PL170326B1 - S posób wytwarzania rosliny transgenicznej PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania rosliny transgenicznej lub cietego kwiatu z tej rosliny, zdolnej do ekspresji rekombinowanej 3',5'-hydroksylazy flawonoidowej, znamienny tym, ze do komórki od- powiedniej rosliny wprowadza sie czasteczke kwasu nukleinowego obejmujaca sekwencje nukleoty- dów przedstawiona na fig. 9 lub fig. 10, albo obejmujaca sekwencje nukleotydów zdolna do hybrydyzowania z sekwencja nukleotydów przedstawiona na fig. 9 lub fig. 10, lub z sekwencja nukleotydów komplementarna do niej, w ostrych warunkach obejmujacych warunki przemywania 6XSSC w temperaturze 50°C, w warunkach umozliwiajacych ewentualna ekspresje czasteczki wspomnianego kwasu nukleinowego, regeneruje sie transgeniczna rosline z tej komórki i namnaza sie transgeniczna rosline przez czas i w warunkach wystarczajacych do ekspresji czasteczki kwasu nukleinowego i ewentualnie odcina sie kwiat od tej rosliny 10. Sposób wytwarzania rosliny transgenicznej lub cietego kwiatu z tej rosliny, zdolnej do ekspresji rekombinowanej 3',5'-hydroksylazy flawonoidowej, znamienny tym, ze do komórki odpowiedniej rosliny wprowadza sie czasteczke kwasu nukleinowego obejmujaca sekwencje nukleotydów kodujaca 3',5'-hydroksylaze przedstawiona na fig. 9 lub fig. 10, lub obejmujaca sekwencje nukleotydów kodujaca sekwencje aminokwasowa majaca co najmniej 60% podobienstwa do sekwencji aminokwasowej przedstawiona na fig. 9 lub fig. 10, w warunkach umozliwiajacych ewentualna ekspresje wspomnianego kwasu nukleinowego, regeneruje sie transgeniczna rosline z tej komórki i namnaza sie transgeniczna rosline przez czas 1 w warunkach wystarczajacych do ekspresji czasteczki kwasu nukleinowego 1 ewentualnie odcina sie kwiat od tej rosliny. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny transgenicznej. W ogólniejszym ujęciu wynalazek dotyczy wytwarzania roślin transgenicznych z zastosowaniem sekwencji genetycznych, kodujących enzymy metabolizujące ścieżki flawonoidowe, służące do manipulowania pigmentacją w roślinach i innych organizmach.

Przemysł kwiaciarski dąży do opracowania nowych i różnorodnych odmian roślin kwiatowych. Skuteczną drogą stworzenia takich nowych odmian jest manipulowanie kolorem kwiatu i odniesiono pewien sukces, stosując tradycyjne techniki hodowli do wytworzenia szerokiego zakresu kolorów dla większości handlowych odmian kwiatów. Podejście to jest jednakże ograniczone przez zasoby genów dla poszczególnych gatunków, i z tego powodu rzadko zdarza się, aby pojedynczy gatunek posiadał pełne spektrum odmian barwnych. Rzeczywiście, z powodu ograniczonej dostępności kwiatów niebieskich mniej niż pięć procent kwiatów ciętych, sprzedawanych w systemie aukcyjnym w Holandii w 1988 roku było koloru niebieskiego Spośród dwunastu najlepiej sprzedawanych kwiatów odmiany niebiesko zabarwione oferowane są tylko dla irysa i frezji, a odmiany te stanowią mniej niż cztery procent łącznej sprzedaży kwiatów. Opracowanie niebieskich odmian ważnych gatunków kwiatów ciętych, na przykład róży, chryzantemy, goździka i gerbery będzie bardzo korzystne zarówno dla rynku kwiatowego jak i rynku artykułów dekoracyjnych.

Kolor kwiatów jest związany przede wszystkim z obecnością dwóch pigmentów flawonoidów i karotenoidów. Flawonoidy są odpowiedzialne za gamę kolorów od żółtego przez czerwony do niebieskiego. Karotenoidy nadają odcień pomarańczowy lub żółty i są zwykle jedynym barwnikiem w kwiatach żółtych lub pomarańczowych. Cząsteczkami flawonoidów odpowiedzialnymi za kolor kwiatu są antocyjaniny, będące glikozylowanymi pochodnymi cyjanidyny, delfmidyny, petunidyny, peonidyny, malwidyny i pelargonidyny, które są zlokalizowane w wakuolach. Różne antocyjaniny mogąwytwarzać znaczne różnice w kolorze. Na kolor kwiatu ma również wpływ ko-pigmentacja flawonoidami bezbarwnymi, kompleksowanie metalami, glikozylowanie, acylowanie, metylowanie i pH w wakuolach (Forkmann, 1991).

Ścieżka biosyntetyczna dla pigmentów flawonoidowych (w dalszej treści opisu nazywana “ścieżką flawonoidową”) jest dobrze poznana i jest pokazana na fig. 1 (Ebel i Hahlbrock, 1988; Hahlbrock i Griesebach, 1979; Wieringi de Vlaming, 1984; SchrEanetal, 1984; Stafford, 1990). Pierwszym pokazanym etapem ścieżki jest kondensacja trzech cząsteczek malonylo-CoA zjedną cząstecziką p-kumaroilo-CoA. Reakcja ta jest katalizowana przez enzym syntetazę chalkonową (CHS). Produkt tej reakcji, 2',4,4',6'-tetrahydrochalkon jest normalnie natychmiast izomeryzowany z wytworzeniem naringeniny przez enzym izomerazę chalkonowoflawanonową (CHI). Naringeninajest następnie hydroksylowana w pozycji 3 środkowego pierścienia przez 3-hydroksylazę flawanonową (F3H) z wytworzeniem dihydrokempferolu (dHk).

Pierścień B dihydrokempferolu może być hydroksylowany albo w pozycji 3' albo w pozycjach 3' i 5' z wytworzeniem odpowiednio dihydrokwercetyny (DHQ) i dihydromirycetyny (DHM). Dwoma kluczowymi enzymami biorącymi udział w tej ścieżce są 3'-hydroksylaza flawonoidowa (w dalszej treści określana jako 3'-hydroksylaza) i 3',5'-hydroksylaza flawonoidowa (w dalszej treści określana jako 3',5'-hydroksylaza. 3'-Hydroksylaza działa na DHK wytwarzając DHQ i na naringeninę, wytwarzając eriodiktiol. 3',5'-Hydroksylaza jest enzymem o szerokim spektum działania, katalizującym hydroksylacje naringeniny i DHK w pozycjach 3' i 5' oraz eriodiktiolu i DHQ w pozycji 5' (Stotz i Forkmann, 1982), w obu przypadkach wytwarzając odpowiednio pentahydroksyflawanon i DHM. Schemat hydroksylacji pierścienia B odgrywa kluczową rolę dla ustalenia koloru płatków kwiatu.

3'-Hydroksylacja flawonoidów w ekstraktach mikrosomalnych wymaga NADPH i O2, jak również aglikonu naringeniny albo aglikonu DHK. Dobrze zbadany jest enzym z hodowli komórek pietruszki (Hagmann et al, 1983). Hamowanie przez tlenek węgla, cytochrom c i NADP+ wskazuje, ze enzym jest enzymem zależnym od cytochromu P450. Wykazano, ze podobny enzym jest obecny w kukurydzy (Larson i Bussard, 1986). 3',5'-Hydroksylaza jest również enzymem klasy cytochromu P450. Enzymy cytochromu P450 są szeroko rozpowszechnione w naturze i zostały scharakteryzowane u kręgowców, owadów, drożdży, grzybów, bakterii

170 326 i jednej rośliny. Oznaczono sekwencję co najmniej 154 genów cytochromu P450 i pogrupowano geny u 27 różnych rodzin genowych (Nebert et al, 1991). W obrębie jednej rodziny sekwencje białka P450 są generalnie identyczne w > 40%, natomiast sekwencje w obrębie tej samej podrodziny są identyczne w > 46% (Herbert et al, 1991). Informacja o roślinnych cytochromach P450 jest ograniczona.

Zdolność regulowania w roślinach aktywności 3' lub 3',5'-hydroksylazy lub innych enzymów biorących udział w drodze flawonoidowej dostarczyłaby środka do manipulowania kolorem płatków kwiatu, umożliwiając przez to ekspresję przez pojedynczy gatunek szerszego spektrum kolorów kwiatów. W tym celu zidentyfikowano i sklonowano sekwencje genetyczne, kodujące enzymy ścieżki flawonoidowej, takie jak 3',5'-hydroksylaza. Te sekwencje rekombinacyjne pozwalają na modulację metabolizmu DHK, jak również metabolizmu innych substratów, takich jak DHQ, naringenina i eriodiktiol, i determinowanie dzięki temu schematu hydroksylacji antocyjanin oraz dostarczenie środka do manipulacji kolorem płatków kwiatu Regulowanie aktywności enzymów ścieżki flawonoidowej pozwala także na manipulowanie kolorem owoców i warzyw oraz liści, na przykład roślin dekoracyjnych. Przy opracowywaniu sposobu według wynalazku sporządzono izolat kwasu nukleinowego, zawierający sekwencję nukleotydów, kodującą lub komplementarną do sekwencji kodującej enzym hydroksyłujący dihydrokempferol (DHK), lub jego pochodną, albo część.

Dla wygody i jedynie z uwagi na skrócenie zapisu stosowane tu określenie “enzym hydroksyłujący DHK” obejmuje enzymy hydroksylujące ścieżki flawonoidowej, działające na jeden lub więcej z poniższych substratów: DHK, DHQ, naringenina, eriodiktiol.

Korzystnie enzymem hydroksyłującym DHK jest 3',5'-hydroksylaza. Jednakże metody zastosowane do klonowania sekwencji genetycznych kodujących ten enzym mogą być zastosowane do wyizolowania sekwencji genetycznych, kodujących inne enzymy, takie jak 3'-hydroksylaza. Zgodnie z tym odwołanie się w treści opisu do izolacji i klonowania 3',5'-hydroksylazy należy uważać za obejmujące odwołanie się do innych flawonoidowych enzymów hydroksyłujących, takich jak 3'-hydroksylaza.

Przez określenie “izolat kwasu nukleinowego” rozumie się sekwencję genetyczną w stanie niewystępującym naturalnie. Generalnie oznacza to wyizolowanie z jej naturalnego stanu lub utworzenie za pomocą procedur niekoniecznie spotykanych w jej naturalnym otoczeniu. W szczególności obejmuje ono cząsteczki kwasu nukleinowego, utworzone lub utrzymywane in vitro, rekombinacyjne lub syntetyczne cząsteczki i kwasy nukleinowe w połączeniu z heterologowymi kwasami nukleinowymi. Określenie to obejmuje również sekwencje występujące naturalnie po co najmniej częściowym oczyszczeniu w stosunku do innych sekwencji kwasów nukleinowych.

Przez określenie “sekwencje genetyczne” w znaczeniu stosowanym w treści opisu rozumie się dowolnąciągła serię zasad nukleotydowych, określającą bezpośrednio lub poprzez serie zasad komplementarnych, sekwencję aminokwasów w enzymie hydroksyłującym dHk, na przykład 3',5'-hydroksylazie. Kwas nukleinowy, lub jego forma komplementarna może kodować pełną długość enzymu, lub jego pochodną, albo część. Określenie “pochodna” obejmuje wszelkie pojedyncze, lub wielokrotne podstawienia, delecja i/lub addycje aminokwasów w stosunku do aminokwasu występującego naturalnie. W odniesieniu do tego określenie kwas nukleinowy obejmuje naturalnie występującąsekwencjęnukleotydówkodującą3',5'-hydroksylazę, lub może obejmować pojedyncze, lub wielokrotne podstawienia, delecje i/lub addycje nukleotydów we wspomnianej sekwencji występującej naturalnie. Do objętych wynalazkiem sekwencji kwasu nukleinowego należą również oligonukleotydy, użyteczne jako sondy genetyczne lub jako cząsteczki “antysensowne”, zdolne do regulacji ekspresji odpowiadającego genu w roślinie. Zgodnie z tym, gdy kwas nukleinowy lub jego postać komplementarna koduje “część” 3',5'-hydroksylazy, to wtedy taka cząsteczka kwasu nukleinowego może znaleźć zastosowanie jako sonda oligonukleotydowa, primer do polimerazowych reakcji łańcuchowych lub w różnych technikach mutagenicznych.

170 326

Do pochodnych enzymu hydroksyłującego DHK, a w szczególności 3',5'-hydroksylazy według wynalazku, otrzymanych przez insercję aminokwasów, należą pochodne otrzymane przez amino- i/lub karboksylo terminalne fuzje, jak również wewnątrzsekwencyjne insercje ΐρΛηρση InH λχζιαΙπ arbinn^wecówz Tncpravim oinknwrika cplniwió ii inmipedrnctcO ^z ca k taVi /=» j x 1X1/ » » x v-x v* vxxxxxxx«_s XX » » » r x xx>J»^i J J **** ’ * *-*-*· xvvxx *-J » » w Λ ivj i » ł xl »»_/xv » » *-VX»V · V warianty, w których do ustalonego miejsca w białku wprowadzono jedną, lub więcej reszt aminokwasów, jakkolwiek możliwa jest również insercja przypadkowa, a następnie odpowiedni skrining otrzymanego produktu. Warianty delecyjne charakteryzują się usunięciem z sekwencji jednego, lub więcej aminokwasów. Warianty z odstawieniem aminokwasów sąto takie warianty, w których co najmniej jedna reszta w sekwencji została usunięta, a na jej miejsce wprowadzona inne reszta. Typowymi podstawieniami są podstawienia przedstawione w poniższej tabeli 1.

Tabela 1

Odpowiednie reszty do podstawienia aminokwasów

Reszta oryginalna	Przykładowe podstawienia
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Gdy 3',5'-hydroksylaza jest derywatyzowana przez podstawienie aminokwasów, aminokwasy są ogólnie zastępowane przez inne aminokwasy mające podobne właściwości, takie jak hydrofobowość, hydrofilowość, elektroujemność, objętościowe łańcuchy boczne i podobne. Typowe podstawienia aminokwasu dotyczy jednej reszty. Insercje aminokwasów będą typowo rzędu około 1-10 reszt aminokwasów, a delecje w zakresie około 1 -20 reszt. Korzystnie delecje, lub insercje dokonuje się w sąsiednich parach, na przykład delecja dwóch reszt lub insercja dwóch reszt.

Omawiane powyżej warianty aminokwasów mogą być łatwo wytworzone technikami syntezy peptydów dobrze znanymi ze stanu techniki, takimi jak synteza peptydów w fazie stałej (Merrifield, 1964) i podobne, lub przez rekombinacyjne manipulacje DNA. Techniki dokonywania mutacji substytucyjnych w ustalonych miejscach w DNA o znanej, lub częściowo znanej sekwencji są dobrze znane, i należy do nich na przykład mutageneza MT3. Manipulacja sekwencją DNA w celu wytworzenia wariantów białek, które manifestują się jako warianty substytucyjne, insercyjne, lub delecyjne jest opisana na przykład przez Sambrook et al, (1989).

Innymi przykładami rekombinacyjnych, lub syntetycznych mutantów i pochodnych 3',5'hydroksylazy mogą być pojedyncze lub wielokrotne podstawienia, delecje i/lub addycje wszelkich cząsteczek, związanych z enzymem, takich jak węglowodany, lipidy i/lub białka, lub polipeptydy.

Określenia “analogi” i “pochodne” obejmują również wszelkie funkcjonalne chemiczne odpowiedniki 3',5,'-hydroksylazy i również wszelkie opisane powyżej pochodne aminokwasów.

170 326

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny transgenicznej lub ciętego kwiatu z tej rośliny, zdolnej do ekspresji rekombinowanej 3',5'-hydroksylazy flawonoidowej, polegający na tym. że do komórki odpowiedniej rośliny wprowadza się cząsteczkę kwasu nukleinowego obcjmującą sekwencje nukleotydów przedstawioną na fig. 9 lub fig. 10, albo obejmującą sekwencję nukleotydów zdolną do hybrydyzowania z sekwencją nukleotydów przedstawioną na fig. 9 lub fig. 10, lub z sekwencją nukleotydów komplementarną do niej, w ostrych warunkach obejmujących warunki przemywania 6XSSC w temperaturze 50°C, w warunkach umożliwiających ewentualną ekspresję cząsteczki wspomnianego kwasu nukleinowego, regeneruje się transgeniczną roślinę z tej komórki i namnaża się transgeniczną roślinę przez czas i w warunkach wystarczających do ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego i ewentualnie odcina się kwiat od tej rośliny.

Odmianą przedmiotu wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny transgenicznej lub ciętego kwiatu z tej rośliny, zdolnej do ekspresji rekombinowanej 3',5'-hydroksylazy flawonoidowej, polegający na tym, że do komórki odpowiedniej rośliny wprowadza się cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencje nukleotydów kodującą 3',5'-hydroksylazę przedstawioną na fig. 9 lub fig. 10, lub obejmującą sekwencję nukleotydów kodującą sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 60% podobieństwa do sekwencji aminokwasowej przedstawioną na fig. 9 lub fig. 10, w warunkach umożliwiających ewentualną ekspresję wspomnianego kwasu nukleinowego, regeneruje się transgeniczną roślinę z tej komórki i namnaza się transgeniczną roślinę przez czas i w warunkach wystarczających do ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego i ewentualnie odcina się kwiat od tej rośliny.

Kwasy nukleinowe stosowane w sposobie według wynalazku mogą być kwasami rybonukleinowymi, lub kwasami dezoksyrybonukleinowymi, jednoniciowymi, lub dwuniciowymi oraz cząsteczkami liniowymi, lub zamkniętymi kowalencyjnie cząsteczkami kołowymi. Korzystnie cząsteczką kwasu nukleinowego jest DNA. W sposobie według wynalazku stosuje się inne cząsteczki kwasów nukleinowych, które ulegają hybrydyzacji w warunkach łagodnych, korzystnie umiarkowanych, a najbardziej korzystnie ostrych, z cząsteczkami kwasu nukleinowego objętego sposobem według wynalazku. Cząsteczka kwasu nukleinowego mająca sekwencję nukleotydów przedstawioną na fig. 9 i 10 stosowaną w sposobie według wynalazku może być cząsteczką wykazującą co najmniej 35%, korzystnie co najmniej 45%, bardziej korzystnie co najmniej 55%, jeszcze bardziej korzystnie co najmniej 65-70%, a najbardziej korzystnie powyżej 85% podobieństwa na poziomie sekwencji nukleotydów lub sekwencji aminokwasów i w której kwas nukleinowy koduje lub jest komplementarny do sekwencji kodującej enzym mający aktywność 3',5'-hydroksylazy. Należy zauważyć jednakże, że sekwencje nukleotydów, lub aminokwasów mogą mieć podobieństwa poniżej podanej wyżej wartości procentowej i ciągle jeszcze kodować enzymy hydroksylujące DHK i takie cząsteczki mogą być jeszcze uważane za objęte zakresem wynalazku, jeśli zachowały regiony homologii. Wynalazek niniejszy obejmuje ponadto cząsteczki kwasu nukleinowego w postaci primerów oligonukleotydowych, zdolnych do hybrydyzacji z częścią omawianych powyżej cząsteczek kwasu nukleinowego w warunkach łagodnych, korzystnie umiarkowanych, a najbardziej korzystnie ostrych.

Rozważane tu cząsteczki kwasu nukleinowego mogąistnieć pojedynczo, lub w połączeniu z cząsteczką wektora, a korzystnie wektora ekspresji. Takie cząsteczki wektora ulegająreplikacji i/lub ekspresji w komórkach eukariotycznych i/lub prokariotycznych. Korzystnie cząsteczki wektora, lub ich części są zdolne do integracji z genomem rośliny. Cząsteczka kwasu nukleinowego może ponadto zawierać sekwencję promotora, zdolną do kierowania ekspresją cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce rośliny. Cząsteczka kwasu nukleinowego i promotor mogą być wprowadzane do komórki za pomocą dowolnej ilości środków, takich jak elektroporacja lub przeniesienie za pośrednictwem Agrobacterium.

Wynalazek niniejszy zilustrowano na przykładzie sekwencji kwasu nukleinowego pochodzących z petunii, ponieważ jest to najdogodniejsze i najkorzystniejsze ze znanych dotychczas źródeł materiału. Jednakże specjalista dostrzeże natychmiast, ze podobne sekwencje mogą być wyizolowane z dowolnej liczby źródeł, takich jak inne rośliny i pewne mikroorganizmy. Genetyka

170 326

3'-hydroksylaz jest znana dla kwiatów Antirrhinum, Verbena i Petunia oraz dla siewek i warstwy aleuronowej ziaren kukurydzy (Helle i Forkmann, 1988). Gen eos reguluje 3'-hydroksylazę w Antirrhinum (Forkmann i Stotz, 1981). natomiast geny Htl i Pr regulują podobne enzymy

Bussard, 1986). Badania chemogenetyczne Verbena hybrida wykazały na przykład, ze w roślinie tej hydroksylacja pierścienia B zarówno w pozycji 3' jak i 5' jest regulowana przez jeden gen (Beale, 1940). Aktywność enzymatyczna dla 3',5'-hydroksylacji jest obecna jedynie w ekstraktach kwiatów odmian wytwarzających delfinidynę (Stotz i Forkmann, 1982). Obecność NADPHzaleznej aktywności enzymatycznej dla hydroksylacji w pozycjach 3' i 5' została również wykazana w przypadku ekstraktów kwiatowych Callistephus i Lathyrus (Forkmann, 1991). Podobnie jak w V. hybrida, obecność aktywności enzymatycznej do 3',5'-hydroksylacji flawanonów i dihydroflawanoli została stwierdzona w ekstraktach kwiatów tylko tych odmian, które zawierają w kwiatach 3',4',5'-hydroksylowane związki flawonoidowe (lub ich pochodne metylowane). Zatem powstawanie 3',4',5'-hydroksylowanych flawonoidów jest wyraźnie zależne od aktywności 3',5'-hydroksylazy flawonoidowej.

Geny kodujące 3',5'-hydroksylazę zidentyfikowano w wielu roślinach dekoracyjnych, w tym Callistephus (R), Petunia (Ff1, Hf2) i Verbena (P) poprzez obecność odpowiednich mutantów, niezdolnych do wytwarzania delfinidyny. Ponadto wykazano obecność odpowiadających aktywności enzymatycznych (Forkmann, 1991). 3',5'-Hydroksylaza została również uznana za enzym mikrosomalnego cytochromu P450 (Heller i Forkmann, 1988). Jednakże nie ma opublikowanych doniesień o klonowaniu genu 3',5'-hydroksylazy z tych, lub innych gatunków roślin.

Do innych gatunków roślin, zdolnych do wytwarzania 3',4',5'-hydroksylowanych flawonoidów lub ich pochodnych należąhortensja (Takeda et al., 1985), ostróżka (Asen et al., 1975, Lisiauthus (Asen et al., 1986), pomidor (von Wettstein-Knowles, 1968) i ziemniak (Harbome i Simmons, 1962). Gatunki te, lub inne rośliny zdolne do wytwarzania 3',4',5'-hydroksylowanych flawonoidów są również odpowiednimi źródłami do izolacji genu 3',5'-hydroksylazy. Wszystkie takie sekwencje kwasów nukleinowych, kodujące bezpośrednio, lub pośrednio enzym ścieżki flawonoidowej (na przykład 3'.5'-hvdroksylaz.ę) są objęte niniejszym wynalazkiem niezależnie od ich źródła.

Podobnie przedstawiona tu strategia klonowania genów może być zastosowana do izolacji genu 3',5p-hydroksylazy z innych roślin, wytwarzających 3',4',5'-hyd.tOksylowane flawonoidy Ujawnione tu klony i nukleotydy mogą być zastosowane do detekcji, izolowania i klonowania podobnych sekwencji genetycznych przy użyciu opisanej w tym sposobie technologii, jakkolwiek mogą być potrzebne, pewne niewielkie modyfikacje procedur(y) eksperymentalnych. Wszystkie takie niewielkie zmiany są objęte niniejszym wynalazkiem. Do przykładów innych odpowiednich źródeł enzymów takich jak 3',5'-hydroksylaza należą, jednakże bez ograniczania się do nich, werbena, ostróżka, szafirek, irys, frezja, cyklamen, ziemniak, bratek i oberżyna.

Sekwencja kwasu nukleinowego, kodująca enzym hydroksylujący DHK, taki jak 3',5'-hydroksylaza może być wprowadzona do rośliny transgenicznej i podlegać w niej ekspresji, dzięki czemu uzyskuje się środek do przekształcenia DHK i/lub innych odpowiednich substratów, jeśli są one syntetyzowane w komórce roślinnej, bezpośrednio w antocyjamnowe pochodne antocyjanidyn takiejak delfnidyna, petunidyna lub malwidyna. Wytwarzanie tych antocyjanin przyczynia się do wytwarzania wielu odcieni koloru niebieskiego lub kolorów zbliżonych. Ekspresja sekwencji kwasu nukleinowego w roślinie może być konstytutywna, indukowana, lub rozwojowa.

Następnym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzana rośliny transgenicznej, zdolnej do ekspresji rekombinacyjnego enzymu hydroksylującego DHK, lub jego aktywnych mutantów lub pochodnych, obejmujący wprowadzenie do komórki odpowiedniej rośliny cząsteczki kwasu nukleinowego, zawierającej sekwencję nukleotydów kodującą wspomniany enzym hydroksylujący DHK, w warunkach umożliwiających końcową ekspresję wspomnianej cząsteczki kwasu nukleinowego, regenerację rośliny transgenicznej z komórki i namnażanie rośliny transgenicznej przez czas i w warunkach wystarczających do umożliwienia ekspresji kwasu nukleinowego

170 326

W korzystnej postaci wynalazek obejmuje sposób wytwarzania transgenicznej rośliny kwitnącej, wykazującej zmienione właściwości kwitnienia, poprzez wprowadzenie do komórki odpowiedniej rośliny sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku w warunkach pozwalających na ostateczna ekspresie wspomninr^f^i sekwencji kwaski nukleinowego odtworzenie roŚlinY ranSgenicznej z komórki i namnażanie wspomnianej rośliny iransgenicznej pz/ez czas i w warunkach wystarczających do umożliwienia ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego do enzymu hydroksylującego DHK.

Korzystnie enzymem hydroksylującym DHK jest 3',5'-hydroksylaza, jest one regulowana rozwojowo, a zmiana kwitnienia obejmuje wytwarzanie kwiatów niebieskich, lub czerwonych, lub innych odcieni koloru, zależnie od warunków fizjologicznych rośliny biorcy. Przez “odpowiednią roślinę” rozumie się roślinę zdolną do wytwarzana substratu dla enzymu 3',5'-hydroksylazy i posiadającąodpowiednie właściwości fizjologiczne i genotyp wymagane do rozwinięcia żądanego koloru. Określenie to może obejmować różę, petunię, goździk, chryzantemę i gerberę, ale nie jest do nich ograniczone. W niektórych gatunkach roślin może być korzystne wybranie “lini wysokiego pH”, którąjest zdefiniowana jako odmiana mająca pH komórkowe w płatkach kwiatowych wyższe niż przeciętnie. Rekombinacyjne 3',5'-hydroksylazy albo ich mutanty, lub pochodne pochodzą ze źródeł opisanych powyżej w niniejszym opisie i należą do nich enzymy pochodzące z petunii, werbeny, ostrózki, szafirka, irysa, frezji, hortensji, cyklamenu, ziemniaka, bratka lub oberzyny.

Specjalista z tej dziedziny od razu znajdzie odmiany tego sposobu, takie jak zwiększanie, lub obniżanie ekspresji enzymu naturalnie występującego w roślinie celowej. To doprowadziłoby do różnych odcieni kolorów, takich jak różne odcienie niebieskiego lub czerwonego.

W celu zmniejszenia aktywności enzymu celowego, takiego jak 3',5'-hydroksylaza, sekwencja kwasu nukleinowego kodującego ten enzym lub jego różne części może być wykorzystana w orientacji antysensownej. Jakkolwiek nie chcemy ograniczać tego wynalazku przez jakąkolwiek poszczególną teorię to, prawdopodobne jest, że taka antysensowna sekwencja kwasu nukleinowego utworzyłaby dupleks z całym naturalnie występującym mRNA, swoistym dla tego enzymu, lub z jego częścią zapobiegając w ten sposób translacji mRNA do aktywnego enzymu. Alternatywnie, do inaktywacji celowych sekwencji kwasu nukleinowego mogą być użyte rybozymy.

Zgodnie z tym sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, zdolnej do ekspresji rekombinacyjnego enzymu hydroksylującego dihydrokempferol (DHK), lub kierującego transkrypcją sekwencji kwasu nukleinowego o wysokim stopniu komplementarności w stosunku do całości cząsteczki mRNA ulegającej translacji do enzymu hydroksylującego DHK, lub w stosunku do części tej cząsteczki, polega na wprowadzeniu do komórki odpowiedniej rośliny izolatu kwasu nukleinowego, w warunkach umożliwiających ostateczną ekspresję wspomnianego izolatu kwasu nukleinowego, odtworzeniu rośliny transgenicznej z komórki i namnażanie wspomnianej rośliny transgenicznej przez czas i w warunkach wystarczających do umożliwienia ekspresji izolatu kwasu nukleinowego. W tej postaci do odpowiednich roślin biorców należą między innymi irys, tulipan, lilia, lisianthus, frezja, ostrózka, limonium i pelargonia.

Powyższe sposoby wytwarzania roślin transgenicznych obejmują alternatywnie wprowadzanie genu, lub fragmentu DNA kodującego antysensowny mRNA, lub oligonukleotydu do całej sekwencji nukleotydów kodującej 3',5'-hydroksylazę albo do ich części, albo regionu, albo komplementarnej do tej sekwencji kodującej.

W konsekwencji wynalazek niniejszy dotyczy wszystkich roślin transgenicznych, zawierających całą sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku, lub jej część, lub jej formy antysensowne i/lub wszelkie homologi, lub formy pokrewne, a w szczególności tych roślin które wykazują zmienione właściwości kwitnienia. Rośliny transgeniczne zawierają zatem trwale wprowadzoną cząsteczkę kwasu nukleinowego, zawierającą sekwencję nukleotydów kodującą enzym hydroksylujący DHK lub sekwencję do niej komplementarną, a w szczególności linie roślin o wysokim pH, niosące cząsteczki kwasu nukleinowego wprowadzone takjak opisano

170 326 powyżej. Wynalazek obejmuje również nasiona takich roślin transgenicznych. Takie nasiona, zwłaszcza jeżeli są barwne, znajdą zastosowanie do oznaczenia własności roślin.

Następnym aspektem wynalazku sąrekombinacyjne postacie enzymów hydroksylui ących DHK, a w szczególności rekombinacyjna 3',5'-hydroksylaza. Rekombinacyjne postacie enzymów zapewniają źródło materiału badawczego do prac mających na celu opracowanie na przykład bardziej aktywnych enzymów i mogą być użyteczne do opracowania systemów in vitro do wytwarzania związków barwnych.

Następnym aspektem wynalazku jest sposób klonowania cząsteczki kwasu nukleinowego, zawierającej sekwencję nukleotydów kodującą, lub komplementarną do sekwencji kodującej cząsteczkę cytochromu P450 lub podobną cząsteczkę z rośliny, który to sposób obejmuje amplifikację sekwencji nukleotydów cytochromu P450 lub sekwencji do niej komplementarnej z odpowiedniego preparatu cząsteczek kwasu nukleinowego z komórek wspomnianych roślin na drodze polimerazowej reakcji łańcuchowej, przy użyciu jednego lub więcej primerów oligonukleotydowych, przy czym primery te mają sekwencję nukleotydów otrzymaną z jednej, lub więcej zgodnych sekwencji znanych cząsteczek mikrosomalnego cytochromu P450.

W zbliżonej postaci sposób klonowania cząsteczek kwasu nukleinowego cytochromu P450, lub sekwencji komplementarnych obejmuje selekcję z odpowiedniej biblioteki cDNA klonu zdolnego do hydrydyzacji z jednym lub więcej primerów' oligonukleotydowych, odpowiadającego jednej, lub więcej zgodnych sekwencji, lub znanych cząsteczek cytochromu P450.

Korzystnie jedna ze zgodnych sekwencji pochodzi z wiążącego hem regionu cytochromu P450, a bardziej korzystnie jest to sekwencja F(G,S)XGXRXCXG (gdzie X oznacza dowolny aminokwas) lub PGFAGRRICPG. W najbardziej korzystnej postaci klonowane sekwencje nukleotydowe kodują lub są komplementarne do enzymów kodujących enzym hydroksylujący DHK, a w szczególności 3',5'-hydroksylazę. Jeszcze bardziej korzystnie 3',5'-hydroksylazajest 3',5'-hydroksylaza opisana powyżej w treści tego opisu, a w szczególności ma ona sekwencję aminokwasów, lub jest kodowana przez sekwencję nukleotydów zasadniczo taką jak przedstawiona na fig. 9, lub 10, lub jest do niej podobna w sposób zdefiniowany powyżej.

Wynalazek niniejszy jest opisany w dalszym ciągu w odniesieniu do następujących figur i przykładów, nie stanowiących jego ograniczenia.

Figura 1(A) i (B) przedstawiają schematycznie ścieżkę biosyntezy pigmentów flawonoidowych. Enzymy biorące udział w pierwszej części ścieżki są oznaczone następująco: PAL = amoniakoliaza fenyloalaninowa; C4H = 4-hydroksylaza cynamonianowa,; 4Cl = ligaza 4-kumaran:CoA; CHS = syntetaza chalkonowa; CHI = izomeraza chalkonoflawanonowa; F3H = 3-hydroksylaza flawanonowa; DFR - 4-reduktaza dihydroflawonolowa; UFGT = 3-O-glukozylotransferaza UDP-glukozowo:flawonoidowa. Następne etapy odpowiadają przekształceniom, które występują w kwiatach P. hybrida i obejmują: 1 - addycję cukru ramnozy do reszty glukozylowej cyjanidyno-3-glukozydu i delfinidyno-3-glukozydu; 2- acylowanie i 5-0glukozylowanie; 3 = 3' metylowanie; 4 = 5' metylowanie; 5 = 3',5'-metylowanie.

Figura 2(A) pokazuje aktywność 3',5'-hydroksylazy w ekstraktach z płatków kwiatowych P. hybrida, odmiana uprawna V23 (Hf1/Hf1, Hf2/Hf2) oraz brak aktywności 3',5'-hydroksylazy w P. hybrida, odmiana uprawna R51 (hf1/hfl, hf2/hf2). Aktywność 3',5'-hydroksylazy wykrywano poprzez konwersję ³H-naringeniny do pochodnych 3'- i 3',5'-hydroksylowanych eriodiktiolu i pentahydroksyflawanonu. Na lewej stronie figury pokazane są struktury biochemiczne substratu, naringeniny i produktu reakcji 3'-hydroksylazy, eriodiktiolu oraz reakcji 3',5'-hydroksylazy, pentahydroksyflawanonu. Umiejscowienie substratu i produktów hydroksylowanych na płytce TLC jest wskazane na prawej stronie figury, która przedstawia od lewej do prawej autoradiogramy produktów reakcji wytworzonych w ekstraktach płatków kwiatowych z P. hybrida, odmiana uprawna V23 i P. hybrida, odmiana uprawna R51 oraz kontroli, wykazującej brak hydroksylacji naringeniny gdy mieszanina reakcyjna nie zawiera NADPH.

Figura 2(B) pokazuje aktywność 3',5'-hydroksylazy w ekstraktach z płatków kwiatowych P. hybrida, odmiana uprawna Old Glory Blue (OGB) na różnych stadiach rozwoju. Autoradiogramy płytek TLC pokazują od lewej do prawej (1) Stadium 1 kwiaty [niepigmentowany,

170 326 zamknięty pąk (długość < 25 mm)]: ograniczona konwersja naringeniny do pochodnej 3',5'-hydroksylowanej pentahydroksyflawanonu, (2) Stadium 2 kwiaty [pigmentowany, zamknięty pąk (długość 25-35 mm)]: zwiększona konwersja do pentahydroksyflawanonu, wskazująca na wyższy poziom 3',5'-hydroksyłazy. (3) Stadium 3 kwiaty: [Ciemno-purpurowy pąk z pojawiającą się koroną (długość > 35 mm)]: maksymalna aktywność 3',5'-hydroksylazy, (4) Stadium 4 kwiaty [ciemno-purpurowy otwarty kwiat, przed pękaniem pylników (długość > 50 mm)]: maksymalna aktywność 3',5'-hydroksylazy, (5) Stadium 5 kwiaty [Całkowicie otwarty kwiat z otwartymi wszystkimi pylnikami]: 3',5'-hydroksylaza niewykrywalna.

Figura 3 (A) jest schematycznym przedstawieniem cząsteczki mRNA kodującej cytochrom P450. Obszar zacieniowany wskazuje względną pozycję sekwencji kodujących region wiążący hem. Zgodną sekwencję aminokwasów dla regionu najlepiej zachowanego tej domeny pokazano za pomocąkodu jednoliterowego. Aminokwasy, które sąobecne w 100^o% sekwencji cytochromu P450, obecne w bazie danych SWISS-PROT zakreślono, a X wskazuje pozycje, w których jest niski stopień zachowania sekwencji.

Figura 3(B) pokazuje pozycje oligosekwencji, użytych do amplikacji PCR cząsteczek P450 pCGP450 i pCGP454 z biblioteki cDNA #1. Oligo 1 i 3 pokrywają sekwencje w zachowanej domenie wiążącej hem, natomiast oligo 2i 4 odpowiadająodpowiednio pBluescript (Stratagene)20 i odwrotnym sekwencjom primerowym. Oligo 1 i 2 wykorzystano do syntezy insertu cDNA w pCGP450; oligo 3 i 4 wykorzystano do syntezy insertu cDNA w pCGP454. Przedstawienie uogólnionej cząsteczki cDNA jest identyczne do przedstawionej na Fig. 3A; sekwencje wektorowe wskazano przez lekkie zacieniowania.

Figura 4(A) jest schematycznym przedstawieniem fragmentów DNA, użytych do sondowania biblioteki cDNA #1 w celu identyfikacji homologów cytochromu P450, w tym pCGP174 i pCGP175. P450: uogólniony klon cDNA cytochromu P450 z domeną wiążącą hem (Hem), wskazaną przez zacieniowany prostokąt; Fragment 1: fragment o długości 900 par zasad otrzymany za pomocą PCR z oligo 5 i 6 przy użyciu jako wzorca pCGP142 DNA; Fragment 2fragment o długości 1,3 kilozasad, wyizolowany z pCGP147 trawionego Sa1I-EcoRI; Fragment 3: fragment o długości 750 kilozasad, otrzymany za pomocąreakcji PCR z oligo 4 i 7 przy użyciu jako wzorca DNA pCGP158; Fragment 4: fragment o długości 670 par zasad, wyizolowany z pCGP160 trawionego PstI-EcoRV; Fragment 5: fragment o długości 150 par zasad otrzymany za pomocą reakcji PCR z oligo 3 i 4, przy użyciu jako wzorca DNA pCGP454. Wszystkie oczyszczane fragmenty znakowano ³²P-dCTP w sposób opisany w części Materiały i Metody.

Figury 4(B) do (H) przedstawiają częściowe sekwencje nukleotydów, odpowiadające przewidywanym aminokwasowym produktom translacji dla insertów cDNA z (i) pCGP142, (ii) pCGP147, (iii) pCGP158, (iv) pCGP160 i (v) pCGP454. Regiony wykorzystane do sondowania biblioteki cDNA #1 w celu wyizolowania pCGP174 i pCGP175 zakreślono strzałkami.

Figury 5 (A) i (B) są schematycznymi przedstawieniami plazmidów odpowiednio pCGP174 i pCGP175. Inserty cDNA wskazano jako otwarte prostokąty w regionie kodującym przypuszczalną domenę wiążącą hem, pokazaną jako obszar zacieniowany. Miejsce EcoRI znajduje się na końcu 5', a miejsce XhoI na końcu 3' obu insertów cDNA.

Figura 6(A) przedstawia autoradiogram plamy RNA sondowanej regionem 3' insertu cDNA pCGP174. Każdy prążek zawierał próbkę 20 pg łącznego dNa wyizolowanego z następujących tkanek petunii 1-5: tkanka wieńca kwiatów OGB na pięciu różnych stadiach rozwoju (1-5) kwiatu, opisanych w części Materiały i Metody; T: tkanka łagiewki pyłkowej z kwiatów OGB ze stadium 3-4; L: tkanka liścia z 6-tygodniowych siewek OGB; IL. tkanka liściowa z 6-tygodniowych siewek OGB traktowanych glukozą i wysokim poziomem światła, V23: tkanka wieńca kwiatów V23 ze stadium 3-4, R51: tkanka korony z kwiatów R51 ze stadium 3-4; VR: tkanka wieńca płatka kwiatowego z kwiatów mieszańca V23 x R51 Fj, stadium 3-4. Sw63: tkanka wieńca płatka kwiatowego kwiatów Sw63, stadium 3 -4; Th7: tkanka wieńca płatka kwiatowego z kwiatów TH7 stadium 3-4.

Figura 6 (B) przedstawia reprezentatywny autoradiogram z analizy RFLP roślin V23xR51 (V/R)F2. DNA genomowe trawione XbaI sondowano regionem 3' pCGP174. Fragment V23

170 326

H silnie hybrydyzujący z sondą wykryto we wszystkich roślinach F 2, które posiadały aktywność 3',5'-hydroksylazy w tkance łagiewki pyłkowej kwiatów (+). Wskzzano oznaczenia FLL P dlii silnie hybrydyzujących pasm (RFLP#1) dla różnych roślin. V: V23 RFFLP V23-podobne, R: RFT P R 5-t-ip^odob eT * ΓΛΖΡλ

Łh ⁱ.... nvtvi v(

Figura 7(A) jest autoradiogramem plamy RNA sondowanej regionem 3' insertu cDNA pCGP175. Każdy prążek zawierał próbkę 20pg całkowitego DNA, wyizolowanego z: 1-5: tkanka wieńca z kwiatów OGB na pięciu różnych stadiach (1-5) rozwoju kwiatu, opisanych w części Materiały i metody; T; tkanka łagiewki pyłkowej z kwiatów OGB stadium 3-4; L: tkanka liściowa z 6-tygodniowych siewek OGB; IL: tkanka liściowa z 6-tygodniowych siewek OGB traktowanych glukoza, i światłem o wysokim natężeniu; V23: tkanka wieńca z kwiatów V23 stadium 3-4; VR: tkanka wieńca płatka kwiatowego z kwiatów mieszańca V23xR51 F1 stadium 3 -4; Sw63 : tkanka wieńca płatka kwiatowego z kwiatów Sw63 stadium 3 -4; Th7 : tkanka wieńca płatka kwiatowego z kwiatów Th7 w stadium 3-4.

Figura 7(B) jest reprezentatywnym autoradiogramem z analizy RFLP roślin V23xR51 (V/R) F2. DNA genomowe trawione Xbal sondowano regionem 3' pCGP175. Oznaczenia RFLP otrzymane przy użyciu sondy pCGP175 były identyczne z oznaczeniem po uzyskanym przy użyciu sondy chi-A. V: RFLP V23-podobne; R: RFLP R51-podobne; H: heterozygotyczne (VR) RFLP.

Na fig. 8 pokazano schematyczne przedstawienie mapy enzymu restrykcyjnego dla pCGP602. Częściowe długości insertu cDNA wskazano pogrubionymi liniami zakończonymi kreską (w przeciwieństwie do strzałek). Poddano je subklonowaniu do M13-mp18 i mp19 oraz sekwencjonowano, stosując wskazane oligonukleotydowe sekwencje primerowe, w celu otrzymania informacji o nakładających się sekwencjach. Rozległość i kierunek informacji o sekwencji, otrzymanej z każdej subklonowanej części jest pokazany liniami zakończonymi półstrzałkami. S1 = sekwencja primerowa 1; S2: sekwencja primerowa 2; S3 = sekwencja primerowa 3; ATG wskazuje metioninowy kodon inicjacyjny i wskazano również łączną długość klonu w parach zasad.

Figury 9(A) do (D) pokazują sekwencję nukleotydów i przewidywane sekwencje aminokwasów dla insertów cDNA z pCGP176 i pCGP602. Insert z pCGP602 zawiera całą pokazaną sekwencję. Koniec 5' insertu pCGP 176 jest wskazany strzałką.

Figury 10(A) do (C) przedstawiają sekwencję nukleotydów i przewidywaną sekwencję aminokwasów dla insertu cDNA z pCGP 175.

Figura 11 jest schematycznym przedstawieniem konstrukcji pCGP618. pCGP618 skonstruowano przez klonowanie insertu cDNA pCGP618 w orientacji sensownej poza promotorem dehydrogenazy gliceroałdehydo-3-fosforaaowej drożdży (PGPD) w wektorze ekspresyjnym pYGA22m. Insert cDNAz pCGP175 ligowano jako fragment EcoRI-KpnI z dużym fragmentem uzyskanym przez trawienie pYGA22m EcoRI/KpnI. E = EcoRI, H = HindII, K = Kpnl, X = Xhol, IR = inertowane powtórzenie plazmidu 2 pm, Trpl = gen Trpi. Ap - marker oporności na ampicylinę.

Figura 12 (A) przedstawia oznaczenie 3',5'-hydroksylazy w ekstraktach drożdży przy użyciu jako substratu i³H-aαriageniay. Autoradiogramy pokazują konwersję ³H-aaringenlny do 3',5'-hydroksylowanej pochodnej peaaahydroksyflawanoau przez ekstrakty drożdży transformowane plazmidem pCGP618 (1 i 2). W drożdżach niearaasfornowaaych nie wykryto aktywności 3',5'-hydroksylazy (C). Pokazano również konwersję aαriageniay do pentahydroksyflawanonu przez 3',5'-hydroksylazę OGB (OGB C).

Figura 12 (B) przedstawia oznaczenie 3',5'-hydroksylazy w ekstraktach drożdży przy użyciu jako substratu ³H-dihydrokwercetyny. Autoradiografy pokazują konwersję ³H-dihydrokwercetyny (DHQ) do ³H-dihydromirycetyay przez ekstrakty drożdży transformowane plazmidem pCGP618 (1 i 2). W drożdżach aletraasformowanych nie wykryto aktywności 3',5'-hydroksylazy (C). Pokazano również konwersję DHQ do DHM przez 3'.5'-hydroksylazę· OGB (OGB C).

Figura 13 przedstawia oznaczenie 3',5'-hydroksylazy w ekstraktach drożdży przy użyciu jako substratu ³H-aariageniay. Autoradiogram pokazuje konwersję ³H-naringeainy do 3', 5'-hy12

170 326 droksylowanej pochodnej pentahydroksyflawanonu przez ekstrakty drożdży transformowane plazmidami pCGP618 i pCGP620 (odpowiednio 1 i 2). Produkty reakcji otrzymane z ekstraktu pCGP620 zawierały również 3'-hydroksylowany eriodiktiol j jak również pewnąilość początkowego substratu naringeniny, co wskazuje na niepełną konwersję do 3',5'-hydroksylowanego produktu końcowego. W drożdżach nietransformowajnych nie wykryto aktywności 3',5'-hydroksylazy (C)

Figura 14 jest schematycznym przedstawieniem plazmidupCGP90. Insert cDNA zpCGP602 klonowano w orientacji sensownej poza promotorem Mac wektora ekspresji pCGP293, jak wskazano na rysunku.

Figura 15 przedstawia oznaczenie 3',5'-hydroksylazy w ekstraktach płatków kwiatowych petunii. Autoradiogram pokazuje obecność niewielkich poziomów aktywności 3',5'-hydroksylazy (konwersja ³H-naringeniny do ³H-pentahydroksyflawanonu) w tkance wieńca płatków kwiatowych (L) Skr4 x Sw63. Znacznie wyższe poziomy aktywności wykryto w tkance wieńca (L) dwóch roślin transgenicznych Skr4 x Sw63/pCGP90 (T/G 1602 i T/G 1603). Aktywności 3',5'-hydroksylazy nie wykryto w ekstraktach łagiewki pyłkowej (T) nietransgenicznego mieszańca Skr4 x Sw63 ani w dwóch roślinach transgenicznych otrzymanych przy użyciu pCGP90. Pokazano również konwersję naringeniny do pentahydroksyflawanonu przez ekstrakty wieńca (L) i łagiewki pyłkowej tkanki płatka kwiatowego OGB.

Figura 16 jest schematycznym przedstawieniem autoradiogramu plamy RNA sondowanej za pomocą cDNA Hfl znakowanego ³²P. Każdy prążek zawierał próbkę 20 pg całkowitego RNA wyizolowanego z (1) płatków korony P. hybrida odmiana uprawna OGB.; (2) płatków korony bratka; (3) łodyg ziemniaka; (4) skórki oberżyny; (5) kwiatów Nicotiana alata; (6) kwiatów Ageratum. Sondę użytą do A i B otrzymano z fragmentu Bali DNA o długości 660 par zasad; dla C użyto fragment EcoRI/Hindlll. Warunki przemywania były następujące: (A) 6 x SSC w 50°C, (B) 2 x SSC w 50°C; (C) 0,2 x SSC w 65°C.

Figura 17 przedstawia fotografię autoradiogramów plam otrzymanych techniką przeniesienia Southerna sondowanych cDNA Hfl znakowanym³ 2p. Każdy prążek zawierał 10 pg DNA trawionego EcoRI Próbki DNA izolowano z (1) oberżyny, (2) irysa holenderskiego, (3) ziemniaka, (4) fiołków i (5) anemonu. Stosowano następujące warunki przemywania: (A) 6 x SSC w 50°C; (B) 2 x SSC w 65°C.

Przykład

Materiały i metody

Enzymy chemiczne i radioizotopy

Eriodiktiol i dihydrokwercetynę uzyskano z firmy Carl Roth KG, a naringeninę otrzymano z firmy Sigma. Dihydromirycetynę syntetyzowano chemicznie z mirycetyny (Extra Synthese, Francja) metodą Vercruyse et al. (1985). [³H]-naringeninę (5,7 Ci/mmol) i [³H]-dihydrokwercetynę (12,4 Ci/mmol) otrzymano z firmy Amersham. Wszystkie enzymy otrzymano ze źródeł handlowych i stosowano zgodnie z zaleceniami producenta.

Szczepy bakteryjne

Stosowano następujące szczepy Escherichia coli:

DH5a supE44i A(lacZYA-ArgF)U169, <D801acZAM15, hsdR17rkk’, mi+h recAl, endAl, gyrA96, thi-1, rełAl, deoR, (Hanahan, 1983 i bRl, 1986).

XL1-Blue supE44, hsdR17, (ik^_, m/), recAl, endAl, gyrA96, thi-1, re1Al, lac’ [F'proAB, lacI^q, lacZAM15, Tn10(tet')] (Bullock et al., 1987).

PLK-F' recA, hsdR17. (rf, mk⁺), mcrXA', mcrB’, lac’, supE44, ga1K2, ga1T22, metB1, [F'proAB, lacl^q, lacZAM15, Tn10(tet)'] (Stratagene).

Pozbawiony zjadliwości szczep Agrobacterium tumefaciens AGLO (Lazo et al., 1991) uzyskano od R. Ludwiga (Department of Biology, University of California, Santa Cruz).

Wektory do klonowania pBluescript i pBluescribe otrzymano z firmy Stratagene.

Transformacja E.coli i A. tumefaciens

Transformację E.coli i A. tumefaciens przeprowadzono zgodnie z metodąlnoue et al. (1990).

170 326

Plazmid pCGP90 (fig. 14) wprowadzono do szczepu Agrobacterium tumefaciens AGLO przez dodanie 5 pg plazmidu DNA do 100 μΐ kompetentnych komórek AGL10, przygotowanych przez zaszczepienie 50 ml hodowli MG/L (Garfinkel i Nester, 1980) i namnazanie przez 16 godzin w 28°C z wytrząsaniem. Następnie komórki peletkowano i ponownie zawieszono w 0.5 ml płynu o składzie 85% (v/v) 100 mM CaCh/15% (v/v) gliceryny. Mieszaninę DNA-Agrobacterium zamrożono przez inkubację w ciekłym N? przez 2 minuty, po czym rozmrożono przez inkubację w 37°C przez 5 minut. Mieszankę DNA/bakterie umieszczono następnie na lodzie na dalsze 10 minut. Następnie komórki zmieszano z 1 ml pożywki MG/L i inkubowano wytrząsając przez 16 godzin w 28°C. Komórki A. tumefaciens noszące pCGP90 wyselekcjonowano na płytkach agarowych MG/L, zawierających 100 pg/ml gentamycyny. Obecność pCGP90 potwierdzono za pomocą analizy Southerna DNA wyizolowanego z transformantów opornych na gentamycynę.

Zastosowane odmiany Petunia hybrida przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2.

Materiał roślinny

Odmiana rośliny	Właściwości	Źródło/Odnośnik
Mieszaniec V30	Old Glory Blue (OGB) F, Ani, An2, An3, An4, An6, An8, An9, An10, Anii, Phi, Ph2, Ph3, Ph4, Ph5, Hfi, Hf2, Hti, Ht2, Rt, Mtl, Mt2, mfi, po, Gf	Ball Seed, USA Koes et al (I986)
V23	Ani, An2, An3, An4, An6, An8, An9, Ani0, phi, Hfi, Hf2, hti, Rt, Po, Bl, Fl	Wallroth et al (I986) Doodeman et al (I984)
R51	Ani, An2, An3, An4, An6, An8, An9, An i0, An ii, Phl, hfl, hf2, Htl, rt, po, bl, fl	Wallroth et al (i986) van Tunen et al (I990) Doodeman et al (I984)
Sw63	Ani, An2, An3, An4, An6, An8, An9, Ani0, Anii, Phi, Ph2, Ph5, hfi, hf2, hti, ht2, rt, po, mfl, fl, Gf	I.N.R.A, Dijon, Cedex Francja
Th7	Ani, An2, An3, An4, An6, An9, Ani0, Anii, Hfi, Hf2, Hti, Ht2, Phi, Ph2, Ph5, Rt, po, mfl, mf2, Gf, fl
Skr4	Ani, An2, An3, An4, An6, Anii, hfl, hf2, htl, Phi, Ph2, Ph5, rt, Mfl, Mf2, fl	I.N.R A, Dijon, Cedex Francja
Skr4xSw63 Mieszaniec Skr4 x Sw 63 Fi
Rwl4	Ani, An2, An4, Phi, ph2, Ph5, hfl, hf2, Hti. Rt, Po, Bi, Lgi, Lui, Vsl, Vs3, Vs5 la, Ygi, ws, Gf, Mtl, Mf2, fl
Rp57	Ani, An2, An4, Phi, ph2, Ph5, hfi, hf2, Hti, Rt, Po, Mt, Mf, fl, Gf, Bl, Lgl, Lul, Vsl, Vs3, Vs5, Ygl, Ws
Rp57 x Rwl4	Mieszaniec Rp57 x Rwi4 Fi

170 326

Rośliny namnazano w specjalnych komorach wzrostowych przy długości dnia 14 godzin i intensywności światła 10000 luksów oraz temperaturze 22 do 26°C. Kwiaty OGB zbierano w stadiach rozwoju zdefiniowanych poniżej:

(1) Stadium 1 niepigmentowany, zamknięty pąk (długość < 25 mm) (2) Stadium 2 pigmentowany, zamknięty pąk (długość 25-35 mm) (3) Stadium 3 Ciemno-purpurowy pąk z pojawiającą się koroną (długość >35 mm) (4) Stadium 4 ciemno-purpurowy otwarty kwiat, przed pękaniem pylników (długość > 50 mm) (5) Stadium 5 Całkowicie otwarty kwiat z otwartymi wszystkimi pylnikami

Kwiaty innych odmian, opisanych w tabeli 2, zbierano przed pęknięciem pylników w stadium maksymalnej akumulacji pigmentu.

Przygotowanie ekstraktów roślinnych do oznaczania aktywności 3',5'-hydroksylazy

Tkankę roślinną homogenizowano w 2 do 5 objętości lodowato-zimnego buforu do ekstrakcji (100 mM fosforanu potasu (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,25 M sacharozy, 0,25 M mannitolu, 0,1% (w/v) BSA, 100 nM pepstatyny, 100 nM leupeptyny, 0,1 mg/ml PmSf, 20 mM 2-merkaptoetanolu i 10 mg/ml polyclar AT). Homogenizat wirowano przy 10000 obrotów na minutę w rotorze JA20 (Beckman) przez 10 minut w 4°C i oznaczano aktywność 3',5'-hydroksylazy w podwielokrotności supematanta.

Oznaczanie 3',5'-hydroksylazy

Aktywność enzymu 3',5'-hydroksylazy mierzono stosując zmodyfikowaną wersję metody opisanej przez Stotza i Forkmanna (1982). Mieszanina reakcyjna do oznaczenia typowo zawierała 100 μ1 ekstraktu roślinnego, 5 μΐ 50 mM NADPH w buforze do oznaczeń (100 mM fosforanu potasu (pH 8,0), 1 mM EDTA i 20 mM 2-merkaptoetanolu), 10 μί’ί [³H]-naringeniny lub 5 LiCi [3H]-dihydrokwercetyny i została dopełniona do końcowej objętości 210 μΐ buforem do oznaczeń. Po inkubacji w 23°C przez 2-16 godzin mieszaninę reakcyjną ekstrahowano z 0,5 ml octanu etylu. Fazę octanową wysuszono pod próżnią a następnie powtórnie zawieszono w 10 μΐ octanu etylu. Trytowane cząsteczki flawonoidu rozdzielono na celulozowych płytkach do chromatografii cienkowarstwowej (Merck Art5577, Niemcy), stosując układ rozpuszczalników chloroform:kwas octowyrwoda (10:9:1, v/v). Po zakończeniu chromatografii płytki TLC spryskano 7% (v/v) roztworem 2,5-difenylooksazolu w eterze etylowym. Produkty reakcji lokalizowano za pomocą autoradiografii i identyfikowano przez porównanie z nieradioaktywnymi wzorcami naringeniny, eriodiktiolu, dihydrokwercetyny i dihydromirycetyny, które rozwijano równolegle z produktami reakcji i wizualizowano w świetle UV. Indukcja syntezy delfinidyny w liściach za pomocą glukozy i wysokiego natężenia światła.

Liście zebrano z P. hybrida, odmiana uprawna OGB i pocięto na skrawki o wielkości 1 cm² w jałowej wodzie. Skrawki liści pływały następnie na powierzchni 2% (w/v) roztworu glukozy i eksponowano je przez 96 godzin na światło o natężeniu 24000 luksów.

Konstruowanie biblioteki cDNA#l

Dwadzieścia gramów wieńców OGB stadium 3 do 4 homogenizowano w 100 ml PEB (200 mM Tris-HCl (pH 8,6), 60 mM KC1, 30 mM MgCh, 25 mM EGTA), zawierającym 10 mM wanadylowego kompleksu rybonukleozydowego. Pozostałości komórek usunięto przez przesączenie homogenizatu poprzez jałowy Miracloth (Calbiochem). Przesącz uwarstwiono na powierzchni skokowego gradientu 6 ml pEb, zawierającego 25% (w/v) sacharozy, 250 jednostek InhibitAce (5-Prime 3-Prime) i 6 ml PEB, zawierającego 50% (w/v) sacharozy i 250 jednostek InhibitAce w probówkach do wirowań Ultra-Clear™ Quick-Seal™ (Beckman). Probówki wirowano przez 3,5 godziny przy 26000 obrotów na minutę w roztworze 70Ti. Polisomy związane z błonami zebrano z granicy fazowej 25% (w/v) roztwór sacharozy/50% (w/v) roztwór sacharozy i dodano do 4 M roztworu izotiocyjanianu guanidyniowego. RNA izolowano z denaturowanych polizomów przez peletkowanie poprzez poduszkę 5,7 M CsCl w sposób opisany przez Turpena i Griffitha (1986).

Do konstruowania ukierunkowanej biblioteki cdNA w λ ZAP użyto zestawu wektorowego Uni-ZAP™ (Stratagene), stosując jako wzorzec 25 μg polisomalnego RNA. Bibliotekę pierwotną, która zawierała 250000 jednostek tworzących kolonie (pfu), amplifikowano przez namnazanie w ciągu nocy na płytkach NZY (Sambrook et al., 1989), a linię amplifikowanego

170 326 faga eluowano w PSB (100 mM NaCl, 8 mM MgSCU, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,01% (w/v) żelatyny) w sposób opisany przez Sambrook et al., 1989). Konstruowanie biblioteki cDNA #2

Całkowity RNA wyizolowano z tkanki płatka kwiatowego P. hybrida, odmiana uprawna OGB kwiatów stadium 3 do 4, stosując metodę Turpena i Griffitha (1986). poli(A)⁺RNA wyselekcjonowano z RNA całkowitego przez trzykrotną chromatografię na oligo-dT celulozie (Aviv i Leder, 1972).

Dwa mikrogramy poli(A)⁺RNA poddano odwrotnej transkrypcji w objętości 20 μΐ, zawierającej 1 x bufor reakcyjny Superscript™, 10 mM ditiotreitolu, 500 μM dATP, 500 μM dGTP, 500 uM-5-metylo-dCTP, 0,75 μg oligonukleotydu #8 i 2 μΐ odwrotnej transkryptazy Superscript™ (BRL). Mieszaninę reakcyjnąinkubowano w 37°C przez 50 minut, w 44°C przez 10 minut, a następnie umieszczono w lodzie.

Mieszaninę reakcyjną drugiej nici (140 μ^ dodano do mieszaniny reakcyjnej pierwszej nici. Mieszanina reakcyjna drugiej nici składała się z 21 mM Tris-HCl, 104 mM KCl, 5,3 mM MgCl₂, 171 nM β-NAD, 11,4 mM (NH^SCh, 214 μM dATP, 642 μΜ dCTP, 214 μΜ dGTP, 214 mM dTTP, 4 mM DTT, 10 pCrP-dCTP (3000 Ci/mmol), 15 jednostek ligazy DNA E. coli, 40 jednostek polimerazy DNA (Boehringer) i 0,8 jednostek RNAzy H. Końcową mieszaninę inkubowano przez 150 minut w 16°C. Aby wytworzyć dwuniciowy cDNA o tępych końcach dodano 10 jednostek polimerazy T4 DNA i kontynuowano reakcję przez następne 15 minut w 16°C. Reakcję zatrzymano i oczyszczano cDNa przez ekstrakcję układem fenol/chloroform, po czym ekstrahowano chloroformem i wytrącano etanolem.

Adaptory EcoRI (Promega) ligowano z cDNA, po czym poddano kinazie w warunkach zalecanych przez producenta. Enzymy denaturowano termicznie (70°C, 20 minut) i oczyszczano DNA przez ekstrakcję układem fenol/chloroform i wytrącenie etanolem. cDNA trawiono z 50 jednostkami Xhol (Boehringer) w objętości mieszaniny reakcyjnej 100 μζ stosując warunki zalecane przez producenta. Enzym zabito termicznie (70°C, 20 minut) i mieszaninę przepuszczono przez szklaną kolumnę S400 (Pharmacia), która została zrównowagowana w buforze STE (Sambrook et al., 1989). Eluat ekstrahowano układem fenol/chloroform i wytrącono etanolem. Po mikrowirowaniu w 4°C przez 30 minut peletkę cDNA spłukano 70% (v/v) etanolem i ponownie zawieszono w 10 μ! buforu TE (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM eDtA)

Do wyizolowania cDNA w zakresie wielkości 1,3 do 2,5 kb z próbki 7,5 μζ którąpoddano elektroforezie poprzez 1%o (w/v) zel agarozowy, zastosowano membranę NA-45 (Schleicher i Schuell).

cDNA frakcjonowany pod względem wielkości ligowaio z 1 μg wektora ZZAPII traktowanego EcoRI/XhoI/CIAP, (Stratagene) w 5 μl buforu reakcyjnego, składającego się z 50 mM Tns-HCl (pH 7,0), 10 mM MgCh, 10 mM ditiotreitiolu, 1 mM ATP i 2 jednostek ligazy DNA T4. Reakcję prowadzono w 4°C przez 2 dni.

Po pozostawieniu w temperaturze pokojowej na dwie godziny mieszaninę reakcyjną po ligowaniu zapakowano, stosując system Packagene (Promega). Łączna ilość rekombinantów wynosiła 270000 pfu.

150000 pfu upakowanego cDNA po transfekcji komórkami PLK-F' wysiano na płytki w ilości 10000 pfu na płytkę o średnicy 15 cm. Płytki inkubowano w 37°C przez osiem godzin, po czym przechowywano przez noc w 4°C. Podwójne próbki przeniesiono na filtry Colony/Plaque Screen™ (Dupont) i traktowano w sposób zalecany przez producenta.

Synteza oligonukleotydów

Oligonukleotydy syntetyzowano na syntetyzerze PCR-Mate DNA firmy Applied Biosystems, stosując metody zalecane przez producenta. Syntetyzowano następujące oligonukleotydy 5',3':

Oligo 1: GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG

Oligo 2: GGATGACTCAGTAAAACGACGGCCAGT

Oligo 3: CCIGG(A/G)CALATIC(G/T)(C/T)(C/T)TICCIGCICC(A/G)AAIGG

Oligo 4: GGATGACTCAAACAGCTATGACCATG

Oligo 5- GTTCAATTCGGAATGATG

170 326

Oligo 6: GCTGCACTTAATCCATAT

Oligo 7: TGCATAGCTTTTGGG

Oligo 8: GAGAGAGAG A GAG AG AGAGATCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT z-^ł· a a Τ'Z*'

UllgO V. ΛΐυΐΌΐ^ΌΙΌΌΛΌ 1 VJ

Oligo 10: CTAGACTCCAATCAC

Oligo 2 i 4 zawierały miejsce wiążące GCN4 (wskazane przez podkreślenie), które jak wykazano ułatwia wzbogacenie w dwuniciowe produkty PCR (Lew i Kemp, 1989).

Podstawa do zaprojektowania oligo 3 była następująca: Napisano sekwencje aminokwasów z przypuszczalnej domeny wiążącej hem cytochromu P450 awokado (Bozak et al., 1990) i odpowiadające sekwencje kodowane przez dwa homologi cytochromu P450 petunii pCGP142 ipCGP147· awokado PFGAGRRGCPG pCGP142 PFGAGKRICPG pCGP147 PFGSGRRICPG

Dzięki temu widoczne było, że zgodne sekwencje aminokwasów regionu wiążącego hem dla trzech roślinnych cytochromów P450 są następujące:

P F G A(S) G R(K) R I(G) C P G

Następnie można było wydedukować możliwe permutacje sekwencji nukleotydów, które mogą kodować aminokwasy znalezione w domenie wiążącej hem cząsteczek trzech cytochromów P450:

5'- CCX TTT GGX GCX GGX AGX CGX ΑΤΧ TGT CCX GGX -3'

C AG CA A GG C

T

X wskazuje pozycje, w których mogą być stosowane wszystkie cztery nukieotydy (A, C, G i T). Oligo 3 został zaprojektowany tak, aby uzupełniać podzestaw zgodnej sekwencji otrzymanej z trzech cytochromów roślinnych P450. Gdy degeneracja zasad była wyzsza niz trzy, stosowano głównie deoksy inozynę. Uzyskano sekwencję nukleotydów taką jak przedstawiona powyżej.

Reakcje PCR

Do wycięcia fagów Bluescript zawierających inserty cDNA petunii z 200000 pfu amplifikowanej λΖΑΡ biblioteki cDNA #1 użyto helpera fagowego (Stratagene), stosując metody opisane przez producenta. Szczep Escherichia coli XL1-Blue transfekowano mieszaniną fagów i wysiano 250000 kolonii do pożywki zawierającej ampicylinę. Komórki ponownie zawieszono w LB (Sambrook et al., 1989) i izolowano plazmid DNA, stosując procedurę bzy alkalicznej (Sambrook et al., 1989). Plazmid DNA oczyszczano następnie w gradiencie CsCl. Ten DNA zastosowano jako szablon do reakcji PCR.

Mieszaniny reakcyjne PCR do amplifikacji homologów; cytochromu P450 płatków kwiatowych zawierały 5 do 100 ng wyciętego DNA, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1,1,5 mM MgCf, 0,01% (w/v) żelatyny, 0,2 mM każdego z dNTP, 0,4 pm każdego z primerów, i 1,25 jednostek Tag polimerazy (Cetus). Mieszaniny reakcyjne (50 μΐ) poddano 30-krotnym cyklicznym zmianom temperatury między 94°C, 48°C i 72°C przez 1 minutę w każdej temperaturze. Amplifikowane produkty oczyszczano na żelu, stosując Geneclean (Bio 101 Inc.), ponownie amplifikowano w celu otrzymania materiału do klonowania i na końcu naprawiano końce, stosując polimerazę T4 DNA. DNA amplifikowany przy użyciu oligo 1 i 2 przed klonowaniem z pBluescript trawiono Hindll i Xhol. Produkt PCR, generowany przez amplifikację między oligo 3 i 4, klonowano bezpośrednio do wektora pBluescript z końcem ddT, opisanego przez Holtona i Grahama (1991).

Skrining bibliotek cDNA

Podwójne zbiory kolonii hybrydyzowano i przemywano w sposób następujący: w celu wykrycia bliźniaczych klonów stosowano ostre warunki (hybrydyzacja: 50% (v/v) formamidu, 6 x SCS, 1% (w/v) SDS w 42°C przez 16 godzin i przemywanie: 2 x SSC, 1% (w/v) w 65°C przez 2x15 minut, następnie 0,2 x SSC, 1 % (w/v) SDS w 65°C przez 2x15 minut), a do wykrycia

170 326 sekwencji zblizonych stosowano warunki łagodne (hybrydyzacja: 20% (v/v) formamid 6 x SSC, 1% (w/v) SDS w 42°C przez 16 godzin i przemywanie: 6 x SSC, 1% (w/v) w 65°C przez 1 godzinę).

Analiza technikąNortherna

Całkowity DNA wyizolowano z próbki, zamrożonej w ciekłym N 2 i zmielonej na drobny proszek przy użyciu moździerza i tłuczka. Do tkanki dodano bufor do ekstrakcji, o składzie 4 M izotiocyjanianu guanidyniowego, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM EDTA, 0,1% (v/v) sarkozylu i mieszaninę homogenizowano przez 1 minutę, stosując politron przy maksymalnej szybkości. Zawiesinę przesączono przez Miracloth (Calbiochem) i wirowano w rotorze z JA20 przez 10 minut przy 10000 obrotów na minutę. Zebrano supemantant i dopełniono CsCl do stężenia 0,2 g/ml (w/v). Następnie próbki uwarstwiono nad 10 ml poduszką 5,7 M CsCl, 50 mM EDTA (pH 7,0) w probówkach do wirówki Quick-seal (Beckman) o pojemności 38,5 ml i wirowano przy 42000 obrotów na minutę przez 12-16 godzin w 23°C w rotorze Ti-70. Peletki ponownie zawieszono w TE/SDS (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1% (w/v) SDS) i ekstrahowano układem rozpuszczalników fenol.chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1), nasyconym w 10 mM EDTA (pH 7.5). Po wytrąceniu etanolem peletki RNA ponownie zawieszono w TE/SDS.

Próbki RNA poddano elektroforezie na żelach 2,2 M formaldehydiu/1,2% (w/v) agarozy, stosując bufor wymywający o składzie 40 mM kwasu morfolinopropanosulfonowego (pH 7,0), 5 mM octanu sodu, 0,1 mM EDTA (pH 8,0). RNA przeniesiono na filtry Hybond-N (Amersham) w sposób opisany przez producenta i sondowano fragmentem cDNA znakowanym ³²P (10⁸ cpm/pg, 2 x 10⁶ cpm/ml). Hybrydyzację wstępną (1 h w 42°C) i hybrydyzację (16 h w 42°C) prowadzono w roztworze o składzie 50% (v/v) formamidu, 1 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 10% (w/v) siarczanu dekstranu. Do etapu hybrydyzacji wraz z sondą znakowaną ’²P dodano zdegradowane DNA ze spermy łososia (100 pg/ml).

Filtry przemywano roztworem o składzie 2 x SSC/1% (w/v) SDS w 65°C przez 1 do 2 godzin, a następnie 0,2 x SCC/1% (w/v) SDS w 65°C przez 0,5 do 1 h. Filtry eksponowano na filmie Kodak XAR z sitem intensyfikującym w -70°C przez 48 h.

Analiza RFLP

a. Izolacja genomowego DNA

DNA izolowano z tkanki liściowej w sposób opisany przez Dellaporta et al., (1983). Preparaty DNA oczyszczano dodatkowo przez wirowanie w gęstości pławnej CsCl (Sambrook et al., 1989).

b. Przeniesienie Southerna

DNA genomowe (10 pg) trawiono przez 16 godzin z 60 jednostkami Xbal i elektroforezowano na 0,7% (w/v) zelu agarozowym w buforze rozwijającym TAE (40 mM Tris-octanu, 50 mM EDTA). Następnie DNA denaturowano w roztworze denaturującym (1,5 M NaCl/0,5 M NaOH) przez 1 do 1,5 godziny, neutralizowano w roztworze o składzie 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5)/1,5 M NaCl przez 2 do 3 godzin, po czym przeniesiono DNA na filtr Hybond N (Amersham) w 20 x SSC.

c. Izolacja sondy chi-A

Klon cDNA chi-A (van Tunen et al., 1988) syntetyzowano przez PCR, stosując szablon cDNA wytworzony z RNA korony płatka kwiatowego OGB w stadium 3 i dwóch primerów oligonukleotydowych; #9, który pokrywał nukleotydy 6-29 i #10, który był komplementarny do nukleotydów 711-725 opublikowanej sekwencjjcDNAchi-A(vanTunenetal., 1988). Uzyskany produkt PCR ligowano z miejscem Smal pBluescribe M13 (Stratagene) i sekwencjonowano w celu potwierdzenia, ze sklonowany fragment odpowiada opublikowanej sekwencji.

Znakowanie sond DNA 3²P

Fragmenty DNA (50 do 100 ng) znakowano radioaktywnie za pomocą [α-^Pl-dCTP w ilości 50 pCi, stosując zestaw do oligoznakowania (Bresatec). Niewłączony [α- P]-dCTP usuwano przez chromatografię na kolumnie Sephadex G-50 (Fine).

170 326

Analiza sekwencji DNA

Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono według metody Sangera et al., (1977), stosując enzym Seouenase (USB. wersja 2.1). Całkowitą, sekwencję klonów pCGP602, pCGP176 i pCGP175 oznaczono przez kompilację sekwencji z rożnych subklonów hd13-mp18 i -mp19 (Norrander et al., 1983; Yamsch-Perron, 1985), otrzymanych za pomocą standardowych procedur klonowanie (Sambrook et al., 1989). Dla niektórych regionów w celu otrzymania danych o nakładających się sekwencjach niezbędne było zsyntetyzowanie primerów oligonukleotydowych

Do tego celu zsyntetyzowano następujących sześć primerów:

5' CGTGCCAATGAGCTAGG 3' 5' GATGITGGTTGTACTGAG 3' 5' OGAAACCAGATTTTCTTG 3' 5' TTTTTTTTTTTTTTTTT(AGC) 3' 5' GTITTCCCAGTCACGAC 3' 5' AACAGCTATGACCATG 3' sekwencja pnmeaa 1 sekwencja jrimeisar 2 sekwenjja primeaa 3 s<^lw^(^i^cja jrimairra 4 primer -40 primer odwrotny

Mapę restrykcyjnąpCGP602, pokazującąpozycję kilku z tych sekwencji można zobaczyć na fig. 8.

Poszukiwania homologii w bazach danych Genbank, SWISS-PROT i EMBL przeprowadzono stosując programy FASTA i TFASTA (Pearson i Lipman, 1988).

Konstruowanie pCGP293

Binarny wektor ekspresji pCGN293 otrzymano z binarnego wektora Ti pCGN1559 (McBride i Summerfelt, 1990). Plazmid pCGN1559 trawiono KpnI, a wystające końce 3' usunięto polimerazą T4 DNA zgodnie ze standartowymi protokołami (Sambrook et al., 1989). Następnie wektor trawiono dodatkowo XbaI, a uzyskany wystający koniec 5' wypełniono, stosując fragment Klenowa polimerazy I DNA. Wektor ponownie ligowano, otrzymując pCGP67. Fragment Pstl, o długości 1,97 kb, zawierający promotor Mac, terminator masy i różne miejsca klonowania (Comai et al., 1990) izolowano z pCGP40 i włączono do miejsca Pstl pCGP67, otrzymując pCGP293.

Plazmid pCGP40 konstruowano przez usunięcie z pCGN7334 genu GUS (Jefferson et al., 1987) jako fragmentu BamHI-SacI i zastąpienie go fragmentem BamHI-SacI z pBluescribe Ml 3, zawierającym miejsce multiklonowania. Plazmid pCGN7334 (otrzymany z firmy Calgene, Inc. CA) skonstruowano przez insersję fragmentu zawierającego produkt fuzji genów Mac-GUS-mas do miejsca XhoI pCGN7329 (Comai et al., 1990).

Konstruowanie pCGP90

Plazmid pCGP90 konstruowano przez klonowanie insertu cDNA z pCGP602 w orientacji sensownej poza promotorem Mac (Comai et al., 1990) z pCGP293. Insert cDNA zawierający fragment BamHI-KpnI izolowano z pCGP602 i ligowano z produktem trawienia pCGP293 za pomocą BamHI/KpnI. Prawidłowość insercji w pCGP90 ustalono za pomocą analizy restrykcyjnej DNA wyizolowanego z transformantów opornych na gentamycynę.

Konstruowanie drozdzowego wektora ekspresji pYGA22m

M13-mp18 trawiono za pomocąEcoRI i BglII, otrzymując fragment o długości 700 par zasad, zawierający miejsce multiklonowania. Fragment ten ligowano z fragmentem EcoRIBglIIzpYGA2269 (Ashikari et al., 1989). Uzyskany konstrukt, oznaczony pYGA22m, zawierał miejsce multiklonowania włączone zgodnie z prądem do promotora drożdżowej dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (fig. 11).

Konstruowanie pCGP618

Fragment EcoRl-KpnI o długości 1,8 kb, zawierający cały insert cDNA z pCGP175 ligowano z fragmentem EcoRI-KpnI o długości 9 kb z pY GA22m. Uzyskany plazmid pCGP6 18, zawierał fragment pCGP175 cDNA, ligowany w orientacji sensownej poza promotorem dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (fig. 11).

Konstruowanie pCGP620

Fragment EcoRI-Kpnl o długości 1,8 kb, zawierający cały insert cDNA z pCGP176 ligowano z fragmentem EcoRI-KpnI o długości 9 kb z pY GA22m (jak opisano dla konstruowania pCGP618). Uzyskany plazmid pCGP620 zawierał fragment pCGP176 cDNA, ligowany w

170 326 orientacji sensownej poza promotorem drożdżowej dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej.

Transformacja drożdży

OZ-UZ-Cp G.iuzxiz.j' LriJlJ ^ινιαν CC, upij ^/ΎοιηικαΠ νι αι., ι,/ο^γ u.cłiio±v±±I1Uhuhu żlu. pJuiw^ pCGP618 i pCGP620 według metody Ito et al., (1983). Dokonano selekcji transformantów pod względem ich zdolności do rewersji prototrofii tryptofanowej u G-1315.

Otrzymywanie ekstraktów drozdzowych do oznaczania aktywności 3',5'-hydroksylazy

a. G-1315/pCGP618

Pojedyncze izolaty G-1315/pCGP618 i rewertanta G-1315 rosnące na pozywce pozbawionej tryptofanu użyto zaszczepienia 50 ml YNBC [1,2% (w/v) drozdżowego podłoża azotowego bez aminokwasów (Difco), 2% (w/v) glukozy i 0,3% (w/v) kwasu Casamino (Difco)] i inkubowano ze wstrząsaniem przez 2 dni w 30°C. Komórki peletkowano przez wirowanie i uzyskano frakcję mikrosomalną według Oeda et al., (1985) z tym wyjątkiem, ze sferoplasty rozrywano w buforze do ekstrakcji, stosowanym do oznaczania aktywności 3',5'-hydroksylazy w tkance roślinnej. Peletki mikrosomalne zawieszono w 400 pl buforu A (10 mM Tns-HCl (pH 7,5), 0,65 M sorbitolu, 0,1 mM DTT, 0,1 EDTA) i 100 pl próbki wykorzystano do oznaczenia aktywności 3',5'-hydroksylazy.

b. G-1315/pCGP620

Pojedynczy izolat G-1315/pCGP620 użyto do zaszczepienia 20 ml YNBC, który następnie inkubowano przez 2 dni w 30°C. Komórki zebrano przez wirowanie, przemyto raz TE, raz buforem A, a następnie ponownie zawieszono w buforze B (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,2 M sorbitolu, 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA), zawierającym zymoliazę (0,1 mg/ml) (Seikagakukogyo, Japonia). Po inkubacji przez 1 godzinę w 30°C komórki peletkowano przez wirowanie i ponownie zawieszono w 400 pl buforu. A. Zawiesinę komórek wirowano następnie z perełkami szklanymi (średnica = 0,4 mm) przez 2 minuty, i oznaczano aktywność 3',5'-hydroksylazy w próbce 100 pl.

Transformacja petunii

a. Materiał roślinny

Nasiona Petunia hybrida (Skr4 x Sw63 i R57 x Rwl4) wyjaławiano w podchlorynie sodu o stężeniu 1,25% (w/v) przez 10 minut i spłukiwano trzy razy wjałowej wodzie. Wyjałowione ziarna nasączono w roztworze kwasu giberelinowego (GA3) o stężeniu 100 mg/ml na 16 do 20 godzin. Następnie kiełkowano je przez 2 tygodnie w pożywce 10% (w/v) MS (Murashige 1 Skoog, 1962), suplementowanej 1% (v/v) sacharozy i 0,8% (w/v) agaru Difco Bacto. Młode siewki przeniesiono do pożywki MS suplementowanej 3% (w/v) sacharozy, a po trzech tygodniach do peletek torfu Jiffy (Jiffy Products Ltd, Norwegia), trzymano w wilgoci i naświetlano (135 pE, światło lampy rtęciowej, 22°C) przez 2 do 3 tygodni. Młode rośliny przeniesiono następnie do komory wzrostowej (68 pE, zimne, białe światło fluorescencyjne, 25°C). Dla hodowli łącznej młode liście ścięto i wyjałowiono przez 2 minuty w 1,35% (w/v) podchlorynie sodu, po czym spłukano trzy razy jałową wodą. Tkankę liściową pocięto następnie na kwadraty o wielkości 25 mm2 i prekultywowano w pożywce MS, suplementowanej w 0,005 mg/ml kinetyny i 1,0 mg/ml kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D), przez 24 godziny.

b. Hodowla łączna Agrobacterium i tkanki Petunia

Szczep Agrobacterium tumefaciens AGLO (Lazo et al., 1991), zawierający wektor binarny oCGP90 (fig. 14) utrzymywano w 4°C na płytkach agarowych mG/L (Garfiiikel i Nester, 1980) z 100 mg/ml gentamycyny. Pojedynczą kolonię namnazano przez noc w ciekłej pożywce, zawierającej 1 % (w/v) Bactopeptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drozdżowego Bacto i 1 % (w/v) NaCl. Następnego dnia przygotowano końcowe stężenie 5 x 10⁸ komórek/ml przez rozcieńczenie w ciekłej pożywce MS, zawierającej 3% (w/v) sacharozy (BPM). Rurki liściowe zamoczono na 5 minut w BPM, zawierającym AGLO/pCGP90. Rurki liściowe odciśnięto do sucha i umieszczono w pożywce do hodowli łącznej na 4 dni. Pożywka do hodowli łącznej składała się z pożywki SH (Schenk i Hildebrand, 1972), suplementowanej 0,05 mg/l kinetyny i 1,0 mg/l 2,4-D i zawierała

170 326 pokarmową, warstwę zawiesiny komórek tytoniu, rozpyloną na pożywce do hodowli łącznej oraz bibułę filtracyjną, umieszczoną na wierzchu zawiesiny komórek tytoniu.

c. Odzyskanie transgenicznych roślin petunii po hodowli łącznej rurki liściowe przeniesiono do następującej pożywki selekcyjnej: rurki Skr4 x Sw63 do świeżej pożywki MS, suplementowanej 3% (w/v) sacharozy, 2 mg/l a-benzyloaminopuryny (BAP), 100 mg/l kanamycyny, 350 mg/l cefotaksymu, 0,3% (w/v) Gelrite Gellan Gum (Schweizerhall); rurki Rp57 x Rwl4 do tej samej pożywki, zawierającej 0,5 mg/l BAP i kwas α-naftalenooctowy (NAA) zamiast 2 mg/l BAP. Po 3 tygodniach regenerujące się eksplanty przeniesiono do świeżej pożywki Przypadkowe pędy, które przetrwały selekcję kanamycyną izolowano i przeniesiono do BPM, zawierającego 100 mg/l kanamycyny i 350 mg/l cefotaksymu w celu indukcji korzenia. Wszystkie hodowle utrzymywano w 16-godzinnym okresie świetlnym (60 μΕ, zimne białe światło fluorescencyjne) w 23 ± 2°C. Gdy korzenie osiągnęły długość 2-3 cm, siewki petunii transgenicznej przeniesiono do autoklawowanej mieszanki doniczkowej Debco 51410/2 w rurkach długości 8 cm. Po 4 tygodniach rośliny replantowano do 15 cm donic,· stosując tę samą mieszankę i utrzymywano w 23°C w 14-godzinnym okresie świetlnym (300 μΕ, światło z halogenku rtęci).

Transformacja tytoniu

a. Materiał roślinny

Rośliny podstawowe Nicotiana tabacum (odmiana uprawna Xanthi) utrzymywano w pożywce MS, suplementowanej 1 mg/ml kwasu indolomasłowego (IBA) i zestalono z 0,25% (w/v) Gelritu. Tkankę liściową pocięto na kwadraty o powierzchni 25 mm” i umieszczono na pożywce MS, zawierającej 1 mg/l BAP i 0,5 mg/l kwasu indolooctowego (IAA) na 24 godziny.

b. Łączna hodowla Agrobacterium i tkanki tytoniu

Hodowlę łączną przeprowadzono w sposób opisany poprzednio dla petunii.

c. Odzysk transgenicznych roślin tytoniu

Po hodowli łącznej rurki liściowe przeniesiono do pożywki MS, suplementowanej 1 mg/l BAP, 0,5 mg/l IAA, 100 mg/l kanamycyny i 350 mg/l cefotaksymu (pożywka selekcyjna). Regenerujące się eksplanty po 2-3 tygodniach przeniesiono do świeżej pożywki selekcyjnej. Przypadkowe pędy, które przetrwały selekcję kanamycyną izolowano i przeniesiono do pożywki MS, zawierającej 1 mg/l IBA, 100 mg/l kanamycyny i 350 mg/l cefotaksymu w celu indukcji korzenia. Gdy korzenie osiągnęły długość 2-3 cm, transgeniczne siewki tytoniu przeniesiono do gleby w sposób taki jak opisano dla petunii.

Analiza antocyjanidyny

Przed analizą HPLC cząsteczki antocyjaniny, obecne w ekstraktach z płatków kwiatowych poddano hydrolizie kwasowej w celu usunięcie ugrupowań glikozylowych z rdzenia antocyjanidyny. Schemat hydroksylacji pierścienia B pigmentów antocyjaninowych ustalono za pomocą analizy HPLC rdzenia cząsteczki antocyjanidyny. Do tej analizy użyto systemu HPLC Hewlett-Packard 1050, wyposażonego w detektor wielu długości fal (MWD). Rozdziały chromatograficzne z odwróconymi fazami przeprowadzano na kartridgowej kolumnie Spherisorb S5 ODS2 o wymiarach 250 mm x 4 mm.

a. Ekstrakcja antocyjanin i flawonoidów

Pigmenty kwiatowe ekstrahowano z segmentów płatków kwiatowych (ca. 50 mg) za pomocą 5 ml metanolu, zawierającego 1% (w/v) wodnego 6M roztworu kwasu chlorowodorowego. Ekstrakty przed wstrzyknięciem do układu HPLC rozcieńczono wodą (1:9) i przesączono (Millex HV, 0,45 μ).

b. Hydroliza antocyjanin

Surowe ekstrakty metanolowe (100 μΐ), otrzymane w powyzszym punkcie a. odparowano do sucha w Pierce Reacti-Vials, stosując strumień suchego azotu w temperaturze pokojowej. Pozostałości rozpuszczono w 200 μΐ ”M HCl, fiolki zamknięto i ogrzewano w 100°C przez trzydzieści minut. Mieszaniny otrzymane po hydrolizie przed analizą HPLC rozcieńczono wodą (1:9) i przesączono (Miller HV, 045 μ).

170 326

c. Chromatografia

Separacji pigmentów kwiatowych dokonano za pomocą elucji gradientowej, stosując następujący układ:

Rozpuszczalnik A· (1^1^^^^^. H3PO4 :H2O) (3:2.5:1000)

Rozpuszczalnik B: acetonitryl

Warunki gradientu: 5% B do 40% B w ciągu 20 minut

Szybkość przepływu: 1 ml/min

Temperatura: 35°C

Detekcja: MWD z jednoczesnym ustaleniem danych przy 280, 350 i 546 nm

Piki aatocyjaaidyn identyfikowano przez porównanie ze znanymi wzorcami.

2. Klonowanie i analiza 3'.5'-hydroksylazy

Charakteryzowanie enzymu 3',5'-hydroksylazy

a. Regulacja rozwojowa

W ekstraktach płatków kwiatowych P. hybrida, odmiana uprawna OGB, zebranych z kwiatów w różnych stadiach rozwoju zdefiniowanych powyżej, analizowano aktywność 3',5'hydroksylazy.

Stwierdzono, że aktywność enzymu 3',5'-hydroksylazy w płatkach kwiatowych OGB jest regulowana rozwojowo podczas dojrzewania korony kwiatowej (fig. 2B). Temu profilowi rozwojowemu towarzyszyła równolegle ekspresja innych genów, zaangażowanych w biosyntezę flawonoidów. Aktywność enzymu 3',5'-hydroksylazy i ekspresja genów syntazy chalkonowej (CHS), izomerazy chalkonowołlawanonowej (CHI), reduktazy dihydroflawanolowej (DHR) osiągały maksimum w pobliżu stadiów 3 do 4 rozwoju kwiatu.

b. Indukcja aktywności 3',5'-hydroksylazy w tkance liściowej

Ekspresja genów ścieżki biosyntezy pigmentów flawonoidowych normalnie w tkance liściowej nie zachodzi. Jednakże syntezę pigmentów delfinidyny w liściach OGB indukowano przez inkubację w 2% (w/v) roztworze glukozy w warunkach wysokiego natężenia światła. W tych warunkach można wykryć aktywność 3',5'-hydroksylazy w tkance liściowej OGB. Wykazano, ze maksymalna aktywność aktywności enzymu występuje po 96 godzinach traktowania glukozą i wysokim natężeniem światła. W tych warunkach była również indukowana ekspresja kilku innych genów biosyntezy pigmentu na poziomach porównywalnych z poziomami obserwowanymi w pojawiających się płatkach kwiatowych. Z wyników tych wyciągnięto wniosek, ze geny Hfl i/lub Hf2 są indukowane w tkance liściowej traktowanej glukozą i wysokim natężeniem światła.

c. Dowód na przynależność 3',5'-hydroksylazy do klasy enzymów cytochromu P450

Wykazano, ze aktywność 3',5'-hydiOksylazy w płatkach kwiatowych OGB jest połączona z frakcją mikrosomalną i zależna od NADPH. Aktywność może być hamowana przez działanie na mikrosomy tlenkiem węgla i dwoma inhibitorami, które w sposób specyficzny inaktywują enzymy cytochromu P450: tetcyclasis i 1-amlaobenzotriazyaę (Taton et al., 1988; Mathews et al., 1985; Rademacher et al., 1987).

Konstruowanie biblioteki cDNA, wzbogaconej w sekwencje cytochromu P450

Translacja mRNA cytochromu P450 zachodzi na polisomach związanych z błonami (Takemori i Kominami, 1989). Zatem w celu wzbogacenia w sekwencje cytochromu P450 (w tym sekwencje 3',5'-hydroksylazy) skonstruowano bibliotekę cDNA, stosując związane z błonami polisomalne RNA, wyizolowane z płatków kwiatowych OGB kwiatów stadium 3 do 4. Izolacja RNA płatków kwiatowych kwiatów stadium 3 do 4 zapewniała, ze sekwencje 3',5'-hydroksylazy były maksymalnie reprezentowane w bibliotece, ponieważ wykazano, że aktywność 3',5'-hydroksylazy w tym stadium rozwoju jest maksymalna (patrz powyżej i fig. 2B). Uzyskana biblioteka, oznaczona jako biblioteka cDNA #1, zawierała 250000 pierwotnych rekombinantów^.

Amplifikacja PCR cDNA cytochromu P450 płatków kwiatowych petunii

Przeprowadzono sekwencjonowanie dużej liczby cytochromów P450, z organizmów tak różnych jak kręgowce, grzyby, owady, bakterie i z jednej rośliny (Nebert et al., Bozak et al., 1990). Charakterystyczną cechą wszystkich tych enzymów jest istnienie pewnej liczby małych

170 326 obszarów zachowania sekwencji, zwłaszcza wokół reszty cysteinowej, biorącej udział w wiązaniu hemu. Sekwencja aminokwasów F(G,S)XGXRXCXGjest obecna w domenie wiążącej hem prawie wszystkich zsekwencjonowanych dotychczas mikrosomalnych cytochromów P450, przy czym X może być dowolnym aminokwasem (fig. 3). Ta zgodna sekwencja została porównana z bazą danych białek NBRF przy użyciu programu FASTA (Pearson i Lipman, 1988) w celu oznaczenia częstości występowania aminokwasów wokół tego obszaru dla wszystkich sekwencji mikrosomalnego cytochromu P450 w bazie danych. Analiza ta wykazała, ze najczęściej występującą sekwencję aminokwasów dla każdej pozycji wokół domeny wiążącej hem była sekwencja:

Zaprojektowano oligonukleotyd do hybrydyzacji z genem kodującym sekwencję podkreśloną i sekwencje podobne. Ten oligonukleotyd, oznaczony oligo 1, jest pokazany poniżej:

5'-GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGTGCIGG-3'

Część podkreślona jest sekwencją dodatkową, która zawiera miejsce rozpoznawane przez Hind III w celu ułatwienia ukierunkowanego klonowania produktów reakcji PCR. Inkluzja deoksyinozyny (I) pokryła różne możliwości wykorzystania kodonu gdy więcej niż dwa kodony kodująten sam aminokwas. Zasada deoksyinozyna ulega sparowaniu z taką samą efektywnością z A, T, G ¹ i C (Martin et al., 1985; Ohtsuka et al., 1985).

Plazmidowy DNA uzyskany z biblioteki cDNA # 1 w sposób opisany w rozdziale Materiały i metody zastosowano jako szablon do amplifikacji sekwencji pokrewnej cytochromu P450 o długości 360 par zasad, stosując oligo 1 i 2 (fig. 3). Oligo 2 odpowiadał primerowi -20 (Stratagene) plus miejsce wiążące GCN4 (Lew i Kemp, 1989) na końcu 5'. Fragment uzyskany w reakcji PCR klonowano z pBluescript, a uzyskany plazmid oznaczono pCGP450. Region 5' pCGP450 kodował sekwencję polipeptydu o znacznej homologii z poprzednio sekwencjonowanymi cząsteczkami cytochromu P450.

Izolacja homologów cytochromu P450 z biblioteki cDNA płatków kwiatowych petunii

Plazmid pCGP450 użyto do skriningu biblioteki #1 cDNA (60000 kolonii) w poszukiwaniu klonów pokrewnych. Do wykrycia zarówno klonów bliźniaczych jak i drugiej grupy cDNA cytochromu P450 zastosowano dwie następujące po sobie hybrydyzacje w ostrych i łagodnych warunkach. Do następnych analiz wybrano dwa reprezentatywne klony cDNA z każdej z bliźniaczych grup. Bliźniaczy pCGP450 oznaczono pCGP142, a reprezentanta drugiej grupy oznaczono pCGP 147. Fragment Sal I-EcoRI, który zawierał tylko sekwencj e koduj ące pCGP 147 zastosowano następnie do ponownego sondowania 16000 kolonii z biblioteki cDNA #1 w łagodnych warunkach. Przeprowadzono sekwencjonowanie łącznie 20 klonów, które hybrydyzowały z sondą, co umożliwiło zidentyfikowanie dwóch dalszych homologów cytochromu P450: pCGP158 i pCGP160 (fig 4A).

Izolacja dodatkowego homologu cytochromu P450 z płatków kwiatowych za pomocą reakcji PCR

Do zaprojektowania drugiego zdegenerowanego oligonukleotydu (oligo 3), który pokrywał sekwencje aminokwasów kodowane przez co najmniej dwa z trzech klonów cytochromów P450 wykorzystano informację o sekwencji wokół przypuszczalnej domeny wiążącej hem klonów petunii pCGP142, pCGP147 i poprzednio opisanej sekwencji cytochromu P450 awokado (O'Keefe i Leto, 1989; Bozak et al., 1990) jak opisano w rozdziale Materiały i metody. Oligonukleotyd ten zastosowano do amplifikacji pokrewnych sekwencji za pomocąreakcji PCR, stosując jako szablon bibliotekę cDNA #1 i oligo 4 jako drugi primer (fig. 3B). Produkty reakcji w zakresie wielkości 2.50-500 par zasad wyizolowano w sposób opisany w rozdziale Materiały i metody i klonowano w ddT-zakończonym wektorze pBluescript, opisanym przez Holtona i Grahama (1991). Klonowane fragmenty reakcji PCR sekwencjonowano i wykazano, ze kodują one piąty homolog cytochromu P450. Do dalszej analizy wybrano jeden klon, oznaczony pCGP455.

170 326

Izolacja dalszych homologów cytochromu P450 z biblioteki cDNA #1

Do skriningu 50000 rekombinantów z biblioteki cDNA #1 w poszukiwaniu sekwencji pokrewnych zastosowano mieszaną sondę fragmentów DNA znakowanych ³²P, która zawierała regiony kodujące homologów cytochromu P450 pCGP142, pCGP147, pCGP158 i pCGP160 oraz insert cDNa z pCGP454 (fig. 4B do 4H). Wykryto łącznie 152 hybrydyzujące klony w łagodnych warunkach hybrydyzacji i przemywania. Dalsze 13 różnych homologów cytochromu P450 zidentyfikowano za pomocą analizy sekwencyjnej DNA wyizolowanego z hybrydyzujących klonów. Wśród tych klonów rozrózniono dwie bliźniacze grupy o dużym podobieństwie Regiony kodujące każdej z tych dwóch grup wykazywały 94% homologii lub podobieństwa na poziomie DNA. Do dalszych badań wybrano dwóch reprezentantów jednej z grup bliźniaczych, pCGP174 i pCGP176 (fig. 5A) oraz jednego reprezentanta drugiej grupy bliźniaczej, pCGP175 (fig. 5B).

Analiza homologów cytochromu P450 za pomocą przeniesienia Northerna i RFLP

Do rozróżnienia, który z homologów cytochromu P450 miał charakterystykę cząsteczkową cDNA kodującego 3',5'-hydroksylazę użyto analiz metodą przeniesienia Northerna i RFLP. W P. hybnda są dwa miejsca genetyczne, Hf1 i Hf2, które regulują aktywność 3'.5'-hydroksylazy (de Vlaming et al., 1984; Wiering, 1974). Ekspresja Hf1 zachodzi zarówno w wieńcu jak i łagiewce pyłkowej kwiatów P. hybrida i daje znacznie wyższe poziomy 3',5'-hydroksylazy niz Hf2, który ulega ekspresji tylko w wieńcu korony kwiata. Aktywność 3',5'-hydroksylazy w petunii jest również regulowana rozwojowo i przestrzennie. W normalnych warunkach wzrostu enzym może być wykryty jedynie w tkankach płatków kwiatowych, a jego stężenie wzrasta do maksymalnego poziomu około stadium 3-4 rozwoju kwiatu a następnie opada w kwiatach w pełni otwartych (stadium 5; patrz fig. 2(B)). Aktywność może być indukowana w tkance liściowej w pewnych warunkach stresu, takich jak traktowanie glukozą/wysokim natężeniem światła, opisanych powyżej. Zgodnie z tym oczekiwano, że klon cDNA kodujący 3',5'-hydroksylazę będzie miał profil ekspresji na przeniesieniach DNA równoległy do profilu aktywności enzymu. Oczekiwano również, że klon cDNA, kodujący 3',5'-hydroksylazę P. hybrida będzie mapował miejsca Hf1 lub Hf2 został zmapowany w chromosomie I genomu P. hybrida i jest połączony z miejscem Phl (Comu, 1984; Comu et al., 1990), natomiast Hf jest blisko połączony z Po na chromosomie V (Wallroth et al., 1986). Do uzyskania danych o połączeniach różnych homologów cytochromu P450 wykorzystano, analizę RFLP DNA wyizolowanego z populacji F2 roślin otrzymanych z krzyżówki między wsobnymi liniami V23 (Hf1/Hf1, Hf2/Hf2) i R51 (hfl/hfl, hf2/hf2). Genotyp Hf1 przypisano roślinom F 2, posiadającym aktywność 3',5'-hydroksylazy w łagiewkach pyłkowych kwiatów. Ponadto w oparciu o połączenie z genem phl, który ma wpływ ,na pH w wakuolach płatków kwiatowych możliwe było przypisanie genotypu HfT/HfT roślinom w populacji F2 (Wiering i de Vlaming, 1984).

Macierzysta linia V23 (Hf1/Hf1) miała równie genotyp ph1/ph1, w wyniku czego uzyskuje się homogenizat płatków kwiatowych o pH w przybliżeniu równym 6,2. Ponieważ rośliny Ph1 dawały homogenizat o pH równym 5,3, możliwe było odróżnienie roślin phl/phl (Hf1/Hf1) w populacji R51 x V23 F2 przez pomiar pH homogenatów płatków kwiatowych.

Do rozróżnienia kandydatów klonów Hf2 wykorzystano miejsca połączenia między miejscami Hf2 i Po. Wykazano, że miejsce Po odpowiada genowi chi-A P. hybrida, który koduje enzym izomerazę chalkonowoflawanonową (van Tunen et al., 1991). Klon cDNA chi-A może być zatem zastosowany w analizie RFLP do konkretnego przypisania genotypu Po lub po w populacji F2. Ponieważ V23 ma genotyp Hf2/Hf2, po/po, możliwe było ustalenie połączenia z miejscem Hf2 przez ko-segregację V23-podobnych, i R51-podobnych szablonów RFLP z szablonami po i Po, wykrytymi przez sondę chi-A.

Do sondowania plam otrzymanych przez przeniesienie RNA i plam otrzymanych techniką Southema DNA genomowego wyizolowanego z poszczególnych roślin w populacji V23 x R51 F2 zastosowano fragmenty cDNA, które odpowiadały niepoddanemu translacj i regionowi 3' homologów cytochromu P450. Za pomocą tej analizy wykazano, że ekspresja genów odpowiadających klonom pCGP174 i pCGP175 następowała równolegle do aktywności 3',5'-hydroksylazy. Ponadto wykazano,

170 326 ze gen odpowiadający pCGP175 był blisko połączony z miejscem Hf1, a odpowiadający pCGP175 połączony z miejscem Hf2.

a. pCGP174

Fragment Hind II-Kpnl 3' z klonu pCGP174 (fig. 5A) o długości 330 par zasad dał taki wzorzec hybrydyzacji zarówno na plamach RNA jak i DNA, który sugerował, ze ten klon odpowiadał miejscu Hf1 (fig. 6). Ekspresja genu zachodziła w tkankach zarówno wieńca jak i łagiewki pyłkowej i miała profil rozwojowy, który był równoległy do aktywności 3',5'-hydroksylazy, osiągając pik w wieńcach płatków kwiatowych stadium 3. Nie wykryto ekspresji w liściu, ale była ona indukowana w tej tkance przez traktowanie glukozą i wysokim natężeniem światła Ponadto nie zachodziła wykrywalna ekspresja genu w tkance płatków kwiatowych hf1/hf1 linii mutantów R51 lub SW63. Dla kontrastu, stosunkowo wysokie poziomy ekspresji wykryto dla Hf1/Hf1 linii V23 i Th7 oraz mieszańca V23 x R51 (fig. 6A).

W populacji V23 x R51 na plamach genomowych DNA trawionego Xbal, otrzymanych technikąSouthema, fragment Hindlll-KpnI 3' z pCGP174 o długości 330 par zasad wykrył dwa RFLP, które dzieliły się niezależnie. RFLP#1 odpowiadał silnie hybrydyzującym pasmom DNA, natomiast RFLP#2 odpowiadał pasmom słabo hybrydyzującym (patrz fig. 6B). jedenaście z 12 roślin, którym był przypisany genotyp ph1/ph1, miało V23-podobny wzorzec dla RFLP#1 i 49 z 49 roślin, które miały aktywność 3',5'-hydroksylazy w łagiewkach pyłkowych miały dla RFLP#1 wzorzec V23- lub VR-podobny. Ponadto dla łącznej ilości 32 roślin nastąpiła całkowita kosegregacja wzorców V23, VR i R51 RFLP dla chi-A (po) z odpowiadającymi wzorcami RFLP#2.

Dane te dostarczają silnego dowodu na to, ze pCGP174 koduje 3',5'-hydroksylazę i odpowiada miejscu Hf1 (RFLP #1) i ze sonda 3' hybrydyzowała krzyżowo z miejscem Hf2 (RFLP #2).

b. pCGP175

Fragment Hindll- Xho 3' z klonu pCGP175 o długości 320 par zasad (fig. 5B) dał taki wzorzec hybrydyzacji zarówno na plamach RNA jak i DNA, który sugerował, ze klon ten odpowiada miejscu Hf2 (fig. 7). Analiza techniką Northern wykazała, że gen był regulowany rozwojowo w sposób podobny jak pCGP174, z maksymalną ekspresję w stadium 3 wieńców płatków kwiatowych, jakkolwiek nie wykryto ekspresji w tkance łagiewki pyłkowej OGB. Ekspresja genu zachodziła również w tkance płatków kwiatowych V23 (Hf2/Hf2), Th7 (Hf2/Hf2) oraz w mieszańcu V23 x R51 (fig. 7A).

Fragment HindIII/XhoI 3' z pCGP175 o długości 320 par zasad otrzymany techniką Soutbema hybrydyzował z tymi samymi fragmentami genomowymi wytworzonymi przez trawienie Xbal DNA genomowego V23 i R51, które słabo hybrydyzowały z sondąpCGP174 3' (RFLP#2). Nastąpiła całkowita kosegregacja wzorców RFLP V23, VR i R51 RFLP wykrywanych przez sondę pCGP175 3' i odpowiadających wzorców RFLP dla chi-A (Po) (fig. 7B).

Eksperymenty z ekspresjąw drożdżach (patrz poniżej) potwierdziły następnie, ze zarówno pCGP175 jak i bliźniaczy pCGP174 (pCGP176) kodują 3',5'-hydroksylazę. Ponadto w wyniku ekspresji pCGP 174 w wersji o pełnej długości w mutancie Petunia bf1/bf1, 1ιΙ2/Μ2 uzyskano wzrost aktywności 3', 5'-bydrokjylazy i zwiększenie produkcj i 3 ',5'-hydroksylowanych antocyj anin powyżej niskich poziomów podstawowych, normalnie spotykanych w roślinach nie-tranjgenicznycb. Po rozpatrzeniu razem z wynikami RFLP wyciągnięto wniosek, ze pCGP174 odpowiada miejscu Hf1, a pCGP175 odpowiada miejscu Hf2.

Izolacja klonów cDNA Hf1 pełnej długości i analiza sekwencji

Na podstawie wstępnej analizy sekwencji wykazano, że pCGP174 nie stanowi pełnej długości klonu odpowiadającego transkryptu, natomiast pCGP175 zawiera przypuszczalny kodon inicjacyjny i jest prawdopodobnie cDNA o pełnej długości. Analiza sekwencji wykazała również, że pCGP176 jest dłuższą wersją pCGP174 i zawiera kodon ATG o długości 17 par zasad na końcu 5'. Jednakże na podstawie samej tej analizy nie było możliwe wiarygodne przewidzenie czy pCGP176 zawiera cały region kodujący tego genu. Zgodnie z tym przeprowadzono skrining bibliotek cDNA #2 w poszukiwaniu dłuższych klonów bliźniaczej

170 326 grupy pCGP174/pCGP176. W poszukiwaniu klonów hybrydyzujących z fragmentem 3' HindIII-KpnI zpCGp174 o długości 0,33 kb przeprowadzono skrining około 1,5 x 10⁵ rekombinantów z biblioteki cDNA #2. Do dalszej analizy wybrano dwa hybrydyzujące klony, oznaczone pCGP601 i pCGP602. Zarówno pCGP60i jak i pCGP602 zawierały przypuszczalne kodony inicjacyjne translacji, ale pCGP602 kodował dłuższy, nie podlegający translacji region 5'.

Mapa restrykcyjna dla pCGP602, wskazująca metodologię zaadoptowana do sekwencjonowania klonów i sekwencji primerów oligonukleotydowych, wykorzystana do uzyskania informacji o nakładających się sekwencjach jest pokazana na fig. 8.

Sekwencja nukleotydów i wydedukowaną sekwencja aminokwasów bliźniaczych klonów pCGP176 i pCGP602 jest pokazana na fig. 9. Podobnie fig. 10 przedstawia sekwencję nukleotydów i wydedukowany produkt translacji pCGP175.

Przy użyciu uporządkowania generowanego za pomocą programu FASTA (Pearson i Lipman, 1988) stwierdzono, ze sekwencje aminokwasów kodowane przez geny 3',5'-hydroksylazy petunii charakteryzuje identyczność pozycji aminokwasów w 94%. Sekwencje nukleotydów są identyczne w 94%. W oparciu o schemat klasyfikacyjny dla cytochromów P450 sekwencja ta podobnie plasuje oba geny w tej samej rodzinie/podrodzinie. Ponieważ sekwencje aminokwasów 3',5'-hydroksylazy charakteryzuje identyczność z innymi poprzednio scharakteryzowanymi członkami superrodziny cytochromu P450 poniżej 40% odpowiadające geny należą do nowej rodziny P450, różnej od wszystkich innych genów P450.

Ekspresja cDNA pCGP175 w drożdżach

Insert cDNA z pCGP 175 ligowano w orientacji sensownej za promotorem dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej w wektore drożdzowym pYGA22m. Uzyskanym konstruktem, oznaczonym pCGP618 (fig. 11) transformowano szczep drożdży G-1315 (Ashikari et al., 1989). Pojedynczy transformant namnazano w 50 ml YNBC w 30°C przez 2 dni. Wykazano, że frakcja mikrosomalna przygotowana z tej hodowli posiada aktywność 3',5'-hydroksylazy, natomiast równoważna frakcja, przygotowana z drożdży nietransformowanych nie posiada aktywności (fig. 12). Na tej podstawie wyciągnięto wniosek, że insert cDNA z pCGP175 koduje 3',5'-hydroksylazę.

Ekspresja pCGP176 w drożdżach

Insert cDNA z pCGP176 ligowano w orientacji sensownej za promotorem dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej w wektorze drozdzowym pYGA”2m. Uzyskanym konstruktem, oznaczonym pCGP620 transformowano szczep drożdży G-1315. Wykazano, ze ekstrakt, przygotowany z drożdży transformowanych posiada aktywność 3',5'-hydroksylazy, natomiast równoważna frakcja, przygotowana z drożdży nietransformowanych nie posiada aktywności (fig. 13). Na tej podstawie wyciągnięto wniosek, ze insert cDNA z pCGP176 koduje 3',5'-hydroksylazę.

Ekspresja cDNA Hf1

a. Ekspresja w mieszańcu hf1/hf1, hf2/hf2 P. hybrida F1, z Skr4 x Sw63

Insert cDNA pCGP602 ligowano za promotorem Mac binarnego wektora Ti pCGP293 Uzyskany konstrukt, oznaczony pCGP90 (fig. 14) wprowadzono do mieszańca F1 Petunia Skr4 x Sw63, przy użyciu przeniesienia genu za pośrednictwem Agrobacterium. Blaszki liściowe Skr4 x Sw63 hodowano łącznie z AGLO/pCGP90, a integrację insertu cDNA pCGP90 z genomem Skr4 x Sw63 potwierdzono za pomocą analizy Southerna roślin otrzymanych po selekcji kanamycyną.

Rośliny transgeniczne miały znacznie wyższe poziomy zarówno aktywności enzymu 3\5'-hydroksylazy (fig. 15) jak i 3',5'-hydroksylowanych antocyjanin (tabela 3A) niz nietransgeniczny mieszaniec Skr4 x Sw63. Chociaż Skr4 x Sw63 jest homozygotyczny i recesywny w odniesieniu do genów Hf1 i Hf2, mptacje te nie blokują całkowicie wytwarzania enzymu, ponieważ w ekstraktach płatków kwiatowych Skr4 x Sw63 wykryto niskie poziomy aktywności enzymu 3k5'-hydro>ksylazy (fig. 15). Ponadto w ekstraktach z płatków kwiatowych Skr4 x Sw63 po hydrolizie kwasowej wykryto niskie poziomy (100 μg/g) malwidyny (tabela 3A). Wprowadzenie cDNA Hf1 powoduje znaczne zwiększenie poziomu aktywności 3',5'-hydroksylazy w tkance wieńców

170 326 płatków kwiatowych (fig. 15), a hydrolizowaae kwasowo ekstrakty z płatków kwiatowych roślin transgenicznych miały poziom malwidyny cztery razy wyzszy niz poziom malwidyny, wykryty w nie-traasgealczaych roślinach kontrolnych (tabela 3A).

b. Ekspresja w Nicotiana. tabacum, odmiana uprawna Xanthi

Kwiaty tytoniu (N. tabacum, odmiana uprawna Xanthi) wytwarzającyjanidynę jako jedyną antocyjaaidyaę. Transformacja tytoniu za pomocą pC.GP90 doprowadziła do akumulacji w kwiatach oprócz cyjanidyny znacznych ilości delfiaidyay (pokazano w tabeli 3A).

Tabela 3A Analiza pigmentów

Poziomy antocyjanidyny, wykryte w hydrolizowanych kwasowo ekstraktach z płatków kwiatowych
Tytoń	Malwidyn (pg/g płatka)	Cyjanidyna (pg/g płatka)	Delfinidyna (pg/g płatka)
Petunia Skr4 x Sw63	100	1 nw	nw
Skr4 x Sw63/pCGP90	410	nw	nw
Tytoń Nienamnazana kontrola	nw	272	nw
Tytoń transgeniczny	nw	229	36

¹ nie wykryto

c. Ekspresja w mieszańcu hfl/hfl, hf2/hf2 P. hybrida F1 Rp57 x Rw14.

Linię petunii Rp57 x Rwl4 transformowano, stosując pCGP90 i procedurę podobną do tej którą stosowano dla Skr4 x Sw63. Kwiaty traasgeaiczne wytwarzały znaczne ilości petunidyny i malwidyny, które były niewykrywalae w roślinach nietraasformowaaych (tabela 3B). Letualdyaa i malwidyna są metylowaaymi pochodnymi delfiaidyay.

Tabela 3B

Analiza pigmentów w linii Rp57 x Rw14 o wysokim pH

Zawartości procentowe antocyjamdyn w hydrolizowanych kwasowo ekstraktach z płatków kwiatowych
Roślina Petunia Rp57 x Rw14 Rp57 x Rw14/pCGP90	Cyjanidyna (%)' 5,0 0	Peonidyna (%)' 95,0 45,2	Petunidyna (%)' 0 7,8	Malwidyna (%)' 0 47,0

Ekspresja wprowadzonego Hf1 cDNA w mieszańcu Skr4 x Sw63 miała znaczny wpływ na kolor kwiatu. Tkanka owocolistka i pręcika kwiatów nie-traasgeniczaych są białe, natomiast te same tkanki w roślinach traasgeaiczaych mająkolor niebiesko/purpurowy. Ponadto ekspresja Hfl cDNA w mieszańcu Skr4 x Sw63 nadawała normalnie bardzo jasno różowej koronie płatka kwiatowego odcień głęboko różowy/fioletowy. W przypadku tytoniu wytwarzanie pochodnych delfinkiyay prowadzi do mniej wyraźnego niebieszczenia starzejących się kwiatów. Ekspresja Hf1 cDNA w mieszańcu Rp57 x Rw14 ma znaczny wpływ na kolor kwiatu. Nie-traasgeaiczae rośliny Rp57 x Rw14 są różowe, a główną zawartą w nich antocyjaaidynąjest peonidyna (patrz tabela 3B). Transformacja za pomocą Hf1 cDNA prowadzi do znacznego niebieszczenia koloru kwiatu.

170 326

Obserwowane zmiany koloru mogą być również opisane za pomocą liczb z Karty Kolorów Królewskiego Towarzystwa Ogrodniczego. Generalnie zmiany mogą być opisane jako przesuwanie się koloru od odcieniu jasnych do średnio różowych o wartości 60C/D-65C/D, do odcieni

ViVll mm . . ........ .1 λΙλι οοΙ/ί γΊί/γί dmm </±1 iiivuivjnivih viviiunvj jł.) </.

h pi roni............

V^VHIWY UJij VX1 ννινιν.

WZ-. liic wszystkie, kwadraty koloru między 70 a 85. Jakkolwiek nie zamierzamy ograniczać możliwych do uzyskania zmian koloru, to niektóre kolory obserwowane w mieszańcu Skr4 x Sw63 mogą być opisane w przybliżeniu jako zmienione od 65B (nietransformowane) do 70B i do 74B (oba transformowane). Podobnie kilka z mieszańców Rp57 x Rw14 może być opisanych jako zmienione od 64C do 72B do 77B i do 82B. Należy pamiętać, że na poszczególne wyniki wpłyną inne czynniki biochemiczne i fizjologiczne i cytowanie specyficznych uzyskiwanych kolorów nie powinno być interpretowane jako definiowanie możliwego zakresu.

Detekcja przypuszczalnych sekwencji genu 3',5'-hydroksylazy w innych gatunkach roślin

Obecność 3',4',5'-hydroksylowanych flawonoidów jest skorelowana z obecnością aktywności 3',5'-hydroksylazy, a w związku z tym i genu 3',5'-hydroksylazy. Należy oczekiwać, że geny te z innych gatunków będąhybrydyzować z genem 3',5'-hydroksylazy petunii w łagodnych warunkach. Z wielu roślin wytwarzających delfinidynę wyizolowano RNA (fig. 16) i/lub DNA (fig 17), sondowano z Hf1 cDNA znakowanym ³²P i przemywano w warunkach o różnej ostrości. W każdym przykładzie wykrywano pasma hybrydyzujące. Zatem izolacja genów 3',5'-hydroksylazy z innych roślin wytwarzających delfinidynę powinna być możliwa przy użyciu jako sondy genu 3',5'-hydroksylazy.

Specjaliści w tej dziedzinie docenią, że opisany tu wynalazek jest podatny na zmiany i modyfikacje inne niż te, które tu szczegółowo opisano. Należy rozumieć, że wynalazek obejmuje wszystkie takie zmiany i modyfikacje Wynalazek obejmuje również wszystkie etapy, cechy, kompozycje i związki opisywane lub wskazywane w tym opisie pojedynczo lub zbiorczo, oraz wszelkie kombinacje dowolnych dwóch lub więcej ze wspomnianych etapów lub cech.

Bibliografia

Asen,S., Stewart, R.N. and Norris, K.H. Phytochemistry 14: 2677-2682, 1975.

Asen,S., Griesbach, R.J.,Norris, K.H. and Leonhardt,B. A. Phytochemistry 25: 2509-2513,

1986.

Ashikari, T., Kiuchi-Goto, N., Tanaka, Y., Shibano, Y., Amachi, T., and Yoshizumi, H. Appl Microbiol. Biotechnol. 30: 515-520, 1989.

Aviv, H. and Leder, P., Proc Natl. Acad Sei. USA 69: 1408-1412, 1972.

Beale, G.H. Journal of Genetics 40(3): 337-358, 1940.

Bethesda Research Laboratories. BRL pUC host: E coli DH5a™ competent cells. Bethesda Res. Lab Focus 8(2): 9, 1986.

Bozak, K.R., Yu, H., Sirevag, R. and Christoffersen, R.E., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 3904-3908, 1990.

Bullock, W. O., Fernandez, J.M. and Short, J.M. Biotechniques 5: 376,1987.

Comai, L., Moran, P. and Maslyar, D., Plant Molecular Biology 15: 373-381, 1990.

Cornu, A., Genetics. In: Petunia Sink, K.C. (Ed). Springer-Verlag, Berlin, Germany pp 35-47, 1984.

Cornu, A., Farcy, E., Maizonnier, D., Haring, M., Veerman, W. and Gerats, A.G.M. In Genetic maps - Locus maps of complex genomes 5th edition, Stephen J. O'Brien (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1990.

Deilaporta, S J., Wood, J. and Hick, J.B. Plant Mol Biol Rep 1: 19-21, 1983.

De Vlaming, P., Gerats, A.G.M., Wiering, H. and Wijsman, H.J.W. Plant Mol Biol Rep 2(2): 21-42, 1984.

Doodeman, M., Gerats, A.G.M., Schram, A.W., de Vlaming, P. and Bianchi, F. Theor. Appl Genet. 67: 357-366. 1984.

Ebel, J. and Hahlbrock, K., In The Flavonoids· Advances in Research Since 1980 Harborne, J.B. (Ed), Academic Press, New York, USA, 641-679, 1988.

Forkmann, G. Plant Breeding 106: 1-26, 1991.

170 326

Forkmann, G. and Stotz, G. Z. Naturforsch 36c: 411-416, 1981.

Garfinkel, D.J. and Nester, E.W. J Bacteriol 144: 732-743, 1980.

Hagmann . M., Heller, W. and Grisebach, H. Eur J. Biochem 134: 547-554, 1983. Hahlbrock, K. and Grisebach, H. Annu Rev Plant Physiol. 30: 105-130, 1979 Hanahan, D. J. Mol. Biol. 166: 557, 1983.

Harbome, J B. and Simmonds, N.W. Arnu Rep. John Irres Irst 53: 29-30, 1962.

Heller. W. and Forkmann, G. In: The Flavonoids, Advances in Research Since 1980

Harbome, J.B. (Ed.), Academic Press, New York, 1988.

Holton, T.A. and Graham, M.W. Nucleic Acids Research 19: 1156, 1991.

Inoue, H., Nojima, H. and Okayama, H. Gene 96: 23-28, 1990.

Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. and Kimura, A. J. Bacteriol, 153: 163-168, 1983. Jefferson, R A., Kavanagh, T.A. and Bevan, M.W. EMBOJ. 6(13)· 3901-3907, 1987. Koes, R.E., Spelt, C.E., Reif, H.J., van den Elzen, P.J.M., Veltkamp, E. and Mol, J.N.M.

Nucl Acids Res 14(13): 5229-5239, 1986.

Larson, R.L and Bussard, J.B Plant Physiol 80:483-486,1986.

Lazo, G.R., Pascal, A S. and Ludwig, R.A. Bio/technology 9: 963-967, 1991.

Lew, A M and Kemp, D.J. Nuci. Acids Res 17(14): 5859-5860, 1989.

McBride, K.E. and Summerfelt, K.R. Plant Molecular Biology 14: 269-276 1990. Martin, F.M., Castro, N.M., Aboula-ela, F., Tinoco, I. Nucl Acids Res 13: 8927-8938,

1985.

Matthews, J.M., Dostal, L.A. and Bend, J.R. Pharmacology and Experimental Therapeutics 235(1): 186-190, 1985.

Merrifield, J. Am. Chem Soc. 85: 2149, 1964.

Murashige, T. and Skoog, F. Physiol. Plant 15: 73-97, 1962.

Nebert, D. W., Nelson, D.R., Coon, M.J., Estabrook, R. W., Feyereisen, R., Fujn-Kuriyama, Y., Gonzalez, F.J., Guengerich, F.P., Gunsalus, I.C. Johnson, E.F., Loper, J.C., Sato, R., Waterman, M.R., Waxman, D.J. DNA and Cell Biology 10: 1-14, 1991.

Norrander, J., Kemp, T. and Messing, J. Gene 26: 101, 1983.

Oeda, K., Sakaki, T., and Ohkawa, H. DNA 4: 203-210, 1985.

O'Keefe, D.P. and Leto, K.J Plant Physiol. 89: 1141-1149, 1989.

Ohtsuka, E., Matsuki, S., Ikehara, M., Takahashi, Y. and Matsubara, K. J. Biol Chem 260(5). 2605-2608, 1985.

Pearson, W.R. and Lipman, D.J. Proc Natl Acad. Sci USA 85: 2444-2448, 1988.

Rademacher, W., Fritsch, H., Graebe, J.E., Sauter, H. and Jung, J Pesticide Science 21: 241-252, 1987.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989.

Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. Proc Natl Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977.

Schenk, R.U. and Hilderbrandt. A.C. Can. J. Bot 50: 199-204, 1972.

Schram, A.W., Jonsson, L.M.V. and Bennink, G.J.H. Biochemistry of flavonoid synthesis in Petunia hybrida, In: Petunia Sink, K.C. (ed.) Springer-Verlag, Berlin, Germany pp 68-75,

1984.

Stafford, H A. Flavonoid Metabolism CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, USA, 1990.

Stotz, G. and Forkmann, G. Z. Naturforsch 37c: 19,23, 1982.

Stotz, G., de Vlaming, P., Wiering, H. and Forkmann, G. Theor Apppl Genet. 70: 300,

1985.

Takeda, K., Kubota, R. and Yagioka, C. Phytochemistry 24: 1207, 1985.

Takemori, S. and Kominami, S. Cytochrome P450, Tokyo University Press, Japan, 1989. Taton, M., Ullman, P., Beneveniste P. and Rahier, A. Pesticide Biochemistry and Physiology 30: 178-189, 1988.

Turpen, T.H. and Griffith, O.M. BioTechmques 4: 11-15, 1986.

van Tunen, A.J., Gerats, A.G.M. and Mol, J.N.M. Plant Mol Biol.. Rep 8: 50-59, 1990.

170 326 van Tunen, A.J., Koes, R.E., Spelt, C.E. van der Krol, A.R., Stuitje, A.R. and Mol., J.N.M. EMBO J 7(5): 1257-1263, 1988.

van Tunen, A.J., Mur, L.A , Recourt, K., Gerats, A.G.M. and Mol., J.N.M The Plant Cell 3: 39-48, 1991.

von Wettstein-Knowles, P. Hereditas 60: 317-346, 1968.

Vercruysse, S.A.R., Delcour, J.A. and Dondeyne, P. J Chromatography 324: 495-497,

1985.

Wallroth, M., Gerats, A.G.M., Rogers, S.G, Fraley, R.T and Horsch, R.B. Mol Gen Genet 202: 6-15, 1986

Wiering, H. and De Vlaming, P. Inheritance and Biochemistry of Pigments. In: Petunia Sink, K.C (Ed.), Springer-Verlag, Berlin, Germany pp 49-65, 1984.

Wiering, H. Genen Phaenen 17(1-2): 117-134, 1974.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. Gene 33: 103, 1985.

FIGURA 1B

170 326

ΙΟΟΗ fiOOH jCOOH CO-SCoA

PAL C4H V 4CLY OH ^uFenyloalamna

C4H V 4ĆL¹⁵,

OH OH p-kumaroilo-CoA malonylc>7CoA

3'-Hydroksylaza

CHS

OH

HO O

Tetrahydroks^chalkon ^hoWJHHh

HO O

Naringenina

JF3H ^HOs^I^©-^oh

HO O °^H

Dihydrokempferol

DFR I UFGT| %&€<* hPVgic

Pełargomdyno-3-glukozyd

3',5 *-Eydroksylaza

- TYOHOH

HQ q ^v,‘ 3*,5'-Eydroksylaza (_jq q

Dihydrokwercetyna Dihydromirycetyna

FIGURA 1A

170 326

HO O-GIc-O-Rha

HO O-GIc-O-Rha

Cyjanidyno-3-rutozyd

Delfinidyno-3-rutozyd

Glu-0 O-GIc-O-Rha-pCum Glc-0 O-GIc-O-Rha-pCum

Cyianidyno-3- (p-kumaroilo) rutozydo-5-glukozyd ³I

Glu-0 O-GIc-O-Rha-pCum

Peonidyno-3-(p-kumaroilo)rutynęzydo-5-glukozyd

Delfinidyno-3-(p-kumaroilo) rntozydo-5-glukozyd

Glc-O O-GIc-O-Rha-pCum

Petunidyno-3-(p-kumaroilo) rutozydo-5-glukozvd «I

Glc-0 O-GIc-O-Rha-pCum

FIGURA 1B

Malwodyno-3-(p-kumaroilo)rutozydo-5-glukozyd

170 326 sr Hydroksylaza

^ώΗΟ O

Naringemna

3*5’ Hydroksylaza

Eriodiktiol

FtG 2

Pentagydroksyflawanon

#··ϊ

2 3 4 5

··< Naringenia *9 Eriodiktiol o Pentahydroksyflawanon

FfG 2B

170 3”6

FIGURA 3

FIGURA 4A

170 326

FIGURA 4C

FIGURA 4D

FIGURa 4E

170 326 pCGP 242

F	S	S	I	R	N	D	E	I	S	S	L
TTT	AGT	TCA	ATT	CGG	AAT	GAT	GAG	ATT	TCG	AGT	CTC
I	S	S	-> I	H	S	M	N	G	S	V	V
ATT	TCA	TCA	ATT	CAT	TCC	ATG	AAC	GGT	TCT	GTT	GTC
N	M	T	Q	K	I	L	C	F	T	N	S
AAC	ATG	ACA	CAA	AAG	ATT	CTT	TGT	TTT	ACA	AAC	TCT
V	T	C	R	T	A	F	G	K	V	Y	K
GTG	ACT	TGT	AGA	ACA	GCT	TTC	GGG	AAA	GTA	TAC	AAA
N	O	N	E	L	I	N	L	M	R	E	V
AAT	CAA	AAT	GAA	TTG	ATA	AAC	TTG	ATG	AGG	GAA	GTA
L	E	L	V	G	G	F	D
CTG	GAA	TTA	GTA	GGA	GGA	TTT	GAT
F	E	N	S	P	V	E	F	I	G	N	H
TTT	GAA	AAT	TCT	CCG	GTT	GAG	TTT	ATT	GGA	AAT	CAC
F	E	L	V	P	F	G	A	G	K	R	I
TTT	GAG	CTT	GTT	CCG	TTT	GGT	GCA	GGA	AAA	AGG	ATT
C	P	G	M	Q	F	G	L	A	N	I	R
TGT	CCA	GGA	ATG	CAA	TTT	GGT	TTA	GCT	AAT	ATT	AGA
H	P	L	A	R	F	L	Y	H	F	N	W
CAT	CCT	TTG	GCT	CGA	TTC	CTC	TAC	CAT	TTT	AAC	TGG
A	L	P	Y	E	T	N	P	E	D	L	D
GCG	CTT	CCA	TAT	GAA	ACT	AAT	CCT	GAA	GAT	TTA	GAT
S AGT	L CTG	K AAA	N AAT	M ATG	D GAT	TA&	GTGCAGCAAAAGAGAAAGA

TCTATACTTAATTGCCGTAGATCACAAAGAAGGTGATATATAAATTC

TGATGTTCTGCTTTAAATGGTGAAAGTCATACTCTACACAATGCTTC

ATCTCCTTAATTTGAGTTTGGTGTACATTTGTGTCTCCCTTTTAGCT

TTGAATTTCACCTTGAAAAATGATCACATTTTCTTTTTCTGTTACTC

CAATTAAGATATATGTTGTGGTTGGTCAATTATGCCATATTTATCAA

AAGATCAAATCAATTCCCTCGTTGATAAGTATAGATTATAAAACTGA

TTAATGAATCAAAAAAAAAAAAAAAAA

FIGURA 4B

170 326 pCGPl«7

QFFNLVSFLLIVFSL

TGCAATTTTTCAACTTGGTTTCCTTTCTCCTTATTGTATTTTCCCTC

20 30 40 .,'!£»

ISLRKWKKSNCQTKKL

ATTTCATTAAGAAAATGGAAGAAATCCAATTGTCAAACCAAAAAATTG

68 78 88

PPGPWKVPFLGSLLHM

CCTCCAGGCCCATGGAAAGTACCTTTTCTTGGAAGCTTGCTTCATATG

106 116 126 136

VGGLPHHVLRDLAKKY

GTAGGTGGACTTCCACACCATGTCCITAGAGATTTAGCCAAAAAATAT 154 164 174 184

GPIMHLQLGKISAVVV

GGACCAATTATGCACCTTCAACTAGGTAAAATTTCTGCCGTTGTAGTT

202 212 222 232 tspemarkvlkthdla

ACTTCTCCTGAGATGGCAAGAAAAGTACTAAAAACTCATGACCTTGCA

250 260 270 280

FAYRPKLLGIE1VCYN

TTTGCATATAGGCCTAAACTTCTAGGCATTGAGATTGTCTGCTATAAT

298 308 318 328

SSDIAFSPYGDYWRQM

AGTTCAGACATTGCCTTTTCCCCGTATGGTGATTACTGGAGGCAAATG

346 356 366 376

RKICVLEVLSAKNVRS

CGTAAAATTTGTGTATTGGAAGTGCTTAGTGCCAAAAATGTCCGGTCA

394 404 414 424

FNSIRRDEILLMIDFL

TTTAACTCGATTAGACGAGATGAAATACTTCTTATGATCGATTTTTTG

442 452 462 472

RSSSGKPVNITERIFS

CGATCATCTTCTGGTAAGCCAGTTAATATAACAGAAAGGATCTTTTCA

490 500 510 520

FIGURA 4C

170 326

FTSSMICRSVFGKRIK

TTCACAAGCTCTATGATTTGTAGATCAGTATTTGGGAAAAGAATAAAG

538 548 558 568

EKDECIRHVKKMTGLI

GAGAAAGACGAATGTATACGACATGTGAAAAAAATGACAGGCTTAATA

586 596 606 616

DGFDVADIFPSLRFLH

GATGGGTTCGATGTGGCTGACATATTCCCTTCGTTGAGGTTTCTTCAT

634 644 654 664

V L igmkgkimdvhrkv GTACTAATCGGTATGAAGGGTAAAATTATGGATGTTCATCGTAAGGTA

682 692 702 712

DAIVEEVMNEKKETLR

GATGCTATTGTTGAGGAAGTCATGAATGAGCACAAAGAAACTCTTCGA

73Ó 740 750 760

TGKTNGEVGGEDLIDV

ACTGGCAAGACCAATGGTGAAGTGGGAGGAGAAGATTTAATTGATGTA 778 788 798 808

LLRLKEEGDLQLPITN

TTGCTAAGACTTAAGGAAGAGGGAGACCTTCAACTTCCAATCACAAAT

826 836 846 856

D N IKAIFNDMFAAGTE GACAACATCAAAGCCATTTTTAATGACATGTTTGCTGCGGGAACAGAA

874 884 894 904

T S STT INWAMVELMKN ACTTCATCAACAACAATTAACTGGGCCATGGTAGAACTGATGAAAAAT

922 932 942 952

P SVFAKAQAEVREVFK CCAAGTGTATTCGCGAAAGCTCAAGCAGAGGTAAGAGAAGTCTTCAAA

970 980 990 1000

GKETFDEDDIEELNYL

GGGAAAGAAACTTTCGATGAAGATGATATCGAGGAGCTGAATTACCTT

1018 1028 1038 1048

KLVIRETLRLK??ŁPL AAGTTAGTCATTAGAGAAACTTTAAGACTCCACCCTCCACTTCCACTT 1066 1076 1086 1096

FIGURA 4D

170 326

LLPRECRRETEINGYT TTGCTTCCAAGAGAATGTCGGAGAGAAACAGAAATAAATGGCTACACT 1114 1124 1134 1144

IPLNTKVIVNVWAIGR ATTCCTTTAAATACCAAAGTCATAGTTAATGTTTGGGCTATTGGAAGA 1162 1172 1182 1192

DPKYWDDAESFKPERF GATCCAAAATATTGGGATGATGCAGAAAGCTTTAAGCCTGAGAGATTT 1210 1220 1230 1240

EHNSLNFAGNNFEYLP GAACATAACTCTTTGAATTTTGCTGGCAATAATTTTGAATATCTTCCT 1258 1268 1278 1288

FGSGRRICPGISFGLA TTTGGTAGTGGAAGGAGGATTTGCCCCGGAATATCATTTGGTTTAGCT 1306 1316 1326 1336

NVYHPLAQLLYHFDWR AATGTTTATCATCCATTGGCTCAATTGTTGTATCATTTCGATTGGAGA 1354 1364 1374 1384

LPTGVDPNDFELTS*

CTTCCTACTGGGGTCGACCCAAATGACTTTGAATTGACTAGTTAGCTG

1402 1412 1422 1432 <sJ3

GAGTAACTACTGGTAGGAAAAGAGACCTTTACTTGATTTTCACTCCTT 1450 1460 1470 1480

ATTCACCTTCTCTAAAGTGATTAAATGG-GCAAATTTTAATTTGAAAT 1498 1508 1518 1528

AATACTTTTTCTTGTTTACATTTCTCTCCCATTGTTGTATTTCATTTA 1546 1556 1566 1576

CCTATTGTTGTACTTCTTTCTTTTGTTGATGTCTTAGGTTTTACCTAT 1594 1604 1614 1624

TTCTATGCATTTGTATTTAAAAAAAAAAAAAAAAA 1642 1652 1662

FIGURA 4E

170 326 pCGPl58

Gly Met GGG ATG	Met ATG	Lys AAG	Gln CAA	Gly Asp GGA GAT	Phe TTC Gly GGG	Leu Asp Val	Leu CTT Asp GAT
TTG GAT	GTA Phe TTT
Leu CTT	Asp GAT	Gln CAA	Cys TGT	Asp GAT	Glu GAA	Glu GAA	Ser TCT	Gly GGA
Arg	Gln	Thr	Ile	Lys	Pro	Leu	Ile	Leu	Asp	Leu	Phe
CGC	CAA	ACT	ATC	AAG	CCT	CTC	ATC	CTG	GAT	TTA	TTC
Ile	Ala	Gly	Ser	Asp	Thr	Ser	Ala	Ile	Thr	Thr	Glu
ATT	GCT	GGA	AGT	GAT	ACA	TCT	GCC	ATA	ACA	ACA	GAA
Trp	Ala	Met	Ala	Glu	Leu	Leu	Arg	Lys	Pro	Gln	Glu
TGG	GCA	ATG	GCA	GAA	CTA	CTT	CGA	AAA	CCT	CAA	GAA

Phe Val	Asn Ala	Trp Ala	Ile ATT	Gly GGA	Arg Asp Pro	Lys AAA
TTT	GTG	AAT	GCA	TGG	GCA	AGA GAT	CCA
Tyr	Trp	Glu	Lys	Pro	Leu	Glu	Phe	Met Pro	Glu	Arg
TAC	TGG	GAA	AAA	CCA	CTG	GAG	TTT	ATG CCT	GAA	AGA
Phe	Leu	Lys	Cys	Ser	Leu	Asp	Tyr	Lys Gly	Arg	—
TTC	TTG	AAG	TGT	AGT	TTG	GAT	TAC	AAA GGT	AGG	G—
Phe	Glu	Tyr	Ile	Pro	Phe	Gly	Ala	Gly Arg	Arg	Ile
TTT	GAG	TAT	ATA	CCA	TTT	GGC	GCA	GGT CGA	AGA	ATT
Cys	Pro	Gly	Met	Pro	His	Cys	Asn	Lys Asp	Gly	Glu
TGT	CCT	GGA	ATG	CCA	CAT	TGC	AAT	AAG GAT	GGT	GAA
Phe	Asp	Ala	Gly	Phe	Asp	Tyr	Ser	Pro Phe	Ser	Trp
TTT	GAT	GCT	GGC	TTC	GAT	TAT	TCA	CCA TTT	AGT	TGG
Glu	Leu	Pro	—	Gly	Met	Ala	Pro	Lys---	Leu	Asn
GAA	TTA	CCT	-AA	GGA	ATG	GCA	CCA	AAG -AT	TTG	AAC
Met	Glu	Glu	Gln	Phe	Gly	Val	Thr	Leu Arg	Lys	Ala
ATG	GAG	GAA	CAG	TTT	GGA	GTT	ACC	TTG AGG	AAG	GCT
Ile	Pro	Leu	Ile	Ala	Ile	Pro	Ser	Met Glu	Glu	Lys
ATT	CCC	CTT	ATT	GCC	ATT	CCC	AGT	ATG GAA	GAA	AAG
Val	Ile	Phe
GTC	ATA	TTT	TAG <	CCCAAAAGCTATGCATTTTGTGTGTATGTTT

FIGURA 4F

170 326 pCGP 160

KQINALLVEIFG AAA CAG ATC AAT GCA TTG CTT GTG GAA ATA TTT GGA

A	G	T	E	S	T	T	A	T	S	Q	W
GCT	GGT	ACA	GAA	TCT	ACA	ACT	GCT	ACA	AGC	CAA	TGG
M	L	V	E	L	L	R	N	R	Q	A	L
ATG	CTT	GTA	GAA	CTC	CTT	AGA	AAT	CGA	CAA	GCC	TTG
			- P	K	D	T	Q	V	M	V	N
			-CCC	AAA	GAC	ACT	CAA	GTT	ATG	GTA	AAC
E	W	A	I	A	Y	D	P	K	I	W	G
GAG	TGG	GCG	ATT	GCG	TAT	GAT	CCT	AAG	ATT	TGG	GGC
S	F	K	P	Q	R	F	I	D	S	K	I
AGC	TTC	AAA	CCC	GAA	AGG	TTT	ATC	GAT	TCA	AAA	ATA
D	P	L	D	H	K	G	Q	N	F	E	Y
GAT	CCT	TTG	GAC	CAC	AAA	GGG	CAA	AAT	TTT	GAA	TAT
F	P	F	G	S	G	R	R	I	c	A	G
TTT	CCT	TTT	GGT	TCT	GGA	AGG	AGA	ATT	TGT	GCT	GGA
E	P	L	A	s	R	V	I	P	L	A	V
GAA	CCT	TTG	GCT	TCT	AGG	GTT	ATT	CCC	TTA	GCT	GTT
A	s	M	I	H	K	F
GCT	TCT	ATG	ATC	CAT	AAG	TTT			-GATATCACTAT
				«3

GTTAGAAGATCCACTCTCATCATTCCTAAGTTGAGAAGAGTGAGGAA

ATTAAAAGAAGCAGAAGATATGTTACTATAAAAACTCGTTATATATA

TATATATTGCTGTATCTATATATGTGTGAATGATCTGCTGCTCATGT

TGTGTTTTGTTGTTTGTGTACTATAGGTCATACCTAAGTTGATGAAA

TGTCTCTGAGAATATATACTCCTTATATAATAGGAGTAATTTACCGA

TAATTAATATTCCTGCGACAAAAAAAAAAAAAAAAA

FIGURA 4G

170 326 pCG£>454

-RESMEDVRLLG CT CGA GAA TCA ATG GAA GAT GTA AGA TTA CTA GGC

-_-——3>

YHIPAKTRLFIN TAT CAC ATA CCT GCT AAA ACG AGA CTC TTT ATC AAT

AWTMGRDPLTWE GCT TGG ACA ATG GGG AGA GAC CCA CTA ACA TGG GAA

NPEEYQPERFLN AAT CCA GAA GAG TAT CAG CCA GAG AGA TTC TTG AAT

RDTDVKGVNFEF AGA GAT ACT GAT GTC AAA GGA GTA AAC TTT GAG TTC

IPFGAGRS ATT CCC TTT GGC GCC GGC AGA AGC «---_;-—

FIGURA 4H

170 326

170 326

V/R F2 Rośliny

Macierzyste

F1

T- o CO T o CM OJ O) n o cn o n cn o o σ> τ- CO v- CO co (O (0 CM CO TT >

in tr tr >

+ + + + + + + + + VVVHVVHVH

Aktywność w łagiewce pyłkowej Oznaczenie RFLP

RFLP 1

RFLP2 <— RFLP 1

FIGURE 6B

170 326

Rośliny

w		O	CT	CT O	V»	CT	o o
CM	W	«	CT	V»	CT	•<«r	V

Macierzyste F1

CT «» CT (O <o W JO ct ct > £E >

HHHHHHVH R V Η V R R V Η V R

Oznaczenie RFLP

CHI RFLP

FIG 7B

170 326

CĆ.

baBOESBa

ATG

Eco

>		>			=
oc o o	υ c	oc. O u	o c	o -C	T3 CZ
LU	i	LU	X	X	X
rrfnfflflgarjaŁ	ftjf^fr.tiwsar.ar.-isurał		K3=a^=

500 1000 1500 4

STOP

Sekwencja dwumciowa ° o. x: ^x asn

PCGP602

( .................... .............. ΗΙ.’··»»·1·ΙΙ·»Μ^ _

FIGURA 8

170 326

FIGURA 9A

FIGURA 9B

FIGURA 9C

FIGURA 9D

170 326 pCGP 602

CTTTCTACTAGCTACTTCGTTATATATATGTAAAATTGTGACTTT 10 20 30 40

GAAAATCATTTAAATTATCATAAGGTTCATTTTATCTTGATCAAA 55 65 75 85

MML

ATATTTACTTCGGCCATATACGTTTTCCTTTAGTCATGATGCTAC 100 110 120 130

LTELGAATSIFLIAH

TTACTGAGCTTGGTGCAGCAACTTCAATCTTTCTAATAGCACACA

145 155 165 175

IIISTLISKTTGRHL

TAATCATTTCAACTCTTATTTCAAAAACTACCGGCCGGCATCTAC

190 200 210 220

PPGPRGWPVIGALPL

CGCCGGGGCCAAGAGGGTGGCCGGTGATCGGAGCACTTCCACTTT

235 245 255 265

LGAMPHVSLAKMAKK

TAGGAGCCATGCCACATGTTTCCTTAGCTAAAATGGCAAAAAAAT

280 290 300 310

YGAIMYLKVGTCGMA

ATGGAGCAATCATGTATCTCAAAGTTGGAACATGTGGCATGGCAG

325 335 345 355

VASTPDAAKAFLKTL

TTGCTTCTACCCCTGATGCTGCTAAAGCATTCTTGAAAACACTTG

370 380 390 400

DINFSNRPPNAGATH

ATATCAACTTCTCCAATCGTCCACCTAATGCAGGTGCCACTCACT

415 425 435 445

LAYNAQDMVFAHYGP

TAGCTTATAATGCTCAAGACATGGTTTTTGCACATTATGGACCAC

460 470 480 490

RWKLLRKLSNLHMLG

GATGGAAGTTGCTAAGGAAATTAAGCAACTTGCATATGCTAGGGG

505 515 525 535

FIGURA 9A

170 326

GKALĘNWANv'kANEL

GAAAAGCCTTAGAGAATTGGGCAAATGTTCGTGCCAATGAGCTAG

550 560 570 580

GHMLKSMSDMSREGQ

GGCACATGCTAAAATCAATGTCCGATATGAGTCGAGAGGGCCAGA

595 605 615 625

RVVVAEMLTFAMANM

GGGTTGTGGTGGCGGAGATGTTGACATTTGCCATGGCCAATATGA

640 650 660 670

I GQVMLSKRVFVDKG TCGGACAAGTGATGCTAAGCAAAAGAGTATTTGTAGATAAAGGTG

685 695 705 715

VEVNEFKDMVVELMT T T GAGGTAAAT GAAT TT AAGGAC AT GGTT GT AGAGT T AATG AC AA

730 740 750 760

IAGYFNIGDFIPCLA

TAGCAGGGTATTTCAACATTGGTGATTTTATTCCTTGTTTAGCTT

775 785 795 805

WMDLQG IEKRMKRLH GGATGGATTTACAAGGGATAGAAAAACGAATGAAACGTTTACATA

820 830 840 850

KKFDALLTKMFDEHK

AGAAGTTTGATGCTTTATTGACAAAGATGTTTGATGAACACAAAG

865 875 885 895

ATTYERKGKPDFLDV

CAACTACCTATGAACGTAAGGGGAAACCAGATTTTCTTGATGTTG

910 920 930 940

VMENGDNSEGERLST

TTATGGAAAATGGGGACAATTCTGAAGGAGAAAGACTCAGTACAA

955 965 975 985

TNIKALLL NLFTAGT CCAACATCAAAGCACTTTTGCTGAATTTGTTCACAGCTGGTACGG

1000 1010 1020 1030

FIGURA 9B

170 326

DTSSSAIEWALAEMM

ACACTTCTTCTAGTGCAATAGAATGGGCACTTGCAGAAATGATGA

1045 1055 1065 1075

KNPAILKKAQAEMDQ

AGAACCCTGCCATTTTGAAAAAAGCACAAGCAGAAATGGATCAAG

1090 1100 1110 1120

VIGRNRRLLESDIPN

TCATTGGAAGAAATAGGCGTTTACTCGAATCCGATATCCCAAATC

1135 1145 1155 1165 lpylraicketfrkh

TCCCTTACCTCCGAGCAATTTGCAAAGAAACATTTCGAAAACACC

1180 1190 1200 1210

PSTPLNLPRISNEPC

CTTCTACACCATTAAATCTTCCTAGGATCTCGAACGAACCATGCA . 1225 1235 1245 1255

IVDGYYIPKNTRLSV

TAGTCGATGGTTATTACATACCAAAAAACACTAGGCTTAGTGTTA

1270 1280 1290 1300

NIWAIGRDPQVWENP

ACATATGGGCAATTGGAAGAGATCCCCAAGTTTGGGAAAATCCAC

1315 1325 1335 1345

LEFNPERFLSGRNSK

TAGAGTTTAATCCCGAAAGATTCTTGAGTGGAAGAAACTCCAAGA

1360 1370 1380 1390

IDPRGNDFELIPFGA

TTGATCCTCGAGGGAACGATTTTGAATTGATACCATTTGGTGCTG

1405 1415 1425 1435

GRRICAGTRMGIVMV

GACGAAGAATTTGTGCAGGAACAAGAATGGGAATTGTAATGGTGG

1450 1460 1470 1480

EYILGTLVHSFDWKL

AATATATATTAGGAACTTTGGTTCATTCATTTGATTGGAAATTAC

1495 1505 1515 1525

FIGURA 9C

170 326

PSEVIELNMEEAFGL

CAAGTGAAGTTATTGAGTTGAATATGGAAGAAGCTTTTGGCTTAG

1540 1550 1560 1570

ALQKAVPLEAMVTPR

CTTTGCAGAAAGCTGTCCCTCTTGAAGCTATGGTTACTCCAAGGT

1585 1595 1605 1615

LQLDVYVP*

TACAATTGGATGTTTATGTACCATAGCTATAGATGTGTATTGTGC 1630 1640 1650 1660

TATAATTGCGCATGTTGTTGGTTGTAGCATGAGATATTAAAAGGA 1675 1685 1695 1705

GTACATGAAGCGCATTGCATGAGTTTAACTTGTAGCTCCTTAATA 1720 1730 1740 1750

TTTTAGGTATTTTTCAATTAATAAGTTCTTGTTGGTTGGGTAAAA 1765 1775 1785 1795

AAAAAAAAAAAA

1810

FIGURA 9D

170 326

FIGURA 10A

FIGURA 10B

FIGURA 10C

170 326 pCGP 175

Μ V L L S E

TTGAATCCAGCTCTATCTGGCTTTAGACAATGGTGCTACTTAGTG 10 20 30 40

LAAATLIFLTTHIFI

AGCTTGCTGCAGCAACCTTAATCTTTCTAACAACACATATCTTCA

65 75 85

STLLS ITNGRRLPPG TTTCAACTCTTCTTTCTATAACTAACGGCCGGCGTCTCCCGCCAG

100 110 120 130

PRGWPVIGALPLLGA

GGCCAAGAGGGTGGCCGGTGATCGGAGCACTTCCACTTTTAGGAG

145 155 165 175

MPHVSLAKMAKKYGA

CCATGCCACATGTTTCCTTAGCTAAAATGGCAAAAAAATATGGAG 190 200 210 220

IMYLKVGTCGMVVAS

CAATCATGTATCTCAAAGTTGGAACGTGTGGCATGGTAGTTGCTT

235 245 255 265

TPDAAKAFLKTLDLN

CTACCCCTGATGCTGCTAAAGCGTTCTTGAAAACACTTGATCTCA

280 290 300 310

F SNRPPNAGATHLAY ACTTCTCCAATCGTCCACCTAATGCAGGTGCCACCCACTTAGCCT

325 335 345 355

GAQDMVFAHYGPRWK

ATGGTGCTCAAGACATGGTTTTTGCACATTATGGACCAAGATGGA

370 380 390 400

LLRKLSNLHMLGGKA

AGTTGCTAAGGAAATTAAGCAACTTACATATGCTAGGGGGGAAAG

415 425 435 445

LENWANVRANELGHM

CCTTAGAAAATTGGGCAAATGTTCGTGCCAATGAGCTAGGACACA

460 470 480 490

LKSMFDMSREGERVV

TGCTAAAATCGATGTTTGATATGAGCAGAGAAGGGGAGAGAGTTG

505 515 525 535

FIGURA 10A

170 326

VAEMLTFAMANMIGQ

TGGTGGCGGAGATGTTGACATTTGCCATGGCGAATATGATCGGAC

550 560 570 580

VI LSKRVFVNKGVEV AGGTGATACTTAGCAAAAGAGTATTTGTAAATAAAGGTGTTGAGG

595 605 615 625

NEFKDMVVELMTTAG

TAAATGAATTTAAGGACATGGTGGTAGAGTTAATGACAACAGCAG

640 650 660 670

YFNIGDFIPCLAWMD

GGTATTTTAACATTGGTGATTTTATTCCTTGTTTAGCTTGGATGG

685 695 705 715

LQGIEKGMKRLHKKF

ATTTACAAGGGATAGAAAAAGGAATGAAACGTTTACATAAGAAGT

730 740 750 760

DALLTKMFDEHKATS

TTGATGCTTTATTGACAAAGATGTTTGATGAACACAAAGCAACTA

775 785 795 805

YERKGKPDFLDCVME

GCTATGAACGTAAGGGGAAACCAGATTTTCTTGATTGTGTTATGG

820 830 840 850

NRDNSEGERLSTTNI

AAAATAGGGACAATTCTGAAGGAGAAAGGCTCAGTACAACCAACA

865 875 885 895

KALLLNLFTAGTDTS

TCAAAGCACTCTTGCTGAATTTGTTCACAGCTGGTACAGACACTT

910 920 930 940

SSAIEWALAEMMKNP

CTTCTAGTGCAATAGAATGGGCACTTGCAGAGATGATGAAGAACC

955 965 975 985

-AILKKAQGEMDQVIG

CTGCCATTTTAAAGAAAGCACAAGGAGAAATGGATCAAGTCATTG

1000 1010 1020 1030

NNRRLLESDIPNLPY

GAAACAATAGGCGTCTGCTCGAATCGGATATCCCAAATCTCCCTT 1045 1055 1065 1075

FIGURA 10B

170 326

LRAICKETFRKHPST

ACCTCCGAGCAATTTGCAAAGAAACATTTCGAAAGCACCCTTCTA

1090 1100 1110 1120

PLNLPRISNEPCIVD

CACCATTAAATCTCCCTAGGATCTCGAACGAACCATGCATTGTCG

1135 1145 1155 1165

GYYIPKNTRLSVNIW

ATGGTTATTACATACCAAAAAACACTAGGCTTAGTGTTAACATAT

1180 1190 1200 1210 aigrdpevwenplef

GGGCAATTGGAAGAGATCCCGAAGTTTGGGAGAACCCACTAGAGT

1225 1235 1245 1255

YPERFLSGRNSKIDP

TTTATCCTGAAAGGTTCTTGAGTGGAAGAAACTCGAAGATTGATC

1270 1280 1290 1300

RGNDFELIPFGAGRR

CTCGAGGGAACGACTTTGAATTGATACCATTTGGTGCTGGACGAA

1315 1325 1335 1345

ICAGTRMGIVMVEYI

GAATTTGTGCAGGGACAAGAATGGGAATCGTAATGGTGGAATATA

1360 1370 1380 1390

LGTLVHSFDWKLPSE

TATTAGGAACTTTGGTCCATTCATTTGATTGGAAATTACCAAGTG

1405 1415 1425 1435

VIELNMEEAFGLALQ

AAGTTATTGAGCTAAATATGGAAGAAGCTTTTGGATTAGCTTTGC

1450 1460 1470 1480

KAVPLEAMVTP'RLPI

AGAAAGCTGTCCCTCTTGAAGCTATGGTTACTCCAAGGCTGCCTA

1495 1505 1515 1525

DVYAPLA*

TTGATGTTTATGCACCTTTAGCTTGAAACATGCCTTTACGTTGGT 1540 1550 1560 1570

TTCAGTTTTGGGTAGTATAATGTTGTGGTGTTTGGCTATAGAAAT

ATTAATAAATGCTAGTATCTTGAAGGCGCGTGCAGGGGGAGGGGG

TTGTCTTAGATAGTAGTAATATGTTAGCCTTCCTTTTATTTCTTG

TGATTGTGAGAATCTTGATATGTTTTCTTGAAAAAAAAAAAAAAA

FIGURA 10C

170 326

FIGURA 11

170 326

170 326

FIG 12B

170 326

FIG 13

170 326

Bam Hl·

FIGURA 14

FI G 15

170 326

FIGURA I¹?

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 6,00 zł

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej lub ciętego kwiatu z tej rośliny, zdolnej do ekspresji rekombinowanej 3',5'-hydroksylazy flawonoidowej, znamienny tym, ze do komórki odpowiedniej rośliny wprowadza się cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydów przedstawionąna fig. 9 lub fig. 10, albo obejmującąsekwencję nukleotydów zdolną do hybrydyzowania z sekwencjąnukłeotydów przedstawionąna fig. 9 lub fig. 10, lub z sekwencją nukleotydów komplementarną do niej, w ostrych warunkach obejmujących warunki przemywania 6XSSC w temperaturze 50°C, w warunkach umożliwiających ewentualną ekspresję cząsteczki wspomnianego kwasu nukleinowego, regeneruje się transgeniczną roślinę z tej komórki i namnaza się transgeniczną roślinę przez czas i w warunkach wystarczających do ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego i ewentualnie odcina się kwiat od tej rośliny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego reguluje się rozwojowo.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się 3',5'-hydroksylazę flawonoidową pochodzącą z petunii, werbeny, ostrózki, szafirka, irysa, frezji, cyklamenu, ziemniaka, bratka lub oberżyny.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się rekombinowaną3',5'-hydroksylazę flawonoidową pochodzącą z petunii.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę kwasu nukleinowego lub enzym obejmujący sekwencję nukleotydową lub aminokwasową, która jest zasadniczo przedstawiona na fig. 9 lub 10 albo mającą co najmniej 40% podobieństwa do tej sekwencji.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymuje się transgeniczną roślinę, którą jest róża, petunia, chryzantema, goździk, gerbera, geranium lub alstromeria.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, ze otrzymuje się transgeniczną roślinę, którą jest róża lub petunia.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze cząsteczkę kwasu nukleinowego przenosi się do komórki roślinnej łącznie z Agrobacterium.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, ze jako cząsteczkę kwasu nukleinowego stosuje się cząsteczkę pCGP90 przedstawioną na fig. 14.
10. 10. Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej lub ciętego kwiatu z tej rośliny, zdolnej do ekspresji rekombinowanej 3',5'-hydroksylazy flawonoidowej, znamienny tym, że do komórki odpowiedniej rośliny wprowadza się cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydów kodującą3',5'-hydroksylazę przedstawiona,. na fig. 9 lub fig. 10, lub obejmującąsekwenęję nukleotydów kodującą sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 60% podobieństwa do sekwencji aminokwasowej przedstawionąna fig. 9 lub fig. 10, w warunkach umożliwiaj ących ewentualną ekspresję wspomnianego kwasu nukleinowego, regeneruje się transgeniczną roślinę z tej komórki i namnaża się transgeniczną roślinę przez czas i w warunkach wystarczających do ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego i ewentualnie odcina się kwiat od tej rośliny.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, ze otrzymuje się transgeniczną roślinę, którąjest róża, petunia, chryzantema, goździk, gerbera, geranium lub alstromeria.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że otrzymuje się transgeniczną roślinę, którąjest róża lub petunia.
13. 13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że cząsteczkę kwasu nukleinowego przenosi się do komórki roślinnej łącznie z Agrobacterium.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako cząsteczkę kwasu nukleinowego stosuje się cząsteczkę pCGP90 przedstawioną.na fig. 14.

    170 326