CN1071456A

CN1071456A - 编码类黄酮途径酶的遗传序列及其应用

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Publication number: CN1071456A
Application number: CN92109770A
Authority: CN
Inventors: T·A·霍尔顿; E·C·科尼什; F·科瓦契奇; Y·特纳克; D·R·莱斯特
Original assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1992-07-11
Publication date: 1993-04-28
Anticipated expiration: 2007-07-11
Also published as: PL170326B1; WO1993001290A1; AU1953092A; SG45187A1; AU2273392A; EP0522880A3; DK0522880T3; EP0522880A2; JP2000023686A; CA2112373A1; US5569832A; DE69231745D1; JPH06500239A; PT522880E; ATE199937T1; IL102450A0; CN1492046A; DE69231745T2; JP3087246B2; US5349125A

Abstract

本发明涉及一种核酸分离物，它含有一种编码二氢莰非醇(DHK)羟化酶或其衍生物或部分的核苷酸序列或其互补序列。本发明还涉及到带有和表达上述核酸物质的转基因植物。

Description

总的来说，本发明涉及编码类黄酮途径代谢酶的遗传序列及其应用。例如用于控制植物和其他有机体的着色作用。

花卉工业的目标就是致力于培育出新的不同的显花植物品种。产生这种新品种的有效方法是通过对花卉颜色的控制，曾使用过传统的培育技术成功地使大部分商业花卉品种显示出各种各样的颜色。但是，这种技术受到某种特定种属基因库的限制，鉴于此原因，对于一个花卉品种很少有全色谱的花色种类。的确，由于兰色花卉来源有限，在荷兰1988年通过拍卖系统出售的切花不到百分之五是兰色花。在十二种销路最好的花卉中，只有鸢尾和小苍兰属提供兰色品种，并且这些品种占整个花卉销售量的不到百分之四。培育主要切花种属例如：玫瑰，菊花，荷兰石竹和非洲菊的兰色品种，将为切花和装饰市场开拓广阔前景。

花的颜色主要取决于两种类型的色素：类黄酮和类胡萝卜素。类黄酮可产生从黄到红到兰范围内的颜色。类胡萝卜素带来橘黄或黄色，并且通常是黄色或橘黄色花卉中的唯一色素。在花卉颜色中起主要作用的类黄酮分子是花色素苷，这种物质是花青素，翠雀素，3′-甲花翠素，芍药色素，锦葵色素和天竺葵色素的糖基化衍生物，并且位于液泡中。不同的花色素苷可以带来明显不同的颜色。花卉的颜色还会受到与无色类黄酮的共同色素沉着。金属络合作用，糖基化，酰化，甲基化及液泡pH的影响（Forkmann，1991）。

已经完善地建立了类黄酮色素的生物合成途径（以后称之为“类黄酮”途径），如图1所示（Ebel和Hahlbrock，1988;Hahl brock和 Grisebach，1979，Wiering and de Vlaming，1984;Schram et al，1984;Stafford，1990）。该途径中第一个指定的步骤包括三分子的丙二酰基辅酶A与一分子的对一香豆酰CoA的缩合反应。该反应受苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）的催化。此反应的产物，2′，4，4′，6′-四羟苯基苯乙烯酮，通常很快被苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶（CHI）异构化而产生柚配质，柚配质接着被黄烷酮3-羟化酶（F3H）在中心环的3位上羟基化而产生二氢莰非醇（DHK）。

二氢莰非醇的B环可以在3′或同时在3′和5′位被羟基化而分别产生二氢五羟黄酮（DHQ）和二氢杨梅黄酮（DHM）。在此途径中的两个关键性酶是类黄酮3′-羟化酶（以后称之为3′-羟化酶）和类黄酮3′，5′-羟化酶（以后称之为3′，5′-羟化酶）。3′-羟化酶作用于DHK产生DHQ，并且作用于柚配质产生圣草酚。3′，5′-羟化酶是一种广谱酶，可以催化柚配质和DHK的3′和5′位的羟基化，以及圣草酚和DHQ的5′位羟基化（Stotz and Forkmann，1982），在这两种情况分别产生五羟黄烷酮和DHM。B环的羟基化方式在决定花瓣颜色方面起着重要作用。

在微粒体提取物中类黄酮的3′-羟基化需要NADPH和氧气以及柚配质或DHK的糖苷配基。已对绉叶欧芹细胞培养物酶进行细致的研究（Hagmann et al.，1983）。由于它受一氧化碳，细胞色素C和NADP⁺的抑制，说明这种酶是一种细胞色素P450-依赖性酶。在玉米中也证实了这种相似的酶活性（Larson and Bussard，1986）。3′，5′-羟化酶也是细胞色素P450类的酶。细胞色素P450酶广泛存在于自然界中，并且已在脊椎动物，昆虫，酵母，真菌，细菌和一种植物中进行表征。已经确定了至少154种细胞色素P450基因的序列，这些基因归属于27个不同的基因族（Nebert et al，1991）。在一个族内，P450蛋白序列的一致性一般大于40%，而在相同的亚族中序列的一致性大于46%（Nebert et al，1991）。有关植物细胞色素P450的资料是有限的。

对植物中与类黄酮途径有关的3′或3′，5′-羟化酶活性或其他酶的控制，提供了一种控制花瓣颜色的方法，从而使单一品种表现出广谱的花色。根据本发明，已经识别和克隆了编码类黄酮途径酶如3′，5′-羟化酶的遗传序列。这些重组序列可以允许对DHK代谢进行调节，以及调节其他底物如DHQ柚配质和圣草酚的代谢，从而确定花色素苷的羟化方式，以提供一种控制花瓣颜色的手段。但是，本发明可以从花卉延伸到水果、蔬菜植物以及例如装饰植物的叶子。

因此，本发明的一方面提供了一种核酸分离物，包括一种编码二氢莰非醇（DHK）羟化酶或其衍生物或其部分分子的编码序列或它的互补序列。

为了方便，而且只是为了用于缩写表示，这里所说的“DHK羟化酶”包括作用于一种或几种下列物质：DHK，DHQ，柚配质，圣草酚的类黄酮途径羟化酶。

优选的DHK羟化酶是3′，5′-羟化酶。但是，用于克隆编码这种酶的遗传序列的方法，也可以用于分离编码如3′-羟化酶的其他遗传序列。因此，本文所指的3′，5′-羟化酶的分离和克隆应当包括其他的类黄酮羟化酶如3′-羟化酶。

术语“核酸分离物”是指处于非自然存在状态的遗传序列。一般地说，这是指从其自然状态分离出，或通过在其自然环境中不必使用的方法而形成。更具体地说，它包括体外形成或保存的核酸分子，重组或合成分子，和异源核酸结合的核酸。它也可以延伸到与其他核酸序列相关的至少部分纯化之后的自然存在的序列。

本文所说“遗传序列”是指直接对DHK羟化酶，如，3′，5′-羟化酶的一个氨基酸序列进行编码或通过碱基互补序列进行编码的核苷酸碱基连续序列。这种核酸或其互补形式可以编码全长度的酶，或其衍生物，或其一部分。“衍生物”是指相对于自然存在的酶而言的任何单一或多个氨基酸的取代、缺失、和/或插入。鉴于此，该核酸包括编码3′，5′-羟化酶的自然产生的核苷酸序列或包含有相对于所说自然产生的序列而言的一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入。本文所指的核酸序列还包括寡聚核苷酸，它可用作基因探针，或者用作能够调节植物内相应基因表达的“反意”分子。因此，当核酸或其互补形式编码3′，5′-羟化酶的一部分时，这种核酸分子可以用作寡聚核苷酸探针、聚合物酶链反应或各种诱变技术中的引物。

本发明中DHK羟化酶尤其是3′，5′-羟化酶的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基的末端融合以及序列内插入一个或多个氨基酸。插入性氨基酸序列变异是指向蛋白质的预定位点导入一个或多个氨基酸残基，当然通过合适地筛选所得产物也可以进行随意插入。缺失变异特征是从序列中去除掉一个或多个氨基酸。取代氨基酸变异是指序列中至少去掉了一个残基并且在该位点插入一个不同的残基。典型的取代是根据下表1进行的取代：

表 1

用于氨基酸取代的合适残基

原始残基典型取代

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln;His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn;Gln

Ile Leu;Val

Leu Ile;Val

Lys Arg;Gln;Glu

Met Leu;Ile

Phe Met;Leu;Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp;Phe

Val Ile;Leu

如果3′，5′-羟化酶发生氨基酸取代，其氨基酸一般用具有类似特性的其他氨基酸取代，如类似的疏水性、亲水性、电负性、大侧链等等。典型的氨基酸取代是一个残基的取代。氨基酸插入通常是按照大约1-10个氨基酸残基的次序插入，而缺失大约是1-20个残基。优选的缺失或插入是以相邻的成对进行，也就是缺失两个残基或插入两个残基。

可以利用本领域中公知的肽合成技术，如固相肽合成（Merrifield，1964）及其类似方法，或通过重组DNA操作法而容易地制备上述氨基酸变异体。在具有已知或部分已知序列的DNA预定位点进行取代突变的技术是公知的，它包括如，M13诱变。通过对DNA序列进行操作产生表现为取代、插入或缺失变异的变异蛋白，在如Sambrook et al（1989）的著作中有详细描述。

本发明中3′，5′-羟化酶的其他代表性重组或合成突变体和衍生物包括取代、缺失和/或加上一个或多个与该酶相关的分子如糖类、脂类和/或蛋白或多肽。

术语“类似物”和“衍生物”也可延伸到3′，5′-羟化酶的任何功能性化学等同物，并也可延伸到上述的任何氨基酸衍生物。

本发明的核酸可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，单股或双股和线性或共价相连的环状分子。优选的核酸分子是cDNA。本发明也可延伸到其他的核酸分子，这些分子能在低等，优选中等，最好是在高度严格条件下与本发明所指的核酸分子杂交。用另一种术语表达则是，本发明延伸至具有图9或10中的某一核苷酸序列的核酸分子，或者延伸到在核苷酸或氨基酸序列水，上具有至少33%，较好是至少45%，优选至少55%，更优选是至少65-70%，甚至最好是大于85%的相似性的一种分子，而且其中该核酸编码或互补于编码具有3′，5′-羟化酶活性的酶的序列。但是，应当注意的是核苷酸或氨基酸序列可以具有低于上述给定的百分率的相似性，并且仍能编码DHK羟化酶，这种分子由于保留同源区仍然被认为属于本发明的范围之内。本发明还延伸到寡聚核苷酸引物形式的核酸分子，这种引物能够在低等，优选中等，最好是高度严格条件下与上述的部分核酸分子进行杂交。

这里所说的核酸分子可以单独存在，或者与一种载体分子最好是表达载体以结合形式存在。这种载体分子可在真核和/或原核细胞中复制和/或表达。优选地是，这种载体分子或其一部分能够整合到植物基因组中。该核酸分子还可以含有一个能够控制植物细胞内核酸分子表达的启动子序列。可以通过许多的方式如通过电击穿或土壤杆菌介导转移（Agrobacterium Mediated transfer）将该核酸分子和启动子导入到细胞中。

使用来源于牵牛花的核酸序列可以典型地实施本发明，因为它代表了迄今最方便和优选的材料来源，但是，本领域中的普通技术人员会很快地意识到可以从任何的其他来源如其他植物或某种微生物中分离相似的序列。有关金鱼草，马鞭草和矮牵牛的花以及玉米种子的糊粉层及幼苗中的3′-羟化酶遗传学特性是已知的（Heller and Forkmann，1988）。在金鱼草中基因eos控制3′-羟化酶（Forkmann and Stotz，1981），而在牵牛花（Stotz et al，1985）和玉米糊粉层（Larson and Russard，1986）中的相似酶分别由Htl和Pr控制。例如，对马鞭草杂交种的化学遗传学研究表明，在这种植物中花色素苷B环中3′和5′位的羟化都是由一种基因控制的（Beale，1990）。可进行3′，5′-羟化反应的酶活性只存在于能产生翠翟素的植物的花卉提取物中（Stotz and Forkmann，1982）。在翠菊属（Callistephus）和山黧豆属（Lathyrus）的花卉提取物中也表现出了在3′和5′位发生羟化反应的NADPH-依赖性微粒体酶活性（Forkmann，1991）。和马鞭草杂交种一样，发现使黄烷酮和二氢黄酮醇发生3′，5′-羟化反应的酶活性只存在于那些花卉中含有3′，4′，5′-羟化类黄酮化合物（或其甲基化衍生物）的植物品种的花卉提取物中。因此，3′，4′，5′-羟化类黄酮的形成显然依赖于类黄酮3′，5′-羟化酶活性。

已经在许多装饰植物包括翠菊（Callistephus（R））、牵牛花（Hf1，Hf2）和马鞭草（P）中利用不能够产生翠雀素的相应突变体识别出了编码3′，5′-羟化酶的基团。而且，已经证实了各自的酶活性（Forkmann，1991）。这种3′，5′-羟化酶也被认为是一种微粒体细胞色素p450酶（Heller and Forkmann，1988）。但是，没有公开出版物报道从这些或其他植物种类中克隆出3′，5′-羟化酶基因。

其他能够产生3′，4′，5′-羟化类黄酮或其衍生物的植物种类包括绣球花属（Takeda，et al，1985），翠雀属（Asen et al，1975），Lisianthus（Asen et ol，1986），西红柿（Von Wettstein-Knowles，1968）和土豆（Harborne and Simmonds，1962）。这些或其他能够产生3′，4′，5′-羟化类黄酮的植物品种也是分离3′，5′-羟化酶基因的合适来源。不管基来源如何，所有这些直接或间接编码类黄酮途径酶（如，3′，5′-羟化酶）的核酸序列都属于本发明的范围之内。

同样，本文所描述的基因克隆方法也可以用于从其他产生3′，4′，5′-羟化类黄酮的植物中分离3′，5′-羟化酶基因。可以用本文公开的克隆和寡聚核苷酸以相同的技术检测、分离和克隆相似的遗传序列，只是对实验步骤需要进行微小的修改。所有这些小的变动都在本发明范围之内。这些酶如3′，5′-羟化酶的其他合适来源的例子包括，但不局限于，马鞭草，飞燕草，葡萄，鸢尾，小苍兰，绣球花，仙客来，马铃薯，三色紫罗兰和茄子。

根据本发明，可以将编码一种DHK羟化酶如3′，5′-羟化酶的核酸序列导入到一种转基因植物中并进行表达，从而提供了一种转化DHK和/或其他合适的底物的手段，如果它是在植物细胞内合成的，最终将转化成花色素如翠雀素、3′-甲花翠素或锦葵色素的花色素苷衍生物。这些花色素苷的产生将带来各种深浅不同的兰色或近兰色。核酸在植物内的表达可以是结构型的，诱导型的或发育中进行的。

因此，本发明的另一方面提供了一种制备能够表达重组DHK羟化酶或其活性突变体或衍生物的转基因植物的方法，所说的方法包括向一种合适植物的细胞中导入一种核酸分子，该分子包含有一种编码所说DHK羟化酶的核苷酸序列，这种方法的实验条件应当允许最终表达所说的核酸分子，从细胞中再产生一种转基因植物并且使所说的转基因植物生长一段时间，这种条件以能够允许核酸的表达。

在一个优选实施方案中，本发明设计了一种产生显示有变化的花簇特性的转基因开花植物的方法，所说的方法包括在允许最终表达所说的核酸序列的条件下，向一种合适的植物细胞中导入本发明的核酸序列，从细胞中再产生转基因植物，并使所说的转基因植物生长一段时间，而且该条件足以允许将该核酸序列表达为DHK羟化酶。

优选的DHK羟化酶是3′，5′-羟化酶，是在发育中可被调节的，变化的花簇包括依据受体植物的生理状况而产生兰色或红色花卉或其他浓淡的颜色。“合适的植物”是指一种能够产生适用于3′，5′-羟化酶的底物植物，并且该植物具有合适的生理特性和产生所期望颜色而需要的基因型。这种植物可以包括但不局限玫瑰，矮牵牛花，石竹，菊花和非洲菊。在特定植物种类中最好选择一种“高pH系”，它被定义为一种具有比平均值较高的花瓣液泡pH。重组3′，5′-羟化酶或其突变体和衍生物的来源如本文前面所述，并包括矮牵牛花、马鞭草、飞燕草、葡萄、鸢尾、小苍兰、绣球花、仙客来、马铃薯或茄子来源的酶。

本领域中的熟练技术人员很快会意识到适用于该方法的改动方案，如增加或减少自然存在于靶植物中的酶的表达。这将会产生不同深浅浓淡的颜色如不同浓淡的兰色或红色。

为了降低靶酶，如3′，5′-羟化酶的活性，可以将编码这种酶的核酸序列或其各个部分以反义方向使用。虽然目的并不是为了将本发明局限于任何特定理论，不过这种反意核酸序列有可能与自然产生的编码该酶的全部mRNA或其部分形成一个二倍体，从而防止mRNA翻译成活性酶。或者，也可以使用核糖酶使靶核酸序列失活。

因此，本发明延伸到一种产生能够表达重组二氢莰非醇（DHK）羟化酶的转基因植物的方法，或者该植物能控制某种核酸的转录，这种核酸基本上与可被翻译成DHK羟化酶的全部或部分mRNA分子互补，所说的方法包括在允许最终表达所说的核酸分离物的条件下，向一种合适的植物中导入根据权利要求1或6的核酸分离物，从细胞中再产生一种转基因植物，并使所说的转基因植物生长一段时间，而且该条件足以允许表达该核酸分离物。在这个方案中，合适的受体植物延伸到特别是鸢尾、郁金香，百合，Lisianthus，小苍兰，飞燕草，柠檬，天竺葵。

因此，上述制备转基因植物的方法延伸到将一种基因或编码一个反意义mRNA的DNA片段或寡聚核苷酸导入到整个或一部分或某区域的编码或互补于编码3′，5′-羟化酶序列的一个核苷酸序列。

因此，本发明延伸到含有全部或部分本发明核酸序列，或其反义形式和/或其任何同源或相关形式的全部转基因植物，尤其是那些表现有不同花朵特性的转基因植物。因此，该转基因植物含有一种稳定导入的核酸分子，该分子包含有一种编码或互补于编码DHK羟化酶的序列的核苷酸序列，该植物尤其是那些携带有上述的导入的核酸分子的高pH植物系。本发明还延伸到这些转基因植物的种子，这些种子，尤其是如果是彩色的，可以用作植物的特有标志。

本发明的另一方面是指重组形式的DHK羟化酶，尤其是重组3′，5′-羟化酶。这种重组形式的酶将为制备一种如活性更强的酶的研究提供材料来源，而且可用于发展体外系统以生产颜料化合物。

本发明的另一方面是设计一种克隆某种核酸分子的方法，该分子包含有一种来自于植物的细胞色素p450分子或其类似分子的核苷酸序列或该编码序列的互补序列，所说的方法包括使用一种或几种寡聚核苷酸引物，通过聚合物酶链反应，对来源于所说植物细胞的某种合适的核酸分子制备物中的细胞色素p450核苷酸序列或互补序列进行扩增，所说的引物具有一种来源于已知微粒体细胞色素p450分子的一种或几种共同序列的核苷酸序列。

在相关实施例中，克隆细胞色素p450核酸分子或其互补序列的方法包括从一种合适的cDNA库中选择一种能够与一种或几种寡聚核苷酸引物杂交的克隆，所说的引物与已知细胞色素p450分子的一种或几种共同序列相对应。

优选的一种共同序列是来源于细胞色素p450分子的血红素结合区（hacm-binding domain），更优选的是F（G，S）XGXRXCXG（其中X是任何氨基酸）或者是PCFACRRICPG。在最优选的实施方案中，所要克隆的核苷酸序列可以编码或互补于一种编码DHK羟化酶，尤其是3′，5′-羟化酶的序列。甚至更优选的是，该3′，5′-羟化酶如前所述，尤其是具有一种由图9或10中描述的氨基酸序列，或基本上由图中的核苷酸序列编码的氨基酸或者与上述定义的酶具有类似性。

本发明将通过下面的非限制性图表和实施例作进一步描述。

图1（A）和（B）图解说明类黄酮色素的生物合成途径。该代谢途径第一部分所涉及的酶类代表的含义如下：PAL＝苯丙氨酸氨裂解酶;C4H＝肉桂酸盐4-羟化酶;4CL＝4-coumarate：CoA裂解酶;CHS＝苯基苯乙烯酮合成酶;CHI＝苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶;F3H＝黄烷酮3-羟化酶;DFR＝二氢黄酮醇4-还原酶;UFGT＝UDP-葡萄糖：类黄酮-3-氧-糖基转移酶。代谢途径后面步骤相当于在P.hybrida花中发生的转化，包括：1＝向花色素-3-葡糖苷和翠雀素-3-葡糖苷的葡糖基残基上加上一个鼠李糖的加成作用;2＝乙酰化作用和5-氧-糖基化作用;3＝3′甲基化作用;4＝5′甲基化作用;5＝3′5′甲基化作用。

图2（A）显示P.hybrida cv V23（Hf1/Hf1，Hf2/Hf2）的花瓣提取物中3′，5′-羟化酶活性以及P.hybrida cv R51（hf1/hf1，hf2/.hf2）中3′，5′-羟化酶活性的丧失。通过³H-4′，5，7-三羟黄烷酮向3′-和3′，5′-羟化衍生物圣草酚及四羟黄烷酮的转变来检测3′，5′-羟化酶的活性。图的左手侧所示为底物4′，5，7-三羟黄烷酮及其3′羟化酶反应产物圣草酚和3′，5′羟化酶反应产物四羟黄烷酮的生物化学结构。底物及其羟化产物在TLC平板上的位置示于图的右手侧，该图从左至右显示了由P.hybrida cv V23和P.hybrida cv R51花的花瓣提取物产生的反应产物和当从反应混合物中省去NADPH时柚苷配基不发生羟基化的对照物的放射自显影图。

图2（B）显示在不同发育阶段的P.hybrida cv Old Glory Blue（OGB）花的花瓣提取物中的3′，5′-羟化酶活性。从左至右的TLC平板放射自显影图表示（1）第一阶段花[花蕾未着色，闭合（长度＜25mm）]：4′，5，7-三羟黄烷酮向3′，5′-羟化衍生物四羟黄烷酮进行有限的转化;（2）第二阶段花[花蕾已着色，闭合（长度为25-35mm）]：增加了向羟黄烷酮的转化，表明存在较高的3′，5′-羟化酶水平;（3）第3阶段花[花蕾深紫色，并出现花冠（长度＞35mm）]：最大3′，5′-羟化酶活性;（4）第4阶段花[花蕾开放，深紫色，花药开裂前（长度＞50mm）]：最大3′，5′-羟化酶活性;（5）第5阶段花[花朵完全开放。全部花药开裂]：不存在可检测的3′，5′-羟化酶活性水平。

图3（A）图解说明一种编码细胞色素P450的mRNA分子。深色区表示编码血红素结合区序列的相对位置。用单个字母代码表明上述结合部位最保守区域的共同氨基酸序列。那些百分之百存在于位于SWISS-PROT数据库的细胞色素P450序列中的氨基酸被框起来，X表示具有低水平序列保守性的位置。

图3（B）显示用于PCR扩增来自cDNA库＃1的细胞色素P450分子pCGP450和pCGP454的寡核苷酸的位置。寡核苷酸1和3包括的顺序位于保守的血红素结合区，而寡核苷酸2和4分别对应于pBluescript（stratagene）-20和反向引物序列。寡核苷酸1和2用来合成插入pCGP450的cDNA;寡核苷酸3和4用于合成插入pCGP454的cDNA。对所延伸的cDNA分子的表示与图3A一致，载体顺序用浅色区表示。

图4（A）图解说明用于探测cDNA库＃1以鉴别包括pCGP174和pCGP175的细胞色素P450同系物的DNA片段。P450：得到的细胞色素P，450cDNA克隆，带有由深色盒表示的血红素结合区（Haem）;片段1：以pCGP142DNA为模板，用寡核苷酸5和6经PCR得到的一段900bp片段;片段2：从pCGP147的SalI-EcoRI酶解片段中分离到的1.3kb片段;片段3：以pCGP168 DNA为模板，用寡核苷酸4和7经PCR得到的一段750bp片段;片段4：从pCGP160的PstI-EcoRV酶解片段中分离到的一个670bp片段;片段5：以pCGP454DNA为模板，用寡核苷酸3和4经PCR提到的一段150bp片段。所有的纯化片段都按下文材料与方法部分所述用³²P-dCTP进行标记。

图4（B）-（H）显示来自（ⅰ）pCGP142，（ⅱ）pCGP147，（ⅲ）pCGP158，（ⅳ）pCGP160和（ⅴ）pCGP454的cDNA插入物的部分核苷酸顺序以及相应的推定的氨基酸转译产物。用以探测cDNA库井1以分离pCGP174和pCGP175的区域已用带箭头的直线画出。

图5（A）和（B）分别图示质粒pCGP174和pCGP175。cDNA插入物以空心盒表示，其中带有以深色区显示的编码推定的血红素结合部位的区域。位于两个cDNA插入物的5′端都有一个EcoRI位点，在3′端有一个XhoI位点。

图6（A）是用pCGP174 cDNA插入物的3′区探测RNA印迹的放射自显影图。每一泳道含有从下列矮牵牛属植物组织中分离的总RNA的20μg样本：1-5：取自花的5个不同发育阶段（见材料与方法部分所述）花的OGB瓣片组织;T：取自第3-4阶段花的OGB合瓣花冠组织;L：取自6周老OGB幼苗的叶组织;IL：取自6周老OGB幼苗并用葡萄糖/强光处理过的叶组织;V23：取自第3-4阶段花的V23瓣片组织;R51：取自第3-4阶段花的R51花冠组织;VR：取自V23×R51F₁杂种第3-4阶段花的花瓣瓣片组织：Sw63：取自Sw63的第3-4阶段花的花瓣瓣片组织;Th7：取自Th7的第3-4阶段花的花瓣瓣片组织。

花的花瓣瓣片组织。

图6（B）表示V23×R51（V/R）F₂植株的RFLP分析放射自显影图。用pCGP174的3′区探测XbaI酶解的基因组DNA。在那些于花（+）的合瓣花冠组织中具有3′，5′-羟化酶活性的所有F₂植株中都检测到了能与探针进行坚固杂交的V23片段。对于不同植株都标明了有强杂交带的RFLP命名（RFLR＃1）。V：类似V23的RFLP，R：类似R51的RFLP，H：杂合子（VR）。

图7（A）是用pCGP175cDNA插入物的3′区探测RNA印迹的放射自显影图。每一泳道含有从下列组织中分离到的总RNA的20μg样本：1-5：取自花的5个不同发育阶段（见材料与方法部分所述）花的OGB瓣片组织;T：取自第3-4阶段花的合瓣花冠组织：L：取自6周龄OGB秧苗的叶组织;IL：取自6周龄OGB秧苗并经葡萄糖/强光处理过的叶组织;V23：取自第3-4阶段花的V23瓣片组织;R51：取自第3-4阶段花的R51花冠组织;VR：取自V23×R51F₁杂种的第3-4阶段花的花瓣瓣片组织;Sw63：取自Sw63的第3-4阶段花的花瓣瓣片组织：Th7：取自Th7的第3-4阶段花的花瓣瓣片组织。

图7（B）表示V23×R51（V/R）F₂植株的RFLP分析的放射自显影图。用pCGP175的3′区探测XbaI酶解的基因组DNA。用pCGP175探针获得的RFLP命名与用Chi-A探针所给定的PO命名一致。V：V23样RFLP;R：R51样RFLP;H：杂合子（VR）RFLP。

图8图示pCGP602的限制性酶图谱。cDNA插入物的部分长度用带有立线端（与箭头相对）的粗线表示。这些片段被亚克隆到M13-mp18和mp19中，并用所示的寡核苷酸引物顺序进行测序以获得重迭顺序的信息。从每一亚克隆部分获得的有关顺序长度和方向的信息用带有半个箭头的直线表示。S1＝引物序列1;S2＝引物顺序2;S3＝引物顺序3;ATG表示甲硫氨酸起始密码子，用碱基对表示的克隆的总长度也同时示出。

图9（A）-（D）表示pCGP176和pCGP602中cDNA插入物的核苷酸顺序的推定的氨基酸顺序。得自pCGP602的插入物包括所示的完整顺序。pCGP176插入物的5′端用箭头表示。

图10（A）-（C）表示pCGP175中cDNA插入物的核苷酸顺序和推测的氨基酸顺序。

图11图解pCGP618的构建。pCGP618的构建是通过将pCGP175 cDNA插入物以有意义方向克隆到表达载体pYGA22m中酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（PGPD）后面实现的。来自pCGP175的cDNA插入物的EcoRI-KpnI片段与用EcoRI/KpnI酶解pYGA22m所得的大片段进行连接。E＝EcoRI，H＝Hind Ⅲ，K＝KpnI，X＝XhoI，IR＝2μm质粒的反相重复，Trpl＝Trpl基因，Ap＝氨苄青霉素抗性标记。

图12（A）显示以³H-4′，5，7-三羟黄烷酮为底物进行的酵母提取物中3′，5′-羟化酶测定。放射自显影图反映了用质粒pCGP618转化的酵母的提取物中³H-4′，5，7三羟黄烷酮向其3′，5′-羟化衍生物四羟黄烷酮的转化（1和2）。在未被转化的酵母（C）中未检测到3′，5′-羟化酶活性。用OGB3′，5′-羟化酶进行的4′，5，7-三羟黄烷酮转化为四羟黄烷酮也示于图中（OGB C）。

图12（B）显示以³H-二氢五羟黄酮作底物进行的酵母提取物中3′，5′-羟化酶测定。放射自显影图反映了用质粒pCGP618转化的酵母的提取物中³H-二氢五羟黄酮（DHQ）向³H-二氢六羟黄酮（DHM）的转化（1和2）。在未被转化的酵母（C）中未检测到3′，5′-羟化酶活性。用OGB3′，5′-羟化酶进行的DHQ向DHM的转化也示于图中（OGB C）。

图13显示以³H-4′，5，7-三羟黄烷酮作底物进行的酵母提取物3′，5′-羟化酶测定，放射自显影图反映出用质粒pCGP618和pCGP620转化的酵母的提取物中³H-4′，5，7-三羟黄烷酮向其3′，5′-羟化衍生物四羟黄烷酮的转化（分别见1和2）。从pCGP620提取物获得的反应产物还包括3′-羟化圣草酚以及一些初始4′，5，7-三羟黄烷酮底物，表明底物向其3′，5′-羟化终产物的转化是不完全的。在未被转化的酵母（C）中未检测到3′，5′-羟化酶活性。

图14图解说明质粒pCGP90。得自pCGP602的cDNA插入物以有意义方向被克隆到如图所示的表达载体pCGP293的Mac启动子后面。

图15显示矮牵牛属植物花瓣提取物中3′，5′-羟化酶测定。放射自显影图表明：在Skr4×Sw63的花瓣瓣片组织（L）中存在低3′，5′-羟化酶活性水平（³H-4′，5，7-三羟黄烷酮向³H-四羟黄烷酮的转化）。在两株Skr4×Sw63/pCGP90转基因植株（T/G1602和T/G1603）的瓣片组织（L）中检测到明显较高水平的酶活性。在非转基因Skr4×Sw63杂交株或两个pCGP90转基因植株的花瓣合瓣花冠提取物中均未测到3′，5′-羟化酶活性。通过OGB花瓣组织的瓣片（L）和合瓣花冠（T）提取物进行的4′，5，7-三羟黄烷酮向四羟黄烷酮的转化也示于图中。

图16是照相表示用³²P标记的Hf1 cDNA探测RNA印迹的放射自显影图。每一泳道含有从下列植物分离到的总RNA的20μg样本：（1）P.hybrida cv.OGB花瓣;（2）三色堇花瓣;（3）土豆茎;（4）茄子表皮;（5）Nicotiana alata 花;（6）藿香花。用于检测A和B的探针从一个660bp BalI DNA片段衍生而来。一个1.4kb的EcoRI/HindⅢ片段用于检测C。所用的漂洗条件为（A）6×SSC，50℃;（B）2×SSC，50℃;（C）0.2×SSC，65℃。

图17是照相表示用³²P标记的Hf1 cDNA探测的Southern印迹的放射自显影图。每一泳道含有10μg用EcoRI酶解的DNA。该DNA样本分离自（1）茄子，（2）荷兰鸢尾，（3）土豆，（4）紫罗兰和（5）银莲花属植物。漂选条件为：（A）6×SSC，50℃;（B）2×SSC，65℃。

实施例

1.材料与方法

化学物质、酶类和放射性同位素

圣草酚和二氢五羟黄酮得自Carl Roth KG，.4′，5，7-三羟黄烷酮购自Sigma。二氢六羟黄酮是根据Vercruysse的方法（Vercruysse et al，1985）从六羟黄酮（Extra Synthese，France）经化学合成而得。[³H]-4′，5，7-三羟黄烷酮（5.7Ci/mmole）和[³H]-二氢五羟黄酮（12.4Ci/mmole）得自Amersham。所用的酶类均为商售来源，并按制造商的说明使用。

细菌菌株

所用的E.Coli菌株为：

DH5α supE44，△（lacZYA-ArgF）U169，φ801acZ△M15，hsdR17（r^- _k，m⁺ _k），recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1.deoR.（Hanahan，1983 and BRL，1986）.

XLl-Blue supE44，hsdR17（r^- _k，m⁺ _k），recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，lac^-，[F′ proAB，lacI^q，lacZ△M15，Tn10（tet^r）]（Bullock et al，1987）.

PLK-F′ recA，hsdR17（r^- _k，m⁺ _k），mcrA^-，mcrB⁺，lac⁺，supE44，galK2，galT22，metBl，[F′ proAB，lacI^q，lacZ△M15，Tn10（tet^r）]（Stratagene）.

弃掉进攻器官的根癌土壤杆菌菌株AGLO（Lazo et al，1991）得自R.Ludwig（Department of Biology，University of California，Santa Cruz）。

克隆载体pBluescript和pBluescribe得自Stratagene。

E.Coli和根癌土壤杆菌的转化

根据Inoue（Inoue et al，1990）的方法转化E.coli株DH5α细胞。

将AGLO细胞接种于50ml MG/L（GarfinKel and Nester，1980）培养基中，于28℃振荡生长16小时制得感受态AGLO细胞。加5μg质粒pCGP90（图14）DNA到100μl感受态AGLO细胞中，使质粒pCGP90导入根癌土壤杆菌菌株AGLO中。然后获取上述所得细胞的团丸，并悬浮于0.5ml含85%（V/V）100mM CaCl₂/15%（V/V）甘油的溶液中。将DNA-土壤杆菌混合物置液氮中冷冻2分钟，再置于37℃5分钟使之解冻。将DNA/细菌混合物置于冰上10分钟。然后加1ml MG/L培养基与细胞混合，再于28℃摇育16小时。用含100μg/ml庆大霉素的MG/L琼脂板筛选携带pCGP90的根癌土壤杆菌细胞。对从庆大霉素抗性转化体分离到的DNA进行Southern印迹分析来证实pCGP90的存在。

所用的矮牵牛属植物杂交变种列于表2中。

表 2

植物材料

植物变种特性来源/出处参考

Old Glory Blue(OGB) F₁Hybrid Ball Seed,USA

V30 An1,An2,An3,An4,An6, Koes et al.(1986)

An8,An9,An10,An11,Ph1

Ph2,Ph3,Ph4,Ph5,Hf1,

Hf2,Ht1,Ht2,Rt,Mt1,Mt2,

mf1,po,Gf

V23 An1,An2,An3,An4,An6, Wallroth et al.(1986)

An8,An9,An10,ph1,Hf1, Doodeman et al.(1984)

Hf2,ht1,Rt,Po,B1,F1

R51 An1,An2,An3,An4,An6, Wallroth et al.(1986)

An8,An9,An10,An11, van Tunen et al.(1990)

Ph1,hf1,hf2,Ht1,rt, doodeman et al.(1984)

Po,b1,f1

Sw63 An1,An2,An3,An4,An6, I.N.R.A.,Dijon,Cedex,

An8,An9,An10,An11, France

Ph1,Ph2,Ph5,hf1,hf2,

ht1,ht2,rt,po,mf1,f1,Gf

Th7 An1,An2,An3,An4,An6, " " "

An9,An10,An11,Hf1,Hf2,

Ht1,Ht2,Ph1,Ph2,Ph5,Rt,

po,mf1,mf2,Gf,F1

Skr4 An1,An2,An3,An4,An6, " " "

An11,hf1,hf2,ht1,Ph1,Ph2,

Ph5,rt,Po,Mf1,Mf2,f1

Skr4×Sw63 Skr4×Sw63 F₁Hybrid

Rw14 An1,An2,An4,Ph1,phz, I.N.R.A.,Dijon,Cedex

Ph5,hf1,hf2,Ht1,Rt,Po, France

Bl,Lg1,Lu1,Vs1,Vs3,Vs5,

la,Yg1,ws,Gf,Mt1,Mf2,f1

Rp57 An1,An2,An4,Ph1,ph2, " " "

Ph5,hf1,hf2,Ht1,Rt,Po,

Mt,Mf,fl,Gf,Bl,Lg1,Lu1,

Vs1,Vs3,Vs5,Yg1,Ws.

Rp57×Rw14 Rp57×Rw14 F₁Hybrid

植物在特定生长室中于22-26℃生长，每天以光强10，000勒光照14小时，在如下所定义的发育阶段采集OGB花：

第1阶段：花蕾未着色，闭合（长度＜25mm）。

第2阶段：花蕾着色，闭合（长度为25-35mm）。

第3阶段：花蕾深紫色，并出现花冠（长度＞35mm）。

第4阶段：深紫色开放的花朵，花药开裂前期（长度＞50mm）。

第5阶段：花朵完全开放，伴有全部花药开裂。

在花药开裂前于色素累积达最大量的生长阶段收集表2所述的其它变种的花。

用于测定3′，5′-羟化酶活性的植物提取物的制备

用2-5倍体积的冰冷提取缓冲液（100mM磷酸钾（pH7.5），1mMEDTA，0.25M蔗糖，0.25M甘露糖醇，0.1%（V/V）BSA，100nM抑肽素，100nM亮肽素，0.1mg/ml PMSF，20mM 2-巯基乙醇和10mg/ml polyclar AT）将植物组织均化。所得组织匀浆用JA20转头（Beckman）以10，000rpm于4℃离心10分钟，用得到的上清液的等份试样进行3′，5′-羟化酶活性测定。

3′，5′-羟化酶测定

用修改的Stotz和Forkmann（1982）方法检测3′，5′-羟化酶酶活性，进行测定的反应混合物一般含有100μl植物提取物、5μl溶于测定缓冲液（100mM磷酸钾（pH8.0），1mM EDTA和20mM2-巯基乙醇）中的50mM NADPH，10μCi[³H]4′，5，7-三羟黄烷酮或5μCi[³H]二氢五羟黄酮，并用测定缓冲液将反应的终体积补足至210μl。于23℃培育2-16小时之后，用0.5ml乙酸乙酯抽提反应混合物。于真空中干燥乙酸乙酯相，然后再重悬于10μl乙酸乙酯中。将氚化的类黄酮分子用氯仿∶乙酸∶水（10∶9∶1，V/V）溶剂系统分散于纤维素薄层板（Merch Art 5577，Germany）上。在色谱分析完毕之后，用溶于二乙基乙醚中7%（V/V）的2，5-二苯基噁唑向TLC板喷洒。用放射自显影法将反应产物定位，通过与在反应产物旁平行实验的非放射性4′，5，7-三羟黄烷酮、圣草酚、二氢五羟黄酮和二氢六羟黄酮标准物相比较对反应混合物进行鉴别，并在紫外光下观察。

葡萄糖/强光诱导植物叶中翠雀素合成

收集P.hybrida cv.OGB的叶子，并在无菌水中切成1cm²的叶片。将叶片漂浮于2%（M/V）的葡萄糖溶液中，并于光强24，000勒下暴露96小时。

＃1cDNA库的构建

取20g第3-4阶段OGB花的瓣片于100ml含10mM钒核糖核酸复合物的PEB（200mM 7ris-HCl（pH8.6），60mM kCl，30mM MgCl₂，25mM EGTA）中均化。将匀浆通过无菌Miracloth（Calbiochem）过滤除去细胞碎片。滤液铺于Ultra-Clear^TMQuick-Seal^TM（Beckman）离心管中含25%（W/V）蔗糖，20单位lnhibit Ace（5-Prime 3-Prime）的6ml PEM和含50%（W/V）蔗糖、250单位lnhibit Ace的6ml PEM 形成的梯度密度顶部。上述离心管用70Ti转头以26，000rpm离心3.5小时。从25%（W/V）蔗糖/50%（W/V）蔗糖界面收集膜结合多核糖体，并加入4M异硫氰酸胍溶液。根据Turpen和Griffith（1986）描述的方法通过-5.7M CsCl缓冲物造丸，从变性的多核糖体中分离RNA。

应用Uni-ZAP^TMXR载体试剂盒（Stratagene）以25μg多核糖体 RNA作模板在λZAP中构建定向的cDNA库。含250，000空斑形成单位（pfu）的初级库通过在NZY平板（Sambrook et al，1989）上过夜生长进行扩增，根据Sambrook等人所述方法（1989）用PSB（100mM NaCl，8mM MgSO₄，50mM Tris-HCl（pH7.5），0.01%（W/V）明胶）洗脱扩增的空斑材料。

＃2 cDNA库的构建

用Turpen和Griffith的方法（1986）从P.hyhrida cv，OGB第3-4阶段花的花瓣组织中分离总RNA。通过三轮oligo-dT纤维素色谱法从总RNA中筛选poly（A）⁺RNA（Aviv and Leder，1972）。

在20μl含1×Superscript^TM反应缓冲液、10mM二硫苏糖醇，500μMdATP、500μMdGTP、500μMdTTP、500μM5-甲基-dCTP、0.75μg寡核苷酸＃8和2μl Superscript^TM反转录酶（BRL）的溶液中加入2ugpoly（A）⁺RNA进行反转录。反应混合物于37℃温育50分钟，于44℃温育10分钟，然后置于冰上。

第二部分反应混合物140μl加入到第一部分反应物中。前者由21mM Tris-HCl，104mM kCl、5.3mM MgCl₂，171μM β-NAD，11.4mM（NH₄）₂So₄，214μM dATP、642μM dCTP，214μM dGTP，214μMdTTP，4mM DTT，10μCi³²P-dCTP（3000Ci/mMole）和15单位E.coliDNA连接酶，40单位DNA聚合酶（Boehringer）和0.8单位RNAseH组成。所得的终混合物于16℃温育150分钟。为了形成双链cDNA钝端，加入10单位T₄DNA聚合酶，反应在16℃继续进行15分钟。中止反应，经酚/氯仿抽提，继而氯仿抽提和乙醇沉淀以纯化cDNA。

根据制造商说明的条件使cDNA与EcoRI接头（Promega）连接，然后激酶处理。加热（70℃，20分钟）使酶变性，经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化DNA。按照制造商说明的条件在100ul反应体积中用50单位XhoI（Boehringer）酶解cDNA。热灭活酶（70℃，20分钟），将混合物通过已经STE缓冲液（Sambrook et al，1989）平衡的S400旋转柱（Phamacia）。洗脱液用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。在4℃微离心30分钟后，用70%（V/V）乙醇冲洗cDNA丸，空气干燥，然后重悬于10μlTE缓冲液中（10mM Tris-HCl（pH7.5），1mM EDTA）。

用NA-45膜（Schleicher和Schuell）从已通过1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳的7.5ul样本中分离分子太小范围在1.3～2.5kb之间的cDNA。

在5ul含50mM Tris-HCl（pH7.0），10mM MgCl₂，10mM二硫苏糖醇，1mM ATP和2单位T₄DNA连接酶的反应缓冲液中用经过1ug λZAPⅡ EcoRI/XhoI/CIAP处理的载体（Stratagene）连接已按分子大小分离的cDNA。反应在4℃下进行2天。

将反应物置室温2小时后，连接反应混合物用Packagene系统（Promega）进行包装。重组子的总数为270，000pfu。

150，000pfu量的被包装的cDNA在转染PLK-F′细胞后以每15cm直径平板含10，000pfu的浓度置于平板上。平板于37℃培育8小时，然后于4℃过夜贮存。复制物置于Colony/Plaque Screen^TM滤膜上，按制造商的说明进行处理。

寡核苷酸的合成

根据制造商提供的方法用Applied Biosystems PCR-Mate DNA合成仪合成寡核苷酸。所合成的寡核苷酸5′-3′顺序为：

寡核苷酸1：GGAAGCTTATICCITT（T/C）GGIGCIGG

寡核苷酸2：GGATGACTCAGTAAAACGACGGCCAGT

寡核苷酸3：

CCIGG（A/G）CAIATIC（G/T）（C/T）（C/T）TICCIGCICC（A/G）AAIGG

寡核苷酸4：GGATGACTCAAACAGCTATGACCATG

寡核苷酸5：GTTCAATTCGGAATGATG

寡核苷酸6：GCTGCACTTAATCCATAT

寡核苷酸8：

GAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT

寡核苷酸9：ATGTCTCCTCCAGTG

寡核苷酸10：CTAGACTCCAATCAC

寡核苷酸2和4包括GCN4接合位点（在其下画线表示），已证明该位点能便利于双链的PCR产物的富积（Lew and kemp，1989）。

寡核苷酸3的命名依据如下：从推测的鳄梨树细胞色素P450的血红素结合区得到的氨基酸顺序（Bozak et al，1990）和由两个矮牵牛属植物细胞色素P450同系物pCGP142和pCGP147编码的相应顺序的排列为：

鳄梨树 P F G A G R R G C P G

pCGP142 P F G A G K R I C P G

pCGP147 P F G S G R R I C P G

因此，三种植物细胞色素P450的血红素结合区的共同氨基酸顺序可以看成是：

P F G A（S） G R（K） R I（G） C P G

所以，推测出的能编码存在于三种细胞色素P450分子的血红素结合区的氨基酸的核苷酸顺序有可能的排列为：

5' -CCX TTT GGX GCX GGX AGX CGX ATX TGT CCX GGX -3'

C AG CA A GG C

T

X表示所有4种核苷酸（A，C，T和G）都能存在的核苷酸位置。寡核苷酸3被设计成补充源于三种植物细胞色素P450的共同顺序的一部分顺序。当碱基简并性大于3时，主要存在的是脱氧次黄苷（Ⅰ）。所得的寡核苷酸顺序如上所示。

PCR反应

根据制造商描述的方法用辅助性噬菌体R408（Stratagene）切割含有从扩增的λZAP＃1 cDNA库得到的矮牵牛属植物cDNA插入物的pBluescript质粒噬菌体。用质粒噬菌体混合物转染E.coli XL1-Blue，在含氨苄青霉素的培养基平板上生长出250，000个菌落。将细胞垂悬于LB中（Sambrook et al.，1989），用碱裂解法（Sambrook et al.，1989）分离质粒DNA。通过在CsCl密度梯度中分带进一步纯化质粒DNA。该DNA用作PCR中的模板。

用于扩增花瓣细胞色素P450同系物的PCR反应含有下列成分：5-100ng已切割的DNA，10mM Tris-Hcl（pH 8.3），50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01%（w/v）明胶，每种dNTP各0.2mM，各种引物0.4μM和1.25单位Taq聚合酶（Cetus）。反应混合物（50μl）在94℃、48℃和72℃各反应1分钟，共循环30次。扩增的产物用Geneclean （Bio 101Inc.）进行凝胶纯化，重复扩增步骤获取足够用于克隆的原料，然后用T₄DNA聚合酶进行末端修复。用寡核苷酸1和2进行扩增和DNA被克隆入pBluescript中之前先用HindⅢ和XhoⅠ酶解。在寡核苷酸3和4间扩增产生的PCR产物按Holton和Graham（1991）的描述直接克隆到以ddT结尾的pBluescript载体中。

cDNA库的筛选

将复制的空斑吸出按下列条件进行杂交和洗涤：用于检测同系克隆时采用高强度条件（杂交：50%（v/v）甲酰胺，6×SSC，1%（w/v）SDS，在42℃进行16小时;漂洗：2×SSC，1%（w/v）SDS 65°，15分钟，2次，然后在0.2×SSC，1%（w/v）SDS，65℃，15分钟，2次），在检测相关顺序时采用低强度条件（杂交：20%（v/v）甲酰胺，6×SSC，1%（w/v）SDS，42℃，16小时;漂洗：6×SSC，1%（w/v）SDS，65℃，1小时）。

Northern 分析

从经液氮冷冻并用研钵研成精细粉末的组织中分离总RNA。将抽提缓冲液（4M异硫氰酸胍，50mM Tris-HCl（pH8.0），20mM EDTA，0.1%（v/v）Sarkosyl）加到组织中，用polytron以最大速度将混合物均化1分钟。通过Miracloth（Calbiochem）过滤悬浮液，并用JA20转头以10，000rpm离心10分钟。收集上清，并加入CsCl（终浓度0.2g/ml）。然后将样本铺在装在10ml 5.7M CsCl和50mM EDTA（pH7.0）缓冲物的38.5ml Quick-seal离心管（Beckman）上层，用Ti-70型转头以42，000rpm于23℃下离心12-16小时。所得团丸垂悬于TE/SDS（10mM Tris-HCl（pH7.5），1mM EDTA，0.1%（w/v）SDS）溶液中，用经10mM EDTA（pH7.5）饱和过的酚∶氯仿∶异戊醇抽提。在用乙醇进行沉淀之后，RNA团丸垂悬于TE/SDS中。

RNA样本通过2.2M甲醛/1.2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，所用电泳缓冲液含有40mM吗啉丙烷磺酸（pH7.0），5mM乙酸钠，0.1mM EDTA（pH8.0）。按制造商的说明把电泳后的RNA转移到Hybond-N滤膜（Amer-sham），并用³²P标记的cDNA片段（10⁸cpm/μg，2×10⁶cpm/ml）进行探测。在50%（v/v）甲酰胺，1M NaCl、1%（w/v）SDS和10%（w/v）硫酸葡聚糖中进行预杂交（1小时，42℃）和杂交（16小时，42℃）。在杂交步骤中，与³²P标记的探针一起加入降解的鲑精DNA（100μg/ml）。

滤膜在2×SSC/1%（w/v）SDS中于65℃漂洗1-2小时，然后在0.2×SSC/1%（w/v）SDS中于65℃再漂洗0.5-1小时。在-70℃将滤膜暴露于带增感屏的Kodak xAR胶片48小时。

RFLP分析

a.基团组DNA的分离

基本上按Dellaporta等人（1983）描述的方法从叶组织中分离DNA。所制备的DNA进一步用CsCl浮力密度离心纯化（Sambrook et al.，1989）。

b.Southern印迹

基因组DNA（10μg）用60单位XhaI酶解16小时，然后用0.7%（w/v）琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为TAE（40mM Tris-乙酸，50mM EDTA）。DNA在变性液（1.5M NaCl/0.5M NaOH）中变性处理1-1.5小时，在0.5M Tris-HCl（pH 7.5）/1.5M NaCl中中和2-3小时，然后用20×SSC将DNA转移到Hybond N（Amersham）滤膜上。

C.分离chi-A探针

通过使用从OGB阶段3花瓣RNA制备的cDNA模板和两个寡聚核苷酸引物：＃9，包括核苷酸6-20和＃10，与已公开的chi-A cDNA序列的核苷酸711-725（van Tunen et al.，1988）互补进行PCR合成chi-A的一个cDNA克隆（van Tunen et al.，1988）。将得到的PCR产物连接到pBluescribe M13^-（Stratagene）的SmaI位点，并且测序，证明已克隆的片段与公开的序列相一致。

DNA探针的³²P-标记

使用一个寡聚物标记盒（Bresatec）用50μCi[α³²P]-dCTP放射性标记DNA片段（50到100ng）。在Sephadex G-50（Fine）柱上色谱分析除去未掺入的[α-³²P]-dCTP。

DNA序列分析

基本上按照Sanger等人（1977）的方法，使用定序酶（USB，说明2.1）方法完成DNA定序。采用来自不同M13-mp18和mp19（Norrander等人，1983，Yanisch-Perron 1985）的亚克隆的汇集的序列确定克隆pCGP602，pCGP176和pCGP175的全部序列，所述的亚克隆是使用标准克隆方法得到的（Sambrook等人，1989）。对于一些区域，必需合成特异的寡核苷酸引物以获得重叠序列资料。为了上述目的，合成了下列6个引物;

5′CGTGCCAATGAGCTAGG 3′引物序列1

5′GATGTTGGTTGTACTGAG 3′引物序列2

5′GGAAACCAGATTTTCTTG 3′引物序列3

5′TTTTTTTTTTTTTTTTT 3′引物序列4

5′GTTTTCCCAGTCACGAC 3′引物-40

5′AACAGCTATGACCATG 3′反转引物

可以在图8中见到pCGP602的限制图谱，该图中显示了这些序列中其中几个的位置。

使用FASTA和TFASTA程序（Pearson和Lipman，1988）完成与Gen-bank，Swiss-PROT和EMBL数据库相对应的同源性调查。

构建pCGP293

从Ti双重载体pCGN1559得到表达型双重载体p CGP 293（McBride和Summerfelt，1990）。用KpnI消化质粒pCGN1559，并按照标准方法（Sambrook等人，1989）用T4 DNA聚合酶除去突出的3′末端。然后用XbaI进一步消化载体，并使用Klenow片段修复得到的5′突出末端。然后将该载体再连接得到pCGP67。从pCGP40中分离含Mac启动子，mas终止区和各种克隆位点（Comai等人，1990）的1.97kb的PstI片段，并将其插入到pCGP67的PstI位点得到pCGP293。

通过除去作为来自pCGN7334的BamHI-SacI片段的GUS基因（Jef-ferson等人），并用来自pBluescribe M13的包括多克隆位点的BamHI-SacI片段代替上述基因以构建质粒pCGP40。通过将含Mac-GUS-mas融合基因的片段插入到pCGN7329（Comai等人，1990）的XhoI位点构建质粒pCGN7334（从Calgene Inc.CA;USA得到）。

构建pCGP90

通过以有意义方向在pCGP293的Mac启动子（Comai等人，1990）后克隆来自pCGP602的cDNA插入片段而构建质粒pCGP90。从pCGP602分离含cDNA插入片段的BamHI-KpnI片段并与pCGP293的BamHI/KpnI消化片段连接。通过限制性分析从庆大霉素抗性转化体分离的DNA以确定上述插入片段正确插入pCGP90中。

构建酵母表达型载体pYGA22m

用EcoRI和BglⅡ消化M13-mp18，以产生一含多克隆位点的700bp片段。将上述片段与来自pYGA2269（Ashikari等人，1989）的9kb EcoRI-BglⅡ片段连接。所得的构建体称作pYGA22m，含有插入到甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子下游的多克隆位点（图11）。

构建pCGP618

将包含来自pCGP175的整个cDNA插入片段的1.8kb EcoRI-KpnI片段与来自pYGA22m的9kb EcoRI-KpnI片段连接。所得的质粒pCGP618包含以一有意义方向连接在甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子后的pCGP175 cDNA片段（图11）。

构建pCGP620

将包含来自pCGP176的全部cDNA插入片段的1.8kb EcoRI-KpnI片段与来自pYGA22m的9Kb EcoRI-KpnI片段连接（如构建pCGP618一样）。所得的质粒，pCGP620含有以一有意义方向连接在酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子后的pCGP176 cDNA片段。

酵母转化

按照Ito等人（1983）方法用pCGP618和pCGP620转化酵母菌株G-1315（Mat α，trpl）（Ashikari等人，1989）。根据其将G-1315恢复到色氨酸原养型的能力选择转化体。

制备酵母提取物以检测3′，5-羟化酶活性

a.G-1315/pCGP618

用在缺乏色氨酸培养基上生长的G-1315/pCGP618和G-1315回复突变型的单一分离物接种50mL的YNBC[1.2%（w/v）没有氨基酸的酵母氮（Difco），2%（w/v）葡萄糖和0.3%（w/v）酪蛋白氨基酸（Difco）]并于30℃振荡培养2天。通过离心细胞形成团丸，按照Oeda等人（1985）的方法，所不同的是原生质球在用于检测植物组织中3′，5′-羟化酶活性的提取缓冲液中破碎，获得微球体部分。把微球体团丸悬浮于400μl缓冲液A（10mM Tris-HCl（pH 7.5），0.65M山梨醇，0.1mM DTT，0.1 mM EDTA），并取100μL样品检测3′，5′-羟化酶活性。

b.G-1315/pCGP620

将G-1315/pCGP620的单一分离物接种20ml YNBC，随后在30℃培养2天。通过离心收集细胞，用TE冲洗一次，用缓冲液A冲洗一次，然后再悬浮于含酶解酶（0.1mg/mL）（Seikagakukogyo，Japan）的缓冲液B（10mM Tris-HCl CPH7.5），1.2M山梨醇，0.1mM DTT，0.1mMEDTA）中。随后在30℃培养1小时，通过离心细胞成团丸并再悬浮于400μl缓冲液A中。用玻璃珠（直径＝0.4mm）把细胞悬浮液形成旋涡2分钟，取100μl样品检测3′，5′-羟化酶活性。

矮牵牛花的转化

a.植物材料

在1.25%（w/v）的次氯酸钠中把碧冬茄（SKr4×Sw63和Rp57×Rw14）种子消毒10分钟并用无菌水冲洗三次。把消毒后的种子在100mg/L赤霉酸（GA₃）溶液中浸泡16到20小时。然后让它们在用1%（v/v）蔗糖和0，8%（w/v）Difco Bacto琼脂补充的10%（w/v）MS（Murashige和Skoog，1962）培养基上发芽2星期。在将幼苗移到Jiffy泥炭颗粒（Jiffy Pro-ducts Ltd，Norway）之前，先将幼苗转移到用3%（w/v）蔗糖补充的MS培养基上生长3星期，在Jiffy泥炭颗粒上保持湿度和照明（135μE。卤化汞光，22℃）2到3星期。然后将这些幼苗移到生长室中（68μE，冷白荧光，25℃）。为了共培养，收获幼叶并在1.35%（w/v）的次氯酸钠中消毒2分钟，随后用无菌水冲洗三次。然后把叶组织切成25mm²并在用0.05mg/L激动素和1.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）补充的MS培养基上预培养24小时。

b.土壤杆菌和矮牵牛花的共培养

把含双重载体pCGP90（图14）的根癌土壤杆菌菌株AGLO（Lazo等人，1991）于4℃保持在含100mg/L庆大霉素的MG/L（Garfinkel和Nester，1980）琼脂平板上。将单个菌落在含1%（w/v）Bacto-胨，0.5%（w/v）Bacto-酵母提取物和1%（w/v）NaCl液体培养基上生长过夜。第二天，通过用含3%（w/v）蔗糖（BPM）的液体MS培养基稀释制备成最终浓度为5×10⁸细胞/mL。在含AGLO/pCGP90的BPM中把叶园片浸5分钟，然后把叶园片吸干并放在共培养基上4天。该共培养基包括用0.05mg/L激动素和1.0mg/L 2，4-D补充的SH培养基（Schenk和Hildebrandt1972），并含有铺散在共培养基上的烟草细胞悬浮液喂养层，在烟草细胞悬浮液的上层放一张滤纸。

c.重获转基因矮牵牛花植物

共培养后，把叶园片转移到下列选择培养基上：SKr4×Sw63园片移到用3%（w/v）蔗糖，2mg/L α-苄氨基嘌呤（BAP），100mg/L卡那霉素，350mg/L 头胞噻肟，0.3% Gelrite Gellan树胶（Schweizerhall）补充的新鲜MS培养基;Rp57×Rw14园片移到同样的培养基上，但用0.5mg/L BAP和α-萘乙酸（NAA）代替2mg/L BAP.3星期后，将再生的分离块转移到新鲜培养基上。分离在卡那霉素选择下存活的不定芽并转移到含100mg/L卡那霉素和350mg/L头胞噻肟的BPM上以诱发根。在23±2℃把全部培养物保持16小时光照周期（60μE。冷白荧光）。当根长到2-3cm长时，将转基因矮牵牛花小植物转移到8cm试管中经高压消毒的51410/2盆栽混合土。4星期后，将植物再种到使用同样盆栽混合土的15cm盆中，并保持于23℃，14小时光照周期300μE，卤化汞光）。

烟草转化

a.植物材料

把红花烟草（cv.Xanthi）原料植物保持在用1mg/L吲哚丁酸（IBA）补充并用0.25%（w/v）的Gelrite固化的MS培养基上。把叶组织切成25mm²并放在含1mg/L BAP和0.5mg/L吲哚乙酸（IAA）的MS培养基上培养24小时。

b.土壤杆菌和烟草组织的共培养

按照前述对矮牵牛花的描述完成共培养。

c.重获转基因烟草植物

共培养后，将叶圆片转移到用1mg/L BAP，0.5mg/L IAA，100mg/L卡那霉素和350mg/L头胞噻肟选择培养基）补充的MS培养基上。2-3星期后，将再生的分离块转移到新鲜的选择培养基上。分离出在卡那霉素选择下存活的不定芽并将其转移至含1mg/L ′IBA，100mg/L卡那霉素和350mg/L头胞噻肟的MS培养基以诱导根。当根长到2-3cm长时，将转基因烟草小苗移植到如对矮牵牛花描述的土壤中。

花色素分析

在HPLC分析前将存在于花瓣提取物中的花色素苷酸水解，从花色素核心除去糖基成分。通过HPLC分析花色素核心分子确定花色素苷色素B环上的羟基化方式。上述分析所用的HPLC系统是一个带多波长检测器（MWD）的Hewlett-Packard 1050。在250mm×4mm ID的Spherisorb S5 ODS2柱上完成反相层析分离。

a.提取花色素苷和类黄酮

用含1%（v/v）6M 含水盐酸的5ml甲醇从花瓣片（Ca.50mg）中提取花色素。用水稀释提取物（1∶9）并在注射到HPLC系统前进行过滤（Millex HV，0.45μ）。

b.花色素苷水解

在室温下，使用干氮气流，在Pierce Reactivials中把上述a中得到的粗甲醇提取物（100μL）蒸发至干燥。残余物溶解于200μL 2MHCl中，盖上小瓶并在100℃加热30分钟。用水稀释水解混合物（1∶9）并在HPLC分析前过滤（Millex HV，0.45μ）。

c.层析

使用下列系统经过梯度洗脱可实现分离花色素：

溶剂A：（三乙胺∶conC.H₃PO₄∶H₂O）（3∶2，5∶1000）

溶剂B：乙腈

梯度条件：5%B到40%B超过20分钟

流速：1ml/min

温度：35℃

检测：在280，350，和546nm用同步数据获得MWD。

参考已知的标准鉴定花色素的峰值。

2.克隆并分析3′，5′-羟化酶

3′，5′-羟化酶的定性

a.发育调节

分析在上述定义的不同发育阶段从花中收获的碧冬茄cv OGB花瓣提取物中3′，5′-羟化酶活性。

已发现在花冠的成熟期间，OGB花瓣中的3′，5′-羟化酶活性受发育过程调节（图2B）。该发育图谱对应于类黄酮生物合成中其他基因的表达。3′，5′-羟化酶活性和苯基苯乙烯酮合酶（CHS），苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶（CHI），二羟黄烷醇还原酶（DFR）基因的表达在花发育的3到4阶段达到峰值。

b.在叶组织中诱导3′，5′-羟化酶活性

在叶组织中不能正常表达类黄酮色素生物合成途径中的基因。但是，通过在强光下，于2%（W/V）蔗糖溶液中培养可在OGB叶中诱导飞燕草色素的合成。在这些条件下，可在OGB叶组织中检测到3′，5′-羟化酶活性。已表明在蔗糖/强光处理96小时后，发生最大诱导酶活性。在这些条件下，也可将数个其它色素生物合成基因的表达诱导至与在花瓣形成期观察到的水平相比。从这些结果得出结论：在蔗糖/强光处理过的叶组织中可诱导Hf1和/或Hf2基因。

c.说明3′，5′-羟化酶属于酶的细胞色素P450类的证据

在OGB花瓣中3′，5′-羟化酶活性显示出与微粒体部分有关并依赖于NADPH的存在。可以通过用一氧化碳处理微粒体和利用两种特异地使细胞色素P450酶失活的抑制剂：tetcyclasis和1-氨基苄三嗪（Taton等人，1988;Matthew等人，1985，Rademacher等人，1987）抑制上述活性。

构建富集细胞色素P450序列的cDNA文库

在膜结合的多核糖体上发生细胞色素P450 mRNA转译（Takemori和Kominami，1989）。因此，为了富集细胞色素P450序列（包括3′，5′-羟化酶序列），使用从第3-4花期的OGB花瓣分离的膜结合的多核糖体RNA构建一个cDNA文库。从3-4期花分离花瓣RNA，是因为已经表明在该发育阶段3′，5′-羟化酶活性最大（看上述及图2B），因此，可确保在该文库中最大限度地提供3′，5′-羟化酶序列。所得的文库，称作cDNA文库＃1，含250，000初级重组体。

利用PCR扩增矮牵牛花花瓣细胞色素P450 cDNA

已经对来自象脊椎动物，真菌，昆虫，细菌和植物的有机体中许多细胞色素P450进行测序（Nebert 等人，1991，Bozak等人，1990）。所有这些酶的一个特征是存在若干小区域的保守序列，特别是涉及血色素结合的半胱氨酸残基周围。在迄今定序过的几乎全部微粒体细胞色素P450的血色素结合区域存在氨基酸序列F（G，S）XGXRXCXG，其中，X可以是任何氨基酸（图3）。使用FASTA程序（Pearson和Lipman，1988），将上述共同序列与NBRF蛋白基础数据相比，以确定对于基础数据中全部微粒体细胞色素P450中这一区域周围，氨基酸出现的频率。这种分析表明，对于血色素结合区域周围每一位置，最共同的氨基酸序列是：

FMPFGAGXRXCLG

设计一个与编码划线部分序列和相似序列的基因杂交的寡核苷酸。该寡核苷酸，称作oligol，表示如下：

5′-GGAAGCTTATICCITT（T/C）GGIGCIGG-3′划线部分是包括一个HindⅢ识别位点的附加序列;该位点有利于PCR产物的直接克隆。脱氧肌苷（Ⅰ）内合物对于密码子使用具有不同的可能性，其中，两个以上的密码子可编码同样的氨基酸。脱氧肌苷碱基对具有与A，T，G和C相似的能力。（Martin等人，1985;Ohtsuka等人，1985）。

用从在材料和方法中描述的cDNA＃1文库得到的质粒DNA作为模板，使用oligos1和2（图3）扩增360bp细胞色素P450相关序列。Oligo 2相应于-20引物（Strategene）在5′末端加一个GCN4结合位点（Lew和Kemp，1989）。将PCR片段克隆到pBluescript中，所得的质粒称作pCGP450。pCGP450的5′区编码一个与先前定序的细胞色素P450分子具显著同源性的多肽序列。

从矮牵牛花花瓣的cDNA文库分离细胞色素P450的同源物

用质粒pCGP450筛选cDNA＃1（60，000噬菌斑）的有关克隆。在高和低强度条件下用两次连续杂交检测pCGP450的同胞克隆和第二组细胞色素P450 cDNA。筛选每一同胞组的cDNA克隆样品以用于随后的分析。pCGP450的同胞称作pCGP142，相应的第二组称作pCGP147。在低强度下，用包括仅有的pCGP147编码序列的SalI-EcoRI片段从cDNA文库＃1中再探测16，000个噬菌斑。给全部20个与探针杂交的克隆定序，进一步鉴定了两个细胞色素P450同源物：

pCGP158和pCGP160（图4A）。

通过PCR分离其他的花瓣细胞色素P450同源物

用来自矮牵牛花pCGP142，pCGP147的推测的血红素结合区周围的序列信息和先前定序的鳄梨细胞色素P450序列（O′keefe和Leto，1989;BozaK et al，1990），按照材料和方法中的描述，设计一个覆盖至少由三个细胞色素P450克隆中的两个编码的氨基酸序列的第二简并寡核苷酸（oligo 3）。用cDNA文库＃1作模板并用oligo4作第二引物（图3B）进行PCR，将该寡聚核苷酸用于扩增相关的序列。按在材料和方法中描述的方法分离大小范围在250-500bp的反应产物并将其克隆到由Holton和Graham（1991）描述的加ddT-尾的pBluescript载体中。将已克隆的PCR片段定序并表明该片段编码第5种细胞色素P450同源物。选择称作pCGP454的克隆作进一步分析。

从cDNA文库＃1进一步分离细胞色素P450同源物

用包括细胞色素P450同源物pCGP142，pCGP147，pCGP158和pCGP160的编码序列和来自pCGP454的cDNA插入片段（图4B到4H）的³²p-标记的DNA片段混合探针，从cDNA文库＃1的50，000个重组体中筛选相关序列。在低严紧度的杂交和冲洗条件下，探测到总共152个杂交克隆。通过序列分析来自杂交克隆的DNA鉴定了其它的13个不同的细胞色素p450同源物。在这些克隆中分辨出两种紧密相关同胞组。在DNA水平上，这两组中每一组的编码区表现出94%的同源性或相似性。选择一个同胞组的两个代表，pCGP147（图5A）和pCGP176以及另一同胞组的一个代表pCGP175（图5B）作进一步研究Northern和RFLP分析细胞色素P450同源物

用Northern和RFLP分析区别有编码3′，5′-羟化酶cDNA分子特征的细胞色素P450同源物。在碧冬茄中有两个遗传位点Hf1和Hf2控制3′，5′-羟化酶活性（de Vlaming等人，1984;Wiering，1974）。Hf1在碧冬茄花的瓣片和合瓣花冠中表达，并产生比仅在瓣片中表达的Hf2高很多的3′，5′-羟化酶活性水平。矮牵牛花的3′，5′-羟化酶活性也是随发育和空间调节的。在正常生长条件下，仅在花瓣组织中可检测到这种酶，在花发育的3-4期左右达到最高水平，然后在全开的花中下降（周期5;见图2B）。在某种逆境条件下，如上述的蔗糖/强光处理，也可在叶组织中诱导酶活性。因此，期望能编码3′，5′-羟化酶的cDNA克隆在RNA印迹上有一个相应于酶活性图谱的表达概况。也希望把编码碧冬茄3′，5′-羟化酶的cDNA克隆绘制到Hf1或Hf2位点。已经把Hf1绘制在碧冬茄基因组的第一条染色体上并与ph1位点相连（Cornu，1984，Cornu等人，1990），同时Hf2紧密连接在第五条染色体上的PO（Wallroth等人，1986）。将从近亲系V23（Hf1/Hf1，Hf2/Hf2）和R51（hf1/hf1，hf2/hf2）杂交得到的植物F₂群体中分离的DNA进行RFLP分析，以获得各种细胞色素P450同源物的连锁资料。规定在花冠中有3′，5′-羟化酶活性的F₂植物是Hf1/-基因型。另外，基于与影响花瓣液泡的pH的ph1基因连锁也可以给F₂群体植物提供Hf1/Hf1基因型（Wiering和de Vlaming，1984）。

V23亲本系（Hf1/Hf1）也有导致花瓣匀浆pH约6.2的ph1/ph1基因型。由于ph1/植物的花瓣匀浆pH为5.3，所以通过分析花瓣匀浆的pH，可以区别在R51×V23F₂组群中的ph1/ph1（Hf1/Hf1）。

利用Hf2和po位点之间的连锁可以区别需选择的Hf2克隆。已经表明Po位点相应于编码苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶的碧冬茄Chi-A基因，（Van Tunen等人，1991）。因此，在RFLP分析中可以用Chi-A的cDNA克隆，以规定在F₂组群中的个体具有Po或Po基因型。由于V23有基因型Hf2/Hf2，Po/Po，因此，由类似V23和类似R51的RFLP共分离图谱和由Chi-A探针检测的Po和Po图谱可以确定与Hf2位点的连锁。

用对应于细胞色素P450同源物的3′未转译区的cDNA片段，探测从V23×R51 F₂组群的个体植物中分离出的染色体DNA的RNA印迹和Southern印迹。通过这种分析，表明对应于cDNA克隆pCGP174和pCGP175的基因以平行于3′，5′-羟化酶活性的方式进行表达。进一步地说，相应于pCGP174的基因与Hf1位点紧密连接，pCGP175与Hf2位点连接。

a.pCGP174

来自克隆pCGP174（图5A）的330bp HindⅢ-KpnI 3′片段与RNA和DNA印迹具有杂交图谱，图谱显示该克隆相应于Hf1位点（图6）。在瓣片和合瓣花冠组织中表达该基因，且该基因有一个平行于3′，5′-羟化酶活性的发育概况，在第3期的花瓣中达到峰值。在叶中未检测到它的表达，但在该组织中，通过蔗糖/强光处理可诱导其表达。进一步说，在hf1/hf1突变系R51或Sw63的花瓣组织中，没有探测到这种基因的表达。相反，在Hf1/Hf1系的V23和Th7以及V23×R51杂种中（图.6A）可检测到相当高水平的表达。

在用XbaI消化的染色体DNA的Sourthern印迹上，来自pCGP的330即Hind Ⅲ-KpnI3′片段探测到两个在V23×R51组群中单独分离的RFLP，RFLP＃1相当于强杂交DNA带，RFLP＃2相当于弱杂交带（见图6B）。具有ph1/ph1基因型的12株植物中有11株具有类似V23的RFLP＃1图谱，并且在合瓣花冠中有3′，5′-羟化酶活性的49株植物中49株具有或者类似于V23或者类似于VR的RFLP＃1图谱。另外，对于全部32株植物，V23，VR和R51的chi-A（PO）具有完全共分离的RFLP图谱，包括相应的RFLP＃2图谱。

该资料提供了有力的证据;pCGP174编码3′，5′-羟化酶并相当于Hf1位点（RFLP＃1）并且3′探到与Hf2位点（RFLP＃2）交叉杂交。

b.pCGP175

来自克隆pCGP175（图5B）的320bp HindⅢ/xhoI3′片段在RNA和DNA印迹上有杂交图谱，说明该克隆对应于Hf2位点（图7）。Northern分析表明基因以与pCGP174相似的方式受发育调节，在第3期的OGB花瓣瓣片中，得到最大程度的表达，但在OGB的花冠组织中未检测到其表达。该基因在V23（Hf2/Hf2），Th7（Hf2/Hf2）和V23×R51杂交体（图7A）的花瓣组织中也表达。

在Southern印迹上，来自pCGP175的320bpHindⅢ/×hoI片段与同pCGP174 3′探针弱杂交（RFLP＃2）的V23和R51染色体DNA由XbaI消化产生的相同基因组片段杂交。通过pCGP175 3′探针检测，有类似V23-，VR-和R51-的RFLP图谱完全共分离，相应于Chi-A（Po）的RFLP图谱。

随后的酵母表达实验（见下面）证实pCGP175和pCGP174的一个同胞（pCGP176）两者都编码3′，5′-羟化酶。另外，pCGP174全长模板在hf1/hf1，hf2/hf2矮牵牛花突变体中的表达，导致3′，5′-羟化酶活性提高并产生高于在非转基因植物中存在的正常低基础水平的3′，5′羟化花色素苷。与RFLP结果归在一起，从这些数据中得出结论，pCGP174相当于Hf1位点，pCGP175相当于Hf2位点。

分离全长的Hf1 cDNA克隆并序列分析

从初步的序列分析表明，pCGP174并不代表一个相应转录的全长克隆，但pCGP175包括一个假设起始密码子并且认为它是一个全长的cDNA。序列分析也表明，pCGP176是一个较长的pCGP174变体并包括从5′末端起的ATG密码为17bp。但是，单独地通过这种分析不可能有把握地预言pCGP176是否包含该基因的全部编码区。因此，筛选cDNA文库＃2以得到pCGP174/pCGP176同胞组群的较长克隆。从来自cDNA文库＃2的约1.5×10⁵个重组体中筛选出与来自pCGP174的0.33KbHindⅢ-KpnI3′片段杂交的克隆。选择两个杂交克隆，称作pCGP601和pCGP602作进一步分析。

pCGP601和pCGP602两者都包括假设的转译起始密码子，但是pCGP602编码一个较长的5′非转译区。

图8是pCGP602的限制酶图谱，显示对该克隆进行序列分析所采用的方法以及获得重叠序列信息所使用的寡聚核苷酸引物。

在图9中显示同胞克隆pCGP176和pCGP602的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列。同样，图10表示pCGP175的核苷酸序列和推导出的转译产物。

使用由LFASTA程序（Pearson和Lipman，1988）产生的序列，发现由矮牵牛花3′，5′-羟化酶基因编码的氨基酸序列有94%的位置等同。核苷酸序列是94%等同。根据细胞色素P450的分类示意图，该序列安置了两个同一族/亚族的基因。由于3′，5′-羟化酶氨基酸序列与先前鉴定的细胞素P450总科成员相比具有低于40%的等同，所以相应的基因属于从其他P450基因分离的新P450科。

在酵母中表达pCGP175

以一有意义的方向，将来自pCGP175的cDNA插入片段连接在酵母载体pYGA22m的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的后面。将所得的称作pCGP618（图11）的构建体转化到酵母菌株G-1315（AshiKari等人，1989）中。让一个单独的转化体在50mL的YNBC中于30℃生长2天。从这一培养物制备的微粒体部分显示有3′，5′-羟化酶活性，而从非转化酵母制备的等同部分没有活性（图12）。由此可得出结论，从pCGP175分离的cDNA插入片段编码3′，5′-羟化酶。

在酵母中表达pCGP176cDNA

以一有意义的方向，把来自pCGP176的cDNA插入片段连接到酵母载体pYGA22m的甘油醛-3-磷酸脱氢酶后面。把所得的称作pCGP620的构建体转化到酵母菌株G-1315中。从该转化酵母制备的提取物有3′，5′-羟化酶活性，而从非转化酵母制备的等同部分没有活性（图13）。由此得出结论，来自pCGP176的cDNA插入片段编码3′，5′-羟化酶。

Hf1 cDNA的表达

a.在hf1/hf1，hf2/hf2碧冬茄F1杂交体SKr4×SW63中表达

把pCGP602 cDNA插入片段连接在Ti双重载体pCGp293启动子Mac的后面。把所得的称作pCGP90的构建体，使用土壤杆菌介导的基因转移方法导入F1矮牵牛花杂交体SKr4×SW63中。SKr4×SW63的叶圆片与AGLO/pCGPP90共培养，并通过Sourthern分析卡那霉素选择后得植物证实，CGP602 cDNA插入片段整合到SKr4×SW63基因组中。

转基因植物比非转基因的SKr4×SW63杂交体有显著高水平的3′，5′-羟化酶活性（图15）和3′，5′-羟化的花色素苷（表3A）。虽然SKr4×SW63的Hf1和Hf2是纯合隐性的，但这些突变不完全阻断酶产生，在SKr4×SW63花瓣提取物中（图15）可检测到低水平的3′，5′-羟化酶活性。另外，在酸水解的SKr4×SW63花瓣提取物中检测到低水平（100μg/gm）的二甲翠雀素（表3A）。Hf1 cDNA的导入明显地提高了花瓣瓣片组织中3′，5′-羟化酶的水平（图15）并且来自突变植物花瓣的酸水解提取物中二甲翠雀素的水平是非转基因对照植物中的4倍（表3A）。

b.在红花烟草栽培种xanthi中表达

烟草（红花烟草cv xanthi）花产生如基底花色素一样的花色素。用pCGP90转化烟草导致在花中除花色素以外积累显著高含量的翠雀素（显示于表3A）。

表3A

色素分析在酸水解的花瓣提取物中花色素水平

植物二甲翠雀素花色素翠雀素

(μg/gm花瓣) (μg/gm花瓣) (μg/gm花瓣)

矮牵牛花

SKr4×SW63 100 nd' nd

SKr4×SW63

/pCGP90 410 nd nd

烟草

非共培养对照 nd 272 nd

转基因烟草 nd 229 36

¹未检测到

c.在hf1/hf1，hf2/hf2碧冬茄F1杂交体Rp57×Rw14中表达

用pCGP90和相同于SKr4×SW63所用的方法转化矮牵牛品系Rp57×Rw14。转基因花产生显著的在非转基因植物检测不到的3′-甲花翠素和二甲翠雀素（表3B）。3′-甲花翠素和二甲翠雀素都是翠雀素的甲基化衍生物。

表3B

高PH系Rp57×RW14的色素分析

在酸水解花瓣提取物中存在的花色素百分比

植物花色素甲基花青素 3-'甲花翠素二甲翠雀素

(%) (%) (%) (%)

矮牵牛花

Rp57×RW14 5.0 95.0 0 0

Rp57×RW14

/pCGp90 0 45.2 7.8 47.0

导入的Hf1 cDNA在SKr4×SW63杂交体中的表达对花的颜色有明显的影响。未转基因花的心皮和雄蕊组织是白色的，而在转基因植物中，这些同样的组织是兰/紫色。另外，在SKr4×SW63杂交体中表达Hf1 cDNA使通常为很淡的粉红色的花冠具有深粉红色/紫罗兰色。对于烟草的情况，产生的翠雀素衍生物产生轻微兰色的成熟中的花。在Rp57×RW14杂交体中表达Hf1 cDNA对花色也有明显的影响。非转基因的Rp57×RW14花是粉红色的，其主要存在的花色素是甲基花青素（见表3B）。用Hf1cDNA转化导致花色明显变兰。

可依据来自Royal Horticultural Society′s CoLour Chart的数据描述观察到的颜色改变。通常，可把改变描述成从60C/D-65C/D的淡到居中的粉红色，到由许多而不是全部的70到85之间的颜色面积表示的深兰/紫色。虽然不希望限制可达到的可能颜色改变，可以把一些在SKr4×SW63杂交体中观察到的颜色近近似地描述成从65B（未转化）到70B和到74B（两者是转化的）的变化。同样，在Rp57×RW14中的几个杂交体可以描述成从64C到72B到77B和到82B的改变。应该记住其他生物化学和生理学条件也影响个体结果并且所得的特殊颜色的例子不应被解释为限制可能的范围。

在其他植物种中检测假设的3′，5′-羟化酶基因序列

3′，4′，5′-羟化的类黄酮的存在与3′，5′-羟化酶活性和其3′，5′-羟化酶基因的存在有关。可以预料来自其它物种的这些基因在低严紧度的条件下可与矮牵牛花3′，5′-羟化酶基因杂交。从一些产生翠雀素的植物分离出RNA（图16）和/或DNA（图17），用³²P-标记的Hf1 cDNA在不同严紧度的条件下探测并洗涤。在每个样品中检测杂交带。因此，使用矮牵牛花3′，5′-羟化酶基因作为探针从其它产生翠雀素的植物中分离3′，5′-羟化酶基因应是可能的。

本领域专业人员懂得本文描述的发明除那些特别描述外可以进行改变和修饰。可以理解本发明包括全部上述变异和修饰。本发明也包括在本说明书中单独地或共同地涉及或说明的全部步骤，特征，组合物和化合物，以及任何将全部任意两个或更多的所述步骤或特征的结合。

Claims

1、一种核酸分离物，包含一种核苷酸序列，该序列编码或互补于一种编码二氢莰非醇(DHK)羟化酶或其衍生物或部分的序列。

2、根据权利要求1的核酸分离物，其中所说的核酸是DNA或cDNA。

3、根据权利要求1或2的核酸分离物，其中的酶是一种3′，5′-羟化酶。

4、根据权利要求3的核酸分离物，其中的酶来源于牵牛花，马鞭草，飞燕草，葡萄，鸢尾，小苍兰，绣球花，仙客来，马铃薯，三色紫罗兰或茄子。

5、根据权利要求4的核酸分离物，其中的酶是来源于牵牛花。

6、根据权利要求5的核酸分离物，该分离物具有一个核苷酸序列，它包含有基本上全部或部分图9或10中所示的核苷酸序列，或者与其至少具有40%的相似性。

7、根据权利要求1、4、5或6的核酸分离物，所说的分离物是存在于转基因植物中。

8、根据权利要求7的核酸分离物，其中的转基因植物是玫瑰、牵牛花、菊花，荷兰石竹，非洲菊，天竺葵、或alstroemeria

9、根据权利要求8的核酸分离物，其中的转基因植物是玫瑰或牵牛花。

10、根据权利要求1、4、5或6的核酸分离物，它存在于一种能够将所说核酸分离物转移到植物细胞或组织中的载体分子中。

11、根据权利要求10的核酸分离物，其中所说的转移需要与土壤农杆菌一起培养。

12、根据权利要求10或11的核酸分离物，其中的载体和核酸分离物是图11中所示的pCGP90。

13、一种重组二氢莰非醇（DHK）羟化酶或其衍生物或其部分。

14、根据权利要求13的重组酶，其中所说的酶是一种3′，5′-羟化酶。

15、根据权利要求13或14的重组酶，其中所说的酶来源于牵牛花、马鞭草、飞燕草、葡萄、鸢尾，小苍兰，绣球花，仙客来，马铃薯，三色紫罗兰或茄子。

16、根据权利要求15的重组酶，其中的酶来源于牵牛花。

17、根据权利要求16的重组酶，它所具有的氨基酸序列包含有基本上全部或部分图9或10中所示的氨基酸序列或具有与其至少40%的同源性。

18、根据权利要求13、15、16或17的重组酶，它存在于一种转基因植物中。

19、根据权利要求18的重组酶，其中所说的转基因植物是玫瑰、牵牛花、菊花、荷兰石竹或非洲菊。

20、根据权利要求19或20的重组酶，其中的转基因植物是玫瑰或牵牛花。

21、一种产生转基因植物的方法，该植物能够表达一种重组二氢莰非醇（DHK）羟化酶，或控制一种基本上互补于全部或部分mRNA分子的核酸序列的转录，该mRNA分子可被翻译成DHK羟化酶，所说的方法包括向一种合适的植物细胞中导入权利要求1或6的核酸分离物，导入条件允许最终表达所说的核酸分离物，从细胞中再产生一种转基因植物，和使所说的转基因植物生长一段时间，并且导入条件足以允许核酸分离物的表达。

22、根据权利要求21的方法，其中重组酶是3′，5′-羟化酶。

23、根据权利要求21或22的方法，其中核酸分离物的表达是随发育调节的。

24、根据权利要求23的方法，其中的重组酶来源于牵牛花、马鞭草、飞燕草、葡萄、鸢尾，小苍兰，绣球花，仙客来，马铃薯，三色紫罗兰或茄子。

25、根据权利要求26的方法，其中的重组酶来源于牵牛花。

26、根据权利要求25的方法，其中的核酸分离物或酶具有一种基本如图9或10所示的核苷酸或氨基酸序列，或者与其具有至少40%的相似性。

27、根据权利要求21、24、25或26的方法，其中的转基因植物是玫瑰、牵牛花、菊花、荷兰石竹、非洲菊或烟草。

28、根据权利要求27的方法，其中的转基因植物是玫瑰或牵牛花。

29、一种带有稳定导入的核酸分子的转基因植物，含有一种核苷酸序列编码或互补于一种编码二氢莰非醇（DHK）羟化酶核苷酸序列。

30、根据权利要求29的转基因植物，其中的酶是一种3′，5′-羟化酶。

31、根据权利要求30的转基因植物，其中的酶来源于牵牛花，马鞭草，飞燕草，葡萄，鸢尾，小苍兰，绣球花，仙客来，马铃薯，三色紫罗兰或茄子。

32、根据权利要求31的转基因植物，其中的酶来源于牵牛花。

33、根据权利要求32的转基因植物，其中的酶具有一种基本上如图9或10中所示的氨基酸序列，或与其具有至少40%的相似性。

34、根据权利要求29至33的任何一种转基因植物，其中所说的植物是玫瑰、牵牛花、菊花、荷兰石竹、非洲菊、鸢尾，郁金香，百合，lisianthus，小苍兰，飞燕草，limunium，天竺葵。

35、根据权利要求34的转基因植物，其中的转基因植物是玫瑰或牵牛花。

36、一种克隆核酸分子的方法，该分子含有一种编码来源于植物的细胞色素P450分子或类似分子的核苷酸序列或该编码序列的互补序列，所说的方法包括用一种或几种寡聚核苷酸引物通过一种或几种聚合酶链反应对来源于所说植物细胞的合适核酸分子制备物中的细胞色素P450核苷酸序列或互补序列进行放大，所说引物具有一种来源于一种或几种已知微粒体细胞色素P450分子的一致序列的核苷酸序列。

37、根据权利要求36的方法，其中的一致序列是来源于细胞色素P450分子的血红素结合区。

38、根据权利要求37的方法，其中的一致序列是F（G，S）XGXRXCXG，其中X是任何氨基酸。

39、根据权利要求37的方法，其中的一致序列是FMPFGAGXRXCLG，其中X是任何氨基酸。

40、根据权利要求36、37、38或39的方法，其中的细胞色素P450分子或类似分子是一种DHK羟化酶。

41、根据权利要求40的方法，其中的DHK羟化酶是3′，5′-羟化酶。

42、根据权利要求40的方法，其中克隆的酶具有一种图9或10中的氨基酸序列或基本是由图9或10中的核苷酸序列所编码，或者具有与其40%的相似性。