JP2012511916A - 変更された花部を有する植物 - Google Patents
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Abstract
Description
表1:配列識別子の要約
少なくとも70%の同一性への言及は、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100%の同一性を包含する。配列番号2、4または10のアミノ酸配列の類似性のレベルでの比較もなされ得る。それゆえ、配列番号2または4または10で記述されるアミノ酸配列と少なくとも70%の類似性を有するF3’5’H酵素またはDFRをコードする核酸分子が本明細書中で意図される。さらにまた、少なくとも70%の類似性は、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100%の類似性または同一性を包含する。
用いた大腸菌株を以下に示す:
DH5α
supE44、Δ(lacZYA−ArgF)U169、(φ80lacZΔM15)、hsdR17(rk -,mk +)、recA1、endA1、gyrA96、thi−1、relA1、deoR(Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557, 1983)。
XL1−Blue
supE44、hsdR17(rk -,mk +)、recA1、endA1、gyrA96、thi−1、relA1、lac-、[F’proAB、lacIq、lacZΔM15、Tn10(tetR)](Bullock et al, Biotechniques 5: 376, 1987)。
BL21−CodonPlus−RIL菌株
ompT hsdS(Rb−mB−)dcm+ Tetr gal endA Hte[argU ileY leuW Camr]
M15大腸菌は大腸菌K12に由来し、表現型Nals、Strs、Thi-、Ara+、Gal+、Mtl-、F-、RecA+、Uvr+、Lon+を有する。
用いた無害化アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株は、AGL0であった(Lazo et al, Bio/technology 9: 963-967, 1991)。
DNA連結
断片を、概して、メーカー推奨手順に従って、1%(w/v)アガロースゲル上で単離し、QIAEX IIゲル抽出キット(Qiagen)またはBresacleanキット(Bresatec, Australia)を用いて精製した。
制限酵素消化後のオーバーハング末端の修復
核酸からのホスホリル基の除去
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
DNAプローブの 32 P標識
プラスミド単離
DNA配列解析
植物形質転換は、国際特許出願PCT/US92/02612(参照により本明細書中に組み入れられる)または国際特許出願PCT/AU96/00296またはLu et al, Bio/Technology 9: 864-868, 1991に記載されたものと同様である。他の方法も用いられ得る。
トランスジェニック分析
色コード化
クロマトグラフィー分析
アントシアニジンの抽出
花器発育段階
段階1: 閉じた蕾、花弁は見えない。
段階2: 開きつつある花蕾:花弁の先端が見える。
段階3: ほぼ全ての花弁の先端が露出。「絵筆段階」
段階4: 茎に対して外側花弁が45°の角度。
段階5: 花全開。
実施例1:キメラF3’5’H遺伝子構築物の調製
構築物の調製
形質転換ベクターpCGP3360(AmCHS 5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’;Pet gen DFR;35S 5’:SuRB)
プラスミドpCGP3356は、pBluescript主鎖中のAmCHS 5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’からなるキメラ遺伝子を含有する。
プラスミドpCGP3357は、pCGP1988ベクター中にAmCHS 5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’からなるキメラ遺伝子を、35S 5’:SuRB選択可能マーカー遺伝子と一緒に含有する(国際特許出願PCT/AU03/01111参照)。
中間プラスミドpCGP1472(ペチュニアDFR−Aゲノムクローン)の構築
制限酵素BglIIによる消化時に、プラスミドpCGP1472から、pet genDFR遺伝子を保有する5.3 kb断片を切り離した。オーバーハング末端を修復し、断片を精製して、プラスミドpCGP3357(上記)の修復AscI末端と結紮した。テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限酵素分析により、AmCHS5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’および35S 5’:SuRB遺伝子に関してタンデム配向でのpet genDFR遺伝子の正しい挿入を確認した。その結果生じたプラスミドを、pCGP3360と名づけた。
形質転換ベクターpCGP3366は、AmCHS 5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’発現カセットおよびペチュニアゲノムDFR−A(pet genDFR)遺伝子を、CaMV35S:ds carnDFR:35S 3’発現カセットおよび35S5’:SuRB選択可能マーカー遺伝子と一緒に含有する。
プラスミドpCGP1472(上記)を鋳型として、ならびに以下のプライマーを用いて、PCRにより、180 bpのペチュニアDFR−Aイントロン1を保有する断片を増幅した:
DFRint35S F GCAT CTCGAG GGATCC TCG TGA TCC
XhoI BamHI
TGG TAT GTT TTG(配列番号5)
DFRint35S R GCAT TCTAGA AGATCT CTT CTT GTT
BglII BamHI
CTC TAC AAA ATC(配列番号6)
全長カーネーションDFR cDNAクローンの単離
約120,000 pfusのカーネーション・コルチナチャネル花弁cDNAライブラリー(その構築は、国際特許出願PCT/AU97/000124に記載されている)を、高緊縮性ハイブリダイゼーション洗浄条件下でプローブとしてEcoRI/XhoI部分カーネーションDFR断片の32P標識断片(国際特許出願PCT/AU96/00296参照)を用いて、スクリーニングした。約20の強ハイブリダイズプラークを選択し、さらに精製した。これらのうち、1つ(KCDFR#17)は、1.3 kb挿入物を含有し、そして51 bpの5’非翻訳配列を有する全長カーネーションDFR cDNAクローンを示した。プラスミドを、pCGP1547と名づけた。
プラスミドpCGP1547(上記)を鋳型として、ならびに以下のプライマーを用いて、PCRにより、〜300 bpのカーネーションDFR cDNAクローンを保有する断片を増幅した:
ds carnDFR F GCAT TCTAGA CTCGAG CGA GAA
XbaI XhoI
TGA GAT GAT AAA ACC(配列番号7)
dscarnDFR R GCAT AGATCT GGATCC GAG ATT GTT
BglII BamHI
TTC TGC G(配列番号8)
中間プラスミドpCGP3364(CaMV35S:ds CarnDFR:35S 3’)の構築
形質転換ベクターpCGP3366の構築
pCGP= 形質転換実験に用いられた形質転換ベクターのプラスミドpCGP識別番号(詳細に関しては表3を参照)
#tg= 産生されたトランスジェニックカーネーションの総数
%CC= 紫色範囲方向への花弁色のシフトを有した産生系統の総数のパーセンテージ
#HPLC= HPLCにより加水分解花弁舷部抽出物のアントシアニジンを分析した個々の系統の数。桃色から紫色範囲への花弁の色の眼に見えるシフトに基づいて、分析用花弁を選択した
%del(範囲)=トランスジェニック系統の集団に関して花弁の加水分解抽出物中に検出されたデルフィニジンの範囲(%)
Av del= トランスジェニック系統の集団に関して花弁の加水分解抽出物中に検出されたデルフィニジンの平均(%)
Delmg/gFW= トランスジェニック系統の集団に関して花弁の加水分解抽出物中に検出されたデルフィニジンの量の範囲(mg/新鮮重量1g)
RHSCC番号= トランスジェニックカーネーション系統の花からの花弁舷部の色コード。RHSCC番号の傍らの「+」は、その色が選択コードのより濃いまたはより強い色調である、ということを強調する
デルフィニジンレベル=総案とシアニジンのパーセンテージおよび花弁組織の新鮮重量1g当たりのmgで示されるHPLCにより確定されるような花弁舷部組織の加水分解抽出物中で検出されるデルフィニジンレベル
nd= 実行せず
他のカーネーション品種中への形質転換ベクターpCGP3366の導入
他の発現カセットの主鎖付加としてのバイナリーベクターpCGP3366の使用
pCGP3366バイナリーベクターへのAMT発現カセットの付加
形質転換ベクターpCGP3601(carnANS 5’:ThMT:carnANS 3’;AmCHS 5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’;Pet gen DFR;CaMV35S 5’:ds carnDFR:35S 3’;35S 5’:SuRB)
中間プラスミドpCGP3431(carnANS 5’:ThMT:carnANS 3’)の構築
形質転換ベクターpCGP3601の構築
形質転換ベクターpCGP3605(CaMV35S:ds carnDFR:35S 3’;CaMV35S:ThMT:35S 3’;Pet gen DFR;AmCHS 5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’;35S 5’:SuRB)
中間プラスミドpCGP3097(CaMV35S:ThMT:35S 3’)の構築
形質転換ベクターpCGP3605の構築
pCGP3366バイナリー構築物へのFNS発現カセットの付加
形質転換ベクターpCGP3616(CaMV35S:ds carnDFR:35S 3’;RoseCHS 5’:ThFNS:nos 3’;Pet gen DFR;AmCHS 5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’;35S 5’:SuRB)
中間プラスミドpCGP3123(RoseCHS 5’:ThFNS:nos 3’)の構築
中間プラスミドpCGP3612(RoseCHS 5’:ThFNS:nos 3’)の構築
形質転換ベクターpCGP3616の構築
形質転換ベクターpCGP3607(CaMV35S’:ds carnDFR:35S 3’;e35S 5’:ThFNS:petD8 3’;Pet gen DFR;AmCHS 5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’;35S 5’:SuRB)
形質転換ベクターpCGP3607の構築
pCGP3366への付加=AmCHS5’:BPF3’5’H#40:petD8 3’;Pet genDFR;CaMV35S:ds carnDFR:35S 3’導入遺伝子を含有するpCGP3366(図3)主鎖に付加されるエキストラ発現カセット
#Tg= 産生されたトランスジェニックカーネーション系統の総数
CC= 「色変化」−紫色範囲方向への花弁色のシフトを有した産生系統の数
Claims (27)
- 花序の改変を示す遺伝子改変植物であって、前記植物またはその子孫が少なくとも1つの非内在性フラボノイド3’,5’ヒドロキシラーゼ(F3’5’H)酵素および少なくとも1つの非内在性ジヒドロフラボノール4−レダクターゼ(DFR)酵素をコードする発現遺伝物質を含み、植物の内在性DFR遺伝子の発現を抑制する遺伝物質を発現する遺伝子改変植物。
- 前記植物またはその子孫が、非内在性S−アデノシルメチオニン:アントシアニン、3’5’メチルトランスフェラーゼ(ThMT)および/またはフラボンシンターゼ(ThFNS)をコードする発現遺伝物質をさらに含む遺伝子改変植物。
- 前記内在性DFR遺伝子を抑制する遺伝物質が、前記植物の内在性DFR遺伝子(ds植物DFR)に対応するセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列である請求項1または2記載の遺伝子改変植物。
- 前記植物がカーネーションであり、前記ds植物DFRがds carnDFRである請求項3記載の遺伝子改変植物。
- 前記カーネーションがセリースウエストパール栽培品種という背景で存在する請求項4記載の遺伝子改変植物。
- 前記花部変更が紫色(パープル)〜青藤色(バイオレット・モーヴ)の範囲の色である請求項1〜5のいずれか一項に記載の遺伝子改変植物。
- 前記花部変更が藤色である請求項6記載の遺伝子改変植物。
- 前記カーネーションがスプレーカーネーション ダイアンサス カリオフィルス(Dianthus caryophyllus)cv.セリースウエストパール品種という遺伝的背景で存在するか、またはその枝変わりである請求項5記載の遺伝子改変植物。
- 前記カーネーションが、ベガ、アーティザン、シンデレラ、ウエストパール、バーバラ、ミレディ、ダークランデブー、コルチナチャネルの遺伝的背景を有する請求項5記載の遺伝子改変植物。
- 前記F3’5’H酵素がスミレ種(Viola sp)からである請求項1〜9のいずれか一項に記載の遺伝子改変植物。
- 前記F3’5’H酵素が、中程度の緊縮条件下で配列番号1または配列番号1の相補型とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によりコードされる請求項10記載の遺伝子改変植物。
- 前記F3’5’H酵素が配列番号1によりコードされる請求項10または11記載の遺伝子改変植物。
- 前記DFRがペチュニア種からである請求項1記載の遺伝子改変植物。
- 前記DFRが、中程度の緊縮条件下で配列番号3または配列番号3の相補型とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によりコードされる請求項13記載の遺伝子改変植物。
- 前記DFRが配列番号3によりコードされる請求項14記載の遺伝子改変植物。
- 前記ds plantDFRがダイアンサス種(ds dianDFR)からである請求項3または請求項10〜15のいずれか一項に記載の遺伝子改変植物。
- 前記ds plantDFRが、高緊縮条件下で配列番号9からの単数または複数の断片あるいは配列番号9の相補型とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を組み入れる請求項16記載の遺伝子改変植物。
- 前記ds plantDFRが、配列番号9からの単数または複数の断片を組み入れる請求項17記載の遺伝子改変植物。
- 前記植物がセリースウエストパール/3366である請求項5記載の遺伝子改変植物。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の遺伝子改変植物からの子孫、生殖物質、切花、組織培養可能細胞および再生可能細胞。
- 紫色(パープル)〜菫色(バイオレット)〜青色を有する組織を含めた花部変更を示すカーネーションまたはその枝変わりの製造における、少なくとも1つの非内在性F3’5’H酵素および少なくとも1つの非内在性DFR酵素をコードする遺伝子配列の使用、ならびに植物の内在性DFR遺伝子を抑制する遺伝物質の組み入れ。
- 非内在性ThMTおよび/またはThNSをコードする遺伝物質の使用をさらに包含する請求項21記載の使用。
- カーネーション植物がセリースウエストパール・カーネーションである請求項21または22記載の使用。
- 前記植物の内在性DFR遺伝子の発現を抑制する遺伝物質が、前記植物の内在性DFR遺伝子に対応するセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含む請求項23記載の使用。
- 花部変更を示すカーネーションの生産方法であって、少なくとも1つの非内在性F3’5’H酵素および少なくとも1つの非内在性DFR酵素をコードする発現可能な遺伝物質をカーネーション植物体の再生可能細胞中に導入すること、ならびに植物の内在性DFR遺伝子の発現を抑制する遺伝物質を組み入れること、そしてそれから植物を再生するかまたは再生植物の子孫を得ることを包含する方法。
- 花部変更を示すカーネーション系統の生産方法であって、少なくとも1つの非内在性F3’5’H酵素または少なくとも1つの非内在性DFR酵素のうちの一方をコードする遺伝物質を含むかもしくは少なくとも1つのds carnDFR分子の組み入れたスプレーカーネーションを選択し、この植物体を、少なくとも1つの非内在性F3’5’H酵素または少なくとも1つの非内在性DFR酵素の他方をコードする遺伝物質を含むかもしくは少なくとも1つのds CarnDFR分子を取り入れた別のカーネーションと交雑し、次いで当該遺伝物質を発現するF1またはその後の世代の植物を選択することを包含する方法。
- 花部変更を示すカーネーションの生産方法であって、少なくとも1つの非内在性F3’5’H酵素または少なくとも1つの非内在性DFR酵素のうちの一方をコードする遺伝物質を含むかあるいは少なくとも1つのds carnDFR分子を組み入れたスプレーカーネーションを選択し、そしてこの植物体を別のカーネーションと交雑すること、そして次に当該遺伝物質を発現するF1またはその後の世代の植物体を選択することを包含する方法。
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