを 作製した。 蕾由来の RNAから 8. OxlO5 pfu/mlのライブラ リ ーが得ら れ、 一方、 開花花弁の c DNAを用いたものからは 1. OxlO6 pfu/mlの c DNAライブラ リ 一が得られた。
これら各ライブラ リ ーの約 3. OxlO5 pfuのファージ、 実施例 4に記 载のキンギヨ ソゥの p SPB1725にコー ドされる 4， CGT c DNAをプロ一 ブと してスク リーニングを行った。 プローブの標識、 ハイブリ ダィ ゼ一ショ ンとその後のメ ンブレンの洗浄、 検出方法は実施例 2 と同 様に行った。 その結果、 最終的に 19個の陽性ク ローンが得られた。 これらのう ちカルコン糖転移酵素をコ一 ドする cDNAと して期待され る長さ （約 1. 5kb) の 8個の c DNAについて塩基配列を決定したと こ ろ、 これら 8ク ローンは全て同じ配列を有しており、 最長の c DNAを 有するクローンを PSFL409と した。 この cDNAの塩基配列を配列番号 ： 69に示し、 それによ り コー ドされるアミ ノ酸配列を配列番号 ： 70 に示す。 pSFL409の c DNAにコー ドされるアミ ノ酸配列はキンギヨ ソ ゥのカルコン 4' 位糖転移酵素のものと高いホモロジ一を有するこ とが明らかとなった。 しかし、 キンギヨ ソゥのカルコン 4' 位糖転 移酵素 cDNAと比較すると、 pSFL409cDNA にコー ドされるアミ ノ酸配 列は開始メチォニンから 10bp程度を欠く不完全長 cDNAであった。 そ こで、 Gene Racer RACE キッ 卜 （ Invi trogen社） を用レヽ、 5， RACE 法にて推定開始メチォニンを含む上流の c DNAフラグメ ン トを増幅 し、 これを p CRII- T0P0ベクタ一にク ローニングしたものを pSFL417 と した。 この完全長を含むリ ナリ ア cDNAはキンギヨ ソゥ 4' 位糖転 移酵素とアミ ノ酸レベルで 65%配列同一性を示した。
実施例 16 リ ナリ ァの cDNAの大腸菌における発現と活性測定 大腸菌発現ベクター P QE61の Ncolサイ ト と Kpnlサイ トへ完全長の リ ナリ ァ cDNAを導入し、 大腸菌発現系によって本リ ナリ ァ cDNAにコ ー ドされるタンパク質の活性について解析した。 まず、 大腸菌発現 コ ンス トラク ト作製のため、 PSFL417を铸型と し、 417- Ncolプライ マー (CCCATATATAGCCATGGAAGATACCATCG) (酉己歹 ij番号 52) と 409- Eco RI (TAGTGTTGTGGAGTCGGGGGATTTCG) (配列番号 53) を用レ、 PCRを行つ た。 これによ り、 pSFL417の開始メチォニンの位置に Ncolサイ トが 挿入され、 3， 側に EcoRIサイ トが挿入された。 これを NcoI/EcoRIで 切断したものと pSFL409 c DNAを EcoRI /Kpnlで切断したものを、 大腸 菌発現ベクター P 9£61の1^01/!^01サィ トにク ローニングし、 完全 長リ ナリ ア c DNAを有する大腸菌発現用コ ンス ト ラク ト （ p SFL418 ) が得られた。
これを大腸菌 JM109に導入し、 実施例 12と同様にして組換えタン パク質の活性測定を行った。 基質に THCを用い、 p SFL418を有する 大腸菌抽出液を反応させた場合は保持時間 30.0分に THCの 4' 位配糖 体が検出された。 一方、 対照実験と して、 pQE61ベクターを有する 大腸菌抽出液を THCに反応させた場合は、 THCの 4 ' 位配糖体は全く 検出されなかった。 さ らに実施例 12にしたがって、 PHCに対する配 糖化活性を測定した。 その結果、 P SFL418を有する大腸菌抽出液を 反応させた場合には保持時間 24. 3分に PHC4 ' 位配糖体が検出された 。 一方対照実験では PHC配糖体は検出されなかった。 以上の結果か ら、 SFL418にク ローニングされたリナリ アの c DNAは 4 ' CGTをコー ドするものと考えられる。

Claims

1 . カルコン類の 4' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質 をコー ドする遺伝子。
2 . 配列番号 2又は 70に記載のアミ ノ酸配列を有する請求項 1記 載の遺伝子。
3 . 配列番号 1又は 69一一一主に記载する塩基配列の一部または全部に対 して、 5 X SS 50°Cの条件下でハイブリ ダィズし、 かつカルコン 類の 4' 位に糖を転移する活性を有のする蛋白質をコー ドする請求項. 1記載の遺伝子。
4 . 配列番号 2又は 70に記载のァミ ノ酸配列に対して 1個又は複 数個のアミ ノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミ ノ酸による置換に よって修飾されているアミ ノ酸配列を有し、 カルコン類の 4' 位に 糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドする請求項 1に記載 の遺伝子。
5 . 配列番号 1又は 69に記载する塩基配列の一部または全部から なる DNAとス ト リ ジヱン 卜な条件下でハイブリ ダイズし、 かつカル コン類の 4' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドす る請求項 1 記載の遺伝子。
6 . ゴマノハグサ科由来である請求項 1 〜 5 のいずれか 1項に記 載の遺伝子。
7 . キンギヨ ソゥ又はリ ナリ ア由来である、 請求項 6に記載の遺 伝子。
8 . 請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の遺伝子を含んでなるベ クタ一。
9 . 請求項 8 に記載のベクタ一によ り形質転換された宿主細胞。
1 0 . 請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の遺伝子によってコー ドされるタンパク質。
1 1 . 請求項 9に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、 当該宿 主細胞からカルコ ン類の 4' 位に糖を転移する活性を有するタンパ ク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製造方法。
1 2 . 請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の遺伝子が導入された 植物体もしく は当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫と なる植物体、 栄養増殖した植物、 またはそれら植物体の組織。
1 3 . 請求項 1 2に記載の植物体の切り花。
1 4 . 請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の遺伝子を用いてカル コン類の 4' 位に糖を転移する方法。
1 5 . 請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の遺伝子を植物体に導 入 · 発現して得られる、 花色が改変された当該植物体もしく は当該 植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体。
1 6 . 花色が黄色味を帯びていることを特徴とする請求項 15に記 載の植物体。
1 7 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の遺伝子と共にォ一レゥ シジン合成酵素をコー ドする遺伝子を植物体に導入、 発現させ、 花 色を黄色く改変させる方法。
1 8 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の遺伝子と共にオーレゥ シジン合成酵素をコー ドする遺伝子を植物体に導入、 発現させ、 さ らに宿主のフラボノィ ド合成系遺伝子の発現を抑制することによつ て花色を黄色く改変させる方法。
1 9 . 請求項 1〜 7のいずれ力、：！項に記載の遺伝子と共にオーレゥ シジン合成酵素をコー ドする遺伝子を植物体に導入、 発現させ、 さ らに宿主のジヒ ドロフラボノ ール還元酵素遺伝子の発現を抑制する ことによって花色を黄色く改変させる方法。
2 0 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の遺伝子と共にオーレゥ シジン合成酵素をコー ドする遺伝子を植物体に導入、 発現させ、 さ らに宿主のフラバノ ン 3—水酸化酵素遺伝子の発現を抑制するこ と によって花色を黄色く改変させる方法。
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