JPH06500239A - フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子配列及びその使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子配列及びその使用本発明は一般にフ ラボノイド経路代謝酵素をコードする遺伝子配列並びに植物及び他の生物体にお ける色素形成の操作におけるごときその使用に関する。

花類産業は開花植物の新規且つ種々の品種を開発することに努力している。この 様な新規な品種を創成するための有効な方法は花の色の操作を通してであり、そ して古典的な育種技法を用いて、花類のほとんどの商業的品種について広範囲な 色を生成することに幾分成功している。しかしながら、この方法は、特定の種の 遺伝子プールの束縛により制限され、そしてこの理由のため単一の種が広範囲の 種類の着色品種を有することはまれである。確かに、青色孔の入手可能性が制限 されているために、１９８８年にオランダにおけるオークジョンで売られた青色 の切花は５％未満であった。１２種類の最もよく売られている花の内、アイリス とフリージアのみが青色の品種を提供しており、そしてこれらの品種が占める割 合は全販売孔の４％未満である。主要な切花用種、例えばバラ、菊、カーネーシ ョン及びガーベラの青色品種の開発は、切花市場及び観賞市場の両者においてか なりの機会を提供するであろう。

花の色は主として２つのタイプの色素、すなわちフラボノイド及びカロチノイド に基く。フラボノイドは黄色から赤ないし青色の範囲に寄与する。カロチノイド はオレンジ又は黄の色調に寄与し、そして一般に黄色又はオレンジ色の花の唯一 の色素である。花の色に主たる寄与をするフラボノイド分子は、シアニジン、デ ルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジン及びベラルゴニジンのグ リコジル化誘導体であるアントシアンである。異るアントシアンが色の顕著な変 化を生成することができる。花の色はまた無色のフラボノイドの補助発色（ｃｏ −ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、金属錯体形成、グリコジル化、アシル化、メチ ル化及び液胞のｐＨにより影響される（Ｆｏｒｋｍａｎｎ　１９９１）。

フラボノイド色素のための生合成経路（以後、「フラボノイド経路と称する）は よく確立されており、そして図１に示される（Ｅｂｅｌ及びＨａｈｌｂｒｏｃｋ 、　１９８８；Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ　ａｎｄ　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ、　１９７９ ；Ｗｉｅｒｉｎｇ　ａｎｄｄｅ　Ｕｌａｍｉｎｇ、　１９８４；Ｓｃｈｒａｍら 、１９８４；５ｔａｆｆｏｒｄ、１９９０）　、この経路の第一の必須の段階は ３分子のマロニル−ＣｏＡと１分子のｐ−フマロイル−ＣｏＡとの縮合を含む。

この反応はカルコン合成酵素（ｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ；ＣＨＳ）に より触媒される。この反応の生成物である２′。

４．４’、６’−テトラヒドロキシカルコンは通常、カルコン・フラバノン・イ ソメラーゼ（ＣＨＩ）酵素により急速に異性化され、ナリンゲニンを生成する。

次に、ナリンゲニンはフラバノン３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）により中央環 の３位においてヒドロキシル化されジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋ ａｅｍｐｆｅｒｏｌ　；ＤＨＫ）を生成する。

ジヒドロチンフェロールのＢ環は３′位、又は３′位及び５′位の両方に電いて ヒドロキシル化されて、それぞれジヒドロケルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒ ｃｅｔｉｎ；ＤＨＱ）及びジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔ ｉｎ；ＤＨＭ）を生成することができる。この経路に関与する２つの必須の酵素 はフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ（以後、３′−ヒドロキシラーゼと称す る）及びフラボノイド３′。

５′−ヒドロキシラーゼ（以後、３’、５’−ヒドロキシラーゼと称する）であ る。３’、５’−ヒドロキシラーゼはヒドロキシル化を触媒する広範囲酵素であ って、ナリンゲニン及びＤＨＫの３′及び５′位並びにエリオジク千オール及び ＤＨＱの５′位（Ｓｔｏｔｚ及びＦｏｒｋｍａｎｎ、　１９８２）のヒドロキシ ル化を触媒し、それぞれペンタヒドロキシフラバノン及びＤＨＭを生成する。Ｂ 環のヒドロキシル化のパターンが花弁の色の決定において必須の役割を演する。

ミクロソーム抽出物中のフラボノイド３′−ヒドロキシル化はＮＡＤＰＨ及び０ □並びにナリンゲニン又はＤＨＫのいずれかを必要とする。

パセリの細胞培養物の細胞培養物の酵素がよく研究されているＣ　Ｈａｇｍａｎ ｎら、１９８３）　、−酸化炭素、シトクロムＣ及びＮＡＤＰ”による阻害が示 すところによれば、この酵素はシトクロムＰ４５０関連酵素である。類似の酵素 、活性がトウモロコシにおいて証明されている（　Ｌａｒｓｏｎ及びＢｕｓｓａ ｒｄ、　１９８６）　０３　’　＋　５　’−ヒドロキシラーゼもまたシトクロ ムＰ４５０クラスの酵素である。シトクロムＰ４５０酵素は自然界に広く分布し ており、そしてを推動物、酵母、菌類、細菌及び１種の植物において特性決定さ れている。少なくとも１５４のシトクロムＰ４５０遺伝子の配列が決定されてお り、そしてこれらの遺伝子は２７の異る遺伝子ファミリーに類別されている（Ｎ ｅｂｅｒｔら、１９９１）。１つのファミリー内においてＰ４５０蛋白質配列は 一般に４０％以上の同一性を有するが、同一のサブファミリー内では４６％以上 の同一性が存在する（Ｎｅｂｅｒｔら、１９９１）。

植物において３′もしくは３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性又はフラボノイド 経路に含まれる他の酵素を制御する可能性は、花弁の花を操作しそれによって単 一種が広範囲の花色を発現することを可能にする手段を提供するであろう。本発 明に従って、３’、５’−ヒドロキシラーゼのごときフラボノイド経路の酵素を コードする遺伝子配列が同定されそしてクローン化された。これらの組換え配列 はＤＨＫ代謝並びにＤＨＱ　、ナリンゲニン及びエリオディクチオール（ｅｒｉ ｏｄｉｃｔｙｏｌ）のごとき他の基質の代謝の調節を可能にし、それによりアン トシアンのヒドロキシル化パターンを決定しそして花弁の色を操作する手段を提 供することを可能にする。しかしながら本発明は、花類のみならず、果実及び野 菜植物並びに例えば観賞用植物の葉に拡張される。

従って、本発明の１つの観点は、ジヒドロカンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａ ｅｍｐｆｅｒｏｌ　；ＤＨＫ）ヒドロキシル化酵素をコードするヌクレオチドの 配列又はそれをコードする配列に相補的な配列を含んで成る核酸単離体、あるい はその誘導体又は部分を提供する。

単に便宜上及び手短かな表記により、ｒ　ＤＦ（Ｋヒドロキシル化酵素」への言 及は、ＤＨＫ、　ＤＨＱ、ナリンゲニン、エリオデイクトイルの１つ又は複数に 作用するフラボノイド経路のヒドロキシル化酵素を包含する。

好ましくは、ＤＨＫヒドロキシル化酵素は３’、５’−ヒドロキシラーゼである 。しかしながら、この酵素をコードする遺伝子配列をクローン化するために使用 される方法は、３′−ヒドロキシラーゼのごとき酵素をコードする他の遺伝子配 列を単離するために使用することもできよう。従って、この明細書において３’ 、５’−ヒドロキシラーゼの単離及びクローニングへの言及は３′−ヒドロキシ ラーゼのごとき他のフラボノイドヒドロキシル化酵素への言及を包含すると理解 されるべきである。

「核酸単離体」なる用語は、非天然存在状態にある遺伝子配列を意味する。これ は一般に、その天然状態から分離されていること、又はその天然環境において必 ずしも遭遇しない方法により形成されたことを意味する。さらに具体的には、そ れはインビトロで形成され又は維持される核酸分子、組換え又は合成分子、及び 異種核酸と組合わされた核酸を包含する。それはまた、他の核酸配列に比べて少 なくとも部分的に精製された後の天然配列に拡張される。

本明細書において使用する場合、「遺伝子配列」とは、ＤＨＫヒドロキシル化酵 素、例えば３’、５’−ヒドロキシラーゼ中のアミノ酸の配列を直接的に特定す るか又は塩基の相補的連続を介して特定するヌクレオチド塩基の連続を意味する 。核酸又はその相補形は全長酵素又はその誘導体もしくは部分をコードすること ができる。

「誘導体」とは、天然酵素に対する任意の単一の又は複数のアミノ酸置換、除去 及び／又は付加を意味する。これに関し、核酸は３′。

５′−ヒドロキシラーゼをコードする天然核酸配列を含み、あるいは該天然配列 に対してｌ又は複数のヌクレオチド置換、除去及び／又は付加を含んでいてもよ い。本明細書において予定される核酸配列はまたは遺伝子プローブとして又は植 物における対応する遺伝子の発現を制御することができる「アンチセンス」分子 として有用なオリゴヌクレオチド配列を包含する。従って、核酸又はその相補形 が３’、５’−ヒドロキシラーゼの「部分」をコードする場合、この様な核酸分 子はオリゴヌクレオチドプローブとしであるいはポリメラーゼ連鎖反応のための 又は種々の変異誘発技法におけるプライマーとして有用であろう。

本発明のＤＨＫヒドロキシル化酵素のそして特に３’、５’−ヒドロキシラーゼ のアミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合体並びに 単一アミノ酸又は複数のアミノ酸の配列内挿入体が含まれる。挿入アミノ酸配列 変形体は蛋白質中の所定の部位に１又は複数のアミノ酸残基が導入されたもので あるが、得られる生成物の適切なスクリーニングを用いればランダム挿入も可能 である。除去変形体は、配列からの１又は複数のアミノ酸の除去により特徴付け られる。置換アミノ酸変形体は、配列中の少なくとも１個の残基が除去されそし てその位置に異る残基が挿入されているものである。典型的な置換は、次の表１ に行って作られるものである。

表　１ アミノ酸置換のための適当な残基 もとの残基　置換の例 Ａ２Ｂ　Ｇｉｎ；　Ｈｉｓ Ｇｌｎ　Ａｓｎ Ｈｉｓ　Ａｓｎ；　Ｇｌｎ ［１ｅ　Ｌｅｕ；　Ｖａｌ Ｌｅｕ　Ｉｌｅ；　Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ａｒｇ；　Ｇｉｎ；　Ｇｌｕ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ；　１ｉｅ Ｐｈｅ　Ｍｅｔ；　Ｌｅｕ；　Ｔｙｒ Ｔｙｒ　Ｔｒｐ；　Ｐｈｅ Ｖａｌ　ｌｉｅ；　Ｌｅｕ ３’、５’−ヒドロキシラーゼがアミノ酸置換によって誘導体化される場合、ア ミノ酸は一般に、類似の性質、例えば疎水性、親水性、電子陰性、大きい側鎖等 を有する他のアミノ酸により置き換えられる。アミノ酸置換は典型的には単一残 基によるものである。アミノ酸挿入は通常的１−１０アミノ酸残基のオーダーで あり、そして除去は約１〜２０残基の範囲である。好ましくは、除去又は挿入は 隣接対において、すなわち２残基の除去又は２残基の挿入として行われる。

前記のアミノ酸変形体は、当業界においてよく知られているペプチド合成技法例 えば固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ、　１９６４）等を用いて、又は組換 えＤＮＡ操作により作ることができる。既知の又は部分的に知られた配列を有す るＤＮＡの所定の部位に置換変異を行う方法はよく知られており、そして例えば Ｍ１３変異変異性を包含する。置換、挿入又は除去変形体として現われる変形体 蛋白質を製造するためのＤＮＡ配残の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９ ８９）に従来から記載されている。

本発明の３’、５’−ヒドロキシラーゼの組換え又は合成変異体及び誘導体の他 の例には、該酵素と関連する任意の分子、例えば炭水化物、脂質及び／又は蛋白 質もしくはポリペプチドの１又は複数の置換、除去及び／又は付加が包含される 。

「類似体」及び「誘導体」なる用語はまた、３’、５’−ヒドロキシラーゼの任 意の機能的化学的同等物にそしてさらに前記のアミノ酸誘導体に拡張される。

本発明の核酸は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸であることができ、単鎖又は二 本鎖であることができ、そして直鎖状又は共育結合により閉じられた環状分子で あることができる。本発明はまた、低い、好ましくは中程度のそして最も好まし くは高いストリンジエンシー条件下で本発明により予定される核酸分子とハイブ リダイズする他の核酸分子に拡張される。他の用語で表現すれば、本発明は、図 ９もしくは図１Ｏに示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子に、あるいはヌ クレオチド又はアミノ酸配列のレベルにおいて少なくとも３５％、好ましくは少 なくとも４５％、さらに好ましくは少な（とも５５％、さらに好ましくは少なく とも６５〜７０％、そして一層好ましくは８５％以上の類似性を有する分子（こ こで、核酸は３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードするか又 はそれをコードする配列に相補的である）に拡張される。しかしながら、ヌクレ オチド配列又はアミノ酸配列は前記の％より低い類似性を有しそしてなおりＨＫ ヒドロキシル化酵素をコードすることができ、そしてこの様な分子もそれらが相 同性の領域を保存している場合には本発明の範囲内に考えられることに注目すべ きである。本発明はまた、低い、好ましくは中程度のそして最も好ましくは高い ストリンジエンシー条件下で、上に予定された核酸分子の部分とハイブリダイズ することができるオリゴヌクレオチドブライマーの形の核酸分子に拡張される。

ここに予定される核酸分子は単独で存在することもでき、又はベクター分子そし て好ましくは発現ベクターとの組合せにおいて存在することもできる。この様な ベクター分子は真核細胞及び／又は原核細胞中で複製しモして／又は発現する。

好ましくは、ベクター分子又はその部分は植物ゲノムに組み込まれ得る。核酸分 子はまた、植物細胞中での核酸分子の発現を指令することができるプロモーター 配列を含むことができる。核酸分子及びプロモーターは、任意の手段により、例 えばエレクトロポレーション又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ）仲介移行により細胞に導入され得る。

ペチュニアは今日量も便利で且つ好ましい材料源を代表するので、本発明はペチ ュニア由来の核酸配列を用いて例示される。しカルながら、当業者は、他の植物 又はある種の微生物のごとき任意の分離源から類似の配列が単離され得ることを ただちに理解するであろう。

３′−ヒドロキシラーゼの遺伝特性はキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ） 、バーベナ（Ｖｅｒｂｅｎａ）及びペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）の花並びにト ウモロコシの実生及び糊粉層において知られている（Ｈｅｉｆｅｒ及びＦｏｒｋ ｍａｎｎ。

１９８５）及びトウモロコシの糊粉層（Ｌａｒｓｏｎ及びＢｕｓｓａｒｄ、　１ ９８６）において同様の酵素を調節する。例えば、バーベナ・ハイブリダ（Ｖｅ ｒｂｅｎａ　ｈｙｂｒｉｄａ）の化学遺伝学的（ｃｈｅｍｏｇｅｎｅｔ　ｉｃ） 研究が示すところによれば、この植物において、アントシアニンのＢ環の３′及 び５′の再位置におけるヒドロキシル化は１つの遺伝子により調節される（Ｂｅ ａｌｅ、　１９４０）　ｏ　３　’　、５　’−ヒドロキシル化の酵素活性はデ ルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）生産株の花の抽出物中にのみ存在する （　５ｔｏｔｚ及びＦｏｒｋｍａｎｎ、　１９８２）。３′及び５′位における ヒドロキシル化のためのＮＡＤＰＩ（−依存性ミクロソーム酵素活性はまた力リ ステブス（Ｃａｌｌｉｓｔｅｐｈｕｓ）及びラチルス（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）の花 抽出物中に証明された（Ｆｏｒｋｍａｎｎ、　１９９１）　、　Ｖ、ハイブリダ （Ｖ、ｈｙｄｒ　１ｄａ）の場合と同様に、フラバノン類及びジヒドロフラバノ ン類の３’、５’−ヒドロキシル化のための酵素活性は花に３’、４’、５’− ヒドロキシル化されたフラボノイド化合物（又はそれらのメチル化誘導体）を含 有する株の花抽出物中にのみ存在することが見出された。従って、３’、４’、 ５’−ヒドロキシル化フラボノイド類の生成は明らかにフラボノイド３’、５’ −ヒドロキシラーゼ活性に依存する。

３’、５’−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子は、カリステデルフィニジン を生産することができない対応する変異株の存在によって同定されている。さら に、各酵素活性が証明されている（Ｆｏｒｋｔｎａｎｎ、　１９９１）。３’、 ５’　−ヒドロキシラーゼはまたミクロソームのントクロムＰ４５０酵素である と考えられた（Ｈｅｌｌｅｒ及びＦｏｒｋｍａｎｎ。

＋９８８）。しかしながら、これらの及び他の植物種からの３’、５’−ヒドロ キシラーゼ遺伝子のクローニングの公表された報告は存在しない。

３′、４’、５’−ヒドロキシル化フラボノイド又はそれらの誘導体を生産する ことかできる他の植物種には、アジサイ（Ｋａｋｅｄｕら、１９８５）　、ヒエ ンソウ（Ａｓｅｎら、１９７５）　、リンアンサス（Ｌｉｓｉａｎｔｈｕｓ）（ Ａｓｅｎら、１９８６）、トマト（ｖａｎ　Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅ ｓ、　１９８６）及びポテト（Ｈａｒｂｏｒｎｅ及びＳｉｍｍｏｎｄｓ、　１９ ６８）が含まれる。これらの種又は３’、４’、５’−ヒドロキシル化フラボノ イドを生産することができる他の植物もまた３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝 子の単離源として適当であろう。フラボノイド経路の酵素（例えば、３′。

５′−ヒドロキシラーゼ）を直接又は間接にコードするこの様なすべての核酸配 列は、その由来に関係なく本発明に含まれる。

同様に、本明細書に略記する遺伝子クローニング法を用いて、３’、４’、５’ −ヒドロキシル化フラボノイド類を生産する他の植物から３’、５’−ヒドロキ シラーゼ遺伝子を単離することができる。実験手順の些細な変更は要求されるか もしれないが、本明細書に記載するのと同じ技法を用いて、類似の遺伝子配列を 検出し、単離しそしてクローン化するためにここに開示されるクローン及びオリ ゴヌクレオチドを用いることができる。その様な些細な変更のすべてが本発明に 含まれる。３’、５’−ヒドロキシラーゼのごとき酵素の他の適当な入手源の例 には、バーベナ、ヒエンソウ、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ、シク ラメン、ポテト、パンジー及びナスが含まれる。

本発明に従えば、３’、５’−ヒドロキシラーゼのごときＤＨＫヒドロキシル化 酵素をコードする核酸配列をトランスジェニック植物に導入しそして発現させ、 それにより、植物細胞中で合成されるなら、ＤＨＫ及び／又は他の適当な基質を 、最終的に、アントシアニジンのアントシアニン誘導体、例えばデルフィニジン 、ベチュニジン又はマルビジン（ｍａｌｖｉｄｉｎ）に転換することができる。

これらのアントシアニンの生産は青色及び青様色の種々の色相の形成に寄与する 。植物における核酸配列の発現は構成的、誘導的又は発生段階に依存的（ｄｅｖ ｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）であることができる。

従って、本発明の他の観点は組換えＤＨＫヒドロキシル化酵素又はその活性変異 体もしくは誘導体を発現することができるトランスジェニック植物の製造方法を 提供し、この方法は適当な植物の細胞に前記ＤＨＫヒドロキシル化酵素をコード するヌクレオチド配列を含んで成る核酸を、該核酸分子の最終的発現を最終的に 許容する条件下に導入し、トランスジェニック植物を該細胞から再生し、そして 該トランスジェニック植物を、前記核酸の発現を可能にするのに十分な期間及び 条件で生長せしめることを含んで成る。

好ましい態様において、本発明は変化した開花を発現するトランスジェニック花 植物の製造方法を含み、この方法は、適当な植物の細胞に、本発明の核酸配列を 該核酸の最終的発現を許容する条件下に導入し、該細胞からトランスジェニック 植物を再生し、そして該核酸配列のＤＨＫヒドロキシル化酵素への発現を可能に するために十分な時間及び条件で生長せしめることを含んで成る。

好ましくは、ＤＨＫヒドロキシル化酵素は３’、５’−ヒドロキシラーゼであり 、発生段階に依存的（ｄｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）に制限され、そして変化した 花は受容体植物の生理由条件に依存して青色もしくは赤色の花又は他の色の色相 の生成を誘導する。「適当な植物」とは、３’、５’−ヒドロキシラーゼ酵素の ための基質を生産することができ、そして所望の色の発生のために必要な適当な 生理的性質及び遺伝子盟を有することができる植物を意味する。これはバラ、ペ チュニア、カーネーション、キク及びガーベラを包含するがこれに限定されない 。幾つかの植物種のおいては、平均花弁ｕｐＨより高いｐＨを有する品種として 定義されるｒ高吐系」を選択することが望ましいであろう。組換え３’、５’− ヒドロキシラーゼ又はその変異体及び誘導体の源は前記した通りであり、そして ペチュニア、バーベナ、ヒエンソウ、ブドウ、アイリス、フリージア、アジサイ 、シクラメン、ポテト、パンジー又はナス由来の酵素を含む。

当業者は、この方法に適用可能な変法、例えば標的植物に天然に存在する酵素の 発現の増加又は減少を認識するであろう。これは色の異る色相、例えば青又は赤 の異る色相を導くであろう。

標的酵素、例えば３’、５’−ヒドロキシラーゼの活性を低下させるため、この 酵素又はその種々の部分をコードする核酸配列をアンチセンス配向において使用 することができるであろう。本発明はいずれか１つの理論に限定することを望む わけではないが、この様なアンチセンス核酸配列は酵素について特定される天然 ｍＲＮＡの全部又は部分とデュプレックスを形成する可能性がある。あるいは標 的核酸配列を不活性化するためにリボザイムを使用することができる。

従って本発明は、組換えジヒドロカンフェロール（ＤＨＫ）ヒドロキシル化酵素 を発現することができるか、又はＤＨＫヒドロキシル化酵素に翻訳され得るｍＲ ＮＡ分子の全部又は部分に実質的に相補的な核酸配列の転写を指令するトランス ジェニック植物の製造方法に拡張され、この方法は、適当な植物の細胞に、請求 項１又は６に記載の核酸単離体を、該核酸単離体の最終的発現を許容する条件下 に導入し、該細胞からトランスジェニック植物を再生し、そして該核酸単離体の 発現を可能にするのに十分な時間及び条件で該トランスジェニック植物を生長せ しめることを含んで成る。この態様において、適当な受容植物は特にアイリス、 チューリップ、ユリ、リンアンサス（Ｌｉｓｉａｎｔｈｕｓ）　、フリージア、 ヒエンソウ、リモニウム（Ｌｉｍｏｎｉｕｍ）及びベラルゴニウム（Ｐｅｌａｒ ｇｏｎｉｕｍ）に拡張される。

従って、トランスジェニック植物を製造するための上記の方法は、アンチセンス ｍＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドをコードする遺伝子又はＤＮＡ断片を、３’、 ５’−ヒドロキシラーゼをコードするか又はこれをコードする配列に相補的なヌ クレオチド配列のすべて又は部分又は領域に導入するという別法に拡張される。

従って、本発明は、本発明の核酸配列のすべて又は部分、あるいはそのアンチセ ンス形、及び／又はその任意の同族体又は変化した形を含有するすべてのトラン スジェニック植物、そして特に変化した花を示すトランスジェニック植物に拡張 される。従って、トランスジェニック植物は、ＤＨＫヒドロキシル化酵素をコー ドするか又はそれをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んで成る安 定に導入された核酸分子を含有し、そして特に、上記のような導入された核酸配 列を単離する高ｐＨ植物系である。本発明はまた、この様なトランスジェニック 植物からの種子に関する。この様な種子は、特に着色されていれば、植物のため の所有標識として宵月であろう。

本発明のさらなる観点は、ＤＨＫが水分解酵素の組換え形、特に組換え３’、５ ’−ヒドロキシラーゼに向けられる。本酵素の組換形は、例えば、さらに活性な 酵素を開発するための研究用材料源を提供し、そして着色された化合物の製造の ためのインビトロ系を開発するために宵月であろう。

本発明の他の観点は、植物からのシトクロム２４５０分子又は類似の分子をコー ドするか又はそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで 成る核酸分子のクローニング方法を含み、この方法は、既知ミクロソームのシト クロム２４５０分子の１又は複数のコンセンサス配列に由来するヌクレオチド配 列を有するｌ又は複数のオリゴヌクレオチドブライマーを用いるポリメラーゼ連 鎖反応による前記植物の細胞からの核酸分子の適当な調製からのクロモソームＰ ４５０ヌクレオチド配列又は相補的配列の増幅を含んで成る。

関連する態様において、シトクロムＰ４５０核酸分子又はその相補的配列をクロ ーニングする方法は、適当なｃＤＮＡライブラリーから既知のシトクロム２４５ ０分子の１又は複数のコンセンサス配列に対応する１又は複数のオリゴヌクレオ チドブライマーにハイブリダイズすることができるクローンを選択することを含 んで成る。

好ましくは、コンセンサス配列の１つはシトクロム２４５０分子のヘム結合ドメ インからのものであり、さらに好ましくはＦ（Ｇ、　５）ＸＧＸＲＸＣＸＧ（こ こでＸは任意のアミノ酸である）又はＰＧＦＡＧＲＲＩＣＰＧである。最も好ま しい態様において、クローニングされるべき核酸は、ＤＨＫヒドロキシル化酵素 、そして特に３’、５’−ヒドロキシラーゼをコードするか又はそれをコードす る配列に対して相補的である。さらに好ましくは、３’、５’−ヒドロキシラー ゼは前に記載したようなものであり、そしてさらに詳しくは図９又は図１Ｏに示 すようなアミノ酸配列を有するか又はヌクレオチド配列によりコードされ、ある いは前に定義したようにそれに類似性を有する。

次に、図及び例に言及しながら本発明をさらに記載するが、それらに限定される ものではない。

図１　（Ａ）及び（Ｂ）はフラボノイド色素の生合成経路の模式図である。経路 の最初の部分に関与する酵素は次のように表示されている。ＰＡＬ　＝フェニル アラニン・アンモニア−リアーゼ；Ｃ４Ｈ＝シンナメート・４−ヒドロキシラー ゼ；４ＣＬ＝４−クマレート；ＣｏＡリアーゼ、ＣＨＳ＝カルコンシンサーゼ、 ＣＨＩ＝カルコンフラボンイソメラーゼ；Ｆ３Ｈ＝フラバノン・３−ヒドロキシ ラーゼ＋ＤＦＲ＝ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ；　ＵＦＧＴ＝ＵＤ Ｐ−グルコース：フラボノイド−３−０−グルコシルトランスフェラーゼ。後の 段階はＰ、ハイブリダ（Ｐ、　ｈｙｂｒｉｄａ）の花において起こる変換に対応 し、そしてｌ＝シアニジン−３−グルコシド及びデルフィニジンー３−グルコシ ドのグルコシル残基へのラムノース糖の付加；２＝アシル化及び５−０−グルコ シル化、３＝３’−メチル化、４＝５’　−メチル化；５＝３’、５’−メチル 化を含む。

図２（Ａ）は、Ｐ、ハイブリダｃｖ　Ｖ２３　（Ｈｆｌ／Ｈｆ１．　Ｈｆ２／Ｈ ｆ２）の花弁抽出物中の３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性、及びＰ、ハイプリ ダＣＶ　Ｒ５１（ｈｆｌ／ｈｆｌ、　ｈｆ２．　ｈｆ２）における３’、５’− ヒドロキシラーゼ活性の失損を示す。３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性は８Ｈ −ナリンゲニンの３′−及び３’、５’−ヒドロキシル化誘導体エリオシクチオ ール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）及びペンタヒドロキシフラバノンへの転換によ り検出された。この図の左側に、反応の基質ナリンゲニン並びに３′−ヒドロキ シラーゼ生成物エリオジクトール及び３’、５’−ヒドロキシラーゼ反応の生成 物ペンタヒドロキシフラバノンが示されている。ＴＬＣプレート上の基質及びヒ ドロキシル化生成物の位置がこの図の右側に示されており、これは左から右に、 Ｐ、ハイブリダｃｖ　Ｖ２３及びＰ、ハイブリダｃｖ　Ｒ５１からの花の花弁抽 出物により生成される反応生成物並びにＮＡＤＰＨが反応混合物から省略された 場合にナリンゲニンのヒドロキシル化が生じないことを示す対照のオートラジオ グラフを示す。

図２（Ｂ）は、異る発達段階におけるＰ９ハイブリダｃｖ　０１ｄＧｌｏｒｙ　 Ｂｌｕｅ　（ＯＧＢ）花の花弁抽出物中の３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性を 示す。左から右に、ＴＬＣプレートのオートラジオグラフは（＋）段階ｌの花〔 未着色、閉じたつぼみ（長さく２５ｍ））：ナリンゲニンから３’、５’−ヒド ロキシル化誘導体ペンタヒドロキシフラバノンへの限定的な転換、（２）段階２ の花〔着色、閉じたつぼみ（長さ２５〜３５ｍ１１）二より高い３’、５’−ヒ ドロキシラーゼレベルを示す、ペンタヒドロキシフラバノンへの増加した転換、 （３）段階３の花〔出現しつつある花冠を伴う濃紫のつぼみ（長さ〉３５ｍｍ） 　）　：最高３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性、（４）段階４の花〔濃紫の開 いた花、朽裂開前（長さ＞５０ｍ））：最高３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性 、（５）段階５の花〔十分に開いた花。すべての朽裂開〕　：検出可能なレベル の３’、５’−ヒドロキシラーゼなし。

図３（Ａ）はシトクロムＰ４５０をコードするｍＲＮＡ分子の模式的表示である 。黒くした領域は、ヘム結合ドメインをコードする配列の相対位置を示す。この ドメインの最も保存された領域のコンセンサスアミノ酸配列は１文字コードを用 いて示されている。５ＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデーターベース中に存在するシトクロ ムＰ４５０配列の１００％に存在するアミノ酸は箱で囲まれており、モしてＸは 低レベルの配列の保存が存在する位置を示す。

図３（Ｂ）は、ｃＤＮＡライブラリー＃ｌからのシトクロムＰ４５０分子ｐＣＧ Ｐ４５０及びｐＣＧＰ４５４のＰＣＲ増幅のために使用されたオリゴの部分を示 す。オリゴ１及び３は保存されたヘム結合ドメイン中の配列をカバーし、他方オ リゴ２及び４はそれぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）−２ ０及び逆プライマー配列に対応した。オリゴｌ及び２はｐＣＧＰ４５０中のｅＤ ＮＡ挿入部を合成するために用いられ、オリゴ３及び４はｐＣＧＰ４５４中のｅ ＤＮＡ挿入部を合成するために使用された。一般化されたｃＤＮＡ分子の表示は 図３Ａに示されるものと同じであり、ベクター配−列は薄い陰により示されてい る。

図４（Ａ）は、ｐｃＧＰ１７４及びｐｃＧＰ１７５を含めてシトクロムＰ４５０ 同族体を同定するためにｃＤＮＡライブラリー＃ｌをプローブするのに用いたＤ ＮＡ断片の模式的表示である。Ｐ４５０＝黒い箱により示されるヘム結合ドメイ ン（Ｈａｅｍ）を伴う、一般化されたシトクロムＰ４５０ｃＤＮＡ　；断片１＝ ９００ｂｐ断片は鋳型としてｐｃＧＰ１４２　ＤＮＡを用い、オリゴ５及ヒ６ヲ 用イルＰＣＲニヨリ得ラレ；断片２＝１．２Ｋｂ断片は、ｐｃＧＰ１４７の５ａ ｌＩ　−ＥｃｏＲＩ消化により単離され：断片３　＝７５０ｂｐ断片は鋳型とし てｐｃｃｐｔｓｓ　ＤＮＡを用い、オリゴ４及び７を用いるＰＣＲにより得られ ；断片４＝６７０ｂｐ断片は、ｐｃＧＰ１６０のＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＶ消化 により単離され；断片５　＝　１５０ｂｐ断片は鋳型としｒｐｃＧＰ４５４　Ｄ ＮＡ　ヲ用イ、オリゴ３及び４を用いるＰＣＲにより得られた。すべての精製さ れた断片は「材料及び方法」の項に記載したようにして”Ｐ−ｄＣＴＰによりラ ベルした。

図４　（Ｂ）　〜（Ｈ）は、（ｉ　）　Ｉ）ＣＧＰ１４２．　（ｉｉ）　Ｉ）Ｃ ＧＰ１４７．　（ｉｉｉ）ｐｃｃｐｔｓｓ、　（ｉｖ）　ＧＩＣＧＰ１６０及び （ｖ）　ｐＣＧＰ４５４からのｃＤＮＡ挿入部についての部分ヌクレオチド配列 及び対応する推定アミノ酸翻訳生成物を示す。ｃＤＮＡライブラリーをプローブ してｐｃＧＰ１７４及びｐｃＧＰ１７５を単離するために使用した領域は矢印で 示されている。

図５（Ａ）及び（Ｂ）はそれぞれプラスミドｐＣＧＰ　１７４及びｐｃＧＰ１７ ５のダイアグラム表示である。ｃＤＮＡ挿入部は中空箱で示されており、仮定的 ヘム結合ドメインをコードする領域は蓋箱で示されている。

両ｃＤＮＡ挿入部のＥｃｏＲ１部位は５′−末端にあり、そしてＸｈｏ　Ｉ部位 は３′−末端にある。

図６（Ａ）はｐｃＧＰ１７４　ｃＤＮＡ挿入部の３′−領域によりプローブされ たＤＮＡプロットのオートラジオグラフである。各レーンは次のペチュニア組織 から単離された全ＲＮＡの２０μｇのサンプルを含んだ。

１〜５は、「材料及び方法」の項に記載する花の発生段階の５つの異る段階（１ 〜５）におけるＯＧＢの周縁（ｌｉｍｂ）組織であり二Ｔは、段階３〜４の花か らのＯＧＢの腎組織であり；Ｌは、ＯＧＢの６週間の実生からの葉組織であり： ＩＬは、ＯＧＢの６週間の実生からのグルコース／高光処理された葉組織であり ：ｖ２３は段階３〜４の花からのＶ２３の周縁（ｌｉｍｂ）組織であり：　Ｒ５ １は段階３〜４の花からのＲ５１花冠組織であり：ｖＲは、Ｖ２３．Ｒ３１のＦ １雑種の段階３〜４の花からの花弁周縁組織であり：　５ｗ６３は、５ｗ６３の 段階３〜４の花からの花弁周縁組織であり：そしてＴｈ７は、Ｔｈ７の段階３〜 ４からの花弁周縁組織である。

図６（Ｂ）はＶ２３．Ｒ５１（Ｖ／Ｒ）Ｆ２植物のＲＦＬＰ分析からの代表的な オートラジオグラフである。Ｘｂａ　Ｉで消化されたゲノムＤＮＡがｐＣＧＰ１ ７４の３′−領域によりプローブされた。プローブに強くハイブリダイズするＶ ２３断片が、花の管組織中で３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性（＋）を育する すべてのＦ２植物において検出された。強くハイブリダイズするバンド（ＲＦＬ Ｐ＃ｌ）についてのＲＦＬＰ判定が種々の植物にライて示された。Ｖ　：　Ｖ２ ３一様ＲＦＬＰ、　Ｒ：　Ｒ５１一様ＲＦＬＰ、　Ｈ：　ヘテロ接合性（ＶＲ） 。

図７（Ａ）はｐｃＧＰ１７５　ｃＤＮＡ挿入部の３′−領域によりプローブされ たＲＮＡプロットのオートラジオグラフである。各レーンは次のものから単離さ れた全ＲＮＡの２０μｇのサンプルを含有した。１〜５は、［材料及び方法」の 項に記載する花の発達の５つ（１〜５）の異る段階における花のＯＧＢの周縁組 織であり；Ｔは段階３〜４の花からのＯＧＢの腎組織であり；Ｌは、ＯＧＢの６ 週間の実生からの葉組織であり、［Ｌは、ＯＧＢの６週間の実生からのグルコー ス／高光処理された葉組織であり：ｖ２３は、段階３〜４の花からのＶ２３周縁 組織であり；　Ｒ５１１＊段Ｆｆｔ　３〜４　（７）花から（７）Ｒ５１花冠組 織であり、　ＶＲｉ！、Ｖ２３．Ｒ５１のＦ１雑種の段階３〜４の花からの花弁 周縁組織であり；　５ｗ６３は、５ｗ６３の段階３〜４の花からの花弁周縁組織 であり；そしてＴｈ７は、Ｔｈ７の段階３〜４の花からの花弁周縁組織である。

図７（Ｂ）は、Ｖ２３□Ｒ５１（Ｖ／Ｒ）Ｆ２植物のＲＦＬＰ分析からの代表的 なオートラジオグラフである。Ｘｂａ　［で消化したゲノムＤＮＡをｐｃＧＰ１ ７５の３′−領域によりプローブした。ｐｃＧＰ１７５プローブを用いて得られ るＲＦＬＰ判定はｃｈｉ　−Ａプローブを用いて帰属される１０判定と同じであ った。Ｖ　：　Ｖ２３一様ＲＦＬＰ、　Ｒ：　Ｒ５１一様ＲＦＬＰ、Ｈ：ヘテロ 接合性（ＶＲ）ＲＦＬＰ　０ 図８は、ｐｃＧＰ６０２の制限酵素地図のダイアグラム表示である。クローニン グに用いたベクターを除＜　ｃＤＮＡ挿入部の長さが、太線で示される。これら はＭ１３−ｍｐ１８及びｍｐ１９にサブクローニングされ、そして示されるオリ ゴヌクレオチドブライマー配列を用いて配列決定され、オーバーラツプする配列 情報が得られた。各サブクローンの断片から得られた配列情報の範囲及び方向を 半矢印を付した線により示す。Ｓ１＝プライマー配列１：Ｓ２＝プライマー配列 ２．Ｓ３＝プライマー配列３゜ＡＴＧはメチオニン開始コドンを示し、クローン の長さく塩基対）も示される。

図９　（Ａ）　〜（Ｄ）はｐｃＧＰ１７６及びｐｃＧＰ６０２からのｃＤＮＡ挿 入部のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。Ｉ）ＣＧＰ６０２ からの挿入部は、示される全配列を含む。ｐｃＧＰ１７６挿入部の５′−末端が 矢印により示される。

図１０（Ａ）〜（Ｃ）はｐｃＧＰ１７５からのｃＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配 列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

図１１はｐＣＧＰ６１８の作製のダイアグラム表示である。ｐｃＧＰ６１８は、 発現ベクターｐＹＧＡ２２ｍ中の酵母グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ ゲナーゼプロモーター（ＰＧＰＤ）の後にｐｃＧＰ１７５　ｃＤＮＡ挿入部をセ ンス方向にクローニングすることにより作製された。Ｉ）ＣＧＰ１７５かＸ＝Ｘ ｈｏ［、ＩＲ＝　２　μｍプラスミドの逆転反復、’ｒｒｐｔ＝’ｒｒｐｔ遺伝 子、Ａｐ＝アンピシリン耐性マーカー。

図１２（Ａ）は、基質として３Ｈ−ナリンゲニンを使用しての酵素抽出物の３’ 、５’−ヒドロキシラーゼアッセイを示す。このオートラジオグラフは、プラス ミドｐｃＧＰ６１８により形質転換された酵母の抽出物による、′Ｈ−ナリンゲ ニンの３’、５’−ヒドロキシル化誘導体ペンタヒドロキシフラバノンへの転換 を示す（１及び２）。形質転換されていない酵母においては３’、５’−ヒドロ キシラーゼ活性は検出されなかった（Ｃ）。ＯＧＢの３’、５’−ヒドロキシラ ーゼによるナリンゲニンのペンタヒドロキシフラバノンへの転換も示される（Ｏ ＧＢ　Ｃ）。

図１２（Ｂ）は、基質としてｍｌ−ジヒドロケルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅ ｒｃｅｔｉｎ）を使用しての、酵母抽出物の３’、５’−ヒドロキシラーゼアッ セイを示す。このオートラジオグラフは、プラスミドｐｃＧＰ６１８により形質 転換された酵母の抽出物による”Ｈ−ジヒドロケルセチン（ＤＨＱ）の３Ｈ−ジ ヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）（Ｄ）ＩＭ）への転換 を示す（１及び２）。形質転換されていない酵母においては３’、５’−ヒドロ キシラーゼ活性は検出されなかった（Ｃ）。ＯＧＢの３’、５’−ヒドロキシラ ーゼによるＤＨＱのＤＨＭへの転換も示される（ＯＧＢ　Ｃ）。

図１３は、基質として”Ｈ−ナリンゲニンを用いての酵母抽出物の３’、５’− ヒドロキシラーゼアッセイを示す。このオートラジオグラフは、プラスミドｐｃ ＧＰ６１８及び１）ＣＧＰ６２０により形質転換された酵母の抽出物による、３ Ｈ−ナリンゲニンの３’、５’−ヒドロキシル化誘導体ペンタヒドロキシフラバ ノンへの転換を示す（それぞれ、１及び２）。ｐｃＧＰ６２０抽出物から得られ た反応生成物はさらに３′−ヒドロキシル化エリオシクチオール（ｅｒｉｏｄｉ ｃｔｙｏｌ）及びもとのナリンゲニン基質の幾らかを含んでおり、３’、５’　 −ヒドロキシル化最終生成物への転換が不完全であることが示された。形質転換 されていない酵母においては３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性は検出されなか った。

図１４は、プラスミドｐｃＧＰ９０のダイアグラム表示である。示されるように 、９ＣＧＰ６０２からのｃＤＮＡ挿入部が発現ベクター９ＣＧＰ２９３のＭａｃ プロモーターの後にセンス方向にクローニングされている。

図１５は、ペチュニアの花弁抽出物の３’、５’−ヒドロキシラーゼアッセイを 示す。このオートラジオグラフは、５ｋｒ４　ｘ　５ｗ６３の花弁周縁組織（Ｌ ）中に低レベルの３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性（”Ｈ−ナリンゲニンの１ Ｈ−ペンタヒドロキシフラバノンへの転換）が存在することを示している。２種 類の５ｋｒ４　ｘ　５ｗ６３／Ｉ）ＣＧＰ９０　トランスジェニック（Ｔ／Ｇ　 １６０２及びＴ／Ｇ　１６０３）の円周組織（Ｌ）中に有意に高レベルの活性が 検出された。非トランスジェニック５ｋｒ４　ｘ　５ｗ６３雑種又は２種類のＩ ＩＣＧＰ９０　トランスジェニックのいずれの花弁管（Ｔ）の抽出物にも３’、 ５’−ヒドロキシラーゼ活性が検出されなかった。ＯＧＢの周縁（Ｌ）及び管（ Ｔ）花弁組織の抽出物による、ナリンゲニンのペンタヒドロキシフラバノンへの 転換も示される。

図１６は、。Ｐ−ラベルされたＨｆ　１　ｃＤＮＡによりプローブされたＲＮＡ プロットのオートラジオグラフの写真表示である。各レーンは、（１）Ｐ、ハイ ブリダ（Ｐ、　ｈｙｂｒｉｄａ）ｃｖ、　ＯＧＢの花弁、（２）パンジーの花弁 、（３）ジャガイモの茎、（４）ナスの皮、（５）ニコチアナ・アラト（Ｎｉｃ ｏｔｉａｎａ　ａｌａｔａ）の花、（６）アゲラツム（Ａｇｅｒａｔｕｍ）の花 から単離された全ＲＮＡの２０μｇのサンプルを含有した。Ａ及びＣのために使 用したプローブは６６０ｂｐ　Ｂａ１ｌ　ＤＮＡ断片に由来し、１、４Ｋｂ　Ｅ ｃｏＲ（／ＨｉｎｄＩＩ［断片をＣのために使用した。使用した洗浄条件は、（ Ａ）５５℃にて６ｘＳＳＣ，（Ｂ）　５０°Ｃにて２ｘＳＳＣ，（Ｃ）　６５° Ｃにて０、２ｘＳＳＣであった。

で消化されたＩＯμｇのＤＮＡを含有した。ＤＮＡサンプルは、（１）ナス、（ ２）オランダアイリス、（３）ジャガイモ、（４）スミレ及び、（５）アネモニ から単離された。洗浄条件は、（Ａ）５０°Ｃにて６ｘＳＳＣ、及び（Ｂ）６５ ℃にて２ｘＳＳＣであった。

実施例 １、材料及び方法 化学物質酵素及びラジオアイソトープ エリオシクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）及びジヒドロクエルセチン（ｄ ｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）はＣａｒｔ　Ｒｏｔｈ　ＫＧから入手し、そ してナリンゲニンはＳｉｇｍａから入手した。ジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄ ｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）はＶｅｒｃｒａｙｓｓｅら（１９８５）の方法により ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）から化学的に合成した。〔３Ｈ〕−ナリンゲ ニン（５，７Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）及び〔３Ｈ〕−ジヒドロクエルセチン（１２， ４Ｃｉ／ｍｍｏ１ｅ）はＡｌ１１ｅｒＣ１１ａｌｌｌから入手した。

すべての酵素は市販品であり、そして製造者の指示に従って使用した。

細菌株 使用した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉ）株は次の通りであった。

ＤＨ５ａ　５ｕｐＥ４４．Δ（ＩａｃＺＹＡ−ＡｒｇＦ）０１６９．　φ８０１ ａｃＺΔＭ１５．　ｈｓｄＲ１７（ｒｍ−、ｌ１ｌｋ　”）＋　ｒｅｃＡｌ、　 ｅｎｄ　ＡＩ、　ｇｙｒＡ９６．　ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡｌ、　ｄｅｏＲ。

（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３及びＢＲＬ、　１９８６）。

ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　５ｕｐＥ４４．ｈｓｄＲ１７（ｒｍ−、ｍｋ”）、ｒｅＣＡ ｌ、ｅｎｄ　ＡＩ、ｇｙｒＡ９６゜ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡｌ、　１ａｃ−、［Ｆ ’　ｐｒｏＡＢ、　１ａｃｒ”、　１ａｃＺΔＭ１５．　ＴｎｌＯ（ｔｅｔ’） ］（Ｂｕｌｌｏｃｋら、　１９８７）。

ＰＬＫ−Ｆ’　ｒｅＣＡ、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ”）、ｍＣｒＡ−、ｍＣ ｒＢ−、ｌａＣ，５ＵｐＥ４４．ｇａｌＫ２゜ｇａｌＴ２２．　ｍｅｔＢｌ、　 ［Ｆ’　ｐｒｏＡＢ、　１ａｃｅ’、　１ａｃＺΔＭ１５．　ＴｎｌＯ（ｔｅｔ ’）］（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。

無力にされた（　ｄ　ｉｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリウム・ツメファシェンス （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＧＬＯ株（Ｌａｚ ｏら、１９９１）はＲ，Ｌｕｄｗｉｇ　（カリフォルニア大学生物学部、サンタ クルツ）から入手した。

クローニングベクターｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅはＳ ｔｒａｔｅｇｅｎｅ大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換はＩｎｏｕｅら（１９９０） の方法に従って行った。コンピテントＡＧＬＯ細胞を、５０ｍＬ　ＭＧル培地（ ｉ壓）に接種後２８°Ｃで１６時間培養して調整した。その１００μＬに５μｇ のプラスミドＤＮＡを加えることにより、プラスミドｐｃＧＰ９０　（図１４） をアグロバクテリウム・ツメファシェンスＡＧＬＯ株に導入した。次に、細胞を ベレット化し、そして０．５ｍＬの８５％（Ｖ／Ｖ）１００［！ＩＭ　ＣａＣｌ ２／１５％（ｖ／ｖ）グリセロール中に再懸濁した。液体Ｎ２中で２分間インキ ュベートすることによりＤＮＡ−アグロバクテリウム混合物を解凍し、そして次 に３７°Ｃにて５分間のインキュベーションにより凍結した。次に、ＤＮＡ／細 菌混合物をさらに１０分間氷上に置いた。次に、細胞をｌ０ＩＬのＭＧ／Ｌ培地 に加え、そして２８℃にて１６時時間上うしながらインキュベートした。１）Ｃ ＧＰ９０を有するＡ、ツメファシェンスの細胞を、１００μｇ／ｍＬのゲンタマ イシンを含有するＭＧル寒天プレート上で選択した。ゲンタマイシン耐性形質転 換体から単離されたＤＮＡのサザン分析により１）ＣＧＰ９０の存在を確認した 。

使用したペチュニア・ハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）の品種を 表２に示す。

表２ 植物材料 植物品種　性　質　由来／文献 Ｏ１ｄ　Ｇｌｏｒｙ　Ｂｌｕｅ　（ＯＧＢ）Ｆ、Ｈｙｂｒｉｄ　Ｂａ１ｌ　５ｅ ｅｄ、ＵＳＡＶ３０　Ａｎｌ、　Ａｎ２．　Ａｎ３．　Ａｎ４．　Ａｎ６　Ｋｏ ｅｓら（１９８６）Ａｎ８．　Ａｎ９．　ＡｎｌＯ，Ａｎｌｌ、　Ｐｈ１Ｐｈ２ ．　Ｐｈ３．　Ｐｈ４．　Ｐｈ５．　Ｈｆｌ。

Ｈｆ２．　Ｈｔｌ、　Ｒｔ２．　Ｒｔ、　Ｍｔｌ、　Ｍｔ２゜ｍｆｌ、　ｐｏ、 　ｃｒ Ｖ２３　Ａｎｌ、　Ａｎ２．　Ａｎ３．　Ａｎ４．　Ａｎ６　Ｗａｌｌｒｏｔｈ ら（１９８６）Ａｎ８．Ａｎ９．ＡｎｌＯ，ｐｈｌ、Ｈｆ１．　Ｄｏｏｄｅｍａ ｎら１９８４Ｈｆ２．　ｈｔｌ、　Ｒｔ、　Ｐｏ、　Ｂｌ、　ＦＩＲ５１Ａｎｌ 、Ａｎ２．Ａｎ３．ａｎ４．Ａｎ６　Ｗａｌｌｒｏｔｈら（１９８６）Ａｎ８． Ａｎ９．ＡｎｌＯ，Ａｎｌｌ、　ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ　ら（１９９０）Ｐｈｉ、 　ｈｔ　１．　ｈｆ２．　）ｉｔ　１．　ｒｔ、　Ｄｏｏｄｅｍａｎら（１９８ ４）ｐｏ、ｂｌ、ｆｌ Ｓｗ６３　Ａｎｌ、　Ａｎ２．　Ａｎ３．　ａｎ４．　Ａｎ６　１．　Ｎ、　Ｒ ，Ａ、　、　Ｄｉ　ｊｏｎ、　Ｃｅｄｅｘ。

Ａｎ８．Ａｎ９．ＡｎｌＯ，Ａｎｌｌ、　フランスＰｈｉ、　Ｐｈ２．　Ｐｈ５ ．　ｈｆ　１．　ｈｆ２　Ｄｏｏｄｅｍａｎら（１９８４）ｈｔｌ、ｈｔ２．ｒ ｔ、ｐｏ、ｍｆｌ、ｆｌ、ＧｆＴｈ７　Ａｎｌ、　Ａｎ２．　Ａｎ３．　Ａｎ４ ．　Ａｎ６　１．　Ｎ、　Ｒ，Ａ、　、　Ｄｉ　ｊｏｎ、　Ｃｅｄｅｘ。

Ａｎ９．ＡｎｌＯ，Ａｎｌｌ、Ｈｆ１．Ｈｆ２．　フランスＨｔ１．　Ｒｔ２． 　Ｐｈｉ、　Ｐｈ２．　Ｐｈ５．　Ｒｔ。

ｐｏ、　ｍｆ　１．　ｍｆ２．　Ｇｆ、　ｆ　１Ｓｋｒ４　Ａｎｔ、　Ａｎ２． 　Ａｎ３．　Ａｎ４．　Ａｎ６　１．　Ｎ、　Ｒ，Ａ、　、　Ｄｉ　ｊｏｎ、　 Ｃｅｄｅｘ。

Ａｎｌｌ、　ｈｆｌ、　ｈｆ２．　ｈｔｌ、　Ｐｈｉ、　Ｐｈ２．フランスＰｈ ５．ｒｔ、Ｐｏ、ＭｆｌＪｆ２．ｆｌＳｋｒ４　Ｘ　５ｗ６３５ｋｒ４　Ｘ　５ ｗ６３　ｐｉ雑種Ｒｗ１４　Ａｎｌ、　Ａｎ２．　Ａｎ４．　Ｐｈｉ、　ｐｈ２ ．　Ｌ　Ｎ、　Ｒ，Ａ、　、　Ｄｉ　ｊｏｎ、　Ｃｅｄｅｘ。

Ｐｈ５．ｈｆｌ、ｈｆ２．Ｈｔｌ、Ｒｔ、Ｐｏ、　ニアランスＢ１．　Ｌｇｌ、 　Ｌｕ１．　Ｖｓｌ、　Ｖｓ３．　Ｖｓ５゜ｌａ、　Ｙｇｌ、　ｗｓ、　Ｇｆ、 　Ｍｔ　ｌ、　Ｍｆ２．　ｆ　ＩＲｐ５７　Ａｎｌ、Ａｎ２．Ａｎ４．Ｐｈｉ、 ｐｈ２．　１．Ｎ、Ｒ，Ａ、、Ｄｉｊｏｎ、Ｃｅｄｅｘ。

Ｐｈ５．　ｈｆｌ、　ｈｆ２．　Ｈｔｌ、　Ｒｔ、　Ｐｏ、　フランスＭｔ、　 Ｍｆ、　ｆｌ、　Ｇｆ、　８１．　Ｌｇｌ、　Ｌｕｌ。

Ｖｓｌ、　Ｖｓ３．　Ｖｓ５．　Ｙｇｌ、　Ｗｓ。

Ｒｐ５７　ｘ　Ｒｗ１４　Ｒｐ５７　ｘ　Ｒｗ１４　Ｆ＋雑種植物を特別の成育 室で、１日１４時間１０．０００ルツクスの光強度及び２２〜２６“Ｃの温室に て成育させた。ＯＧＢの花を次に定義する発生段階において収穫した。

段階１：着色なし、つぼみが閉じている（長さく２５Ｍ）段階２：着色あり、つ ぼみが閉じている（長さ２５〜３５ｍ）段階３：暗紫色のっぽみ、花冠が生じつ つある（長さ＞３５ｍ＋＊）段階４：暗紫色開花、朽裂開前（長さ＞５０Ｍｍ） 段階５：十分に開花、すべての朽裂開 表２に記載する他の品種の花を、最大色素蓄積の段階で朽の開裂前に収穫した。

３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性のアッセイのための植物抽出物の調製 植物組織を２〜５倍体積の氷冷した抽出緩衝液（１００ｍＭ　’Ｊン酸カリウム （１）Ｈ７，５）、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．２５Ｍシュークロース、　０ ．２５Ｍマンニトール、０．１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ　、　１１００ｎペプスタチ ン、　１００ｒ＋ｌＪ　ロイペプチン、　０．　Ｉ　ｍｇ／ｎ＋Ｌ　ＰＭＳＦ　 、　２０ｍＭ　２−メルカプトエタノール及び１０ｍｇ／ｍＬポリクラ（ｐｏｌ ｙｃｌａｒ）ＡＴ　）中でホモジナイズした。ホモジネートを１０．　ｏｏｏｒ ｐｍにてＪＡ２０　ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で４°Ｃにて１０分間遠心し 、そして上清の一部を３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性に３’、５’−ヒドロ キシラーゼ酵素の活性は、５ｔｏｔｚ及びＦｏｒｋｍａｎｎ（１９８２）により 記載された方法の変法を用いて測定した。アッセイ反応混合物は典型的には１０ ０μＬの抽出抽出物、５μＬの５０ｍＭ　ＮＡＤＰＨ／アッセイ緩衝液（１００ ｎ＋Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８，０）、１　［ＤＭ　ＥＤＴＡ　。

及び２０ｍＭ　２−メルカプトエタノール〕、及びｌＯμＣｉの〔３Ｈ〕ナリン ゲニン又は５μＣｉの（”Ｈ）ジヒドロクエルセチンを含有しており、そしてア ッセイ緩衝液により最終体積２１０μＬにした。２３℃にて２〜１６時間のイン キュベーションの後、反応混合物を０．５ｍＬの酢酸エチルで抽出した。酢酸エ チル相を真空乾燥し、そして１０μＬの酢酸エチルに再懸濁した。トリチル化さ れたフラボノイド分子をセルロース薄層プレート（メルクＡｒｔ５５７７　、仲 間）上で、クロロホルム／酢酸／水（１０：　９　：　１　ｖ／ｖ）溶剤系を用 いて分離した。クロマトグラフィーの完了の際、ＴＬＣプレートにエーテル中７ ％（ｖ／ｖ）２．　５−ジフェニルオキサゾールを噴霧した。反応生成物をオー トラジオグラフィーにより局在化し、そして反応生成物と並んで泳動されそして ＵＶ光のもとて可視化された、非−放射性ナリンゲニン、エリオシクチオール、 ジヒドロクエルセチン及びジヒドロミルセチン標準との比較により同定された。

葉におけるデルフィニジン合成のグルコース／高光誘導葉をＰ、ハイブリダｃｖ 、　ＯＧＢから収穫し、そして無菌水中でｌａ１片に切った。次に、葉片を２％ （Ｗ／Ｖ）グルコース溶液上に浮かせ、そして２４．０００ルツクスの光強度に ９６時間暴露した。

ｃＤＮＡライブラリー＃ｌの作製 段階３〜４のＯＧＢの花の周縁２０ｇを、１０ｍＭバナジルリボヌクレオシド錯 体を含有するＰＥＢ　（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＣ（ｐＨ８，６）、　６ ０ｍＭ　ＫＣＩ。

３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２５ｍＭ　ＥＧＴＡ　）　１００ｍＬ中でホモジナイズ した。ホモジネートを無菌のＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に通 して濾過することにより細胞片を除去した。濾液を、Ｕｌｔｒａ−Ｃ１ｅａｒ　 ？＋′Ｑｕｃｋ−３ｃａｌ　”　（Ｂｅｃｋｍａｎ）遠心チューブ中、２５％（ Ｗ／Ｖ）シュークロース及び２５０ユニツトの［ｎｈｉｂｉｔＡｃｅ　（５−Ｐ ｒｉｍｅ　３−Ｐｒｉｍｅ）を含有する６＋ＬのＦＥＢ　、並びに５０％（ｗ／ ｖ）シュークロース及び２５０ユニツトのＩｎｈｉｂｉｔＡｃｅを含有する６ｍ ｌのＦＥＢの段階的勾配の上部に重層した。チューブを７０Ｔｉローター中で２ ６．００Ｏｒｐｍにて３．５時間遠心した。２５％（ｗ／ｖ）シュークロース１ ５０％（Ｗ／Ｖ）シュークロース界面から膜結合ポリゾームを集め、そして４Ｍ イソチオシアン酸グラニシン溶液に加えた。Ｔｕｒｐｅｎ及びＧｒｉｆｆｉｔｈ 　（１９８６）により記載されているようにして５．７Ｍ　ＣｓＣｌクッション を通してペレット化することによりＲＮＡを変性したポリゾームから単離した。

Ｕｎｉ　−ＺＡＰ　”　ＸＲベクターキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を用い、 鋳型としてポリゾームＲＮＡを２５μｇ使用してλＺＡＰ中にディレクショナル ｃＤＮＡライブラリーを作製した。２５０．０００プラーク形成ユニツト（ｐｆ ｕ）を含有する一部ライブラリーをＮＺＹプレート（５ａＩｌｌｂｒｏｏｋら、 １９８９）上での一夜増殖により増幅し、そして増幅されたファージストックを Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）により記載されているようにしてＰＳＢ　（１ ００ｍＭＮａＣ１，８ｍＭ　ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ ７，５）、　０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン〕中に溶出した。

ｃＤＮＡライブラリー＃２の作製 全ＲＮＡを、Ｐ、ハイブリダｃｖ、　ＯＧＢの段階３〜４の花の花弁組織から、 Ｔｕｒｐｅｎ及びＧｒｉｆｆｉｔｈ　（１９８６）の方法を用いて単離した。ポ リ（Ａ）　”　ＲＮＡを前記全ＲＮＡから３サイクルのオリゴ−ｄＴセルロース クロマトグラフィー（Ａｖｉｖ及びＬｅｄｅｒ、　１９７２）により選択した。

２ｕＨのポリ（Ａ）　”　ＲＮＡを、ｔｘ　５ｕｐｅｒＳＣｒｉｐｔ　”反応緩 衝液、１０ｍＭジチオスレイトール、　５００μＭ　ｄＡＴＰ、　５００μＭ　 ｄＧＴＰ、　５００μＭｄＴＴＰ、　５００μＭ　Ｓ−メチル−ｄＣＴＰ、　０ ．７５膜ｇオリゴヌクレオチド＃８及び２　μＬ　５ｕｐｅｒＳＣｒｉｐｔ　” 逆転写酵素（ＢＲＬ）を含む２０μＬ体積中で逆転写した。反応混合物を３７℃ にて５０分間、４４°Ｃにて１０分間インキュベートし、次に氷上に置いた。

第二鎖反応混合物（１４０μＬ）を第−鎖反応混合物に加えた。第二鎖反応混合 物は２１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１０４ｍＭ　ＫＣＩ、　５．３ｍＭ　Ｍｇ Ｃ１，、１７１μＭ　β−ＮＡＤ、　１１．４１１１Ｍ（ＮＨ４）ＳＯ４，２１ ４μＭ　ｄＡＴＰ、　６４２μＭ　ｄＣＴＰ。

２１４　ｕＭ　ｄＧＴＰ、　２１４μＭ　ｄＴＴＰ、　４ｍＭ　ＤＴＴ、　１０ μＣｉ”Ｐ　−ｄＣＴＰ（３０００Ｃ４／ｍ　ｍｏｌｅ）　、　１５Ｌニツト大 腸菌ＤＮＡリガーゼ、４　Ｑ　：Ｌ　ニットＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ）及びＱ、８：Ｌニー７トＲＮＡ５ｅ　Ｈから成った。最終混合物を１ ６°Ｃにて１５０分間インキュベートした。２重鎖ｃＤＮＡを平滑末端化するた め、ｌＯユニットの７４　ＤＮＡポリメラーゼを加え、そして反応を１６°Ｃに てさらに１５分間続けた。反応を停止し、ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム 抽出、そして次にクロロホルム抽出及びエタノール沈澱により精製した。

ＥｃｏＲ［アダプター（Ｐｒｏｍｅｇａ）をｃＤＮＡに連結し、そして次に製造 者により推奨された条件を用いてキナーゼ処理した。加熱（７０°Ｃｌ２Ｏ分） により酵素を変性させ、そしてフェノール／クロロホルム抽出（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ）により、ｌｏｏ＋ｏＬの反応体積中で、製造者の推奨する条件を用いて 消化した。酵素を加熱失活させ（７０°Ｃｌ２Ｏ分間）、そして混合物を、ＳＴ Ｅ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）中で平衡化された５４００スパンカ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。溶出液をフェノール／クロロホルム抽出 し、そしてエタノール沈澱させた。４°Ｃにて３０分間のマイクロ遠心分離の後 、ｃＤＮＡペレットを７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールで洗浄し、空気乾燥し、そし てｌＯμＬのＴＥ緩衝液（ｔＯ＋ｏＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１）Ｈ７，５）、　 １ｍＭ　ＥＤＴＡ　）中に再懸濁した。

そのうち、７．５μＬを１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルを用いて電気泳動し、１ ．３〜２．５Ｋｂのサイズ範囲のｃＤＮＡを単離するためにＮＡ−４５膜（Ｓｃ ｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌｌ）を用いた。

サイズ分画されたｃＤＮＡを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，０）、　 １０ｍＭ　ＭｇＣ１＊。

１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及び２ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガ ーゼから成る反応緩衝液５μＬ中で、λＺＡＰＩＩ　ＥｃｏＲ［／Ｘｈｏｌ／Ｃ ＩＡＰ処理ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　１μｇと連結した。反応は４℃ にて２日間行った。

室温に２時装置いた後、Ｐａｃｋａｇｅｎｅ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて連結 反応混合物をパッケージした。組換え体の全数は２７０．０００ｐｆｕであった 。

１５０、０ＯＯｐｆｕの量のパッケージされたｃＤＮＡを、ＰＬＫ−Ｆ’細胞の トランスフェクションの後、１５ａ１１直径のプレート当り１０．０００ｐｆｕ でプレートした。プレートを３７℃にて８時間インキュベートし、そして４℃に て一夜貯蔵した。２枚のリフトをＣｏｌｏｎｇ／Ｐｌａｑｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　 ”フィルター（Ｄｕｐｏｎｔ）上に取り、そして製造者が推奨するように処理し た。

゛オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＰＣＲ−Ｍａ ｔｅ　ＤＮＡ合成機上で、製造者により推奨される方法を用いて合成した。合成 されたオリゴヌクレオチドは５’−３’の方向に次の通りであった。

オリゴ１　：　ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＩＣＣＩＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＧＧＩＧＣＩＧＧ オリゴ２　：　ＧＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴオリ ゴ３　：　ＣＣＩＧＧ（Ａ／Ｇ）ＣＡＩＡＴＩＣ（Ｇ／ＴＸＣ／ＴＸＣ／Ｔ）Ｔ ＩＣＣＩＧＣＩＣＣ（Ａ／Ｇ）オリゴ５・ＧＴＴＣＡＡＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴ Ｇオリゴ６　：　ＧＣＴＧＣＡＣＴＴＡＡＴＣＣＡＴＡＴオリゴ７　：　ＴＧＣ ＡＴＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧオリゴ８　：　ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧ ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴオリゴ９　：　Ａ ＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧオリゴ１０　：　ＣＴＡＧＡＣＴＣＣＡＡＴＣＡ Ｃオリゴ２及び４は、２木組ＰＣＲ生成物の濃縮を促進することが示されている （　Ｌｅｍ及びＫｅｍｐ、　１９８９）　ＧＣＮ４結合部位（アンダーラインで 示しである）を含んだ。

オリゴ３の設計のための基礎は次の通りであった。アボカドのシトクロムＰ４５ ０の想定されるヘム結合ドメインからのアミノ酸配列（Ｂｏｚａｋら、１９９０ ）及び２つのベチューアシトクロムＰ４５０相同ｐＣＧＰ１４２及び１）ＣＧＰ １４７によりコードされる対応する配列を整列させた。

アボカド　ＰＦＧＡＧＲＲＧＣＰＧ ｐＣＧＰ１４２　Ｐ　Ｆ　ＧＡＧＫＲＩ　ＣＰ　ＧｐｃＧＰ１４７　Ｐ　Ｆ　Ｇ 　Ｓ　Ｇ　ＲＲＩ　ＣＰ　Ｇ３つの植物シトクロムＰ４５０のヘム結合領域のコ ンセンサスアミノ酸配列は次の様に見ることができよう。

Ｐ　Ｆ　Ｇ　Ａ（Ｓ）Ｇ　Ｒ（Ｋ）ＲＩ（Ｇ）ＣＰ　０３種のシトクロム２４５ ０分子のヘム結合ドメイン中に見出されるアミノ酸をコードすることができるヌ クレオチド配列の可能な順列は次の様に演えきすることができよう。

５　’　−ＣＣＸ　ＴＴＴ　ＧＧＸ　ＧＣＸ　ＧＧＸ　ＡＧＸ　ＣＧＸ　ＡＴＸ 　ＴＧＴ　ＣＣＸ　ＧＧＸ−３’ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＧＧ　Ｃ Ｘは４種類すべてのヌクレオチド（Ａ、　Ｃ，Ｇ及びＴ）を使用することができ るヌクレオチド位置を示す。オリゴ３は、３種の植物シトクロムＰ４５０に由来 するコンセンサス配列のサブセットを相補するように設計された。塩基の縮重が ３より大である場合、デオキシイノシン（Ｉ）を用いた。得られるオリゴヌクレ オチド配列は上に示す通りであった。

ＰＣＲ反応 ヘルパーファージＲ４０８（Ｓｔｒａｔｅｇａｎｅ）を用いて、製造者により記 載された方法を用いて、２００．０００ｐｆｕの増幅されたλＺＡＰ　ｃＤＮＡ ライブラリー＃ｌからペチュニアｃＤＮＡ挿入部を含有するｐＢ１ｕｅｓｃｒｉ ｐｔファージミドを切り出した。大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅをファージミド混合物 によりトランスフェクトし、そして２５０．０００コロニーをアンピシリン含有 培地上にプレートした。細胞をＬＢ　（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に再懸 濁し、そしてアルカリ溶解法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いてプラス ミドＤＮＡを単離した。ＣｓＣｌグラジェント上でのバンド形成によりプラスミ ドＤＮＡをさらに精製した。このＤＮＡをＰＣＲ用鋳型鋳型て用いた。

花弁シトクロムＰ４５０同族体の増幅のためのＰＣＲ反応混合物は５＊ｇから１ １００ｎの切り出されたＤＮＡ　、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ（ｐＨ８゜ ３）、　５０ｍＭ　ＫＣＩ。

１．５ｄ　ＭｇＣ１ｚ、　０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、Ｑ、２ｍＭずつのｄ ＮＴＰ、　０．４μＭずつのプライマー及び１．２５ユニツトのＴａｑポリメラ ーゼ（Ｃｅｔｕｓ）を含有した。反応混合物（５０μＬ）を、９４°Ｃ１４８° Ｃ及び７２℃の間で各温度において１分間ずつ、３０回循環した。増幅された生 成物をＧｅｎｅｃｌｅａｎ　（Ｂｉｏ　１０１　Ｉｎｃ、）を用いてゲル精製し 、クローニングのために十分な量を得るために再増幅し、そして次にＴ４　ＤＮ Ａポリメラーゼを用いて末端修復した。オリゴｌ及び２を用いて増幅したＤＮＡ を１（ｉｎｄｌ［及びＸｈｏ　Ｉで消化した後に９Ｂ１ｕｓｃｒｉｐｔにクロー ニングした。

オリゴ３及び４間の増幅により生じたＰＣＴ生成物を、Ｈｏ１ｔｏｎ及びＧｒａ ｈａｍ　（１９９１）により記載されたｄｄＴ−テイルｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ に直接り２枚のプラークリフトを次のようにしてハイブリダイズさせそして洗浄 した。高ストリンジエンシー条件〔ハイブリダイゼーション＝５０％（ｖ／ｖ） ホルムアミド、６ＸＳＳＣ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、　４２°Ｃに゛〔１６時間 、及び洗浄＋　２ＸＳＳＣ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、　６５℃にて２×１５分間 、これに続き０．２ｘＳＳＣ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、　６５°Ｃにて２×１５ 分間〕を用いて兄弟クローンを検出し、そして低ストリンジエンシー条件〔ハイ ブリダイゼーション：２０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、６ｘＳＳＣ，１％（ｗ／ ｖ）ＳＤＳ、　４２℃にて１６時間、及び洗浄：　６ＸＳＳＣ，１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、　６５℃にて１時間〕を用いて関連配列を検出した。

ノザン分析 全ＲＮＡを、液体Ｎ、中で凍結した組織から単離し、そして乳鉢と乳棒を用いて 微粉砕した。４Ｍイソチオシアン酸グアニジン、５０ｄＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８，０）　、　２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌの 抽出緩衝液を組織に添加し、そして混合物を最大速度でポリトロンを用いて１分 間ホモジナイズした。懸濁液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を 用いて濾過し、そしてＪＡ２０ローター中で１０．　ＯＯＯｒｐｍにて１０分間 遠心した。

上清を集め、そして０．２　ｇ／ｍＬ　ＣＣ５Ｃ１（／ｖ）にした。次に、サン プルを、３８．５ｍＬのＱｕｉｃｋ　−５ｅａｌ遠心チユーブ（Ｂｅｃｋｍａｎ ）中で５．７Ｍ　ＣｓＣ１゜５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，０）の１０ｍＬクッ ション上に重層し、そしてＴｉ−７０ｏ−ター中で、４２．００Ｏｒｐｍにて１ ２〜１６時間２３°Ｃにおいて遠心した。ペレットをＴＥ／ＳＤＳ　（１０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％（ｗ／ｖ ）ＳＤＳ　）中に再懸濁し、そして１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）中で飽和 されたフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）に より抽出した。エタノール沈澱の後、ＲＮＡベレットをＴＥ／ＳＤＳ中に再懸濁 した。

ＲＮＡサンプルを、２．２Ｍホルムアルデヒド７１．２％（ｗ／ｖ）アガロース ゲルにより、４０ｍＭモルホリノプロパンスルホン酸（ｐ）１７．０）、５　ｄ 酸ナトリウム、　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を含有する泳動緩衝液を 用いて電気泳動した。ＲＮＡを、製造者が記載するようにしてＨｙｂｏｎｄ　− Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移行させ、そして３２Ｐ−ラベル化ｃＤＮ Ａ断片（１０”ｃｐｍ／μｇ、２ｘｌＯ”ｃｐｍ／ｍＬ）によりプローブした。

プレハイブリダイゼーション（４２°Ｃにて１時間）及びハイブリダイゼーショ ン（４２°Ｃにて１６時間）を５０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、ＩＭ　ＮａＣ１ ，１％（ｗ／ｖ）ＳＯＳ、　１０％（宵／Ｖ）硫酸デキストラン中で行った。ハ イブリダイゼーションの段階で、変性したサケ精子ＤＮＡ　（１００μｇ／ｍＬ ）を２ｆｆｉＰ−ラベル化プローブと共に加えた。

フィルターを２ｘＳＳＣ／　１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ中で６５℃にて１−２時間洗 浄し、そして次に０．２ｘＳＳＣ／　１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ中で６５°Ｃにて０ ．５〜１時間洗浄した。フィルターを、増感スクリーンを用いて一７０℃にて４ ８時間コダックＸＡＲフィルムに感光した。

ＲＦＬＰ分析 ａ、ゲノムＤＮＡの単離 Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら（１９８３）が記載したのと実質的に同様にして、葉組 織からＤＮＡを単離した。ＤＮＡ調製物をＣｓＣ１浮力密度遠心（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら、１９８９）によりさらに精製した。

ｂ、サザンプロット ゲノムＤＮＡ（１０Ｐｇ）を６０ユニツトのＸｂａ　［により１６時間消化し、 そして０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを通して、ＴＡＥ（４０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ−アセテ−）、　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ）の泳動緩衝液中で電気泳動した。次に 、ＤＮＡを変性溶液（１，５Ｍ　ＮａＣ１１０，５Ｍ　Ｎａ０Ｈ）中で１−１． ５時間変性させ、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　／１．５Ｍ　Ｎａ Ｃｌ中で２〜３時間中和し、そして次にＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ　Ｎ（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）フィルターに２０ＸＳＳＣ中で移行させた。

ＯＧＢの段階３の花弁ＲＮＡから作られたｃＤＮＡ鋳型及び２つのオリゴヌクレ オチドブライマー、すなわち公表されたｃｈｉ　−Ａ　ｃＤＮＡ配列（ｖａｎ　 Ｔｕｎａｍら、１９８８）のヌクレオチド６〜２０をカバーする＃９．及びヌク レオチド７１１−７２５に対して相補的な＃１０を用いて合成した。

生ずるＰＣＲ生成物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍ２Ｓ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）のＳｍａ　［部位に連絡し、そして配列決定して、クローン化された断片が 公表された配列に対応することを確認した。

ＤＮＡプローブの３２Ｐ−ラベル化 ＤＮＡ断片（５０〜１０１００ｌを５０μｃｉのＣａ−”Ｐ）−ｄＣＴＰにより 、オリゴラベル化キット（Ｂｒｅｓａｔｅｃ）を用いて放射能ラベルした。取り 込まれなかった（α−”Ｐ）　−ｄＣＴＰは５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（Ｆｉ ｎｅ）カラムのクロマトグラフィーにより除去した。

ＤＮＡ配列分析 ５ａｎｇｅｒら（１９７７）の方法と実質上同様にして、５ｅｑｕｅｎａｓｅ酵 素（［ＪＳＢ、バージョン２．ｌ）を用いてＤＮＡ配列決定を行った。クローン １）ＣＧＰ６０２　、　ｐｃＧＰ１７６及び１）ＣＧＰ１７５の完全な配列を、 標準的クローニング方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて得られた異 るＭ２Ｓ−ｍｐ１８及び−ＩＩｌｐ１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら、１９８３　 ；　Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　１９８５）サブクローンからの配列の編集 により決定した。幾つかの領域については、オーバーラツプする配列データーを 得るために特定のオリゴヌクレオチドブライマーを合成する必要があった。この 目的のため（こ、次の６種のプライマーを合成した。

５’　ＣＧＴＧＣＣＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＧ　３’　プライマー配列１５’ＧＡ ＴＧＴＴＧＧＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧ　３’　プライマー配列２５’ＧＧＡＡＡＣ ＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＴＧ　３’　プライマー配列３５’　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴ（ＡＧＣ）　３’　プライマー配列４５’　ＧＴＴＴＴＣＣＣ ＡＧＴＣＡＣＧＡＣ３’　プライマー−４０５、ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡ ＴＧ　３’　逆プライマーこれらの配列の幾つかの位置を示すｐｃＧＰ６０２の 制限地図は図８に見られる。

Ｇｅｎｂａｎｋ　５Ｗ（ＳＳ−ＰＲＯＴ及びＥＭＢＬデータベースに対する相同 性の検索を、ＦＡＳＴＡ及びＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐ ｍａｎ、　１９８８）を用いて実施した。

ｐｃＣＰ２９３の作製 発現バイナリ−（ｂｉｎａｒｙ）ベクターｐＣＧＰ２９３は、Ｔｉｚ＜イナリー ベクターｐｃＧＮ１５５９　（ＭｃＢｒｉｄｅ及びＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、　１ ９９０）から誘導された。

プラスミドｐＣＧＮ１５５９を狼！で消化し、そして突出する３′−末端を標準 的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に行って７４ＤＮＡポリメラーゼによ り除去した。次に、ベクターを独創によりさらに消化し、そして生ずる５′突出 部をＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片を用いて修復した。次に、ベクタ ーを再連絡して９０ＧＰ６７を得た。Ｍａｃプロモーター。

ノス・ターミネータ−及び種々のクローニング部位を有する１、　９７ＫｂＰｓ ｔｌ断片（Ｃｏｍａｉ　ら、１９９０）を１）ＣＧＰ４０から単離し、そしてｐ ＣＧＰ６７のＰｓｔ部位に挿入してｐＣＧＰ２９３を得た。

９ＣＧＮ７３３４からＧＵＳ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７）をＢａ ｍＨＩ−Ｓａｃｌ断片として取り出し、そしてそれを、多クローニング部位を含 むプラスミドｐｃＧＰ４０を作製した。Ｍａｃ−ＧＵＳ−ｍａｓ遺伝子融合体を 含有する断片をｐＣＧＮ７３２９　（Ｃｏｍａｉ　ら、１９９０）のＸｈｏ　１ 部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＧＮ７３３４　（Ｃａｌｇｅｎｅ、 　Ｉｎｃ、　（ＣＡ）、米国）を作製した。

ｐｃＧＰ９０の作製 ｐｃＧＰ６０２からのｃＤＮＡ挿入部をｐＣＧＰ２９３のＭａｃプロモーター（ Ｃｏｍａ　ｉら、１９９０）の後にセンス方向にクローニングすることによりプ ラスミドｐｃＧＰ９０を作製した。ｃＤＮＡ挿入部を含有するＢａｍＨＩ−Ｋｐ ｎ　［断片を１１ＣＧＰ６０２から単離し、そしてｐＣＧＰ２９３のＢａｍＨ［ −Ｋｌ）ｎ　Ｉ消化物と連結した。ｐｃＧＰ９０中の挿入部の正しい挿入を、ゲ ンタマイシン耐性形質転換体から単離したＤＮＡの制限酵素分析により達成した 。

グ部位を含む７００ｂｐ断片を生成させた。この断片をｐＹＧＡ２２６９（Ａｓ ｈｉｋａｒｉら、１９８９）からの９　Ｋｂ　ＥｃｏＲｌ−Ｂｇｌ　Ｉ［断片と 連結した。

ｐＹＧＡ２２ｍと称する得られた構成は、酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフ ェートデヒドロゲナーゼプロモーターの下流に挿入されたマルチクローニング部 位を含んでいた（図１１）。

スミドＩ）ＣＧＰ６１８は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ プロモーターの後にセンス方向に連結されたｐｃＧＰ１７５　ｃＤＮＡ断片を含 んでいた（図１１）。

断片を、ｐＹＧＡ２２ｍｃρＣＧＰ６１８の作製について記載したように）がら の９ＫｂのＥｃｏＲ［−に９ｎ　Ｉ断片と連結した。得られるプラスミドｐｃＧ Ｐ６２０は、酵母グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモータ ーの後にセンス方向に連結された１ｌｃＧＰ１７６　ｃＤＮＡ断片を含んでいた 。

（１９８３）　ニ従ッテ、ｐｃＧＰ６１８及びｐｃＧＰ６２０　ニより形質転換 した。形質転換体を、Ｇ　−１３１５をトリプトファン自律合成性（ｐｒｏｔｏ ｔｒｏｐｈｙ）に回復させるそれらの能力により選択した。

ａ　、　Ｇ　−１３１５／　ｐｃＧＰ６１８トリプトファンを欠く培地上に増殖 したＧ　−１３１５／ＩＩＣＧＰ６１８及びＧ−１３１５復帰変異株の単一単離 体を用いて５０ｍＬのＹＮＢＣ（アミノ酸不含酵母ナイト口ジエンベース（Ｄｉ ｒｃｏ）１．２％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び０．３％（ｗ／ｖ ）カザミノ酸（Ｄｉｒｃｏ））に接種し、そして３０℃にて２日間振とうしなが らインキュベートした。細胞を遠心によりペレット化し、そしてミクロソーム画 分を０ｅｄａら（１９８５）に従って得たが、但し植物組織中の３’、５’−ヒ ドロキシラーゼ活性のアッセイのために使用される抽出緩衝液中でスフエコプラ ストを破砕した。ミクロソーム　ペレットを４００μＬの緩衝液Ａ　（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）１７．５）、　０．６５Ｍソルビトール、　０．　ｌａ ＋Ｍ　ＤＴＴ、　０．１＋ｎＭ　ＥＤＴＡ）中に懸濁し、そして１００μＬのサ ンプルを３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性についてアッセイした。

ｂ、　Ｇ１３１５／Ｉ）ＣＧＰ６２０ Ｇ　−１３１５／ｐｃＧＰ６２０　（７）単一単離体を用いて２０ｍ１ノＹＮＢ ｃニ接種し、次にこれを２日間３０℃にてインキュベートした。細胞を遠心分離 により集め、ＴＥにより１回及び緩衝液Ａにより１回洗浄し、そして次にザイモ リアーゼ１００　Ｔ　（０，１ｍｇ／ｍＬ）　（生化学工業）を含有する緩衝液 Ｂ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｉｌＨ７，５）、　１．２Ｍソルビトール 、　０．１　ｍＶ　ＤＴＴ。

０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。３０℃にて１時間のインキュベーショ ンの後、細胞を遠心分離によりペレット化し、そして４００μｌの緩衝液Ａ中に 再懸濁した。次に、細胞懸濁液をガラスピーズ（直径０．４ｍ＋ａ）と共に２分 間ポルテックスし、そして１００μＬのサンプルを３’、５’−ヒドロキシラー ゼ活性についてアッセイした。

ペチュニアの形質転換 ａ、植物材料 ペチュニア・ハイブリダ（Ｓｋｒ４　ｘ　５ｗ６３　、及びＲｐ５７　ｘ　Ｒｗ １４　）の種子を１．２５％（Ｗ／Ｖ）次亜塩素酸ナトリウム中で１０分間殺菌 し、そして無菌水中で３回洗浄した。殺菌された種子を１００ｍｇルのジベレリ ン酸（ＧＡＳ）溶液に１６〜２０時間浸漬した。次に、これらを、１％（Ｖ／Ｖ ）シュークロース及び０．８％（ｗ／ｖ）ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）バクトアガー を補充した１０％（ｗ／ｖ）ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及び５ｋｏｏｙ、　１９ ６２）上で２週間発芽させた。

若い実生を、３％（Ｗ／Ｖ）シュークロースが補充されたＭＳ培地に３週間移し 、次にシフイー・ビート（Ｊｉｆｆｙ　ｐｅａｔ）ペレット（ＪｉｆｆｙＰｒｏ ｄｕｃｔｓ　Ｌｔｄ、　ノルウェイ）に移し、高湿度のもとに保持し、そして２ 〜３週間光照射した（１３５μＥ、塩化゛水銀灯２２°Ｃ）。次に、これらの若 植物を成育キャビネット（６８μＥ、冷白色蛍光灯、２５°Ｃ）。

同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）のため、若い葉を収穫し、そして１ ．３５％（Ｗ／Ｖ）次亜塩素酸ナトリウム中で２分間殺菌し、次に無菌水中で３ 回洗浄した。次に葉組織を２５１１Ｉｍ！の正方形に切断し、そして０．０５ｍ ｇ九〇カイネチン及び１．０ｍｇルの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４ −Ｄ）を補充したＭＳ培地上で２４時間前培養した。

ｂ、アグロバクテリウムとペチュニア組織との共存培養バイナリ−ベクターｐｃ ＧＰ９０　（図１４）を含むアグロバクテリウム・ツメファシェンス　ＡＧＬＯ （Ｌａｚｏら、１９９１）を４℃にて、１００ｍｇ几のゲンタマイシンを含有す るＭＧ／Ｌ　（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ及びＮｅ５ｔｅｒ、　１９８０）寒天プレー ト上に保持した。１％（Ｗ／Ｖ）バクト・ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）バクト 酵母エキス及び１％（ｗ／ｖ）ＮａＣ１を含有する液体培地中で単一コロニーを 一夜増殖させた。次の日、３％（Ｗ／Ｖ）シュークロースを含有する液体ＭＳ培 地（ＢＰＭ）中への希釈により５Ｘ１０”細胞／［ＩＩＬの最終濃度を調製した 。葉のディスクを、ＡＧＬＯ／　Ｉ）ＣＧＰ９０を含有するＢＰＭ中に浸漬した 。次に葉のディスクを紙の上で乾燥し、そして共存培養培地上に４日装置いた。

共存培養培地は、０．０５ｍｇ几のカイネチン及び１．　Ｏｍｇ／Ｌの２．４− Ｄが補充された５Ｈ（Ｓｃｈｅｎｋ及びＨｉ　１ｄｅｂｒａｎｄｔ。

１９７２）から成り、そして共存培養培地に一面に拡がったタバコ細胞懸濁物の フィーダ一層及びそのタバコ細胞懸濁物の上に置かれた濾紙を含んでいた。

Ｃ，トランスジェニックペチュニア植物の再生共存培養の後、葉組織を次の選択 培地に移した：　５ｋｒ４　Ｘ　５ｗ６３のディスクは、３％（Ｗ／Ｖ）シュー クロース、２ｍｇ／Ｌのα−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、　１００　ｍｇ ルカナマイシン、　３５０　ｍｇルセファタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）及 び０．３％（Ｗ／Ｖ）ゼライト・ゼラン・ガム（Ｇｅｌｒｉｔｅ　Ｇｅ１ｌａｎ 　ＧｕｍＸスイス）を補充された新鮮なＭＳ培地へ；Ｒｐ５７　Ｘ　Ｒｗ１４の ディスクは、２ｍｇルのＢＡＰの代りに０．５　ｍｇ／ＬのＢＡＰ及びα−ナフ タレン酢酸（ＮＡＡ）を含有する同じ培地に。３週間後、再生しつつある外植片 を新鮮な培地に移した。カナマイシン選択に対して生き残った不定芽を、根の誘 導のため、１００　ｍｇ／Ｌカナマイシン及び３５０　ｍｇルセフオタキシムを 含有するＢＰＭに移した。すべての培養物を１６時間照射（６０μＥ、冷白色蛍 光灯）のもとで２３±２°Ｃに保持した。根が２〜３ＣＸ１の長さに達した時、 トランスジェニックペチュニア植物を、８ｃｍのチューブ中のオートクレーブ殺 菌されたＤｅｂｃｏ　５１４１０／２ボツトミツクスに移した。４週間後、植物 を同じポットミックスを用いる１５ａｎのポットに再移植し、そして１４時間照 射（３００μＥ、ハロゲン化水銀灯）のもとで２３°Ｃにて保持した。

タバコの形質転換 ａ、植物材料 ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）　（ｃｖ、Ｘａ ｎｔｈｉ）ストック植物は、１ｍｇ几のインドール酪酸（ＩＢＡ）が補充されそ して０．２５％（ｗ／ｖ）ゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）に上り固化されたＭＳ 培地上に維持した。葉の組織を２５ａｌの正方形に切断し、そして１ｍｇ几のＢ ＡＰ及び０．５ｍｇ几のインドール酢酸（ＩＡＡ）を含有するＭＳ培地に２４時 時間−た。

ｂ、アグロバクテリウムとタバコ組織との共存培養ペチュニアについて前記した ようにして共存培養を行った。

仁　トランスジェニックタバコ植物の再生共存培養の後、葉のディスクを、ｌｏ ｇ几のＢＡＰ、　０．５ｍｇ几のＩＡＡ。

１００　ｍｇ几のカナマイシン及び３５０　ｍｇルのセフオタキシムが補充され たＭＳ培地（選択培地）に移した。２〜３週間後、再生しつつある外植片を新鮮 な選択培地に移した。カナマイシン選択に対して生き残った不定芽を単離し、そ して根の誘導のため、１　ｍｇ／Ｌの［ＢＡ、　１００ｍｇルのカナマイシン及 び３５０　ｍｇ凡のセファタキシムを含有するＭＳ培地に移した。根が２〜３０ の長さに達した時、ペチュニアについて記載したようにして、トランスジェニッ クタバコ植物を土壌に移植した。

アンドシアニジンの分析 ＨＰＬＣ分析に先立って、花弁抽出物中に存在するアンドシアニン分子を酸加水 分解して、アンドシアニジン核からグリコジル成分を除去した。アントシアニン 色素のＢ環でのヒドロキシル化パターンをアンドシアニジン核分子のＨＰＬＣ分 析により決定した。この分析において使用したＨＰＬＣ系は多波長検出器（ＭＷ Ｄ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋ　ａｎｄ１０５０であった。５ｐｈｅｒｉ ｓｏｒｂ　Ｓ５０ＤＳ２力−トリツジカラム２５０ＨＬＩＩＸ４ｍｍＩＤ上で逆 層クロマトグラフ分離を行った。

ａ、アントシアニン及びフラボノイドの抽出孔の色素を、花弁の断片（約５０ｍ ｇ）から、１％（ｖ／ｖ）の水性６Ｍ塩酸を含有するメタノール５−により抽出 した。抽出物を水で希釈しく１：９）、そして濾過した（Ｍｉｌｌｅｘ　ＨＶ、 　０．４５　ｕ）後にＨＰＬＣ系に注射した。

ｂ、アンドシアニンの加水分解 前記ａ、において得た粗メタノール抽出物（１００μＬ）を室温にて乾燥窒素流 を用いてＰｉｅｒｃｅ　Ｒｅａｃｔｉ−Ｖｉａｌｓ中で蒸発乾固した。残渣を２ ００μＬの２ＭＨＣｌに溶解し、バイアルにキャップを付し、そして次に１００ °Ｃにて３０分間加熱した。加水分解混合物を水（１：９）で希釈し、そしてＨ ＰＬＣ分析に先立って濾過した（Ｍｉｌｌｅｘ　ＨＶ、　０．４５μ）。

Ｃ，クロマトグラフィー 花の色素の分離は、次の系を用いるグラジェント溶出により行った。

溶剤Ａ：　（トリエチルアミン：濃硫酸：　Ｈ，０）　（３：　２．５　：　１ ０００）溶剤Ｂニアセトニトリル グラジェント条件＝２０分間にわたり５％Ｂから４０％Ｂへ流速：ｌ−７分 カラム温度、３５℃ 検　出：　２８０．３５０及び５４６ｎｍでの同時データー取得によるＭＷＤア ントンアニジンのピークは既知標準との比較により同定した。

２．３’、５’−ヒドロキシラーゼのクローニング及び分析３’、５’−ヒドロ キシラーゼ酵素の特性決定ａ９発生段階による制御（Ｄｅｖｅｌａｐｍｅｎｔｎ ｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）前に定義した発達の異る段階における花から収穫し たｐ、ノｚイブリダｃｖ、　ＯＧＢの花弁の抽出物を３’、５’−ヒドロキシラ ーゼ活性について測定した。

ＯＧＢの花弁中の３’、５’−ヒドロキシラーゼ酵素活性は花冠の成熟の間に発 生段階による制御がされることが見出された（図２Ｂ）。

この発生的プロフィールはフラボノイド生合成に関与する他の遺伝子の発現と平 行した。３’、５’−ヒドロキシラーゼ酵素の活性、並びにカルコン（ｃｈａｌ ｃｏｎｅ）シンサーゼ（ＣＨＳ）、カルコンフラバノンイソメラーゼ（ＣＨＩ） 及びジヒドロフラボノールレダクターゼ（ＤＦＲ）遺伝子の発現は花の発達の段 階３〜４付近でピークとなった。

ｂ２葉組織における３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性の誘導フラボノイド色素 生合成経路の遺伝子は通常は葉組織中では発現されない。しかしながら、デルフ ィニジン色素の合成はＯＧＢの葉において、２％（Ｗ／Ｖ）グルコース溶液中強 い光のもとてのインキュベーションにより誘導された。これらの条件下で、３’ 、５’−ヒドロキシラーゼ酵素活性がＯＧＢ葉組織組織中出され得る。酵素活性 の最大誘導が９６時間のグルコース／高光処理の後に起こることが示された。こ れらの条件下で、幾つかの他の色素生合成遺伝子の発現も、発生中の花弁中に観 察されるレベルに匹敵するレベルに誘導された。

これらの結果から、Ｈｆｌ及び／又はＨｆ２遺伝子がグルコース／高光処理され た葉組織において誘導されると結論された。

ｃ、３’、５’　−ヒドロキシラーゼがシトクロムＰ４５０クラスの酵ＯＧＢ花 弁中の３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性はミクロソーム画分に関連しており、 そしてＮＡＤＰＨの存在に依存することが示された。活性は、−酸化炭素による ミクロソームの処理により、及びシトクロムＰ４５０酵素を特異的に不活性化す る２種類の阻害前、テトライクラシス（ｔｅｔｃｙｃｌａｓｉｓ）及び１−アミ ノベンゾトリアジン（Ｔａｔｏｎら、１９８８　；　Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９ ８５　；　Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら、１９８７）　、により阻害されることがで きた。

シトクロムＰ４５０配列について濃縮されたｃＤＮＡライブラリーの作製シトク ロムＰ４５０ｍＲＮＡの翻訳は膜結合ポリゾームにおいて起こる（Ｔａｋｅｍｏ ｒｉ及びＫｏｍｉｎａｍｉ、　１９８９）ｏ従って、シトクロムＰ４５０配列（ ３’、５’−ヒドロキシラーゼ配列を含む）について濃縮するため、段階３〜４ の花のＯＧＢの花弁から単離された膜結合ポリゾームＲＮＡを用いてｃＤＮＡラ イブラリーを作製した。段階３〜４の花からの花弁のＲＮＡの単離により　３′ 、５１−ヒドロキシラーゼ配列がこのライブラリーにおいて最高に代表されるこ とが保証された。なぜなら、３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性は発生のこの段 階において最大であることが示されたからである（前記及び図２Ｂを参照のこと ）。ｃＤＮＡライブラリー＃ｌと称する得られたライブラリーは２５０．０００ の一次組換体を含んでいた。

ペチュニアの花弁シトクロムＰ４５０ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅多数のシトクロムＰ ４５０が、を推動物、菌類、昆虫、細菌及び１種の植物（Ｎｅｂｅｒｔら、１９ ９１．　Ｂｏｚａｋら、１９９０）と、多様な生物体から配列決定されている。

これらすべての酵素の特徴は、特にヘム結合に関与するシスティン残基付近での 、多数の小さな配列保存領域の存在である。今日までに配列決定されているほと んどすべてのミクロソーム由来シトクロムＰ４５０のヘム結合ドメインにアミノ 酸配列Ｐ（Ｇ、　５）ＸＧＸＲＸＣＸＧが存在し、ここでＸはいずれのアミノ酸 であってもよい（図３）。このコンセンサス配列をＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅ ａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、　１９８８）を用いてＮＢＲＦ蛋白質データベー スと比較することにより、データベース中のすべてのミクロソーム性シトクロム Ｐ４５０配列についてこの領域付近のアミノ酸の存在頻度を決定した。この分析 が示すところによれば、ヘム結合ドメイン付近の各位置の最も共通なアミノ酸配 列は： ＦＭＰＦＧＡＧＸＲＸＣＬＧ アンダーラインを付した配列及び類似の配列をコードする遺伝子にハイブリダイ ズするようにオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴｌと称するこのオリゴヌク レオチドを下に示す。

５　’　−ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＩＣＣＩＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＧＧＩＧＣＩＧＧ−３ ’アンダーラインを付した部分は、ＰＣＲ生成物の方向性クローニングを促進す るためのＨｉｎｄｌ［Ｉ認識部位を含む追加の配列である。デオキシイノシン（ １）を含めることにより、２以上のコドンが同一のアミノ酸配列をコードし得る ようなコドンの使用の異る可能性がカバーされた。デオキシイノシンは類似の効 率でＡ、　Ｔ、　Ｇ及びＣに塩基対合する（Ｍａｒｔｉｎら、１９８５　；　０ ｈｔｓｕｋａら、１９８５）。

「材料及び方法」の項に記載したようにしてｃＤＮＡライブラリー＃ｌから得ら れたプラスミドＤＮＡを、オリゴ１及び２を用いての３６０ｂｌ）のシトクロム Ｐ４５０関連配列の増幅のための鋳型として使用した（図３）。オリゴ２は一２ ０プライマー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）の５′−末端にＧＣＮ４結合部位（Ｌｅ ｗ及びＫｅｍｐ、　１９８９）を付加したものに対応する。

ＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、そして生ずるプラスミ ドをｐＣＧＰ４５０と称した。ｐｃＧＰ４５０の５′−領域はすでに配列決定さ れているシトクロムＰ４５０分子に対して存意に相同性を有するポリペプチド配 列をコードする。

ペチュニアの花弁ｃＤＮＡライブラリーからのシトクロムＰ４５０同族体二！！ プラスミドｐＣＧＰ４５０を用いて、関連クローンについてｃＤＮＡライブラリ ー＃１　（６０，０００プラーク）をスクリーニングした。高ストリンジエンシ ー及び低ストリンジエンシーの条件下での２つの引続くハイブリダイゼーション を用いて、１ｌｃＧＰ４５０の兄第クローン及びシトクロムＰ４５０ｃＤＮＡの 第ニゲループの両者を検出した。兄第群のそれぞれの代表的ｃＤＮＡクローンを 次の段階の分析のために選択した。ｐｃＧＰ４５０の兄第クローンをｐｃＧＰ１ ４２と命名し、そして第ニゲループの代表を１１ＣＧＰ１４７と命名した。次に 、ｐＣＧＰ　１４７のコード配列のみを含む５ａｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片を用いて ｃＤＮＡライブラリー＃ｌからの１６，０００プラークを低ストリンジエンシー において再プローブした。このプローブとハイブリダイズする合計２０クローン を配列決定し、さらに２つのシトクロムＰ４５０同族体ｐＣＧＰ１５８及びＩ） ＣＧＰ１６０を同定することができた（図４Ａ）。

追加の花弁シトクロムＰ４５０同族体のＰＣＲにょる単離ペチュニアのクローン ｐｃＧＰ１４２及びｐｃＧＰ１４７並びにすでに配列決定されているアボカドの シトクロムＰ４５０配列（０’Ｋｅｅｔｅ及びＬｅｔｏ。

１９８９　；　Ｚｏｚａｋら、１９９０）の推定上のヘム結合ドメイン付近から の配列情報を「材料及び方法」の項に記載したのと同様にして用いて、前記３つ のシトクロムＰ４５０クローンの少なくとも２つによりコードされるアミノ酸配 列をカバーする第二の縮重オリゴヌクレオチド（オリゴ３）を設計した。このオ リゴヌクレオチドを用い、そして鋳型としてのｃＤＮＡライブラリー＃ｌ及び第 ニプライマーとしてのオリゴ４を用いて、ＰＣＲにより関連配列を増幅した（図 ３Ｂ）。サイズ範囲２５０〜５００ｂｐの反応生成物を「材料及び方法」の項に 記載したようにして単離し、そしてｆ（ａｌｔｏｎ及びＧｒａｈａｍ　（１９９ １）により記載されたｄｄＴを付加したｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにクロ ーン化した。クローン化されたＰＣＲ断片を配列決定し、第五のシトクロムＰ４ ５０同族体をコードすることが示された。ｐＣＧＰ４５４と称する１つのクロー ンを更なる分析のために選択した。

ｃＤＮＡライブラリー＃ｌからの更なるシトクロムＰ４５０同族体の単離シトク ロムＰ４５０同族体ｐｃＧＰ１４２．　ｐｃＧＰ１４７．　ｐｃＧＰ１５８及び ｐｃＧＰ１６０　リコード領域並びにｐＣＧＰ４５４からのｃＤＮＡ　（図４Ｂ 〜４Ｈ）を含む３２ｐ−ラベル化ＤＮＡ断片の混合プローブを用いて、関連配列 のために、ｃＤＮＡライブラリー＃ｌから５０．０００個のクローンをスクリー ニングした。低ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で合計１５２個のハイブ リダイズするクローンが検出された。ハイブリダイズするクローンから単離され たＤＮＡの配列分析により更なる１３の異るシトクロムＰ４５０同族体が同定さ れた。これらのクローン間で２つの密接に関連する兄第群が区別された。これら ２群のそれぞれのコード領域はＤＮＡレベルで９４％の相同性又は類似性を示し た。１つの兄第群の２つの代表ｐｃＧＰ１７４（図５Ａ）及ヒｐｃＧＰ１７６、 並ヒニ他ノ兄弟群の１つの代表ｐｃＧＰ１７５（図５Ｂ）を更なる研究のために 選択した。

シトクロムＰ４５０同族体のナサン及びＲＦＬＰ分析３’、５’−ヒドロキシラ ーゼをコードするｃＤＮＡの分子的特徴を有するシトクロムＰ４５０同族体区別 するためにノザン及びＲＦＬＰ分析を用いた。Ｐ、ハイブリダ中には３’、５’ −ヒドロキシラーゼ活性を制御する２つの遺伝子座Ｈｆｌ及び■２が存在する（ ｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇら、１９８４　；　Ｗｉｅｒｉｎｇ、　１９７４）　、　 Ｈｆ　１はＰ、ヒブリダの花の周縁及び管の両方において発現され、そして周縁 のみで発現されるＨｆ２に比べて非常に高いレベルの３’、５’−ヒドロキシラ ーゼ活性をもたらす。

ペチュニアの３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性も発生的且つ空間的に制御され る。通常の成育条件のもとで、この酵素は花弁組織においてのみ検出することが でき、花の発達段階の段階３〜４付近で最高レベルに増加しそして十分に開いた 花において低下する〔段階５；図２（Ｂ）を参照のこと〕。活性はまた、ある種 のストレス条件、例えば前記のグルコース／高光処理のもとて葉組織においても 誘導され得る。従って、３’、５’−ヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡク ローンは、酵素活性プロフィールと平行するＲＮＡプロット上の発現プロフィー ルを有すると予想された。さらに、Ｆ７　ハイブリダの３’、５’−ヒドロキシ ダーゼをコードする。ｃＤＮＡはクローの交配に由来する植物の２１代から単離 されたＤＮＡのＲＦＬＰ分析を用いて、種々のシトクロムＰ４５０同族体につい ての連鎖データーを得た。

Ｈｆ　１　／−遺伝子型は花の管に３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性を有する Ｆ２植物に帰属された。さらに、花弁の液胞のｐＨに影響を与える助遺伝子への 連鎖に基いて、Ｈｆ　１　／Ｈｆ　１遺伝子型をＦ、集団の植物に帰属させるこ とが可能であった（Ｗｉｅｒｆｎｇ及びｄｅＶｌａｍｉｎｇ、　１９８４）。

Ｖ２３親系（Ｈｆ　１　／Ｈｆ　１　’）はまた約６．２の花弁ホネジネー）ｐ Ｈをもたらすｐｈ　１　／ｐｈ　１遺伝子型を育していた。肋ｌ／−植物は５． ３の花弁ホモジネートｐＨを有するので、花弁ホモジネートのｐＨを測定するこ とによりＲ５１ｘ　Ｖ２３　Ｆ！集団内のｐｈｉ／Ｉ）ｈｌ　（Ｈｆｌ／Ｈｆ１ ）植物を区別することが可能であった。

Ｈｆ２及び匹遺伝子座間の連鎖を用いて、候補Ｈｆ２クローンを区別した。匹座 は、酵素カルコンフラバノンイソメラーゼをコードするＰ、ハイブリダｃｈｉＡ 遺伝子に対応することが示されている（　ｖａｎＴｕｎｅｎら、１９９１）　、 従って、ｃｈｉＡのｃＤＮＡクローンは、Ｆ２集団中の個体に跋又は他遺伝子型 を帰属させるためのＲＦＬＰ分析において使用することができた。Ｖ２３はＩｆ 　２　／Ｈｆ　２　、　Ｐｏ／Ｐａ遺伝子型を育するので、ｃｈｉＡプローブに より検出されるＶ２３様及びＲ５１様ＲＦＬＰパターンと跋及び旭パターンとの 同時分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔ　１ｏｎ）によりＨｆ２遺伝子座への連鎖を 決定することができた。

シトクロム２４５０同族体の３′−非翻訳領域に対応するｃＤＮＡ断片を使用し て、Ｖ２３　ｘ　Ｒ５１Ｆ、集団中の個々の植物から単離されたゲノムＤＮＡの サザンプロット及びＲＮＡプロットをプローブした。この分析により、ｃＤＮＡ 　クローンｐｃＧＰ１７４及びｐｃＧＰ１７５　ニ対応する遺伝子が３’、５’ −ヒドロキシラーゼ活性に平行する態様で発現されたこいることが示された。

ａ、　ｐｃＧＰ１７４ ’）　ロー　ンｐｃＧＰ１７４（図５Ａ）からノ３３０ｂｐ　ノＨｉｎｄｌ［［ −Ｋｐｎｌ　３　’　−断片はｌ？ＮＡ及びＩＩＮＡ　（７）両プロット上のハ イブリダイゼーションのパターンを与え、このパターンはこのクローンヵ＜Ｈｆ ｌ遺伝子座に対応することを示した（図６）。この遺伝子は周縁組織及び管組織 の両方で発現され、モして３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性と平行する発達プ ロフィールを有し、段階３の花弁周縁にピークを示した。葉においては発現は観 察されながったが、この組織においてグルコース／高光処理により誘導された。

さらに、ｈｆ　ｌ　／ｈｆ　１変異系Ｒ５１及び５ｗ６３の花弁組織中に遺伝子 の検出可能な発現は存在しなかった。これに対して、Ｈｆ　１　／Ｈｆ　ｌ系Ｖ ２３及び丁並びｌ：Ｖ２３　ｘ　Ｒ５１雑種ニオいては高レベルの発現が観察さ れた（Ｆｉｇ、６Ａ）。

集団において独立に分離する（ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）　２つのＲＦＬＰを検出し た。

ＲＦＬＰ＃１は強くハイブリダイズするＤＮＡバンドに対応し、他方ＲＦＬＰ＃ ２は弱（ハイブリダイズするバンドに対応した（図６Ｂを参照のこと）。

ｆ）ｈｌ／肋ｌ遺伝子型に帰属された１２の植物の１１がＲＦＬＰ＃１について Ｖ２３様パターンを有し、そして管において３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性 を有する４９の植物の内４９がＲＦＬＰ＃１についてＶ２３又はＶＲ様パターン のいずれかを有していた。さらに、全３２の植物について、ｃｈｉＡ（Ｐａ）　 ｌ：ツイテ（７）Ｖ２３．　ＶＲ及ヒＲ５１ＲＦＬＰハ９−シトＲＦＬＰ＃２（ ７）対応するパターンとの完全な同時分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が 存在した。

これらのデーターは、９ＣＧＰ１７４が３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性する ことの強力な証拠を提供した。

ｂ、　ｐｃＧＰ１７５ クロー　ンｐｃＧＰ１７５（図５Ｂ）　カラノ３２０ｂｐ　（ＤＨｉｎｄｌ［− Ｘｈｏｌ　３　’　−断片はＲＮＡ及びＤＮＡプロットの両者上のハイブリダイ ゼーションのパターンを与え、このパターンはこのクローンがＨｆ２遺伝子座に 対応することを示唆した（図７）。ノザン分析が示すところによれば、この遺伝 子はｐｃＧＰ１７４と同様に発生的に制御され、段階３のＯＧＢ花弁周縁におい て最大の発現を示すが、ＯＧＢの管組織においては発現は観察されなかった。こ の遺伝子はまた、Ｖ２３（Ｈｆ２／Ｈｆ２）　、　Ｔｈ７（Ｈｆ２／Ｈｆ２）、 及びＶ２３　ｘ　Ｒ５１雑種の花弁組織中でも発現された（図７Ａ）。

片は、Ｉ）ＣＧＰ１７４の３′側プローブ（ＲＦＬＰ＃２）に弱くハイブリダイ ズするＶ２３及びＲ５１ゲノムＤＮＡのＸｂａｒ消化により生成した同じゲノム 断片にハイブリダイズした。ｐＣＧＰ１７５の３′側プローブにより検出される Ｖ２３　、　ＶＲ及びＲ５１様ＲＦＬＰパターン並びにｃｈｉ−Ａ　（Ｐａ）に ついての対応するｌ？ＦＬＰパターンの完全な同時分離（Ｃｏ　−ｓｅｇｒｅｇ ａｔｉｏｎ）が存在した。

次に発現実験（下記参照のこと）は、ｐｃｃｐ　１７５及びｐｃＧＰ１７４の兄 弟（９ＣＧＰ１７６）の両者が３’、５’−ヒドロキシラーゼをコードしている ことを確認した。さらに、ｈｆｌ／ｈｆｌ、　ｈｆ２／ｈｆ２ペチュニアの変異 株におけるｐｃｃｐ　１７４の完全長バージョンの発現は増加した３′。

５′−ヒドロキシラーゼ活性、及び非−トランスジェニック植物において通常見 出される低い基底レベルを上回る３’、５’−ヒドロキシル化アントシアンの生 産をもたらした。ＲＦＬＰの結果と相まって、予備的配列分析から、ｐｃＧＰ１ ７４は対応する転写物の完全長クローンを代表せず、ｐｃＧＰ１７５が推定上の 開始コドンを含み、そして完全長ｃＤＮＡであると推定された。配列分析はさら に、ｐｃＧＰＩ７６はｐｃＧＰ１７４の一層長いバージョンであって、５′−末 端から１７６ｂｐ　ｉ：ＡＴＧ　コドンを含有することを示した。しかしながら 、この分析のみからは、ｐｃＧＰＩ７６がこの遺伝子の全コード領を含有するか 否かを確信して予想することは不可能であった。行って、Ｉ）ＣＧＰ１７４　／ Ｉ）ＣＧＰ１７６兄第群の一層長いクローンについて、ｅＤＮＡライブラリー＃ ２をスクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリー＃２からの約１．５Ｘ１０’個 の組換体を、ｐｃＧＰ１７４からの０．３３Ｋｂ町ｄｌＩ［−狼１３’−断片に ハイブリダイズするクローンについてスクリーニングした。ｐｃＧＰ６０１及び ｐｃＧＰ６０２と称するハイブリダイズするクローンを、更なる分析のために選 択した。ｐＣＧＰ６０１及び９ＣＧＰ６０２の両者は推定上の翻訳開始コドンを 含んでいたが、ｐｃＧＰ６０２はより長い５′−非翻訳領域を含んでいた。

クローンの配列決定のために適合された方法及びオーバーラツプする配列情報を 得るために使用されたオリゴヌクレオチドブライマー配列を示すｐｃＧＰ６０２ の制限酵素地図を図８に示す。

兄弟株ｐｃｃｐ　１７６及びｐｃＧＰ６０２のヌクレオチド配列及び推定される アミノ酸配列を図９に示す。同様に、図１０はｐｃＧＰ１７５のヌクレオチド配 列及び推定される翻訳生成物を示す。

ＬＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、　１９８８）によ り生ずる整列を用いて、ペチュニアの３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子によ りコードされるアミノ酸配列は９４％の位置的同一性を共有することが見出され た。ヌクレオチド配列は９４％同一であった。シトクロムＰ４５０の分類方式に 基いて、この配列の類似性は両遺伝子を同じファミリー／サブ−ファミリーに置 いた。３’、５’−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列はシトクロムＰ４５０スー パーファミリーのすでに特性決定された構成員のいずれとも４０％未満の同一性 を共有するので、対応する遺伝子は、他のすべてのＰ４５０遺伝子とは別の新し いＰ４５０ファミリーに属する。

酵母における１）ＣＧＰ１７５　ｃＤＮＡの発現ｐｃＧＰ１７５からのｃＤＮＡ 挿入部を酵母ベクターｐＹＧＡ２２ｍ中のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ ドロゲナーゼプロモーターの後にセンス方向に連結した。ｐＣＧＰ６１８（図１ １）と称する得られた構成物を酵母Ｇ−１３１５株（Ａｓｈｉｋａｒｉら、１９ ８９）に形質転換した。単一形質転換体を５０ｍＬのＹＮＢＣ中で３０℃にて２ 日間増殖させた。この培養物から調製したミクロソーム画分は３’、５’−ヒド ロキシラーゼ活性を有することが示されたが、非形質転換酵母から調製された同 等の画分は活性を育しなかった（図１２）。このことから、ｐｃＧＰ１７５から のｃＤＮＡ挿入部は３’、５’−ヒドロキシラーゼをコードしていると結論され た。

酵母におけるｐｃＧＰ１７６　ｃＤＮＡの発現ｐＣＧＰ　１７６からのｃＤＮＡ 挿入部を酵母ベクターｐＹＧＡ２２ｍ中のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ ドロゲナーゼプロモーターの後にセンス方向に連結した。ｐｃＧＰ６２０と称す る得られた構成物を酵母Ｇ−１３１５株に形質転換した。形質転換された酵母か ら調製された抽出物は３′。

５′−ヒドロキシラーゼ活性を育するが、非形質転換酵母から調製された同等の 画分は活性を育しないことが示された（図１３）。このことから、Ｉ）ＣＧＰ　 １７６からのｃＤＮＡ挿入部は３’、５’−ヒドロキシラーゼをコードしている ことが結論された。

における発現 ｐｃＧＰ６０２のｃＤＮＡ挿入部をＴｉ−バイナリ−ベクターｐＣＧＰ２９３の Ｍａｃプロモーターの後に連結した。ｐｃＧＰ９０　（図１４）と称する得られ た構成物を、アグロバクテリウム介在遺伝子移送を用いてＦ１ペチュニア雑種５ ｋｒｘ　Ｘ　５ｗ６３に導入した。５ｋｒ４　ｘ　５ｗ６３の葉ディスクをＡＧ ＬＯ／ｐｃＧＰ９０と共に同時培養し、そして５ｋｒ４　ｘ　５ｗ６３ゲノムへ の１）ＣＧＰ６０２ｃＤＮＡ挿入部の組み込みを、カナマイシン選択後に得られ た植物のサザン分析により確認した。

トランスジェニック植物は、非トランスジェニック５ｋｒ４　Ｘ　５ｗ６３雑種 よりも有意に高いレベルの３’、５’−ヒドロキシラーゼ酵素活性（図１５）及 び３’、５’−ヒドロキシル化アンドシアニン（表３Ａ）の両方を有していた。

５ｋｒ４　ｘ　５ｗ６３はＨｆｌ遺伝子及びＨｆ２遺伝子の両方についてホモ接 合性劣性であるが、低レベルの３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性が５ｋｒ４　 Ｘ　５ｗ６３の花弁抽出物において検出されるので（図１５）、これらの変異は 酵素生産を完全にはブロックしない。さらに、酸加水分解された５ｋｒ４　ｘ　 ５ｗ６３の花弁抽出物において低レベル（１００ａ　ｇ／ｇｍ）のマルビジン（ ｍａｌｖｉｓｉｎ）が検出された（表３Ａ）。Ｈｆ　１　ｃＤＮＡの導入が花弁 周縁組織中の３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性のレベルを増加させ（図１５） 、そしてトランスジェニック植物からの花弁の酸加水分解された抽出物は、非ト ランスジェニック対照において検出されたマルビジンの４倍のレベルをタバコ（ Ｎ、タバクムｃｖ　Ｘａｎｔｈｉ）の花は、唯一のアンドシアニジンとしてシア ニジンを生産する。ｐｃＧＰ９０によるタバコの形質転換は、シアニジンに加え て育意量のデルフィニジンの蓄積を導いた（表３Ａ）。

表３Ａ 色素分析 Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　１ｅｖｅｌｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ａｃｉｄ　ｈ ｙｄｒｏｌｙｓｅｄ　ｐｅｔａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ加水分解された花弁抽出物 中に見出されるアントシアニジンのレベル植　物　マルビジン　シアニジン　デ ルフイニジン（μｇ／ｇｍ花弁）（μｇ／ｇｍ花弁）（μｇ／ｇｍ花弁）Ｓｋｒ ４　ｘ　５ｗ６３　１００　ｎｄ’　ｎｄＳｋｒ４　ｘ　５ｗ６３／ｐｃＧＰ９ ０　４１０　ｎｄ　ｎｄ非同時培養対照　ｎｄ　２７２　ｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｎｄ　２２９　３６トランスジエニツ クタバコ 検出されず。

ｃ、　ｈｆｌ／ｈｆ１．　ｈｆ２／ｈｆ２　Ｐ、　ハイブリダＦＩ雑種Ｒｐ５７ 　Ｘ　Ｒｗ１４における発現 ｐｃＧＰ９０．及び５ｋｒ４　Ｘ　５ｗ６３について使用したのに類似する方法 を用いて、ペチュニアＲｐ５７　Ｘ　ＲｗｌＪ系を形質転換した。トランスジェ ニック化はかなりの量のベチュニジン及びマルビジンを生産し、これらは非形質 転換植物中では検出されなかった（表３Ｂ）。ペチュニジン及びマルビジンはい ずれもデルフィニジンのメチル化誘導体である。

表３Ｂ 高ｐｉ（系Ｒｐ５７　ｘ　Ｒｗ１４の色素分析酸加水分解された花弁抽出物中に 見出されるアントシアニジンの％植　物　シアニジン　ペオニジン　ペチュニジ ン　マルビジン（％）　（％）　（％）　（％） ペチュニア Ｒ１］５７　ｘ　Ｒｗ１４　５．０　９５．０　０　０Ｒｐ５７　ｘ　Ｒｗ１４ 　０　４５．２　７．８　４７．０／ｐｃＧＰ９０ 顕著な効果を有した。非トランスジェニック花の雄ずい集及び雄すい組織が白い が、トランスジェニック植物の同じ組織は青／紫色であった。さらに、５ｋｒ４ 　ｘ　５ｗ６３雑種におけるＨｆ　１　ｃＤＮＡの発現は、通常は非常に淡いピ ンクである花冠深いピンク／スミレ色の色合いを与えた。タバコの場合、デルフ ィニン誘導体の生産は老化つつある花をわずかに青くした。Ｒｐ５７　ｘ　Ｒｗ １４雑種におけるＨｆ　１　ｃＤＮＡの発現はやはり花の色に顕著な効果を有し た。非トランスジェニックＲｐ５７ｘ　Ｒｗ１４の花はピンクであり、主たるア ントシアニジンであるペオニジンが存在した（表３Ｂを参照のこと）。Ｈｆ　ｌ 　ｃＤＮＡによる形質転換は花の色を顕著に青くした。

観察される色の変化はまた、Ｒｏｙａｌ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　５ｏｃ ｉｅｔｙ’５Ｃｏｌｏｒ　Ｃｈａｒｔからの番号として記載することができる。

一般に、変化は色を６０Ｃ／Ｄ−６５Ｃ／Ｄの淡青〜中間ピンク色調から、７ｏ と８５の間のカラースクエアーのすべてではないが多くによって代表される暗青 ／紫色調に動かすものとして記載することができる。達成され得る可能な色の変 化を限定することは望まないが、５ｋｒ４　ｘ　５ｗ６３雑種において観察され る色の幾つかは、６５Ｂ（非形質転換）から７０８及び７４Ｂ（いずれも形質転 換されている）への変化を有するものとして記載することができよう。同様に、 Ｒｐ５７　ｘ　Ｒｗ１４雑種における幾つかは６４Ｃから７２Ｂ、　７７Ｂそし て８２Ｂに動くものとして記載することができよう。他の生化学的及び生理学的 条件が佃々の結果に影響を与えるであろうこと、及び達成される特定の色への言 及は可能な範囲を定義するものと解釈すべきでないことを記憶すべきである。

他の植物種における推定上の３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子配列の検出 ３’、４’、５’−ヒドロキシル化フラボノイドの存在は３′。

５′−ヒドロキシラーゼ活性、そしてそれ故に３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺 伝子に関連する。他の種からのこれらの遺伝は低ストリンジエンシー条件下でペ チュニアの３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子とハイブリダイズするであろう 。ＲＮＡ　Ｃ図１６）及び／又はＤＮＡ（ｌｌｆｆｌ１７）を多数のデルフィニ ジン生産植物から単離し、ＩＰ−ラベル化Ｈｆ　１　ｅＤＮＡによりプローブし 、そして異るストリンジエンシー条件下で洗浄した。すべての例においてハイブ リダイズするバンドを検出した。従って、他のピルフィニジン生産植物からの３ ’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子の単離は、プローブとしてペチュニアの３’ 、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子を用いて可能である。

ここに記載した発明は、具体的に記載したちの以外の変更が可能であることを当 業者は認識するであろう。本発明はこの様な変更のすべてを包含すると理解すべ きである。本発明はまた、本明細書の個々に又は集合的に言及され又は示される 段階、特徴、組成物及び化合物、並びに該段階又は特徴の２以上の任意のそして すべての組合せを包含する。

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Ａ、Ｇ、Ｍ、　Ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｐｓ−Ｌｏｃｕｓ　ｍａｐｓ　ｏｆ 　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｇｅｎｏｍｅｓ、５ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏ氏B ５ｔｅｐｂｅｎ　Ｊ、０’Ｂｒ１ｅｎ（Ｅｄ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ。

１９９０゜ Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ、　Ｓ、　Ｊ、　、　Ｗｏｏｄ、　Ｊ、及びＦｌｉｃｋ、 　Ｊ、　Ｂ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　ＲｅｐA　１　：１９ −２１．１９８３゜ Ｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ、Ｐ、、Ｇｅｒａｔｓ、Ａ、Ｇ、Ｍ、、Ｗｉｅｒｉｎｇ、 Ｈ，及びＷｉ　ｊｓｍａｎ、Ｈ，Ｊ、Ｗ、ＰｌａｎｔＭｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒ ｅｐ、　２（２）　：２１−４２．１９８４゜Ｄｏｏｄｅｍａｎ、　Ｍ、　、　 Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、　Ｇ、　Ｍ、　、　Ｓｃｈｒａｍ、　Ａ、　Ｗ、　、　ｄ ｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ、　ＰA及びＢｉａｎｃｈｉ。

Ｆ、　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｌ）１．　Ｇｅｎｅｔ、　６７：３５７−３６６、１ ９８４゜Ｅｂｅｌ、　Ｊ、及びｔ（ａｈｌｔ＋ｒｏｃｋ、に、、　Ｉｎ　Ｔｈｅ 　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃ■ Ｓｉｎｃｅ　１９８０．　Ｉ（ａｒｂｏｒｎｅ、　Ｊ、　Ｂ、　（Ｅｄ、　）、 　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　hＪＳＡ。

６４１−６７９．１．９８８゜ Ｆｏｒｋｍａｎｎ、Ｇ、Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｒｉｇ　１０６　二１−２６ ．１９９１　。

Ｆｏｒｋｍａｎｎ、　Ｇ、及び５ｔｏｔｚ、　Ｇ、　Ｚ、　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓ ｃｈ　３６ｃ：４１１−４１６．１９８１゜Ｇａｒｆ　ｉｒ＋ｋｅ１．　Ｄ、　 Ｊ、及びＮｅ５ｔｅｒ、　Ｅ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ、　１４４ニ ア３２−７４３．１９８O　。

Ｈａｇｍａｎｎ、　Ｍ、　、　Ｈｅ１１ｅｒ、　Ｗ、及びＧｒｉｓｅｂａｃｈ、 　Ｈ，Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３４：５４７|５５４゜ １９８３゜ ）（ａｈｌｂｒｏｃｋ、　Ｋ、及びＧｒｉｓｅｂａｃｈ、　Ｈ，Ａｎｎｕ、　Ｒ ｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３０：１０５−１R０゜ １９７９゜ Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　１６６：５５７．１９８ ３゜Ｈａｒｂｏｒｎｅ、　Ｊ、　Ｂ、及びＳｉｍｍｏｎｄｓ、Ｎ、ｌＶ、Ａｎｒ ＋ｕ、Ｒｅｐ、Ｊｏｈｎ　Ｌｎｎｅｓ　Ｉｎ５ｔ、５３：２９−３０、１９６２ ゜ Ｈｅ１ｌｅｒ、Ｗ、及びＦｏｒｋｍａｎｎ、Ｇ、　ｌｎ：Ｔｈｅ　Ｆｌａｖｏｎ ｏｉｄｓ、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｉｎｃｅ　１９８０． Ｈａｒｂｏｒｎｅ、Ｊ、Ｂ、（Ｅｄ、）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ、１９８８゜Ｈｏ１ｔｏｎ、　Ｔ、　Ａ、　及びＧｒａｈａｍ、Ｍ 、Ｗ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９＋１１５６．１９ ９１゜Ｉｎｏｕｅ、　Ｈ，、Ｎｏｊｉｍａ、　Ｈ，及び０ｋａｙａｒｎａ、　Ｈ ，Ｇｅｎｅ　９６：２３−２８．１９９０゜ｒｔｏ、　Ｈ，、Ｆｕｋｕｄａ、　 Ｙ、　、　Ｍｕｒａｔａ、　Ｋ、及びＫｉｍｕｒａ、　Ａ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、　、　１５３F　１６３− １６８、１９８３゜ Ｊｅｆ　ｆｅｒｓｏｎ、　Ｒ，Ａ、　、　Ｋａｖａｎａｇｈ、　Ｔ、　Ａ、及び Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、　Ｗ、　ＥＭＢＯＪ、　６（１３）　：R９０１− ３９０７、１９８７゜ Ｋｏｅｓ、Ｒ，Ｅ、　、　５ｐｅｌｔ、　Ｃ，Ｅ、、　ｌ？ｅｉｆ、Ｈ，Ｊ、、 　ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ、　Ｐ、　Ｊ、Ｍ、　、　Ｖ■撃狽汲≠高吹B Ｅ、及びＭｏ１．　Ｊ、　Ｎ、　Ｍ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ ４（１３）　：５２２９−５２３９．１９８６゜Ｌａｒｓｏｎ、　Ｒ，Ｌ、及び Ｂｕｓｓａｒｄ、　Ｊ、　Ｂ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８０＋４８３ −４８６．１９８６゜Ｌａｚｏ、　Ｇ、　Ｒ，、Ｐａ５ｃａ１．　Ａ、　Ｓ、及 びＬｕｄｅｉｇ、Ｒ，Ａ、Ｂｉｏ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：９６３−９６７ ゜Ｌｅｗ、　Ａ、　Ｍ、及びＫｅｍｐ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　１７（１４）　：５８５９−５８６０．１９８９K ＭｃＢｒｉｄｅ、　Ｋ、　Ｅ、及びＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、に、Ｒ，Ｐｌａｎｔ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１４：２６９−１３：８９２７−８９ ３８．１９８５゜Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｊ、　Ｍ、　、　Ｄｏｓｔａｌ、　Ｌ、 　Ａ、及びＢｅｎｄ、　Ｊ、　Ｒ，Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｅｏｌｏｇｙ　ａｎｄＥ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｅｓ　２３５（１）：１８６− １９０．１９８５６Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓ ａｃ、　８５　：２１４９．１９６４゜Ｍｕｒａｓｈｊｇｅ、　Ｔ、及びＳｋｏ ｏｇ、Ｐ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ　１５ニア３−９７．１９６２゜Ｎｅｂ ｅｒｔ、　Ｄ、　Ｗ、　、　Ｎｅ１ｓｏｎ、　Ｄ、　Ｒ，、Ｃｏｏｎ、　Ｍ、　 Ｊ、　、　Ｅｓｔａｂｒｏｏｋ−Ｒ，Ｗ、　、　Ｆｅ凾■窒■奄唐■氏B Ｒ，、Ｆｕ　ｊｉｉ−Ｋｕｒ　ｉｙａｍａ、　Ｙ、　、　Ｇｏｎｚａｌｅｚ、　 Ｆ、　Ｊ、　、　Ｇａｅｎｇｅｒｉｃｂ、　Ｆ、　Ｐ、　、@Ｇｕｎｓａｌｕｓ 。

１、　Ｃ，Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ、　Ｅ、　Ｆ、　、　Ｌｏｐｅｒ、　Ｊ、　Ｃ，、 ５ａｔｏ、　Ｒ，、Ｗａｔｅｒｍａｎ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｗａ■高≠氏A　Ｄ、　 Ｊ。

ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１０：１−ｔ４．１９９１　。

Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ、　、　Ｋｅｍｐ、　Ｔ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ 、　Ｇｅｎｅ　２６：ｌＯｌ、　１９８３＋１０ｅｄａ、　Ｋ、　、　５ａｋａ ｋｊ、　Ｔ、、及びＯｈｋａｗａ、　Ｈ，ＤＮＡ　４：２０３−２１０．１９８ ５゜０’　Ｋｅｅｆｅ、　Ｄ、　Ｐ、及びＬｅｅｏ、　Ｋ、　Ｊ、　Ｐｌａｎｔ 　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８９；１１４１−１１４９．１９８９゜０ｈｔｓｕｋａ、 　Ｅ、　、　Ｍａｔｓｕｋｉ、　Ｓ、　、　Ｉｋｅｈａｒａ、　Ｍ、　、　Ｔａ ｋａｈａｓｈｉ、　Ｙ、及びＭａｔｓｕｂ≠窒＝B Ｋ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０（５）　：２６０５−２６０８． １９８５゜Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｗ、　Ｒ，及びＬｉｐｍａｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｐ ｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８５：２４S４− ２４４８、１９８８゜ Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ、　Ｗ、　、　Ｆｒｉ　ｔｓｃｈ、　Ｈ，、Ｇｒａｅｂｅ 、　Ｊ、　Ｅ、　、　５ａｕｔｅｒ、　Ｈ，及びＪｕｎｇ、i。

Ｐｅ５ｔｉｃｉｄｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　２１＋２４１−２５２．１９８７゜Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　、　Ｆｒ１ｔｓｅｈ、　Ｅ、　Ｆ、及びＭａｎｉａｔｉ ｓ、Ｔ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏ ｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、　ＵＳＡ、　１９８９゜ Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、及びＣｏｕｌｓｏｎ、　Ａ 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ`　７４： ５４６３−５４６７、１９７７゜ ５ｃｈｅｎｋ、　Ｒ，Ｕ、及びＨｉｌｄｅｒｂｒａｎｄｔ、　Ａ、　Ｃ，Ｃａｎ 、　Ｊ、　Ｂａｔ、　５０　：１９９−２０４．１９７２゜５ｃｈｒａｌＩ１． 　Ａ、　Ｗ、　、　Ｊｏｎｓｓｏｎ、　Ｌ、　Ｍ、　Ｖ、及びＢｅｎｎ１ｎｋ、 　Ｇ、　Ｊ、　Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ狽窒凵@ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉ ｄａ、　Ｉｎ：Ｐｅｔｕｎｉａ　５ｉｎｋ、に、Ｃ。

（ｅｄ、　）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｇｅｒｍａ ｎｙ　ｐｐ　６８−７５．１９８４゜５ｔａｆｆｏｒｄ、　Ｈ，Ａ、　Ｆｌａｖ ｏｎｏｉｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓａ＋、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　Ｂｏ ｃａ　ＲａｔｏｎB Ｆｌｏｒｉｄａ、　ＵＳＡ、　１９９０゜５ｔｏｔｚ、　Ｇ、及びＦｏｒｋｍａ ｎｎ、　Ｇ、　Ｚ、　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ　３７ｃ：　１９−２３．１９８ ２゜５ｔｏｔｚ、　Ｇ、　、　ｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ、　Ｐ、　、　Ｗｉｅｒｉ ｎｇ、　Ｈ，及びＦｏｒｋｍａｎｎ、　Ｇ、　Ｔｈｅｏｒ、　Ａ垂垂垂戟B Ｇｅｎｅｔ、７０：３００，１９８５　。

Ｔａｋｅｄａ、　Ｋ、　、　Ｋｕｂｏｔａ、　Ｒ，及びＹａｇｉｏｋａ、　Ｃ， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４：１２０７．１９８５K Ｔａｋｅｍｏｒｉ、　Ｓ、及びＫｏｍｉｎａｍｉ、　Ｓ、　Ｃｙｔｏｅｈｒｏａ ＋ｅ　Ｐ２Ｓ５．　Ｔｏｋｙｏ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、　Ｊａｐａ ｎ、　１９８９゜Ｔａｔｏｎ、　Ｍ、　、　Ｕｌｌｍａｎ、　Ｐ、　、　Ｂｅｎ ｅｖｅｎｉｓｔｅ、　Ｐ、及びＲａｈｉｅｒ、　Ａ、　ＰｅｓｔｉｃｉｄｅＢｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　３０：１７８−１８９ ．１９８８゜ＴｕｒＱｎ、　Ｔ、　Ｈ，及びＧｒｉｆｆｉｔｈ、０．Ｍ、Ｂｉｏ 　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：１１−１５．１９８６゜ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ、　 Ａ、　Ｊ、　、　Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、　Ｇ、　Ｍ、及びＭｏ１．　Ｊ、　Ｎ、 　Ｍ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂ奄盾戟A　Ｒｅｐ。

８：５０−５９．１９９０゜ ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ、　Ａ、　Ｊ、　、　Ｋｏｅｓ、　Ｒ，Ｅ、　、　５ｐｅｔ ｔ、　ｃ、　Ｅ、　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ、　Ａ、　ＲC、５ｔｕｉｔｊｅ 。

Ａ、　Ｒ，及びＭｏ１．　、　Ｊ、　Ｎ、　Ｍ、　ＥＭＢＯＪ、　７（５）　： １２５７−１２６３．１９８８゜ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ、　Ａ、　Ｊ、　、　Ｍｕ ｒ、　Ｌ、　Ａ、　、　Ｒｅｃｏｕｒｔ、に、　、　Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、　Ｇ 、　Ｍ、及びlｏ１．　、　Ｊ、　Ｎ。

Ｍ、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　３：３９−４８．１９９１　。

ｖｏｎ　Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｐ、）ｌｅｒｅｄｉｔａｓ　６ ０：３１７−３４６．１９６８　。

Ｖｅｒｃｒｕｙｓｓｅ、　Ｓ、　Ａ、　Ｒ，、Ｄｅｌｅｏｕｒ、　Ｊ、　Ａ、及 びＤｏｎｄｅｙｎｅ、　Ｐ、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ≠垂■■ ３２４：４９５〜４９７．１９８５゜ Ｗａｌｌｒｏｔｈ、　Ｍ、　、　Ｇｅｒａｔｓ、　Ａ、　Ｇ、　Ｍ、　Ｒｏｇｅ ｒｓ、　Ｓ、　Ｇ、　、　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、及びＨ盾窒唐モ■B Ｒ，Ｂ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０２：６−１５．１９８６゜ Ｗｉｅｒｉｎｇ、Ｈ，ａｎｄ　Ｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ、Ｐ、　Ｉｎｈｅｒｉｔａ ｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆＰｉｇｍｅｎｔｓ、　Ｉｎ： Ｐｅｔｕｎｉａ　５ｉｎｋ、　Ｋ、　Ｃ，（Ｅｄ、　）、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ、　ＢｅｒｌｉｎB Ｇｅｒｍａｎｙ　１１ｐ４９−６５．１９８４゜Ｗｉｅｒｉｎｇ、Ｈ，Ｇｅｎｅ ｎ　Ｐｈａｅｎｅｎ　１７（１−２）：１１７−１３４．１９７４゜Ｙａｎｉｓ ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、 Ｇｅｎｅ　３３：１０３．１９８５゜ＦＩＧＵＲＥ　ＩＡ ＦＩＧＵＲＥ　４Ｂ ＦＩＧＵＲＥ４Ｃ ＦＩＧＵＲＥ　４Ｄ ＦＩＧＵＲＥ４Ｅ Ｖａｌ　工１ｅ　Ｐｈｅ ＦＩＧＵＲＥ　４Ｆ ｐＣＧＰ　１６０ Ａ　Ｓ　Ｍ　Ｘ　ＨＫ　Ｆ　−−−一−−−−ＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡ ＡＧＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＡＴＡＡＡＡＡＣＴＣＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡ ＴＡＴＴＧＣＴＧＴＡＴＣＴＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧ ＣＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＣＴＡＴＡＧＧＴＣ ＡＴＡＣＣＴＡＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＦＩＧＵＲＥ　４Ｇ −ＲＥＳＭＥＤＶＲＬＬＧ ＹＨＩＰＡＫＴＲＬＦ’　工　Ｎ ＴＡＴ　ＣＡＣＡＴＡ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＭＡ　ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＣＴＣＴＴＴ 　ＡＴＣＭＴＡＷＴＭＧＲＤＰＬＴＷＥ ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　ＧＡＣＣＣＡ　ＣＴＡ　Ａ ＣＡ　ＴＧＧ　ＧＡＡＮＰＥＥＹＱＰＥＲＦ’ＬＮ ＡＡＴ　ＣＣＡ　ＧＭ　ＧＡＧ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　Ｔ ＴＣＴＴＧ　ＡＡＴＲＤＴＤＶＫＧＶＮＦＥＦ’ ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＧＴＣＡＡＡ　ＧＧＡ　ＧＴＡ　ＡＡＣＴＴ Ｔ　ＧＡＧ　ＴＴＣＩＰＦ’ＧＡＧＲ３ ＦＩＧＵＲＥ　４Ｈ ＣＴＴＴＣＴＡＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴＣＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＡＡＴ ＴＧＴＧＡＣＴＴＴｌｏ　２０　３０　４０ ＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＡＡＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＣ ＴＴＧＡＴＣＡＡＡＭＬ ＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＧＣＣＡＴＡＴＡＣＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＣＡ ＴＧＡＴＧＣＴＡＣｌｏｏ　１１０　１２０　１３０ Ｌ置ＧＡＡＴＳＩＦＬＩＡＨ １１１ＳＴＬ　工　ＳＫＴＴＧＲＨＬ ＴＭＴＣＡＴＴＴＣＭＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＧＧＣＣＧＧ ＣＡＴＣＴＡＣＰＰＧ　Ｐ　ＲＧＷＰＶＩＧＡＬＰＬ ＣＧＣＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＧＧＡＧＣＡＣ ＴＴＣＣＡＣＴＴＴＬＧＡＭＰＨＶＳＬＡＫＭＡＫＫ ＴＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＣＣＡＣＡＴＧＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＡＡＡＡＴＧＧ ＣＡんυす講ＡＴＹＧＡＩＭＹＬＫＶＧＴＣＧＭＡ ＶＡＳＴＰＤＡＡＫＡＦＬＫＴＬ ＤＩＮＦＳＮＲＰＰＮＡＧＡＴＨ ＲＷＫＬＬＲＫＬＳＮＬＨＭＬＧ ＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＴＡＡＧＣＭＣＴＴＧＣＡＴＡＴ ＧＣＴＡＧＧＧＧＦＩＧＵＲＥ　９Ａ ＧＫＡＬＥＮＷＡＮＶＲＡＮＥＬ ＲＶＶＶＡＥＭＬＴＦＡＭＡＮＭ ＧＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＣＭＴＡＴＧＡＶＥＶＮＥＦ”ＫＤＭＶＶＥＬＭＴ ＡＴＴＹＥＲＫＧＫＰＤＦＬＤＶ ＦＩＧＵＲＥ　９Ｂ ＦＩＧＵＲＥ　９Ｃ ＦＩＧＵＲＥ　９Ｄ ＦＩＧＵＲＥ　ｌ０Ａ ＶＩＬＳＫＲＶＦＶＮＫＧＶＥＶ ６４０　６５０　６６０　６７Ｏ ＮＮＲＲＬＬＥＳＤＩＰＮＬＰＹ ＦＩＧＵＲＥ　ＩＯＢ ＤＶＹＡＰＬＡ　★ ＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＡＧＴＡＴＭＴＧＴＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＴ ＡＴＡＧＡＡＡＴＦＩＧＵＲＥ　ＩＯＣ 国際調査報告　−一□８゜ ＰＣＴＩＡＷ ＰｅｎｓＰＣｒｎ３Ａ／２ＩｌｌＬａａｐａｍｍｋｗｓｏｆｆｉｎ＋−ｄｌｌＩ ｊｕ１７１９９２１□国際調査報告　い。１．１・□Ｎ。

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Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．ジヒドロカンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｍｒｏｌ；ＤＨＫ ）ヒドロキシル化酵素又はその誘導体もしくは部分をコードするか、又はこれを コードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含で成る核酸単離体。
2. ２．前記核酸がＤＮＡ又はｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸単離体。
3. ３．前記酵素が３′，５′−ヒドロキシラーゼである、請求項１又は２に記載の 核酸単離体。
4. ４．前記酵素がペチュニア、バーベナ、ヒエンソウ、ブドウ、アイリス、フリー ジア、アジサイ、シクラメン、ポテト、パンジー又はナス由来である請求項１〜 ３のいずれか１項に記載の核酸単離体。
5. ５．前記酵素がペチュニア由来である、請求項４に記載の核酸単離体。
6. ６．図９又は１０に記載されているか又はそれに対して少なくとも４０％の類似 性を有するヌクレオチド配列の実質的にすべて又は部分を含んで成る核酸配列を 有する、請求項４又は５に記載の核酸単離体。
7. ７．トランスジェニック植物に存在する場合の請求項１〜６のいずれか１項に記 載の核酸単離体。
8. ８．前記トランスジェニック植物がパラ、ペチュニア、キク、カーネーション、 ガーベラ、ゼラニウム又はユリズイセンである、請求項７に記載の核酸単離体。
9. ９．トランスジェニック植物がバラ又はペチュニアである請求項８記載の核酸単 離体。
10. １０．核酸単離体を植物細胞又は組織に移行させることができるベクター分子中 に含まれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸単離体。
11. １１．前記移行がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）との共存 培養を必要とする、請求項１０に記載の核酸単離体。
12. １２．前記ベクター及び核酸単離体が図１１に示すｐＣＧＰ９０である、請求項 １０又は１１に記載の核酸単離体。
13. １３．組換えジヒドロカンフェロール（ＤＨＫ）ヒドロキシル化酵素又はその誘 導体もしくは部分。
14. １４．前記酵素が３′，５′−ヒドロキシラーゼである、請求項１３に記載の組 換え酵素。
15. １５．前記酵素がペチュニア、バーベナ、ヒエンソウ、ブドウ、アイリス、フリ ージア、アジサイ、シクラメン、ポテト、パンジー及びナス由来である、請求項 １３又は１４に記載の組換え酵素。
16. １６．前記酵素がペチュニア由来である、請求項１５に記載の組換え酵素。
17. １７．図９又は１０に記載の又はそれに対して少なくとも４０％の類似性を有す るアミノ酸配列の実質的にすべて又は部分を含んでなるアミノ酸配列を有する、 請求項１５又は１６に記載の組換え酵素。
18. １８．トランスジェニック植物中に存在する場合の請求項１３〜１７のいずれか １項に記載の組換え酵素。
19. １９．前記トランスジェニック植物がバラ、ペチュニア、キク、カーネーション 又はガーベラである、請求項１８に記載の組換え酵素。
20. ２０．前記トランスジェニック植物がバラ又はペチュニアである、請求項１９に 記載の組換え酵素。
21. ２１．組換えジヒドロカンフェロール（ＤＨＫ）ヒドロキシル化酵素を発現する ことができるか、又はＤＨＫヒドロキシル化酵素に翻訳できるｍＲＮＡ分子の全 部もしくは部分に実質的に相補的な核酸配列の転写を指令するトランスジェニッ ク植物の製造方法であって、請求項１又は６に記載の核酸単離体を該核酸単離体 の最終的発現を可能にする条件下に適当な植物の細胞に導入し、該細胞からトラ ンスジェニック植物を再生し、そして該トランスジェニック植物を前記核酸単離 体の発現を可能にするのに十分な時間及び条件下で成長せしめる、ことを含んで 成る方法。
22. ２２．前記組換え酵素が３′，５′−ヒドロキシラーゼである、請求項２１に記 載の方法。
23. ２３．前記核酸単離体の発現が発生段階により制限される、請求項２１又は２２ に記載の方法。
24. ２４．前記組換え酵素がペチュニア、バーベナ、ヒエンソウ、ブドウ、アイリス 、フリーシア、アジサイ、シクラメン、ポテト、パンジー又はナス由来のもので ある、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．前記組換え酵素がペチュニア由来のものである、請求項２６に記載の方法 。
26. ２６．前記核酸単離体又は酵素が図９又は図１０に記載されているのと実質的に 同じか又はそれに対して少なくとも４０％の類似性を有するヌクレオチド配列又 はアミノ酸配列を有する、請求項２３又は２４に記載の方法。
27. ２７．前記トランスジェニック植物がバラ、ペチュニア、キク、カーネーション 、ガーベラ又はタバコである、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. ２８．前記トランスジェニック植物がバラ又はペチュニアである、請求項２７に 記載の方法。
29. ２９．ジヒドロカンフェロール（ＤＨＫ）ヒドロキシル化酵素をコードするか、 又はそれをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んで成る安定に導入 された核酸分子を有するトランスジェニック植物。
30. ３０．前記酵素が３′，５′−ヒドロキシラーゼである、請求項２９に記載のト ランスジェニック植物。
31. ３１．前記酵素がペチュニア、バーベナ、ヒエンソウ、ブドウ、アイリス、フリ ージア、アジサイ、シクラメン、ポテト、パンジー又はナス由来である、請求項 ３０に記載のトランスジェニック植物。
32. ３２．前記酵素がペチュニア由来のものである、請求項３１に記載のトランスジ ェニック植物。
33. ３３．前記酵素が図９又は２に記載のものと実質的に同じかあるいはそれに対し て少なくとも４０％の類似性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３１又は３ ２に記載のトランスジェニック植物。
34. ３４．前記植物がバラ、ペチュニア、キク、カーネーション、ガーベラ、アイリ ス、チューリップ、ユリ、リシアンサス（Ｌｉｓｉａｎｔｈｕｓ）、フリージア 、ヒエンソウ、リムニウム（Ｌｉｍｕｎｉｕｍ）又はペラルゴニウムである、請 求項２９〜３２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
35. ３５．前記トランスジェニック植物がバラ又はペチュニアである、請求項３４に 記載のトランスジェニック植物。
36. ３６．植物からのシトクロムＰ４５０分子又は類似分子をコードするか又はそれ をコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子をク ローニングする方法であって、１又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーを用 いて１又は複数のポリメラーゼ連鎖反応により前記植物の細胞からの核酸分子の 適切な調製物からシトクロムＰ４５０ヌクレオチド配列又は相補的配列を増幅す ることを含んで成り、前記プライマーが既知のミクロソーム由来シトクロムＰ４ ５０分子の１又は複数のコンセンサス配列に由来するヌクレオチド配列を有する ものである、前記方法。
37. ３７．前記コンセンサス配列がシトクロムＰ４５０分子のヘム結合ドメインから のものである、請求項３６に記載の方法。
38. ３８．前記コンセンサス配列がＦ（Ｇ，Ｓ）ＸＧＸＲＸＣＸＧであり、ここでＸ は任意のアミノ酸である、請求項３７に記載の方法。
39. ３９．前記コンセンサス配列がＦＭＰＦＧＡＧＸＲＸＣＬＧであり、ここでＸが 任意のアミノ酸である、請求項３７に記載の方法。
40. ４０．前記シトクロムＰ４５０分子又は類似分子がＤＨＫヒドロキシル化酵素で ある、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
41. ４１．前記ＤＨＫヒドロキシル化酵素が３′，５′−ヒドロキシラーゼである、 請求項４０に記載の方法。
42. ４２．前記クローン化された酵素が図９又は１０に示すのと実質的に同じかある いはそれに対して少なくとも４０％の類似性を有するアミノ酸配列、又はヌクレ オチド配列によりコードされているアミノ酸配列を有する、請求項４０又は４１ に記載の方法。