JP5765711B2

JP5765711B2 - 変更された花部を有する植物

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Publication number: JP5765711B2
Application number: JP2011541027A
Authority: JP
Inventors: フィリッパブルグリエラ
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: USPP21595P3; US20100162451P1; US20110321184A1; CO6400154A2; JP2012511916A; CA2747552C; EP2358870A4; WO2010069004A1; EP2358870A1; ECSP11011216A; CA2747552A1

Description

本出願は、米国特許仮出願第61/139,354号（2008年12月19日出願、表題「A Plant」）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に関連し、それからの優先権を主張する。

本発明は、一般的に植物の遺伝子改変の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、所望の色表現型を発現する遺伝子改変植物に関する。

本明細書で著者に言及される出版物の文献目録詳細は、本説明の末尾に集められている。

本明細書中での任意の従来技術に対する参照は、この従来技術が任意の国における共通の一般的知識の一部を構成するということの承認ではないし、承認であると解釈されるべきでなく、あるいはそれを如何なる形態でも示唆するものでなく、示唆するものであると解釈されるべきでない。

花あるいは観賞用または園芸用植物産業は、花および／または植物の新しい且つ異なる品種を開発しようと努力している。このような新規の品種を作り出すための有効な方法は、花色の操作によるものである。古典的品種改良技法は、今日入手可能な花および／または植物の商業的品種のほとんど全てに関する広範囲の色を出すためにかなりの成功を伴って用いられてきた。しかしながら、このアプローチは、特定の種の遺伝子プールという制約により限定されおり、そしてこの理由のために、単一種が全範囲の色の品種を有することは稀である。例えば、植物または植物の一部、例えば花、葉、果実および茎の新規の色の品種の開発は、切花、観賞植物および園芸市場においてともに、有意の機会を提供する。花あるいは観賞または園芸植物産業において、カーネーションの新色品種の開発は特に重要である。これは、異なる色の花だけでなく、葯および花柱も含む。

花色は、主に三種類の色素：すなわちフラボノイド、カロテノイドおよびベタレインが元になっている。３つのうち、フラボノイドは最も一般的で、黄色〜赤色〜青色までの一連の色に寄与する。花色の主因をなすフラボノイド分子はアントシアニンであり、これは、シアニジンのグリコシル化誘導体およびそのメチル化誘導ペオニジン、デルフィニジンおよびそのメチル化誘導ペチュニジンならびにマルビジンおよびペラルゴニジンである。アントシアニンは、花弁の表皮細胞の液胞中、または葉の表皮下細胞の液胞中に局在化される。

フラボノイド色素は、フェニルプロパノイド経路の二次代謝産物である。フラボノイド色素のための生合成経路（フラボノイド経路）は、十分に確立されており（Holton and Cornish, Plant Cell 7: 1071-1083, 1995；Mol et al, Trends Plant Sci. 3: 212-217, 1998；Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001a；およびWinkel-Shirley, Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b；Tanaka and Mason, In Plant Genetic Engineering, Singh and Jaiwal (eds) SciTech Publishing Llc., USA, 1: 361-385, 2003；Tanaka et al, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 1-24, 2005；Tanaka and Brugliera, In Flowering and Its Manipulation, Annual Plant Reviews Ainsworth (ed), Blackwell Publishing, UK, 20: 201-239, 2006）、図１に示されている。３つの反応および酵素は、フラボノイド経路における最初の重要な基質の１つであるｐ−クマロイル−ＣｏＡへのフェニルアラニンの変換に関与する。酵素は、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）および４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）である。当該経路における初発段階は、３分子のマロニル−ＣｏＡ（アセチルＣｏＡおよびＣＯ₂に及ぼすアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の作用により提供される）と１分子のｐ−クマロイル−ＣｏＡの縮合反応を含む。この反応は、酵素カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）により触媒される。この反応の生成物である２’，４，４’，６’−テトラヒドロキシ−カルコンは、常態では、酵素カルコンフラバノンイソメラーゼ（ＣＨＩ）により異性化されて、ナリンゲニンを生成する。ナリンゲニンは、その後、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）により中心環の３位でヒドロキシル化されて、ジヒドロケンフェロール（ＤＨＫ）を生じる。

ＤＨＫのＢ環の水酸化のパターンは、花弁の色を決定するのに重要な役割を果たす。Ｂ環は、３’位または３’および５’位で水酸化されて、それぞれジヒドロクエルセチン（ＤＨＱ）またはジヒドロミリセチン（ＤＨＭ）を生じ得る。当該経路のこの部分に関与する２つの重要な酵素は、ともにシトクロムＰ４５０クラスの酵素の成員であるフラボノイド３’ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’Ｈ）およびフラボノイド３’，５’ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’５’Ｈ）である。

Ｆ３’Ｈは、多数の植物種において赤およびピンク色の花色に寄与するシアニジン由来の色素をもたらすフラボノイド経路における重要酵素である。Ｆ３’５’Ｈは、多くの種において紫色、菫色および青色の花色に寄与するデルフィニジン由来のアントシアニンの産生をもたらす。

Ｆ３’５’Ｈをコードするヌクレオチド配列は、クローン化されている（国際特許出願PCT/AU92/00334（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）ならびにHolton et al, Nature, 366: 276-279, 1993および国際特許出願PCT/AU03/01111（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）参照）。これらの配列は、ペチュニア（国際特許出願PCT/AU92/00334およびHolton et al, 1993（上記）参照）、タバコ（国際特許出願PCT/AU92/00334参照）、カーネーション（国際特許出願PCT/AU96/00296（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）参照）およびバラ（国際特許出願PCT/AU03/01111参照）におけるフラボノイドの３’，５’の水酸化による改変をもたらすのに効率的であった。

ジヒドロフラボノール（ＤＨＫ、ＤＨＱ、ＤＨＭ）からの有色アントシアニンの産生にはジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ（ＤＦＲ）が関与し、ロイコアントシアニジンの産生をもたらす。ロイコアントシアニジンはその後、アントシアニジン、ペラルゴニジン、シアニジンおよびデルフィニジンに変換される。これらのフラボノイド分子は、正常生理学的条件下では不安定で、グリコシルトランスフェラーゼの作用による３位でのグリコシル化がアントシアニン分子を安定化し、したがって、アントシアニンの蓄積を可能にする。概して、グリコシルトランスフェラーゼは、糖部分をＵＤＰ糖からフラボノイド分子に移して、グリコシル化の位置に対する高特異性ならびに受容体基質に対する相対的に低い特異性を示す（Seitz and Hinderer, Anthocyanins. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Constabel and Vasil (eds.), Academic Press, New York, USA, 5: 49-76, 1988）。アントシアニンは、３−モノシド、３−ビオシドおよび３−トリオシド、ならびに３，５−ジグリコシドおよび３，７−ジグリコシド（糖グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースおよびキシロースと関連）として生じ得る（Strack and Wray, In: The Flavonoids - Advances in Research since 1986、Harborne, J.B. (ed), Chapman and Hall, London, UK, 1-22, 1993）。

アントシアニン分子の安定化に関与するグリコシルトランスフェラーゼとしては、ＵＤＰグルコース：フラボノイド３−グルコシルトランスフェラーゼ（３ＧＴ）（これは、ＵＤＰグルコースからのグルコース部分をアントシアニジン分子の３−Ｏ−位に移してアントシアニジン３−Ｏ−グルコシドを生じる）が挙げられる。

多くのアントシアニジングルコシドが、アシル化誘導体の形態で存在する。アントシアニジングルコシドを改変するアシル基は、それらの構造に基づいて２つの主なクラスに分けられ得る。脂肪族アシル基はマロン酸またはコハク酸を包含し、芳香族クラスはヒドロキシ桂皮酸、例えばｐ−クマリン酸、カフェイン酸およびフェルラ酸、ならびに安息香酸、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸を包含する。例えば、カーネーションでは、アントシアニジンはマリル化アントシアニンとして存在する（Nakayama et al, Phytochemistry, 55, 937-939, 2000；Fukui et al, Phytochemistry, 63(1): 15-23, 2003）。

上記の改変のほかに、液胞または色素が局在する区画のｐＨ、ならびにフラボノイド、例えばフラボノールおよびフラボンとの共色素形成は、花弁の色に影響を及ぼし得る。フラボノールおよびフラボンは、芳香族アシル化もされ得る（Brouillard and Dangles, In: The Flavonoids- Advances in Research since 1986；Harborne, J.B. (ed), Chapman and Hall, London, UK, 1-22, 1993）。

カーネーションの花は、それらの遺伝子型によって、２種類のアントシアニジン、すなわちペラルゴニジンとシアニジンを生じ得る。Ｆ３’Ｈ活性の非存在下では、ペラルゴニジン由来のアントシアニンが生成され、そうでない場合は、シアニジン由来のものが生成される。ペラルゴニジン由来色素は、通常は、無色フラボノールであるケンフェロールを伴う。シアニジン由来色素は、通常は、ケンフェロールおよびクエルセチンの両方を伴う。ペラルゴニジンおよびケンフェロールはともに、ＤＨＫに由来する；シアニジンおよびクエルセチンはともに、ＤＨＱに由来する（図１）。

ＤＦＲにより示される基質特異性は、植物が蓄積するアントシアニンを調節する。ペチュニアおよびシンビジウムＤＦＲはＤＨＫを低減せず、したがってそれらはペラルゴニジンベースの色素を蓄積しない（Forkmann and Ruhnau, Z Naturforsch C. 42c, 1146-1148, 1987；Johnson et al, Plant Journal, 19, 81-85, 1999）。多数の重要な栽培花卉種、例えばアイリス、デルフィニウム、シクラメン、ゲンチアン、リンドウ、シンビジウム、ニーレンベルギアは、それらの内在性ＤＦＲの基質特異性のために、ペラルゴニジン由来色素を蓄積しないと推測される（Tanaka and Brugliera, 2006、上記）。

カーネーションでは、ＤＦＲ酵素は、ＤＨＫを、ペラルゴニジン由来の色素への前駆体であるロイコペラルゴニジンに代謝して、杏色〜赤レンガ色のカーネーションを生じ、ＤＨＱを、シアニジン由来の色素への前駆体であるロイコシアニジンに代謝して、桃色〜赤色カーネーションを産生し得る。カーネーションＤＦＲは、ＤＨＭを、デルフィニジン由来の色素への前駆体であるロイコデルフィニジンに変換し得る（Forkmann and Ruhnau, 1987、上記）。野生型または古典的由来カーネーション系統はＦ３’５’Ｈ酵素を含有せず、したがってＤＨＭを合成しない。

ペチュニアＤＦＲ酵素は、カーネーションＤＦＲとは異なる特異性を有する。それは、ＤＨＱをロイコシアニジンに変換し得るが、しかしそれはＤＨＫをロイコペラルゴニジンに変換できない（Forkmann and Ruhnau, 1987、上記）。Ｆ３’５’Ｈ酵素を含有するペチュニア系統において、ペチュニアＤＦＲ酵素は、この酵素により産生されるＤＨＭをロイコデルフィニジンに変換し得るし、これはさらに改変されて、青色花に主に関与するデルフィニジン由来の色素を生じる、ということも知られている（図１参照）。ペチュニアＤＦＲはＤＨＱおよびＤＨＭの両方を変換し得るとしても、それは、ＤＨＭをより効率的に変換し得るので、したがってデルフィニジンの産生に好都合である（Forkmann and Ruhnau, 1987、上記）。

カーネーションは世界中で最も広範に栽培されている切花の１つである。

栽培カーネーションの現在および過去の切花品種は、数千を数える。これらは、植物の形態、花の大きさおよび花の型に基づいて、３つの一般的な群に分けられる。３つの花型は、スタンダード、スプレーおよびミディである。販売されているカーネーションの大半は、２つの主要群、すなわちスタンダードとスプレーに入る。スタンダードカーネーションは、１本の茎に単一の大型の花が必要とされる条件下での栽培を意図される。脇芽および蕾は除去されて（摘芽と呼ばれる工程）、最終的な花のサイズを大きくする。スプレーおよび／またはミニチュアは、１本の茎に多数の小型の花を生じる栽培を意図される。側生芽が「扇」型の茎を形成し得るよう、中央の花だけが除去される。

一本の茎に多数の花蕾があることは種々の種類のフラワーアレンジメントによく適合し、花産業の大量販売市場部門で用いられる花束に嵩を提供するので、スプレーカーネーション品種は花業界で人気がある。

スタンダードおよびスプレー栽培品種はカーネーション切花産業のほとんどを占めていて、米国では各々がほぼ同数販売されている。日本では、スプレー型の品種は販売されているカーネーション花の総数の70％を占めるが、一方、欧州では、スプレー型カーネーションは、オランダのオークションを通して売買されるカーネーション花の約５０％を占める。競り下げ競売取引は、欧州全体の消費の良好な目安である。

スタンダードおよびミディ型カーネーションは新しい色を導入するために成功裏に遺伝子操作されてきた（Tanaka and Brugliera, 2006、上記；国際特許出願PCT/AU96/00296も参照）が、しかしこれは、スプレーカーネーションには適用されていない。カーネーションの色の取り合わせに青色は存在しておらず、近年、遺伝子改変スタンダード型カーネーション品種の導入によりその空白が埋められたに過ぎない。しかしながら、スタンダード型品種は、ある種の目的、例えば、多数の小型カーネーションが必要とされる花束およびフラワーアレンジメント、例えば手で持てる大きさのアレンジメントおよび小卓セッティングには用いられ得ない。

特に商業的に人気のある１つの特定のスプレーカーネーションは、セリースウエストパール系統のカーネーション（ダイアンサス・カリオフィルスDianthus caryophyllus cv. Cerise Westpearl）である。この品種は優れた栽培特性、ならびにフザリウム属のような真菌病原体に対する中等度〜良好な抵抗性を有する。セリースウエストパールは、ウエストパールの枝変わりである。しかしながら、本発明の出現前には、紫／青色スプレーカーネーションは入手可能ではなかった。

ホワイトユネスコは、ミディ型の古典的由来カーネーションである。それは白色であり、そして主に花弁がカーネーションＤＦＲ転写物を蓄積しないため、普通はアントシアニンを産生せず、したがって、ホワイトユネスコがビオラＦ３’５’ＨおよびペチュニアＤＦＲで形質転換された場合、産生されるアントシアニンの８０％以上がデルフィニジンベースであった（国際特許出願PCT/AU96/00296参照）。このプロセスは紫色／菫色花弁を有するカーネーション系統を得るのに有用であったが、しかし、それは、花弁中に花弁カーネーションＤＦＲｍＲＮＡまたは機能性ＤＦＲ酵素を蓄積する能力においては突然変異体であるが、しかし産生されるＤＨＭが安定な有色アントシアニンに変換され得るよう正常な残りのアントシアン経路を有する白色系統の同定に限定される。分析された１３系統のうち（国際特許出願PCT/AU96/00296参照）、２つだけがカーネーションＤＦＲを欠くがしかしアントシアニンを産生する能力は正常である。２つのうち、１つだけ（ホワイトユネスコ）が、Ｆ３’５’ＨおよびペチュニアＤＦＲの導入時に紫色／菫色花弁を生じた。

セリースウエストパールのような有色系統に形質転換されるビオラＦ３’５’ＨおよびペチュニアＤＦＲを用いる同様のアプローチの適用は、有意の新規の有色生成物を生じていない。

したがって、セリースウエストパールのような有色系統を用いて新規の有色紫／藤色花を産生する代替的手段を見つけ出す必要がある。

この明細書全体を通して、文脈が別の状況を必要としない限り、「〜を含む」あるいはその変形である「〜を含む（単数）」または「〜を含んでいる」という語は、記述される素子または整数あるいは複数の素子または整数の群を包含するが、しかし任意の他の素子または整数あるいは複数の素子または整数の群を除外することを意味する、と理解されるであろう。

ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列識別番号（配列番号）により示される。配列番号は、配列識別子＜400＞1（配列番号１）、＜400＞2（配列番号２）等と数的に対応する。

本明細書全体を通して用いられる配列識別子の要約を、表１に示す。

本発明は、花部変更を示す遺伝子改変植物を提供する。さらに具体的には、本発明は、遺伝子改変カーネーション、さらに具体的には、花部変更を示す遺伝子改変カーネーションスプレーを提供する。変更された花部は、組織または細胞小器官、例えば花、花弁、葯および花柱中の赤色−紫色〜青色、例えば紫および藤色〜青色の範囲の色である。一実施形態では、完全飽和色の順に整列され、低飽和および低明色が横に並べられる英国王立園芸協会（ＲＨＳ）カラーチャートを用いて、色が決定される。色群は観察可能なスペクトルを通して進行し、本明細書中で言及される色は、一般的に、Ｆａｎ２に含入される赤紫（ＲＨＳＣＣ５８−７４）、紫（ＲＨＳＣＣ７５−７９）、紫−菫（ＲＨＳＣＣ８１−８２）、菫（ＲＨＳＣＣ８３−８８）、菫−青（８９−９８）、青（ＲＨＳＣＣ９９−１１０）群中に存在する。色は、６１Ａ、６４Ａ、７１Ａ、７１Ｃ、７２Ａ、８１Ａ、８６Ａおよび８７Ａを含めた範囲、ならびにその間のまたはそれに近い色から選択される。

それゆえ、本発明は、花びらにおいて機能を有する非内在性のＦ３’５’Ｈ、機能性ＤＦＲならびに植物の内在性のＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する遺伝物質中を含む色の紫／菫色の色調を有するその子孫を含めた遺伝子改変植物に関する。

一実施形態では、遺伝物質は、植物の内在性のＤＦＲ配列（ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ）に対応するセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含む。これは、ヘアピンＲＮＡｉ（ｈｐＲＮＡｉ）を介した主に転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によるサイレンシングを誘導する。「内在性の」とは、酵素または遺伝子が植物中で進化した、すなわち常態でその植物中に存在することを意味する。「非内在性」酵素または遺伝子は、遺伝子または他の遺伝物質が、遺伝的angering改変（engineeringのミススペルと思われます）または育種実行により植物または植物の親に導入されたということを意味する。

一実施形態では、植物は、カーネーション、例えばスプレーカーネーションであり、内在性ＤＦＲはカーネーションＤＦＲである。遺伝物質は、ｄｓｃａｒｎＤＦＲと呼ばれるキメラ構築物である。

一実施形態では、植物およびその子孫は、非内在性Ｓアデノシルメチオニン：アントシアニン３’５’メチルトランスフェラーゼ（３’５’ＡＭＴ）および／または非内在性フラボンシンターゼ（ＦＮＳ）をコードする遺伝物質をさらに含む。

さらなる一実施形態では、３’５’ＡＭＴはトレニア（ＴｈＭＴ）からであり、ＦＮＳはトレニア（ＴｈＦＮＳ）からである。

改変植物、特に遺伝子改変スプレーカーネーションは、少なくとも１つのＦ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つのＤＦＲ酵素をコードする遺伝子配列を含み、少なくとも１つのｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子を発現する。本発明がカーネーションに関する限りでは、ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲはｄｓｃａｒｎＤＦＲであり、カーネーションスプレーはウエストパールのようなセリースウエストパールの原種を含めたセリースウエストパール遺伝的背景であるのが好都合である。本発明に含まれる他のカーネーション栽培品種は、有色品種、例えばシンデレラ、コルチナチャネル、ベガ、アーティザン、ミレディ、バーバラ、ダークランデブーである。本明細書中で意図される他の植物としては、キク、バラ、ガーベラ、トルコギキョウ、チューリップ、ユリ、フウロソウ、ペチュニア、アイリス、トレニア、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、ニチニチソウ、テンジクアオイ、ラン、ブドウ、リンゴ、トウダイグサ、フクシアおよびその他の観賞または園芸植物が挙げられる。

本発明の一態様は、選択組織における花部変更を示す遺伝子改変植物であって、少なくとも1つのＦ３’，５’Ｈ酵素および少なくとも1つのＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝物質を含み、ＤＦＲ遺伝子を抑制する遺伝物質を発現する遺伝子改変植物に関する。さらに具体的には、本発明は、花部変更を示す遺伝子改変植物であって、植物またはその子孫が、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝物質を含み、植物の内在性のＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する遺伝物質を発現する遺伝子改変植物を提供する。一実施形態では、植物およびその子孫は、非内在性ＴｈＭＴをコードする遺伝物質をさらに含む。特定の一実施形態では、内在性ＤＦＲ遺伝子を抑制する遺伝物質は、内在性ＤＦＲ遺伝子またはそのｍＲＮＡ（「ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ」）に対応するセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含む。「変更された花部」という用語は、この文脈中では、遺伝子操作前の植物（例えば、親植物または同一種の植物）の花部と比較した場合を意味する。「コードする」という用語は、機能性Ｆ３’５’ＨおよびＤＦＲ酵素を産生するための遺伝物質の発現を包含する。

「ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子」は、植物のセンスおよびアンチセンス断片の両方を含む遺伝物質であって、内在性ＤＦＲゲノムまたはｃＤＮＡ配列または対応するｍＲＮＡである。ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲは、内在性ＤＦＲ遺伝子のｈｐＲＮＡｉ媒介性遺伝子サイレンシングを誘導するよう発現される。特定の一実施形態では、植物はカーネーションであり、ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子はｄｓｃａｒｎＤＦＲである。

特定の一実施形態では、植物はスプレーカーネーションである。

したがって、本発明の別の態様は、選択組織における花部変更を示すスプレーカーネーション植物であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝物質を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現するスプレーカーネーションに関する。

本発明のさらに別の態様は、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変セリースウエストパール・スプレーカーネーション植物またはその枝変わりであって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現するカーネーションに関する。

本発明の別の態様は、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変キク植物であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃｈｒｙｓＤＦＲ分子を発現するキクに関する。

本発明のさらに別の態様は、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変バラ植物であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｒｏｓｅＤＦＲ分子を発現するバラに関する。

本発明のさらに別の態様は、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変ガーベラ植物であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｇｅｒｂＤＦＲ分子を発現するガーベラに関する。

本発明のさらに別の態様は、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変観賞または園芸植物であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子を組み入れる鑑賞または園芸植物に関する。

一実施形態では、植物およびその子孫は、非内在性ＴｈＭＴおよび／または非内在性ＴｈＦＮＳをコードする遺伝物質をさらに含む。「紫〜青色」への言及は、藤色を包含する。

特定の一実施形態では、本発明は、セリースウエストパール（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３３６６として本明細書中で同定される遺伝子改変スプレーカーネーションおよびその子孫ならびに枝変わりを提供する。別の実施形態では、本発明は、セリースウエストパール（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３６０１として本明細書中で同定される遺伝子改変スプレーカーネーションおよびその子孫ならびに枝変わりを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、セリースウエストパール（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３６０５として本明細書中で同定される遺伝子改変スプレーカーネーションおよびその子孫ならびに枝変わりを提供する。さらに、別の実施形態では、本発明は、セリースウエストパール（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３６１６として本明細書中で同定される遺伝子改変スプレーカーネーションおよびその子孫ならびに枝変わりを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、セリースウエストパール（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３６０７として本明細書中で同定される遺伝子改変スプレーカーネーションおよびその子孫ならびに枝変わりを提供する。

遺伝子改変植物からの子孫、生殖物質、切花、組織培養可能細胞および再生可能細胞も、本発明の一部を構成する。

本発明はさらに、紫色〜菫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示すカーネーションまたはその枝変わりの製造における、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする遺伝子配列ならびに植物の内在性ＤＦＲ遺伝子を抑制する遺伝物質の使用を提供する。

さらに具体的には、本発明は、紫〜青色を有する組織を含む改変された花序を示す遺伝子改変植物、例えばスプレーカーネーション、例えばセリースウエストパールカーネーションまたはその枝変わりの製造における、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を組み入れる遺伝子配列の使用に関する。

Ｆ３’５’Ｈ酵素は、任意の供給源からであり得る。ビオラ種からのＦ３’５’Ｈ酵素は、特に有用である（表１参照）。同様に、ＤＦＲ酵素をコードするヌクレオチド配列は、任意の種、例えばペチュニア種（例えば表１参照）、アイリス、シクラメン、デルフィニウム、リンドウ、シンビジウム、ニーレンベルギアに由来し得るが、これらに限定されない。ｄｓｃａｒｎＤＦＲのヘアピンループを形成するセンスおよびアンチセンス断片は、カーネーションから得られる。ｄｓｃａｒｎＤＦＲ中のイントロンは、ペチュニアＤＦＲ−Ａイントロン１に由来する（Beld et al, Plant Mol. Biol. 13: 491-502, 1989）が、しかしながら、カーネーションにおいてプロセシングされ得る任意のイントロンが用いられ得る。別の実施形態では、イントロンは用いられない。

ビオラ種からのＦ３’５’Ｈ、ペチュニア種からのＤＦＲおよびダイアンサス種からのＤＦＲに関する適切なヌクレオチド配列を、表１に記載する。
表１：配列識別子の要約

ＢＰ、ブラックパンジー；ｎｔ、ヌクレオチド；ａａ、アミノ酸；ｐｅｔ、ペチュニア；ｃａｒｎ、カーネーション；ＴｈＭＴ、トレニアからのＳ−アデノシルメチオニン：アントシアニン３’５’メチルトランスフェラーゼ；ＡＮＳ、アントシアニンシンターゼ；ＣＨＳ、カルコンシンターゼ；３’５’ＡＭＴ、Ｓ−アデノシルメチオニン：アントシアニン３’５’メチルトランスフェラーゼ；ＦＮＳ、フラボンシンターゼ；ＴｈＦＮＳ、トレニアからのフラボンシンターゼ。

アントシアニンを産生するほとんどの植物中で起こるアントシアニジン３−グルコシドの産生を示すフラボノイド色素に関する生合成経路のスキームである。この経路に関与する酵素を以下に示す：ＰＡＬ＝フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；Ｃ４Ｈ＝シンナメート４−ヒドロキシラーゼ；４ＣＬ＝４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ；ＣＨＳ＝カルコンシンターゼ；ＣＨＩ＝カルコンフラバノンイソメラーゼ；Ｆ３Ｈ＝フラバノン３−ヒドロキシラーゼ；ＤＦＲ＝ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ；ＡＮＳ＝アントシアニジンシンターゼ、３ＧＴ＝ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ；その他の略語：ＤＨＫ＝ジヒドロケンフェロール、ＤＨＱ＝ジヒドロクエルセチン、ＤＨＭ＝ジヒドロミリセチン。

バイナリープラスミドｐＣＧＰ３３６０キメラの略図である。ｐＣＧＰ３３６０の構築は、実施例１に記載される。選択された制限酵素部位に印を付けてある。略語としては、以下のものが挙げられる：ＬＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの左側境界、ＲＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの右側境界領域、ＴｅｔＲ＝抗生物質テトラサイクリン耐性遺伝子複合体。遺伝子構成要素の説明に関しては表２を参照されたい。

バイナリープラスミドｐＣＧＰ３３６６キメラの略図である。ｐＣＧＰ３３６６の構築は、実施例１に記載される。選択された制限酵素部位に印を付けてある。略語としては、以下のものが挙げられる：ＬＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの左側境界、ＲＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの右側境界領域、ＴｅｔＲ＝抗生物質テトラサイクリン耐性遺伝子複合体。この図において、「ｄｓｃａｒｎＤＦＲ」＝ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’発現カセット。遺伝子構成要素の説明に関しては表２を参照されたい。

バイナリープラスミドｐＣＧＰ３６０１キメラの略図である。ｐＣＧＰ３６０１の構築は、実施例１に記載される。略語としては、以下のものが挙げられる：ＬＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの左側境界、ＲＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの右側境界領域、ＴｅｔＲ＝抗生物質テトラサイクリン耐性遺伝子複合体。この図において、「ｄｓｃａｒｎＤＦＲ」＝ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’発現カセット。遺伝子構成要素の説明に関しては表２を参照されたい。

バイナリープラスミドｐＣＧＰ３６０５キメラの略図である。ｐＣＧＰ３６０５の構築は、実施例１に記載される。略語としては、以下のものが挙げられる：ＬＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの左側境界、ＲＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの右側境界領域、ＴｅｔＲ＝抗生物質テトラサイクリン耐性遺伝子複合体。この図において、「ｄｓｃａｒｎＤＦＲ」＝ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’発現カセットおよび「ＴｈＭＴ」＝ＣａＭＶ３５Ｓ：ＴｈＭＴ：３５Ｓ３’発現カセット。遺伝子構成要素の説明に関しては表２を参照されたい。

バイナリープラスミドｐＣＧＰ３６１６キメラの略図である。ｐＣＧＰ３６１６の構築は、実施例１に記載される。略語としては、以下のものが挙げられる：ＬＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの左側境界、ＲＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの右側境界領域、ＴｅｔＲ＝抗生物質テトラサイクリン耐性遺伝子複合体。この図において、「ｄｓｃａｒｎＤＦＲ」＝ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’発現カセット。遺伝子構成要素の説明に関しては表２を参照されたい。

バイナリープラスミドｐＣＧＰ３６０７キメラの略図である。ｐＣＧＰ３６０７の構築は、実施例１に記載される。略語としては、以下のものが挙げられる：ＬＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの左側境界、ＲＢ＝アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドからの右側境界領域、ＴｅｔＲ＝抗生物質テトラサイクリン耐性遺伝子複合体。この図において、「ｄｓｃａｒｎＤＦＲ」＝ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’発現カセットおよび「ＴｈＦＮＳ」＝ｅ３５Ｓ５’：ＴｈＦＮＳ：ｐｅｔＤ８３’発現カセット。遺伝子構成要素の説明に関しては表２を参照されたい。

本明細書中で用いる場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、その文脈がそうでないことを明らかに指図しない限り、複数態様を含む。したがって、例えば「ある植物（a plant）」への言及は、単数の植物、ならびに２つ以上の植物を包含する；「ある葯（an anther）」への言及は、単数の葯、ならびに２つ以上の葯を包含する；「本発明（the invention）」への言及は、本発明の単数の態様または複数の態様を包含する；などである。

本発明は、遺伝子改変植物、例えば花部変更を示すカーネーション植物、特にスプレーカーネーションを意図する。花部変更は、任意の組織または細胞小器官、例えば花、花弁、葯および花柱においてであり得る。本明細書中で意図される特定の花部は、赤紫色〜青色、例えば藤色を含めた紫〜青色の範囲の色を包含する。色の決定は、英国王立園芸協会（ＲＨＳ）カラーチャート（ＲＨＳＣＣ）に対して測定されるのが便利であり、色７７Ａ、７７Ｂ、Ｎ８０Ｂ、８１Ａ、８１Ｂ、８２Ａ、８２Ｂ、８８Ｄ、ならびに上記の範囲のいずれかの末端の間のまたはそれに近い色を包含する。「花部」という用語は、狭義に解釈されるものではなく、任意の有色細胞、組織、細胞小器官またはその部分、ならびに花および花弁に関する。

それゆえ、本発明の一態様は、選択組織における花部変更を示す遺伝子改変植物であって、少なくとも1つのＦ３’，５’Ｈ酵素および少なくとも1つのＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝物質を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子を抑制する遺伝物質を発現する遺伝子改変植物に関する。「植物」は、遺伝子改変を継続する親植物およびその子孫を包含する。特に本発明は、花部変更を示す遺伝子改変植物であって、植物またはその子孫が、少なくとも1つの非内在性フラボノイド３’５’ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’５’Ｈ）酵素および少なくとも1つの非内在性ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ（ＤＦＲ）酵素をコードする発現遺伝物質を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する遺伝物質を発現する遺伝子改変植物を提供する。

一実施形態では、植物およびその子孫は、非内在性Ｓ−アデノシルメチオニン：アントシアニン３’５’メチルトランスフェラーゼ（ＴｈＭＴ）および／またはフラボンシンターゼ（ＴｈＦＮＳ）をコードする遺伝物質をさらに含む。植物の内在性ＤＦＲ遺伝子を抑制する遺伝物質は、一実施形態では、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子またはｍＲＮＡ（「ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ」）に対応するセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含む。

ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子は、宿主植物における内在性ＤＦＲ遺伝子またはそのｍＲＮＡに対応するＤＦＲゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからのセンスおよびアンチセンス遺伝物質のキメラ構築物である。「内在性」ＤＦＲは、常態では遺伝子操作前に宿主植物中に存在するＤＦＲである。非内在性酵素または遺伝子は、遺伝子工学処理または植物育種実行により植物または植物の親に導入された遺伝子または他の遺伝物質を包含する。

ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子は、発現される場合、宿主植物中のＤＦＲ遺伝子をＰＴＧＳにより抑制する。ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子は、カーネーション（ｄｓｃａｒｎＤＦＲ）、キク（ｄｓｃｈｒｙｓＤＦＲ）、バラ（ｄｓｒｏｓｅＤＦＲ）、ガーベラ（ｄｓｇｅｒｂＤＦＲ）、ダイアンサス（ｄｓｄｉａｎＤＦＲ）、ペチュニア（ｄｓｐｅｔＤＦＲ）から、または観賞または園芸植物（ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ）からであり得る。他のｄｓｐｌａｎｔＤＦＲは、トルコギキョウ、チューリップ、ユリ、フウロソウ、ペチュニア、アイリス、トレニア、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、ニチニチソウ、テンジクアオイ、ラン、ブドウ、リンゴ、トウダイグサまたはフクシアからであり得る。

特定の一実施形態では、植物はスプレーカーネーションである。したがって、本発明の別の態様は、選択組織における花部変更を示すスプレーカーネーション植物であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝物質を含み、少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現するスプレーカーネーションに関する。ｄｓｃａｒｎＤＦＲは、発現される場合、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する。

一実施形態では、植物およびその子孫は、非内在性ＴｈＭＴおよび／またはＴｈＦＮＳをコードする遺伝物質をさらに含む。

それゆえ、本発明のさらなる態様は、選択組織における花部変更を示すスプレーカーネーションであって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素、少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素および少なくとも１つの比内在性ＴｈＭＴおよび／またはＴｈＦＮＳをコードする発現遺伝物質を含み、少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現するスプレーカーネーションに関する。

本発明は任意のスプレーカーネーションを包含するが、しかしセリースウエストパール系統のカーネーションはその枝変わりを含めて特に有用である。セリースウエストパールの有用な枝変わりはウエストパールを含む。

したがって、本発明の別の態様は、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変セリースウエストパール・スプレーカーネーション植物またはその枝変わりであって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現するカーネーションに関する。

さらに具体的には、本発明は、花部変更を示す遺伝子改変セリースウエストパール植物（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３３６６（ＣＷ／３３６６またはセリースウエストパール／３３６６としても言及される）系統であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現する系統を提供する。

さらに具体的には、本発明は、花部変更を示す遺伝子改変セリースウエストパール植物（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３６０１（ＣＷ／３６０１またはセリースウエストパール／３６０１としても言及される）系統であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現する系統を提供する。

さらに具体的には、本発明は、花部変更を示す遺伝子改変セリースウエストパール植物（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３６０５（ＣＷ／３６０５またはセリースウエストパール／３６０５としても言及される）系統であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現する系統を提供する。

さらに具体的には、本発明は、花部変更を示す遺伝子改変セリースウエストパール植物（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３６１６（ＣＷ／３６１６またはセリースウエストパール／３６１６としても言及される）系統であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現する系統を提供する。

さらに具体的には、本発明は、花部変更を示す遺伝子改変セリースウエストパール植物（ＣＷ）／ｐＣＧＰ３６０７（ＣＷ／３６０７またはセリースウエストパール／３６０７としても言及される）系統であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現する系統を提供する。

上記の態様の各々において、植物およびその子孫は、非内在性ＴｈＭＴおよび／またはＴｈＦＮＳをコードする遺伝物質をさらに含み得る。

セリースウエストパール・トランスジェニック系統の例としては、#25958（FLORIGENE Moonberry（商標））および系統#25947（FLORIGENE Moonpearl（商標））が挙げられる。

本明細書中で意図される付加的遺伝子改変カーネーションとしては、スプレーカーネーションのウエストパール、コルチナチャネル、ベガ、バーバラおよびアーティザン、ならびにスタンダードカーネーションのシンデレラ、ダークランデブー、ミレディが挙げられる。

本明細書中で意図される他の遺伝子改変植物としては、キク、バラ、ガーベラ、トルコギキョウ、チューリップ、ユリ、フウロソウ、ペチュニア、アイリス、トレニア、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、ニチニチソウ、テンジクアオイ、ラン、ブドウ、リンゴ、トウダイグサまたはフクシアおよびその他の観賞または園芸植物が挙げられる。

本発明のさらに別の態様は、紫色〜青色の組織を示す遺伝子改変観賞または園芸植物であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現遺伝子配列を含み、植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子を発現する鑑賞または園芸植物に関する。

一実施形態では、植物およびその子孫は、非内在性ＴｈＭＴおよび／または非内在性ＴｈＦＮＳをコードする遺伝物質をさらに含む。「紫〜青色」という用語は、藤色を包含する。

ｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ、ｄｓｃｈｒｙｓＤＦＲ、ｄｓｒｏｓｅＤＦＲ、ｄｓｇｅｒｂＤＦＲ、ｄｓｐｅｔＤＦＲおよびｄｓｄｉａｎＤＦＲは、宿主植物のＤＦＲをコードする遺伝子のセンスおよびアンチセンスゲノムまたはｃＤＮＡ断片を含む。この分子の発現は、宿主植物における内在性ＤＦＲ遺伝子の抑制を生じる。同様の注釈は、他の宿主植物からのｄｓｐｌａｎｔＤＦＲに関して当てはまる。

遺伝子配列は、Ｆ３’５’Ｈ酵素およびＤＦＲ酵素をコードするヌクレオチド配列を保有する単一構築物であり得るし、あるいは多重遺伝子構築物が用いられ得る。さらに、遺伝子配列は植物細胞のゲノム中に組込まれ得るし、あるいはそれは染色体外人工染色体として保持され得る。さらに、少なくとも１つのＦ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つのＤＦＲ酵素を発現し、少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を発現するスプレーカーネーションの生成は、組換え手段単独により、または従来の育種および組換えＤＮＡ操作の組合せにより生成され得る。遺伝子配列は、プロモーターおよびその他の調節配列と操作可能的に連結されるという意味で「発現され」て、転写および翻訳を生じて、Ｆ３’５’ＨおよびＤＦＲ酵素を産生する。

それゆえ、本発明の別の態様は、花部変更を示すスプレーカーネーションのような遺伝子改変植物の生産方法であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードする発現可能な遺伝物質をスプレーカーネーション植物のような植物の再生可能細胞中に導入すること、ならびに植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を組み入れること、そしてそれから植物を再生するかまたは再生植物からの子孫を得ることを包含する方法を意図する。

キク、バラ、ガーベラおよび観賞植物からの同様の方法が、本明細書中で意図される。

植物は次に、種々の世代の成長または栽培を受け得る。それゆえ、遺伝子改変スプレーカーネーションへの言及は、その子孫およびその姉妹系統、ならびにその枝変わりを包含する。

本発明の別の態様は、花部変更を示すスプレーカーネーションのような遺伝子改変植物の生産方法であって、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つのＤＦＲ酵素をコードする発現可能遺伝物質を含み、ならびに植物の内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を組み入れたスプレーカーネーションのような植物を選択すること、そしてこの植物体を、少なくとも1つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも1つの非内在性ＤＦＲ酵素を有する他のものをコードする遺伝物質を含み、ならびに少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を組み入れた別の植物、例えばスプレーカーネーションと交雑すること、そして次に当該遺伝物質を発現するＦ１またはその後の世代の植物体を選択することを包含する方法を提供する。

宿主植物に関する非内在性Ｆ３’５’ＨおよびＤＦＲ酵素をコードするヌクレオチド配列は、任意の供給源、例えばビオラ種、ペチュニア種、サルビア種、トルコギキョウ種、キキョウ種、ソリア種、チョウマメ種、ケンネディア種、ホタルブクロ種、ラベンダー種、バーベナ種、トレニア種、デルフィニウム種、ナス種、サイネリア種、ブドウ種、バビアナ・ストリクタ、マツ種、トウヒ種、カラマツ種、インゲンマメ種、ブルーベリー種、シクラメン種、アイリス種、テンジクアオイ種、リパリエ種、フウロソウ種、エンドウマメ種、スイートピー種、ニチニチソウ種、ゼニアオイ種、トビカズラ種、ソラマメ種、セントポーリア種、サルスベリ種、ノボタン種、ルリマツリ種、ヒポカリプツス種、ツツジ種、アマ種、ファジービーン種、ハイビスカス種、アジサイ種、シンビジウム種、ナツフジ種、イワオウギ種、ハギ種、アスパラガス種、アサヒカズラ種、エンドウマメ種、フリージア種、ウツボグサ種またはサンジソウ種などからであり得る。例えば、一実施形態では、Ｆ３’５’Ｈ酵素はビオラ種からである。

ＤＦＲは、同一のまたは異なる植物種からも得られる。例えば、一実施形態では、ＤＦＲ酵素は、ペチュニアからである。別の実施形態では、ＤＦＲはアイリスからである。

ｄｓｃａｒｎＤＦＲのヘアピンループを形成するセンスおよびアンチセンス断片は、カーネーションから得られる（EMBL寄託番号Z67983、GenBank寄託番号ｇｉ：1067126）か、あるいはキク、バラ、ガーベラまたは観賞植物からの機能性等価物である。ｄｓｃａｒｎＤＦＲの目的はＲＮＡｉ媒介性サイレンシングにより内在性カーネーションＤＦＲ遺伝子を抑制することであるため、内在性カーネーションＤＦＲ配列の種々の断片が用いられ得る（国際特許出願PCT/IB99/00606、Wesley et al, Plant J., 27, 581-590, 2001、Ossowski et al, Plant J., 53, 674-690, 2008参照）。例えば、一実施形態では、300 bp断片がセンスおよびアンチセンス方向で用いられる。ｄｓｃａｒｎＤＦＲ中のイントロンはペチュニアＤＦＲ−Ａイントロン１から得られる（Beld et al, Plant Mol. Biol. 13: 491-502, 1989）が、しかしながらカーネーションにおいてプロセシングされ得る任意のイントロンが用いられ得る。別の実施形態では、イントロンは用いられない。さらにまた、同一の注釈は、包括的にｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子に当てはまる。

本発明は、紫色〜菫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示すカーネーションまたはその枝変わりの製造における、少なくとも１つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、ならびに植物の内在性ＤＦＲ遺伝子を抑制する遺伝物質の組み入れる遺伝子配列の使用を提供する。

本発明は、紫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示すスプレーカーネーション、例えばセリースウエストパール・カーネーションまたはその枝変わりの製造における、少なくとも１つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、ならびに少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を組み入れる遺伝子配列の使用も意図する。

別の実施形態では、本発明は、紫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示す、バラ、キク、ガーベラ、チューリップ、ユリ、ラン、トルコギキョウ、ベゴニア、トレニア、フウロソウ、ペチュニア、ニーレンベルギア、テンジクアオイ、アイリス、インパチェンス、シクラメン、ブドウ、リンゴ、トウダイグサまたはフクシアあるいはその他の観賞または園芸植物から選択される遺伝子改変植物またはその枝変わりの製造における、少なくとも１つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、ならびに少なくとも１つのｄｓＤＦＲ（内在性ＤＦＲ遺伝子のサイレンシングに向けられる）分子を組み入れる遺伝子配列の使用を意図する。

一実施形態では、植物およびその子孫は、非内在性ＴｈＭＴおよび／またはＴｈＦＮＳをコードする遺伝物質をさらに含む。植物細胞は、各々が種々の遺伝子のうちの１つ以上を保有する２つ以上の遺伝子構築物で形質転換されることを必要とし得る。

切花、組織培養可能細胞、再生可能細胞、植物の一部、種子、生殖物質（花粉を含む）は、全て本発明に包含される。

上記のように、Ｆ３’５’ＨおよびＤＦＲ酵素をコードするヌクレオチド配列は、全て、同一種の植物から、あるいは２つ以上の異なる種から得られる。ビオラ種からのＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列、ならびにペチュニア種およびカーネーションからのＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列は、本発明の実行に特に有用である。Ｆ３’５’Ｈ酵素およびＤＦＲ酵素をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれぞれのアミノ酸配列は、表１に明示されている。

Ｆ３’５’Ｈをコードする核酸分子は、国際特許出願PCT/AU92/00334およびHolton et al, 1993（上記）でも提供される。これらの配列は、ペチュニア（国際特許出願PCT/AU92/00334およびHolton et al, 1993（上記）参照）、タバコ（国際特許出願PCT/AU92/00334参照）およびカーネーション（国際特許出願PCT/AU96/00296参照）におけるフラボノイドの３’５’ヒドロキシル化を調整するために用いられてきた。他の種、例えばビオラ、サルビアおよびソリアからのＦ３’５’Ｈのヌクレオチド配列がクローン化されている（国際特許出願PCT/AU03/01111参照）。これらの配列のうちの何れも、プロモーターおよび／またはターミネーターと組合せて用いられ得る。本発明は、配列番号１によりコードされるＦ３’５’Ｈおよび配列番号３によりコードされるＤＦＲ、ならびにカーネーションＤＦＲ（Z67983, gi: 1067126）（配列番号９）、もしくは低または高緊縮（ストリンジェント）条件下で配列番号１または３または９のいずれかあるいはその相補形態とハイブリダイズし得るか、あるいは最適アラインメント後に配列番号１または３または９と少なくとも約70％の同一性を有するヌクレオチド配列を特に意図する。

緊縮（ストリンジェンシー）のレベルを決定して、配列番号１、配列番号３、配列番号９またはそれらの相補形態とハイブリダイズし得る核酸分子を限定する目的のために、低緊縮は、ハイブリダイゼーションのために少なくとも約0％から少なくとも約15％v/vまでのホルムアミド、および少なくとも約1 M〜少なくとも約2 Mの塩を、ならびに洗浄条件のために少なくとも約1 M〜少なくとも約2 Mの塩を含み、包含する。一般的に、低緊縮性は約25〜30℃から約42℃までである。温度は変更され、ホルムアミドの含入を取り替えるため、および／または代替的緊縮条件を生じるために、より高い温度が用いられ得る。必要な場合、代替的緊縮性条件、例えば中程度の緊縮性（これは、少なくとも約16％v/v〜少なくとも約30％v/vのホルムアミド、および少なくとも約0.5 M〜少なくとも約0.9 Mの塩をハイブリダイゼーションのために、そして少なくとも約0.5 M〜少なくとも約0.9 Mの塩を洗浄条件のために含み、包含する）、あるいは高緊縮性（これは、少なくとも約31％v/v〜少なくとも約50％v/vのホルムアミド、および少なくとも約0.01 M〜少なくとも約0.15 Mの塩をハイブリダイゼーションのために、そして少なくとも約0.01 M〜少なくとも約0.15 Mの塩を洗浄条件のために含み、包含する）が適用され得る。概して、洗浄は、Ｔ_m＝69.3+0.41（Ｇ+Ｃ）％で実行される（Marmur and Doty, J. Mol. Biol. 5: 109, 1962）。しかしながら、二重鎖ＤＮＡのＴ_mは不適性塩基対の数が1％増す毎に1℃減少する（Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem. 46: 83, 1974）。ホルムアミドは、これらのハイブリダイゼーション条件においては随意である。特定レベルの洗浄緊縮性を以下に示す：低緊縮性は、6×ＳＳＣ緩衝液、1.0％w/vＳＤＳ（25〜42℃）；中等度緊縮性は、2×ＳＳＣ緩衝液、1.0％w/vＳＤＳ（20〜65℃の範囲の温度で）；高緊縮性は、2×ＳＳＣ緩衝液、0.1％〜1.0％w/vＳＤＳ（65℃の温度で）。
少なくとも70％の同一性への言及は、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100％の同一性を包含する。配列番号２、４または１０のアミノ酸配列の類似性のレベルでの比較もなされ得る。それゆえ、配列番号２または４または１０で記述されるアミノ酸配列と少なくとも70％の類似性を有するＦ３’５’Ｈ酵素またはＤＦＲをコードする核酸分子が本明細書中で意図される。さらにまた、少なくとも70％の類似性は、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100％の類似性または同一性を包含する。

Ｆ３’５’ＨおよびＤＦＲ酵素をコードする核酸分子、ならびにｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子の発現は、１つ以上のプロモーターおよび／またはターミネーターを包含する。一実施形態では、より高いｐＨを有する組織中のＦ３’５’Ｈおよび／またはＤＦＲヌクレオチド配列の発現を指図するプロモーターが選択される。

一実施形態では、プロモーター配列は、形質転換されるべき宿主カーネーション植物に本来備わっているか、あるいはその領域が宿主植物中で機能的である代替的供給源に由来し得る。他の供給源としては、アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ遺伝子、例えばノパリン、オクタピン、マンノピンまたは他のオピンの生合成のための酵素をコードする遺伝子のためのプロモーター；植物からのプロモーター、例えばユビキチンをコードする遺伝子からのプロモーター；組織特異的プロモーター（米国特許第5,459,252号（Conkling等）；WO 91/13992（Advanced Technologies）参照）；植物ウイルス（例えば、宿主特異的ウイルス）からのプロモーター、あるいは部分的または全体的合成プロモーターが挙げられる。カーネーション植物において潜在的に機能性である多数のプロモーター（例えば、Greve, J. Mol. Appl. Genet. 1: 499-511, 1983；Salomon et al, EMBO, J. 3: 141-146, 1984；Garfinkel et al, Cell 27: 143-153, 1983；Barker et al, Plan Mol. Biol. 2: 235-350, 1983参照）；例えば、植物から単離される種々のプロモーター（例えば、トウモロコシｏｂｉ−１遺伝子からのＵｂｉプロモーター、例えば米国特許第4,962,028号参照）ならびにウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓ）。他の実施形態では、プロモーターは、ＡｍＣＨＳ５’、ＲｏｓｅＣＨＳ５’、ｃａｒｎＡＮＳ５’およびｐｅｔＤＦＲ５’（ＰｅｔｇｅｎＤＦＲから）であり、それぞれ、対応するターミネーターｐｅｔＤ８３’、ｎｏｓ３’、ｃａｒｎＡＮＳ３’およびｐｅｔＤＦＲ３’（ＰｅｔｇｅｎＤＦＲから）を伴う。

プロモーター配列は、転写を調節するシス作用配列を含み得るが、この場合、調節は、例えば化学的または物理的抑圧または誘導（例えば、代謝産物、光または他の物理化学的因子に基づいた調節；例えば、線虫応答性プロモーターを開示するWO 93/06710参照）、あるいは細胞分化に基づいた調節（例えば、植物における葉、根、種子等；例えば、根特異的プロモーターを開示する米国特許第5,459,252号参照）を包含する。

用いられ得る他のシス作用配列としては、転写および／または翻訳エンハンサーが挙げられる。これらのエンハンサー領域は当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得る。

少なくとも１つのＦ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つのＤＦＲ酵素をコードし、少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を、適切なプロモーターおよび／またはターミネーターと組合せて組み入れる核酸分子（単数または複数）は、スプレーカーネーションにおけるフラボノイド分子の活性を調整するために用いられる。デルフィニジンベースの分子のレベルを調整することについての本明細書中での言及は、30％まで、またはそれ以上、特に30〜50％、さらに詳しくは50〜75％、さらに特定的には75％以上、あるいは常態の内在性または現存レベルより低い活性のレベルの上昇または低減に関する。

「花部」という用語は、本明細書中で用いる場合、植物の花をつける部分、あるいは節間伸長により栄養部分から通常は分離され、常態では個々の花、苞葉および花柄、ならびに小花柄を含む１つより多い花の任意の花系を指す。上記のように、「トランスジェニック植物」への言及は「遺伝子改変植物」としても読み取られ得るし、第一世代トランスジェニック植物に最終的には由来する子孫またはハイブリッド系統を包含する。

本発明は、紫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示すスプレーカーネーション、例えばセリースウエストパール・カーネーションまたはその枝変わりの製造における、少なくとも１つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、ならびに内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を組み入れる遺伝子配列の使用も意図する。

本発明は、紫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示すキク植物またはその枝変わりの製造における、少なくとも１つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、ならびに内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｃｈｒｙｓＤＦＲ分子を組み入れる遺伝子配列の使用も意図する。

本発明は、紫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示すバラ植物またはその枝変わりの製造における、少なくとも１つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、ならびに内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｒｏｓｅＤＦＲ分子を組み入れる遺伝子配列の使用も意図する。

本発明は、紫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示すガーベラ植物またはその枝変わりの製造における、少なくとも１つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、ならびに内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｇｅｒｂＤＦＲ分子を組み入れる遺伝子配列の使用も意図する。

本発明は、紫色〜青色を有する組織を含めた花部変更を示す植物の製造における、少なくとも１つの非内在性Ｆ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つの非内在性ＤＦＲ酵素をコードし、ならびに内在性ＤＦＲ遺伝子の発現を抑制する少なくとも１つのｄｓｐｌａｎｔＤＦＲ分子を組み入れる遺伝子配列の使用も意図する。

一実施形態では、植物およびその子孫は、非内在性ＴｈＭＴおよび／または非内在性ＴｈＦＮＳをコードする遺伝物質をさらに含む。遺伝物質は、単一または多重構築物を含み得る。「紫〜青色」は、藤色を包含する。

同様の使用実施形態は、上記のような他の植物に当てはまる。

栽培ビジネスモデルも提供され、そのモデルは、本明細書中に記載されるような遺伝子改変スプレーカーネーション植物を生成すること、苗木、種子、再生可能細胞、組織培養可能細胞または他の物質を栽培者に提供すること、植物の商業的販売数の植物を作り出すこと、ならびに切花を小売人または卸売り人に提供することを包含する。

以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はそれらに限定されない。これらの実施例において、以下に略述するような材料および方法を用いた。

以下の方法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989またはSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001またはPlant Molecular Biology Manual (2^nd edition), Gelvin and Schilperoot (eds), Kluwer Academic Publisher, The Netherlands, 1994またはPlant Molecular Biology Labfax, Croy (ed), Bios scientific Publishers, Oxford, UK, 1993に記載された方法と同様であった。

クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびＰＣＲスクリプトは、Stratagene（米国）から入手した。ｐＣＲ７２．１は、Invitrogen（米国）から入手した。

大腸菌形質転換
用いた大腸菌株を以下に示す：
ＤＨ５α
ｓｕｐＥ４４、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ＡｒｇＦ）Ｕ１６９、（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^-，ｍ_k ⁺）、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１、ｄｅｏＲ（Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557, 1983）。
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^-，ｍ_k ⁺）、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ^-、［Ｆ’ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ^q、ｌａｃＺΔＭ１５、Ｔｎ１０（ｔｅｔ^R）］（Bullock et al, Biotechniques 5: 376, 1987）。
ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ菌株
ｏｍｐＴｈｓｄＳ（Ｒｂ−ｍＢ−）ｄｃｍ+ Ｔｅｔ^r ｇａｌｅｎｄＡＨｔｅ［ａｒｇＵｉｌｅＹｌｅｕＷＣａｍ^r］
Ｍ１５大腸菌は大腸菌Ｋ１２に由来し、表現型Ｎａｌ^s、Ｓｔｒ^s、Ｔｈｉ^-、Ａｒａ⁺、Ｇａｌ⁺、Ｍｔｌ^-、Ｆ^-、ＲｅｃＡ⁺、Ｕｖｒ⁺、Ｌｏｎ⁺を有する。

Inoue et al, Gene 96: 23-28, 1990の方法に従って、大腸菌株の形質転換を実施した。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株および形質転換
用いた無害化アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株は、ＡＧＬ０であった（Lazo et al, Bio/technology 9: 963-967, 1991）。

5 gのプラスミドＤＮＡを、50 mLのＬＢ培養（Sambrook et al, 1989、上記）を接種し、28℃で振盪しながら16時間インキュベートすることにより調製した100μLのコンピーテントＡＧＬ０細胞に付加することにより、プラスミドＤＮＡをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株ＡＧＬ０に導入した。次に、細胞をペレット化して、0.5 mLの85％（v/v）の100 mM ＣａＣｌ₂／15％（v/v）のグリセロール中に再懸濁した。液体Ｎ₂中で2分間インキュベートすることにより、ＤＮＡ−アグロバクテリウム混合物を凍結し、次いで、37℃で5分間のインキュベーションにより解凍させた。次に、ＤＮＡ／細菌混合物を、さらに10分間、氷上に載せた。次いで細胞を1 mLのＬＢ（Sambrook et al, 1989、上記）培地と混合し、28℃で16時間、振盪しながらインキュベートした。適切な抗生物質、例えば50 μg／mLのテトラサイクリンまたは100μg／mLゲンタマイシンを含入するＬＢ寒天プレート上に、当該プラスミドを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を選択した。抗生物質耐性形質転換体から単離されたＤＮＡの制限酵素マッピングにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中のプラスミドの確認を実行した。

ＤＮＡ連結

メーカーにより推奨された手順に従って、Amersham連結キットまたはPromega連結キットを用いて、ＤＮＡ連結を実行した。

ＤＮＡ断片の単離および精製
断片を、概して、メーカー推奨手順に従って、1％（w/v）アガロースゲル上で単離し、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（Qiagen）またはＢｒｅｓａｃｌｅａｎキット（Bresatec, Australia）を用いて精製した。

制限酵素消化後のオーバーハング末端の修復

標準プロトコール（Sambrook et al, 1989、上記）に従って、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片を用いて、オーバーハング５’末端を修復した。標準プロトコール（Sambrook et al, 1989、上記）に従って、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オーバーハング３’末端を修復した。

核酸からのホスホリル基の除去

メーカーの推奨に従って、クローニングベクターからホスホリル基を除去して再環化を防止するために、典型的には、小エビアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ）［USB］を用いた。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）

別記しない限り、鋳型としてプラスミドＤＮＡを用いるＰＣＲ条件は、総容積50μL中に2 ngのプラスミドＤＮＡ、100 ngの各プライマー、2 μLの10 mMｄＮＴＰミックス、5μLの10×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、0.5μLのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いることを包含した。サイクル条件は、94℃で5分間の初期変性ステップ、その後、94℃で20分間、50℃で30分間および72℃で1分間の35サイクルを含み、最後に、72℃で10分間処理した後、4℃で保存した。

Perkin Elmer GeneAmpＰＣＲシステム9600で、ＰＣＲを実施した。

ＤＮＡプローブの ³² Ｐ標識

Ｇｉｇａｐｒｉｍｅキット（Geneworks）を用いて、50 μCiの［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰで放射能標識した。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（Fine）カラムまたはＭｉｃｒｏｂｉｏｓｐｉｎＰ−３０トリス・クロマトグラフィーカラム（BioRad）上でのクロマトグラフィー処理により、取り込まれていない［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰを除去した。

プラスミド単離

適切に選択した抗生物質（例えば、100 μg/mLアンピシリンまたは10〜50μg/mLテトラサイクリン等）を含有するＬＢブロス（Sambrook et al, 1989、上記）を接種し、振盪しながら37℃（大腸菌）または29℃（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）で〜16時間、液体培養をインキュベートすることにより、挿入物に関して単一コロニーを分析した。アルカリ溶解法（Sambrook et al, 1989、上記）を用いて、あるいはＷｉｚａｒｄＰｌｕｓＳＶミニプレプＤＮＡ精製システム（Promega）またはQiagen, Valencia, CAプラスミド・ミニキット（Qiagen）を用いて、プラスミドＤＮＡを精製した。一旦、挿入物の存在が確定されたら、アルカリ溶解法（Sambrook et al, 1989、上記）を用いて、あるいはＱＩＡフィルター・プラスミド・ミディキット（Qiagen）を用いて、メーカーが推奨する条件に従って、50 mLの一晩培養から大量のプラスミドＤＮＡを調製した。

ＤＮＡ配列解析

ＰＲＩＳＭ（商標）即時型反応ダイプライマーサイクルシーケンシングキット（Applied Biosystems）を用いて、ＤＮＡシーケンシングを実施した。Perkin ElmerＰＣＲ機（GeneAmpＰＣＲシステム9600）を用いて、サイクルシーケンシング反応を実施した。一般的に、クイーンズランド大学（St Lucia, Brisbane, Australia）のオーストラリアゲノム研究機関で、ならびにウォルター・エリザホール医学研究所（Melbourne, Australia）で、シーケンシング作業を実施した。

ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）アプリケーション（バージョン9.5.2およびそれ以前のもの）［MacVector Inc, Cary, North Carolina, USA］を用いて、配列を解析した。

ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡプログラム（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8), 2444-2448, 1988）またはＢＬＡＳＴプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990）を用いて、GenBank、SWISS-PROTおよびEMBLデータベースに対する相同性検索を実施した。デフォルト設定を用いるＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）アプリケーション（MacVector Inc, USA）内で、ＬＡＬＩＧＮプログラム（Huang and Miller, Adv. Appl. Math. 12: 373-381, 1991）またはＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（Thompson et al, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994）を用いて、配列類似性パーセンテージを得た。

デフォルト設定を用いるＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson et al, 1994、上記）を用いて、多重配列アラインメントを生成した。

植物形質転換
植物形質転換は、国際特許出願PCT/US92/02612（参照により本明細書中に組み入れられる）または国際特許出願PCT/AU96/00296またはLu et al, Bio/Technology 9: 864-868, 1991に記載されたものと同様である。他の方法も用いられ得る。

Propagation Australia(Queensland, Australia)から、ダイアンサスカリオフィルス（Dianthus caryophyllus）cv.セリースウエストパールの切り枝を得た。

トランスジェニック分析
色コード化

英国王立園芸協会（ＲＨＳ）カラーチャート、第三および／または第四版（London, UK）1995および／または2007を用いて、観察された色の記述を提供した。それらは、観察された色表現型を記述する代替的手段を提供する。しかしながら、指定された数字は、感知された色に対する指針としてのみ解釈されるべきであり、得られると考えられる色を限定するとみなされるべきでない。

カーネーションの花弁は、爪部、副花冠および舷部の３つの帯域からなる（Glimn-Lacy and Kaufman, Botany Illustrated, Introduction to Plants, Major Groups, Flowering Plant Families, 2^nd ed, Springer, USA, 2006）。概して、花弁舷部のみが有色で、爪部は緑色であり、副花冠は白色の色合いである（図４参照）。カーネーションの花弁／花／花部の色への言及は、一般的に、カーネーションの花弁舷部の色に関する。

クロマトグラフィー分析

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を、一般的にはBrugliera et al, Plant J. 5: 81-92, 1994に記載されたとおりに実施した。

概して、花弁舷部から単離した抽出物に関して、ＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析を実施した。

アントシアニジンの抽出

ＨＰＬＣ分析の前に、花弁舷部抽出物中に存在するアントシアニンおよびフラボノール分子を酸加水分解して、アントシアニジンまたはフラボノール・コアからグリコシル部分を除去した。アントシアニジンおよびフラボノール標準を用いて、花抽出物中に存在する化合物を同定する助けとした。

本質的にはFukui et al, 2003（上記）に記載されたとおりに、花弁抽出物を調製した。花弁を、6 N ＨＣｌ（0.2 mL）に付加し、100℃で20分間煮沸した。加水分解アントシアニジンを0.2 mLの１−ペンタノールで抽出した。ＯＤＳ−Ａ３１２（15 cm×6 mm、YMC Co., Ltd, Kyoto, Japan）カラム、1 mL／分の溶媒流量、およびＳＰＤ−Ｍ２０Ａフォトダイオードアレイ検出器（Shimadzu Co., Ltd）を用いてアントシアニジンのＨＰＬＣ分析を実施した。用いた溶媒系を以下に示す：酢酸：メタノール：水＝15：20：65。これらのＨＰＬＣ条件下で、デルフィニジンの保持時間およびλ_maxはそれぞれ4.0分および534 nmであり、これらの値を、真正塩化デルフィニジン（Funakoshi Co., Ltd, Tokyo, Japan）の値と比較した。

既知の標準、すなわちデルフィニジン、ペチュニジン、マルビジン、シアニジンおよびペオニジンを参照することにより、アントシアニジン・ピークを同定した。

花器発育段階

以下のように定義される発育段階で、カーネーション花を採取した：
段階１：閉じた蕾、花弁は見えない。
段階２：開きつつある花蕾：花弁の先端が見える。
段階３：ほぼ全ての花弁の先端が露出。「絵筆段階」
段階４：茎に対して外側花弁が45°の角度。
段階５：花全開。

ＴＬＣまたはＨＰＬＣ分析のために、最大色素蓄積の段階で、段階４の花から花弁舷部を収集した。

ノーザンブロット分析のために、フラボノイド経路遺伝子の最大発現の段階で、段階３の花から花弁を収集した。

実施例１：キメラＦ３’５’Ｈ遺伝子構築物の調製

構築物の調製に用いられるプロモーター、ターミネーターおよびコード断片の要約ならびにそれぞれの略語を、表２に列挙する。

表２：構築物調製に用いられる略語

セリースウエストパールは、セリース有色カーネーション（ＲＨＳＣＣ５７Ｄ）である。それは、典型的には、ペラルゴニジン由来の色素を蓄積し（1.0 mg/gの花弁新鮮重量の総アントシアニン含量の〜99％）、したがってＦ３’Ｈ活性を欠き、そこで、それはＦ３’Ｈ遺伝子における突然変異体と考えられる。２つの花に関するＨＰＬＣ分析結果は、セリースウエストパールの花弁中に蓄積している1.08 mg/gアントシアニン（99％ペラルゴニジン）、2.9〜4.6 mg/gフラボノイドおよび0.3〜0.6 mg/gジヒドロフラボノールを明示した。セリースウエストパールは、ピンク花ウエストパールの枝変わりである。

セリースウエストパールのスプレーカーネーション背景で新規の紫色／青色花を生産するために、パンジーＦ３’５’ＨｃＤＮＡクローンおよびペチュニアゲノムＤＦＲ遺伝子を利用して、ｄｓｃａｒｎＤＦＲ発現カセットを用いてまたは用いずに、２つのバイナリーベクター構築物を調製した。

表３は、セリースウエストパールの形質転換に用いられるバイナリーベクター構築物中に含入されるキメラＦ３’５’ＨおよびＤＦＲ遺伝子発現カセットの要約を提供する（略語の説明に関しては表２を参照）。

表３：キメラ構築物の要約

注：全て、ＡＬＳ選択可能マーカー遺伝子（３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ）を有する。
略語および遺伝構成要素の説明に関しては、表２を参照されたい。

構築物ｐＣＧＰ３６０１、３６０５、３６０７、３６１６はすべてｐＣＧＰ３３６６を基礎にしており、トレニアからのアントシアニン３’５’メチルトランスフェラーゼｃＤＮＡクローンの花特異的または構成的発現（デルフィニジンのメチル化を標的化）［ｐＣＧＰ３６０１および３６０５］またはトレニアからのフラボンシンターゼｃＤＮＡクローンの花特異的または構成的発現（共色素フラボンの産生を標的化）［ｐＣＧＰ３６１６および３６０７］であるエキストラ発現カセットを有する。

構築物の調製
形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６０（ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’；ＰｅｔｇｅｎＤＦＲ；３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ）

形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６０は、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’発現カセットおよびペチュニアゲノムＤＦＲ−Ａ遺伝子を、３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ選択可能マーカー遺伝子と一緒に含有する。

中間プラスミドｐＣＧＰ３３５６（ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’）の構築
プラスミドｐＣＧＰ３３５６は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖中のＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’からなるキメラ遺伝子を含有する。

制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩによる消化時に、プラスミドｐＣＧＰ１９６１（国際特許出願PCT/AU03/01111参照）から、ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０ｃＤＮＡクローンを保有する〜1.6 kb断片を切り離した。オーバーハング末端を修復し、断片を精製した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にＡｍＣＨＳ５’：ｐｅｔＨｆ１：ｐｅｔＤ８３’を含有するプラスミドｐＣＧＰ７２５（国際特許出願PCT/AU03/01111に記載）を、制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＡｍＣＨＳ５’およびｐｅｔＤ８３’領域を保有する主鎖ベクターを切り離した。オーバーハング末端を修復し、〜4.9 kb断片を単離し、精製し、ｐＣＧＰ１９６１（上記）からの平滑末端化ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０断片と連結した。アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＡｍＣＨＳ５’プロモーターおよびｐｅｔＤ８３’ターミネーター間のセンス配向でのＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０ｃＤＮＡクローンの正しい挿入を確認した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３３５６と名づけた。

中間プラスミドｐＣＧＰ３３５７（ｐＣＧＰ１９８８中のＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’）の構築
プラスミドｐＣＧＰ３３５７は、ｐＣＧＰ１９８８ベクター中にＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’からなるキメラ遺伝子を、３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ選択可能マーカー遺伝子と一緒に含有する（国際特許出願PCT/AU03/01111参照）。

プラスミドｐＣＧＰ３３５６（上記）を制限酵素ＰｓｔＩで消化して、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’発現カセットを保有する3.5 kb断片を切り離した。その結果生じた５’−オーバーハングを、標準プロトコール（Sambrook et al, 1989、上記）に従って、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を用いて修復した。断片を精製し、プラスミドｐＣＧＰ１９８８のＳｍａＩ末端と連結した（国際特許出願PCT/AU03/01111参照）。テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ選択可能マーカー遺伝子カセットに関してタンデム配向でのＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’遺伝子の正しい挿入を確認した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３３５７と名づけた。

中間プラスミドｐＣＧＰ１４７２（ペチュニアＤＦＲ−Ａゲノムクローン）の構築

ベクターλ２００１中のペチュニア・ハイブリダｃｖ．Old Glory BlueＤＮＡから、ゲノムライブラリーを作製した（Holton, 1992、上記）。約200,000 pfuをＮＺＹプレート上に沈着させて、収量をＮＥＮフィルター上に取り、フィルターを400,000 cpm/mLの³²Ｐ標識ペチュニアＤＦＲ−ＡｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた（Brugliera et al, 1994（上記）に記載）。ハイブリダイズクローンを精製し、ＤＮＡを各々から単離して、制限酵素消化によりマッピングした。これらのクローンのうちの１つの13 kbＳａｃＩ断片を単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＳａｃＩ末端と結紮して、プラスミドｐＣＧＰ１４７２を作製した。より微細なマッピングは、〜5.3 kbＢｇｌＩＩ断片が完全ペチュニアＤＦＲ−Ａ遺伝子を含有することを示した（Beld et al, 1989、上記）。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６０の構築
制限酵素ＢｇｌＩＩによる消化時に、プラスミドｐＣＧＰ１４７２から、ｐｅｔｇｅｎＤＦＲ遺伝子を保有する5.3 kb断片を切り離した。オーバーハング末端を修復し、断片を精製して、プラスミドｐＣＧＰ３３５７（上記）の修復ＡｓｃＩ末端と結紮した。テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’および３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ遺伝子に関してタンデム配向でのｐｅｔｇｅｎＤＦＲ遺伝子の正しい挿入を確認した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３３６０と名づけた。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６６（ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’；ＰｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’；３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ）
形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６６は、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’発現カセットおよびペチュニアゲノムＤＦＲ−Ａ（ｐｅｔｇｅｎＤＦＲ）遺伝子を、ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’発現カセットおよび３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ選択可能マーカー遺伝子と一緒に含有する。

中間プラスミドｐＣＧＰ３３５９の構築
プラスミドｐＣＧＰ１４７２（上記）を鋳型として、ならびに以下のプライマーを用いて、ＰＣＲにより、180 bpのペチュニアＤＦＲ−Ａイントロン１を保有する断片を増幅した：
ＤＦＲｉｎｔ３５ＳＦ GCAT CTCGAG GGATCC TCG TGA TCC
XhoI BamHI
TGG TAT GTT TTG（配列番号５）
ＤＦＲｉｎｔ３５ＳＲ GCAT TCTAGA AGATCT CTT CTT GTT
BglII BamHI
CTC TAC AAA ATC（配列番号６）

５’末端に制限酵素認識部位ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを組み入れるよう、順方向プライマー（ＤＦＲｉｎｔ３５ＳＦ）を意図した。逆方向プライマー（ＤＦＲｉｎｔ３５ＳＲ）は、増幅された180 bp産物の３’末端にＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を組み入れるよう意図した。その結果生じた180 bpＰＣＲ産物を、次に、制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化して、プラスミドＲＴｐｐｏｐｔｃＡＦＰ（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびターミネーター断片の供給源）のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ末端と結紮した（Wnendt et al., Curr Genet 25: 510-523, 1994）。アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ｐＲＴｐｐｏｐｔｃＡＦＰのＣａＭＶ３５Ｓおよび３５Ｓ３’断片間のペチュニアＤＦＲ−Ａイントロン１断片の正しい挿入を確証した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３３５９と名づけた。

全長カーネーションＤＦＲｃＤＮＡクローンの単離

部分的カーネーションＤＦＲｃＤＮＡクローンの単離は、国際特許出願PCT/AU96/00296に記載されている。
約120,000 pfusのカーネーション・コルチナチャネル花弁ｃＤＮＡライブラリー（その構築は、国際特許出願PCT/AU97/000124に記載されている）を、高緊縮性ハイブリダイゼーション洗浄条件下でプローブとしてＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部分カーネーションＤＦＲ断片の³²Ｐ標識断片（国際特許出願PCT/AU96/00296参照）を用いて、スクリーニングした。約20の強ハイブリダイズプラークを選択し、さらに精製した。これらのうち、１つ（ＫＣＤＦＲ＃１７）は、1.3 kb挿入物を含有し、そして51 bpの５’非翻訳配列を有する全長カーネーションＤＦＲｃＤＮＡクローンを示した。プラスミドを、ｐＣＧＰ１５４７と名づけた。

中間プラスミドｐＣＧＰ３３６３（ＣａＭＶ３５Ｓ：センス部分カーネーションＤＦＲ：ペチュニアＤＦＲイントロン１：３５Ｓ３’）の構築
プラスミドｐＣＧＰ１５４７（上記）を鋳型として、ならびに以下のプライマーを用いて、ＰＣＲにより、〜300 bpのカーネーションＤＦＲｃＤＮＡクローンを保有する断片を増幅した：
ｄｓｃａｒｎＤＦＲＦ GCAT TCTAGA CTCGAG CGA GAA
XbaI XhoI
TGA GAT GAT AAA ACC（配列番号７）
ｄｓｃａｒｎＤＦＲＲ GCAT AGATCT GGATCC GAG ATT GTT
BglII BamHI
TTC TGC G（配列番号８）

５’末端に制限酵素認識部位ＸｂａＩおよびＸｈｏＩを組み入れるよう、順方向プライマー（ｄｓｃａｒｎＤＦＲＦ）を意図した。逆方向プライマー（ｄｓｃａｒｎＤＦＲＲ）は、増幅された〜300 bp産物の３’末端にＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を組み入れるよう意図した。その結果生じた〜300 bpＰＣＲ産物を、次に、制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化して、プラスミドｐＣＧＰ３３５９（上記）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ末端と結紮した。アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、プラスミドｐＣＧＰ３３５９のＣａＭＶ３５ＳおよびペチュニアＤＦＲイントロン１断片間のセンス方向での部分カーネーションＤＦＲ断片の正しい挿入を確認した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３３６３と名づけた。

中間プラスミドｐＣＧＰ３３６４（ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓＣａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’）の構築

上記の増幅部分カーネーションＤＦＲ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化し、プラスミドｐＣＧＰ３３６３（上記）のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ末端と結紮した。アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、プラスミドｐＣＧＰ３３６３のペチュニアＤＦＲイントロン１および３５Ｓ３’断片間のアンチセンス方向での部分カーネーションＤＦＲ断片の正しい挿入を確認した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３３６４と名づけた。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６６の構築

制限酵素ＰｓｔＩによる消化時に、プラスミドｐＣＧＰ３３６４から、ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’発現カセットを保有する〜1.4 kb断片を切り離した。断片を精製して、プラスミドｐＣＧＰ３３６０（上記）のＰｓｔＩ末端と結紮した（図２）。テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’、ｐｅｔｇｅｎＤＦＲおよび３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ遺伝子に関してタンデム配向でのＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’発現カセットの正しい挿入を確認した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３３６６と名づけた（図３）。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６０およびｐＣＧＰ３３６６のＴ−ＤＮＡを、アグロバクテリウム媒介性形質転換により、スプレーカーネーション系統セリースウエストパール中に導入した。除草剤クロルスルフロンを含有する培地上で成育し、根を生じるそれらの能力に基づいて、トランスジェニック細胞を選択した。根を有するトランスジェニック苗を培地から取り出して、土壌に移し、Bundoora（Victoria, Australia）の温度制御温室中で成育させ、開花させた。

ＲＨＳＣＣを用いて眼で、トランスジェニック植物の花弁舷部の色を記録し、ＨＰＬＣ分析を用いて加水分解花弁リム抽出物中のアントシアニジンを確定した。結果を表４に要約する。

表４：Ｆ３’５’ＨおよびＤＦＲ遺伝子発現カセットを含有するＴ−ＤＮＡで形質転換されたセリースウエストパールカーネーションからの花弁のトランスジェニック分析の結果

導入遺伝子＝Ｔ−ＤＮＡ上に含入されるキメラＦ３’５’ＨおよびＤＦＲヌクレオチド配列
ｐＣＧＰ＝形質転換実験に用いられた形質転換ベクターのプラスミドｐＣＧＰ識別番号（詳細に関しては表３を参照）
＃ｔｇ＝産生されたトランスジェニックカーネーションの総数
％ＣＣ＝紫色範囲方向への花弁色のシフトを有した産生系統の総数のパーセンテージ
＃ＨＰＬＣ＝ＨＰＬＣにより加水分解花弁舷部抽出物のアントシアニジンを分析した個々の系統の数。桃色から紫色範囲への花弁の色の眼に見えるシフトに基づいて、分析用花弁を選択した
％ｄｅｌ（範囲）＝トランスジェニック系統の集団に関して花弁の加水分解抽出物中に検出されたデルフィニジンの範囲（％）
Ａｖｄｅｌ＝トランスジェニック系統の集団に関して花弁の加水分解抽出物中に検出されたデルフィニジンの平均（％）
Ｄｅｌmg/gＦＷ＝トランスジェニック系統の集団に関して花弁の加水分解抽出物中に検出されたデルフィニジンの量の範囲（mg/新鮮重量1g）

結果は、試験した２つの構築物（ｐＣＧＰ３３６０およびｐＣＧＰ３３６６）のうち、ｐＣＧＰ３３６６は、紫色範囲への色のシフトを有する花を生じた系統のパーセンテージがより高かった、ということを示唆している。さらに、花弁の加水分解抽出物中で検出された平均デルフィニジンは、ｐＣＧＰ３３６０系統と比較して、ｐＣＧＰ３３６６系統ではより高かったこれは、おそらくは、ＤＨＫ基質に関する内在性ＤＦＲおよび導入Ｆ３’５’Ｈ間の競合低減をもたらすＲＮＡｉ媒介性サイレンシングを介したｄｓｃａｒｎＤＦＲカセットによる内在性カーネーションＤＦＲの抑制のためであると思われた。導入ペチュニアＤＦＲ（ＤＨＫを利用できない）は、その後、ＤＨＭ（ＤＨＫ上でのＦ３’５’Ｈ反応の生成物）をロイコデルフィニジンに変換させ、内在性アントシアニン経路酵素による活性が花弁組織中に蓄積するデルフィニジン由来色素を生じた。新規の色の花弁を生じるスプレーカーネーション系統を同定するために、花弁舷部の色を、既に市場に出ている藤色／紫色カーネーション系統と比較した。これらは、ミディカーネーション系統FLORIGENE Moonshadow（商標）［８２Ａ、８２Ｂ］およびFLORIGENE Moondust（７６Ａ）、ならびにスタンダードカーネーション系統FLORIGENE Moonvista（商標）［８１Ａ＋］、FLORIGENE Moonshade（商標）［８１Ａ、８２Ａ］、FLORIGENE Moonlite（商標）［７７Ｄ／８２Ｄ、７７Ｃ、Ｎ８０Ｂ］およびFLORIGENE Moonaqua（商標）［８４Ａ／Ｂ］を包含した。22のＣＷ／３３６６系統を、新規のスプレーカーネーションであるとして最初に選択したが、一方、新規のスプレーカーネーション系統であるとして選択したＣＷ／３３６０系統は１つだけであった。花弁色の一貫性および花弁数に関してさらに試験した結果、新製品系統の可能性を有する新規のスプレーカーネーションであるとされたものはＣＷ／３３６６では11と減少し、ＣＷ／３３６０では全くなかった（表５）。

表５：選択セリースウエストパール／３３６６系統で検出された花弁舷部のＲＨＳ色コードおよびデルフィニジンレベル

受託番号＝個々のトランスジェニック系統に与えられる独自の番号
ＲＨＳＣＣ番号＝トランスジェニックカーネーション系統の花からの花弁舷部の色コード。ＲＨＳＣＣ番号の傍らの「＋」は、その色が選択コードのより濃いまたはより強い色調である、ということを強調する
デルフィニジンレベル＝総案とシアニジンのパーセンテージおよび花弁組織の新鮮重量１g当たりのmgで示されるＨＰＬＣにより確定されるような花弁舷部組織の加水分解抽出物中で検出されるデルフィニジンレベル
ｎｄ＝実行せず

コロンビアにおけるさらなる野外試験評価は、系統＃２５９５８、＃２５９４７、＃２５９７３、＃２５９６５および＃２５９７６は、一貫した且つ安定した色ならびに良好な植物成育特性を有する新規のスプレーカーネーション花を生じる、ということを明示した。２つの系統（＃２５９５８および＃２５９４７）を、商業化のために選択した。その後、系統＃２５９５８をFLORIGENE Moonberry（商標）、系統＃２５９４７をFLORIGENE Moonpearl（商標）と名づけた。ともに、世界中の市場に出すための切花の生産のために、コロンビアで栽培されている。

他のカーネーション品種中への形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６６の導入

構築物ｐＣＧＰ３３６６（少なくとも１つのＦ３’５’Ｈ酵素および少なくとも１つのＤＦＲ酵素を含有し、少なくとも１つのｄｓｃａｒｎＤＦＲ分子を組み入れた）を用いてカーネーション品種セリースウエストパール中の高デルフィニジンレベルを首尾よく得るために、同一遺伝子を、他の有色カーネーション栽培変種、例えばシンデレラ、ウエストパール、ベガ、アーティザン、バーバラ、ダークランデブー、ミレディ、コルチナチャネル（これらに限定されない）中に導入する。

トランスジェニック植物を上記のような花色に関して評価し、（対照と比較して）新規の花色を有する系統を商業化のために選択する。

他の発現カセットの主鎖付加としてのバイナリーベクターｐＣＧＰ３３６６の使用

さらに青色／紫色範囲の方向に花弁色をシフトするために、アントシアニンまたはフラボノイド組成を調整する他の遺伝子をｐＣＧＰ３３６６バイナリーベクターに付加した。これらは、カーネーションにおけるメチル化アントシアニンの産生、例えばマルビジンおよびペツニジン色素の産生を調製するためのＳ−アデノシルメチオニン：アントシアニン３’５’メチルトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）活性をコードする遺伝子、ならびにフラボンの産生を調整するためのフラボンシンターゼ（ＦＮＳ）活性をコードする遺伝子を包含した。
ｐＣＧＰ３３６６バイナリーベクターへのＡＭＴ発現カセットの付加

マルビジン（メチル化形態のデルフィニジン）を基礎にしたアントシアニンを産生しようとして、形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６６（図３）にＡＭＴ発現カセットを付加することにより、２つの新規の形質転換ベクターｐＣＧＰ３６０１およびｐＣＧＰ３６０５を調製した。トレニアからのＡＭＴ配列（国際特許出願PCT/AU03/00079）を、カーネーションのＡＮＳ遺伝子からの花特異的プロモーター断片（ｃａｒｎＡＮＳ５’）およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子からの構成的プロモーター断片（ＣａＭＶ３５Ｓ）の制御下で用いた。
形質転換ベクターｐＣＧＰ３６０１（ｃａｒｎＡＮＳ５’：ＴｈＭＴ：ｃａｒｎＡＮＳ３’；ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’；ＰｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＣａＭＶ３５Ｓ５’：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’；３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ）

バイナリー構築物ｐＣＧＰ３６０１は、ｐＣＧＰ３３６６バイナリー構築物主鎖（上記）（図３）中にｃａｒｎＡＮＳ５’：ＴｈＭＴ：ｃａｒｎＡＮＳ３’発現カセットを含有する。

中間プラスミドｐＣＧＰ３４３１（ｃａｒｎＡＮＳ５’：ＴｈＭＴ：ｃａｒｎＡＮＳ３’）の構築

制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｓｐ７１８による消化時に、プラスミドｐＴＭＴ５（国際特許出願PCT/JP00/00490に記載）から、トレニアＡＭＴｃＤＮＡクローンを保有する〜1.0 kb断片（Ｔｈ]ＭＴ）（配列番号１１）を切り離した。オーバーハング末端を修復し、精製断片を、プラスミドｐＣＧＰ１２７５（国際特許出願PCT/AU2008/01700（参照により本明細書中に組み入れられる）に記載）のＸｂａＩ／ＰｓｔＩ修復末端と結紮した。アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、カーネーションＡＮＳ遺伝子のプロモーター断片（ｃａｒｎＡＮＳ５’）およびカーネーションＡＮＳ遺伝子のターミネーター断片（ｃａｒｎＡＮＳ３’）間のＴｈＭＴ断片の正しい挿入を確立した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３４３１と名づけた。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３６０１の構築

制限酵素ＣｌａＩによる消化時に、プラスミドｐＣＧＰ３４３１から、ｃａｒｎＡＮＳ５’：ＴｈＭＴ：ｃａｒｎＡＮＳ３’発現カセットを保有する4.4 kb断片を単離した。オーバーハング末端を修復し、精製断片を、プラスミドｐＣＧＰ３３６６（上記）（図３）のＰｍｅＩ末端と結紮した。テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’、ｐｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＣａＭＶ３５Ｓ５’：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’および３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ遺伝子に関してタンデム配向でのｃａｒｎＡＮＳ５’：ＴｈＭＴ：ｃａｒｎＡＮＳ３’発現カセットの正しい挿入を確立した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３６０１と名づけた（図４）。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３６０５（ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’；ＣａＭＶ３５Ｓ：ＴｈＭＴ：３５Ｓ３’；ＰｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’；３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ）

バイナリー構築物ｐＣＧＰ３６０５は、ｐＣＧＰ３３６６バイナリー構築物主鎖（上記）（図３）中にＣａＭＶ３５Ｓ：ＴｈＭＴ：３５Ｓ３’発現カセットを含有する。

中間プラスミドｐＣＧＰ３０９７（ＣａＭＶ３５Ｓ：ＴｈＭＴ：３５Ｓ３’）の構築

制限酵素Ａｓｐ７１８による消化時に、プラスミドｐＴＭＴ５（国際特許出願PCT/JP00/00490に記載）を先ず線状化した。オーバーハング末端を修復し、次いで、トレニアＡＭＴｃＤＮＡクローンを保有する〜1.0 kb断片（ＴｈＭＴ）（配列番号１１）を、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化時に、線状化プラスミドから切り離した。断片を精製し、プラスミドｐＲＴｐｐｏｐｔｃＡＦＰ（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびターミネーター断片の供給源）のＸｂａＩ（修復末端）／ＥｃｏＲＩ末端と結紮した（Wnendt et al., 1994、上記）。アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子のプロモーターおよびターミネーター断片（それぞれ、ＣａＭＶ３５Ｓおよび３５Ｓ３’）間のセンス配向でのＴｈＭＴ断片の正しい挿入を確立した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３０９７と名づけた。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３６０５の構築

制限酵素ＰｓｔＩによる消化時に、プラスミドｐＣＧＰ３０９７（上記）から、ＣａＭＶ３５Ｓ：ＴｈＭＴ：３５Ｓ３’発現カセットを保有する〜1.6 kb断片を単離した。オーバーハング末端を修復し、精製断片を、プラスミドｐＣＧＰ３３６６（上記）（図３）のＰｍｅＩ末端と連結した。テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’、ｐｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’および３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ遺伝子に関してタンデム配向でのＣａＭＶ３５Ｓ：ＴｈＭＴ：３５Ｓ３’発現カセットの正しい挿入を確立した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３６０５と名づけた（図５）。
ｐＣＧＰ３３６６バイナリー構築物へのＦＮＳ発現カセットの付加

セリースウエストパール背景でフラボン（共色素として作用するため）および高レベルのデルフィニジンを産生しようとして、形質転換ベクターｐＣＧＰ３３６６（図３）にＦＮＳ発現カセットを付加することにより、さらに２つの形質転換ベクターｐＣＧＰ３６１６およびｐＣＧＰ３６０７を調製した。トレニアからのＦＮＳ配列（国際特許出願PCT/JP00/00490）（配列番号１３）を、バラのＣＨＳ遺伝子からの花特異的プロモーター断片（ＲｏｓｅＣＨＳ５’）およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子からの構成的プロモーター断片（ＣａＭＶ３５Ｓ）の制御下で用いた。
形質転換ベクターｐＣＧＰ３６１６（ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’；ＲｏｓｅＣＨＳ５’：ＴｈＦＮＳ：ｎｏｓ３’；ＰｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’；３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ）

バイナリー構築物ｐＣＧＰ３６１６は、ｐＣＧＰ３３６６バイナリー構築物主鎖（上記）（図３）中にＲｏｓｅＣＨＳ５’：ＴｈＦＮＳ：ｎｏｓ３’発現カセットを含有する。

中間プラスミドｐＣＧＰ３１２３（ＲｏｓｅＣＨＳ５’：ＴｈＦＮＳ：ｎｏｓ３’）の構築

制限酵素ＡｓｃＩによる消化時に、バイナリーベクタープラスミドｐＳＦＬ５３５（国際特許出願WO2008/156206に記載）から、ｅ３５Ｓ５’：ＴｈＦＮＳ：ｐｅｔＤ８３’発現カセットを保有する3.2 kb断片を切り離した。断片を精製し、2.9 kbプラスミドｐＵＣＡＰ＋ＡｓｃＩのＡｓｃＩ末端と結紮した（プラスミドｐＵＣＡＰ／ＡｓｃＩは、マルチクローニング部位のいずれかの末端にエクストラクローニング部位、具体的にはＡｓｃＩ認識部位を有するｐＵＣ１９ベースのクローニングベクターである）。アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ｐＵＣベースのクローニングベクター中のｅ３５Ｓ５’：ＴｈＦＮＳ：ｐｅｔＤ８３’発現カセットの正しい挿入を確立した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３１２３と名づけた。

中間プラスミドｐＣＧＰ３６１２（ＲｏｓｅＣＨＳ５’：ＴｈＦＮＳ：ｎｏｓ３’）の構築

このプラスミドｐＣＧＰ３１２３（上記）を、制限酵素ＢａｍＨＩでの消化時に、線状化した。オーバーハング末端を修復し、次に、線状化プラスミドをその制限酵素ＸｈｏＩで部分消化後に、ＴｈＦＮＳｃＤＮＡを保有する断片を切り離した。1.7 kb断片を精製し、国際特許出願PCT/AU2008/001694に記載されたプラスミドｐＣＧＰ２２０３（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖中のＲｏｓｅＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃１８：ｎｏｓ３’）のＳｍａＩ／ＸｈｏＩ末端と結紮した。アンピシリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＲｏｓｅＣＨＳプロモーターおよびｎｏｓターミネーター間のＴｈＦＮＳ断片の正しい挿入を確立した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３６１２と名づけた。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３６１６の構築

制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩによる消化時に、プラスミドｐＣＧＰ３６１２（上記）から、ＲｏｓｅＣＨＳ５’：ＴｈＦＮＳ：ｎｏｓ３’発現カセットを保有する4.9 kb断片を単離した。オーバーハング末端を修復し、精製断片を、プラスミドｐＣＧＰ３３６６（上記）（図３）のＰｍｅＩ末端と連結した。テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’、ｐｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’および３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ遺伝子に関してタンデム配向でのＲｏｓｅＣＨＳ５’：ＴｈＦＮＳ：ｎｏｓ３’発現カセットの正しい挿入を確立した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３６１６と名づけた（図６）。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３６０７（ＣａＭＶ３５Ｓ’：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’；ｅ３５Ｓ５’：ＴｈＦＮＳ：ｐｅｔＤ８３’；ＰｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’；３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ）

バイナリー構築物ｐＣＧＰ３６０７は、ｐＣＧＰ３３６６バイナリー構築物主鎖（上記）（図３）中にｅ３５Ｓ５’：ＴｈＦＮＳ：ｐｅｔｏＤ８３’発現カセットを含有する。
形質転換ベクターｐＣＧＰ３６０７の構築

制限酵素ＡｓｃＩによる消化時に、プラスミドｐＣＧＰ３１２３（上記）から、ｅ３５Ｓ５’：ＴｈＦＮＳ：ｐｅｔｏＤ８３’発現カセットを保有する3.2 kb断片を切り離した。断片を精製し、プラスミドｐＣＧＰ３３６６（上記）（図３）のＰｍｅＩ末端と結紮した。テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により、ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’、ｐｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’および３５Ｓ５’：ＳｕＲＢ遺伝子に関してタンデム配向でのｅ３５Ｓ５’：ＴｈＦＮＳ：ｐｅｔｏＤ８３’発現カセット正しい挿入を確立した。その結果生じたプラスミドを、ｐＣＧＰ３６０７と名づけた（図７）。

形質転換ベクターｐＣＧＰ３６０１（図４）、ｐＣＧＰ３６０５（図５）、ｐＣＧＰ３６０７（図７）およびｐＣＧＰ３６１６（図６）のＴ−ＤＮＡを、アグロバクテリウム媒介性形質転換により、スプレーカーネーション系統セリースウエストパール中に導入した。除草剤クロルスルフロンを含有する培地上で成育し、根を生じるそれらの能力に基づいて、トランスジェニック細胞を選択した。根を有するトランスジェニック苗を培地から取り出して、土壌に移し、Bundoora（Victoria, Australia）の温度制御温室中で成育させ、開花させた。結果を、表６に要約する。

表６：紫色／菫色範囲方向への花弁色の有意のシフトを生じたトランスジェニックセリースウエストパールの数の要約

構築物＝形質転換実験に用いた形質転換ベクターのプラスミドｐＣＧＰ識別番号
ｐＣＧＰ３３６６への付加＝ＡｍＣＨＳ５’：ＢＰＦ３’５’Ｈ＃４０：ｐｅｔＤ８３’；ＰｅｔｇｅｎＤＦＲ；ＣａＭＶ３５Ｓ：ｄｓｃａｒｎＤＦＲ：３５Ｓ３’導入遺伝子を含有するｐＣＧＰ３３６６（図３）主鎖に付加されるエキストラ発現カセット
＃Ｔｇ＝産生されたトランスジェニックカーネーション系統の総数
ＣＣ＝「色変化」−紫色範囲方向への花弁色のシフトを有した産生系統の数

上記のような花色に関してトランスジェニック植物を評価し、（対照と比較して）新規の花色を有する系統を商業化のために選択される。

本明細書中に記載される本発明は、具体的に記載されたもの以外の変更および修正を受け入れることができる、と当業者は理解するであろう。本発明はこのような変更および修正の全てを包含する、と理解されるべきである。本発明は、本明細書中で個別にまたは集合的に言及されるかまたは示される全てのステップ、特徴、組成物および化合物、ならびに上記のステップまたは特徴のうちの任意の２つ以上の任意のおよび全ての組合せも包含する。

Claims

花色が変更された遺伝子修飾カーネーション植物であって、該植物は、以下の：
配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコードされた非固有フラボノイド３’，５’ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’５’Ｈ）酵素；
配列番号３に示すヌクレオチド配列によりコードされた非固有ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ（ＤＦＲ）酵素；
該カーネーション植物の固有ＤＦＲの発現をダウンレギュレートするための、該カーネーション植物のＤＦＲ遺伝子に相当し、かつ、配列番号９に示すヌクレオチド配列の断片を含むセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列（ｄｓｃａｒｎＤＦＲ）；並びに
配列番号１１に示すヌクレオチド配列によりコードされた非固有Ｓ−アデノシルメチオニン：アントシアニン３’５’メチルトランスフェラーゼ（ＴｈＭＴ）；又は
配列番号１３に示すヌクレオチド配列によりコードされたフラボンシンターゼ（ＴｈＦＮＳ）；
を発現する少なくとも１つの発現遺伝物質を含み、かつ、該カーネーション植物がセリースウエストパール栽培品種という背景で存在する、前記遺伝子修飾カーネーション植物。
花色が変更された遺伝子修飾カーネーション植物の生産方法であって、
該カーネーション植物に、以下の：
配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコードされた非固有フラボノイド３’，５’ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’５’Ｈ）酵素；
配列番号３に示すヌクレオチド配列によりコードされた非固有ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ（ＤＦＲ）酵素；
該カーネーション植物の固有ＤＦＲの発現をダウンレギュレートするための、該カーネーション植物のＤＦＲ遺伝子に相当し、かつ、配列番号９に示すヌクレオチド配列の断片を含むセンス及びアンチセンスヌクレオチド配列（ｄｓｃａｒｎＤＦＲ）；並びに
配列番号１１に示すヌクレオチド配列によりコードされた非固有Ｓ−アデノシルメチオニン：アントシアニン３’５’メチルトランスフェラーゼ（ＴｈＭＴ）；又は
配列番号１３に示すヌクレオチド配列によりコードされたフラボンシンターゼ（ＴｈＦＮＳ）；
を発現する少なくとも１つの発現遺伝物質を、
導入するステップ；及び
それからカーネーション植物を再生するステップ；
を含み、ここで、該カーネーション植物がセリースウエストパール栽培品種という背景で存在する、前記生産方法。